CN101443034A

CN101443034A - 变应性抑制剂组合物和试剂盒及其使用方法

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Publication number: CN101443034A
Application number: CNA2006800488521A
Authority: CN
Inventors: 王宾; 金华利; 康友敏; 朱贤主; 吴加亮
Original assignee: China Agricultural University; Wyeth LLC
Current assignee: China Agricultural University; Wyeth LLC
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2009-05-27
Also published as: WO2007076084A3; US20150086593A1; KR20080078850A; AU2006330880B2; ZA200805296B; US9962437B2; EP1963513B1; WO2007076084A2; US8795675B2; US20130230551A1; NZ596043A; EP1963513A2; BRPI0620459A2; US20070166335A1; JP2010513220A; CA2631467A1; US20170112918A9; CA2631467C; AU2006330880A1; EP1963513A4

Abstract

本发明公开了抑制针对变应原蛋白的变态反应的组合物和试剂盒。该组合物包含真核细胞表达载体，其含有编码变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽的核苷酸序列；以及变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽。该试剂盒包括第一容器和第二容器，第一容器包含真核细胞表达载体，该载体含有编码变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽的核苷酸序列；第二容器包含变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽。公开了抑制针对跳蚤变应原蛋白；猫变应原蛋白；犬变应原蛋白；尘螨变应原蛋白；花生变应原蛋白；日本雪松变应原蛋白；以及热带无爪螨变应原蛋白的变态反应的组合物和试剂盒。还公开了使用这些组合物和试剂盒的方法。

Description

变应性抑制剂组合物和试剂盒及其使用方法

发明领域

本发明涉及可用于防止和抑制针对变应原的变态反应的组合物和试剂盒，还涉及使用这些组合物和试剂盒的方法。本发明提供了防止和抑制跳蚤变应性皮炎、针对猫和犬毛或毛皮垢屑、尘螨、花生、日本雪松花粉和热带无爪螨变应原的变态反应的组合物、试剂盒和方法。

发明背景

针对各种变应原的变态反应代表了重要的健康问题，尤其是对于变态反应诱导了严重反应和/或变态原诱导的速发型超敏反应(AIH)的情况。

变应性被认为是持续T细胞活化的结果，通过特异变应原驱动了针对宿主皮肤的致病性炎症。几种方法被用于缓解AIH，它们包括非特异性免疫抑制药物或靶向T或B细胞的单克隆抗体(A.J.Van Oosterhout etal，Am.J.Respir.CellMol.Biol.17，386(September1，1997)；P.Proksch etal，J Immunol 174，7075(June1，2005))。但是，这种情况是有害的，由于经长期治疗的患者通常会在它们抵御感染的能力方面受到损害。将免疫性从Th2型转向Th1型也被证明仅是有限成功(S.Jilek，C.Barbey，F.Spertini，B.Corthesy，J Immunol 166，3612(March1，2001))。最近发现T调节细胞，包括天然产生的胸腺衍生CD4⁺CD25⁺Treg细胞(I.M.deKleer et al，J Immunol 111，6435(May 15，2004)；D.Lundsgaard，T.L.Holm，L.Hornum，H.Markholst，Diabetes 54，1040(April1，2005)；M.J.McGeachy，L.A.Stephens，S.M.Anderton，J Immunol 175，3025(September 1，2005)；I.Bellinghausen，B.Klostermann，J.Knop，J.Saloga，J Allergy Clin Immunol 111，862(April 1，2003)；E.M.Ling et al，Lancet363，608(February 21，2004)；以及J.Kearley，J.E.Barker，D.S.Robinson，C.M.Lloyd，J.Exp.Med.，jem.20051166(November 28，2005))、粘膜诱导的Th3细胞和抗原诱导的CD4⁺CD25^-Tr细胞被提议用作免疫调节剂或抑制剂或自身反应性病原(H.Fukaura etal，J.Clin.Invest.98，70(July 1，1996))。已经开发了多种手段来诱导T调节细胞限制自身反应性T细胞。优先地，诱导抗原特异的T调节细胞靶向变应性、哮喘和自身免疫疾病抗原被认为是有希望的策略。几条证据已表明，通过利用未成熟DC、亚适免疫原(suboptimal immunogen)或部分阻断DC中的共刺激分子诱导抗原特异的调节性T细胞1(TO)是可能的(A.Kumanogoh et al.，JImmunol166，353(January1，2001)；M.K.Levings et al，Blood 105，1162(February 1，2005)；以及S.K.Seo etal，Nat Med 10，1088(October 1，2004))。所有这些手段都在体外或在实验条件下完成。通过共接种作为共给药疫苗的抗原匹配DNA和蛋白抗原而诱导可在体内抑制抗原特异性T细胞功能的Tr细胞(H.Jin et al，Virology 337，183(June 20，2005))。

非宿主跳蚤的主要特征在于其是噬血性寄生虫，可以在任何哺乳动物或鸟类动物的身体发现。猫蚤(Ctenocephalides felis)为主要出现在猫和狗中的寄生虫，而狗蚤(Ctenocephalides canis)限于家狗和野狗。跳蚤过敏性皮炎(FAD)是在猫和狗中最常见的皮肤病。当跳蚤寄生虫叮咬，其唾液作为刺激物并引起变态反应时，导致FAD。叮咬位点发红、肿胀、发炎和瘙痒。动物经常会用其爪子抓该叮咬部位，引起伤口转变为皮肤溃疡，并导致进一步的细菌和真菌感染。这对狗或猫造成重大威胁，并且目前对于这种疾病没有有效的药物治疗或预防方法。

通常，跳蚤变应原指来自跳蚤抗原的多种不同大小的蛋白，它们引起变态反应。在文献的一些部分中，其指猫跳蚤唾液变应原蛋白FSA1或Cte f1。GeneBank AF102502(通过参考将其并入本文)公开了编码来自Ctenocephalides felis的跳蚤唾液腺的FSA1或Cte f 1蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。该653核苷酸序列包括编码序列1-531(其包括信号肽(1-54)编码序列)和成熟蛋白序列(55-528)。GeneBank AAD17905(通过参考将其并入本文)公开了来自Ctenocephalides felis的跳蚤唾液腺的FSA1或Cte f 1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，包括信号肽(1-18)和成熟蛋白序列(19-176)。

主要的猫变应原蛋白为Fel dI。GeneBank M74953(通过参考将其并入本文)公开了编码来自家猫的主要变应原的Fel dI蛋白的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。其具有第二B分泌肽序列。这种Fel d I序列为416bp mRNA，包括由序列1-25构成的5’非翻译区和编码88氨基酸(SEQ ID NO：4；GeneBank AAC41617，通过参考将其并入本文)的编码序列26-292。信号肽由26-79编码，成熟蛋白由80-289编码。3’非翻译区为293-416。GeneBank M74952(通过参考将其并入本文)公开了编码来自家猫主要变应原的Fel dI蛋白的氨基酸和核苷酸序列(SEQ IDNO：5)。这种Fel dI序列为410bp mRNA，包括由序列1-7构成的5’非翻译区和编码92氨基酸(SEQ ID NO：6；GeneBank AAC37318，通过参考将其并入本文)的编码序列8-286。信号肽由8-73编码，成熟蛋白由74-283编码。3’非翻译区为287-410。

主要的犬变应性蛋白为唾液脂质促进剂Can f1和Can f2。GeneBankAF027177(通过参考将其并入本文)公开了编码来自家狗主要变应原的唾液lipocalin蛋白的Can f1蛋白的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。这种Can f1序列为525bp mRNA，编码174氨基酸(SEQ ID NO：8；GeneBank AAC48794，通过参考将其并入本文)。

GeneBank AF027178(通过参考将其并入本文)公开了编码来自家狗主要变应原的唾液lipocalin蛋白的Can f2蛋白的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。这种Can f2序列为791bp mRNA，包括编码180氨基酸(SEQ ID NO：10；GeneBank AAC48795，通过参考将其并入本文)的编码序列195-737。

GeneBank Ul 1695(通过参考将其并入本文)公开了编码尘螨变应性源蛋白抗原Der P 1的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。这种Der P 1序列为1099bp mRNA，包括编码180氨基酸(SEQ ID NO：12；GeneBankAAB60125，通过参考将其并入本文)的编码序列50-1012。该编码序列包括编码信号肽的编码序列50-109和编码成熟肽的编码序列344-1009。GeneBank AAB60125公开了包括氨基酸1-20的信号肽和包括氨基酸99-320的成熟蛋白。

GeneBank L77197(通过参考将其并入本文)公开了编码花生变应性源蛋白抗原Ara h II的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。这种Ara hII序列为编码110氨基酸并包括polyA信号562-567的717bp序列。

GeneBank AF059616(通过参考将其并入本文)公开了编码花生变应性源蛋白抗原Ara h II的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。这种Ara h 5序列为包括编码序列17-412的743bp序列。GeneBank AAD55587(通过参考将其并入本文)公开了131氨基酸蛋白(SEQ ID NO：15)。

GeneBank AB081309(通过参考将其并入本文)公开了编码日本雪松(cryptomeria japonica)变应性源抗原Cry j 1.1的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：16)。这种Cry j 1.1序列为1295bp序列，包括编码序列62-1186，其中信号肽由62-124编码，成熟蛋白由125-1183编码，polyA位点在1295。GeneBank BAB86286(通过参考将其并入本文)公开了374氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，包括氨基酸1-21的信号肽和氨基酸22-374的成熟蛋白。

