CN103826653A - 免疫接种和诊断应用中的多瘤病毒jc肽和蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫接种或免疫领域，特别是治疗性免疫接种和诊断。公开了能够引发抗瘤病毒JC(JCV)的保护性免疫应答的药物组合物和试剂盒，其可用于例如治疗或预防进行性多病灶脑白质病(PML)和/或进行性多病灶脑白质病-免疫重构炎性综合征(PML-IRIS)。处于此种PML或PML-IRIS的危险中的个体可以例如为免疫受损或被免疫抑制的患者或具有适格进行免疫抑制治疗的自身免疫性疾病的患者。本发明还涉及包含JCV蛋白的至少一个CD4+表位的组合物以及其治疗性、预防性和诊断性用途。

Description

免疫接种和诊断应用中的多瘤病毒JC肽和蛋白质
本发明涉及免疫接种或免疫的领域，特别是治疗性免疫接种和诊断。公开了能够引发抗多瘤病毒JC(JCV)保护性免疫应答的药物组合物和试剂盒，所述药物组合物和试剂盒可用于例如治疗或预防进行性多病灶脑白质病(PML)和/或进行性多病灶脑白质病-免疫重构炎性综合征(PML-IRIS)。处于此种PML或PML-IRIS的危险中的个体可以例如是免疫受损或被免疫抑制的患者或具有适格接受免疫抑制治疗的自身免疫疾病的患者。本发明还涉及包含JCV蛋白的至少一个CD4+表位的组合物及其治疗性、预防性和诊断性用途。
进行性多病灶脑白质病和进行性多病灶脑白质病-免疫重构炎性综合征由多瘤病毒JC(JCV)对中枢神经系统的感染引起。这两种疾病最近都显现为多发性硬化和其它自身免疫性疾病的单克隆抗体疗法的并发症。
进行性多病灶脑白质病(PML)最早被描述于1958年。1971年，多瘤病毒JC(JCV)被鉴定为PML的致病剂。PML是机会性的并且通常为致命的感染，其在免疫受损的状态例如HIV感染、癌症、器官移植、免疫缺陷或罕见地在自身免疫性疾病的过程中发生。在AIDS患者中，PML是最严重的并发症之一，尽管其发生率在引入抗病毒疗法后降低(Cinque等人,2001)。JCV感染在健康成人中是高度普遍的，60%或更多的群体携带潜伏性/持久性感染(Egli等人,2009)。近年来，PML已显露为自身免疫性疾病（特别是多发性硬化(MS)）的单克隆抗体疗法和利用那他珠单抗(抗-VLA-4)的治疗中的日益普遍的严重不利事件(Kleinschmidt-DeMasters和Tyler,2005)(Langer-Gould等人,2005)(Jilek等人)(Anonymous,2011)。其它单克隆抗体例如利妥昔单抗(抗-CD20)、英夫利昔单抗(抗-肿瘤坏死因子(TNF)-α)和用于治疗类风湿关节炎(RA)的IgG1-TNF受体2融合蛋白依那西普也与PML相关联。依法珠单抗(抗-白细胞功能相关抗原-1)已被撤市(Pugashetti和Koo,2009)。由于在接受那他珠单抗的MS患者中报导了超过120例PML病例，因此PML发病率为1:500至1:1000，而危及该高度有效的治疗的用途(佚名,2011)。
PML的发病机制的特征在于在显著的免疫应答不存在的情况下髓磷脂形成性少突胶质细胞的裂解性感染和星形细胞的顿挫性感染。然而,其它CNS细胞例如小脑颗粒神经元也可被JCV感染(Du Pasquier等人,2003a)。尽管控制JCV感染的机制还不完全清楚，但JCV感染的潜伏期可能受到健康个体中有效体液和/或细胞免疫应答的控制(DuPasquier等人,2001)(Du Pasquier等人,2004a)(Weber等人,1997)。因此，已将JCV-特异性CD8+细胞毒性T细胞的存在与从PML的恢复相联系，而这些细胞在具有致命结果的PML病例中不存在(Du Pasquier等人,2004a；Du Pasquier等人,2006；Koralnik等人,2002)。另外，PML还优先在减少的CD4+T细胞数目或受损的CD4+细胞功能的情形（例如AIDS和特发性CD4+淋巴细胞减少）中发生(Stoner等人,1986)(Gillespie等人,1991；Zonios等人,2008)。与CD8+JCV-特异性T细胞的作用相当，PML的消退在CD4+数目和功能恢复之后，这表明CD4+和CD8+病毒特异性T细胞对于宿主的保护是至关重要的。
与AIDS中显著的免疫抑制相反，在非何杰金氏淋巴瘤和白血病中，基于单克隆抗体的疗法抑制特定的免疫功能例如在抗-VLA-4/那他珠单抗疗法中穿过内皮屏障的细胞迁移，或在利妥昔单抗的情形中消除某些免疫细胞例如CD20表达性B细胞(Lutterotti和Martin,2008)。在抗-VLA-4疗法的情境中，目前的假说假定PML由CNS的受损的免疫监督引起，因为活化的T细胞和CD209+不成熟的树突细胞不能穿过血脑屏障(BBB)和进入脑(del Pilar Martin等人,2008；Stuve等人,2006；Yednock等人,1992)。因此，局部抗原呈递在CNS中受损(del Pilar Martin等人,2008)。
备选地，已认为VLA-4/血管细胞粘着分子-1(VCAM-1)相互作用(所述相互作用作为骨髓中造血前体细胞的保持信号)的抑制导致JCV从其天然小生境之一释放(Tan等人,2009a)、增加的病毒复制和具有对CNS细胞的向性的JCV变体的出现(Houff等人,1988；Ransohoff,2005)。
PML中利用这些单克隆抗体的疗法的停止重新建立CNS中经JCV感染的细胞的免疫监督，并导致该隔室(compartment)的临床上明显的炎性反应。炎症因BBB的开放以及T细胞和单核细胞/巨噬细胞的流入而可在磁共振成像(MRI)上通过对比增强性损伤可视化。PML的后一种表现被称为免疫PML-重构炎性综合征(PML-IRIS)(Koralnik,2006；Tan等人,2009b)。在约30%至50%的病例中，PML-IRIS可导致患者的临床状态的快速恶化和死亡(Tan等人,2009b)。其细胞和分子发病机制，即牵涉哪些T细胞亚型、抗体或细胞因子目前不甚了解。
进行性多病灶脑白质病-免疫重构炎性综合征可使进行性多病灶脑白质病的诊断变得模糊，并导致具有严重临床失能和可能地死亡的显著的免疫发病机制。与进行性多病灶脑白质病（其中脱髓鞘由在感染位点不存在免疫应答的情况下JC病毒造成的少突胶质细胞裂解引起）不同，进行性多病灶脑白质病-免疫重构炎性综合征中的组织破坏是由抗JC病毒感染的少突胶质细胞和星形细胞的强烈免疫应答以及脑的炎性肿胀引起的。当免疫能力被重新建立时（例如在利用高度活性的逆转录病毒疗法治疗的AIDS患者中或在利用抗-VLA-4单克隆抗体那他珠单抗治疗并且洗去抗体后的MS患者中），PML-IRIS开始。在PML-IRIS过程中，免疫细胞进入脑并且消除JCV-感染的星形细胞和少突胶质细胞。在现有技术水上对参与进行性多病灶脑白质病-免疫重构炎性综合征的细胞和介导者了解甚少。
尽可能早地诊断PML和PML-IRIS以及基于潜在的疾病机制鉴定有效的疗法不仅在MS中而且在许多其它自身免疫性疾病中，在获得性免疫缺陷过程中，在恶性肿瘤过程中和在移植医学中是非常重要的目标。用于诊断JVC的方法是已知的。例如，有可能通过PCR检测病毒。备选的方式是检测针对JCV的抗体，例如通过ELISA。在Goldmann等人,1999或DE19543553中教导了用于诊断JCV感染的示例性方法，例如使用针对JCV核心蛋白VP1的ELISA。
到目前为止对疾病的治疗方法研究较少。Goldmann等人,1999或DE19543553建议利用VP1蛋白的免疫接种，该蛋白可被装配成病毒样颗粒。已教导，利用弗氏完全佐剂(FCA)的免疫接种诱发免疫应答，而不利用佐剂的免疫接种不是免疫原性的。然而，弗氏完全佐剂因其毒性而不能用于人。
鉴于病原性免疫应答的危险(如在PML-IRIS中是普遍的)，开发允许治疗PML和预防PML及PML-IRIS的免疫接种是特别的挑战。
该问题被本发明、特别是被权利要求的主题解决了。
本发明在第一方面提供了包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽，其中所述表位选自包含SEQ ID NO：1-92的组。在第二方面，本发明提供了包括含有至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽和佐剂的药物试剂盒，其中所述表位选自包含SEQ ID NO：1-92的组。优选地，所述佐剂选自包含TLR-7激动剂和/或TLR-8激动剂的组。
发明人令人惊讶地显示了CD4+反应在控制JCV感染和预防PML中的生物学相关性。先前认为CD8+细胞和细胞免疫应答起控制JCV的主要作用。
发明人鉴定了许多CD4+表位，特别是来自JVC的VP1蛋白的表位，所述表位适合用于治疗性和预防性疫苗。例如，用于这类疫苗中的肽或蛋白质可包含来自本文中公开的一种或多种JCV蛋白的一个或多个表位序列。本发明的蛋白质或肽可以例如包含VP1蛋白或与VP1蛋白具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质的氨基酸序列。根据优选的方面，本发明提及利用VP1蛋白或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质的免疫接种。VP1蛋白或其变体可以以五聚体（即以JCV衣壳体的形式）存在于疫苗中。然而，优选地，VP1蛋白或其变体以病毒样颗粒(VLP)的形式存在。VLP可由VP1组成或其还可包含其它JCV蛋白例如VP2和/或VP3。本发明的药物试剂盒从而可包含抗原(即包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽，包括VP1或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质)作为一个组分。
蛋白质和肽在本申请的上下文中基本上彼此互换地使用。通常地，蛋白质比肽更长，且例如包含超过100个氨基酸，而肽具有5至100个氨基酸。
CD4+表位是在MHC II类分子的情境中能够被CD4+T细胞的T细胞受体识别的肽。发明人已鉴定了CD4+T细胞表位，其被健康对照和PML/PML-IRIS患者的CD4+T细胞识别。这类肽公开于下面的表1中(SEQ ID NO：1-92)中。这些表位中的数个不能被使用外周T细胞的经典方法鉴定，而仅被鉴定为与从PML-IRIS患者的脑活检组织分离的T细胞反应。由于该患者在脑和CSF中显示低的至不存在的JCV病毒载荷，因此JCV-特异性大脑内CD4+介导的免疫应答似乎已将病毒感染从脑清除或几乎清除，因而所进行的实验确保鉴定的CD4+T细胞表位、特别是被鉴定为被源自脑的T细胞识别的那些表位的高度生物关联性。被源自脑的T细胞鉴定的T细胞表位显示在SEQ ID NO:1-3,7-9,11,23,37-38,43-45和69-71中，包含这些表位的肽和蛋白质对于本文中描述的预防性和治疗性免疫接种方法是特别优选的。在优选实施方案中，本发明的蛋白质或肽包含至少一个选自包含SEQ ID NO:1-3,7-9,11,23,37-38,43-45和69-71的组的CD4+表位。
