CN102552900A - 蒿属花粉变应原疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蒿属花粉变应原疫苗及其制备方法和应用。所述蒿属花粉变应原疫苗，包括：大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原。该联合疫苗相比单一的蒿属花粉变应原疫苗，在能保证安全性的同时也提高了治疗的有效性；可以治疗由多种蒿属花粉过敏介导的过敏性皮炎、慢性荨麻疹、变应性鼻炎和过敏性哮喘疾病。

Description

蒿属花粉变应原疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种变应原疫苗，尤其涉及一种蒿属花粉变应原疫苗，以及它的制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

人们对于变应原疾病的认识始于“花粉热”，1911年科学家Noon和Freeman首次利用花粉提取液来治疗花粉热，变应原疾病治疗的历史从此开始。我国变应原的发展是1956年协和医院耳鼻喉科主任张庆松教授从美国引进，并取得了突破性进展，发现了中国最重要的秋季型致敏花粉是蒿属(Artemisia)植物花粉。上世纪八十年代由叶世泰、乔秉善牵头全国数十家医院完成的中国气传致敏花粉调查显示，很多地区夏秋季空气中花粉含量最多的为蒿属花粉。此后，大批学着对我国蒿属花粉过敏开展大量的临床流行病学调查，发现蒿属花粉过敏广泛分布于我国各个地区，在北方地区它是过敏性鼻炎和哮喘主要致病因素。

蒿属(Artemisia)植物为1、2或多年生草本植物，稀灌木，常具浓烈香气，多有根状颈和营养枝。蒿属的花粉特征具有高度一致性，主要体现在花粉呈球形或近球形，极面观呈三裂圆形具三孔沟，赤道面观为圆形或椭圆形。多数种的染色体数目为2n＝18，少数种的染色体数目为2n＝36。

我国蒿属花粉分布较广，并且在临床上已证实导致人过敏的花粉有三种：艾蒿花粉(Artemisia argyi Levl.et Vant)、大籽蒿花粉(Artemisiasieversiana Wild)、黄花蒿花粉(Artemisia annua L)。可见《中国气传花粉和植物彩色图谱》的记载。

2011年北京新华联协和药业在蒿属花粉传播季节(7月-10月)开展了一项流行病学调查，对疑是蒿属花粉过敏的病人同时点刺艾蒿花粉变应原点刺液、大籽蒿花粉变应原点刺液、黄花蒿花粉变应原点刺液。此次临床流行病学调查结果显示：在我国，三种蒿属花粉存在交叉过敏，虽然不同病人对三种蒿属花粉变应原反应程度存在差异性。在我国还存在不同种类的蒿属花粉，现尚没有报道证明其它蒿属花粉是否致人过敏。其它蒿属花粉相比上述三种蒿属花粉，分布范围和生长能力相对比较小。再者，蒿属花粉过敏存在交叉免疫原性，黄花蒿花粉、大籽蒿花粉、艾蒿花粉分布广泛，花粉原料更易于收集，所以这三种蒿属花粉是制备蒿属花粉变应原疫苗的合适的原料选择。北京协和医院变应原制剂室生产的大籽蒿花粉变应原注射液和黄花蒿花粉变应原注射液已证明安全有效，同时，欧洲和北美洲的艾蒿花粉变应原注射液也已被明安全有效。结合我国蒿属花粉过敏的流行病学，如果能研制出黄花蒿花粉、大籽蒿花粉和艾蒿花粉的变应原联合疫苗，肯定会比单一蒿属花粉变应原疫苗更有效，也更合适我国蒿属花粉过敏患患者的需求。即相比单一的蒿属花粉变应原疫苗，在能保证安全性的同时也会提高治疗的有效性。

现在变应原特异免疫治疗的方法主要分为皮下注射给药免疫治疗和舌下给药免疫治疗。皮下注射给药免疫治疗已有100年的历史，其安全性和有效性已经被得到证明。上世纪90年代初，变应原舌下滴剂疫苗诞生，1998年，WHO宣布了变应原舌下滴剂疫苗安全和有效。本世纪初，舌下滴剂变应原疫苗广泛用于欧洲、南美洲、澳州、东南亚和中东地区。