GeneBank AB081310(通过参考将其并入本文)公开了编码日本雪松(cryptomeria japonica)变应性源抗原Cry j 1.2的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：18)。这种Cry j 1.2序列为1313bp序列，包括编码序列46-1170，其中信号肽由46-108编码，成熟蛋白由109-1167编码，polyA位点在1313。GeneBank BAB86287(通过参考将其并入本文)公开了374氨基酸蛋白(SEQ ID NO：19)，包括氨基酸1-21的信号肽和氨基酸22-374的成熟蛋白。

GeneBank U59102(通过参考将其并入本文)公开了编码热带无爪螨变应性源蛋白抗原Blo t 5的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：20)。这种Blo t 5序列为537bp序列，包括编码序列33-437。GeneBank AAD10850(通过参考将其并入本文)公开了134氨基酸蛋白(SEQ ID NO：21)。

仍亟需防止和抑制这些变应原诱导的变态反应的组合物和方法。

发明概述

本发明涉及防止和抑制针对变应原蛋白的变态反应的组合物。该组合物包含：

(a)真核细胞表达载体，其含有编码变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽的核苷酸序列；以及

(b)变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽。

本发明提供了防止和抑制针对变应原蛋白的变态反应的组合物，该变应原蛋白选自：跳蚤变应原蛋白；猫变应原蛋白；犬变应原蛋白；尘螨(dust mite)变应原蛋白；花生变应原蛋白；日本雪松(Japanese cedar)变应原蛋白；以及热带无爪螨(blomia tropicalis)变应原蛋白。

本发明还涉及防止和抑制针对变应原蛋白的变态反应的试剂盒。该试剂盒包括：

(a)包含真核细胞表达载体的第一容器，该载体含有编码变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽的核苷酸序列；和

(b)第二容器，其包含变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽。

本发明还提供了防止和抑制针对变应原蛋白的变态反应的试剂盒，该变应原蛋白选自：跳蚤变应原蛋白；猫变应原蛋白；犬变应原蛋白；尘螨变应原蛋白；花生变应原蛋白；日本雪松变应原蛋白；以及热带无爪螨变应原蛋白。

本发明还涉及防止和抑制个体中针对变应原蛋白的变态反应的方法。该方法包括向该个体给予以下成分的一个或多个步骤：

(a)真核细胞表达载体，含有编码变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽的核苷酸序列；以及

(b)变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽。

本发明提供了对针对个体中变应原蛋白的变态反应的防止和抑制，其中所述变应原蛋白选自：跳蚤变应原蛋白；猫变应原蛋白；犬变应原蛋白；尘螨变应原蛋白；花生变应原蛋白；日本雪松变应原蛋白；以及热带无爪螨变应原蛋白。

附图简要说明

图1a-1c涉及小鼠中的跳蚤变应性模型。C57b/6小鼠被跳蚤抗原或作为阴性对照的盐水初免疫两次，每两周一次，以跳蚤抗原或作为阴性对照的PBS、作为阳性对照的组胺皮内攻击。在图1a中，在攻击后30min时测量皮肤测试后的局部反应。图1b显示了抗跳蚤抗原的IgE产生。在图1c中，在小鼠中测试了跳蚤抗原体外刺激的CD4+T细胞增殖应答。结果为至少三次实验的代表。^*P<0.05，如所指出的，与未经刺激的对照组比较。

图2a-2d显示DNA和蛋白的联合免疫抑制了速发型超敏反应的出现。图2a显示了来自F或pcDF100+F联合免疫后小鼠的皮肤测试的数据。图2b显示了pcDF100+F联合免疫后小鼠中剂量依赖的皮肤应答。图2c显示了在诱导和治疗后IgE和IgG1的抗跳蚤抗原水平。图2d显示了体外特异跳蚤抗原刺激的CD4+T细胞增殖应答。结果为至少三次实验的代表。^*P<0.05，如所指出的，与V+F和F接种组比较。

图3a-3c显示，CD4⁺CD25^-T细胞造成了所观察到的抑制。图3a中，从跳蚤抗原免疫的小鼠脾分离5 X 10⁵CD3⁺T细胞并加至96孔板。同时，将来自未经刺激的小鼠，F、V+F和pcDF100+F免疫的小鼠的1 X 10⁵脾细胞也添加至相同板。类似地，从V+F或pcDF100+F免疫小鼠的脾分离1 X 10⁵非T细胞或T细胞，纯化的CD8⁺、CD4⁺或CD4⁺CD25”T细胞。这些共培养物在1 X 10⁵骨髓衍生的DC存在下在体外被跳蚤抗原(50μg/ml)刺激48h。通过MTS-PMS(Promega)按制造商的说明检查增殖，并通过下式确定刺激指数(SI)：跳蚤抗原刺激的数量/未经刺激培养物的数量)。在图3b中，来自未经刺激的小鼠、F、V+F和pcDF100+F免疫小鼠的1 X 10⁶脾细胞被过继转移进未经刺激的C57小鼠。类似地，从经pcDF100+F、V+F、F免疫的小鼠或未经刺激的对照小鼠的脾分离1x 10⁶非T细胞或T细胞、1 x 10⁶纯化的CD8⁺、CD4⁺、5 x 10⁵CD4⁺CD25^-和CD4⁺CD25⁺T细胞并过继转移至跳蚤抗原预刺激的同基因小鼠，研究皮肤测试应答。图3c显示DNA和蛋白的共给药诱导了抗原特异的抑制。从pcDF100+F、V+F免疫的小鼠或者未经刺激的(naive)对照小鼠的脾分离1x10⁶CD4⁺CD25^-T细胞，并过继转移进未经刺激小鼠，接着它们在转移后24小时被特异跳蚤抗原或非特异的OVA蛋白免疫，然后分离CD4⁺T细胞并分析它们的增殖。图中显示的结果为两实验的代表。^*P<0.05，如所指出的，与V+F和F转移比较。

图4a-4c显示来自pcDF100+F联合免疫小鼠的DC在体外诱导Tr细胞。图4a显示pcDF100+F联合免疫限制的在DC上的MLR刺激活性。免疫后48小时，将分离自小鼠脾的DC用于在MLR中刺激T细胞增殖。通过CFSE活性测量T细胞增殖。结果为两各自实验之一的代表。^*P<0.05，如所指出的，与V+F和F接种组比较。图4b显示与未经刺激的CD4⁺T细胞共培养的分离自pcDF100+F、V+F、F免疫的或未经刺激小鼠的DC的数据。采用新鲜DC重复刺激T细胞，两天一次，3个周期，接着在每个刺激周期后分析IL-10、IL-4和IFN-γ阳性细胞数量以及调节MLR刺激活性的能力。在图4c中，以来自C57小鼠的APC和来自Balb/c小鼠的T细胞进行MLR。通过CFSE测量T细胞增殖。结果为两独立实验的代表。^*P<0.05，如所指出的，与V+F和F接种组比较。

图5a-5c显示了皮肤病学评分数据。

图6显示了联合免疫前皮肤测试的结果。

图7显示了联合免疫后皮肤测试的结果。

图8显示了联合免疫后皮肤病学评分数据。

图9A-9F显示数据，它们证实了联合免疫对FAD猫的治疗作用。

图10A-10C显示数据，它们证实了联合免疫对FAD猫的治疗作用

图11显示了质粒pVAX1-K-FSA1的图谱。

本发明优选实施方案的说明

本发明提供了防止和抑制变态反应和变应原诱导的速发型超敏反应的组合物、试剂盒和方法。本发明提供了防止和抑制跳蚤变应性皮炎的组合物、试剂盒和方法，防止和抑制猫变应性的组合物、试剂盒和方法，防止和抑制犬变应性的组合物、试剂盒和方法，防止和抑制螨变应性的组合物、试剂盒和方法，防止和抑制花生变应性的组合物、试剂盒和方法，防止和抑制日本雪松变应性的组合物、试剂盒和方法，以及防止和抑制热带无爪螨变应性的组合物、试剂盒和方法。

本发明的组合物包含变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白以及编码变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的表达载体。

本发明的试剂盒包括包含变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的容器和包含表达载体的容器，该表达载体编码变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白。

本发明的方法包括向患有或易感于变态反应或变应原诱导的速发型超敏反应的个体联合给予本发明的组合物和/或本发明试剂盒的组分。

存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白，以及由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白具有氨基酸序列重叠，使得它们共有表位，即存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的至少一个表位与由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的至少一种表位相同。在一些实施方案中，存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白与由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白相同。在一些实施方案中，存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白为由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的片段。在一些实施方案中，由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白为存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的片段。在一些实施方案中，存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白为由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的片段。在一些实施方案中，1)存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白和2)由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白之一或二者与天然产生的为变应原的蛋白相同。在一些实施方案中，1)存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白和2)由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白二者都与天然产生的为变应原的蛋白相同。在一些实施方案中，1)存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白和2)由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白之一或二者与天然产生的为变应原的蛋白的片段相同。在一些实施方案中，1)存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白和2)由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白二者都与天然产生的为变应原的蛋白的片段相同。在一些实施方案中，存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白与天然产生的为变应原的蛋白的片段相同，而由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白与天然产生的为变应原的蛋白相同。在一些实施方案中，存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白与天然产生的为变应原的蛋白相同，而由存在于该组合物或试剂盒中并用在该方法中的表达载体编码的变应原蛋白或包含该变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白与天然产生的为变应原的蛋白的片段相同。