VP1是JCV的主要衣壳蛋白，且包含高比例的所鉴定的免疫显性表位。野生型VP1的序列公开于例如DE19543553中。然而，VP1也可被突变，例如在位置55、269和其它位置上。已显示超过50%的体内存在的VP1突变是在这些位置上。对应于来自突变的VP1蛋白的肽的表位也可用于本发明的情境中。表1中的一些肽对应于突变的VP1片段。包含本发明的CD4+表位的蛋白质或肽由SEQ ID NO:1-92的肽组成，或它们可以更长，例如具有12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35或更多个，40或更多个，50或更多个，75或更多个，100或更多个，125或更多个，150或更多个或200或更多个氨基酸的长度。它们可由野生型或天然存在的突变的VP1或其它JCV蛋白的氨基酸组成，或包含不同的序列，例如非源自相同病毒蛋白或不为其天然排列的序列。例如，它们可以是包含选自包含SEQ ID NO：1-92的组的2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个表位的融合蛋白。
在一个实施方案中，蛋白质与VP1具有至少70%的氨基酸同一性。优选地，其包含至少一个选自包含SEQ ID NO：1-92的组的表位。与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质可以是还包含至少一个选自包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：46-76的组的表位的融合蛋白。优选地，蛋白质包含至少一个SEQ ID NO:1-3,7-9,11,23,37-38,43-45,和69-71中所示的表位。
在一个实施方案中，包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质以病毒样颗粒的形式存在。VP1蛋白或其衍生物（例如突变体或片段，其包含与野生型VP1的至少70%的氨基酸序列同一性，如DE19543553中所描述的）或其融合蛋白可装配成病毒样颗粒，这也被描述于DE19543553中。
当然，本发明的试剂盒还可包含两种或更多种包含至少一个选自SEQ ID NO:1-92的源自JCV的CD4+表位的肽或蛋白质，优选地在一种组合物中。优选地，试剂盒包含两种或更多种具有选自SEQ ID NO：1-3,7-9,11,23,37-38,43-45和69-71的来自JCV的CD4+表位的肽或蛋白质。由于CD4+表位和CD8+表位都似乎与有效的抗JCV免疫应答相关，如果本发明的肽或蛋白质包含至少一个CD4+表位和一个CD8+表位，将是特别有利的。
如本发明的实施例中所显示的，本发明的肽和蛋白质可用于给患有PML的受试者施用以诱导或增强抗JCV的特异性大脑内CD4+-介导的免疫应答。因此，根据本发明的一个方面，包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽用于治疗受试者中PML的方法中。已患有PML和/或PML-IRIS的受试者的治疗在本文中被称为治疗性免疫接种。在优选的实施方案中，包含VP1蛋白的氨基酸序列或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质的氨基酸序列的蛋白质被用于治疗PML。在另一个优选实施方案中，用于治疗PML的肽或蛋白质包含选自SEQ IDNO:1-3,7-9,11,23,37-38,43-45和69-71的表位或由所述表位组成。
当治疗发展了PML的受试者时，已发现基于施用本发明的肽或蛋白质的治疗可通过施用能够扩增和维持T细胞的细胞因子而被进一步改善。在本发明的过程中已发现共施用这样的细胞因子为重要免疫功能的重构提供了刺激物。可使用数种细胞因子，例如IL-7,IL-2,IL-15和IL-21。使用IL-7或IL-7的衍生物是特别优选的。
在其它实施方案中，通过治疗性免疫接种进行的PML治疗还包括佐剂的施用。所述佐剂可以是适合于给人受试者施用并且引起T细胞活化和/或抗原在施用部位的呈递的任何佐剂。例如，待用于本发明的方法和试剂盒的佐剂可选自MF59、氢氧化铝、磷酸钙凝胶、脂多糖、咪唑并-喹啉(例如咪喹莫特,S-28463)、具有CpG基序的寡核苷酸序列、硬脂酰酪氨酸、DTP-GDP、DTP-DPP、苏氨酰-MDP、7-烯丙基-8-氧鸟苷、糖脂bay R1005、多抗原肽系统、聚合的半抗原肽、细菌提取物、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、vit-A等。
优选地，待用于实施本发明的佐剂是TLR-7激动剂或TLR-8激动剂。数种TLR-7激动剂是已知的并且是商业上可得的，例如来自Invivogen,San Diego。实例是腺嘌呤类似物CL264、鸟苷类似物洛索立宾或优选地，咪唑并喹啉化合物例如瑞喹莫德、Gardiquimod　或咪喹莫德(4-氨基-1-异丁基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉)。已知TLR-8激动剂具有与TLR-7激动剂相似的生物学效应，从而也可，或备选地被使用。TLR-8激动剂的实例是单链RNA或大肠杆菌(E.coli)RNA。示例性的TLR-7/8配体是噻唑并喹啉化合物CL075、咪唑并喹啉化合物R848或水溶性R848咪唑并喹啉化合物CL097、胸苷同聚物硫代磷酸酯ODN(Poly(dT)。
用于本发明的优选佐剂是咪喹莫特。在本发明的情境中可使用超过一种佐剂(优选选自包含TLR-7激动剂和/或TLR-8激动剂的组)，如果需要的话，可使用刺激免疫应答的其它方式，例如如下文中描述的。
根据优选的实施方案，治疗性免疫接种包括VP1(或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质)与佐剂（例如咪喹莫特）和细胞因子例如（IL-7）的组合施用。VP1蛋白或其变体可以作为五聚体（即以JCV衣壳体的形式）存在于该组合中。然而,优选地，VP1蛋白或其变体以病毒样颗粒(VLP)的形式存在。VLP可由VP1组成或其还可包含其它JCV蛋白,例如VP2和/或VP3。特别优选地，将由VP1或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质组成的VLP与佐剂和细胞因子组合施用。最优选地，将由VP1组成的VLP与咪喹莫特和IL-7组合施用以进行治疗性免疫接种。
在一个实施方案中，例如，试剂盒还可包含IL-7。IL-7优选用于这样的情况，在所述情况中患有PML的受试者被治疗(即在治疗性免疫接种中)并且在无进一步刺激的情况下预期没有充分的免疫应答，例如，当患者是免疫缺陷型时。发明人显示了IL-7与试剂盒的其它组分的施用能够诱导先天性免疫缺陷个体中的保护性免疫应答。IL-7还可用于接受免疫抑制药物的受试者或因HIV感染而免疫受损的患者。
优选地，皮下施用包含至少一个源自JCV的CD4+表位的本发明的蛋白质或肽。也可选择其它施用模式，例如经皮肤、肌内、静脉内、经肺或口服施用。
优选地以适合于诱导针对本发明的蛋白质或肽的免疫应答的方式给受试者施用佐剂。例如，可以以与施用本发明的蛋白质或肽相同的方式和在施用所述蛋白质或肽的同时施用佐剂，且两者可在一种组合物中，例如包含在一个小瓶中。在一个实施方案中，包含CD4+表位的蛋白质或肽和佐剂均用于皮下施用。备选地，以允许刺激针对表位的免疫应答的方式施用它们，例如，抗原被皮下施用，而佐剂被局部或经皮肤施用，特别地，其可在抗原的注射位点例如以乳膏或洗剂的形式被施用。经皮肤施用佐剂（例如咪喹莫特）的方式在现有技术中是已知的。例如，可将包含有效浓度的佐剂的乳膏施用至皮下注射附近、约5cm x5cm区域的皮肤上。
优选地同时或在短时间间隔内连续施用佐剂和抗原。例如，可在皮下注射后直接经皮肤施用咪喹莫特乳膏。可将乳膏覆盖以防止进一步扩散，并且在约4-12小时，例如8小时后擦掉。
在第一次施用包含至少一个CD4+表位的蛋白质或肽和佐剂后，可进行进一步的施用过程以加强免疫应答，例如2、3或4个施用过程。所述过程之间的时间可以为约1至约4周，优选地约2至约3周，例如10天。在一个实施方案中，第一次施用后2周进行加强免疫，以及第一次施用后6周进行另一次加强免疫。在免疫缺陷型或免疫受损的受试者中，施用抗原和佐剂二者以进行加强是有利的。在非免疫缺乏型或免疫受损的受试者，还可能仅使用佐剂进行第一次或第一和第二次免疫接种，即仅使用抗原进行以后的免疫接种。
除了用于治疗已发生PML的受试者外，本发明的蛋白质或肽还可有效地用于预防尚未发生PML但处于发生该疾病的危险中的受试者的PML和/或PML-IRIS。该方法在本文中称为预防性免疫接种。待通过预防性免疫接种治疗的受试者可以是尚未感染JVC的受试者，这意指预防性免疫接种用于预防受试者的感染。然而，优选地，待通过预防性免疫接种治疗的受试者是已感染了JCV的受试者。预防性免疫接种不需要包括佐剂的施用。优选地预防性免疫接种既不包括佐剂的施用也不包括细胞因子（例如IL-7）的施用。然而，预防性免疫接种法还可包括将给各受试者施用这些化合物。
根据优选的方面，预防性免疫接种包括施用VP1蛋白或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质。VP1蛋白或其变体可作为五聚体（即以JCV衣壳体的形式）存在于预防性疫苗中。然而,优选地，VP1蛋白或其变体以病毒样颗粒(VLP)的形式存在于预防性疫苗中。VLP可由VP1组成或其还可包含其它JCV蛋白例如VP2和/或VP3。
以治疗性或预防性免疫接种方案对其施用本发明的蛋白质或肽的受试者具有遗传或获得性免疫缺陷，这意味着适应性或先天性免疫功能的几个方面是功能失调的或受损的。所述免疫缺陷可由遗传性功能障碍例如特发性CD4+淋巴细胞减少或Hyper-IgE-综合征引起，或归因于由疾病或病理学病况(如AIDS、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或乙型或丙型肝炎病毒感染)引起的获得性免疫缺陷。受试者还可以是因治疗干预而造成的免疫受损的。例如，癌症治疗通常涉及导致免疫系统的某些功能障碍的化学治疗或辐射过程。另外，通常用于移植医学以及还用于治疗自身免疫性疾病的免疫抑制治疗可促成待根据本发明治疗的受试者的免疫缺陷。