专利申请CN200910147470.X(专利名称：一种稳定的含有蒿属花粉变应原的药物组合物，公开日期：2010年12月8日)公开了一种药物组合物，可以包含北艾花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和大籽蒿花粉变应原。北艾花粉主要分布于欧洲，和上述我国主要致敏的蒿属花粉变应原：大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原、艾蒿花粉变应原不同。并且，该专利申请只是提到可以将蒿属花粉变应原制备成组合物，仅有这样的思路，并没有具体公开该组合物是如何制备的，变应原的比例，制得的组合物疗效怎样...等都是未知的，即实质上并没有解决蒿属花粉是否可以用来制备得到联合疫苗这一技术问题。

发明内容

本发明的目的之一在于针对上述问题，提供了一种蒿属花粉变应原疫苗。它是一种黄花蒿花粉、大籽蒿花粉和艾蒿花粉的变应原联合治疗性疫苗。

本发明的另一目的，在于提供一种所述蒿属花粉变应原疫苗的制备方法。

本发明的又一目的，在于提供所述蒿属花粉变应原疫苗在制备治疗过敏性疾病药物中的应用。

本发明提供的一种蒿属花粉变应原疫苗，包括：大籽蒿花粉(Artemisia sieversiana Willd)变应原、黄花蒿花粉(Artemisia annuaL.)变应原、艾蒿花粉(Artemisia argyi Levl.et Vant)变应原。

其中，所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原三者的活性比为(0.5～2)∶(0.5～2)∶(0.5～2)，优选为(0.5～1)∶(0.5～1)∶(0.5～1)，更优选1∶1∶1。

本发明所述的蒿属花粉变应原疫苗，还包括药学上可接受的载体。

其中，所述药学上可接受的载体为氯化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲盐、甘油和苯酚。

其中，所述氯化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、甘油和苯酚的加入浓度为：氯化钠0.5％～1％，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液10mM～500mM，苯酚0.2％～0.5％，甘油50％。氯化钠优选0.5％；磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液优选50mM～500mM；苯酚优选0.2％～0.4％。上述浓度百分数都是W/V比(重量体积比)。

其中，所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH值为7.5～8.5，优选8.0。

本发明所述的蒿属花粉变应原疫苗制成的剂型可以是：注射剂、胶囊、舌下滴剂、口服液、鼻腔剂或贴剂。

所述疫苗制成的剂型优选舌下滴剂。舌下给药变应原疫苗相比皮下注射给药变应原疫苗，更安全，患者可以自己回家用药。鼻炎和哮喘病人中，儿童患者占很大比例，对于儿童群体患者，舌下给药变应原疫苗，患者依从性更好，更容易接受这种治疗方式。

其中，所述蒿属花粉变应原疫苗舌下滴剂的有效剂量为80AU/ml～50000AU/ml。

本发明提供的一种所述蒿属花粉变应原疫苗的制备方法，包括：提取所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原的变应原，将三种变应原原液以及药学上可接受的载体混合。

其中，所述籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液和艾蒿花粉变应原原液的具体提取方法都是一样的，包括：分别以大籽蒿花粉、黄花蒿花粉或艾蒿花粉为原料，将花粉脱脂、浸提、过滤、浓缩，制得所述籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液和艾蒿花粉变应原原液。

所述籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液和艾蒿花粉变应原原液的提取方法，进一步地，包括以下步骤：

1)收集大籽蒿花粉、黄花蒿花粉或艾蒿花粉；收集花粉后，筛除杂质，然后对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定；

2)脱脂：将步骤1)得到的花粉分别用丙酮浸泡搅拌脱脂，将脱脂后的固体物自然干燥；其中，花粉和丙酮的体积比为1∶2～1∶10，优选1∶5；

3)浸提：将步骤2)脱脂后的大籽蒿花粉、黄花蒿花粉或艾蒿花粉，分别以料液比1∶10～1∶50(W∶V)加入10mM～500mM，pH值为7.5～8.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，2～8℃搅拌2～24h进行提取，得到粗提液；将粗提液，6000rpm，4℃，离心15min；取上清8000rpm，4℃，离心30min后取上清；其中，料液比优选1∶25，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液浓度优选50mM～500mM，pH值优选8.0；提取温度优选4℃，时间优选12～24h，更优选24h；