在一些实施方案中，该组合物或试剂盒包括变应原蛋白，例如来自病原体、食品、环境因子或刺激物的蛋白。在一些实施方案中，该组合物或试剂盒包括包含变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白，该变应原蛋白例如为来自病原体、食品、环境因子或刺激物的蛋白。类似地，在一些实施方案中，该组合物或试剂盒包括表达载体，其编码变应原蛋白，例如来自病原体、食品或刺激物的蛋白，在一些实施方案中，该组合物或试剂盒包括表达载体，其编码包含变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白，该变应原蛋白例如为来自病原体、食品、环境因子或刺激物的蛋白。

在一些实施方案中，由表达载体编码的变应原蛋白或包含变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白与包括在该组合物或试剂盒中的变应原蛋白或包含变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白相同。在一些实施方案中，由表达载体编码的变应原蛋白或包含变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白与包括在该组合物或试剂盒中的变应原蛋白或包含变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白不同。在一些实施方案中，包括在该组合物中的肽或蛋白为变应原蛋白。在一些实施方案中，包括在该组合物中的肽或蛋白为变应原蛋白的片段。在一些实施方案中，由表达载体编码的肽或蛋白为变应原蛋白。在一些实施方案中，由表达载体编码的肽或蛋白为变应原蛋白的片段。根据本发明，所述方法包括在个体暴露于该变应原蛋白之前给予足够量的该组合物来抑制针对该变应原蛋白的变态反应。

在一些实施方案中，本发明提供了跳蚤变应性皮炎的抑制剂。本发明的跳蚤变应性皮炎抑制剂包括含有跳蚤唾液变应原蛋白(例如猫唾液抗原1(FSA1或Cte f1)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的真核细胞表达载体，并联合跳蚤唾液变应原蛋白(例如猫唾液抗原1(FSA1或Cte f1))或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了猫变应性抑制剂。本发明的猫变应性抑制剂包括含有猫变应原蛋白(例如Fel d I)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的真核细胞表达载体，并联合猫变应原蛋白(例如Fel d I)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了犬变应性抑制剂。本发明的犬变应性抑制剂包括含有犬变应原蛋白(例如Can f1或Can f2)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的真核细胞表达载体，并联合犬变应原蛋白(例如Can f1或Can f2)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了尘螨变应性抑制剂。本发明的尘螨变应性抑制剂包括含有尘螨变应性变应原蛋白(例如Der P或Der F1)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的真核细胞表达载体，并联合螨变应原蛋白(例如Der P或Der F1)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了花生变应性抑制剂。本发明的花生变应性抑制剂包括含有花生变应性变应原蛋白(例如Ara HII或Ara H5)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的真核细胞表达载体，并联合花生变应性变应原蛋白(例如Ara HII或Ara H5)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了日本雪松变应性抑制剂。本发明的日本雪松变应性抑制剂包括含有日本雪松变应性变应原蛋白(例如Cry j 1.1或Cry j 1.2)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的真核细胞表达载体，并联合日本雪松变应性变应原蛋白(例如Cry j 1.1或Cry j 1.2)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了热带无爪螨变应性抑制剂。本发明的热带无爪螨变应性抑制剂包括含有热带无爪螨变应性变应原蛋白(例如Blo t5)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的真核细胞表达载体，并联合热带无爪螨变应性变应原蛋白(例如Blo t5)或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白。

该变应原蛋白可以在大肠杆菌(Escherichia coli)或真核细胞(例如，酵母或CHO细胞)中表达，例如，将分子克隆方法用于将变应原蛋白编码序列整合进对应的表达载体，引起蛋白产物通过大肠杆菌、酵母或CHO细胞系统被表达。类似地，可以设计包含变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白。编码这类肽或蛋白的核酸序列可被整合进表达载体并在宿主细胞中产生，在这里它们表达肽或蛋白，随后被纯化，或者肽可以被合成。或者，可以从天然来源纯化变应原蛋白。

包括在本发明组合物或试剂盒中的真核细胞表达载体可以为包括质粒表达载体、病毒表达载体或噬菌体表达载体的表达载体。质粒DNA和染色体DNA片段形成的表达载体和其它表达载体在遗传工程领域是公知的和常用的。在一些实施方案中，使用质粒载体pVAX1(Invitrogen)。在一些实施方案中，使用质粒载体provax，其具有CMV启动子、hCG引导物和牛生长激素poly A。在一些实施方案中，质粒载体为pcDNA3质粒(Invitrogen)，其包括人巨细胞病毒中早期(CMV)启动子、牛生长激素多聚腺苷酸信号(BGH polyA)、T7序列、ColEl复制起点、以及JE病毒信号序列。

在真核细胞表达载体中，变应原蛋白或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的编码序列可操作地连接到真核表达所需的调节序列。适合的启动子的实例包括RSV(Rous肉瘤病毒)启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子如CMV中早期启动子、SV40病毒启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)如HIV长末端重复(LTR)启动子、Moloney病毒、ALV、Epstein Barr病毒(EBV)、以及来自人基因的启动子，例如人肌动蛋白启动子、人肌球蛋白启动子、人血红蛋白启动子、人肌肉肌酸启动子和人金属硫蛋白启动子。可用于实施本发明的多聚腺苷酸信号的实例包括但不限于SV40多聚腺苷酸信号和LTR多聚腺苷酸信号。除了DNA表达所需的调节元件外，其它的元件也可以包括在DNA分子中。这些另外的元件包括增强子。增强子可以选自但不限于：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强子如来自CMV、RSV和EBV的那些。

在一些实施方案中，真核细胞表达载体与变应原蛋白或包含这种变应原蛋白的抗原表位的肽或蛋白的比例为1:5-5:1；优选为1:1(摩尔比为1-20:100,000；优选的摩尔比例为15:100,000)。

在一些实施方案中，将抑制剂组合物或试剂盒组分的组合通过注射、雾化器/气雾剂/喷雾、滴鼻剂、滴眼剂、口服、舌下、口腔、阴道、渗透、吸收、物理或化学手段经肌内、皮内(intracutaneously)/皮内(intradermally)、透皮、皮下、静脉内和经过粘膜组织给予生物体；或者其可以通过其它物理混合或包装而给予生物体。试剂盒组分不必一起输送；它们无需在相同位点输送，也无需通过相同给药途径输送。

可以通过各种手段引入药物组合物，例如针注射、无针注射器、基因枪、电穿孔、以及微粒轰击。

本领域普通技术人员可以配制组合物和试剂盒组分，所选择的组合物取决于所选的给药模式。适合的药物载体在最新版的本领域标准参考文献Remington’s Pharmaceutical Sciences，A.Osol中有描述。

对于胃肠外给药，可以将制剂作为与药物可接收的胃肠外载体结合的溶液、混悬液、乳液或冻干粉提供。这些载体的实例为水、盐水、葡萄糖溶液。也可以使用脂质体和非水载体如不挥发油。载体或冻干粉可以含有维持等渗性(例如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如缓冲剂和防腐剂)的添加剂。通过常用技术将该制剂灭菌。可注射组合物可以是无菌和物热源的。

给药剂量随一些因素变化，例如：药物动力学特征；其给药模式和途径；接受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度；同步治疗的类型；以及治疗频率。在一些实施方案中，所用的组合物的量或试剂盒组分组合的量通常是每次给药1250ug/kg体重；每1至30天以组合物或试剂盒组分给药一次，优选每7-14天一次。在一些实施方案中，以单一剂量给药。在一些实施方案中，以多剂量给药。在一些实施方案中，总共给药2-3次。

在一些实施方案中，向患有变态反应的个体给予所述组合物或试剂盒。在一些实施方案中，向这样的个体给予所述组合物或试剂盒，该个体不患有变态反应但已经暴露于变应原或很可能已经暴露于变应原。在一些实施方案中，向这样的个体给予所述组合物或试剂盒，该个体不患有变态反应但已知对变应原敏感，即其之前有过对变应原的变态反应。

本发明的方法可用于人和兽医药领域。相应地，本发明涉及治疗和防止哺乳动物、鸟类和鱼中的变态反应。本发明的方法可尤其用于包括人、牛、绵阳、猪、马、犬和猫物种在内的哺乳动物物种。

以下给出的实施例包括本发明各方面的代表性实例。这些实施例不意味着限制本发明的范围，而是用于说明目的。此外，本发明的各方面可通过以下的说明总结。但是，这种说明不意味着限制本发明的范围，而是强调本发明的各个方面。本领域普通技术人员可容易地了解本发明的其它方面和实施方案。

实施例

实施例1：跳蚤唾液变应原肽的多肽合成和构建表达该肽的真核细胞表达载体

所述的跳蚤唾液变应原蛋白(FSA)具有如SEQ ID NO：2中所描述的氨基酸残基序列。

所合成的包含SEQ ID NO：22中所述氨基酸残基的多肽称为pep66。所合成的包含SEQ ID NO：23中所述氨基酸的多肽称为pep100。

编码pep66的核苷酸序列具有SEQ ID NO 24中所描述的核苷酸序列，并称为FAD66。

编码pep100的核苷酸序列具有SEQ ID NO 25中所描述的核苷酸序列，并称为FAD100。

编码pep66和pep100的真核载体包含至少一个SEQ ID NO 24或SEQ ID NO：25中所描述的核苷酸序列，并分别称为pcDF66或pcDF100。