根据优选的实施方案，待利用本发明的肽或蛋白质治疗（通过预防性或治疗性治疗）的受试者正在经历免疫抑制治疗或将经历免疫抑制治疗。这意味着一旦主冶医生决定患者将通过施用免疫抑制剂治疗，就将可能给所述受试者施用一种或多种本发明的肽或蛋白质以防止PML和/或PML/IRIS的发展。这对于例如将接受器官移植的患者是特别有用的。
备选地，经历或适格进行免疫抑制治疗的受试者可以是患有自身免疫性疾病（优选特征在于T细胞起发病机理的作用或为免疫抑制的靶标的自身免疫性疾病）的患者。如本文中所用，自身免疫性疾病包括例如急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性心肌病、自身免疫性心肌病(autoimmunecardiomyopathy)、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴组织增生综合征、自身免疫性外周神经病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合征、自体免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、白赛病、乳糜泻、克罗恩病、皮肌炎、1型糖尿病、嗜酸性筋膜炎、胃肠道类天疱疮、古德帕斯彻氏综合症、格雷夫斯病、格林－巴利综合征(GBS)、桥本脑病、桥本氏甲状腺炎、红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、复发性多软骨炎、类风湿关节炎、干燥综合症、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、脉管炎和韦格纳肉芽肿。优选地，自身免疫性疾病是多发性硬化。在除MS外的自身免疫性疾病当中，其中
本发明的试剂盒的组分从而可用于给选自包含被诊断患有PML的受试者或处于发生PML的风险中的受试者的组的受试者施用。
处于发生PML的风险中的受试者在现有技术中是熟知的。这些受试者可用本发明的蛋白质和肽来预防性治疗。如上文所概述的，实例是免疫缺陷或免疫受损(例如，因HIV感染或AIDS而引起的或因肿瘤而引起的)患者。这样的患者还可具有先天性免疫缺陷，例如特发性CD4+淋巴细胞减少或Hyper-IgE-综合征患者。备选地，免疫系统可因目前正在进行的或计划进行的免疫抑制治疗而受损。患者可以适格进行免疫抑制治疗，例如他们具有自身免疫性疾病例如多发性硬化、类风湿关节炎、红斑狼疮、克罗恩病或银屑病，或当他们是移植患者（即已接受移植物或将要接受移植物的患者）时。具有获得性或先天性减弱的免疫状态(尤其是受损的CD4+T细胞数目和功能)的任何患者潜在地处于发生PML以及随后的PML-IRIS的风险中，如果要矫正所基于的免疫受损的话。
在本发明的情境中，免疫抑制治疗可以是例如利用环孢素或FK506结合蛋白，利用细胞毒性药物(例如环磷酰胺、米托蒽醌、白消安以及许多在血液学肿瘤或实体瘤的治疗中标准地用作单一药物疗法或组合疗法的其它药物)或利用免疫抑制或免疫调节性抗体例如选自包含那他珠单抗,依法珠单抗,利妥昔单抗,奥瑞珠单抗和阿仑珠单抗的组的单克隆抗体的治疗。免疫抑制治疗还可以是放射或化学疗法。
免疫抑制治疗优选包括利用一种或多种免疫抑制抗体，更优选一种或多种单克隆抗体或其它生物学、细胞疗法或基于小分子的治疗来治疗受试者。已显示免疫抑制治疗可导致PML和/或PML-IRIS，所述免疫抑制治疗为例如利用数种主要的用于癌症和自身免疫性疾病的单克隆抗体，包括那他珠单抗(抗-VLA-4)、依法珠单抗(抗-白细胞功能相关抗原-1)(已从市场撤回)、利妥昔单抗(抗-CD20)、奥瑞珠单抗(抗-CD20)、阿仑珠单抗(抗-CD52)或英夫利昔单抗(抗-肿瘤坏死因子(TNF)-α)或利用IgG1-TNF受体2融合蛋白依那西普的免疫抑制治疗。该风险可介由本发明被预防或减小。预期使某些免疫功能受损的其它生物制品或小分子（例如磷酸鞘氨醇受体1激动剂，芬戈莫德）可导致增加的发生PML/PML-IRIS的风险，所述免疫功能为例如活化的免疫细胞至CNS的迁移(在CNS免疫监督中)(如在那他珠单抗的情形中)，或将细胞捕捉在二级淋巴器官中(如在芬戈莫德的情形中)以及其它具有类似效果的。因此，优选的是待利用本发明的肽和蛋白质治疗(通过预防性或治疗性治疗)的受试者是目前利用一种或多种选自那他珠单抗,依法珠单抗,利妥昔单抗,奥瑞珠单抗和阿仑珠单抗的单克隆抗体或另一种免疫抑制剂(参见上文)治疗的受试者，或计划对其进行此种治疗的受试者。优选地，利用抗体那他珠单抗或其衍生物治疗所述受试者。
在优选的实施方案中，本发明涉及预防性或治疗性免疫接种，其包括给接受一种或多种上述免疫抑制抗体(优选地那他珠单抗)的受试者施用VP1蛋白或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质，例如以五聚体的形式或以包含VP1或VP1变体或由VP1或VP1变体组成的VLP的形式。
利用本发明的试剂盒治疗受试者对于已被诊断为JCV的携带者的受试者可以是特别有利的。然而,对于新近感染JCV的受试者也有显著地风险，例如在免疫抑制治疗过程中。因此如果未进行JCV感染的诊断或如果对JCV的测试是阴性的，则通过本发明的试剂盒对受试者进行抗JCV的免疫接种也是有利的。
优选地，给选自下组的受试者施用试剂盒或本发明的组分：
a)免疫受损或免疫缺陷受试者，例如HIV携带者，具有免疫抑制治疗的受试者或先天性免疫缺陷患者例如特发性CD4+淋巴细胞减少或Hyper-IgE-综合征患者;
b)适格进行免疫抑制治疗的受试者。
在一个方面，本发明涉及本文中描述的用于治疗PML（即用于治疗被诊断患有PML）的受试者的药物试剂盒。如由发明人令人惊讶地显示的，可介由本发明诱导对JCV的免疫，可从脑消除JCV并且可治愈(减少或消除)PML的症状。
本发明还涉及本文中描述的用于预防受试者的PML和/或PML-IRIS的药物试剂盒，所述受试者选自：
a)免疫受损或免疫缺陷受试者，例如HIV携带者，具有免疫抑制治疗的受试者或先天性免疫缺陷患者例如特发性CD4+淋巴细胞减少或Hyper-IgE-综合征患者；和
b)适格进行免疫抑制治疗的受试者。
免疫抑制治疗可以例如是被诊断患有自身免疫性疾病的受试者或移植患者的治疗。可在免疫抑制治疗之前、之后或期间给所述患者施用试剂盒的组分。特别地，如果免疫抑制治疗的开始不紧迫，在开始免疫抑制治疗之前介由本发明开始或加强针对JCV的免疫应答可以是有利的。然而,发明人已显示也可能获得足以治疗免疫受损个体的PML的对JCV的免疫应答。这是与经历免疫抑制治疗的受试者相似的情形。
在一些情况下，在本发明的免疫接种后的前几天或前几周(例如2天、5天、7天、14天或28天)或直至显示JCV从脑清除或PML的症状被治愈，减少或中断免疫抑制治疗可以是有利的。这可由医师根据患者的免疫状态和减少或中断患者的免疫抑制治疗的风险来决定。备选地或另外，可给受试者施用免疫刺激性治疗例如利用IL-7的治疗。
本发明还涉及治疗PML的方法和预防PML和/或PML-IRIS的方法，其中
a)给患者施用包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽，其中所述表位选自包含SEQ ID NO：1-92的组，和
b)任选地，给患者施用选自包含TLR-7激动剂和/或TLR-8激动剂的组的佐剂。
本发明还涉及包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽，其中所述表位选自包含SEQ ID NO：1-92的组。所述蛋白质或肽是适合用于本文中描述的本发明的试剂盒，从而合适用于制备所述试剂盒、添加佐剂的一个组分。
当前的发明人已显示公开的CD4+表位的生物关联性，并且第一个分离了由这些表位组成的肽。在本发明的情境中，表位可在MHC II的情境中被呈递（被抗原呈递细胞进一步加工或不加工），即术语表位涉及SEQ ID NO：1-92中公开的氨基酸序列，发明人已显示其能够诱导CD4+T细胞应答，并且不一定涉及可从MHC II分离的肽。
包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽(其中表位选自包含SEQ ID NO：1-92的组)可以是VP1或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质的融合蛋白，其还包含至少一个选自包含SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：46-76的组的表位。本发明的蛋白质或肽从而可包含来自超过一种天然JCV蛋白，例如来自2、3或4种JCV蛋白的表位。
如上所述，包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽(其中表位选自包含SEQ ID NO：1-92的组)可用于制备本发明的试剂盒，即用于对受试者进行抗JCV的免疫接种，例如用于治疗或预防PML或PML-IRIS。备选地，包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽(其中表位选自包含SEQ ID NO：1-92的组)可用于诊断JCV感染。特别地，其可被用于诊断PML,优选在利用其它方法例如症状分析和/或脑的MRI情境中。
本文中描述的蛋白质或肽非常适合用于诊断JCV感染和/或用于诊断PML的方法。本发明因此还涉及用于诊断JCV感染或用于诊断PML的方法，所述方法包括使来自受试者的样品与包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽接触，其中所述表位选自包含SEQ ID NO：1-92的组。
在一个实施方案中，在适合于来自样品的抗体与所述蛋白质或肽结合的条件下进行所述用于诊断感染的方法。如果检测到了抗体对样品的结合（例如通过ELISA），则受试者感染了JCV或已感染了JCV。
在优选的实施方案中，利用了本发明的蛋白质或肽包含CD4+表位的特征。可在适合用于检测样品中的CD4+T细胞对表位的存在的反应的条件下进行用于诊断感染的方法。例如，可使用用于T细胞的增殖测定（其可以例如测量3H-胸苷掺入、溴代-2’-脱氧尿苷(BrdU)的掺入），或用于活化标志物（例如CD25或一种或多种细胞因子）的表达的测定。可使用ELISPOT测定，但ELISA测定、闪烁测定或者细胞外或细胞内FACS也可以是适合的。用于通过包含所公开的表位的蛋白质或肽的CD4+活化的测定可提供关于JCV感染或受试者的免疫状态(当与PCR测试和/或针对JCV的抗体在来自患者的样品中的存在的测试组合时)的额外信息，或其可被用于替代现有技术中先前已知的此种测试。
在一个实施方案中，测试了CD4+ T细胞活化，并分析了CD4+T细胞的表型，例如测定了Th1、Th2或Th1/2表型。这可基于现有技术中已知的细胞因子的表达和/或基于其它分化标志物例如转录因子的表达来进行。