4)过滤：将步骤3)得到的粗提液分别依次用2～10μm、0.45～1μm和0.22～0.45μm滤膜过滤；依次使用的滤膜优选8μm、0.45μm和0.22μm；

5)浓缩：将步骤4)过滤后的提取液，分别用3KD～10KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致；提取液超滤浓缩至原体积的1/10～1/5，用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于100000AU/ml；超滤膜优选5KD，提取液超滤浓缩至原体积优选1/5。

本发明提供的所述蒿属花粉变应原疫苗在制备治疗过敏性疾病药物中的应用。

尤其是在制备通过特异性免疫方式治疗蒿属花粉过敏介导的过敏性疾病药物中的应用。所述过敏性疾病包括过敏性皮炎、慢性荨麻疹、变应性鼻炎和过敏性哮喘。

本发明提供的蒿属花粉变应原疫苗选用了三种蒿属花粉变应原：大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原，它们是我国主要致敏的三种蒿属花粉变应原。联合疫苗的整体有效性高于单一的蒿属花粉变应原疫苗，囊括了我国致敏蒿属花粉的主要变应原。可以治疗由多种蒿属花粉过敏介导的过敏性皮炎、慢性荨麻疹、变应性鼻炎和过敏性哮喘疾病，疗效好，联合用药有效性提高，并且安全性和稳定性都比现有技术好。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1大籽蒿花粉变应原原液的制备

1)通过机械(吸尘器)采集或水培法收集大籽蒿花粉，然后使用300目网筛除去灰尘等杂质，并对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定。

2)将1)所得到的花粉以体积比1∶5加入丙酮，在室温间断搅拌下脱脂，每次3h，脱脂后丙酮无色，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味。

3)将脱脂后的大籽蒿花粉1000g以投料比1∶25(W∶V)加入25000ml、200mM、PH8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，4℃搅拌24h。将提取后的提取液，6000rpm，4℃，离心15min；取上清8000rpm，4℃，离心30min后取上清。

4)将提取结束后的提取液用8μm滤膜澄清过滤，再将粗提液经0.45μm、0.22μm滤膜依次过滤。

5)将4)过滤后的提取液，用5KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致。将提取液超滤浓缩到原体积1/10，用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于100000AU/ml。

实施例2黄花蒿花粉变应原原液的制备

1)通过机械(吸尘器)采集或水培法收集黄花蒿花粉，然后使用300目网筛除去灰尘等杂质，并对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定。

2)将1)所得到的花粉以体积比1∶2加入丙酮，在室温间断搅拌下脱脂，每次3h，脱脂后丙酮无色，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味。

3)将脱脂后的黄花蒿花粉1000g以投料比1∶10(W∶V)加入25000ml、50mM、PH8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，3℃搅拌12h。将提取后的提取液，6000rpm，4℃，离心15min；取上清8000rpm，4℃，离心30min后取上清。

4)将提取结束后的提取液用8μm滤膜澄清过滤，再将粗提液经0.45μm、0.22μm滤膜依次过滤。

5)将4)过滤后的提取液，用5KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致。将提取液超滤浓缩到原来体积的1/5，用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于100000AU/ml。

实施例3艾蒿花粉变应原原液的制备

1)通过机械(吸尘器)采集或水培法收集艾蒿蒿花粉，然后使用300目网筛除去灰尘等杂质，并对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定。

2)将1)所得到的花粉以体积比1∶10加入丙酮，在室温间断搅拌脱脂，每次3h，直至脱脂后上清丙酮为无色，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味后称重。

3)将脱脂后的艾蒿花粉1000g以投料比1∶50(W∶V)加入25000ml、500mM、pH8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，2℃搅拌24h。将提取后的提取液，6000rpm，4℃，离心15min；取上清8000rpm，4℃，离心30min后取上清。

4)将提取结束后的提取液用8μm滤膜澄清过滤，再降粗提液经0.45μm、0.22μm滤膜依次过滤。

5)将4)过滤后的提取液，用5KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致。将提取液超滤浓缩到原来体积的1/10，用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于100000AU/ml。

大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液也可采用完全相同的方法进行制备。

实施例4蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备

1)半成品的配制

将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH8.0，50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比1∶1∶1配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50％(w/v)的甘油，终浓度为0.2％(w/v)的苯酚和终浓度为0.5％(w/v)的氯化钠，最终配制成50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml五个浓度的半成品。

