KR20140062702A

KR20140062702A - 예방접종 및 진단 적용에서의 폴리오마 바이러스 jc 펩티드 및 단백질

Info

Publication number: KR20140062702A
Application number: KR1020147004608A
Authority: KR
Inventors: 일리야스 옐시크; 로란트 마르틴; 스벤 쉬플링; 미라이아 소스페드라; 자라 요우제프
Original assignee: 유니베르시태트 취리히
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2012-07-23
Publication date: 2014-05-26
Also published as: CA2842543A1; MX2014000776A; CN103826653A; HK1198517A1; NZ620196A; JP2014520877A; EP2734218A2; EP2548567A1; AU2012288955B2; US20140356320A1; WO2013014134A3; AU2012288955A1; BR112014001516A2; EA201490322A1; US9738690B2; WO2013014134A2

Abstract

본 발명은 예방접종 또는 면역화, 특히 치료적 예방접종, 및 진단 분야에 관한 것이다. 예를 들어, 진행성 다발성 백질뇌병증(PML) 및/또는 진행성 다발성 백질뇌병증-면역 재구성 염증 증후군(PML-IRIS)의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는, 폴리오마 바이러스 JC(JCV)에 대한 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 약학적 조성물 키트가 개시된다. 상기 PML 또는 PML-IRIS의 위험이 있는 개체는, 예를 들어, 면역손상되거나 면역억제된 환자 또는 면역보호 치료에 적격인 자가면역 질병을 갖는 환자일 수 있다. 본 발명은 또한 JCV 단백질의 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 조성물, 및 이의 치료적, 예방적 및 진단적 용도에 관한 것이다.

Description

예방접종 및 진단 적용에서의 폴리오마 바이러스 JC 펩티드 및 단백질{POLYOMA VIRUS JC PEPTIDES AND PROTEINS IN VACCINATION AND DIAGNOSTIC APPLICATIONS}

본 발명은 예방접종 또는 면역화, 특히 치료적 예방접종, 및 진단 분야에 관한 것이다. 폴리오마 바이러스 JC(JCV)에 대한 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 약학적 조성물 및 키트가 개시되어 있고, 이는, 예를 들어, 진행성 다발성 백질뇌병증(Progressive multifocal leukoencephalopathy, PML) 및/또는 진행성 다발성 백질뇌병증-면역 재구성 염증 증후군(Progressive multifocal leukoencephalopathy-immune reconstitution inflammatory syndrome, PML-IRIS)의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 상기 PML 또는 PML-IRIS의 위험이 있는 개체는, 예를 들어, 면역손상 또는 면역억제 환자 또는 면역억제 치료에 적격인 자가면역 질병을 가진 환자일 수 있다. 본 발명은 또한 JCV 단백질의 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 조성물 및 이의 치료적, 예방적 및 진단적 용도에 관한 것이다.

진행성 다발성 백질뇌병증 및 진행성 다발성 백질뇌병증-면역 재구성 염증 증후군은 폴리오마 바이러스 JC(JCV)에 의한 중추신경계의 감염에 의해 야기된다. 둘 모두는 다발경화증 및 다른 자가면역 질병에서 모노클로날 항체 요법의 합병증으로서 최근에 출현하였다.

진행성 다발성 백질뇌병증(PML)은 1958년에 처음 기재되었다. 1971년에, 폴리오마 바이러스 JC(JCV)가 PML의 원인 작용제로서 확인되었다. PML은 면역손상의 상태, 예를 들어, HIV 감염, 암, 기관 이식, 면역결핍, 또는 드물게는 자가면역 질병 동안 발생하는 기회 감염 및 종종 치명적인 감염이다. AIDS 환자에서, PML은 비록 항레트로바이러스 요법의 도입 후에 이의 발생률이 감소하였으나, 가장 심각한 합병증 중 하나였다(Cinque et al., 2001). JCV에 의한 감염은 건강한 성인에서 매우 유행되어 있으며, 집단의 60% 또는 그 초과가 잠복/지속 감염을 갖는다(Egli et al, 2009). 최근 수년간, PML은 자가면역 질병, 특히 다발경화증(MS)의 모노클로날 항체 요법 및 나탈리주맙(natalizumab)(항-VLA-4)을 이용한 치료에서 증가하는 흔한 심각한 유해 사례로 나타났다(Kleinschmidt-DeMasters and Tyler, 2005)(Langer-Gould et al, 2005)(Jilek et al.)(Anonymous, 2011). 류머티스 관절염(RA)을 치료하는데 사용되는 다른 모노클로날 항체, 예를 들어, 리툭시맙(rituximab)(항-CD20), 인플릭시맙(infliximab)(항-종양 괴사 인자(TNF)-알파) 및 IgG1-TNF 수용체 2 융합 단백질 에타너셉트(etanercept)가 또한 PML과 관련되었다. 에팔리주맙(efalizumab)(항-백혈구 기능-관련 항원-1)은 이미 시장으로부터 회수되었다(Pugashetti and Koo, 2009). 나탈리주맙을 투여받는 MS 환자에서 120명을 초과하는 PML 환자가 보고되었고, PML 발생률은 1:500 내지 1:1,000이며, 상기 매우 효과적인 치료의 사용을 위태롭게 한다(Anonymous, 2011).

PML의 발병기전은 미엘린-형성 희소돌기아교세포의 용해 감염 및 현저한 면역 반응의 부재하에서의 별아교세포의 불발 감염을 특징으로 한다. 그러나, 다른 CNS 세포, 예를 들어, 소뇌 과립 뉴런이 또한 JCV에 의해 감염될 수 있다(Du Pas-quier et al., 2003a). JCV 감염을 조절하는 메커니즘은 아직 불완전하게 이해되어 있으나, JCV 감염의 잠복기는 필시 건강한 개체에서 효과적인 체액성 및/또는 세포 면역 반응에 의해 조절된다(Du Pasquier et al, 2001)(Du Pas-quier et al, 2004a)(Weber et al, 1997). 따라서, JCV-특이적 CD8+ 세포독성 T 세포의 존재는 PML로부터의 회복과 연관된 반면, 이들 세포는 치명적인 결과를 갖는 PML 환자에는 존재하지 않았다(Du Pasquier et al, 2004a; Du Pasquier et al, 2006; Koralnik et al, 2002). 또한, PML은 감소된 CD4+ T 세포 수 또는 손상된 CD4+ 세포 기능, 예를 들어, AIDS 및 특발성 CD4+ 림프구감소증의 상황에서 우선적으로 발생한다(Stoner et al, 1986)(Gillespie et al, 1991; Zonios et al, 2008). CD8+ JCV-특이적 T 세포의 역할과 동등하게, PML의 해소는 CD4+ 수 및 기능의 회복을 후속시키며, 이는 CD4+ 및 CD8+ 바이러스-특이적 T 세포 둘 모두가 숙주 보호에 중요한 것을 나타낸다.

AIDS, 비-호지킨 림프종 및 백혈병에서의 현저한 면역억제와 대조적으로, 모노클로날 항체-기반 요법은 특정 면역 기능, 예를 들어, 항-VLA-4/나탈리주맙 요법에서 내피 장벽을 가로지르는 세포 이동을 억제하거나, 리툭시맙의 경우에서 특정 면역 세포, 예를 들어, CD20-발현 B 세포를 제거한다(Lutterotti and Martin, 2008). 항-VLA-4 요법의 상황에서, 현재의 가설은 PML이 CNS의 손상된 면역 감시로부터 발생하는 것으로 추정하는데, 이는 활성화된 T 세포 및 CD209+ 미숙 수지상 세포가 혈액뇌장벽(BBB)을 가로지를 수 없고, 뇌에 접근할 수 없기 때문이다(del Pilar Martin et al., 2008; Stuve et al., 2006; Yednock et al., 1992). 결과로서, CNS에서의 국소 항원 제시가 손상된다(del Pilar Martin et al., 2008).

대안적으로, 골수에서 조혈 전구체 세포에 대한 보유 신호로 작용하는 VLA-4/혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1) 상호작용의 억제가 이의 자연 활동 범위 중 하나로부터의 JCV의 방출(Tan et al, 2009a), 증가된 바이러스 복제 및 CNS 세포에 대해 향성(tropism)을 갖는 JCV 변이체의 발생(Houff et al, 1988; Ransohoff, 2005)을 유발시키는 것으로 생각되었다.

PML에서 상기 모노클로날 항체를 이용한 요법의 중지는 CNS에서 JCV-감염된 세포에 대한 면역학적 감시를 재확립시키고, 상기 구획에서 임상적으로 명백한 염증 반응을 발생시킨다. 염증은 BBB의 개방 및 T 세포 및 단핵구/대식세포의 유입으로 인해 자기 공명 영상화(MRI)에서의 대조-증강 병소에 의해 시각화될 수 있다. PML의 단핵구/대식세포의 표시는 면역 PML-재구성 염증 증후군(PML-IRIS)으로 명명되었다(Koralnik, 2006; Tan et al, 2009b). PML-IRIS는 환자의 임상 상태의 신속한 황폐 및 환자의 약 30% 내지 50%에서 사망을 발생시킬 수 있다(Tan et al, 2009b). 이의 세포 및 분자 발병기전, 즉, T 세포 서브타입, 항체 또는 사이토카인이 관련된 세포 및 분자 발병기전은 현재 충분히 이해되어 있지 않다.

진행성 다발성 백질뇌병증-면역 재구성 염증 증후군은 진행성 다발성 백질뇌병증의 진단을 불명료하게 만들 수 있고, 심각한 임상 장애 및 가능하게는 사망과 함께 현저한 면역병인을 발생시킬 수 있다. 감염 부위에서의 면역 반응의 부재하에서 JC 바이러스에 의한 희소돌기아교세포 용해로부터 말이집탈락이 발생하는 진행성 다발성 백질뇌병증과는 다르게, 진행성 다발성 백질뇌병증-면역 재구성 염증 증후군에서의 조직 파괴는 JC 바이러스-감염된 희소돌기아교세포 및 별아교세포에 대한 강한 면역 반응 및 뇌의 염증성 종창에 의해 야기된다. 예를 들어, 매우 활성인 레트로바이러스 요법으로 치료된 AIDS 환자 또는 항-VLA-4 모노클로날 항체 나탈리주맙으로 치료된 MS 환자에서 면역적격이 재확립되는 경우 및 항체의 세척 후에 PML-IRIS가 개시된다. PML-IRIS 동안, 면역 세포는 뇌로 진입하고, JCV-감염된 별아교세포 및 희소돌기아교세포를 제거한다. 진행성 다발성 백질뇌병증-면역 재구성 염증 증후군과 관련된 세포 및 매개체는 당 분야의 상태에서 충분히 이해되어 있지 않다.

가능한 한 초기에 PML 및 PML-IRIS를 진단하고, 근원적 질병 메커니즘을 기초로 하여 효과적인 요법을 확인하는 것은 MS에서 뿐만 아니라, 다수의 다른 자가면역 질병, 후천적 면역결핍 동안, 악성종양 동안 및 이식 약물에서 중요한 목표이다. JCV의 진단을 위한 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, PCR에 의해 바이러스를 검출하는 것이 가능하다. 대안적 방법은, 예를 들어, ELISA에 의한 JCV에 대한 항체의 검출이다. 예를 들어, JCV 코어 단백질 VP1에 대한 ELISA를 이용하여 JCV 감염을 진단하기 위한 예시적 방법은 문헌[Goldmann et al, 1999], 또는 DE 195 43 553호에 교시되어 있다.

상기 질병의 치료 방법은 지금까지 덜 연구되었다. 문헌[Goldmann et al., 1999], 또는 DE 195 43 553호에는 바이러스 유사 입자로 어셈블리될 수 있는 VP1 단백질을 이용한 예방접종이 암시되어 있다. 프로인트 완전 애쥬번트(Freund's Complete Adjuvant, FCA)를 이용한 예방접종이 면역 반응을 유도하는 반면 애쥬번트가 없는 예방접종이 면역원성이 아닌 것으로 교시되어 있다. 그러나, 프로인트 완전 애쥬번트는 이의 독성으로 인해 인간에서 사용될 수 없다.

PML-IRIS에서 유행하는 바와 같은 병원성 면역 반응의 위험에 비추어 볼 때, PML의 치료 및 PML 및 PML-IRIS의 예방을 가능케 하는 예방접종을 개발하는 것은 특히 도전적인 일이다.

이러한 문제는 본 발명, 특히 청구항의 주제에 의해 해결된다.

본 발명은 첫번째 양태에서 JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 제공하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택된다. 두번째 양태에서, 본 발명은 JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드 및 애쥬번트를 포함하는 약학적 키트를 제공하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 애쥬번트는 TLR-7 효능제 및/또는 TLR-8 효능제를 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명자는 놀랍게도 JCV 감염의 조절 및 PML의 예방에 있어서의 CD4+ 반응의 생물학적 관련성을 밝혀내었다. 이전에는, JCV 조절에서의 주요 역할은 CD8+ 세포 및 세포 면역 반응에 의해 수행된다고 생각하였다.

본 발명자는 치료 및 예방 백신에 사용하기에 적합한, 특히 JVC의 VP1 단백질로부터 다수의 CD4+ 에피토프를 확인하였다. 예를 들어, 상기 백신에서 사용하기 위한 펩티드 또는 단백질은 본원에 개시된 JCV 단백질 중 하나 이상으로부터의 에피토프 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 펩티드는, 예를 들어, VP1 단백질 또는 VP1 단백질과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 VP1 단백질 또는 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질을 이용한 예방접종에 관한 것이다. VP1 단백질 또는 이의 변이체는 펜타머, 즉, JCV 캡소머(capsomer)의 형태로 백신에 존재할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, VP1 단백질 또는 이의 변이체는 바이러스-유사 입자(VLP)의 형태로 존재한다. VLP는 VP1으로 구성될 수 있거나, 이는 또한 다른 JCV 단백질, 예를 들어, VP2 및/또는 VP3을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학적 키트는 한 성분으로서 항원을 포함할 수 있고, 즉, JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드는 VP1 또는 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질을 포함한다.

단백질 및 펩티드는 주로 본 출원의 상황에서 서로에 대한 교환하여 사용된다. 통상적으로, 단백질은 펩티드보다 길고, 예를 들어, 100개를 초과하는 아미노산을 포함하는 반면, 펩티드는 5 내지 100개의 아미노산을 갖는다.

CD4+ 에피토프는 MHC 클래스 II 분자의 상황에서 CD4+ T 세포의 T 세포 수용체에 의해 인지될 수 있는 펩티드이다. 본 발명자는 건강한 대조군 및 PML/PML-IRIS를 갖는 환자의 CD4+ T 세포에 의해 인지되는 CD4+ T 세포 에피토프를 확인하였다. 이들 펩티드는 하기 표 1에 개시되어 있다(SEQ ID NO:1-92). 이들 에피토프 중 몇몇은 말초 T 세포를 이용하는 전통적 방법에 의해 확인될 수 없었으며, 단지 PML-IRIS를 갖는 환자의 뇌 생검으로부터 분리된 T 세포와 반응성인 것으로 확인되었다. 이러한 환자는 뇌 및 CSF에서 낮거나 부재하는 JCV 바이러스 로드를 나타내었으므로, JCV-특이적 뇌내 CD4+-매개 면역 반응은 뇌로부터 바이러스 감염을 청소시키거나 거의 청소시키는 것으로 보이며, 따라서 수행된 실험은 확인된 CD4+ T 세포 에피토프, 특히, 뇌-유래 T 세포에 의해 인지되는 것으로 확인된 CD4+ T 세포 에피토프의 높은 생물학적 관련성을 보장한다. 뇌-유래 T 세포에 의해 확인된 T 세포 에피토프는 SEQ ID NO:1-3, 7-9, 11, 23, 37-38, 43-45, 및 69-71에 기재되어 있고, 이들 에피토프를 포함하는 펩티드 및 단백질이 본원에 기재된 예방적 및 치료적 예방접종 방법에 특히 바람직하다. 한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 단백질 또는 펩티드는 SEQ ID NO:1-3, 7-9, 11, 23, 37-38, 43-45, 및 69-71을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함한다.