在本发明的情境中，待分析的(和通过该分析转化的)样品优选是血液样品、脑组织样品例如来自脑实质的样品或脑脊髓液(CSF)的样品(例如来自脑活组织检查或穿刺，或从其产生的)。例如，如果要分析T细胞活性，可通过本领域已知的方法从血液或CSF分离PBMC或T细胞。然而，发明人已显示优选分析来自脑组织例如脑实质的T细胞的T细胞活性。如果要分析抗体，可使用血清。
在本发明的优选实施方案中，受试者或患者是人。备选地，受试者或患者也可以是人源化动物例如在实验系统中对JCV易感的人源化小鼠。当受试者/患者是人时，本申请中提及的蛋白质，如果未另外特别提及，也优选是人或人来源的。例如，IL-7应当是人IL-7或能够结合IL-7受体并且介导其信号转导的其衍生物。其可以是重组IL-7例如以融合蛋白的形式。TLR也是人TLR。
认识到CD4+应答在对JCV的免疫应答中和从脑清除病毒中的重要性的发明人确定了多瘤病毒JC的免疫原性表位的位置。鉴定了来自JCV的3个开放阅读框的免疫显性肽。测试了一组覆盖JCV的所有开放阅读框的重叠肽中的肽，包括主要衣壳蛋白中的重要变体。所鉴定的CD4+T细胞表位可被用于诊断性检查JCV感染状态，但也可用于免疫接种患者/对照，例如具有弱的抗JCV的免疫应答(组成型地或因疾病(例如AIDS，组成型免疫缺陷例如特发性CD4+淋巴细胞减少)或治疗(癌症治疗、单克隆抗体疗法，例如MS中的那他珠单抗，以及其它疗法)而引起的)和处于发生PML的风险中或已发生PML的受试者。
发明人已确定了所有JCV蛋白的CD4+T细胞表位的精细特异性的图谱。检查了来自PML和PML-免疫重构炎性综合征(PML-IRIS)患者的脑活检组织的T细胞培养物和T细胞克隆。由于该免疫应答在其靶向病毒的最重要表位并且导致其(包括感染)消除的意义上具有保护性，因此来自测试健康对照和多发性硬化(MS)患者的外周血淋巴细胞的作图数据（但特别是来自表征PML-IRIS过程中脑浸润T细胞的抗原精细特异性的数据）支持用于诊断和免疫接种/治疗目的生物关联性和有用性。
此外，在本发明的过程中，于在64岁时发生PML的特发性CD4+淋巴细胞减少(一种罕见的组成型免疫缺陷)患者中进行了个体治愈尝试。在该患者中,发明人测试了利用完整主要衣壳蛋白VP1的免疫接种是否可在某些条件下使不充分的抗JCV免疫应答加强至可从脑消除JCV的情况。发明人通过皮下注射重组VP1蛋白与经皮肤施用的TLR7激动剂(咪喹莫特,Aldara)以及重组静脉内注射(i.v.)IL-7(Cytheris)的组合来免疫接种患者。患者不仅在仅2次免疫接种后显示抗JCV VP1的体外增殖反应，而且还使血清JCV病毒载荷减少至0，开始显示微小的对比增强(通过脑MRI成像)和略微升高的CSF细胞计数,以及最后临床上的逐渐改善，这全都支持免疫接种在体内是有效的。
下列实例意欲举例说明本发明，但不限定其范围。本文中引用的所有出版物为了所有目的整体并入本文。
图例
图1：a)针对JCV VP1/VLP蛋白和破伤风类毒素蛋白(TTx)测试了来自脑活检组织(左图框)、CSF(左二图框)和PBMC(左三图框)以及未处理的PBMC(右图框)的PHA扩增的大的单核细胞群体。结果显示平均SI±SEM。注意y-轴的不同标度。b)离体定量来自脑活检组织(左图框)、CSF(左二图框)、PBMC(左三图框)和未处理的PBMC(右图框)的PHA-扩增的CD4+T细胞中的Th1-、Th2-、Th17-和Th1-2细胞。数字代表阳性细胞的百分比。Th1被鉴定为CD4+IFN-γ+IL-17A-/IL-4-；Th17细胞被鉴定为CD4+IL-17A+IFN-γ-；Th2被鉴定为CD4+IL-4+IFN-γ-，以及Th1-2被鉴定为CD4+IFN-γ+IL-4+。
图2：a)源自脑的PHA-扩增的细胞抗204个重叠15元肽的增殖反应，所述肽覆盖JCV的所有开放阅读框(涵盖Agno,VP1,VP2,VP3,大-T和小-T蛋白并且被组织在各5个肽的41个库。结果显示平均SI±SEM。条形的不同模式对应于不同开放阅读框。JCV基因组中的5个开放阅读框的图示(右手上方的图)。b)源自脑的大的单核细胞群体抗单个JCV肽的增殖反应。结果显示平均SI±SEM。注意图框a和b中y-轴的不同标度。c)特异于诱导来自脑活检组织的PHA-扩增的细胞中最强增殖反应的5个JCV肽的T细胞的前体频率。d)结合HLA-A*02:01-VP136四聚体(中图)和HLA-A*02:01-VP1100四聚体(下图)的CD8+T细胞的百分比。
图3：a)显示脑活检组织中每一种个体TCC的频率的圆环图。b)抗64个个体VP1肽的TCC的增殖反应。结果显示平均SI±SEM。c)对于脑来源的大群体(上图，显示平均SI±SEM)和对于不同TCC(下图，不同模式对应于不同TCC并且每一个单个细胞生长培养物用方块来表示)鉴定的免疫显性肽的图示。
图4：a)Th1-2(上图)和Th1(下图)VP1/VLP-特异性CD4+T细胞克隆的细胞内IFN-γ和IL-4产生的代表性流式细胞术分析。b)点图表示通过细胞内细胞因子染色显示的具有Th1-2和Th1表型的VP1-特异性脑来源的单细胞培养物的百分比。每一个点对应于21个所分析的单细胞培养物之一。圆环图表示每一个TCC的功能表型。c)在用PHA刺激后72h，Th1-2 TCC(n=5,黑色条形)和Th1 TCC(n=6,白色条形)的培养上清液中IFN-γ和IL-4产生的ELISA检测。结果显示平均值±SEM。d)Th1-2 TCC(n=5,黑色条形)和Th1 TCC(n=6,白色条形)的转录因子Gata3和t-bet的RT-PCR分析。值是相较于脑来源PHA-扩增的细胞(校准物=1)的相对表达。结果显示平均值±SEM。
图5：利用VP1免疫接种免疫受损的受试者的治疗方案。M=月,D=天,W=周,MRI=磁共振成像。在VP1施用后直接施用佐剂(咪喹莫特)。
图6：治疗过程中VP1免疫应答的发展。VLP1=由VP1蛋白构成的病毒样颗粒1，TT=破伤风类毒素。
图7：治疗过程。图7A显示VP1刺激后的病毒载荷和平均SI，图7B显示CSF中的白细胞计数。IL-7和VP1的施用时间点相同并且对应于图5中显示的安排。
图8：VP1-特异性T-细胞的表征。仅CD4+细胞在VP1刺激后(免疫接种后6周)增殖。
图9：增殖的CD4细胞是活化的记忆细胞。
图10：VP1活化的CD4+T细胞表达高背景的IL-4并且在VP1刺激后产生IFN-γ。在第0天用抗原刺激CD4+ T细胞。在第6天，用抗原再刺激它们，1小时后，用布雷菲德菌素A阻断分泌，15h后，进行细胞内细胞因子染色并且通过FACS进行分析。
图11：3H-胸苷掺入测定。在所示的时间点上，从患者获得外周血单核细胞(PBMC)，将其与抗原(VP1/VLP)一起新鲜地接种(1x10e5个细胞/孔)。在7天的温育后，测量3H-胸苷掺入。大于2的刺激指数被认为是阳性反应。SI示于图的y-轴上。
实施例1　免疫显性CD4+表位的鉴定
材料和方法
患者
HLA-类II型：DRB1*13:01,-*16:01；DRB3*02:02；DRB5*02:02；DQA1*01:02,-*01:03；DQB1*05:02,-*06:03(患者1)；和DRB1*11:03,-*15:01；DRB3*02:02；DRB5*01:01；DQA1*01:02,-*05:XX(X表示未分类至确切亚型)；DQB1*03:01,-*06:02(患者2)。
神经病理学
通过打开活检获得总体积约0.1ml的小的组织碎片。在于缓冲的福尔马林中固定2小时后，将组织包埋在石蜡中。用苏木精-伊红(H&E)、van Gieson氏三色染色、PAS、Turnbull’s染色(针对siderin和Luxol)对4μm的切片机切片进行染色。按照制造商的说明书，使用下列抗体在自动化Ventana HX IHC系统,benchmark(Ventana-Roche Medical systems,Tucson,AZ,USA)上进行免疫组织化学染色：抗-CD45/LCA(DAKO,Glostrup,丹麦；M701)、抗-CD3(DAKO；M1580)、抗-CD45R0(DAKO；M0742)、抗-CD20(DAKO；M0755)、抗-CD79a(DAKO；M7050)、抗-CD68(Immunotech/Beckmann-Coulter,Krefeld,德国,2164)、抗-HLA-DR(DAKO；M775)、抗-NF(Zymed/Invitrogen,Darmstadt,德国,80742971)、抗-GFAP(DAKO；Z334)和抗-p53(DAKO；M7001)。
脑组织处理和脑来源、CSF来源的和外周血单核细胞的扩增
将约0.033ml的活检组织切成小块2，通过在37℃水浴中于包含1mg/ml胶原酶A(Roche Diagnostics,Penzberg,德国)和0.1mg/mlDNA酶I(Roche)的溶液中温育45分钟来进行破裂。将所产生的细胞悬浮物洗涤3次，使用Percoll密度梯度离心(GE Healthcare,Munich,德国)分离脑来源的单核细胞。将细胞重悬浮于30%的Percoll溶液中，利用78%Percoll溶液来小心地进行底层化。离心后，从梯度的界面收集脑来源的单核细胞。
CSF-来源的单核细胞直接从诊断性脊椎穿刺术获得，外周血单核细胞通过Ficoll密度梯度离心(PAA,Pasching,澳大利亚)来分离。
通过以每孔2000个细胞与2x105个受辐射的非自体PBMC(3,000rad)和1μg/ml的PHA-L(Sigma,St Louis,MO)一起接种来在96孔U形底微量滴定板中来扩增脑-、CSF-和外周血-来源的单核细胞。培养基由含有100U/ml青霉素/链霉素(PAA)、50μg/ml庆大霉素(BioWhittaker,Cambrex)、2mM L-谷氨酰胺(GIBCO,Invitrogen)和5%热去补体的人血清(PAA)的RPMI(PAA)组成。24h后，添加20U/ml人重组IL-2(hrIL-2,Tecin,Roche Diagnostics)，且每3-4天添加额外的hrIL2。两周后，将细胞混合，进行分析，冷藏保存或再次用1μg/ml PHA,20U/ml hrIL-2和异体被辐射的PBMC再刺激。
脑来源的单核细胞的流式细胞术分析
用下列抗体对直接来自脑消化的脑来源单核细胞的表面标志物进行染色：CD45(AmCyan,2D1,BD Pharmingen,San Diego,USA)、CD56(Alexa488,B159,BD Pharmingen)、CD3(PeCy7,UCHT1,eBioscience,San Diego,USA)、CD4(APC,RPA-T4,eBioscience)、CD8(PB,DK25,Dako,Glostrup,丹麦)、CD45RO(FITC,UCHL1,eBioscience)、CD19(FITC,HIB19,BD Pharmingen)、CD38(APC,HIT2,BD Pharmingen)和CD27(APC-Alexa750,CLB-27/1,Invitrogen)。在a3LSRII(BD Biosciences,Heidelberg,德国)流式细胞仪上进行分析。