三种蒿属花粉变应原按活性比1∶1∶1混合，保证了三种蒿属花粉变应原的质和量的均一性。

2)半成品分装

将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。

实施例5蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备

1)半成品的配制

将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用PH8.0，300mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比1∶1∶1配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50％(w/v)的甘油，终浓度为0.4％(w/v)的苯酚和终浓度为0.5％(w/v)的氯化钠，最终配制成50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml五个浓度的半成品。

2)半成品分装

将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。

实施例6蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备

1)半成品的配制

将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用PH8.0，50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比1∶1∶1配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50％(w/v)的甘油，终浓度为0.3％(w/v)的苯酚和终浓度为1％(w/v)的氯化钠，最终配制成50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml五个浓度的半成品。

2)半成品分装

将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。

实施例7蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备

1)半成品的配制

将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用PH8.0，500mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000.AU/ml后混合，按体积比1∶1∶1配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50％(w/v)的甘油，终浓度为0.2％(w/v)的苯酚和终浓度为0.5％(w/v)的氯化钠，最终配制成50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml五个浓度的半成品。

2)半成品分装

将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。

实施例8蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备

1)半成品的配制

将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH8.0，50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，以体积比0.5∶2∶0.5配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50％(w/v)的甘油，终浓度为0.2％(w/v)的苯酚和终浓度为0.5％(w/v)的氯化钠，最终配制成50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml五个浓度的半成品。

2)半成品分装

将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。

实施例9蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备

1)半成品的配制

将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH8.0，50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，以体积比0.5∶0.5∶2配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50％(w/v)的甘油，终浓度为0.2％(w/v)的苯酚和终浓度为0.5％(w/v)的氯化钠，最终配制成50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml五个浓度的半成品。

2)半成品分装

将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。

实施例10蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备

1)半成品的配制

将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH8.0，50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，以体积比2∶0.5∶0.5配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50％(w/v)的甘油，终浓度为0.2％(w/v)的苯酚和终浓度为0.5％(w/v)的氯化钠，最终配制成50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml五个浓度的半成品。

2)半成品分装

将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。

实施例11蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备

1)半成品的配制

将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH8.0，50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，以体积比2∶2∶0.5配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50％(w/v)的甘油，终浓度为0.2％(w/v)的苯酚和终浓度为0.5％(w/v)的氯化钠，最终配制成50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml五个浓度的半成品。

2)半成品分装

将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。

实施例12蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备

1)半成品的配制

按本发明专利的工艺制备大籽蒿花粉变应原提取液、黄花蒿花粉变应原提取液、艾蒿花粉变应原提取液，在5KD超滤过程中，用50mMPH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液超滤。

将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH6.0，50mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比1∶1∶1配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50％(w/v)的甘油，终浓度为0.2％(w/v)的苯酚和终浓度为0.5％(w/v)的氯化钠，最终配制成50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml五个浓度的半成品。

2)半成品分装

将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。

实施例13蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备

1)半成品的配制

按本发明专利的工艺制备大籽蒿花粉变应原提取液、黄花蒿花粉变应原提取液、艾蒿花粉变应原提取液，在5KD超滤过程中，用50mMPH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液超滤。

将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH5.0，50mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比1∶1∶1配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50％(w/v)的甘油，终浓度为0.2％(w/v)的苯酚和终浓度为0.5％(w/v)的氯化钠，最终配制成50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml五个浓度的半成品。

2)半成品分装

将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。

实施例14蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备

1)半成品的配制

按本发明专利的工艺制备大籽蒿花粉变应原提取液、黄花蒿花粉变应原提取液、艾蒿花粉变应原提取液，在5KD超滤过程中，用50mMPH7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液超滤。

将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH7.0，50mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比1∶1∶1配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50％(w/v)的甘油，终浓度为0.2％(w/v)的苯酚和终浓度为0.5％(w/v)的氯化钠，最终配制成50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml五个浓度的半成品。

2)半成品分装

将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。

试验例1蒿属花粉变应原交叉免疫性

1)体内点刺实验方法

本实验使用北京协和医院变应原制剂室制备的艾蒿花粉变应原点刺液、黄花蒿花粉变应原点刺液、大籽蒿花粉变应原点刺液给疑是蒿属花粉患者同时点刺三种点刺液。此次蒿属花粉过敏流行病学调查地点为我国蒿属花粉最严重的东北地区。在此次流行病学调查实验中，共进入实验组的有1059例病人，其中893例病人点刺三种蒿属花粉变应原阳性；4例病人点刺黄花蒿阳性，艾蒿、大籽蒿点刺阴性；162例病人三种蒿属花粉点刺阴性。此次蒿属花粉过敏临床流行病学调查结果显示：在我国，艾蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原、大籽蒿花粉变应原存在交叉过敏。