VP1은 JCV의 주요 캡시드 단백질이며, 이는 높은 비율의 확인된 면역우세 에피토프를 포함한다. 야생형 VP1의 서열은, 예를 들어, DE 195 43 553호에 개시되어 있다. 그러나, VP1은 또한, 예를 들어, 위치 55, 269 및 기타 위치에서 돌연변이될 수 있다. 생체내에서 발생하는 VP1 돌연변이의 50% 초과가 상기 위치에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 돌연변이된 VP1 단백질로부터의 펩티드에 해당하는 에피토프가 또한 본 발명의 상황에서 사용될 수 있다. 표 1의 펩티드 중 일부는 돌연변이된 VP1 단편에 해당한다. 본 발명의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드는 SEQ ID NO:1-92의 펩티드로 구성되거나, 이들은 더 길 수 있고, 예를 들어, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개, 또는 그 초과, 40개 또는 그 초과, 50개 또는 그 초과, 75개 또는 그 초과, 100개 또는 그 초과, 125개 또는 그 초과, 150개 또는 그 초과 또는 200개 또는 그 초과의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 이들은 야생형 또는 자연 발생 돌연변이된 VP1 또는 다른 JCV 단백질의 아미노산으로 구성될 수 있거나, 이들은 상이한 서열, 예를 들어, 동일한 바이러스 단백질로부터 유래되지 않거나 이들의 자연 배열이 아닌 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들은 SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 에피토프를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.

한 구체예에서, 단백질은 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 이는 SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질은 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:46-76을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 에피토프를 추가로 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 단백질은 SEQ ID NO:1-3, 7-9, 11, 23, 37-38, 43-45, 및 69-71에 기재된 에피토프 중 적어도 하나를 포함한다.

한 구체예에서, JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질은 바이러스 유사 입자의 형태로 존재한다. VP1 단백질 또는 이의 유도체, 예를 들어, DE 195 43 553호에 기재된 바와 같은 야생형 VP1과 적어도 70%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 돌연변이 또는 단편, 또는 이들의 융합 단백질은 DE 195 43 553호에 또한 기재되는 바이러스 유사 입자로 어셈블리될 수 있다.

물론, 본 발명의 키트는 또한 바람직하게는 한 조성물 내에 SEQ ID NO:1-92의 군으로부터 선택된 JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 2개 이상의 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 SEQ ID NO:1-3, 7-9, 11, 23, 37-38, 43-45, 및 69-71의 군으로부터 선택된 JCV로부터의 CD4+ 에피토프를 갖는 2개 이상의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. CD4+ 에피토프 및 CD8+ 에피토프 둘 모두는 JCV에 대해 효과적인 면역 반응과 관련된 것으로 보임에 따라, 본 발명의 펩티드 또는 단백질이 적어도 하나의 CD4+ 에피토프 및 하나의 CD8+ 에피토프 둘 모두를 포함하는 경우가 특히 유리하다.

본 발명의 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 펩티드 및 단백질은 JCV에 대한 특정 뇌내 CD4+-매개 면역 반응을 유도하거나 향상시키기 위해 PML에 걸린 피검체에 투여되기에 유용하다. 따라서, 본 발명의 한 양태에 따르면, JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드가 피검체에서 PML을 치료하는 방법에 사용된다. PML 및/또는 PML-IRIS에 이미 걸린 피검체의 치료는 본원에서 치료적 예방접종으로 언급된다. 한 바람직한 구체예에서, VP1 단백질의 아미노산 서열 또는 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 PML의 치료에 사용된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, PML의 치료에서 사용되는 펩티드 또는 단백질은 SEQ ID NO:1-3, 7-9, 11, 23, 37-38, 43-45, 및 69-71의 군으로부터 선택된 에피토프를 포함하거나 이로 구성된다.

PML이 발생한 피검체를 치료하는 경우, 본 발명의 펩티드 또는 단백질의 투여를 기초로 한 치료가 T 세포를 확장시키고 유지시킬 수 있는 사이토카인의 투여에 의해 추가로 개선될 수 있는 것이 발견되었다. 상기 사이토카인의 공동-투여가 중요한 면역 기능의 재구성을 위한 자극을 제공하는 것이 본 발명의 과정에서 밝혀졌다. 여러 사이토카인, 예를 들어, IL-7, IL-2, IL-15 및 IL-21이 사용될 수 있다. IL-7 또는 IL-7의 유도체의 사용이 특히 바람직하다.

또 다른 추가 구체예에서, 치료적 예방접종에 의한 PML 치료는 또한 애쥬번트의 투여를 포함한다. 애쥬번트는 인간 피검체에 투여되기에 적합하고, 투여 부위에서 T 세포 활성화 및/또는 항원 제시를 발생시키는 임의의 애쥬번트일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 키트에서 사용되는 애쥬번트는 MF59, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 포스페이트 겔, 지질다당류, 이미다조퀴놀린(예를 들어, 이미퀴모드(Imiquimod), S-28463), CpG 모티프를 갖는 올리고누클레오티드 서열, 스테아릴 티로신, DTP-GDP, DTP-DPP, 트레오닐-MDP, 7-알릴-8-옥소구아노신, 당지질 베이(glycolipid bay) R1005, 다중-항원 펩티드 시스템, 중합화된 합텐 펩티드, 박테리아 추출물, TLR-7 효능제, TLR-8 효능제 및 vit-A 등의 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명을 실시하는데 사용되는 애쥬번트는 TLR-7 효능제 또는 TLR-8 효능제이다. 여러 TLR-7 효능제가 공지되어 있고, 예를 들어, Invivogen, San Diego로부터 시판된다. 예로는 아데닌 유사체 CL264, 구아노신 유사체 록소리빈(Loxoribine), 또는, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린 화합물, 예를 들어, 레시퀴모드(Resiquimod), 가르디퀴모드™(Gardiquimod™) 또는 이미퀴모드(Imiquimod)(4-아미노-1-이소부틸-1H-이미다졸[4,5-c]키놀린)이 있다. TLR-8 효능제는 TLR-7 효능제와 유사한 생물학적 효과를 갖는 것으로 공지되어 있고, 따라서 또한 또는 대안적으로 사용될 수 있다. TLR-8 효능제의 예는 단일가닥의 RNA 또는 이.콜리(E.coli) RNA이다. 예시적 TLR-7/8 리간드는 티아졸로퀴놀린 화합물 CL075, 이미다조퀴놀린 화합물 R848, 또는 수용성 R848 이미다조퀴놀린 화합물 CL097, 티미딘 동종중합체 포스포로티오에이트 ODN(Poly(dT)이다.

본 발명에서 사용되는 바람직한 애쥬번트는 이미퀴모드이다. 바람직하게는 TLR-7 효능제 및/또는 TLR-8 효능제를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 애쥬번트가 본 발명의 상황에서 사용될 수 있고, 필요시, 면역 반응을 자극시키기 위한 추가 수단이, 예를 들어, 하기에 기재되는 바와 같이 이용될 수 있다.

한 바람직한 구체예에 따르면, 치료적 예방접종은 애쥬번트, 예를 들어, 이미퀴모드, 및 사이토카인, 예를 들어, IL-7과 조합된 VP1(또는 VP1와 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질)의 투여를 포함한다. VP1 단백질 또는 이의 변이체는 펜타머로서 상기 조합으로, 즉, JCV 캡소머의 형태로 제공될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, VP1 단백질 또는 이의 변이체는 바이러스-유사 입자(VLP)의 형태로 제공된다. VLP는 VP1으로 구성될 수 있거나, 이는 또한 다른 JCV 단백질, 예를 들어, VP2 및/또는 VP3을 포함할 수 있다. VP1 또는 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질로 구성되는 VLP가 애쥬번트 및 사이토카인과 조합하여 투여되는 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직하게는, VP1으로 구성되는 VLP는 치료적 예방접종을 위해 이미퀴모드 및 IL-7과 조합하여 투여된다.

한 구체예에서, 예를 들어, 키트는 IL-7을 추가로 포함할 수 있다. IL-7은 바람직하게는 PML에 걸린 피검체가 치료(즉, 치료적 예방접종에서의 치료)되는 경우에 사용되며, 추가 자극 없이, 예를 들어, 환자가 면역결핍성인 경우에 충분하지 않은 면역 반응이 예상된다. 키트의 다른 성분과의 IL-7의 투여가 선천적 면역 결핍을 갖는 개체에서 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 것이 본 발명자에 의해 밝혀졌다. IL-7은 또한 면역억제 약물을 투여받는 피검체 또는 HIV 감염으로 인해 면역손상된 환자에서 사용될 수 있다.

바람직하게는, JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 본 발명의 단백질 또는 펩티드는 피하 투여된다. 다른 투여 방식, 예를 들어, 피부, 근내, 정맥내, 폐 또는 경구 투여가 또한 선택될 수 있다.

애쥬번트는 바람직하게는 본 발명의 단백질 또는 펩티드에 대해 면역 반응을 유도하기에 적합한 방식으로 피검체에 투여된다. 예를 들어, 애쥬번트는 본 발명의 단백질 또는 펩티드의 투여와 동일 방식 및 상기 투여시에 투여될 수 있고, 둘 모두는 하나의 조성물에 존재할 수 있고, 예를 들어, 하나의 바이얼에 함유될 수 있다. 한 구체예에서, CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드 둘 모두 및 애쥬번트는 피하 투여용이다. 대안적으로, 이들은 에피토프에 대한 면역 반응의 자극을 가능케 하는 방식으로 투여되고, 예를 들어, 항원은 피하 투여되고, 애쥬번트는 국소적 또는 피부로 투여되고, 특히, 이는 항원의 주사 부위에, 예를 들어, 크림 또는 로션의 형태로 투여될 수 있다. 애쥬번트, 예를 들어, 이미퀴모드의 피부 적용 방식은 당 분야의 상태에 공지되어 있다. 예를 들어, 효과적인 농도의 애쥬번트를 포함하는 크림이 약 5cm x 5cm의 영역 상에서 피하 주사 부근의 피부에 투여될 수 있다.

애쥬번트 및 항원은 바람직하게는 동시에 투여되거나, 짧은 기간 내에 연속적으로 투여된다. 예를 들어, 이미퀴모드 크림은 피하 주사 후에 직접 피부에 투여될 수 있다. 추가 스프레딩을 방지하기 위해 크림이 덮여질 수 있고, 약 4-12시간, 예를 들어, 8시간 후에 제거된다.

CD4+ 에피토프 중 적어도 하나를 포함하는 단백질 또는 펩티드 및 애쥬번트의 첫번째 투여 후, 면역 반응을 증대시키기 위해 추가 투여 과정, 예를 들어, 두번째, 세번째 또는 네번째 투여 과정이 수행될 수 있다. 과정 사이의 시간은 약 1 내지 약 4주, 바람직하게는 약 2 내지 약 3주, 예를 들어, 10일일 수 있다. 한 구체예에서, 2주 후 및 또 다른 6주 후에 부스터 면역화가 첫번째 투여에 후속된다. 면역결핍 또는 면역손상 피검체에서, 부스팅을 위해 항원 및 애쥬번트 둘 모두를 투여하는 것이 유리하다. 면역결핍 또는 면역손상되지 않은 피검체에서, 첫번째, 또는 첫번째 및 두번째 면역화를 위해 애쥬번트만 사용하고, 즉, 이후의 면역화를 위해 항원만 사용하는 것이 또한 가능하다.

PML이 발생한 피검체의 치료에 사용되는 것과는 별개로, 본 발명의 단백질 또는 펩티드는 또한 PML이 아직 발생하지 않았으나, 상기 질병이 발생할 위험이 있는 피검체에서 PML 및/또는 PML-IRIS를 방지하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본원에서 예방적 예방접종으로 언급된다. 예방적 예방접종에 의해 치료되는 피검체는 JVC에 아직 감염되지 않은 피검체일 수 있고, 이는 예방적 예방접종이 피검체의 감염을 예방하는데 사용되는 것을 의미한다. 그러나, 바람직하게는, 예방적 예방접종에 의해 치료되는 피검체는 JCV에 이미 감염된 피검체이다. 예방적 예방접종은 애쥬번트의 투여를 포함시킬 필요는 없다. 예방적 예방접종이 애쥬번트의 투여 또는 IL-7과 같은 사이토카인의 투여를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 예방적 예방접종 방법은 또한 각각의 피검체로의 상기 화합물의 투여를 포함할 수 있다.

한 바람직한 양태에 따르면, 예방적 예방접종은 VP1 단백질 또는 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질의 투여를 포함한다. VP1 단백질 또는 이의 변이체는 펜타머로서 예방적 백신에 존재할 수 있고, 즉, JCV 캡소머의 형태로 존재할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, VP1 단백질 또는 이의 변이체는 바이러스-유사 입자(VLP)의 형태로 예방적 백신에 존재한다. VLP는 VP1으로 구성될 수 있거나, 이는 또한 다른 JCV 단백질, 예를 들어, VP2 및/또는 VP3를 포함할 수 있다.

치료적 또는 예방적 예방접종 요법에서 본 발명의 단백질 또는 펩티드가 투여되는 피검체는 유전적 또는 후천적 면역결핍을 가지며, 이는 적응 또는 선천 면역 기능의 여러 양태가 기능이상이거나 손상된 것을 의미한다. 상기 면역결핍은 유전적 기능이상, 예를 들어, 특발성 CD4+ 림프구감소증 또는 과-IgE-증후군으로부터 발생할 수 있거나, 후천적 면역결핍으로 인해 질병 또는 병리 질환, 예를 들어, AIDS, 백혈병, 림프종, 다발골수종 또는 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스의 감염으로부터 발생할 수 있다. 피검체는 또한 치료적 개입으로부터의 결과로서 면역손상될 수 있다. 예를 들어, 암 치료는 종종 면역계의 특정 기능이상을 초래하는 화학요법 또는 방사선 과정을 포함한다. 또한, 이식 약물 및 또한 자가면역 질병의 치료에서 흔히 사용되는 면역억제 치료가 본 발명에 따라 치료되는 피검체의 면역결핍의 원인일 수 있다.

한 바람직한 구체예에 따르면, 예방적 또는 치료적 치료에 의한 본 발명의 펩티드 또는 단백질에 의해 치료되는 피검체는 면역억제 치료를 진행 중이거나 면역억제 치료를 겪게 될 것이다. 이는 환자가 면역억제제의 투여에 의해 치료되는 것으로 주치의에 의해 결정된 후, PML 및/또는 PML/IRIS의 발생을 예방하기 위해 본 발명의 펩티드 또는 단백질 중 하나 이상을 상기 환자에게 투여할 수 있는 것을 의미한다. 이는, 예를 들어, 기관 이식을 받는 환자에게 특히 유용하다.