蛋白质和肽
为了鉴定JCV-特异性T细胞，应用了204个涵盖整个JC病毒蛋白质组的(13-16元)肽。由pe(肽和象GmbH,Potsdam,德国)合成和提供肽。这204个肽以5个氨基酸重叠并且包括35个常见单氨基酸突变。为了说明在不同JCV基因型和株系中发生的氨基酸变异，将来自可在GenBank(到2008年3月为止)获得的全部479个JCV基因组序列的每一个JCV编码的蛋白质(包括Agno,VP1,VP2,VP3,大T抗原和小t抗原)的氨基酸序列进行比对，将在超过1%的所有获取的序列中普遍存在的那些多态型被定义为常见突变。
为了确定哪个个体肽被CNS-来源的T细胞识别，使用二维接种方案。将肽排列在一组82个库中，其中每一个库包含5种不同的肽。通过不同的肽根据矩阵在每个孔中的组合以及每一个个体肽出现在正好两个库中（所述库中其余的肽不同），可在阳性库的交集处鉴定免疫原性候选肽。
JCV VP1蛋白形成病毒样(VLP)颗粒，因此VP1和VLP用作可互换的术语。如先前所述(Goldmann等人,1999)，由Life ScienceInkubator,Bonn,德国产生形成VLP(VP1/VLP)的VP1蛋白。由PEPScreen,Custom Peptide Libraries,SIGMA合成和提供具有10个氨基酸的重叠并且覆盖MBP(16个肽)、MOG(25个肽)和PLP(27个肽)的20元鞘磷脂肽。破伤风类毒素蛋白(TTx)(Novartis Behring,Marburg,德国)被用作阳性对照。
增殖测定
通过将每孔2-2.5x104个脑来源、CSF来源或外周血来源的PHA-扩增的细胞和1x105个受辐射的自体PBMC与肽一起或不与肽一起，以一式二份接种在96孔U形底微量滴定板中进行72小时来测试JCV肽、VP1/VLP和TTx的识别。在7天的原代增殖(primary proliferation)中以2x105个细胞/孔测试未处理的PBMC。除了TTx以外，还添加PHA-L刺激作为阳性对照。以2μM/肽的终浓度(对于库中的肽)和以10μM的浓度(对于个体肽)在库中或作为个体肽来测试所有JCV肽。以2μg/ml测试VP1/VLP，以5μg/ml测试破伤风类毒素蛋白(TTx)，以1μg/ml测试PHA。在β闪烁计数器(Wallac1450,PerkinElmer,Rodgau-Jürgesheim,德国)中通过3H-胸苷(Hartmann Analytic,Braunschweig,德国)掺入测量增殖。刺激指数(SI)计算为SI=平均cpm(每分钟计数)(肽)/平均cpm(背景)。当SI>3,cpm>1000并且高于平均背景cpm至少3个标准差(SD)时，反应被认为是阳性的。
如上所述，以5μM作为个体肽测试了髓磷脂肽。
脑来源的VP1/VLP-特异性T细胞克隆的产生
将2.5x104个脑来源的PHA-扩增的细胞和1x105个受辐射的自体PBMC与VP1/VLP蛋白一起或不与所述蛋白一起接种在96孔U形底微量滴定板中。在48小时的培养后，将板分成母板和子板。通过甲基-3H-胸苷掺入检测子板中的增殖。在母板中鉴定VP1/VLP-反应性培养物，每3-4天添加IL-2直至第12天。通过在有限稀释条件下以0.3和1个细胞/孔将来自VP1/VLP-反应性细胞的细胞接种在96孔U形底微量滴定板中，和添加2x105个受辐射的异体PBMC和1μg/ml的完全RPMI中的PHA-L来从阳性培养物建立T细胞克隆(TCC)。24h后，添加20U/ml的人重组IL-2。随后通过将2.5x104个来自正在生长的集落的细胞与受辐射的自体PBMC一起在VP1/VLP蛋白存在或不存在的情况下接种，进行72h来确认VP1/VLP特异性。利用1μg/ml PHA-L、20U/ml hrIL-2和受辐射的异体PBMC每2周再刺激特定培养物，每3-4天添加hrIL2。
TCR分析
通过22种抗TCRBV单克隆抗体(Immunotech,Marseille,France,(Muraro等人,2000))与CD4(APC,eBioscience)和CD8(PB,PB,DakoCytomation,丹麦)的组合来评价PHA-扩增的细胞和T细胞克隆的TCR Vβ链表达。
CNS来源单核细胞中前体频率的测定
通过有限稀释测定VP1/VLP-特异性细胞的频率。将20、200、2000或20000个脑来源PHA-扩增的细胞与1x105个受辐射的自体PBMC在VP1/VLP蛋白存在或不存在的情况下以一式四份接种在96孔U形底微量滴定板中。72小时后，通过甲基-3H-胸苷掺入测量增殖。如先前所述(Taswell,1981)计算频率。观察到的数据是：r，阴性反应培养物或每一个剂量i的孔的数目；n，每剂量i的孔的总数，和λ，剂量i中的细胞数目。计算的数据是：pi=ri/ni，每一个剂量i的阴性反应物培养的分数。使用下列公式计算频率：f=-(ln pi)/λi。
细胞因子的产生
对于细胞内细胞因子染色，在最后一次再刺激后12天分析PHA-扩增的细胞和TCC。在布雷菲德菌素A(10μg/ml,eBioscience)存在的情况下利用PMA(50ng/ml,Sigma)和离子霉素(1μg/ml,Sigma)刺激细胞，进行5h。随后，用
Figure BDA0000470271930000221
Fixable Dead Cell Stain试剂盒(AmCyan,Molecular Probes,Invitrogen)对细胞进行染色，将其固定，并用相应的缓冲液(eBioscience)进行渗透化，在室温下对CD3(PE,DakoCytomation,丹麦)、CD8(PB,DakoCytomation,丹麦)、IFNγ(FITC,BDPharmingen)、IL-4(PE-Cy7,eBioscience)和IL-17A(AlexaeBioscience)进行染色。IFN-γ-、IL-4-和IL-2水平还可按照制造商的方案(Biosource,Camarillo,California)通过ELISA在用PHA或VP1/VLP再刺激后72小时、在PHA-扩增的细胞的培养上清液中以及TCC中进行测定。
通过RT-PCR定量mRNA表达水平
对于mRNA基因表达测定，引物和探针组(Tbet,Hs00203436_m1和Gata3,Hs00231122_m1)购自Applied Biosystems(Foster City,CA)。18S rRNA用作内源性对照，相对基因表达使用脑来源PHA-扩增的细胞作为校准物，通过△△Ct法来计算。
VP1/VLP-特异性抗体的ELISA
如先前所述(Weber等人,1997)测定来自两个IRIS-PML患者的CSF和血清的VP1/VPL-特异性免疫球蛋白G抗体的滴度。简而言之，用100ml VP1-VLP(1mg/ml)涂覆ELISA板，利用CSF或血清的系列稀释物温育所述板。通过缀合有生物素的抗-人Fc抗体(eBioscience)捕获人IgG，并通过抗生物素蛋白辣根过氧化物酶(eBioscience)进行检测。针对特定隔室中的IgG的总量调整CSF以及血清中的抗体滴度。结果表示为任意单位，使用总是相同的人血清作为标准对其进行标准化。
HLA-A*0201/JCV VP136和VP1100四聚体以及四聚体染色
如先前所述合成HLA-A*02:01四聚体复合物。简而言之，使HLA-A*02:01、β2微球蛋白和表位肽重折叠，使用尺寸排阻层析分离所述蛋白。通过将BirA靶序列添加至HLA-A*0201分子的最后一个C末端胞外结构域来实现位点-特异性生物素化。使用Extravidin-PE(Sigma)产生四聚体复合物。使用抗-CD2/CD3/CD28MAC珠粒(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)刺激PHA-扩增的脑浸润性细胞，刺激后第5天，洗涤细胞，将其重悬浮至5x106个细胞/ml的浓度。利用3μl PE偶联的四聚体HLA-A*02:01/JCV VP136或HLA-A*02:01/JCVVP1100对100μl进行染色。在37℃温育30分钟后，洗涤细胞，用抗-CD3(PB,eBiolegend,San Diego,CA)和抗-CD8(FITC,Dako)在冰上再染色30分钟。随后洗涤细胞，用0.5%多聚甲醛固定，随后利用流式细胞术进行分析。
结果
那他珠单抗-相关PML-IRIS的两个病例
分别在2009年7月和2010年1月提供的具有复发-缓和MS(RR-MS)的两名41和43岁的男性患者在分别进行28和40个月的那他珠单抗治疗后具有临床迹象(患者1，视场缺损；患者2，单肢轻瘫)和怀疑为PML的影像学表现。立即停止那他珠单抗，进行数轮血浆去除术。两名患者随后都发生了在MRI上具有对比增强的斑状或带状区域的PML-IRIS(图1a)和恶化的临床表现（患者1的视力的完全丧失，患者2发生偏瘫、偏盲和神经心理学恶化）。关于诊断性检查，基于CSF JCV病毒载荷（虽然其是低的）患者1立即被诊断为PML。患者2的诊断更为复杂，其有CSF JCV病毒载荷的反复阴性PCR结果，直至第三次测试才为正好高于阈值水平的阳性；12个拷贝(NIH参照实验中阈值为10个拷贝)。与低或临界JCV CSF病毒载荷相反，在本研究中建立的血清和CSF中JCV主要衣壳蛋白(VP1/VLP)-特异性抗体的抗体测试显示强鞘内抗体反应，在将总的IgG浓度调整至相同水平后CSF中的VP1/VLP-特异性抗体滴度与血清中的相比为95-180倍更高。因此，与病毒DNA的PCR测试不同，鞘内抗体反应使得患PML-IRIS时CNS被JCV感染没有疑问。患者2的IgG亚类分析显示鞘内抗体主要是IgG1和IgG3。这些数据显示出局限于CNS隔室并且主要针对主要结构JCV蛋白VP1/VLP的强JCV-特异性体液免疫应答。抗体反应的小的组分是否靶向其它JCV蛋白仍待研究。
由于诊断PML的上述困难，患者2经历了诊断性脑活组织检查来确认或否定PML。神经病理学检查未显示PML的典型迹象，即染色深的少突胶质细胞中的核包涵体和奇形怪状的星形细胞，而非CNS细胞的缺少和大量血管周和实质淋巴单核细胞浸润,与星状星形细胞的反应性胶质增生和泡沫状巨噬细胞的弥散性和破坏性实质浸润的突出。大部分细胞染色呈HLA-DR阳性，这通常仅在活化的小神经胶质细胞中见到并且不存在于正常脑组织中。T细胞和B细胞存在于浸润中，高比例的后者染色呈浆细胞标志物CD138阳性。处理部分活检组织，也通过流式细胞术表征CNS来源的单核细胞。96.5%的细胞表达泛造血细胞标志物CD45(未显示)，并且其中有42.4%表达泛T细胞标志物CD3+。这些当中有24.1%是CD8+，且70.4%是CD4+T细胞。几乎所有这些细胞都表达记忆标志物CD45RO。29%的CD45+CNS浸润性细胞表达B细胞标志物CD19，在这些当中有86.1%是CD27/CD38阳性的，即它们是记忆B细胞/浆细胞。因此，诊断为炎性脱髓鞘病而非PML。对于JCV的随后免疫组织化学分析是阴性的，但通过原位杂交的第二次尝试发现了JCV DNA的零星核信号(数据未显示)，这与低JCV病毒载荷和强鞘内抗体反应一起确认了PML的最初怀疑并且指向IRIS而非基于的脱髓鞘病促成神经病理学发现。
