CN103421106A

CN103421106A - 重组热带剥爪螨变应原Blo t 5蛋白及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN103421106A
Application number: CN201210157336XA
Authority: CN
Inventors: 蔡俊龙; 杨彬; 付永锋; 程训佳
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-05-17
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2013-12-04

Abstract

本发明涉及生物技术领域，涉及一种重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白及其制备方法和用途。本发明从培养的热带剥爪螨提取RNA，通过PCR获得热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白的编码基因后，构建变应原Blo t5蛋白的表达载体pET19b-Blo t5。经大量的表达纯化及进一步的鉴定，证实本发明的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白可以与热带剥爪螨过敏患者的血清中IgE和IgG抗体特异性结合，具有与天然热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白相同免疫活性。本发明的制备方法，可获得具有生物学活性的可溶性重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白，可用于热带剥爪螨引起的过敏性疾病的诊断和治疗，能避免天然提取物的非单一性及标准化难的障碍。

Description

重组热带剥爪螨变应原Blo t 5蛋白及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白及其制备方法与用途

背景技术

过敏性哮喘是危害严重的公共卫生问题，近年来，其发病率及死亡率呈持续上升趋势。据WHO估计，全世界现有3亿的哮喘患者，其中50％以上的成人和至少80％的儿童患者均由过敏因素诱发，每年有25万以上的患者死于哮喘，因此，哮喘已不仅是发达国家的公共卫生问题，几乎所有国家都深受其害。据统计，我国大陆哮喘的发病率尚较低，为2.1%(不包括香港6.2%和台湾2.6%)，但我国哮喘患者的死亡率却高达36.7/10万，位居全球第一。此外，我国哮喘的发病在各地区之间的差异可达10倍，以重庆最高，西藏最低，并且在未来十年内，哮喘的发病将持续上升，由于我国人口基数大，哮喘的发病率上升2个百分点，将增加2千万以上的发病人数。

研究表明，过敏性哮喘可以由多种因素诱发，其中环境中存在的各种变应原是其主要诱发原因。这些变应原包括尘螨、动物的皮屑、花粉和霉菌等，在众多的变应原中螨类是最主要的变应原，花粉、真菌次之。螨变应原是引起变态反应性疾病的重要病因之一，也是引起儿童变应性哮喘的独立且重要的危险因子。尘螨主要包括户尘螨、粉尘螨和热带剥爪螨。生物学研究表明，环境温度和湿度是影响螨类生存的主要因素，户尘螨、粉尘螨和热带剥爪螨的分布具有明显的地域性。其中在热带和亚热带地区热带剥爪螨为主要的螨种。

近年来，有研究通过免疫印迹方法从热带剥爪螨中分离鉴别出至少25种变应原。已正式命名的有Blo t1、Blo t3、Blo t4、Blo t5、Blo t6、Blo t10、Blo t11、Blo t12、Blo t13、Blo t19和Blo t21等11种。剥爪螨变应原Blo t5是热带剥爪螨的主要变应原蛋白，可被大部分热带剥爪螨过敏患者血清中的IgE抗体特异性结合。核磁共振的方法研究Blo t5的结构，发现它的空间结构有两个很靠近的表位，分别有完整的抗体互补决定区（complementarity-determining regions，CDRs），有很好的抗原抗体结合性。

目前临床上对热带剥爪螨过敏患者的诊断和特异性抗原免疫治疗采用的是传统的热带剥爪螨浸出液，其含有多种抗原成分，且相对效价和特异性抗原水平存在明显的差异，很难进行标准化定量，容易引起患者出现诊断或治疗性过敏反应，因此对其诊治的应用受到限制。本申请发明人关注到，重组的热带剥爪螨变应原蛋白不仅产量高，生产条件恒定，将有利于进行标准化，更适合进行临床诊断与治疗。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的热带剥爪螨变应原浸出液进行过敏性疾病的诊断与治疗的存在的不足，提供重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白及其制备方法与用途。