대안적으로, 면역억제 치료를 받고 있거나 면역억제 치료에 적격인 피검체는 자가면역 질병, 바람직하게는 T 세포가 병인적 역할을 하거나, 면역억제의 표적임을 특징으로 하는 자가면역 질병에 걸린 환자일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 자가면역 질병은, 예를 들어, 급성 파종성 뇌척수염(ADEM), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 심근병증(autoimmune cardiomyopathy), 자가면역 심근병(autoimmune cardiomyopathy), 자가면역 간염, 자가면역 내이 질병, 자가면역 림프구증식 증후군, 자가면역 말초 신경병증, 자가면역 췌장염, 자가면역 다내분비선 증후군, 자가면역 프로게스테론 피부염, 자가면역 혈소판감소 자색반, 자가면역 두드러기, 자가면역 포도막염, 베체트병, 복강병, 크론병, 피부근염, 타입 1 당뇨병, 호산구성 근막염, 위장 유사천포창, 굿파스쳐 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군(GBS), 하시모토 뇌병증, 하시모토 갑상선염, 홍반성 루푸스, 다발경화증, 중증근무력증, 보통천포창, 악성빈혈, 다발근육염, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 재발성 다발신경병증, 류머티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 횡단성 척수염, 궤양성 대장염, 혈관염, 및 베게너 육아종증을 포함한다. 바람직하게는, 자가면역 질병은 다발경화증이다. 자가면역 질병 중에서, MS이 아닌 것이 있다.

따라서, 본 발명의 키트의 성분은 PML을 갖는 것으로 진단된 피검체 또는 PML이 발생할 위험이 있는 피검체로 구성되는 군으로부터 선택된 피검체로의 투여용일 수 있다.

PML이 발생할 위험이 있는 피검체는 당 분야의 상태에서 널리 공지되어 있다. 이들 피검체는 본 발명의 단백질 및 펩티드로 예방적으로 치료될 수 있다. 상기 개설된 바와 같이, 예로는, 예를 들어, HIV 감염 또는 AIDS, 또는 종양으로 인해 면역결핍되거나 면역손상된 환자가 있다. 상기 환자는 또한 특발성 CD4+ 림프구감소증 또는 과-IgE-증후군을 갖는 환자와 같이 선천적 면역결핍을 가질 수 있다. 대안적으로, 면역계는 현재 진행되거나 계획된 면역억제 치료로 인해 손상될 수 있다. 환자는, 예를 들어, 이들이 자가면역 질병, 예를 들어, 다발경화증, 류머티스 관절염, 홍반성 루푸스, 크론병 또는 건선을 갖는 경우, 또는 이들이 이식 환자, 즉, 이식을 받거나 이식을 받으려고 하는 환자인 경우에 면역억제 치료에 적격일 수 있다. 특히, 손상된 CD4+ T 세포 수 및 기능의 감소된 면역성의 후천적 또는 선천적 상태를 갖는 임의의 환자가, 근원적 면역손상이 고쳐진 경우 PML 및 이후의 PML-IRIS가 발생할 위험이 잠재적으로 있다.

본 발명의 상황에서, 면역억제 치료는, 예를 들어, 사이클로스포린 또는 FK506 결합 단백질, 세포독성 약물(예를 들어, 사이클로포스파미드, 미톡산트론, 부술판 및 혈액 또는 고형 종양의 치료에서 단일 약물 또는 조합 요법으로 표준 사용되는 많은 다른 약물) 또는 면역억제 또는 면역조절 항체, 예를 들어, 나탈리주맙, 에팔리주맙, 리툭시맙, 오크렐리주맙 및 알렘투주맙을 포함하는 군으로부터 선택된 모노클로날 항체를 이용한 치료일 수 있다.

면역억제 치료는 바람직하게는 하나 이상의 면역억제 항체, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 모노클로날 항체 또는 다른 생물학적 약제, 세포 요법 또는 소분자-기반 치료를 이용한 피검체의 치료를 포함한다. 예를 들어, 나탈리주맙(항-VLA-4), 에팔리주맙(항-백혈구 기능-관련 항원-1, 이미 시장으로부터 회수됨), 리툭시맙(항-CD20), 오크렐리주맙(항-CD20), 알렘투주맙(항-CD52) 또는 인플릭시맙(항-종양 괴사 인자(TNF)-알파) 또는 IgG1-TNF 수용체 2 융합 단백질 에타너셉트를 포함하는 암 및 자가면역 질병에서 사용되는 여러 주요 모노클로날 항체를 이용한 면역억제 치료가 PML 및/또는 PML-IRIS를 발생시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 위험은 본 발명의 수단에 의해 예방되거나 감소될 수 있다. 다른 생물학적 약제 또는 소분자, 예를 들어, 나탈리주맙에 대한 경우에서와 같이 CNS로의 활성화된 면역 세포의 이동(CNS 면역 감시 동안) 또는 핑골리모드(fingolimod), 및 유사한 효과를 갖는 다른 생물학적 약제 또는 소분자에 대한 경우에서와 같이 이차 림프 기관에서의 세포 포획과 같은 특정 면역 기능을 손상시키는 스핑고신-포스페이트 수용체 1 효능제인 핑골리모드가 PML/PML-IRIS를 발생시킬 위험을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 따라서, 예방적 또는 치료적 치료에 의해 본 발명의 펩티드 및 단백질에 의해 치료되는 피검체는 나탈리주맙, 에팔리주맙, 리툭시맙, 오크렐리주맙 및 알렘투주맙 또는 또 다른 면역억제제(상기 참조)의 군으로부터 선택된 하나 이상의 모노클로날 항체에 의해 현재 치료되는 피검체, 또는 상기 치료가 계획 중인 피검체인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 피검체는 항체 나탈리주맙 또는 이의 유도체로 치료된다.

한 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 면역억제 항체 중 하나 이상, 바람직하게는, 나탈리주맙을 투여 받는 피검체로의, 예를 들어, 펜타머 형태 또는 VP1 또는 VP1 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 VLP의 형태의 VP1 단백질 또는 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질의 투여를 포함하는 예방적 또는 치료적 예방접종에 관한 것이다.

본 발명의 키트를 이용한 피검체의 치료는 JCV의 보인자인 것으로 진단된 피검체에게 특히 유리할 수 있다. 그러나, 예를 들어, 면역억제 치료의 과정에서 피검체가 JCV에 새로이 감염될 유의한 위험이 또한 존재한다. 따라서, JCV 감염의 진단이 수행되지 않거나, JCV에 대한 시험이 음성인 경우에 본 발명의 키트에 의해 JCV에 대해 피검체를 면역화시키는 것이 또한 유리하다.

본 발명의 키트의 성분은 바람직하게는 하기 군으로부터 선택된 피검체에 투여된다:

a) 면역손상 또는 면역결핍 피검체, 예를 들어, HIV의 보인자, 면역억제 치료를 받는 피검체 또는 선천적 면역결핍 환자, 예를 들어, 특발성 CD4+ 림프구감소증 또는 과-IgE-증후군을 갖는 환자;

b) 면역억제 치료에 적격인 피검체.

한 양태에서, 본 발명은 PML 치료, 즉, PML을 갖는 것으로 진단된 피검체를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 약학적 키트에 관한 것이다. 본 발명자에 의해 놀랍게도 밝혀진 바와 같이, JCV에 대한 면역성이 본 발명에 의해 유도될 수 있고, JCV는 뇌로부터 제거될 수 있고, PML의 증상은 치유(감소 또는 제거)될 수 있다.

본 발명은 또한 하기 군으로부터 선택된 피검체에서 PML 및/또는 PML-IRIS를 예방하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 약학적 키트에 관한 것이다:

a) 면역손상 또는 면역결핍 피검체, 예를 들어, HIV의 보인자, 면역억제 치료를 받는 피검체 또는 선천적 면역결핍 환자, 예를 들어, 특발성 CD4+ 림프구감소증 또는 과-IgE-증후군을 갖는 환자; 및

b) 면역억제 치료에 적격인 피검체.

면역억제 치료는, 예를 들어, 자가면역 질병을 갖는 것으로 진단된 피검체 또는 이식 환자의 치료일 수 있다. 키트의 성분은 면역억제 치료 전, 치료 후 또는 치료 동안 상기 환자에 투여될 수 있다. 특히, 면역억제 치료의 개시가 급하지 않은 경우, 면역억제 치료가 개시되기 전에 본 발명에 의해 JCV에 대한 면역 반응을 개시시키거나 부스팅시키는 것이 유리할 수 있다. 그러나, 본 발명자는 면역손상된 개체에서 PML을 치료하기에 충분한 JCV에 대한 면역 반응을 달성하는 것이 또한 가능한 것을 밝혀내었다. 이는 면역억제 치료를 받는 피검체와 유사한 상황이다.

일부 상황에서, 처음 며칠 또는 몇 주 동안(예를 들어, 본 발명의 면역화 2일, 5일, 7일, 14일 또는 28일 후), 또는 뇌로부터의 JCV의 청소가 밝혀지거나 PML의 증상이 치유될 때까지 면역억제 치료를 감소시키거나 중단하는 것이 유리할 수 있다. 이는 환자의 면역 상태 및 환자에서의 면역억제 치료를 감소시키거나 중단할 위험에 따라 의학 진료의에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 면역 자극성 치료, 예를 들어, IL-7을 이용한 치료가 피검체에 제공될 수 있다.

본 발명은 또한 PML을 치료하는 방법 및 PML 및/또는 PML-IRIS를 예방하는 방법에 관한 것으로, 이는,

a) JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드가 환자에 투여되는 단계로서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택되는, 단계, 및

b) 임의로, TLR-7 효능제 및/또는 TLR-8 효능제를 포함하는 군으로부터 선택된 애쥬번트가 환자에게 투여되는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드에 관한 것으로, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택된다. 상기 단백질 또는 펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 적합한 키트의 한 성분이며, 따라서 상기 키트를 제조하고, 애쥬번트를 첨가하는데 적합하다.

본 발명자는 개시된 CD4+ 에피토프의 생물학적 관련성을 밝혀내었고, 상기 에피토프로 구성되는 펩티드를 처음 분리하였다. 본 발명의 상황에서, 에피토프는 항원 제시 세포에 의해 추가로 가공되거나 추가로 가공됨이 없이 MHC II와 관련하여 제공될 수 있고, 즉, 상기 용어 에피토프는 CD4+ T 세포 반응을 유도할 수 있고, 반드시 MHC II로부터 분리될 수 있는 펩티드일 필요는 없는 것으로 본 발명에 의해 밝혀진 SEQ ID NO:1-92에 개시된 바와 같은 아미노산 서열에 관한 것이다.

JCV로부터 유래된, SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:46-76을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 에피토프를 추가로 포함하는 VP1의 융합 단백질 또는 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질일 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 또는 펩티드는 하나 이상의 자연 JCV 단백질, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 JCV 단백질로부터의 에피토프를 포함할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, JCV로부터 유래된, SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드가 본 발명의 키트를 제조하고, 즉, JCV에 대한 피검체의 면역화를 위해, 예를 들어, PML 또는 PML-IRIS를 치료하거나 예방하기 위해 이용될 수 있다. 대안적으로, JCV로부터 유래된, SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드는 JCV에 의한 감염을 진단하는데 사용될 수 있다. 특히, 이는, 바람직하게는 증상 및/또는 MRI 또는 뇌의 분석과 같은 다른 방법의 상황에서 PML을 진단하는데 사용될 수 있다.

본원에 기재된 단백질 또는 펩티드는 JCV에 의한 감염을 진단하는 방법에서 사용하고/하거나 PML을 진단하는데 매우 적합하다. 따라서, 본 발명은 또한 피검체로부터의 샘플과 JCV로부터 유래된 SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 접촉시키는 것을 포함하는, JCV에 의한 감염을 진단하거나 PML을 진단하는 방법에 관한 것이다.

한 구체예에서, 감염을 진단하기 위한 방법은 상기 단백질 또는 펩티드에 대한 샘플로부터의 항체의 결합에 적합한 조건하에서 수행된다. 샘플에 대한 항체의 결합이, 예를 들어, ELISA에 의해 검출되는 경우, 피검체는 JCV에 의해 감염되어 있거나, JCV에 의해 감염된 적이 있는 것이다.

한 바람직한 구체예에서, CD4+ 에피토프를 포함하는 바와 같은 본 발명의 단백질 또는 펩티드의 특징이 활용된다. 감염을 진단하기 위한 방법은 에피토프/에피토프들의 존재에 대해 샘플 내의 CD4+ T 세포의 반응을 검출하는데 적합한 조건하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 3H-티미딘의 포함, 브로모-2'-데옥시유리딘(BrdU)의 포함을 측정할 수 있는 T 세포에 대한 증식 검정, 또는 CD25 또는 하나 이상의 사이토카인과 같은 활성화 마커의 발현에 대한 검정이 이용될 수 있다. ELISPOT 검정이 이용될 수 있으나, ELISA 검정, 신틸레이션 검정 또는 세포외 또는 세포내 FACS가 또한 적합할 수 있다. 개시된 에피토프/에피토프들을 포함하는 단백질 또는 펩티드에 의한 CD4+ 활성화에 대한 검정은 PCR 시험 및/또는 환자로부터의 샘플 내의 JCV에 대한 항체의 존재에 대한 시험과 조합되는 경우 피검체의 JCV 감염 또는 면역 상태와 관련된 추가 정보를 제공할 수 있거나, 이는 당 분야의 상태에서 이전에 공지된 상기 시험 대신에 사용될 수 있다.

한 구체예에서, CD4+ T 세포 활성화가 시험되고, CD4+ T 세포의 표현형이 분석되고, 예를 들어, Th1, Th2 또는 Th1/2 표현형이 결정된다. 이는 당 분야의 상태에서 공지된 바와 같은 사이토카인의 발현, 및/또는 전사 인자와 같은 다른 분화 마커의 발현을 기초로 하여 수행될 수 있다.

본 발명의 상황에서, 분석(및 이러한 분석에 의해 변형)되는 샘플은 바람직하게는 혈액 샘플, 뇌 조직 샘플, 예를 들어, 뇌 실질로부터의 샘플 또는, 예를 들어, 뇌 생검 또는 천공으로부터 또는 이들로부터 유래되는 뇌척수액(CSF)의 샘플이다. 예를 들어, T 세포 활성이 분석되는 경우, PBMC 또는 T 세포는 당 분야에 공지된 방법에 의해 혈액 또는 CSF로부터 분리될 수 있다. 그러나, 본 발명자는 뇌 실질과 같은 뇌 조직으로부터 T 세포의 T 세포 활성을 분석하는 것이 바람직한 것을 밝혀내었다. 항체가 분석되는 경우, 혈청이 사용될 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 피검체 또는 환자는 인간이다. 대안적으로, 피검체 또는 환자는 또한 인간화된 동물, 예를 들어, 실험 시스템에서 JCV에 의한 감염에 민감한 인간화된 마우스일 수 있다. 피검체/환자가 인간임에 따라, 달리 특별히 언급되지 않는 경우 본 출원에서 언급된 단백질은 또한 바람직하게는 인간 또는 또는 인간 기원의 단백질이다. 예를 들어, IL-7은 IL-7 수용체에 결합할 수 있고 이의 신호전달을 매개할 수 있는 인간 IL-7 또는 이의 유도체이어야 한다. 이는, 예를 들어, 융합 단백질 형태의 재조합 IL-7일 수 있다. TLR은 또한 인간 TLR이다.

JCV에 대한 면역 반응 및 뇌로부터의 바이러스의 청소에서의 CD4+ 반응의 중요성을 인지한 본 발명자는 폴리오마 바이러스 JC의 면역원성 에피토프를 맵핑하였다. JCV의 3개의 열린해독틀로부터의 면역우세 펩티드가 확인되었다. 주요 캡시드 단백질 내에 중요한 변이체를 포함하는 JCV의 모든 열린해독틀에 걸친 중첩 펩티드의 한 세트의 펩티드가 시험되었다. 확인된 CD4+ T 세포 에피토프는 JCV 감염 상태의 진단 시험에 사용될 수 있으나, 환자/대조군, 예를 들어, JCV에 대해 약한 면역 반응을 갖고(본질적이거나 질병(예를 들어, AIDS, 본질적 면역결핍, 예를 들어, 특발성 CD4+ 림프구감소증) 또는 치료(암 요법, 모노클로날 항체 요법, 예를 들어, MS에서의 나탈리주맙, 및 또한 다른 요법)로 인함), PML이 발생할 위험이 있거나 PML이 이미 발생한 적이 있는 피검체를 예방접종하는데 또한 사용될 수 있다.