脑浸润性T细胞的抗原特异性
随后表征了脑浸润性T细胞的抗原特异性和频率。首先通过无偏刺激(PHA)将脑来源单核细胞扩增为大群体。虽然我们的培养条件相较于CD8+T细胞更有利于CD4+的表达，但CD4+T细胞的相对组成保持稳定，如通过利用针对T细胞受体(TCR)可变链Vβ1-Vβ22的单克隆抗体的染色所显示的。由于脑活组织检查时记忆CD4+几乎超过CD8+T细胞3倍，因此我们将注意力集中在CD4+T细胞上，并且评价它们针对JCV的特异性。为了该目的，在增殖测定中针对重组JCV衣壳蛋白VP1/VLP和针对破伤风毒素蛋白(TTx)测试扩增的脑T细胞。我们直接将脑来源的与CSF-或外周血-来源的T细胞以及与未处理的外周血单核细胞进行比较。如图1a中显示的，脑来源的T细胞针对VP1/VLP蛋白以大于600的刺激指数(SI)作出反应，而对针对TTx无反应。CSF中针对VP1/VLP和TTx的SI分别为7和14，在PHA-扩增的PBMC中，针对VP1/VLP和TTx的反应分别是阴性的和中度阳性的(SI为6.5)。未处理的PBMC在7天的原代增殖测定中显示对TTx的反应显著强于对VP1/VLP的反应。
脑浸润性CD4+T细胞的功能表型
发明人随后基于它们的细胞因子分泌模式检查大脑内CD4+T细胞是否属于主要T帮助细胞(Th)亚型Th1、Th2或Th17细胞之一。通过针对Th1-、Th2-和Th17细胞的标志细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17的细胞内细胞因子染色检查了来自脑、CSF和PBMC以及未处理的OBMC的扩增的大的T细胞群体。IL-17产生性细胞几乎不可检测(图1b)，而IFN-γ分泌性细胞构成46.1至53.2%的来自脑和CSF的细胞(图1b)。当结合IFN-γ和IL-4的细胞内染色时，情况显著不同。在脑和CSF来源的群体中，Th1-、Th2-和双功能Th1-2细胞(分泌IL-4和IFN-γ二者)在频率上相似(图1b)，而Th2细胞在外周血来源的PHA-扩增的细胞中占据优势(图1b)。32.7%的脑来源CD4+T细胞具有双功能Th1-2表型。
脑浸润性T细胞的精细特异性
为了确定哪个特异性JCV肽被脑浸润性T细胞识别，合成204个淘选所有JCV蛋白(Agno,VP1,VP2,VP3,大-T和小-T)的15元肽，将其分配在一组82个库中，其中每一个肽出现2次，但在两个不同的库中(参见方法)。脑来源的T细胞对多个库有响应(图2a；库1-41)。发明人鉴定了15个免疫原性候选肽，随后单个地测试所述候选肽，使得鉴定出11个刺激性肽(SI大于10的肽)(图4b)。反应是针对肽4(Agno25，数字表示15元肽的第1个氨基酸(aa))、20(VP134)、23(VP154)、27-29(VP174)(所有VP174肽；28和29是具有单氨基酸突变的肽27的变体)、72(VP1310)、73(VP1319)、76(VP1335)、191(LTAg668)和195(sTAg82)(对具有大于25的SI的肽加以粗体)的。因此，脑来源的T细胞对数种JCV蛋白(Agno,VP1,LTAg,sTAg)有响应，然而，针对VP1(6个肽)的反应迄今最强。所述VP1是主靶获得了下述的支持：针对完整VP1/VLP蛋白(图1a)的反应甚至更强并且当与响应于Agno25(1/14492)和LTAg668(1/1449)的细胞相比较时以更高的VP1-特异性T细胞的前体频率反应(响应于肽VP134、VP1319和VP174的T细胞的1/294至1/714)（图2c)。当发明人检查PHA-扩增的CSF-和外周血来源的T细胞时，CSF仅产生弱的针对库39和该库中包含的肽LTAg668的反应，PBMC是阴性的。显著地，肽VP134(在SI(图2b)和前体频率(图2c)方面引发最强反应的肽)包含JCV表位VP136（其是与VP1100一起在HLA-A*02:01的情境中被HLA-类I-限制的CD8+T细胞识别的两个表位之一）(Du Pasquier等人,2003b)。PML-IRIS患者2是HLA-A*02:01+(在方法下，HLA-类I和-类II型)，因此，发明人通过四聚体染色测定了PHA-扩增的脑浸润性CD8+T细胞中对于这两个HLA-A*02:01JCV表位是特异性的CD8+T细胞的频率。0.8%的PHA-扩增的脑浸润性CD8+T对于VP136是特异性，0.6%对于VP1100是特异性的(图4d)。关于HLA-类II，患者2表达MS相关HLA-DR单体型DRB1*15:01和DRB5*01:01。当VP1/VLP蛋白被来自DRB1*15:01/B5*01:01纯合供体的APC呈递时，JCV-特异性CD4+T细胞应答受到DRB1*15:01/B5*01:01的很大限制(未显示)。这些数据显示，与鞘内抗体相似，CD4+T细胞反应主要针对主要结构JCV蛋白VP1，并且肽VP134包含针对病毒特异性CD4+和CD8+T细胞二者的表位。先前已对流感核蛋白肽显示了CD4+和CD8+T细胞对相同免疫显性表位的这种集中性(Carreno等人,1992)。
表1显示由发明人鉴定的免疫显性CD4+T细胞表位。
由于PML的特征在于少突胶质细胞裂解和鞘磷脂的释放以及由于患者患有MS，因此有趣地检查脑来源T细胞是否响应于鞘磷脂蛋白。针对覆盖主要鞘磷脂蛋白、鞘磷脂碱性蛋白(MBP)、含蛋白脂蛋白(PLP)和鞘磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的重叠肽测试了PHA-扩增的脑来源T细胞，但尽管存在针对JCV VP1/VLP蛋白的强反应，没有一种髓磷脂肽被识别。
表1：免疫显性JCV表位的列表。显示了JCV肽的氨基酸序列和长度。各肽的位置与参照JCV基因组NC_001699的相应蛋白质相关。具有氨基酸突变的肽被称为变体(V1、V2等)。仅被从脑分离的T细胞克隆识别的肽通过粗体来标记。其它肽被外周T细胞克隆识别。
Figure BDA0000470271930000271
Figure BDA0000470271930000281
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JCV-特异性CD4+T细胞克隆的精细特异性和功能表型
先前的数据已显示基于某些转录因子的表达，CD4+分化成某些T帮助细胞表型例如Th1细胞(IFN-γ产生者)、分泌IL-17的Th17细胞、表达标志细胞因子IL-4的Th2细胞或T调节性细胞(Zhu等人,2010)。成为Th1或Th2细胞的分比被认为是相互排斥的并且受转录因子T-bet(Th1)和Gata-3(Th2)控制(Zhu等人,2010)。基于这些数据，我们发现具有双功能(Th1-2)表型的定型记忆细胞是高度出人预料的，我们因此建立了VP1/VLP-特异性T细胞克隆来在克隆水平上检查这点。如材料和方法中所述产生了VP1/VLP-特异性TCC。最初，通过有限稀释产生21个VP1/VLP-特异性单细胞来源的培养物，就TCRVβ表达、功能表型和精细特异性而言对其进行表征(表2)。该表征允许鉴定11种假定的不同的TCC。对应于每一个TCC的单细胞生长培养物的数目提供了关于每一种TCC在脑浸润性中的频率(图3a)。TCC-4是最丰富的，并且由5个从单个生长孔出现的集落代表，其次是TCC-2(具有3个单细胞生长培养物)、TCC-1、-8、-9和-10(具有2个单细胞生长培养物)和最后是TCC-3、-5、-6、-7和-11(仅具有1个单细胞生长培养物)。11种TCC的精细特异性概述于图5b中。针对64个覆盖VP1蛋白的15元肽测试每一种TCC，使得鉴定了下列刺激性肽：VP134(被TCC-1和-2识别)、VP154(被TCC-3识别)、VP174(所有VP174肽、被TCC-4识别)、VP191(被TCC-5识别)、VP1143(被TCC-6识别)、VP1229(被TCC-7识别)、VP1319(被TCC-8和-9识别)和VP1335(被TCC-10和-11识别)。考虑到识别特定肽的不同TCC的数目以及每一种TCC在脑浸润中的频率，被VP1特异性脑浸润性TCC识别的免疫显性肽是VP134、VP174、VP1319和VP1335，这确认了使用脑来源的大的细胞群体获得的精细特异性(图3c)。这些TCC的细胞内细胞因子染色揭示了Th1-2和Th1表型(图4a)。代表57%的脑来源VP1特异性单细胞生长培养物的5种TCC显示Th1-2表型，而代表43%的脑来源VP1-特异性单细胞生长培养物的6种TCC显示Th1表型(图4b)。特异性与功能表型不相关。对于免疫显性肽中的三个肽(VP134、VP1319和VP1335)，我们发现具有两种表型的TCC。Th1-2和Th1TCC的T帮助细胞表型通过利用ELISA测量IL-4和IFN-γ蛋白分泌以及通过测定转录因子Gata3和T-bet的mRNA的表达来确认。Th1-2TCC(n=5)，除IFN-γ外还分泌IL-4，而IL-4分泌在Th1TCC中几乎不可检测到(n=6)(图6c)。细胞因子分泌特征谱不是因PHA的刺激导致的，因为在用VP1/VLP蛋白特异性刺激后，通过细胞内细胞因子染色或来自培养上清液的ELISA测量，观察到了相同的稳定模式。转录因子表达确认了TCC的表型。Th1-2TCC(n=5)表达Gata3和T-bet的mRNA，而Th1TCC(n=6)仅表达t-bet(图6d)。
讨论
PML的病毒病因学几乎在40年前就已显示，但关于控制JCV感染的免疫机制仍然了解相对少。CD8+JCV-特异性细胞毒性T细胞被与从PML的恢复相关联(Du Pasquier等人,2004a；Koralnik等人,2002)，并且已在HLA-A*02:01-阳性个体中鉴定了两个病毒表位(Du Pasquier等人,2004a；Du Pasquier等人,2004b)。相反地，关于PML中的JCV-特异性CD4+T细胞的精细特异性和特征可获得的信息有限，对于PML-IRIS可获得的所述信息甚至更少(Jilek等人)。感染位点（即CNS实质）处的病毒特异性T细胞反应根本未被检查。