本发明通过基因工程手段，从克隆化培养的热带剥爪螨提取其主要变应原蛋白Blo t5的编码基因，构建表达载体，在大肠杆菌中诱导表达重组热带剥爪螨变应原Blo t5，获得的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白可用于热带剥爪螨引起的过敏性疾病的诊断与治疗。

本发明的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白是由序列SEQ ID No：1核苷酸序列编码的蛋白；Blo t5编码基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

本发明提供了一种用于制备重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白的质粒，然而产生本发明的质粒构建方法不受特别的限制。

本发明提供了重组热带剥爪螨变应原Blo t5的制备方法，其包括如下步骤：

（1）热带剥爪螨的克隆化培养培养；

（2）从上述克隆化培养的热带剥爪螨的菌体中提取总RNA；

（3）合成引物：

Blo t5-S5-CCCATATGAAGAAGGATGATTTCCGAA-3

Blo t5-as5-CCCTCGAGTTATTGGGTTTGAATATC-3

（4）以cDNA为模板，通过PCR获得热带剥爪螨变应原Blo t5编码基因片段；

（5）将编码基因克隆入原核表达载体中，转化宿主菌，培养所得重组工程菌，然后诱导其表达目的蛋白；

（6）采用Ni²⁺亲和层析将重组热带剥爪螨变应原Blo t5提纯，从而获得纯化的重组热带剥爪螨变应原Blo t5；

（7）免疫学方法鉴定重组热带剥爪螨变应原Blo t5免疫原性

在上述表达方法中，步骤（3）所述的Blo t5编码基因如SEQ ID No：1所示；所述的Blo t5编码基因其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

在上述表达方法中，步骤（5）所述原核表达载体为pET19b，宿主菌为大肠杆菌BL21 Star^TM(DE3)pLysS，培养基为LB液体培养基，培养温度为20～37℃，培养时间6～16小时。

在上述表达方法中，步骤（5）中采用IPTG为诱导剂；培养的菌体达到合适的浓度后以IPTG进行诱导表达，诱导条件为：IPTG浓度为0.1～1mM，诱导温度为20～37℃，诱导时间为2～16小时。本发明的一个实施例中，优选诱导条件为：IPTG浓度为1mM，诱导温度为37℃，诱导时间为4小时。

在上述表达方法中，步骤（6）中采用下述纯化方法：将热带剥爪螨变应原Blo t5表达工程菌在37℃诱导3小时后，离心收集菌体，置于冰上超声裂解，然后加入溶菌酶30℃振摇30分钟，离心，上清，以Novagen公司的Ni-NTAHis-Bind Resin进行提纯，冰箱保存。

本发明的进一步的目的是提供如前所述的重组热带剥爪螨变应原Blo t5在制备热带剥爪螨过敏性疾病的诊断与治疗的试剂中的用途。

本发明经试验证实，所述的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白可以与热带剥爪螨过敏患者的血清中IgE特异性结合或刺激机体产生抗热带剥爪螨变应原抗体IgG，具有与天然热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白相同免疫活性。本发明重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白的制备方法，可获得具有生物学活性的可溶性重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白，可用于制备诊断或治疗热带剥爪螨引起的过敏性疾病的试剂或制剂。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明从培养的热带剥爪螨中提取总RNA，扩增出热带剥爪螨主要变应原蛋白Blo t5的编码基因，从而构建表达载体。转入大肠杆菌诱导后，重组热带剥爪螨变应原Blo t5以可溶性蛋白形式在大肠杆菌中高效表达，经过Ni²⁺亲和层析获得高纯度具有生物学活性的重组热带剥爪螨变应原Blo t5，可用于热带剥爪螨引起的过敏性疾病的诊断与治疗，明显避免了天然提取物的非单一性及标准化难的障碍。