본 발명자는 모든 JCV 단백질에 대해 CD4+ T 세포 에피토프의 미세 특이성을 맵핑하였다. PML 및 PML-면역 재구성 염증 증후군(PML-IRIS)에 걸린 환자의 뇌 생검으로부터의 T 세포 배양물 및 T 세포 클론이 시험되었다. 상기 면역 반응은 바이러스의 가장 중요한 에피토프를 표적으로 하고, 바이러스의 제거를 발생시키고 감염을 함유하는 의미에서 보호적이므로, 건강한 대조군 및 다발경화증(MS) 환자의 말초 혈액 림프구의 시험으로부터의 맵핑 데이터, 및 특히 PML-IRIS 동안 뇌-침윤 T 세포의 항원 미세 특이성의 특성규명으로부터의 데이터는 진단 및 예방접종/치료 목적을 위한 생물학적 관련성 및 유용성을 뒷받침한다.

또한, 본 발명의 과정에서, 64세의 연령에서 PML이 발생한 희귀한 본질적 면역결핍인 특발성 CD4+ 림프구감소증을 갖는 환자에서 개별적 치유 시도가 수행되었다. 이러한 환자에서, 본 발명자는 전체 주요 캡시드 단백질 VP1을 이용한 예방접종이 특정 조건하에서 JCV가 뇌로부터 제거될 수 있는 지점까지 JCV에 대한 불충분한 면역 반응을 부스팅할 수 있는 상황을 시험하였다. 본 발명자는 피부 적용되는 TLR7 효능제(이미퀴모드, Aldara) 및 재조합 i.v. IL-7(Cytheris)와 조합된 재조합 VP1 단백질의 피하 주사에 의해 환자를 예방접종하였다. 환자는 단지 2회의 예방접종 후에 JCV VP1에 대한 시험관내 증식 반응을 나타냈을 뿐만 아니라, 혈청 JCV 바이러스 로드를 0으로 감소시켰고, 뇌 MRI 영상화에 의해 약간의 대조 증강 및 약간 상승된 CSF 세포 수를 나타내기 시작하였고, 최종적으로 임상적으로 개선되며, 이들 모두는 예방접종이 생체내에서 작용한 것을 뒷받침한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 본원에 인용된 모든 간행물은 모든 목적상 본원에 완전히 포함된다.

도면

도 1: a) 뇌 생검으로부터의 PHA-확장된 벌크 단핵 세포 집단(좌측 패널), CSF(좌측으로부터 두번째 패널) 및 PBMC(좌측으로부터 세번째 패널) 뿐만 아니라 조작되지 않은 PBMC(우측 패널)가 JCV VP1/VLP 단백질 및 파상풍 톡소이드 단백질(TTx)에 대해 시험되었다. 결과는 평균 SI ± SEM을 제시한다. y-축에 대해 다양한 척도를 주의하라. b) 뇌 생검으로부터의 PHA-확장된 CD4⁺ T 세포(좌측 패널), CSF(좌측으로부터 두번째 패널), PBMC(좌측으로부터 세번째 패널) 및 조작되지 않은 PBMC(우측 패널)에서의 Th1-, Th2-, Th17- 및 Th1-2 세포의 생체외 정량. 숫자는 양성 세포의 백분율을 나타낸다. Th1은 CD4⁺ IFN-감마⁺ IL-17A^-/IL-4^-로 확인되었고; Th17 세포는 CD4⁺ IL-17A⁺ IFN-감마^-로 확인되었고; Th2는 CD4⁺ IL-4⁺ IFN-감마^-로 확인되었고; Th1-2는 CD4⁺ IFN-감마⁺ IL-4⁺로 확인되었다.

도 2: a) JCV의 모든 열린해독틀(Agno, VP1, VP2, VP3, 큰-T, 및 작은-T 단백질을 포함함)에 걸쳐 있고, 각각 5개 펩티드의 41개의 푸울로 조직된 204개의 중첩 15-mer 펩티드에 대한 뇌-유래 PHA-확장 세포의 증식 반응. 결과는 평균 SI ± SEM을 제시한다. 다양한 패턴의 막대는 다양한 열린해독틀에 해당한다. JCV 유전체 내의 5개의 열린해독틀의 개략적 표시(상부 우측 도면). b) 개별적 JCV 펩티드에 대한 뇌-유래 벌크 단핵 세포 집단의 증식 반응. 결과는 평균 SI ± SEM을 제시한다. 패널 a 및 b에서 y-축에 대해 다양한 척도를 주의하라. c) 뇌 생검으로부터의 PHA-확장된 세포에서 가장 강한 증식 반응을 유도하는 5개의 JCV 펩티드에 특이적인 T 세포의 전구체 빈도. d) HLA-A*02:01-VP1₃₆ 테트라머(중간 그래프) 및 HLA-A*02:01-VP1₁₀₀ 테트라머(하부 그래프)에 결합하는 CD8+ T 세포의 백분율.

도 3: a) 뇌 생검 내의 각각의 개별적 TCC의 빈도를 나타내는 고리 모양. b) 64개의 개별적 VP1 펩티드에 대한 TCC의 증식 반응. 결과는 평균 SI ± SEM을 제시한다. c) 뇌-유래 벌크 집단(상부 그래프, 평균 SI ± SEM을 제시함) 및 다양한 TCC(하부 그래프, 다양한 패턴은 다양한 TCC에 해당하고, 각각의 단일 세포 성장 배양물은 사각형에 의해 표시됨)에 대해 확인된 면역우세 펩티드의 개략적 표시.

도 4: a) Th1-2(상부 플롯) 및 Th1(하부 플롯) VP1/VLP-특이적 CD4⁺ T 세포 클론에 의한 세포내 IFN-감마 및 IL-4 생성의 대표적 흐름세포측정 분석. b) 도트-플롯은 세포내 사이토카인 염색에 의한 Th1-2 및 Th1 표현형을 갖는 VP1-특이적 뇌-유래 단일 세포 배양물의 백분율을 나타낸다. 각각의 도트는 분석된 21개의 단일 세포 배양물 중 하나에 해당한다. 고리 모양은 각각의 TCC의 기능적 표현형을 나타낸다. c) PHA를 이용한 자극 72시간 후의 Th1-2 TCC(n=5, 흑색 막대) 및 Th1 TCC(n=6, 백색 막대)의 배양 상층액 중의 IFN-감마 및 IL-4 생성의 ELISA 검출. 결과는 평균 ± SEM을 제시한다. d) Th1-2 TCC(n=5, 흑색 막대) 및 Th1 TCC(n=6, 백색 막대)의 전사 인자 Gata3 및 t-bet에 대한 RT-PCR 분석. 값은 뇌-유래 PHA-확장 세포에 비한 상대 발현이다(교정자 =1). 결과는 평균 ± SEM을 제시한다.

도 5. VP1을 이용한 면역손상된 피검체의 면역화에 대한 치료 계획. M=개월, D=일, W=주, MRI= 자기 공명 영상화. 애쥬번트(이미퀴모드)가 VP1의 투여 후에 직접 투여되었다.

도 6. 치료 동안의 VP1 면역 반응의 발생. VLP1= VP1 단백질로 구성된 바이러스 유사 입자 1, TT= 파상풍 톡소이드.

도 7. 치료 과정. 도 7A는 VP1 자극 후의 바이러스 로드 및 평균 SI를 도시하고, 도 7B는 CSF 내의 백혈구 수를 도시한다. IL-7 및 VP1의 투여 시점은 동일하고, 도 5에 도시된 계획에 해당한다.

도 8. VP1-특이적 T-세포의 특성규명. CD4+ 세포만 VP1 자극 후(면역화 6주 후)에 증식한다.

도 9. 증식하는 CD4 세포는 활성화된 기억 세포이다.

도 10. VP1에 의해 활성화된 CD4+ T 세포는 높은 백그라운드의 IL-4를 발현하고, VP1 자극 후에 IFN-감마를 생성한다. CD4+ T 세포는 0일에 항원으로 자극되었다. 6일에, 이들은 항원으로 재자극되었고, 1시간 후에, 분비가 브레펠딘 A로 블로킹되었고, 15시간 후에, 세포내 사이토카인 염색이 수행되었고, FACS에 의해 분석되었다.

도 11. 3H-티미딘 통합 검정. 지정된 시점에서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 환자로부터 수득되었고, 항원(VP1/VLP)으로 새로이 시딩(1x10e5 세포/웰)되었다. 인큐베이션 7일 후, 3H-티미딘 통합이 측정되었다. >2의 자극 지수가 양성 반응으로 간주된다. SI는 그래프의 y-축 상에 제시된다.

실시예 1 - 면역우세 CD4+ 에피토프의 확인

재료 및 방법

환자

HLA-클래스 II 타입: DRB1*13:01, _*16:01; DRB3*02:02; DRB5*02:02; DQA1 *01:02, _*01:03; DQB1*05:02, _*06:03(환자 1); 및 DRB1*11:03, _*15:01; DRB3*02:02; DRB5*01:01; DQA1*01:02, _*05:XX(X는 정확한 서브타입으로 유형 분류되지 않은 것을 나타냄); DQB1*03:01, _*06:02(환자 2).

신경병리학

약 0.1 ㎖의 전체 부피의 작은 조직 단편을 개방 생검에 의해 수득하였다. 2시간 동안 완충된 포르말린 중에서의 고정 후, 조직을 파라핀에 포매시켰다. 4 ㎛의 마이크로톰 섹션을 헤마톡실린-에오신(H&E), 반 기슨 트리크롬(van Gieson's trichrome), PAS, 시더린(siderin) 및 룩솔(Luxol)에 대한 턴불 염색(Turnbull's stain)으로 염색하였다. 면역조직화학 염색을 다음과 같은 항체를 이용하여 제조업체의 설명서에 따라 자동화된 Ventana HX IHC 시스템, benchmark(Ventana-Roche Medical systems, Tucson, AZ, USA)에서 수행하였다: 항-CD45/LCA(DAKO, Glostrup, Denmark; M701), 항-CD3(DAKO; M1580), 항-CD45R0(DAKO; M0742), 항-CD20(DAKO; M0755), 항-CD79a(DAKO; M7050), 항-CD68(Immunotech/Beckmann-Coulter, Krefeld, Germany, 2164), 항-HLA-DR(DAKO; M775), 항-NF(Zymed/Invitrogen, Darmstadt, Germany, 80742971), 항-GFAP(DAKO; Z334) 및 항-p53(DAKO; M7001).

뇌-유래, CSF-유래 및 말초 혈액 단핵 세포의 뇌 조직 가공 및 확장

약 0.033 ㎖의 생검을 작은 단편으로 절단하고, 45분 동안 수조에서 37℃에서 1 ㎎/㎖ 콜라게나제 A(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany) 및 0.1 ㎎/㎖ DNAse I(Roche)을 함유하는 용액에서의 인큐베이션에 의해 분쇄시켰다. 생성된 세포 현탁액을 3회 세척하였고, 뇌-유래 단핵 세포를 Percoll 밀도 구배 원심분리(GE Healthcare, Munich, Germany)를 이용하여 분리시켰다. 세포를 30% Percoll 용액 중에 재현탁시키고, 78% Percoll 용액을 이용하여 조심스럽게 하층화(underlayer)시켰다. 원심분리 후, 뇌-유래 단핵 세포를 구배의 경계면으로부터 회수하였다.

CSF-유래 단핵 세포를 진단 척추 천자로부터 직접 수득하고, 말초 혈액 단핵 세포를 Ficoll 밀도 구배 원심분리(PAA, Pasching, Austria)에 의해 분리시켰다.

2 x 10⁵개의 비-자가의 방사선 조사된 PBMC(3,000 rad) 및 1 ㎍/㎖의 PHA-L(Sigma, St Louis, MO)과 함께 웰 당 2000개의 세포를 시딩함으로써 뇌-유래, CSF-유래 및 말초 혈액-유래 단핵 세포를 96-웰 U-바닥 미세역가 플레이트에서 확장시켰다. 배지는 100 U/㎖의 페니실린/스트렙토마이신(PAA), 50 ㎍/㎖의 겐타마이신(BioWhittaker, Cambrex), 2 mM L-글루타민(GIBCO, Invitrogen) 및 5% 열-보체제거된 인간 혈청(PAA)을 함유하는 RPMI(PAA)로 구성되었다. 24시간 후, 20 U/㎖의 인간 재조합 IL-2(hrIL-2, Tecin, Roche Diagnostics)을 첨가하고, 추가 hrIL2를 3-4일 마다 첨가하였다. 2주 후, 세포를 푸울링시키고, 분석하고, 냉동보존시키거나 1 ㎍/㎖의 PHA, 20 U/㎖의 hrIL-2 및 동종이형의 방사선 조사된 PBMC로 다시 재자극시켰다.

뇌-유래 단핵 세포의 흐름세포측정 분석

뇌 분해로부터 직접적으로 유래되는 뇌-유래 단핵 세포를 표면 마커에 대한 다음과 같은 항체로 염색시켰다: CD45(AmCyan, 2D1, BD Pharmingen, San Diego, USA), CD56(Alexa 488, B159, BD Pharmingen), CD3(PeCy7, UCHT1, eBioscience, San Diego, USA), CD4(APC, RPA-T4, eBioscience), CD8(PB, DK25, Dako, Glostrup, Denmark), CD45RO(FITC, UCHL1, eBioscience), CD19(FITC, HIB19, BD Pharmingen), CD38(APC, HIT2, BD Pharmingen), 및 CD27(APC-Alexa 750, CLB-27/1, Invitrogen). a3 LSRII(BD Biosciences, Heidelberg, Germany) 흐름세포측정기에서 분석을 수행하였다.

단백질 및 펩티드

JCV-특이적 T 세포의 확인을 위해, 전체 JC 바이러스 프로테옴을 포함하는 204개(13-16 mer)의 펩티드를 적용시켰다. 펩티드는 pe(peptides and elephants GmbH, Potsdam, Germany)에 의해 합성되고 제공되었다. 이들 204개의 펩티드는 5개의 아미노산에 의해 중첩되고, 35개의 공통의 단일 아미노산 돌연변이를 포함한다. 다양한 JCV 유전형 및 계통 사이에서 발생하는 아미노산 변화를 설명하기 위해, GenBank(March 2008)에서 이용가능한 모든 479개의 JCV 유전체 서열로부터의 Agno, VP1, VP2, VP3, 큰 T 항원 및 작은 t 항원을 포함하는 각각의 JCV 엔코딩된 단백질의 아미노산 서열을 정렬시키고, 모든 회수된 서열의 1% 초과에서 우세한 다형태를 공통 돌연변이로 규정하였다.

개별적 펩티드가 CNS-유래 T 세포에 의해 인지되는지 결정하기 위해, 2-차 시딩 계획을 적용하였다. 펩티드를 82개 푸울의 세트로 배열하였고, 각각의 푸울은 5개의 상이한 펩티드를 함유한다. 직각 매트릭스에 따른 각각의 웰에서의 상이한 펩티드, 및 잔여 펩티드가 상이한 정확히 2개의 푸울 내에서 보이는 각각의 개별적 펩티드의 조합에 의해, 면역원성 후보 펩티드가 양성 푸울의 교차점에서 확인될 수 있었다.