从Greer Laboratory Company(Lenoir，North Carolina，United States)购得跳蚤唾液变应原蛋白，并通过Lee，et al.，Parasite Immunology19：13-19，1997中所描述的系统跳蚤培养方法制备。在一个成体年末期，从感染动物的分离的唾液腺得到雌性跳蚤。将唾液腺细胞悬浮在SDS-还原缓冲液中并在振荡器中搅动30秒。将细胞研碎，将粗蛋白保存在-20℃。

包含编码FSA表位pep66和pep 100的核苷酸序列的所述真核细胞表达载体分别称为pcDF66或pcDF100。

1.合成FSA多肽pep66、pep 100，以及它们的编码基因

我们采用Epitlot软件验证了FSA的MHC II类表位和化学合成的肽pep66和pep100的氨基酸序列。新合成的基因和蛋白产物的序列如下：

肽66-80：QEKEKCMKFCKKVCK(SEQ ID NO：22)，称为pep66；

肽100-114：GPDWKVSKECKDPNN(SEQ ID NO：23)，称为pep100。

编码pep66和pep100的核苷酸序列分别称为FAD66和FAD100。这些核苷酸序列包括以下序列：

FAD66：CAAGAGAAAG AAAAATGTAT GAAATTTTGCAAAAAAGTTT GCAAA(SEQ ID NO：24)，

FAD 100：GGTCCTGATT GGAAAGTAAG CAAAGAATGCAAAGATCCCA ATAAC(SEQ ID NO：25)。

2.构建FAD66和FAD100表达载体

将表达载体pGFP(Clontech，Mountain View，CA，U.S.A)作为模板购得。我们进行了FSA核苷酸序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增，以便用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记该FSA核苷酸序列。通过使用P66F和PR引物以及P100F和PR引物完成该引物延伸。用在克隆方法中的引物序列如下：P66F：5’-AAGCTTGCCA TGCAAGAGAA AGAAAAATGTATGAAATTTT GCAAAAAAGT TTGCAAAGGTACC GCCATGGTGAGCAAGGG CGAGGA-3’(SEQ ID NO：26)(所述序列中从扩增产物的5’末端起第13至57位碱基为FAD66；从扩增产物的5’末端起第58位-63位碱基为Kpn 1识别位点；从扩增产物的5’末端起的第一至第六碱性核苷酸为Hind III识别位点)；PR：5’-TTA GGTACCTTACTTGTAC AGCTCGTCCAT-3’(SEQ ID NO：27)(所述序列中从扩增产物的5’末端起的第4-9位碱基为Kpn I识别位点)，P100F：5’-AAGCTTGCCA TG GGTCCTGA TTGGAAAGTA AGCAAAGAATGCAAAGATCC CAATAACGGT ACCGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’(SEQ ID NO：28)(所述序列中从扩增产物的5’末端起的第13至57位碱基为FAD66；从扩增产物的5’末端起的第58位-63位碱基为Kpn I识别位点；所述序列中从扩增产物的5’末端起的第1位-6位的碱基为Hind III识别位点)，PR：5’-TTAGGTACCTTAC TTGTAC AGCTCGTCCAT-3’(SEQ ID NO：27)(从扩增产物的5’末端起的第4位-9位的碱基为Kpn I识别位点)。采用BamHX和Hind III消化PCR产物和真核表达载体pcDNA3(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，U.S.A.)。采用T4 DNA连接酶将扩增产物连接进质粒，随后转化进Escherichia coli Top 10。E.coli在培养箱中生长后，提取质粒DNA并采用Kpn I进行限制性消化来获得阳性克隆。阳性克隆包括含有FAD66和GFP基因的质粒pcDF66-GFP，和含有FAD 100和GFP基因的质粒pcDF100-GFP。在用pn I消化pcDF66-GFP和pcDF100-GFP后，将低熔点琼脂糖凝胶电泳用于回收大片段，然后进行自身结合。最后，将产物转化进Escherichia coli Top 10，提取质粒，将限制性内切酶Kpn/消化测定用于获得阳性克隆。所获得的克隆包括FAD66表达载体pcDF66和FAD 100表达载体pcDF100。

在5％ CO₂和37℃下，将正常猿肾细胞(CV1细胞)(从上海细胞生物学研究所购得)培养在含有10％胎牛血清的DMEM中。在35mm培养皿中在CV1细胞上进行pcDF66-GFP和pcDF100-GFP的转染，2.5 x 10⁵细胞/ml，每培养皿2ml。根据“分子克隆实验指南”(第三版)(中译文)(黄培堂等人翻译，科学出版社，2002年9月出版)中所描述的方法进行质粒的纯化。阳离子脂质体介质(Lipofectamine^TM 2000，Invitrogen)被用于转染，并根据制造商的说明(Invitrogen，CA，USA)培养CV1细胞。在孵育24后，在荧光显微镜下观察细胞培养物，显示在真核细胞中表达了pcDF100-GFP和pcDF66-GFP。结果证实pcDF100-GFP和pcDF66-GFP也可以在真核细胞中表达。

实施例2.跳蚤变应性皮炎抑制剂作为跳蚤变应性皮炎的治疗剂

在昆明白、BALB/c和C57BL/6小鼠经包含FSA蛋白的载体和编码FSA蛋白的核苷酸序列或其蛋白免疫的实验中证实，免疫是跳蚤变应性皮炎的有效疗法。可用于免疫的载体可包括真核细胞表达载体，该真核细胞表达载体进一步包括编码FSA蛋白(例如pcDF66或pcDF100)的核苷酸序列，以及FSA合成肽(pep66或pep100)或FSA蛋白(跳蚤唾液变应原蛋白)。该免疫效果好于仅包括真核细胞表达载体(包括编码FSA肽或FSA蛋白的核苷酸序列)的免疫载体。已知研究证实，编码不同表位的DNA序列具有不同的效果。例如，FAD 100似乎在抑制跳蚤变应性皮炎方面具有更强的治疗效果。每个谱系小鼠中的结果类似，说明该免疫的免疫抑制活性不限于MHC遗传背景。因此，我们可从以上结果直接得出结论，通过使用包含真核细胞表达载体以及FSA蛋白或FSA肽的FAD抑制剂，有可能有效抑制跳蚤变应性皮炎，其中该真核细胞表达载体进一步包含编码FSA蛋白的核苷酸序列。

T细胞增殖实验和相关的细胞因子扩增实验证实，包括编码FSA蛋白的真核细胞表达载体和FSA蛋白或FSA肽的FAD抑制剂抑制了抗原特异的T细胞增殖，由此抑制了变态反应。可以通过IL-10诱导免疫抑制，由此抑制IL-5、IL-13和其它细胞因子表达水平。本发明中的FAD抑制剂可以有效预防和/或治疗跳蚤变应性皮炎，尤其是由Ctenocephalides felis引起的皮炎。

1.昆明白小鼠实验.

将三百六十(360)只雌性昆明白小鼠分成相等数量的总共12组。第一组中的每只小鼠用含有100微克pcDF66的100微升0.9％ NaCl水溶液免疫。第二组中的每只小鼠用含有100微克pep66的100微升0.9％NaCl水溶液免疫。第三组中的每只小鼠用含有50微克pcDF66和50微克pep66的100微升0.9％ NaCl水溶液免疫。第四组中的每只小鼠用含有100微克pcDF100的100微升0.9％ NaCl水溶液免疫。第五组中的每只小鼠用含有100微克pep100的100微升0.9％ NaCl水溶液免疫。第六组中的每只小鼠用含有50微克pcDF100和50微克pep 100的100微升0.9％ NaCl水溶液免疫。第七组中的每只小鼠用含有50微克pcDF66和50微克pep100的100微升0.9％ NaCl水溶液免疫。第八组中的每只小鼠用含有50微克pcDF100和50微克pep66的100微升0.9％ NaCl水溶液免疫。第九组中的每只小鼠用含有100微克灭活跳蚤抗原(购自Greer Lab Company，North Carolina，United States)的100微升0.9％ NaCl水溶液免疫。第十组中的每只小鼠用含有50微克灭活跳蚤抗原(购自Greer Lab Company，North Carolina，United States)和50微克pcDF66的100微升0.9％ NaCl水溶液免疫。第十一组中的每只小鼠用含有50微克灭活跳蚤抗原(购自Greer Lab Company，North Carolina，United States)和50微克pcDF100的100微升0.9％N aCl水溶液免疫。第十二组中的每只小鼠用含有100微克pcDNA3的100微升0.9％ NaCl水溶液免疫，作为对照。在首次免疫后14天，以相同剂量进行加强免疫。在加强免疫后7天，采用以下方法进行皮肤测试。