附图说明

图1PCR扩增热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白编码基因电泳图。

图2重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白在大肠杆菌中表达检测SDS-PAGE电泳结果，

其中M为低分子蛋白marker；1为未诱导的细菌裂解液；2为经1mM的IPTG37℃诱导3小时后，细菌裂解液。

图3纯化后重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白SDS-PAGE检测电泳结果。

图4重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白抗原特异性Dot blotting检测，

其中1为鼠单克隆抗体1E1;2为鼠单克隆抗体6A11;3为鼠单克隆抗体1C10。

图5重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白western blot检测，

其中;1,4,7为BSA;2,5,8为热带剥爪螨浸提液；3，6，9为重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白;1,2,3与鼠单克隆抗体1E1反应结果；4,5,6与鼠单克隆抗体6A11反应结果;7,8,9与鼠单克隆抗体1C10反应结果。

图6热带剥爪螨过敏患者、户尘螨过敏患者和健康体检者的血清对纯化后Blo t5的反应性。

具体实施方式

实施例1热带剥爪螨培养

按专利申请号：201010545972.0的培养方法分离并培养热带剥爪螨，培养采用封闭式容器，温度(25±2)℃，相对湿度75%。

实施例2热带剥爪螨变应原Blo t5编码基因获得

按照Rneasy Total RNA试剂盒的使用说明，提取热带剥爪螨菌体的总RNA，使用GeneAmp RNA PCR Kit进行RT-PCR，获得cDNA。根据GeneBank公布的热带剥爪螨变应原Blo t5的mRNA序列（U59102.1），设计引物：上游引物：5’-CCCATATGAAGAAGGATGATTTCCGAA-3’，含Nde I酶切位点；下游引物：5’-CCCTCGAGTTATTGGGTTTGAATATC-3’，含Xho I酶切位点。以cDNA为模板，PCR扩增编码热带剥爪螨变应原Blo t5成熟肽段的基因片段，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为355bp（如图1所示）。

实施例3构建重组表达质粒pET19b-Blo t5

以QIAquick PCR Purification Kit提纯PCR扩增产物，再以NdeI和Xho I酶切PCR扩增产物插入pET19b载体中。转入大肠杆菌JM109，将菌液涂布于LB琼脂板（含氨苄青100μg/ml，氯霉素34μg/ml），37℃过夜培养后，挑取克隆，抽提重组质粒进行双酶切鉴定，结果显示目标条带与Blo t5基因片段的PCR产物大小一致，说明成功构建了热带剥爪螨变应原Blo t5的重组质粒pET19b-Blot5（如图2，图3所示）由上海英俊生物有限公司对该重组质粒进行测序鉴定，并采用Vector NTI 10软件，推定氨基酸序列，并与Genebank中公布的序列（U59102.1）进行比对，结果表明Blo t5基因片段与U59102.1一致。

实施例4重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白的表达

重组质粒pET19b-Blo t5转化大肠杆菌BL21 Star(DE3)pLysS后，涂布于LB琼脂板（含氨苄青100μg/ml，氯霉素34μg/ml），37℃温箱中培养过夜。挑选单一菌落入800ml LB培养液（含氨苄青50μg/ml，氯霉素34μg/ml）中，37℃ 220rmp振摇，培养至OD600约为0.5时，加入1mM的IPTG，37℃诱导3小时，4℃ 8000rpm离心10分钟，弃上清，收集细菌沉淀。经12.5%的SDS-PAGE检测，IPTG诱导的菌液在分子量大约17kD处出现目的蛋白表达条带（如图6所示）。

实施例5纯化重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白

本发明的热带剥爪螨变应原Blo t5以可溶性蛋白形式表达。细菌沉淀中，加入20ml Binding buffer，冰上超声后，加入200g/ml溶菌酶混匀，30℃振摇30分钟后，冰上超声，4℃ 14000r/min离心20分钟，上清液用Ni2+亲和层析法纯化蛋白。经12.5%的SDS-PAGE检测，热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白的包涵体纯度可达到99%以上。

实施例6测定重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白含量

使用DC Protein Assay试剂盒检测重组蛋白含量。牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白，以PBS分别配制不同浓度BSA标准液（1.5mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0mg/ml），建立BSA蛋白浓度标准曲线。根据标准曲线，计算重组蛋白浓度为1.8mg/ml。每升细菌可制备80mg热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白。