JCV VP1 단백질은 바이러스-유사 입자(VLP)를 형성하고, 따라서 VP1 및 VLP는 상호교환가능한 용어로 사용된다. VP1 단백질 형성 VLP(VP1/VLP)가 이전에 기재된 바와 같이 Life Science Inkubator, Bonn, Germany에 의해 생성되었다(Goldmann et al, 1999). 10개 아미노산의 중첩을 갖고, MBP(16 펩티드), MOG(25 펩티드) 및 PLP(27 펩티드)를 포함하는 20 mer 미엘린 펩티드는 PEPScreen, Custom Peptide Libraries, SIGMA에 의해 합성되었고 제공되었다. 파상풍 톡소이드(TTx)(Novartis Behring, Marburg, Germany)를 양성 대조군으로 사용하였다.

증식 검정

72시간 동안 펩티드와 함께 또는 펩티드 없이 96-웰 U-바닥 미세역가 플레이트에 웰 당 2-2.5 x 10⁴개의 뇌-유래, CSF-유래 또는 말초 혈액-유래 PHA-확장 세포 및 1 x 10⁵개의 자가 방사선 조사된 PBMC를 이중으로 시딩함으로써 JCV 펩티드, VP1/VLP 및 TTx의 인지를 시험하였다. 조작되지 않은 PBMC를 7-일의 일차 증식에서 2 x 10⁵개의 세포/웰로 시험하였다. TTx에 더하여, PHA-L 자극을 양성 대조군으로 추가하였다. 모든 JCV 펩티드를 푸울 내의 펩티드에 대해 펩티드 당 2 μM의 최종 농도 및 개별적 펩티드에 대해 10 μM의 농도로 푸울 내에서 또는 개별적 펩티드로 시험하였다. VP1/VLP를 2 ㎍/㎖로 시험하고, 파상풍 톡소이드(TTx)를 5 ㎍/㎖로 시험하고, PHA를 1 ㎍/㎖로 시험하였다. 신틸레이션 베타 계수기(Wallac 1450, PerkinElmer, Rodgau-Jurgesheim, Germany) 내의 ³H-티미딘(Hartmann Analytic, Braunschweig, Germany) 포함에 의해 증식을 측정하였다. 자극 지수(SI)를 SI = 평균 cpm(분당 수)(펩티드)/평균 cpm(백그라운드)로 계산하였다. SI > 3, cpm > 1000 및 평균 백그라운드 cpm을 초과하는 적어도 3개의 표준 편차(SD)인 경우에 반응을 양성으로 간주하였다.

미엘린 펩티드를 상기 기재된 바와 같이 5 μM으로 개별적 펩티드로 시험하였다.

뇌-유래 VP1/VLP-특이적 T 세포 클론의 생성

2.5 x 10⁴개의 뇌-유래 PHA-확장 세포를 VP1/VLP 단백질과 함께 또는 VP1/VLP 단백질 없이 1 x 10⁵개의 자가의 방사선 조사된 PBMC와 함께 96-웰 U-바닥 미세역가 플레이트에 시딩하였다. 배양 48시간 후, 플레이트를 마더(mother) 및 도터(daughter) 플레이트로 분할하였다. 증식을 메틸-³H-티미딘 포함에 의해 도터 플레이트에서 측정하였다. VP1/VLP-반응성 배양물을 마더 플레이트에서 확인하였고, IL-2를 12일까지 3-4일마다 첨가하였다. 96-웰 U-바닥 미세역가 플레이트 내에서의 0.3 및 1개의 세포/웰의 제한 희석 조건 하에서의 VP1/VLP-반응성 웰로부터의 세포의 시딩, 및 완전 RPMI 중의 2 x 10⁵개의 동종이형의 방사선 조사된 PBMC 및 1 ㎍/㎖의 PHA-L의 첨가에 의해 T 세포 클론(TCC)을 양성 배양물로부터 확립시켰다. 24시간 후, 20 U/㎖의 인간 재조합 IL-2를 첨가하였다. 이후, 72시간 동안 VP1/VLP 단백질과 함께 또는 VP1/VLP 단백질 없이 자가의 방사선 조사된 PBMC와 함께 성장하는 콜로니로부터의 2.5 x 10⁴개의 세포의 시딩에서 VP1/VLP 특이성이 확인되었다. 특정 배양물을 1 ㎍/㎖의 PHA-L, 20 U/㎖의 hrIL-2 및 동종이형의 방사선 조사된 PBMC로 2주마다 재자극시키고, hrIL2를 3-4일마다 첨가하였다.

TCR 분석

TCR Vβ 사슬 발현을 CD4(APC, eBioscience) 및 CD8(PB, PB, DakoCytomation, Denmark)와 조합된 22개의 항 TCRBV 모노클로날 항체(Immunotech, Marseille, France, (Muraro et al, 2000))에 의해 PHA-확장 세포 및 T 세포 클론에서 평가하였다.

CNS-유래 단핵 세포에서의 전구체 빈도의 결정

VP1/VLP-특이적 세포의 빈도를 제한 희석에 의해 결정하였다. 20, 200, 2,000 또는 20,000개의 뇌-유래 PHA-확장 세포를 VP1/VLP 단백질과 함께 또는 VP1/VLP 단백질 없이 1 x 10⁵개의 자가의 방사선 조사된 PBMC를 갖는 96-웰 U-바닥 미세역가 플레이트에 사중으로 시딩하였다. 72시간 후, 메틸-³H-티미딘 포함에 의해 증식을 측정하였다. 이전에 기재된 바와 같이 빈도를 계산하였다(Taswell, 1981). 관찰된 데이터는 다음과 같다: r, 음성적으로 반응하는 배양물 또는 각각의 용량 i의 웰의 수; n, 용량 i 당 웰의 전체 수; 및 λ, 용량 i 내의 세포의 수. 계산된 데이터는 다음과 같았다: pi = ri/ni, 각각의 용량 i의 음성적으로 반응하는 배양물의 분획. 빈도를 다음과 같은 식을 이용하여 계산하였다: f = -(ln pi)/λi.

사이토카인 생성

세포내 사이토카인 염색을 위해, PHA-확장 세포 및 TCC를 마지막 재자극 12일 후에 분석하였다. 세포를 5시간 동안 브레펠딘 A(10 ㎍/㎖, eBioscience)의 존재하에서 PMA(50 ng/㎖, Sigma) 및 이오노마이신(ionomycin)(1 ㎍/㎖, Sigma)으로 자극하였다. 다음으로, 세포를 LIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stain Kit(AmCyan, Molecular Probes, Invitrogen)로 염색시키고, 해당 완충액(eBioscience)을 이용하여 고정시키고, 투과화시키고, 실온에서 CD3(PE, DakoCytomation, Denmark), CD8(PB, DakoCytomation, Denmark), IFN감마(FITC, BDPharmingen), IL-4(PE-Cy7, eBioscience) 및 IL-17A(Alexa Fluor®-647, eBioscience)에 대해 염색하였다. IFN-감마-, IL-4- 및 IL-2 수준을 또한 PHA 또는 VP1/VLP를 이용한 자극 72시간 후에 PHA-확장 세포의 배양 상층액 및 TCC 중에서 제조업체의 프로토콜(Bio-source, Camarillo, California)에 따라 ELISA에 의해 결정하였다.

RT-PCR에 의한 mRNA 발현 수준의 정량

mRNA 유전자 발현 검정을 위해, 프라이머 및 프로브 세트(Tbet, Hs00203436_ml 및 Gata3, Hs00231122_ml)를 Applied Biosystems(Foster City, CA)로부터 구입하였다. 18S rRNA를 내인성 대조군으로 사용하였고, 상대 유전자 발현을 교정자로서 뇌-유래 PHA-확장 세포를 이용하여 ΔΔCt 방법에 의해 계산하였다.

VP1/VLP-특이적 항체에 대한 ELISA

둘 모두의 IRIS-PML 환자로부터의 CSF 및 혈청 중의 VP1/VPL-특이적 면역글로불린 G 항체의 역가를 이전에 기재된 바와 같이 결정하였다(Weber et al., 1997). 간단히, ELISA 플레이트를 100 ㎖ VP1-VLP(1 ㎎/㎖)로 코팅하고, CSF 또는 혈청의 연속 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 인간 IgG를 비오틴 컨쥬게이션된 항-인간 Fc 항체(eBioscience)에 의해 포획하고, 아비딘 호스라디쉬 퍼옥시다제(eBioscience)에 의해 검출하였다. CSF 뿐만 아니라 혈청 중에서의 항체 역가를 특정 구획 내의 IgG의 전체량으로 조정하였다. 결과를 표준으로서 동일 인간 혈청을 항상 이용하여 표준화된 임의의 단위로 표현하였다.

HLA-A*0201/JCV VP1 ₃₆ 및 VP1 ₁₀₀ 테트라머 및 테트라머 염색

HLA-A*02:01 테트라머 복합체를 이전에 기재된 바와 같이 합성하였다. 간단히, HLA-A*02:01, β2 마이크로글로불린 및 에피토프 펩티드를 재폴딩시키고, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분리시켰다. 부위-특이적 비오티닐화를 HLA-A*0201 분자의 마지막 C 말단 세포외 도메인에 대한 BirA 표적 서열의 첨가를 통해 달성하였다. 테트라머 복합체를 엑스트라비딘(Extravidin)-PE(Sigma)를 이용하여 생성시켰다. PHA-확장 뇌-침윤 세포를 항-CD2/CD3/CD28 MAC 비드(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)로 자극시키고, 자극 5일 후, 세포를 세척하고, 5 x 10⁶ 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 100 ㎕를 3 ㎕의 PE-커플링된 테트라머 HLA-A*02:01/JCV VP1₃₆ 또는 HLA-A*02:01/JCV VP1₁₀₀으로 염색시켰다. 37℃에서의 30분의 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 얼음 상에서 추가 30분 동안 항-CD3(PB, eBiolegend, San Diego, CA) 및 항-CD8(FITC, Dako)로 염색하였다. 이후, 세포를 세척하고, 흐름세포측정에 의한 분석 전에 0.5% 파라포름알데하이드로 고정시켰다.

결과

나탈리주맙-관련 PML-IRIS의 2명의 환자

재발-완화 MS(RR-MS)를 갖는 41 및 43세의 2명의 남성 환자는 나탈리주맙 치료 각각 28 및 40개월 후에 임상 징후(환자 1에서 시야 결손; 환자 2에서 단불완전마비) 및 PML이 의심되는 영상 결과를 갖는 것으로 각각 2009년 7월 및 2010년 1월에 나타내었다. 나탈리주맙을 즉시 중단시키고, 여러 라운드의 혈장분리반출술을 수행하였다. 둘 모두의 환자는 이후에 MRI 상에서 대조 증강의 반점형 또는 띠(band)-유사 영역(도 1a) 및 환자 1에서 시각의 완전한 상실, 및 환자 2에서 반마비, 반맹 및 신경심리 황폐의 악화된 임상 결과를 갖는 PML-IRIS가 발생하였다. 진단 정밀검사와 관련하여, 환자 1은 CSF JCV 바이러스 로드를 기초로 하여 PML로 즉시 진단되었으나, 이는 낮았다. 환자 2에서의 진단은 세번째 시험이 역치 수준 바로 위의 양성이 될때까지 CSF JCV 바이러스 로드에 대한 반복적인 음성 PCR 결과로 더욱 악화되었다(12 카피(copy); NIH 참조 연구소에서 역치 10 카피). 낮거나 경계선인 JCV CSF 바이러스 로드와 대조적으로, 상기 연구 동안 확립된 혈청 및 CSF 중의 JCV 주요 캡시드 단백질(VP1/VLP)-특이적 항체에 대한 항체 시험은 동일 수준으로 전체 IgG 농도를 조정한 후에 혈청에 비해 CSF 중에서 95-180배 더 높은 VP1/VLP-특이적 항체 역가를 갖는 강한 수막강내 항체 반응을 나타내었다. 그러므로, 바이러스 DNA에 대한 PCR 시험과 상이하게, 수막강내 항체 반응은 PML-IRIS의 시점에서 JCV에 의해 CNS 감염의 의심을 남기지 않았다. 환자 2에서의 IgG 서브클래스의 분석은 수막강내 항체가 주로 IgG1 및 IgG3인 것을 입증하였다. 이들 데이터는 CNS 구획으로 제한되고, 주요 구조 JCV 단백질 VP1/VLP에 대해 주로 유도되는 강한 JCV-특이적 체액성 면역 반응을 나타낸다. 항체 반응의 작은 성분이 다른 JCV 단백질을 표적으로 하는지의 여부는 연구되어야 하는 채로 남아있다.

PML을 진단하기 위한 상기 난점으로 인해, 환자 2는 PML을 확인하거나 반박하기 위해 진단 뇌 생검을 수행하였다. 신경병리학적 시험은 PML의 통상적인 징후, 즉, 과다염색 희소돌기아교세포 및 기이한 별아교세포 내의 핵내 봉입체를 나타내는데 실패하였고, 오히려 소수의 CNS 세포 및 대량의 혈관주위 및 실질 림프핵성 침윤, 별모양 별아교세포를 갖는 반응성 신경아교증 및 포말 대식세포의 미만성 및 파괴성 실질 침윤의 우세를 나타내었다. 세포 대부분은 보통 활성화된 미세아교세포에서만 발견되고, 정상의 뇌 조직에서는 부재하는 HLA-DR에 대해 양성으로 염색되었다. T 세포 및 B 세포가 침윤물 내에 존재하였고, B 세포의 높은 비율이 혈장 세포 마커 CD138에 대해 양성 염색되었다. 생검 조직의 일부를 처리하였고, CNS-유래 단핵 세포를 또한 흐름세포측정에 의해 특성규명하였다. 세포의 96.5%가 범(pan) 조혈 세포 마커 CD45(제시되지 않음)를 발현하였고, 이들 중 42.4%가 범 T 세포 마커 CD3⁺를 발현하였다. 이들 중 24.1%는 CD8⁺ 및 70.4% CD4⁺ T 세포였다. 상기 세포 거의 대부분은 기억 마커 CD45RO를 발현하였다. CD45⁺ CNS-침윤 세포의 29%는 B 세포 마커 CD19를 발현하였고, 이들 중 86.1%는 CD27/CD38에 대해 양성이었고, 즉, 이들은 기억 B 세포/혈장 세포였다. 따라서, PML이 아닌 염증성 말이집탈락 질병의 진단이 이루어졌다. JCV에 대한 이후의 면역조직화학은 음성이었으나, JCV DNA에 대한 드문 핵 신호가 제자리부합법(in situ hybridization)의 두번째 시도에 의해 발견되었고(데이터는 제시되지 않음), 이는 낮은 JCV 바이러스 로드 및 강한 수막강내 항체 반응과 함께 PML의 최초 의심을 입증하였고, 근원적 말이집탈락 질병이 아니라 신경병리학적 결과로 인한 IRIS임을 나타내었다.