发明人的数据给本主题提供了新的洞察，并且引导他们提出下列在那他珠单抗治疗下的PML-IRIS过程中的发病机制事件。抗-VLA-4抗体在免疫豁免位点例如脑通过阻断细胞迁移(Stuve等人,2006)和CNS中的局部抗原呈递(del Pilar Martin等人,2008)来抑制JCV感染的免疫监督。因此，病理性向神经JCV变体可因仍未明了的原因在少数(1/500-1/1000)被治疗的MS患者中导致PML(Major,2010；Ransohoff,2005)。一旦PML被怀疑并且那他珠单抗被终止或通过血浆交换术主动除去，那么具有完全功能性和活化的T细胞区域重获向CNS隔室的进入，引发对于PML-IRIS来说是非常典型的强炎症并且通过许多机制(包括CD4+和CD8+T细胞以及抗体形成性浆细胞)有效地消除病毒感染的细胞。
表2VP1特异性脑浸润性T细胞克隆(TCC)的表征
Figure BDA0000470271930000321
在CNS-浸润性T-和B细胞当中，具有Th1-或上述双功能Th1-2表型的CD4+T细胞基于下列发现可能是最关键的元素。它们的Th1-(IFN-γ)和Th2(IL-4)细胞因子的平行分泌有可能解释HLA-类II分子不仅在居留细胞例如病毒感染的星形细胞和小神经胶质细胞上而且还在浸润性免疫细胞上的表达，因为IFN-γ是HLA-类II的最强诱导者。虽然因材料的缺乏而不能进行HLA-DR与星形细胞标志物例如GFAP的共定位研究，但HLA-DR的广泛表达强力表明这些也是阳性的。与MS及其动物模型实验性自身免疫性脑炎(EAE)(其中已显示了迁移T细胞的局部再活化)类似，JCV-特异性Th1-2以及还有Th1细胞可能通过识别经JCV-感染的HLA-类II阳性星形细胞、小神经胶质细胞/巨噬细胞或招募的树突细胞(DC)上的JCV肽被局部再活化。此外，大量IL-4的分泌导致CNS隔室中记忆B细胞/成浆细胞的活化和扩增，结果是病毒特异性抗体的分泌。局部产生的JCV衣壳蛋白(VP1)-特异性IgG抗体可识别被病毒感染的少突胶质细胞，随后所述细胞可通过补体或抗体介导的细胞的细胞毒性被裂解。CSF中IgG1和IgG3抗体(其以高亲和力结合补体并且已在其它病毒感染的情境中被描述)的相对增加支持该想法。由于被感染的少突胶质细胞不表达HLA-类II,但有效地表达HLA-类I，因此可预期JCV-特异性、HLA-A2-限制的CD8+细胞毒性T细胞(Koralnik等人,2001)(Koralnik等人,2002)也通过杀死JCV-感染的少突胶质细胞和/或星形细胞起作用。具有PML的AIDS患者的外周血中的这些先前描述的细胞也可能参与脑中JCV的局部消除得到了我们对特异于JCV VP136和JCV VP100(如通过肽加载的HLA-A*02:01四聚体定义的)的CD8+T细胞的观察的支持。感染的星形细胞可以不仅用作CD4+病毒特异性T细胞的局部抗原呈递细胞，而且还可被Th1-2溶细胞性细胞杀死(Hemmer等人,1997)，而这与星形细胞的DR表达的问题一起需要进一步研究。
上述发病机制方案解释了IFN-γ-和IL-4的作用,即HLA-类II分子在脑中的广泛表达以及抗JCV的强鞘内抗体反应，然而，仍然令人困惑的是大部分脑浸润性细胞显示Th1-2表型。先前，这些细胞被称为Th0细胞，并且被认为是幼稚细胞发育成定型为Th1或Th2谱系的记忆细胞之前的中间分化步骤(Mosmann和Coffman,1989)。然而，基于下列单个克隆的细胞因子模式，该想法很早就受到争议(Kelso,1995)。今天，Th1-和Th2细胞被理解为相互排斥的命运(Ansel等人,2006)。然而,具有双重细胞因子分泌的个体TCC已在麻疹病毒感染中被描述为Th0细胞(Howe等人,2005)和在MS的基于改变的肽配体的疗法过程中被描述为在恶化疾病自体反应T细胞之中(Bielekova等人,2000)。发明人当前基于细胞内细胞因子染色、细胞因子分泌和转录因子表达的稳定的Th1-2克隆的观察，指向CNS中确定的T帮助细胞亚群体而非中间或短暂的分化阶段。由于Th0细胞的上述不清楚的作用和关于它们作为终末分化细胞存在的先前争论，我们在此处提出将IFN-γ/IL-4T帮助细胞称为双功能Th1-2细胞。导致该Th1-2分化的情境和信号需要进一步研究。在最近公开的病毒感染模型的研究中，作者显示非保护性Th2可通过抗原-特异性TCR信号、I型和II型干扰素和IL-12的协调作用被转化成稳定地表达IFN-γ/IL-4的保护性CD4+细胞(Hegazy等人,2010)(Zhu和Paul,2010)。发明人的发现是在人中体内存在稳定的GATA-3+T-bet+和IL-4+IFN-γ+Th2+1表型的第一个证据。可以想象这些细胞在脑中被重编程，并且它们可很好地解释PML-IRIS的异常强的免疫应答和暴发过程。
关于脑浸润性T细胞的精细特异性，发明人的数据在数个方面是有趣的。JCV-特异性T细胞反应总体上是广泛的，因为来自几乎所有JCV蛋白的肽被识别，这与发明人的确定JCV的针对健康供体和MS患者的外周血来源的CD4+T细胞的免疫显性表位的图谱的努力一致。然而，超过50%的被脑来源CD4+T细胞识别的肽是主要结构蛋白VP1的部分。此外，VP1-特异性T细胞在增殖的强度和前体频率方面占优势。特别吸引人的是VP134-48不仅包含针对细胞毒性HLA-A*02:01-限制的CD8+T细胞的主要表位(Du Pasquier等人,2003b)(发明人也通过四聚体染色在PML-IRIS患者的脑中发现了所述表位)，而且还包含针对HLA-DRB1*15:01/DRB5*01:01-限制的CD4+T细胞的主要表位。此外，肽VP174和具有单个氨基酸置换的其两个变体的识别表明，该表位的识别可与在持续的JCV感染过程中保护宿主免于免疫逃避相关。这已在先前对于人免疫缺陷-(Borrow等人,1997)和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染(Ciurea等人,2001)被显示。强劲的抗VP1的鞘内抗体反应进一步强调了该结构蛋白的作用。因此，发明人的发现显示VP1对于抗JCV感染的脑细胞的保护性免疫应答是重要的，并且这些是由抗体、CD4+和CD8+T细胞介导的。该反应的强度可能部分由患者2的HLA型决定，所述患者表达主要MS风险等位基因DRB1*15:01/DRB5*01:01和A*02:01,其将相同的VP1表位呈递给CD4+和CD8+T细胞。他因此可能已经历了特别明显的脑的T细胞介导的免疫应答，其免疫病理学后果是重大的PML-IRIS、脑肿胀和神经学上的恶化。如已由其他人指出的(Cinque等人,2003)，JCV-特异性免疫应答是双刃剑。在无功能性免疫应答的情况下，脑细胞被未抵抗的病毒感染裂解。在另一方面，如果不受约束，在PML-IRIS过程中强劲的JCV-特异性反应引起脑炎症和水肿，同时其有效地从CNS消除JCV，如果不被免疫抑制至少暂时地减弱，其可导致患者死亡(Tan等人,2009b)。
在PML-IRIS过程中脑中的细胞和体液JCV-特异性免疫应答不仅使治疗复杂化，而且还可首先使PML的诊断模糊化。与依赖于CSF JCV病毒载荷并且如果进行活组织检查，分别依赖于针对JCV抗原和DNA的免疫组织化学和原位杂交的目前的常规不同，抗VP1的鞘内抗体反应似乎更强劲并且应当进行检查。在本研究的两名PML-IRIS患者中，鞘内VP1-特异性抗体滴度极高，尽管JCV DNA几乎不能被PCR和原位杂交检测到。JCV抗体测试的重要作用不仅得到具有PML的AIDS患者中高抗体滴度的先前观察(Weber等人,1997)的支持,而且还得了到那他珠单抗-治疗的MS患者中的最近数据(Gorelik等人,2010)的支持。
本研究的另一个重要的且出人预料的观察是，与JCV-特异性抗体反应不同，发病机制相关T细胞被限制于CNS实质本身中，并且CSF对于研究T细胞特异性和功能几乎无作用。该发现可能不仅与PML-IRIS而且还与MS高度相关，其中出于明显的原因,即因为CNS组织对于研究者是很少能获得，大多数研究集中在CSF上作为CNS内的反应的替代者。因此进一步的研究应当尽可能试图检查活检组织或尸体剖检组织，如果其可获得的话。当研究该具有PML-IRIS的MS患者的脑浸润性CD4+T细胞时，发明人进一步吃惊地看到来自3个主要鞘磷脂蛋白的肽都不被识别，这表明在重大脑炎症过程中髓磷脂-特异性T细胞的旁观者活化或-招募未发生，但该细胞精细地特异于致病剂。
实施例2　针对JCV的免疫接种
在具有特发性CD4+淋巴细胞减少(罕见的组成型免疫缺陷)的患者中进行了个体愈合尝试，所述患者在64岁时发生PML(在图11中称为“患者Hamburg”)。此男性患者曾是健康的，即在他的生命过程中未经历罕见或常见的感染，并且在2010年2月因未明来源的脑炎的迹象而住院。他被彻底检查，并且作出了疑似EBV相关脑炎的诊断。在抗病毒疗法过程中在短暂的改善后，他进一步（尽管缓慢地）恶化了。在2010中，进行了两次脑活组织检查，在2010年末进行的第二次检查中，基于CSF中阳性JCV病毒载荷以及脑中JCV-感染的少突胶质细胞和星形细胞的显示作出了进行性多病灶脑白质病(PML)的诊断。平行地，发明人发现低CD4+T细胞计数(约300/微升)以及0.5或更小的CD4+/CD8+比率，这两者都与特发性CD4+淋巴细胞减少的诊断相一致。此外，实验室中的体外实验记录了在外周血单核细胞中不存在针对JCV病毒VP1的T细胞反应，以及几乎完全不存在幼稚CD4+T细胞。根据这些观察，发明人基于预先存在的和可能遗传上决定的低CD4+数目推理出患者可能已发生PML，这进一步因在50岁以上开始并且增强的完全生理免疫退化而得以加强。
发明人想测试利用VP1的免疫接种以及在该CD4+淋巴细胞减少的情况下，优选与重组IL-7组合的免疫接种是否将增加患者必须具有的JCV-特异性T细胞的数目，因为他是JCV阳性的。此外，如果这将发生，那么发明人希望疫苗诱导的或加强的JCV VP1-特异性T细胞反应将引起这些细胞迁移至CNS并且从CNS隔室消除病毒和病毒感染的细胞。发明人因此申请了“个体愈合尝试”，与患者讨论该选择及其潜在风险并且获得了他的同意。IL-7(Cytheris)的使用在另一例CD4+淋巴细胞减少(Patel等人,2010)中得到最近出版物的进一步支持，在所述患者重组IL-7与抗病毒药一起产生患者的显著改善，然而在该患者中，未进行免疫学研究，从而关于抗原特异性免疫应答的改善一无所知。