实施例7重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白抗原特异性Dolt blotting检测

分别将2μg重组变应原Blo t5、5μg热带剥爪螨粗提液和2μg重组隐孢子虫子孢子表面蛋白P23(rP23)加样于硝酸纤维素膜上，室温干燥。以含3%脱脂奶的PBS湿盒内室温封闭1小时。分别加鼠单克隆抗体1E1、6A11和1C10，室温孵育1小时。分别加HRP-goat Anti-mouse IgG抗体（1:250稀释），室温孵育1小时。以DAB底物显色试剂盒显色20分钟。Dolt blotting结果显示重组变应原Blo t5蛋白和热带剥爪螨粗提液都可与单克隆抗体1E1、6A11和1C10特异性结合，而无关蛋白重组隐孢子虫子孢子表面蛋白P23无反应性（如图3所示）。

实施例8重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白抗原特异性Western blotting检测

重组变应原Blo t5 0.1μg、热带剥爪螨粗抗原5μg和BSA 0.1μg每道进行还原SDS-PAGE电泳后，电转到醋酸纤维素膜上。以含3%脱脂奶的PBS于湿盒内室温封闭1小时。分别加单克隆抗体1E1、6A11和1C10，室温孵育1小时。分别加HRP-goat Anti-mouse抗体（1:250稀释），室温孵育1小时。以DAB底物显色试剂盒显色，20分钟后终止反应，观察结果。Western blot结果显示还原条件下，用单克隆抗体1E1、6A11和1C10分别作用于重组蛋白和天然蛋白，重组蛋白在17kDa处有明显条带，天然蛋白在14kDa处有明显条带（如图4所示）。抗Blo t5单克隆抗体可与重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白特异性结合。

实施例9以重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白检测热带剥爪螨过敏患者血清

重组变应原Blo t5以0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至5μg/ml，每孔用0.1ml包被酶标板，4℃过夜。以含1%脱脂奶的PBS于湿盒内室温封闭1小时。分别加热带剥爪螨、户尘螨过敏患者血清和健康体检者血清（1:10稀释）37℃孵育2小时。HRP-goat-Anti-Human IgE抗体室温孵育1小时。最终用OPD显色，反应30分钟终止反应。用重组变应原Blo t5检测69份热带剥爪螨过敏患者血清中的IgE，其中20份血清反应成阳性，阳性率为29.0%，表明重组变应原Blo t5免疫活性良好。为了解重组变应原Blo t5户尘螨过敏患者血清的反应性，用ELISA检测其IgE反应性，阳性率为33.3%，反应性略低于热带剥爪螨过敏的患者血清（如图5所示）。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 重组热带剥爪螨变应原Blo t 5蛋白及其制备方法与用途

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 339

<212> DNA

<213> Blomia tropicalis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(339)