뇌-침윤 T 세포의 항원 특이성

다음으로, 뇌-침윤 T 세포의 항원 특이성 및 빈도를 특성규명하였다. 뇌-유래 단핵 세포를 먼저 비편향 자극(PHA)에 의해 벌크 집단으로 확장시켰다. 본 발명의 배양 조건은 CD8⁺ T 세포에 비해 CD4⁺의 확장을 선호하였으며, CD4⁺ T 세포의 상대 조성은 T 세포 수용체(TCR) 가변 사슬 Vβ1-Vβ22에 대한 모노클로날 항체를 이용한 염색에 의해 입증되는 바와 같이 안정적인 채로 유지되었다. 뇌 생검의 시점에서 CD8⁺ T 세포에 비해 기억 CD4⁺의 거의 3배의 과량으로 인해, 본 발명자는 CD4⁺ 세포에 관심을 집중하였고, 이들의 JCV에 대한 특이성을 평가하였다. 이러한 목적을 위해, 확장된 뇌 T 세포를 증식 검정에서 재조합 JCV 캡시드 단백질 VP1/VLP 및 파상풍 독소 단백질(TTx)에 대해 시험하였다. 본 발명자는 CSF-유래 또는 말초 혈액-유래 T 세포 뿐만 아니라 조작되지 않은 말초 혈액 단핵 세포에 비해 뇌-유래 T 세포를 직접 비교하였다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 뇌-유래 T 세포는 TTx에 대한 반응 없이 VP1/VLP 단백질에 대해 > 600의 자극 지수(SI)로 반응하였다. CSF 내의 VP1/VLP 및 TTx에 대한 SI는 각각 7 및 14였고, PHA-확장 PBMC에서, VP1/VLP 및 TTx에 대한 반응은 각각 음성 및 중간 정도로 양성(6.5의 SI)이었다. 조작되지 않은 PBMC는 7일의 일차 증식 검정에서 VP1/VLP에 비해 TTx에 대한 유의하게 더 강한 반응을 나타내었다.

뇌-침윤 CD4 ⁺ T 세포의 기능적 표현형

이후, 본 발명자는 뇌내 CD4⁺ T 세포가 이들의 사이토카인 분비 패턴을 기초로 하여 주요 T 헬퍼(Th) 서브타입, Th1, Th2 또는 Th17 세포 중 하나에 속하는지 시험하였다. 뇌로부터의 확장된 벌크 T 세포 집단, CSF 및 PBMC 뿐만 아니라 조작되지 않은 PBMC를 Th1-, Th2- 및 Th17 세포의 서명 사이토카인인 IFN-감마, IL-4, 및 IL-17에 대한 세포내 사이토카인 염색에 의해 시험하였다. IL-17-생성 세포는 거의 검출되지 않은 반면(도 1b), IFN-감마-분비 세포는 뇌 및 CSF로부터의 세포에서 46.1 및 53.2%를 구성하였다(도 1b). IFN-감마 및 IL-4에 대한 세포내 염색을 조합하는 경우, 상황은 현저하게 상이하였다. 뇌-유래 및 CSF-유래 집단에서, Th1-, Th2- 및 이기능성 Th1-2 세포(IL-4 및 IFN-감마 둘 모두를 분비함)는 빈도에 있어서 유사한 반면(도 1b), Th2 세포는 말초 혈액-유래, PHA-확장 세포에서 우세하였다(도 1b). 32.7%의 뇌-유래 CD4⁺ T 세포는 이기능성 Th1-2 표현형을 가졌다.

뇌-침윤 T 세포의 미세 특이성 및 빈도

특정 JCV 펩티드가 뇌-침윤 T 세포에 의해 인지되는지 결정하기 위해, 모든 JCV 단백질(Agno, VP1, VP2, VP3, 큰-T, 및 작은-T)에 걸쳐 있는 204개의 15-mer 펩티드를 합성하였고, 각각의 펩티드가 2회 보이지만, 2개의 상이한 푸울로 82개 푸울의 세트를 배열시켰다(방법 참조). 뇌-유래 T 세포는 다수의 푸울에 반응하였다(도 2a; 푸울 1-41). 본 발명자는 이후에 개별적으로 시험된 15개의 면역원성 후보 펩티드를 확인하였고, 11개의 자극성 펩티드(SI>10을 갖는 펩티드)를 확인하였다(도 4b). 반응이 펩티드 4(Agno₂₅, 숫자는 15-mer 펩티드의 첫번째 아미노산(aa)을 나타냄), 20(VP1₃₄), 23(VP1₅₄), 27-29(VP1₇₄)(모든 VP1₇₄ 펩티드; 28 및 29는 단일한 aa 돌연변이를 갖는 펩티드 27의 변이체임), 72(VP1₃₁₀), 73(VP1₃₁₉), 76(VP1₃₃₅), 191(LTAg₆₆₈), 및 195(sTAg₈₂)에 대해 유도되었다(SI > 25를 갖는 펩티드는 굵은 글씨로 나타냄). 따라서, 뇌-유래 T 세포는 여러 JCV 단백질(Agno, VP1, LTAg, sTAg)에 대해 반응하였으나, 단연 VP1(6 펩티드)에 대해 가장 강하였다. 상기 VP1은 Agno₂₅(1/14492) 및 LTAg₆₆₈(1/1449)에 반응하는 세포와 비교하는 경우 전체 VP1/VLP 단백질에 대한 심지어 더 강한 반응(도 1a) 및 VP1-특이적 T 세포의 더 높은 전구체 빈도(펩티드 VP1₃₄, VP1₃₁₉ 및 VP1₇₄에 반응하는 1/294 내지 1/714의 T 세포)에 의해 뒷받침되는 주요 표적이다(도 2c). 본 발명자가 PHA-확장 CSF-유래 및 말초 혈액-유래 T 세포를 시험한 경우, CSF만 푸울 39 및 상기 푸울 내에 함유된 펩티드 LTAg₆₆₈에 대해 약한 반응을 발생시켰고, PBMC는 음성이었다. 특히, SI(도 2b) 및 전구체 빈도(도 2c)와 관련하여 가장 강한 반응을 유도하는 펩티드인 펩티드 VP1₃₄는 HLA-A*02:01의 상황에서 HLA-클래스 I-제한 CD8⁺ T 세포에 의해 인지되는 VP1₁₀₀과 함께 2개의 에피토프 중 하나인 JCV 에피토프 VP1₃₆을 함유한다(Du Pasquier et al, 2003b). PML-IRIS 환자 2는 HLA-A*02:01⁺(방법하에서 HLA-클래스 I 및 HLA-클래스 II 타입)이며, 이러한 이유로, 본 발명자는 테트라머 염색에 의해 PHA-확장 뇌-침윤 CD8+ T 세포에서 상기 2개의 HLA-A*02:01 JCV 에피토프에 특이적인 CD8+ T 세포의 빈도를 결정하였다. PHA-확장 뇌-침윤 CD8+ T의 0.8%는 VP1₃₆에 특이적이었고, 0.6%는 VP1₁₀₀에 특이적이었다(도 4d). HLA-클래스 II와 관련하여, 환자 2는 MS-관련 HLA-DR 일배체형 DRB1*15:01 및 DRB5*01:01을 발현한다. JCV-특이적 CD4+ T 세포 반응은, VP1/VLP 단백질이 DRB1*15:01/B5*01:01 동형접합 공여자로부터 APC에 의해 제시된 경우 DRB1*15:01/B5*01:01에 의해 주로 제한되었다(제시되지 않음). 이들 데이터는 수막강내 항체와 유사하게, CD4⁺ T 세포 반응이 주로 주요 구조 JCV 단백질 VP1에 대해 유도되고, 펩티드 VP1₃₄가 바이러스-특이적 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 둘 모두에 대한 에피토프를 함유하는 것을 입증한다. 동일한 면역우세 에피토프에 대한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 상기 집중은 인플루엔자 핵단백질 펩티드에 대해 이전에 제시되었다(Carreno et al, 1992).

표 1은 본 발명자에 의해 확인된 면역우세 CD4+ T 세포 에피토프를 제시한다.

PML이 희소돌기아교세포 용해 및 미엘린의 방출을 특징으로 하고, 환자가 MS에 걸려 있으므로, 뇌-유래 T 세포가 미엘린 단백질에 반응했는지의 여부를 시험하는 것이 관심이었다. PHA-확장 뇌-유래 T 세포를 주요 미엘린 단백질에 걸쳐 있는 중첩 펩티드, 미엘린 염기성 단백질(MBP), 단백질지질 단백질(PLP), 및 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)에 대해 시험하였으나, JCV VP1/VLP 단백질에 대한 강한 반응에도 불구하고 미엘린 펩티드의 어떤 것도 인지되지 않았다.

표 1: 면역우세 JCV 에피토프의 목록. 각각의 JCV 펩티드의 아미노산 서열 및 길이가 제시된다. 각각의 펩티드의 위치는 참조 JCV 유전체 NC 001699의 각각의 단백질과 관련된다. 아미노산 돌연변이를 갖는 펩티드는 변이체(V1, V2 등)로 지정된다. 뇌로부터 분리된 T 세포 클론에 의해 인지된 펩티드만 굵은 글씨로 표시된다. 다른 펩티드는 말초 T 세포 클론에 의해 인지되었다.

JCV -특이적 CD4 ⁺ T 세포 클론의 미세 특이성 및 기능적 표현형

이전 데이터에서 특정 전사 인자의 발현을 기초로 하여 CD4+가 Th1 세포(IFN-감마 생산자), IL-17을 분비하는 Th17 세포, 서명 사이토카인 IL-4를 발현하는 Th2 세포, 또는 T 조절 세포와 같은 특정 T 헬퍼 표현형으로 분화시키는 것이 밝혀졌다(Zhu et al., 2010). Th1 또는 Th2 세포로의 분화는 상호 배타적인 것으로 생각되고, 이는 전사 인자 T-bet(Th1) 및 Gata-3(Th2)에 의해 조절된다(Zhu et al., 2010). 상기 데이터를 기초로 하여, 이기능성(Th1-2) 표현형을 갖는 수임 기억 세포의 본 발명의 발견은 매우 예기치 않은 것이었고, 따라서 본 발명자는 클론 수준에서 상기 포인트를 시험하기 위해 VP1/VLP-특이적 T 세포 클론을 확립하였다. VP1/VLP-특이적 TCC를 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 생성시켰다. 먼저, 21개의 VP1/VLP-특이적 단일 세포-유래 배양물을 제한 희석에 의해 생성시키고, TCRV 베타 발현, 기능적 표현형 및 미세 특이성에 대해 특성규명하였다(표 2). 이러한 특성규명은 11개의 추정된 상이한 TCC의 확인을 가능케 하였다. 각각의 TCC에 해당하는 단일 세포 성장 배양물의 수는 뇌 침윤물 내의 각각의 TCC의 빈도에 관한 이해를 제공한다(도 3a). TCC-4가 가장 풍부하였고, 단일 성장 웰로부터 출현하는 5개의 콜로니로 표시되고, 이후 TCC-2는 3개의 단일 세포 성장 배지에서 표시되고, TCC-1, -8, -9 및 -10은 2개의 단일 세포 성장 배지에서 표시되고, 최종적으로 TCC-3, -5, -6, -7 및 -11은 단지 1개의 단일 세포 성장 배지에서 표시된다. 11개의 TCC의 미세 특이성은 도 5b에 요약되어 있다. 각각의 TCC를 VP1 단백질에 걸쳐 있는 64개의 15-mer 펩티드에 대해 시험하였고, 이는 다음과 같은 자극 펩티드의 확인을 발생시켰다: VP1₃₄(TCC-1 및 -2에 의해 인지됨), VP1₅₄(TCC-3에 의해 인지됨), VP1₇₄(모든 VP1₇₄ 펩티드, TCC-4에 의해 인지됨), VP1₉₁(TCC-5에 의해 인지됨), VP1₁₄₃(TCC-6에 의해 인지됨), VP1₂₂₉(TCC-7에 의해 인지됨), VP1₃₁₉(TCC-8 및 -9에 의해 인지됨) 및 VP1₃₃₅(TCC-10 및 -11에 의해 인지됨). 뇌 침윤물에서의 특정 펩티드를 인지하는 상이한 TCC의 수 및 각각의 TCC의 빈도 둘 모두를 고려하여, VP1 특이적 뇌 침윤 TCC에 의해 인지되는 면역우세 펩티드는 VP1₃₄, VP1₇₄, VP1₃₁₉ 및 VP1₃₃₅였고, 이는 뇌-유래 벌크 세포 집단을 이용하여 수득된 미세 특이성을 입증한다(도 3c). 상기 TCC의 세포내 사이토카인 염색은 Th1-2 및 Th1 표현형을 나타내었다(도 4a). 뇌-유래 VP1 특이적 단일 세포 성장 배양물의 57%에 해당하는 5개의 TCC는 Th1-2 표현형을 나타내었고, 뇌-유래 VP1-특이적 단일 세포 성장 배양물의 43%에 해당하는 6개의 TCC는 Th1 표현형을 나타내었다(도 4b). 특이성 및 기능적 표현형은 상관 관계가 없었다. 면역우세 펩티드 중 3개(VP1₃₄, VP1₃₁₉ 및 VP1₃₃₅)에 대해, 본 발명자는 둘 모두의 표현형을 갖는 TCC를 발견하였다. Th1-2 및 Th1 TCC의 T 헬퍼 표현형을 ELISA에 의한 IL-4 및 IFN-감마 단백질 분비를 측정하고, 전사 인자 Gata3 및 T-bet의 mRNA의 발현을 결정함으로써 확인하였다. Th1-2 TCC(n=5)는 IFN-감마에 더하여 IL-4를 분비한 반면, IL-4 분비는 Th1 TCC(n=6)에서 드물게 검출가능하였다(도 6c). 사이토카인 분비 프로파일은 PHA에 의한 자극으로 인한 것이 아니었는데, 이는 배양 상층액으로부터의 세포내 사이토카인 염색 또는 ELISA 측정에 의해 VP1/VLP 단백질을 이용한 특정 자극 후에 동일한 안정적인 패턴이 관찰되었기 때문이다. 전사 인자 발현으로 TCC의 표현형을 확인하였다. Th1-2 TCC(n=5)는 Gata3 및 T-bet에 대한 mRNA를 발현한 반면, Th1 TCC(n=6)는 단지 t-bet만 발현하였다(도 6d).

논의

PML의 바이러스 병인론은 거의 40년 이전에 밝혀졌으나, JCV 감염을 조절하는 면역 메커니즘에 관해서는 여전히 비교적 적게 공지되어 있다. CD8⁺ JCV-특이적 세포독성 T 세포가 PML로부터의 회복과 관련되었고(Du Pasquier et al, 2004a; Koralnik et al., 2002), 2개의 바이러스 에피토프가 HLA-A*02:01-양성 개체에서 확인되었다(Du Pasquier et al, 2004a; Du Pasquier et al, 2004b). 대조적으로, PML 및 좀 덜하게는 PML-IRIS에서 JCV-특이적 CD4⁺ T 세포의 미세 특이성 및 특징에 대해 제한된 정보가 이용가능하다(Jilek et al). 감염 부위, 즉, CNS 실질에서의 바이러스-특이적 T 세포 반응은 전혀 시험된 적이 없다.

본 발명자의 데이터는 상기 대상에 대한 새로운 통찰을 제공하며, 나탈리주맙 치료하에서 PML-IRIS 동안 후속되는 병인론적 사건을 이들에게 제공한다. 항-VLA-4 항체는 세포 이동(Stuve et al, 2006) 및 CNS에서의 국소 항원 제시(del Pilar Martin et al., 2008)를 차단함으로써 뇌와 같은 면역면책 부위(immunoprivileged site)에서의 JCV 감염의 면역 감시를 억제한다. 결과로서, 병리학적 신경친화 JCV 변이체는 아직 이해되지 않은 이유로 치료되는 MS 환자의 적은 수(1/500-1/1000)에서 PML을 야기시킬 수 있다(Major, 2010; Ransohoff, 2005). PML이 의심되고, 나탈리주맙이 중지되거나 혈장분리반출술에 의해 능동적으로 제거되자마자, 완전히 기능적이고 활성화된 T 세포는 CNS 구획에 대한 접근을 회복하고, PML-IRIS에 대해 통상적인 강한 염증을 개시시키고, CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 및 항체-형성 혈장 세포를 포함하는 다수의 메커니즘에 의해 바이러스-감염된 세포를 효과적으로 제거한다.