2)体外实验

本实验采用RAST竞争免疫抑制实验，采用UniCAP(法玛西亚)，用艾蒿花粉变应原包被的immunoCAP小管，收集30份三种蒿属花粉点刺阳性的蒿属花粉变应原血清分别来验证三种蒿属花粉变应原交叉过敏的强度。实验方法：将黄花蒿花粉变应原溶液、艾蒿花粉变应原溶液、大籽蒿花粉变应原溶液配制为蛋白浓度为100μg/ml溶液(Bradford法测定蛋白浓度)。将100μg/ml三种蒿属花粉变应原溶液用生理盐水稀释为10-1、10-2、10-3三个浓度，分别取100μl样品置于5mleppendorf小管中，每管加100μl蒿属花粉变应原血清，37℃孵育60min。以100μl生理盐水加100μl阳性血清为阳性对照，以100μl生理盐水加100μl阴性血清为阴性对照，对艾蒿花粉变应原immunoCAP上机检测，计算每个浓度的抑制率。实验结果如下：

表一：蒿属花粉交叉免疫抑制实验抑制率

三种蒿属花粉变应原交叉过敏实验通过体内点刺试验结果显示：以艾蒿花粉变应原immunoCAP小管为检测试剂，三种蒿属花粉变应原在10-1浓度均能完全抑制。这种可能是，三种蒿属花粉变应原每一种蒿属花粉变应原均能和阳性血清中的蒿属花粉变应原IgE抗体完全中和。

试验例2蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗活性的检测

取本申请三批通过实施例4-14制备得到的蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗，活性检测使用UniCAP采用RAST竞争性抑制实验的方法。

将50000AU、10000AU、2000AU、400AU、80AU五个浓度的成品和内部参考品分别用生理盐水稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-55个浓度，然后和100μl等量血清混合，37℃孵育60min，然后对艾蒿花粉变应原immunoCAP上机检测，计算抑制率，以稀释度1/10的对数值为横坐标，百分抑制率为纵坐标，计算50％抑制率时的稀释度。通过50％抑制率的稀释度与内部参考品相比，计算出活性(AU/ml)。

表二：疫苗活性值

试验结果显示：本发明的疫苗具备很高的免疫活性。

试验例3蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗主要致敏蛋白含量的检测

蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗(实施例4-14)主要致敏蛋白Art v1使用市购的艾蒿花粉Art v1Elisa定量检测试剂盒检测，按照试剂盒所

附操作说明操作。检测结果如表三：

表三：蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗主要致敏蛋白含量

试验例4 蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗稳定性的考察

本实验通过三批通过实施例4-14制备的蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗在2-8℃放置，3月、6月、9月、12月、18月活性的变化，考察蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的稳定性。

表四：实施例4疫苗稳定性实验数据

表五：实施例5疫苗稳定性实验数据

表六：实施例6疫苗稳定性实验数据

表七：实施例7疫苗稳定性实验数据

表八：实施例8疫苗稳定性实验数据

表九：实施例9疫苗稳定性实验数据

表十：实施例10疫苗稳定性实验数据

表十一：实施例11疫苗稳定性实验数据

表十二：实施例12疫苗稳定性实验数据

表十三：实施例13疫苗稳定性实验数据

表十四：实施例14疫苗稳定性实验数据

通过以上实验，实施例4-11蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗样品在2-8℃放置18月，活性没有明显的变化，在此条件放置18月基本稳定。实施例12-14蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗在2-8℃放置18月，活性开始降低。通过本实验可知，本发明用PH8.0，50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗相比其它pH值的缓冲液更加稳定。

试验例5蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的药效学评价

1、动物致敏

参考Hsiue TR等人Int Arch Allergy Immuol 1997；112(3)：295-302其中的方法，将20mg大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原、艾蒿花粉变应原混合溶液吸附到1％Al(OH)3凝胶上，给豚鼠皮下注射0.5ml，另将20mg三种蒿属花粉变应原溶于0.1％Al(OH)3凝胶上，给同一豚鼠腹腔注射0.5ml.每间隔10天重复致敏1次，共3次。