<400> 1

aag aag gat gat ttc cga aac gaa ttc gat cac ttg ttg atc gaa cag 48

Lys Lys Asp Asp Phe Arg Asn Glu Phe Asp His Leu Leu Ile Glu Gln

1 5 10 15

gca aac cat gct atc gaa aag gga gaa cat caa ttg ctt tac ttg caa 96

Ala Asn His Ala Ile Glu Lys Gly Glu His Gln Leu Leu Tyr Leu Gln

20 25 30

cac caa ctc gac gaa ttg aat gaa aac aag agc aag gaa ttg caa gag 144

His Gln Leu Asp Glu Leu Asn Glu Asn Lys Ser Lys Glu Leu Gln Glu

35 40 45

aaa atc att cga gaa ctt gat gtt gtt tgc gcc atg atc gaa gga gcc 192

Lys Ile Ile Arg Glu Leu Asp Val Val Cys Ala Met Ile Glu Gly Ala

50 55 60

caa gga gct ttg gaa cgt gaa ttg aag cga act gat ctt aac att ttg 240

Gln Gly Ala Leu Glu Arg Glu Leu Lys Arg Thr Asp Leu Asn Ile Leu

65 70 75 80

gaa cga ttc aac tac gaa gag gct caa act ctc agc aag atc ttg ctt 288

Glu Arg Phe Asn Tyr Glu Glu Ala Gln Thr Leu Ser Lys Ile Leu Leu

85 90 95

aag gat ttg aag gaa acc gaa caa aaa gtg aag gat att caa acc caa 336

Lys Asp Leu Lys Glu Thr Glu Gln Lys Val Lys Asp Ile Gln Thr Gln

100 105 110

taa 339

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> Blomia tropicalis

<400> 2

Lys Lys Asp Asp Phe Arg Asn Glu Phe Asp His Leu Leu Ile Glu Gln

1 5 10 15

Ala Asn His Ala Ile Glu Lys Gly Glu His Gln Leu Leu Tyr Leu Gln

20 25 30

His Gln Leu Asp Glu Leu Asn Glu Asn Lys Ser Lys Glu Leu Gln Glu

35 40 45

Lys Ile Ile Arg Glu Leu Asp Val Val Cys Ala Met Ile Glu Gly Ala

50 55 60

Gln Gly Ala Leu Glu Arg Glu Leu Lys Arg Thr Asp Leu Asn Ile Leu

65 70 75 80

Glu Arg Phe Asn Tyr Glu Glu Ala Gln Thr Leu Ser Lys Ile Leu Leu

85 90 95

Lys Asp Leu Lys Glu Thr Glu Gln Lys Val Lys Asp Ile Gln Thr Gln

100 105 110

Claims

1.重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白，其特征在于，该重组蛋白为由序列SEQID No：1的核苷酸序列编码的蛋白；通过下述方法制得：

（1）从克隆化培养的热带剥爪螨菌体中分离总RNA，通过RT-PCR合成cDNA；

（2）合成引物：

Blo t5-S5-CCCATATGAAGAAGGATGATTTCCGAA-3

Blo t5-as5-CCCTCGAGTTATTGGGTTTGAATATC-3

（3）以cDNA为模板，通过PCR获得热带剥爪螨变应原Blo t5编码基因片段；

（4）将编码基因克隆入原核表达载体中，转化宿主菌，培养所得重组工程菌，然后诱导其表达目的蛋白；

（5）采用Ni²⁺亲和层析将重组热带剥爪螨变应原Blo t5提纯，获得纯化的重组热带剥爪螨变应原Blo t5。

2.根据权利要求1所述的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白，其特征在于，所述方法步骤（1）中，所分离的总RNA来源于克隆化培养的热带剥爪螨。

3.根据权利要求1所述的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白，其特征在于，所述方法步骤（3）中，所述的Blo t5编码基因如SEQ ID No：1所示。

4.根据权利要求1所述的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白，其特征在于，所述方法步骤（3）中，所述的Blo t5编码基因其所编码的氨基酸序列如SEQ IDNo：2所示。

5.根据权利要求1所述的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白，其特征在于，所述方法步骤（4）中，所述的原核表达载体为pET19b。

6.根据权利要求1所述的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白，其特征在于，所述方法步骤（4）中，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21 Star^TM(DE3)pLysS。

7.根据权利要求1所述的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白，其特征在于，所述方法步骤（4）中，培养宿主细胞的培养基是LB液体培养基，培养温度是20～37℃，培养时间6～16小时。

8.根据权利要求1所述的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白，其特征在于，所述方法步骤（4）中，菌体达到合适的浓度后用IPTG诱导表达，诱导条件为：IPTG浓度为1mM，诱导温度为37℃，诱导时间为4小时。

9.根据权利要求1所述的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白，其特征在于，所述方法步骤（5）中，纯化方法为：将热带剥爪螨变应原Blo t5表达工程菌在37℃诱导4小时后，离心收集菌体，置于冰上超声裂解，然后加入溶菌酶30℃振摇30分钟，离心，上清，以Novagen公司的Ni-NTA His-Bind Resin进行提纯，冰箱保存。

10.权利要求1的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白在制备诊断热带剥爪螨过敏性疾病的试剂中的用途。

11.权利要求1的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白在制备治疗热带剥爪螨过敏性疾病的制剂中的用途。