표 2. VP1 특이적 뇌 침윤 T 세포 클론( TCC )의 특성규명

CNS-침윤 T- 및 B 세포 중에서, Th1- 또는 상기 이기능성 Th1-2 표현형을 갖는 CD4⁺ T 세포가 하기 발견을 기초로 하여 가장 중요한 구성요소일 것이다. Th1- (IFN-감마) 및 Th2(IL-4) 사이토카인의 이들의 동시 분비가 바이러스-감염된 별아교세포 및 미세아교세포와 같은 상재 세포 뿐만 아니라 침윤 면역 세포 상에서의 HLA-클래스 II 분자의 발현을 설명할 것이며, 이는 IFN-감마가 HLA-클래스 II의 가장 강한 유도인자이기 때문이다. GFAP와 같은 별아교세포 마커를 이용한 HLA-DR의 공동국소화(colocalization) 연구는 재료의 소량으로 인해 수행될 수 없었으나, HLA-DR의 광범위한 발현은 이들이 또한 양성임을 강하게 암시한다. MS 및 이의 동물 모델 실험 자가면역 뇌염(EAE)과 유사하게, 이동하는 T 세포의 국소 재활성화가 입증된 경우, JCV-특이적 Th1-2 및 또한 Th1 세포는 JCV-감염된 HLA-클래스 II 양성 별아교세포, 미세아교세포/대식세포 또는 동원된 수지상 세포(DC)에 대한 JCV 펩티드의 인지에 의해 국소적으로 재활성화될 것이다. 또한, 많은 양의 IL-4의 분비는 바이러스-특이적 항체 분비의 결과와 함께 CNS 구획 내에서의 기억 B 세포/형질모세포의 활성화 및 확장을 발생시켰다. 국소 생성된 JCV 캡시드 단백질(VP1)-특이적 IgG 항체는 보체-매개 또는 항체-매개 세포 세포독성에 의해 이후에 용해될 수 있는 바이러스-감염된 희소돌기아교세포를 인지할 수 있다. 높은 친화성으로 보체에 결합하고, 다른 바이러스 감염의 상황에서 기재된 적이 있는 IgG1 및 IgG3 항체의 CSF 내에서의 상대적 증가가 상기 개념을 뒷받침한다. 감염된 희소돌기아교세포는 HLA-클래스 II를 발현하지 않고, HLA-클래스 I을 효과적으로 발현하므로, JCV-특이적 HLA-A2-제한 CD8⁺ 세포용해 T 세포(Koralnik et al., 2001)(Koralnik et al., 2002)가 또한 JCV-감염된 희소돌기아교세포 및/또는 별아교세포를 사멸시킴으로써 제공되는 것으로 예상될 수 있다. PML을 갖는 AIDS 환자의 말초 혈액 내에 상기 이전에 기재된 세포가 또한 뇌 내의 JCV의 국소적 박멸에 아마 관여한다는 것은 펩티드-로딩된 HLA-A*02:01 테트라머에 의해 규정된 바와 같은 JCV VP1₃₆ 및 JCV VP₁₀₀에 특이적인 CD8+ T 세포의 본 발명의 관찰에 의해 뒷받침된다. 감염된 별아교세포는 CD4⁺ 바이러스-특이적 T 세포에 대한 국소 항원 제시 세포로 작용할 수 있을 뿐만 아니라 Th1-2 세포용해 세포에 의해 사멸될 수 있으나(Hemmer et al, 1997), 이는 별아교세포에 의한 DR 발현의 문제와 함께 추가 연구를 필요로 할 것이다.

상기 병인론적 시나리오는 IFN-감마- 및 IL-4의 효과, 즉, 뇌에서의 HLA-클래스 II 분자의 광범위한 발현 뿐만 아니라 JCV에 대한 강한 수막강내 항체 반응을 설명하나, 뇌-침윤 세포의 큰 분획이 Th1-2 표현형을 나타내는 것은 여전히 불명확하다. 이전에, 상기 세포는 ThO 세포로 언급되었고, Th1 또는 Th2 계통으로 수임되는 기억 세포로 나이브 세포가 발달하기 전의 중간 분화 단계로 간주되었다(Mosmann and Coffman, 1989). 그러나, 상기 개념은 이후의 단일 클론의 사이토카인 패턴을 기초로 하여 초기부터 이미 논쟁이 있었다(Kelso, 1995). 오늘날, Th1- 및 Th2 세포는 상호 배타적 운명으로 이해되어 있다(Ansel et al, 2006). 그러나, 이중 사이토카인 분비를 갖는 개별적 TCC가 홍역 바이러스 감염(Howe et al, 2005) 및 MS의 변경된 펩티드 리간드-기반 요법 동안 질병-악화 자가반응 T 세포(Bielekova et al, 2000) 사이에서 ThO 세포로 기재되었었다. 세포내 사이토카인 염색, 사이토카인 분비 및 전사 인자 발현 지점을 기초로 한 안정적 Th1-2 클론의 본 발명자의 본 발명의 관찰은 중간 또는 일시적 분화 단계가 아닌 CNS에서의 규정된 T 헬퍼 세포 하위집단을 나타낸다. ThO 세포의 상기 언급된 질병-규정된 역할 및 말단 분화된 세포로서의 이들의 존재에 관한 이전의 논쟁으로 인해, 본 발명자는 IFN-감마/IL-4 T 헬퍼 세포를 이기능성 Th1-2 세포로 언급하는 것을 본원에서 제안한다. 상기 Th1-2 분화를 발생시키는 상황 및 신호는 추가 시험을 필요로 한다. 바이러스 감염 모델에서 최근 공개된 연구에서, 작가는 비-보호 Th2 세포가 항원-특이적 TCR 신호, 타입 I 및 II 인터페론 및 IL-12의 협력된 작용에 의해 IFN-감마/IL-4-발현 및 보호 CD4+ 세포로 안정적으로 전환될 수 있는 것을 입증하였다(Hegazy et al, 2010)(Zhu and Paul, 2010). 본 발명자의 발견은 인간에서 생체내에서 안정적인 GATA-3+T-bet+ 및 IL-4+IFN-감마+ Th2+1 표현형의 존재에 대한 첫번째 증거이다. 상기 세포가 뇌에서 재프로그램화 가능한 것으로 생각할 수 있으며, 이들은 PML-IRIS의 매우 강한 면역 반응 및 극발성 과정을 잘 설명할 수 있다.

뇌-침윤 T 세포의 미세 특이성과 관련하여, 본 발명자의 데이터는 여러 양태에서 흥미롭다. JCV-특이적 T 세포 반응은 전체적으로 광범위한데, 이는 거의 모든 JCV 단백질로부터의 펩티드가 인지되며, 이는 건강한 공여자 및 MS 환자에서 말초 혈액-유래 CD4⁺ T 세포에 대한 JCV의 면역우세 에피토프를 맵핑하려는 본 발명자의 노력과 일치하기 때문이다. 그러나, 뇌-유래 CD4⁺ T 세포에 의해 인지되는 펩티드의 50% 초과는 주요 구조 단백질 VP1의 일부이다. 또한, VP1-특이적 T 세포가 증식 및 전구체 빈도의 강도와 관련하여 우세하다. VP1₃₄ _-48이 본 발명자가 테트라머 염색에 의해 PML-IRIS 환자의 뇌에서 또한 발견한 세포독성의 HLA-A*02:01-제한 CD8⁺ T 세포(Du Pasquier et al, 2003b)에 대한 주요 에피토프 뿐만 아니라 HLA-DRB1*15:01/DRB5*01:01-제한 CD4⁺ T 세포에 대한 주요 에피토프를 함유하는 것이 흥미롭다. 또한, 펩티드 VP1₇₄ 및 단일한 아미노산 치환을 갖는 이의 2개의 변이체의 인지는 상기 에피토프의 인지가 지속적 JCV 감염 동안 면역 회피로부터 숙주를 보호하는 것과 관련될 수 있는 것을 나타낸다. 이는 인간 면역결핍(Borrow et al, 1997) 및 림프구성 맥락수막염 바이러스 감염(Ciurea et al., 2001)에 대해 이전에 밝혀진 적이 있다. VP1에 대한 강한 수막강내 항체 반응은 상기 구조 단백질의 역할을 추가로 뒷받침한다. 따라서, 본 발명자의 발견은 VP1이 JCV-감염된 뇌 세포에 대한 보호 면역 반응에 중요하고, 이들이 항체, CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에 의해 매개되는 것을 나타낸다. 상기 반응의 강도는 부분적으로 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에게 동일한 VP1 에피토프를 제공하는 주요 MS 위험 대립유전자 DRB1*15:01/DRB5*01:01 및 A*02:01 둘 모두를 발현하는 환자 2의 HLA 타입에 의해 결정될 것이다. 따라서, 상기 환자는 대량의 PML-IRIS, 뇌 종창, 및 신경계 악화의 뇌의 면역병리학적 결과를 갖는 뇌에서 특히 현저한 T 세포-매개 면역 반응을 경험할 수 있다. 다른 사람에 의해 이미 지적된 바와 같이(Cinque et al, 2003), JCV-특이적 면역 반응은 양날의 검(double-edged sword)이다. 기능적 면역 반응 없이, 뇌 세포는 싸우지 않은 바이러스 감염에 의해 용해된다. 또 한편으로, 억제되지 않는 경우, PML-IRIS 동안의 강한 JCV-특이적 반응은 뇌 염증 및 부종을 야기시키고, 이는 CNS로부터 JCV를 효과적으로 제거하면서, 이는 면역억제에 의해 적어도 일시적으로 약화되지 않는 경우 환자의 사망을 초래할 수 있다(Tan et al., 2009b).

PML-IRIS 동안의 뇌에서의 세포 및 체액성 JCV-특이적 면역 반응은 치료를 복잡하게 만들 뿐만 아니라, 무엇보다도 먼저 PML의 진단을 모호하게 만들 수 있다. CSF JCV 바이러스 로드에 의존하고, 생검이 수행되는 경우 JCV 항원 및 DNA 각각에 대해 면역조직화학 및 제자리부합법에 의존하는 현재의 과정과 다르게, VP1에 대한 수막강내 항체 반응이 더욱 확실한 것으로 보이며, 시험되어야 한다. 본 연구의 둘 모두의 PML-IRIS 환자에서, 수막강내 VP1-특이적 항체 역가는 PCR 및 제자리부합법에 의해 거의 검출가능하지 않은 JCV DNA에도 불구하고 극도로 높았다. JCV 항체 시험의 중요한 역할은 PML을 갖는 AIDS 환자에서의 높은 항체 역가의 이전의 관찰(Weber et al., 1997) 뿐만 아니라 나탈리주맙-치료된 MS 환자에서의 최근의 데이터(Gorelik et al., 2010)에 의해 뒷받침된다.

상기 연구의 또 다른 중요하고 예기치 않은 관찰은 JCV-특이적 항체 반응과 상이하게, 병인론적으로 관련된 T 세포가 CNS 실질 자체로 제한되고, CSF가 T 세포 특이성 및 기능을 연구하는데 거의 사용되지 않는다는 점이다. 이러한 발견은 PML-IRIS 뿐만 아니라 MS와 매우 관련이 있을 것이며, 상기 대부분의 연구는 명백한 이유, 즉, CNS 조직이 연구자에게 있어서 드물게 이용가능하다는 점으로부터 CNS 내에서의 반응을 위한 대용물로서 CSF에 집중하였다. 따라서, 이후의 연구는 획득될 수 있는 경우 생검 또는 부검 조직을 시험하기 위해 모든 가능한 노력을 기울여야 한다. PML-IRIS를 갖는 상기 MS 환자의 뇌-침윤 CD4+ T 세포를 연구하는 경우, 본 발명자는 3개의 주요 미엘린 단백질로부터의 펩티드 중 어느 것도 인지되지 않은 것을 확인하고 추가로 놀랐으며, 이는 대량의 뇌 염증 동안 미엘린-특이적 T 세포의 방관자 활성화 또는 동원이 발생하지 않고, 세포가 원인 작용제에 정교하게 특이적인 것을 암시한다.

실시예 2 - JCV 에 대한 면역화

64세의 연령에서 PML이 발생한 드문 본질적 면역결핍인 특발성 CD4+ 림프구감소증을 갖는 환자(도 11에서 "환자 함부르크"로 언급됨)에서 개별적 치유 시도를 수행하였다. 상기 남성 환자는 건강하였으며, 즉, 생애에 걸쳐 이상 또는 빈번한 감염을 겪지 않았고, 2010년 2월에 공지되지 않은 기원의 뇌염의 징후로 인해 입원하였다. 상기 환자는 철저히 정밀검사하였으며, 의심되는 EBV-관련 뇌염의 진단을 수행하였다. 항바이러스 요법 동안의 일시적 개선 후, 상기 환자는 비록 느리긴 하지만 추가로 악화되었다. 2010년 동안 2회의 뇌 생검이 수행되었고, 2010년 말의 두번째 생검에서, CSF 내의 양성 JCV 바이러스 로드 및 뇌 내의 JCV-감염된 희소돌기아교세포 및 별아교세포의 증거를 기초로 하여 진행성 다발성 백질뇌병증(PML)의 진단이 이루어졌다. 동시에, 본 발명자는 낮은 CD4+ T 세포 수(약 300/마이크로리터) 뿐만 아니라 0.5 또는 그 미만의 CD4+/CD8+ 비를 발견하였고, 이들 둘 모두는 특발성 CD4+ 림프구감소증의 진단과 일치한다. 또한, 실험실에서의 시험관내 실험에서 말초 혈액 단핵 세포 중의 JCV 바이러스 VP1에 대한 T 세포 반응의 부재 및 나이브 CD4+ T 세포의 거의 완전한 부재가 기록되었다. 상기 관찰 후, 본 발명자는 상기 환자가 미리 존재하고 아마 유전적으로 결정된 적은 CD4+ 수를 기초로 하여 PML이 아마 발생하였고, 50세 연령을 초과하여 발생하고 증가하는 전체적인 생리학적 면역 퇴화에 의해 추가로 약화된 것으로 추론하였다.

본 발명자는 VP1을 이용한 예방접종, 및 CD4+ 림프구감소증의 경우 바람직하게는 재조합 IL-7과 조합된 VP-1을 이용한 예방접종이 상기 환자가 JCV-양성임에 따라 상기 환자가 반드시 가져야 하는 JCV-특이적 T 세포의 수를 증가시키는지 시험하고자 하였다. 추가로, 상기가 발생한 경우, 본 발명자는 백신-유도되거나 백신-부스팅된 JCV VP1-특이적 T 세포 반응이 CNS로의 상기 세포의 이동 및 CNS 구획으로부터 바이러스 및 바이러스-감염된 세포의 제거를 발생시키는 것을 기대하였다. 따라서, 본 발명자는 상기 옵션 및 이의 잠재적 위험이 논의된 "개별적 치유 시도"를 환자에게 문의하였고, 환자의 동의를 얻었다. IL-7(Cytheris)의 사용은 CD4+ 림프구감소증의 또 다른 환자에서의 최근의 간행물(Patel et al, 2010)에 의해 추가로 뒷받침되었고, 여기서 항바이러스 약물과 함께 재조합 IL-7은 환자의 실질적 개선을 발생시켰으나, 상기 환자에서, 면역학적 연구는 수행되지 않았고, 이에 따라 항원-특이적 면역 반응의 개선에 관해 공지된 것이 없다.