2、给药方式

试验组共分为6组：正常组、对照组、三种蒿属花粉混合变应原给药组(给药1组)、大籽蒿花粉变应原给药组(给药2组)、黄花蒿花粉变应原给药组(给药3组)、艾蒿花粉变应原给药组(给药4组)。正常组在试验期间不给药，对照组舌下滴变应原溶媒。三种蒿属花粉混合变应原舌下滴剂疫苗的规格(实施例4)：50000AU/ml(5号)、10000AU/ml(4号)、2000AU/ml(3号)、400AU/ml(2号)、80AU/ml(1号)。

大籽蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗、黄花蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗、艾蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗规格：50000AU/ml(分别为5-1号，5-2号，5-3号)、10000AU/ml(分别为4-1号，4-2号，4-3号)、2000AU/ml(分别为3-1号，3-2号，3-3号)、400AU/ml(分别为2-1号，2-2号，2-3号)、80AU/ml(分别为1-1号，1-2号，1-3号)。每组清洁级致敏豚鼠10只。

用量：第1天舌下含服1号，1-1号，1-2号和1-3号1滴，第二天舌下含服1号，1-1号，1-2号和1-3号2滴，第三天舌下含服1号，1-1号，1-2号和1-3号3滴，第四天舌下含服1号，1-1号，1-2号和1-3号4滴，第五天舌下含服1号，1-1号，1-2号和1-3号5滴；第6～10天舌下含服2号，2-1号，2-2号和2-3号药，每天的剂量跟1号，1-1号，1-2号和1-3号药相同；第11～15天舌下含服3号，3-1号，3-2号和3-3号药，每天的剂量与1号，1-1号，1-2号和1-3号药相同；第16～20天含服4号，4-1号，4-2号和4-3号药，每天的剂量跟1号，1-1号，1-2号和1-3号药相同；第21～25天舌下含服5号，5-1号，5-2号和5-3号药，每天的剂量与1号，1-1号，1-2号和1-3号药相同；从第26天，开始舌下含服5号，5-1号，5-2号和5-3号药，每天舌下给药5滴，维持至5个月治疗结束。

3、药效学评价

在给药结束后，每组豚鼠分别在不同位置皮下注射0.5ml100AU/ml大籽蒿花粉变应原水溶液、黄花蒿花粉变应原水溶液、艾蒿花粉变应原水溶液。测量每只豚鼠不同注射部位产生的风团和红斑的直径(长轴直径和短轴直径的平均值)，计算每组豚鼠每种花粉变应原风团和红斑直径的算术平均数。结果如表十五。

表十五：蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗药效学评价

从表中可知：单一蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗，能够有效地降低对应蒿属花粉过敏程度，同时也可以降低其他两种蒿属花粉过敏程度，但是单一蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗相对三种蒿属花粉混合变应原疫苗，其对其它两种蒿属花粉过敏的治疗的有效程度不如三种蒿属花粉变应原混合舌下滴剂疫苗(p＜0.01)。通过此实验的结果证明了三种蒿属花粉变应原存在交叉性，但也存在差异性，三种蒿属花粉变应原联合疫苗的有效性高于单一的蒿属花粉变应原疫苗。

试验例6蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的临床疗效

1、实验方案

挑选花粉症病人共400例，病程4年以上，经大籽蒿花粉变应原点刺液、黄花蒿花粉变应原点刺液、艾蒿花粉变应原点刺液点刺试验均为阳性(+++以上)。其中，100例，三种蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗给药(实施例4)，100例，大籽蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗给药，100例，黄花蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗给药，100例，艾蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗给药。三种蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗、大籽蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗、黄花蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗和艾蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗的规格均为：1号：80AU/ml。2号：400AU/ml 3号：2000AU/ml 4号：10000AU/ml 5号：50000AU/ml。