上述患者的免疫接种方法包括下列步骤(关于免疫接种和测试的时间安排参见下面的方案)：利用与经皮肤施用的TLR7激动剂(咪喹莫特,Aldara；商购可得的)和静脉内施用的重组IL-7(Cytheris)组合的完整重组主要衣壳蛋白VP1(由Life Science Inkubator,Bonn提供的)的皮下注射。将VP1蛋白以病毒样颗粒(VLP)的形式施用，如在本文中使用的条件下与此种颗粒相关的重组表达的VP1蛋白。如下文中所显示的，患者在仅两次免疫接种后不仅显示抗JCV VP1的体外增殖反应，而且还将JCV病毒载荷减少至0，并且最终开始显示PML损伤周围略微的对比增强(通过脑MRI成像)，这全都支持免疫接种在体内起作用。他还显示在发生JCV-特异性免疫应答后具有略向延迟的临床改善。此外，由于发明人的来自实施例1中描述的PML-IRIS患者的脑浸润性T细胞的数据表明，具有T帮助细胞1-2表型的JCV-特异性CD4+T细胞可能对于从脑消除JCV病毒是关键的，发明人还对患者的脑脊髓液中的Th1-2CD4+T细胞进行染色，并且可显示这些细胞确实存在。
在具有乳腺癌的患者中进行了另一个个体愈合尝试，所述患者接受化学疗法并且作为化学疗法的副作用发生急性髓性白血病(AML)。该患者随后接受自体和异体造血干细胞移植作为AML的治疗，随后发生急性移植物抗宿主病(IV级)。作为这些治疗的后果获得的免疫缺陷导致PML。该病例在图11中称为“患者Zurich”。这两名患者都利用重组IL-7(皮下(s.c.))来进行治疗。2天后，施用了第一剂VP1(s.c.1mg,将咪喹莫特乳膏使用在皮肤上)。在第一剂VP1后2天，给予第二剂rIL-7。在第一IL-7剂后第12天，患者接受利用VP1s.c.加上咪喹莫特的第二次免疫接种，在该情况下同时施用rIL-7。在第6周，施用第三剂的VP1/咪喹莫特和第四剂的rIL-7。图11显示来自利用获自两名患者的外周血单核细胞(PBMC)在图中指定的时间点进行的下文中描述的增殖测定的结果。大于2的刺激指数被认为是阳性反应。可看到两名患者在免疫接种后都显示抗JCV的阳性免疫应答。
材料和方法
血液和CSF样品
在书面知情同意后获得了生物样品。通过Ficoll(PAA,Pasching,澳大利亚)密度梯度离心从EDTA-血液分离了外周血单核细胞(PBMC)。
通过接种2000个细胞/孔加上2x105个受辐射的(45Gy)异体饲养细胞来扩增脑脊髓液(CSF)-来源的单核细胞。添加了1μg/mlPHA-L(Sigma-Aldrich,Munich,德国)和500IU/ml IL-2(由Federica Sallusto,Institute for Research in Biomedicine,Bellinzona,CH友好地提供)。每3-4天重复IL-2的添加直至第14天。
增殖测定
通过将2x105个细胞接种在96孔U形微量滴定板中来测试PBMC对VP1(由Viktorya Demina,Life Science Inkubator,Bonn,德国友好地提供)和破伤风类毒素蛋白(TTx,Novartis,Marburg,德国)的增殖反应。以2μg/ml使用VP1，以5μg/ml使用TTx。在7天的温育后，测量3H-胸苷(Hartmann Analytic,Braunschweig,德国)的掺入。通过将孔+抗原的平均CPM(每分钟计数)除以孔(无抗原)的平均CPM来计算刺激指数(SI)。
为了利用流式细胞术测量对VP1和TTx的增殖反应，使用CellTraceTM CFSE细胞增殖试剂盒(Invitrogen,Darmstadt,德国)。因此，如上所述接种细胞，并且6天后用抗原再刺激，按照制造商的说明书利用CFSE进行处理。5天后，通过流式细胞术分析细胞。
流式细胞术分析
通过将50μl体积的适当的抗体混合物添加至100μl血液中来进行全血染色。将混合物在室温下温育30分钟，随后用FACS裂解液(BD Phar Mingen)裂解红血细胞10分钟。洗涤后，在LSR II(BD)中通过流式细胞术分析细胞。使用了下列抗体：CD4(APC,RPA-T4,eBioscience)、CD8(PB,DK25,Dako,Glostrup,丹麦)、CD45RO(FITC,UCHL1,eBioscience)、CD25(PE-Cy7,eBioscience)、CD3(PE,DakoCytomation,丹麦)、CD8(PB,DakoCytomation,丹麦)、IFN-γ(FITC,BDPharmingen)、IL-4(PE-Cy7,eBioscience)。
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Claims (32)

1.包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽，其中所述表位选自包含SEQ ID NO：1-92的组。
2.权利要求1的蛋白质或肽,其中所述表位选自包含SEQ IDNO:1-3,7-9,11,23,37-38,43-45和69-71的组。
3.权利要求1或2的蛋白质，其中所述包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质包括VP1或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质。
4.权利要求3的蛋白质，其中所述VP1或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质还包含至少一个选自包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：46-76的组的表位。
5.权利要求3-4的任一项的蛋白质，其中所述包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质以病毒样颗粒的形式存在。
6.权利要求1-5的任一项的蛋白质或肽，其用于诊断JCV感染和/或用于诊断PML的方法中。
7.权利要求1-5的任一项的蛋白质或肽，其用于治疗受试者中的PML的方法中。
8.权利要求7的蛋白质或肽，其中所述PML治疗包括施用能够扩增和维持T细胞的细胞因子。
9.权利要求8的蛋白质或肽，其中所述细胞因子选自IL-7,IL-2,IL-15和IL-21。
10.权利要求7-9的任一项的蛋白质或肽，其中所述PML治疗包括佐剂的施用。
11.权利要求10的蛋白质或肽，其中所述佐剂选自MF59、氢氧化铝、磷酸钙凝胶、脂多糖、咪唑并-喹啉(例如咪喹莫特,S-28463)、具有CpG基序的寡核苷酸序列、硬脂酰酪氨酸、DTP-GDP、DTP-DPP、苏氨酰-MDP、7-烯丙基-8-氧鸟苷、糖脂bay R1005、多抗原肽系统、聚合的半抗原肽、细菌提取物、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂和vit-A。
12.权利要求1-5的任一项的蛋白质或肽，其用于预防处于发生PML的风险中的受试者的PML和/或PML-IRIS的方法中。
13.权利要求12的蛋白质或肽，其中所述受试者被JCV感染。
14.权利要求7-13的任一项的蛋白质或肽，其中所述受试者选自:
a)具有先天性免疫缺陷例如特发性CD4+淋巴细胞减少或Hyper-IgE-综合征的患者，
b)具有由疾病或病理学病况如AIDS、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或者乙型或丙型肝炎病毒感染引起的获得性免疫缺陷的受试者，和
c)具有由治疗性干预例如化学疗法、放射或免疫抑制治疗引起的获得性免疫缺陷的受试者。
15.权利要求14的蛋白质或肽，其中所述免疫抑制治疗包括用免疫抑制抗体进行的治疗。
16.权利要求15的蛋白质或肽，其中所述免疫抑制抗体选自那他珠单抗,依法珠单抗,利妥昔单抗,奥瑞珠单抗和阿仑珠单抗。
17.权利要求14-16的任一项的蛋白质或肽，其中所述受试者患有自身免疫性疾病。
18.权利要求17的蛋白质或肽，其中所述自身免疫性疾病是多发性硬化。
19.权利要求18的蛋白质或肽，其中所述受试者将用抗体那他珠单抗来治疗。
20.一种药物试剂盒，其包括含有至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽以及佐剂，其中所述表位选自包含SEQ ID NO：1-92的组，所述佐剂优选选自包含TLR-7激动剂和/或TLR-8激动剂的组。
21.权利要求20的药物试剂盒，其中所述佐剂是TLR-7激动剂,优选地，咪喹莫特。
22.权利要求20或21的药物试剂盒，其中所述包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质包括VP1或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质。
23.权利要求22的药物试剂盒，其中所述VP1或与VP1具有至少70%的氨基酸同一性的蛋白质为还包含至少一个选自包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：46-76的组的表位的融合蛋白。
24.权利要求20-23的任一项的药物试剂盒，其中所述包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质以病毒样颗粒的形式存在。
25.权利要求20-24的任一项的药物试剂盒，其中所述试剂盒还包括IL-7。
26.权利要求20-25的任一项的药物试剂盒，其中将皮下施用所述包含至少一个源自JCV的CD4+表位的蛋白质或肽。
27.权利要求20-26的任一项的药物试剂盒，其中将经皮肤施用所述佐剂。
28.权利要求20-27的任一项的药物试剂盒，其中将给选自经诊断患有PML的受试者或处于发生PML的风险中的受试者的受试者施用所述试剂盒的组分，和
其中所述受试者任选地被诊断为JCV携带者。
29.权利要求20-28的任一项的药物试剂盒，其中将给选自下组的受试者施用所述试剂盒的组分:
a)免疫受损或免疫缺陷的受试者，例如HIV携带者，具有免疫抑制治疗的受试者或先天性免疫缺陷患者例如具有特发性CD4+淋巴细胞减少或Hyper-IgE-综合征的患者；
b)适格进行免疫抑制治疗的受试者。
30.权利要求20-29的任一项的药物试剂盒，用于治疗PML。
31.权利要求20-30的任一项的药物试剂盒，其用于在选自下组的受试者中预防PML和/或PML-IRIS：
a)免疫受损或免疫缺陷的受试者，例如HIV携带者，具有免疫抑制治疗的受试者或先天性免疫缺陷患者例如具有特发性CD4+淋巴细胞减少或Hyper-IgE-综合征的患者；和
b)适格进行免疫抑制治疗的受试者,
其中所述免疫抑制治疗优选选自包含利用那他珠单抗,依法珠单抗,利妥昔单抗,奥瑞珠单抗和阿仑珠单抗的治疗的组。
32.权利要求29或31的任一项的药物试剂盒，其中所述免疫抑制治疗是对被诊断患有自身免疫性疾病的受试者或移植患者的治疗，其中在免疫抑制治疗之前、之后或期间给所述患者施用试剂盒的组分，其中所述免疫抑制治疗优选选自包含利用那他珠单抗,依法珠单抗,利妥昔单抗,奥瑞珠单抗和阿仑珠单抗的治疗的组。
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