상기 환자에서의 예방접종 방법은 다음과 같은 단계(예방접종 및 시험의 시기에 대해서는, 하기 도표 참조)를 포함하였다: 피부 적용되는 TLR7 효능제(이미퀴모드, Aldara; 시판됨) 및 정맥내 재조합 IL-7(Cytheris)과 조합된 전체 재조합 주요 캡시드 단백질 VP1(Life Science Inkubator, Bonn에 의해 제공됨)을 이용한 피하 주사. VP1 단백질을 본원에서 사용된 조건하에서 바이러스-유사 입자(VLP)와 결합된 재조합적으로 발현된 VP1 단백질로서, 바이러스-유사 입자(VLP)의 형태로 투여하였다. 하기 제시되는 바와 같이, 환자는 단지 2회의 예방접종 후에 JCV VP1에 대한 시험관내 증식 반응을 나타냈을 뿐만 아니라, JCV 바이러스 로드를 0으로 감소시켰고, 최종적으로 뇌 MRI 영상화에 의해 PML 병변 주위에 약간의 대조 증강을 나타내기 시작하였으며, 이들 모두는 예방접종이 생체내에서 작용한 것을 뒷받침한다. 상기 환자는 또한 JCV-특이적 면역 반응이 발생한 후에 약간의 지연과 함께 임상적 개선을 나타내었다. 또한, 실시예 I에 기재된 PML-IRIS 환자에서의 뇌-침윤 T 세포로부터의 본 발명자의 데이터가 T 헬퍼 1-2 표현형을 갖는 JCV-특이적 CD4+ T 세포가 뇌로부터 JCV 바이러스의 제거에 중요할 것임을 암시하였으므로, 본 발명자는 또한 환자의 뇌척수액 내의 Th1-2 CD4+ T 세포를 염색시켰고, 이들 세포가 확실히 존재하는 것을 입증할 수 있었다.

화학요법을 받았고, 화학요법의 부작용으로서 급성 골수성 백혈병(AML)이 발생한 유방암을 갖는 환자에서 또 다른 개별적 치유 시도를 수행하였다. 이후, 환자에는 AML의 치료로서 자가 및 동종이형 조혈 줄기 세포 이식을 받았고, 이후에 급성 이식편대숙주병(등급 IV)이 발생하였다. 상기 치료의 결과로서 획득된 면역결핍은 PML을 발생시켰다. 상기 환자는 도 11에서 "환자 취리히"로 언급된다. 둘 모두의 환자를 재조합 IL-7(s.c)에 의해 치료하였다. 2일 후, VP1의 첫번째 용량(피하, 1 ㎎, 피부 상 이미퀴모드 크림)을 투여하였다. VP1의 첫번째 용량 2일 후, rIL-7의 두번째 용량을 제공하였다.

첫번째 IL-7 용량 12일 후, 환자는 피하로 VP1 + 이미퀴모드, 및 이러한 경우 동시에 rIL-7을 이용한 두번째 예방접종을 투여받았다. 6주에서, VP1/이미퀴모드의 세번째 용량 및 rIL-7의 네번째 용량을 투여하였다. 도 11은 둘 모두의 환자로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용한 그래프에서 표시된 시점에서 수행된 하기 기재되는 증식 검정으로부터의 결과를 도시한다. >2의 자극 지수는 양성 반응으로 간주된다. 둘 모두의 환자가 예방접종 후에 JCV에 대한 양성 면역 반응을 나타낸 것이 관찰될 수 있다.

재료 및 방법

혈액 및 CSF 샘플

생물학적 샘플을 사전고지된 서면 동의 후에 수득하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜(PAA, Pasching, Austria) 밀도 원심분리에 의해 EDTA-혈액으로부터 분리시켰다.

뇌척수액(CSF)-유래 단핵 세포를 2000 세포/웰 + 2x10⁵개의 방사선 조사된(45 Gy) 동종이형 공급자 세포를 시딩함으로써 확장시켰다. 1 ㎍/㎖의 PHA-L(Sigma-Aldrich, Munich, Germany) 및 500 IU/㎖의 IL-2(Federica Sallusto, Institute for Research in Biomedicine, Bellinzona, CH의 호의로 제공됨)를 첨가하였다. IL-2의 첨가를 14일까지 3-4일마다 반복하였다.

증식 검정

VP1(Viktorya Demina, Life Science Inkubator, Bonn, Germany의 호의로 제공됨) 및 파상풍 톡소이드(TTx, Novartis, Marburg, Germany)에 대한 PBMC의 증식 반응을 96-웰 U-바닥 미세역가 플레이트에 2x10⁵개의 세포를 시딩함으로써 시험하였다. VP1을 2 ㎍/㎖로 사용하였고, TTx를 5 ㎍/㎖로 사용하였다. 인큐베이션 7일 후, ³H-티미딘(Hartmann Analytic, Braunschweig, Germany)의 포함을 측정하였다. 항원을 갖는 웰의 평균 CPM(분 당 수)을 항원이 없는 웰의 평균 CPM으로 나누어 자극 지수(SI)를 계산하였다.

흐름세포측정에 의한 VP1 및 TTx에 대한 증식 반응을 측정하기 위해, CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit(Invitrogen, Darmstadt, Germany)를 사용하였다. 이에 따라, 세포를 상기 기재된 바와 같이 시딩하고, 6일 후에 항원으로 재자극시키고, 제조업체의 설명서에 따라 CFSE로 처리하였다. 5일 후, 세포를 흐름세포측정에 의해 분석하였다.

흐름세포측정 분석

50 ㎕ 내지 100 ㎕ 부피의 혈액 중에 적절한 항체 칵테일을 첨가함으로써 전체 혈액 염색을 수행하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, FACS Lysing Solution(BD PharMingen)를 이용하여 10분의 적혈구 세포 용해를 수행하였다.

세척 후, 세포를 LSR II(BD)에서의 흐름세포측정에 의해 분석하였다. 다음과 같은 항체를 사용하였다: CD4(APC, RPA-T4, eBioscience), CD8(PB, DK25, Dako, Glostrup, Denmark), CD45RO(FITC, UCHL1, eBioscience), CD25(PE-Cy7, eBioscience), CD3(PE, Da-koCytomation, Denmark), CD8(PB, DakoCytomation, Denmark), IFN-감마(FITC, BDPharmingen), IL-4(PE-Cy7, eBioscience).

참고문헌

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<400> 34 Gly Glu Asn Val Pro Pro Val Leu His Ile Thr Asn Thr Ala Thr 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant of JCV peptide <400> 35 Gly Glu Asn Val Pro Ser Val Leu His Ile Thr Asn Thr Ala Thr 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant of JCV peptide <400> 36 Gly Glu Asn Val Pro Pro Val Leu His Ile Thr Lys Thr Ala Thr 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant of JCV peptide <400> 37 Ile Thr Asn Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Phe Gly Val 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant of JCV peptide <400> 38 Ile Thr Lys Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Phe Gly Val 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant of JCV peptide <400> 39 Asp Glu Phe Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys Gly Asp Asn Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant of JCV peptide <400> 40 Asp Glu Phe Gly Val Arg Pro Leu Cys 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JC virus <400> 57 Cys Gln Gln Ala Val Asp Thr Val Ala Ala Lys Gln Arg Val 1 5 10 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> JC virus <400> 58 Ala Lys Gln Arg Val Asp Ser Ile His Met Thr Arg Glu Glu Met 1 5 10 15 <210> 59 <211> 14 <212> PRT <213> JC virus <400> 59 Thr Arg Glu Glu Met Leu Val Glu Arg Phe Asn Phe Leu Leu 1 5 10 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> JC virus <400> 60 Ile Phe Gly Ala His Gly Asn Ala Val Leu Glu Gln Tyr Met Ala 1 5 10 15 <210> 61 <211> 14 <212> PRT <213> JC virus <400> 61 Glu Gln Tyr Met Ala Gly Val Ala Trp Ile His Cys Leu Leu 1 5 10 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> JC virus <400> 62 Val Ile Tyr Asp Phe Leu Lys Cys Ile Val Leu Asn Ile Pro Lys 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> JC virus <400> 63 Leu Asn Ile Pro Lys Lys Arg Tyr Trp Leu Phe Lys Gly Pro Ile 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> JC virus <400> 64 Val Phe Glu Asp Val Lys Gly Thr Gly Ala Glu Ser Arg Asp Leu 1 5 10 15 <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> JC virus <400> 65 Glu Ser Arg Asp Leu Pro Ser 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virus <400> 73 Trp Ile Asp Cys Tyr Cys Phe Asp Cys Phe Arg Gln Trp Phe 1 5 10 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> JC virus <400> 74 Phe Arg Gln Trp Phe Gly Cys Asp Leu Thr Gln Glu Ala Leu His 1 5 10 15 <210> 75 <211> 14 <212> PRT <213> JC virus <400> 75 Asp Leu Thr Gln Glu Ala Leu His Cys Trp Glu Lys Val Leu 1 5 10 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> JC virus <400> 76 Trp Glu Lys Val Leu Gly Asp Thr Pro Tyr Arg Asp Leu Lys Leu 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant of JCV peptide <400> 77 His Phe Arg Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant of JCV peptide <400> 78 Val Cys Gly Met Phe Thr Asn Arg Ser Gly Tyr Gln Gln Trp Arg 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant of JCV peptide <400> 79 His Leu Arg Gly Phe Ser Asn Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant of JCV peptide <400> 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Claims

JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드로서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택되는, 단백질 또는 펩티드.
제 1항에 있어서, 에피토프가 SEQ ID NO:1-3, 7-9, 11, 23, 37-38, 43-45, 및 69-71을 포함하는 군으로부터 선택되는 단백질 또는 펩티드.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질이 VP1 또는 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질을 포함하는 단백질.
제 3항에 있어서, VP1 또는 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질이 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:46-76을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 에피토프를 추가로 포함하는 융합 단백질인 단백질.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질이 바이러스 유사 입자의 형태로 존재하는 단백질.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, JCV에 의한 감염을 진단하고/하거나 PML을 진단하기 위한 방법에 사용하기 위한 단백질 또는 펩티드.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 피검체에서 PML을 치료하는 방법에 사용하기 위한 단백질 또는 펩티드.
제 7항에 있어서, 상기 PML 치료가 T 세포를 확장시키고 유지시킬 수 있는 사이토카인의 투여를 포함하는 단백질 또는 펩티드.
제 8항에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-7, IL-2, IL-15 및 IL-21로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질 또는 펩티드.
제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PML 치료가 애쥬번트의 투여를 포함하는 단백질 또는 펩티드.
제 10항에 있어서, 상기 애쥬번트가 MF59, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 포스페이트 겔, 지질다당류, 이미다조퀴놀린(예를 들어, 이미퀴모드, S-28463), CpG 모티프를 갖는 올리고누클레오티드 서열, 스테아릴 티로신, DTP-GDP, DTP-DPP, 트레오닐-MDP, 7-알릴-8-옥소구아노신, 당지질 베이(glycolipid bay) R1005, 다중-항원 펩티드 시스템, 중합화된 합텐 펩티드, 박테리아 추출물, TLR-7 효능제, TLR-8 효능제 및 vit-A의 군으로부터 선택되는 단백질 또는 펩티드.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, PML이 발생할 위험이 있는 피검체에서 PML 및/또는 PML-IRIS를 예방하는 방법에서 사용하기 위한 단백질 또는 펩티드.
제 12항에 있어서, 상기 피검체가 JCV에 감염된 피검체인 단백질 또는 펩티드.
제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검체가,
a) 선천성 면역결핍, 예를 들어, 특발성 CD4+ 림프구감소증 또는 과-IgE-증후군(Hyper-IgE-Syndrome)을 갖는 피검체,
b) 질병 또는 병리 질환, 예를 들어, AIDS, 백혈병, 림프종, 다발골수종 또는 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스의 감염으로부터 발생하는 후천적 면역결핍을 갖는 피검체, 및
c) 치료적 개입, 예를 들어, 화학요법, 방사선 또는 면역억제 치료로부터 발생하는 후천적 면역결핍을 갖는 피검체의 군으로부터 선택되는 단백질 또는 펩티드.
제 14항에 있어서, 상기 면역억제 치료가 면역억제 항체를 이용한 치료를 포함하는 단백질 또는 펩티드.
제 15항에 있어서, 상기 면역억제 항체가 나탈리주맙(natalizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 리툭시맙(rituximab), 오크렐리주맙(ocrelizumab) 및 알렘투주맙(alemtuzumab)의 군으로부터 선택되는 단백질 또는 펩티드.
제 14항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검체가 자가면역 질병에 걸린 피검체인 단백질 또는 펩티드.
제 17항에 있어서, 상기 자가면역 질병이 다발경화증인 단백질 또는 펩티드.
제 18항에 있어서, 상기 피검체가 항체 나탈리주맙으로 치료되는 피검체인 단백질 또는 펩티드.
JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프, 및 바람직하게는 TLR-7 효능제 및/또는 TLR-8 효능제를 포함하는 군으로부터 선택되는 애쥬번트를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 포함하는 약학적 키트로서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1-92를 포함하는 군으로부터 선택되는 약학적 키트.
제 20항에 있어서, 애쥬번트가 TLR-7 효능제, 바람직하게는, 이미퀴모드인 약학적 키트.
제 20항 또는 제 21항에 있어서, JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질이 VP1 또는 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질을 포함하는 약학적 키트.
제 22항에 있어서, VP1 또는 VP1과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질이 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:46-76을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 에피토프를 추가로 포함하는 융합 단백질인 약학적 키트.
제 20항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질이 바이러스 유사 입자의 형태로 존재하는 약학적 키트.
제 20항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 키트가 IL-7을 추가로 포함하는 약학적 키트.
제 20항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, JCV로부터 유래된 적어도 하나의 CD4+ 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드가 피하 투여되는 약학적 키트.
제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 애쥬번트가 피부 투여되는 약학적 키트.
제 20항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 키트의 성분이 PML을 갖는 것으로 진단된 피검체 또는 PML이 발생할 위험이 있는 피검체로 구성된 군으로부터 선택된 피검체에 투여되고, 상기 피검체가 JCV의 보인자인 것으로 임의로 진단된 피검체인 약학적 키트.
제 20항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 키트의 성분이,
a) 면역손상 또는 면역결핍 피검체, 예를 들어, HIV의 보인자, 면역억제 치료를 받는 피검체 또는 선천성 면역결핍 환자, 예를 들어, 특발성 CD4+ 림프구감소증 또는 과-IgE-증후군을 갖는 환자; 및
b) 면역억제 치료에 적격인 피검체의 군으로부터 선택된 피검체에 투여되는, 약학적 키트.
제 20항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, PML을 치료하는데 사용하기 위한 약학적 키트.
제 20항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 면역손상 또는 면역결핍 피검체, 예를 들어, HIV의 보인자, 면역억제 치료를 받는 피검체 또는 선천성 면역결핍 환자, 예를 들어, 특발성 CD4+ 림프구감소증 또는 과-IgE-증후군을 갖는 환자; 및
b) 면역억제 치료에 적격인 피검체의 군으로부터 선택된 피검체에서 PML 및/또는 PML-IRIS를 예방하는데 사용하기 위한 약학적 키트로서,
상기 면역억제 치료가 바람직하게는 나탈리주맙, 에팔리주맙, 리툭시맙, 오크렐리주맙 및 알렘투주맙을 이용한 치료를 포함하는 군으로부터 선택되는, 약학적 키트.
제 29항 또는 제 31항에 있어서, 면역억제 치료가 자가면역 질병 또는 이식 환자로 진단된 피검체의 치료이고, 상기 키트의 성분이 면역억제 치료 전, 치료 후 또는 치료 동안 상기 환자에 투여되고, 상기 면역억제 치료가 바람직하게는 나탈리주맙, 에팔리주맙, 리툭시맙, 오크렐리주맙 및 알렘투주맙을 이용한 치료를 포함하는 군으로부터 선택되는, 약학적 키트.