每组100例病人中，男女各半，最大年龄58岁，最小年龄9岁。使用方法：滴于舌下，含1～2分钟后吞服，每日1次。

用量：第1天舌下含服1号1滴，第二天舌下含服1号2滴，第三天舌下含服1号3滴，第四天舌下含服1号4滴，第五天舌下含服5滴；第6～10天舌下含服2号药，每天的剂量跟1号药相同；第11～15天舌下含服3号药，每天的剂量与1号药相同；第16～20天含服4号药，每天的剂量跟1号药相同；第21～25天舌下含服5号药，每天的剂量与1号药相同；从第26天，开始舌下含服5号药，每天舌下给药5滴，维持至治疗结束。

2、治疗的疗效

我们将疗效的判定标准分为四级：

(1)病人经过治疗后，有三个以上花粉季节在原地区未发病者，列为基本痊愈。

(2)脱敏以后：①花粉季节发病时间缩短；②症状减轻；③对症用药减少或免用；④原来在发病季需用肾上腺皮质激素者，脱敏后激素停用；⑤发病季节原来必须住院治疗者，脱敏后可以免于住院治疗；⑥发病季原来不能上班工作者，治疗后可以坚持日常工作；⑦花粉鼻炎病人脱敏治疗后十年以上未出现哮喘症状者；⑧过敏性鼻炎并哮喘的病人，治疗后花粉季不再出现哮喘发作症状；⑨脱敏治疗后，发病季节各项客观检查及体征有明显减轻者。

凡在上列九项指标中具有三项以上者，属于明显好转。

(3)在上列九项指标中具有1～2项者，属于减轻。

(4)治疗前后发病基本无改变着属于无效。

现将300例花粉过敏病人的总的脱敏治疗疗效列为表七。

表十六：400例花粉过敏病人的脱敏治疗疗效

从上表可以看出，花粉病人采用特异性脱敏治疗后治疗有效率：大籽蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗：88％，黄花蒿花粉变应原舌下免疫滴剂疫苗：89％，艾蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗：90％，三种蒿属花粉变应原联合舌下滴剂疫苗：97％。花粉病人采用特异性脱敏治疗后痊愈率：大籽蒿花粉变应原舌下滴剂疫苗：3％，黄花蒿花粉变应原舌下免疫滴剂疫苗：4％，艾蒿话费呢变应原舌下滴剂疫苗：3％，三种蒿属花粉变应原联合舌下滴剂疫苗：11％。结果显示，三种蒿属花粉变应原联合疫苗相比单一的蒿属花粉变应原疫苗在治疗有效性和治疗后痊愈率高，三种蒿属花粉变应原联合疫苗在治疗蒿属花粉过敏症状更有效。同样，对其余实施例和本发明的活性比进行实验，效果近似。

Claims (10)

1.一种蒿属花粉变应原疫苗，包括：大籽蒿花粉(Artemisiasieversiana Willd)变应原、黄花蒿花粉(Artemisia annua L.)变应原和艾蒿花粉(Artemisia argyi Levl.et Vant)变应原。

2.根据权利要求1所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原三者的活性比为(0.5～2)∶(0.5～2)∶(0.5～2)。

3.根据权利要求1或2所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原三者的活性比为(0.5～1)∶(0.5～1)∶(0.5～1)，优选为1∶1∶1。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括药学上可接受的载体；所述药学上可接受的载体为氯化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲盐、甘油和苯酚。

5.根据权利要求4所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述氯化钠浓度为0.5％～1％，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液浓度为10mM～500mM，苯酚浓度为0.2％～0.5％，甘油浓度为50％；氯化钠优选0.5％，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液优选50mM～500mM，苯酚优选0.2％～0.4％。

6.根据权利要求4或5所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH值为7.5～8.5，优选8.0。

7.根据权利要求1～3任意一项所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述疫苗制成的剂型为：注射剂、胶囊、舌下滴剂、口服液、鼻腔剂或贴剂；优选舌下滴剂，其有效剂量为80AU/ml～50000AU/ml。

8.权利要求4～7任意一项所述蒿属花粉变应原疫苗的制备方法，其特征在于，包括：提取所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原的变应原，将三种变应原原液以及药学上可接受的载体混合。

9.根据权利要求8所述的蒿属花粉变应原疫苗的制备方法，其特征在于，分别以大籽蒿花粉、黄花蒿花粉或艾蒿花粉为原料，将花粉脱脂、浸提、过滤、浓缩，制得籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液和艾蒿花粉变应原原液。

10.权利要求1～7任意一项所述的蒿属花粉变应原疫苗在制备治疗过敏性疾病药物中的应用。