从腹侧鼠胸腔去毛，向10个个体皮内注射30μl的1μg/μl FSA蛋白。同时，注射等量的组胺溶液(0.01％组胺浓度)和PBS，用作阳性对照和阴性对照。每个对照组10个个体。每个注射后20分钟时，我们测量了水疱直径，以微米表示。t检验结果表明，与pcDF100单一免疫(第四组)或pep100单一免疫(第五组)相比，pcDF100和pep 100化合物免疫(第六组)表现出明显差异(P<0.05)。pcDF66和pep66化合物免疫(第三组)与pcDF66单一免疫(第一组)之间有明显差异(P<0.05)，而与pep66单一免疫(第二组)无明显差异。跳蚤抗原和pcDF66(第十组)或pcDF100(第十一组)化合物免疫与单独跳蚤抗原(第九组)产生的结果无明显差异(P<0.05)。第十和十一组与pcDF66(第一组)或pcDF100(第四组)免疫相比未显示任何明显差异。与表达载体或表位多肽单一免疫组(第1、2、3和4组)相比，第六和第七组中测量的水疱直径无差异。

基于以上皮肤测试结果，我们可推断，包含FSA蛋白的真核细胞表达载体或编码FSA肽的核苷酸序列和所述FSA肽，或者包含FSA蛋白的真核细胞表达载体或编码FSA肽的核苷酸序列和FSA蛋白以抗原特异方式减小皮肤变应性。这些结果表明，减小皮肤上的变态反应可以通过免疫抑制诱导。

2.BALB/c和C57B/6小鼠测试结果

为了进一步确认以上以昆明白小鼠获得的结果，测试了两纯系小鼠(BALB/c和C57B/6)来确定FAD的免疫抑制是否是MHC限制的。实验方法与在昆明白小鼠中采用的方法相同。t检验结果表明，pcDF100和pep100免疫(第六组)与pcDF100单一免疫(第四组)或pep100单一免疫(第五组)相比无明显差异(P<0.05)。来自跳蚤抗原和pcDF100化合物免疫(第十一组)的结果与通过跳蚤抗原(第九组)或pcDF100(第四组)免疫产生的结果相比，显示了非常显著的差异(P<0.01)。跳蚤抗原和pcDF66免疫(第十组)、单独跳蚤抗原免疫(第九组)、或单独pcDF66免疫(第一组)之间没有显著差异。pcDF100和pep66免疫(第八组)、单独pcDF100免疫(第四组)、或单独pep66免疫(第二组)之间没有显著差异。

以上结果表明，抗变应性免疫抑制为抗原特异的。例如用pcDF100和pep100免疫比pcDF100或pep100单独免疫更有效。用跳蚤抗原和pcDF100免疫比任何仅包括一种组分的免疫载体更有效。

在经FAD有效处理的那些组之间也存在免疫抑制水平的差异。例如，跳蚤抗原和pcDF100化合物免疫组与任何单一免疫组相比具有更有效的免疫抑制效果。t检验结果表明，与采用单独pcDF100(第四组)或单独pep100(第五组)免疫的结果相比，pcDF100和pep100化合物免疫(第六组)有显著差异(P<0.05)。用pcDF100和pep66化合物免疫(第八组)进行的免疫的免疫抑制效果与单独pcDF100(第四组)或单独pep66(第二组)的相比有显著差异(P<0.05)。采用跳蚤抗原和pcDF100(第十一组)免疫与单独跳蚤抗原(第九组)或单独pcDF100(第四组)相比有极其显著的差异(P<0.01)。

我们从我们的结果推断，抗变应性免疫抑制为抗原特异的。例如，pcDF100和pep100化合物免疫组与pcDF100单一免疫组或pep100单一免疫组相比，免疫是更有效的。此外，pep66和pep100肽可以具有交叉反应性。例如，pcDF100和pep66免疫与pcDF100单一免疫组或pep66单一免疫组相比，免疫更有效。采用跳蚤抗原和pcDF66化合物免疫的免疫没有产生明显的免疫抑制。这些结果与在BALB/c组中获得的结果一致。尽管在所研究的各个品系小鼠中在免疫有效性方面有微小差异，这三个不同品系小鼠的实验结果的相同结论：包含真核细胞表达载体(进一步包含FSA蛋白)的免疫载体或编码FSA肽的核苷酸序列和FSA肽；或者包含FSA蛋白的真核细胞表达载体或编码FSA肽的核苷酸序列和FSA蛋白可以引起有效的抗变应性免疫抑制。

实施例3.经免疫小鼠中T细胞增殖

将三百六十(360)BALB/c小鼠和三百六十C57B/6小鼠各分为12组，每组30只小鼠。按照实施例2中所描述的方法进行免疫。在加强免疫后的第7天，分离肾细胞并测试T细胞扩增活性。具体方法是：在无菌条件下，从小鼠取出肾细胞，用于形成单细胞悬液。将溶血溶液用于除去红血细胞，接着采用PBS液洗涤三次。离心细胞并进行细胞计数。细胞浓度调整至1 x 10⁶细胞/ml，将来自每只动物的每种细胞悬液分为四个实验组并接种至96孔培养板。向一个组中加入100μl Con-A(有丝分裂原)，终浓度5μg/ml。向第二组加入特定抗原(跳蚤)用作刺激物，终浓度为5μg/ml。不加入刺激物，用作阴性对照组，以及加入100μl BSA用作另一无关抗原，终浓度为2μg/ml。37℃下在CO₂培养中孵育48小时后，向每孔加入100μl MTS，终浓度为5mg/ml。孵育4小时后，将酶标仪用于读取492nm处的OD值，并计算刺激指数(SI＝测试OD÷非刺激OD)。BALB/c小鼠的T细胞增殖结果表明，包含编码FSA肽跳蚤唾液的核苷酸序列的真核细胞表达载体和所述FSA肽产生明显的FAD的抗原特异性免疫抑制。例如，包含pcDF100的载体和pep100(第六组)和包含跳蚤抗原的载体和pcDF100(第十一组)与用包含单一组分的载体免疫相比，免疫更为有效。此外，包含pcDF66和pep66的免疫介质组(第三组)、包含跳蚤抗原和pcDF66的免疫介质组(第十组)与对应的单一免疫组相比，证实了没有明显的免疫抑制。采用包含pcDF100和pep100化合物的介质的免疫组和采用包含跳蚤抗原和pcDF100化合物的介质的免疫组的结果与通过皮肤测试显示的免疫抑制结果一致。包含pcDF100和pep66的免疫介质(第八组)与对应的单一免疫组中看到的免疫抑制效果相比，在免疫抑制效果方面有极其显著差异(P<0.01)。

C57B/6 T细胞增殖结果说明，含有编码FSA肽的核苷酸序列的真核细胞表达载体和所述FSA肽可以产生明显的抗原特异性免疫抑制。例如，与对应的单一免疫组(第一和第二组)相比，pcDF66和pep66化合物免疫(第三组)的免疫效果有明显差异(P<0.05)。此外，pcDF100和pep100化合物免疫组(第六组)与对应的单一免疫组(第四组和第五组)相比，免疫效果有极其显著差异(P<0.01)。采用包含跳蚤抗原和pcDF66的介质(第十组)免疫小鼠明显比对应的单一免疫组(第九组和第一组)明显更有效(P<0.05)。跳蚤抗原和pcDF100化合物免疫组(第十一组)与对应的单一免疫组(第九组和第四组)相比，免疫效果有极其显著差异(P<0.01)。此外，该两表位之间存在交叉反应性。例如，pcDF66和pep100化合物免疫组(第七组)和相应的单一免疫组(第一组和第五组)中的T细胞增殖情况有明显差异(P<0.05)。pcDF100和pep66化合物免疫组(第八组)和相应的单一免疫组(第四组和第二组)中的T细胞增殖情况有明显差异(P<0.05)。pcDF100和pep100化合物免疫组、pcDF100和pep66化合物免疫组以及跳蚤抗原和pcDF100化合物免疫组中的T细胞增殖情况结果都与皮肤测试结果一致。

实施例4.经免疫小鼠的细胞因子水平变化

将360昆明白小鼠、360 BALB/c小鼠和360 C57B/6小鼠每个品系组的个体分为12组，每组30只小鼠。按照实施例2中描述的方法进行免疫。加强免疫后第7天时，切下脾，并分离总RNA(TRIZOL，DingguoBiological Company)。根据Dalianbao Biological Company的RNART-PCR操作手册进行逆转录以获得cDNA。简言之，将1μg纯化的总RNA置于250μL离心管中。接着顺序加入以下试剂：4μl MgCl₂、2μl 10×缓冲液、8.5μl DEPC水、2μl dNTP混合物、0.5μl RNase抑制剂、0.5μl M-MLV逆转录酶(Promega)、0.5μL寡(dT)₁₂引物。反应条件为42℃ 30min、99℃ 5min和5℃ 5分钟。基因家族次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)被用作内源表达标准品。调整各组的cDNA浓度，使所有的样品浓度一致。然后，将2μl的cDNA用于进行PCR扩增，评估三种细胞因子基因的表达水平：IFN-γ、IL-4，和IL-10。该反应所需的引物和PCR反应条件如表1中所示。(因为基因家族HPRT在体内具有固定的表达，其被用作对照的内源表达标准品的模板)。

表1.HPRT、IFN-γ、IL-4和IL-10引物序列和PCR反应规范

靶基因	引物	反应条件
靶基因	引物	反应条件	HPRT	5’GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG(SEQ ID NO：29)3’GAGGGTAGGCTGGCCTATGGCT(SEQ ID NO：30)	94℃ 30sec、60℃ 30sec和72℃ 40sec
IFN-γ	5’CATTGAAAGCCTAGAAAGTCTG(SEQ ID NO：31)3’CTCATGGAATGCATCCTTTTTCG(SEQ ID NO：32)	94℃ 30sec、58℃ 30sec和72℃ 40sec	HPRT		94℃ 30sec、60℃ 30sec和72℃ 40sec
IFN-γ		94℃ 30sec、58℃ 30sec和72℃ 40sec	IL-4	5’GAAAGAGACCTTGACACAGCTG(SEQ ID NO：33)3’GAACTCTTGCAGGTAATCCAGG(SEQ ID NO：34)	94℃ 30sec、54℃ 30sec和72℃ 40sec
IL-10	5’CCAGTTTACCTGGTAGAAGTGATG(SEQ ID NO：35)3’TGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA(SEQ ID NO：36)	94℃ 30sec、56℃ 30sec和72℃ 40sec	IL-4		94℃ 30sec、54℃ 30sec和72℃ 40sec

将Bio-Rad成像软件(Quantity One 4.2.0)用于分析从PCR产物的电泳凝胶获得的图像。所获得的表达谱结果大体上与每个品系小鼠一致。pcDF66和pep66化合物免疫(第3组)中的IL-10表达水平比pcDF66单一免疫(第1组)和pep66单一免疫(第2组)中的高。pcDF100和pep100化合物免疫(第6组)中的IL-10表达水平比pcDF100单一免疫组(第4组)或pep100单一免疫组(第5组)中的高。跳蚤抗原和pcDF66化合物免疫组(第10组)中的IL-10表达水平比跳蚤抗原(第9组)或pcDF66单一免疫组(第1组)中的高。跳蚤抗原和pcDF66化合物免疫组(第11组)中的IL-10表达水平比跳蚤抗原(第9组)或pcDF100单一免疫组(第4组)中的高。各个组之间IL-4和IFN-γ表达水平没有明显差异。这些结果提示，用包含编码FSA的核苷酸序列的真核细胞表达载体和所述FSA蛋白或所述FSA肽化合物进行的免疫增强了IL-10表达水平。

此外，在三种类型的小鼠中就IL-5和IL-13生成了表达谱。结果表明，对于包含编码FSA肽的核苷酸序列的真核细胞表达载体和所述FSA蛋白或肽(第3组、第6组、第10组和第11组)，IL-5和IL-13水平明显低于各个单一免疫组的水平。

实施例5.检测经免疫小鼠中的血液IgE水平

将两组360只BALB/c和360只C57B/6小鼠各自分为12组，每组12只小鼠，并采用实施例2中描述的方法进行免疫。在免疫之前和加强免疫后14天时从眼窝静脉内取血。通过离心分离血液，采用ELISA测定IgE水平。用在ELISA板上的包被抗原为购自Greer Laboratory(Lenoir，North Carolina，United States)的跳蚤抗原。ELISA板上的第一组分为分离的血清，用于结合的第二组分为标记了辣根过氧化物酶抗氧化物酶的山羊抗小鼠IgE抗体。在抗体结合了抗原后将底物加入到系统，并将酶标仪用于读取492nm处的OD值。免疫后昆明白小鼠、BALB/c小鼠、C57B/6小鼠中的IgE产生对于所有三组小鼠来说大体一致。除了跳蚤抗原单一免疫组(第九组)之外，每组的IgE水平相对较低。在跳蚤抗原单一免疫组(第九组)免疫后产生的IgE水平在所有小鼠组中是最高水平。与跳蚤抗原单一免疫组(第九组)相比，IgE水平在跳蚤抗原和pcDF66免疫的组(第十组)以及跳蚤抗原和pcDF100疫免疫的组(第11组)中显著降低。这表明，包含编码FSA肽的核苷酸序列的真核细胞表达载体和所述FSA蛋白在免疫后降低了IgE水平。

实施例6.猫变应原蛋白抗原Fel d I.1(具有小B引导物的Fel d I)编码的遗传克隆和真核细胞表达测定

1.以下序列被用作Fel d I.1引物。引物是人工合成的：

(a)Fel d I.1 P1 5’引物：AAGCTTGGATGTTAGACGC(SEQ ID NO37)

(b)Fel d I.1 P2 3’引物：GGTACCTTAACACAGAGGAC(SEQ ID NO38)

2.Fel d I.1表达载体构建

Fel d I.1 cDNA被用作采用Fel d I.1 P1和Fel d I.1 P2的PCR扩增Feld I.1基因的模板。对引物进一步描述如下：

(a)Fel d I.1 P1 5’-AAGCTTGGATGTTAGACGC-3’(SEQ ID NO37)(该序列中从引物5’末端起的第1位-第6位碱基为Hind III识别序列；第9位-第11位为原始的起始密码子)；

(b)Fel d I.1 P2 5’-GGTACCTTAACACAGAGGAC-3’(SEQ ID NO38)(该序列中从5’末端起的第1位-第6位碱基为Kpn I识别位点；第7位-第9位为原始的终止密码子)。

Kpn I和Hind III分别用于消化PCR产物和真核表达载体pVAX1(Invitrogen Corp.)。接着采用T4DNA连接酶连接消化的核苷酸片段。将所得到的质粒产物转化进Escherichia colt Top 10，生长至最大拷贝数，然后采用本领域普通技术人员已知的方法分离质粒。我们采用Kpn I和Hind III内切酶进行限制性消化。所选择的质粒克隆称为pVAX1-Fel d I.1，包括pVax质粒序列和Fel d I.1基因。通过序列分析(Augct Co.Ltd.，Beijing China)，进行进一步的分析以获得最终的Fel dI.1 P1表达载体，pFel d I.1。

3.pFeld I.1真核表达

在5％ CO₂和37℃条件下，在含有10％胎牛血清的DMEM中培养正常猿肾细胞(CV1细胞，购自上海细胞研究所)。用移液管转移2.5 x 10⁵细胞/ml 2mL体积至35mm培养皿。采用标准方法进行转染。简言之，根据“分子克隆实验指南”(第三版，中译文)(黄培堂等人翻译，科学出版社，2002年9月出版)中所描述的方法进行质粒的纯化。根据制造商的说明(Invitrogen，CA，USA)，将阳离子脂质体介质(Lipofectamine^TM2000，Invitrogen)用于转染所培养的CV1细胞。转染24小时后，收集细胞，并将RNA提取试剂(TRIZOL，Dingguo Biological Company)用于分离总细胞RNA。为了防止污染，提取的总RNA分别装入几个EP管。将微量移液器用于小心吸取2μl提取的总RNA，并用RT-PCR试剂扩增总细胞cDNA。添加样品后，进行逆转录，在42℃进行逆转录30-60分钟，在99℃变性5分钟。在取出使用前，将反应管在5℃放置5分钟。采用Fel d I.1 P1和Fel d I.1P2作为引物，将分离的cDNA用作模板用于基因扩增PCR。将PCR产物用于低熔点琼脂糖凝胶分析来检测Fel d I.1阳性带。结果证明Fel d I.1在真核细胞中被表达。

实施例7.猫变应原蛋白抗原Fel d I.2遗传克隆和真核细胞表达测定

1.以下的序列被用作Fel d I.2引物。引物是人工合成的：

(a)Fel d I.2 P1 5’引物：AAGCTTGGATGAAGGGGGCTC(SEQ IDNO：39)

(b)Fel d I.2 P2 3’引物：GGTACCTTAACACAGAGGAC(SEQ IDNO：40)

2.Fel d I.2表达载体构建

Fel d I.2cDNA被用作采用Fel d I.2P1和Fel d I.2 P2引物的PCR扩增的模板，以产生多个拷贝的Fel d I.2基因。该引物进一步描述如下：(a)Fel d I.2 P1 5’-AAGCTTGGATGAAGGGGGCTC-3’(SEQ ID NO：39)(从引物5’末端起的第1位-第6位碱基为Hind III识别位点；从引物的该末端起的第9位-第11位为原始的起始密码子)；(b)Fel d I.2 P2 5’-GGTACCTTAACACAGAGGAC-3’(SEQ ID NO：40)(从引物5’末端起的第1位-第6位碱基为Kpn I识别位点，从引物的该末端起的第7位-第9位为原始的终止密码子)。

Kpn I和Hind III相继用于消化PCR产物和真核表达载体pVAX1(Invitrogen Corp.)。采用T4 DNA连接酶连接消化的质粒和PCR产物。将产物转化进Escherichia coli Top 10，提取质粒，采用限制性内切酶Kpn I和Hind III消化测定以获得阳性克隆，即含有Can f 1基因的质粒pVAX1-Fel d I.2。通过序列分析(Augct Co.Ltd.，Beijing China)，进行进一步的测定校正以获得Fel d I.2表达载体，pFel d I.2。

3.pFel d I.2真核表达

如之前实施例6第3部分中所描述的方法，让pFel d I.2表达载体消化、转化、分离和连接。分离的PCR产物接受低熔点琼脂糖凝胶测试以证实Fel d I.2阳性带。该结果证实Fel d I.2在真核细胞中被表达。

实施例8.犬变应原蛋白抗原Can f 1遗传克隆和真核细胞表达测定

1.Can f 1引物合成

以下的引物被用作Can f 1引物。引物是人工合成的：

Can f 1 P1 5’引物：AAGCTTATGAAGACCCTGCTCCTCAC(SEQID NO：41)

Can f 1 P2 3’引物：GGTACCCTACTGTCCTCCTGGAGAGC(SEQID NO：42)

2.Can f 1表达载体构建

Can f 1 cDNA被用作采用Can f 1 P1和Can f 1 P2引物进行PCR扩增的模板，用于产生多拷贝的Can f 1基因。对引物进一步说明如下：(a)Can f 1 P1 5’-AAGCTTATGAAGACCCTGCTCCTCAC-3’(SEQ IDNO：41)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Hind III识别位点；从引物的该末端起的第7位-第9位为原始的起始密码子)；(b)Can f 1 P25’-GGTACCCTACTGTCCTCCTGGAGAGC-3’(SEQ ID NO：42)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Kpn I识别位点，从该序列的5’末端起的第7位-第9位为原始的终止密码子)。

如实施例7第2部分中所述的方法，让PCR片段和pVAX1(Invitrogen，Inc.)消化、转化、分离和连接。选择阳性克隆，并采用实施例7第2部分中所讨论的序列分析进行分析以获得Can f 1表达载体，pCanf1。

3.pCanf1真核表达

如实施例6第3部分所述，让pCanf1表达载体经历转染、总RNA分离和PCR。使分离的PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶测试，以证实pCanf1阳性带。结果证明pCanf1在真核细胞中被表达。

实施例9.犬变应原蛋白抗原Can f 2遗传克隆和真核细胞表达测定

1.Can f 2引物合成

以下的引物被用作Can f 2引物。引物是人工合成的：

Can f2 P1 5’引物：AAGCTT ATGCAGCTCCTACTGCTG(SEQ IDNO：43)

Can f2 P2 3’引物：GGTACCCTAGTCTCTGGAACCC(SEQ ID NO：44)

2.Can f 2表达载体构建

Can f 2 cDNA被用作采用Can f 2 P1和Can f 2P2引物进行PCR扩增的模板，用于产生多拷贝的Can f 2基因。对引物进一步说明如下：Can f 2 PI5’-AAGCTT ATGCAGCTCCTACTGCTG-3’(SEQ ID NO：43)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Hind III识别位点；第7位-第9位为原始的起始密码子)；(b)Can f 2 P2 5’GGTACCCTAGTCTCTGGAACCC-3’(SEQ ID NO：44)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Kpn I识别位点，第7位-第9位为原始的终止密码子)。

如实施例7第2部分中所述的方法，让PCR片段和pVAX1(Invitrogen，Inc.)消化、转化、分离和连接。选择阳性克隆，并采用实施例7第2部分中所讨论的序列分析进行分析以获得Can f 2表达载体，pCanf2。

3.pCanf2真核表达

如实施例6第3部分所述，让pCanf2表达载体经历转染、总RNA分离和RT-PCR。使分离的PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶测试，以证实pCanf2阳性带。结果证明pCanf2在真核细胞中被表达。

实施例10.尘螨变应原蛋白抗原Der p 1遗传克隆和真核细胞表达测定

1.Der p 1引物合成

以下的引物被用作Der p 1引物。引物是人工合成的：

Der p 1 P1 5’引物：AAGCTTAACATGAAAATTGTTTTGG(SEQ IDNO：45)

Der p 1 P2 3’引物：GGTACCGTTTAGAGAATGACAACAT(SEQ IDNO：46)

2.Der p 1表达载体构建

Der p 1 cDNA被用作采用Der p 1 P1和Der p 1 P2引物进行PCR扩增的模板，用于产生多拷贝的Der p 1基因。对引物进一步说明如下：

(a)Der p 1 P1 5’-AAGCTTAACATGAAAATTGGTTTTGG-3’(SEQ IDNO：45)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Hind III识别位点，第10位-第12位为原始的起始密码子)；

(b)Der p 1 P2 5’-GGTACCCTACTGTCCTCCTGGAGAGC-3’(SEQ ID NO：42)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Kpn I识别位点，第9位-第11位为原始的终止密码子)。

如实施例7第2部分中所述的方法，让PCR片段和pVAX1(Invitrogen，Inc.)消化、转化、分离和连接。选择阳性克隆，并采用实施例7第2部分中所讨论的序列分析进行分析以获得Der p 1表达载体，pDerp1。

3.pDerp1真核表达

如实施例6第3部分所述，让pDerp1表达载体经历转染、总RNA分离和RT-PCR。使分离的PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶测试，以证实pDerp1阳性带。结果证明pDerp1在真核细胞中被表达。

实施例11.花生变应原蛋白抗原Ara h II遗传克隆和真核细胞表达测定

1.Ara h II引物合成

以下的引物被用作Ara h II引物。引物是人工合成的：

Ara h II P1 5’引物：AAGCTTCTCATGCAGAAGAT(SEQ ID NO：47)

Ara h II P2 3’引物：GGTACCTTAGTAT CTGTCTC(SEQ ID NO：48)

2.Ara h II表达载体构建

Ara h II cDNA被用作采用Ara h II P1和Ara h II P2引物进行PCR扩增的模板，用于产生多拷贝的Ara h II基因。对引物进一步说明如下：(a)Ara h II P1 5’-AAGCTTCTCATGCAGAAGAT-3’(SEQ ID NO：47)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Hind III识别位点，第10位-第12位为原始的起始密码子)；(b)Ara h II P2 5’-GGTACCTTAGTATCTGTCTC-3’(SEQ ID NO：48)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Kpn I识别位点，从引物序列5’末端起的第9位-第11位为原始的终止密码子)。

如实施例7第2部分中所述的方法，让PCR片段和pVAX1(Invitrogen，Inc.)消化、转化、分离和连接。选择阳性克隆，并采用实施例7第2部分中所讨论的序列分析进行分析以获得Ara h II表达载体，pArahII。

3.pArahII真核表达

如实施例6第3部分所述，让pArahII表达载体经历转染、总RNA分离和RT-PCR。使分离的PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶测试，以证实pArahII阳性带。结果证明pArahII在真核细胞中被表达。

实施例12.花生变应原蛋白抗原Ara h 5遗传克隆和真核细胞表达测定

1.Ara h 5引物合成

以下的引物被用作Ara h 5引物。引物是人工合成的：

Ara h 5 P1 5’引物：AAGCTTATGTCGTGGCAAAC(SEQ ID NO：49)

Ara h 5 P2 3’引物：GGTACCTAAAGACCCGTATC(SEQ ID NO：50)

2.Ara h 5表达载体构建

Ara h 5 cDNA被用作采用Ara h 5 P1和Ara h 5 P2引物进行PCR扩增的模板，用于产生多拷贝的Ara h5基因。对引物进一步说明如下：(a)Ara h 5 P1 5’-AAGCTTATGTCGTGGCAAAC-3’(SEQ ID NO：49)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Hind III识别位点，第7位-第9位为原始的起始密码子)；(b)Ara h 5 P2 5’-GGTACCTAAAGACCCGTATC-3’(SEQ ID NO：50)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Kpn I识别位点，从引物序列5’末端起的第7位-第9位为原始的终止密码子)。

如实施例7第2部分中所述的方法，让PCR片段和pVAX1(Invitrogen，Inc.)消化、转化、分离和连接。选择阳性克隆，并采用实施例7第2部分中所讨论的序列分析进行分析以获得Ara h 5表达载体，pArah5。

3.pArah5真核表达

如实施例6第3部分所述，让pArah5表达载体经历转染、总RNA分离和RT-PCR。使分离的PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶测试，以证实pArah5阳性带。结果证明pArah5在真核细胞中被表达。

实施例13.日本雪松(Cryptomeria japonica)花粉变应原蛋白抗原Cry j 1.1遗传克隆和真核细胞表达测定

1.Cry j 1.1引物合成

以下的引物被用作Cry j 1.1引物。引物是人工合成的：

Cry j 1.1 P1 5’引物：AAGCTTATGGATTCCCCTTGCTTAT(SEQ IDNO：51)

Cry j 1.1 P2 3’引物：GGTACCATCAACAACGTTTAGAG(SEQ IDNO：52)

2.Cry j 1.1表达载体构建

Cry j 1.1 cDNA被用作采用Cry j 1.15 P1和Cry j 1.15 P2引物进行PCR扩增的模板，用于产生多拷贝的Cry j 1.1基因。对引物进一步说明如下：

(a)Cry j 1.1 P15’-AAGCTTATGGATTCCCCTTGCTTAT-3’(SEQIDNO：51)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Hind III识别位点，第7位-第9位为原始的起始密码子)；

(b)Cry j 1.15 P25’-GGTACCATCAACAACGTTTAGAG-3’(SEQID NO：52)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Kpn I识别位点，从引物序列5’末端起的第7位-第9位为原始的终止密码子)。

如实施例7第2部分中所述的方法，让PCR片段和pVAX1(Invitrogen，Inc.)消化、转化、分离和连接。选择阳性克隆，并采用实施例7第2部分中所讨论的序列分析进行分析以获得Cry j 1.1表达载体，pCryj1.1。

3.pCryj1.1真核表达

如实施例6第3部分所述，让pCryj1.1表达载体经历转染、总RNA分离和RT-PCR。使分离的PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶测试，以证实pCryj1.1阳性带。结果证明pCryj1.1可以在真核细胞中被表达。

实施例14.日本雪松(Cryptomeria japonica)花粉变应原蛋白抗原Cryj 1.2遗传克隆和真核细胞表达测定

1.Cry j 1.2引物合成

以下的引物被用作Cry j 1.2引物。引物是人工合成的：

Cry j 1.2 P1 5’引物：AAGCTTATGGATTCCCCTTGCTTAG(SEQ IDNO：53)

Cry j 1.2 P2 3’引物：GGTACCTCAACAACGTTTAGAGAGAG(SEQIDNO：54)

2.Cry j 1.2表达载体构建

Cry j1.2 cDNA被用作采用Cry j 1.2 P1和Cry j 1.2 P2引物进行PCR扩增的模板，用于产生多拷贝的Cry j 1.1基因。对引物进一步说明如下：

(a)Cry j 1.2 P15’-AAGCTTATGGATTCCCCTTGCTTAG-3’(SEQID NO：53)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Hind III识别位点；从引物序列5’末端起的第7位-第9位为原始的起始密码子)；

(b)Cry j 1.2 P2 5’-GGTACCTCAACAACGTTTAGAGAGAG-3’(SEQ ID NO：54)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Kpn I识别位点；从引物序列5’末端起的第7位-第9位为原始的终止密码子)。

如实施例7第2部分中所述的方法，让PCR片段和pVAX1(Invitrogen，Inc.)消化、转化、分离和连接。选择阳性克隆，并采用实施例7第2部分中所讨论的序列分析进行分析以获得Cry j 1.2表达载体，pCryj1.2。

3.pCryj1.2真核表达

如实施例6第3部分所述，让pCryj1.2表达载体经历转染、总RNA分离和RT-PCR。使分离的PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶测试，以证实pCryj1.2阳性带。结果证明pCryj1.2可以在真核细胞中被表达。

实施例15.热带无爪螨变应原蛋白抗原Blo t 5遗传克隆和真核细胞表达测定

1.Blo t 5引物合成

以下的引物被用作Blo t 5引物。引物是人工合成的：

Blo t 5 P1 5’引物：AAGCTTACAATGAAGTTCGC(SEQ ID NO：55)

Blo t 5 P2 3’引物：GGTACCAATTTTTATTGGGT(SEQ ID NO：56)

2.Blo t 5表达载体构建

Blo t 5 cDNA被用作采用Blo t 5 P1和Blo t 5 P2引物进行PCR扩增的模板，用于产生多拷贝的Blo t 5基因。对引物进一步说明如下：

(a)Blo t 5 P1 5’-AAGCTTACAATGAAGTTCGC-3’(SEQ IDNO：55)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Hind III识别位点；从引物序列5’末端起的第10位-第12位为原始的起始密码子)；

(b)Blo t 5 P2 5’-GGTACCAATTTTTATTGGGT-3’(SEQ IDNO：56)(从引物序列5’末端起的第1位-第6位碱基为Kpn I识别位点；从引物序列5’末端起的第12位-第14位为原始的终止密码子)。

如实施例7第2部分中所述的方法，让PCR片段和pVAX1(Invitrogen，Inc.)消化、转化、分离和连接。选择阳性克隆，并采用实施例7第2部分中所讨论的序列分析进行分析以获得Blo t 5表达载体，pBlot5。

3.pBlot5真核表达

如实施例6第3部分所述，让pBlot5表达载体经历转染、总RNA分离和RT-PCR。使分离的PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶测试，以证实pBlot5阳性带。结果证明pBlot5可以在真核细胞中被表达。

实施例16.诱导抑制变态反应的适应性T调节细胞：通过DNA和蛋白疫苗的联合免疫诱导的亚适DC对T调节细胞的转化

总跳蚤提取物在小鼠中诱导速发型皮内变态反应，由此，这种细胞可被用于评估旨在改善AIH的免疫治疗方法。采用这种通过跳蚤变应原诱导的AIH啮齿动物模型，编码跳蚤唾液特异抗原(FSA1)的DNA和蛋白疫苗的联合免疫改善实验性AIH，包括抗原诱导的轮形成、增强的T细胞增殖、淋巴细胞和肥大细胞向攻击位点的渗透。AIH的改善直接涉及诱导展示CD4⁺/CD25^-/FoxP3⁺表型(Tr特征性的)的跳蚤抗原特异T细胞的特异群。在抗原刺激后这些Tr还表达IL-10、IFN-γ和转录因子T-bet。这些Tr由MHC-II⁺/CD40^低DC群驱动，而该MHC-II⁺/CD40^低DC群由DNA和蛋白疫苗的联合免疫诱导。这些研究鉴定了AIH控制中的重要细胞角色。利用这些细胞调节和它们的诱导将为开发变应性和相关病症的疗法提供新方向。

方法

组织学分析.在最后免疫后的第14天，对于每组小鼠，收集来自小鼠的皮肤样品并在4％多聚甲醛中固定，包埋在石蜡块中。切下4-5μm的切片，在二甲苯再水合之前将其置于sylan包被的剥离载玻片上，并用逐渐减小浓度的醇溶液洗涤。通过室温下3％过氧化氢处理10分钟阻断内源过氧化物酶活性，通过在0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0)中煮沸而完成抗原修复。最后，针对肥大细胞以苏木精和伊红(H&E)或甲苯胺蓝对载玻片染色，并在用于观察组织变化的光学显微镜下分析。

皮肤测试.在最后免疫后的第14天，以1μg/μl的跳蚤唾液抗原在无损伤的侧面胸部皮肤上皮内攻击。PBS被用作阴性对照，而组胺被用作阳性对照。采用校正的千分尺在攻击后20分钟内测量皮肤反应的直径。当注射位点大于阳性和阴性对照攻击的注射直径总和的一半大小时，反应被认为是阳性的。

T细胞回忆应答.在第14天时将从经免疫小鼠分离的T细胞以5 x10⁴细胞/孔培养在含有RPMI-10/5％ FCS的96孔板中，重复三份，然后用20μg/ml的跳蚤唾液抗原刺激48h。刺激后，在加入20pl的MTS-PMS(Pormaga，USA)溶液2-4hrs后，通过比色反应评估细胞增殖，其颜色密度通过读板仪(Magellan，Tecan Austria GmbH)在570nm处读取。

测量跳蚤抗原特异的抗体.采用跳蚤抗原包被的板通过ELISA和以特异的辣根过氧化物酶偶联的大鼠抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM和IgE抗体(SouthernBiotech，Birmingham，USA)的检测测量抗跳蚤IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM和IgE同种型的血清浓度，采用ELISA读板仪(Magellan，Tecan Austria GmbH)测量吸收(450nm)

RT-PCR.在免疫后14天采用TRIzol试剂(Promega)从脾和皮肤组织分离总RNA。合成cDNA，并在含有5μl cDNA和1.0μM的以下各引物的反应混合物中进行PCR：HPRT、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-10和IL-12(38)。对于Gata3和T-bet分析，分离了CD4⁺CD25^-T细胞并制备总RNA。按所述采用如下特异引物序列完成RT-PCR，对于Gata3，5’-GGAGGCATCCAGACCCGAAAC-3’(正向)(SEQ ID NO：57)和5’-ACCATGGCGGTGACC-ATGC-3’(反向)(SEQ ID NO：58)；对于T-bet，5’-TGAAGCCCACACTCCTACCC-3’(正向)(SEQ ID NO：59)；和5’-GCGGCATTTTCTCAGTTGGG-3’(反向)(SEQ ID NO：60)。

分离CD4⁺CD25”T细胞和过继转移.从小鼠脾制备单肾细胞悬液，并根据制造商的方法使用MagCellect小鼠CD4⁺CD25⁺调节T细胞分离试剂盒(R&D Systems，Inc.，USA)分离和纯化CD4⁺CD25^-T细胞。所选择的细胞群的纯度为96-98％。将纯化的细胞(1 x 10⁶/小鼠)由静脉内过继转移进C571BL6小鼠。

CFSE标记和细胞共培养.用CFSE(Molecular Probes)标记从C57/BL6分离的未经刺激CD4⁺T细胞。为了测定调节活性，将1 x 104pcDF100+F诱导的调节或对照T细胞在跳蚤抗原(100μg/ml)和1 x 104骨髓衍生的DC存在下与4 x 104纯化的和CFSE标记的未经刺激CD4⁺T细胞共培养。对于一些培养物，让Tr细胞与100g/ml的抗IL-10、抗IFN-γ或同种型对照抗体共培养。72h后，收集并标记细胞，接着通过流式细胞计量术选择CFSE+细胞。

流式细胞计量术.分离CD4⁺CD25^-T细胞并与PE偶联的抗CD44、CD69、CD62L抗体(eBioscience，CA，USA)一起在冰上孵育。进行T细胞中细胞因子产生和FoxP3表达的流式细胞计量术，从动物脾制备单细胞悬液，并用过量抗-Fc(BD PharMingen，USA)封闭Tc受体。以冰冷的PBS洗涤细胞。为了对细胞内细胞因子染色，在抗-CD28mAb(BDPharMingen，USA)存在下以Con A(Sigma-Aldrich)刺激T细胞过夜。收集的细胞用4％多聚甲醛固定和用0.1％皂甙(Sigma-Aldrich)透化处理。为了对表面CD4或细胞质IL-10、IL-4、IFN-γ或FoxP3染色，将合适浓度的藻红蛋白标记的抗体(eBioscience，CA，USA)添加到经透化处理的冰上细胞30min，随后以冷PBS洗涤两次。采用FACSCalibur处理和筛选样品，并采用Cell Questpro软件(BD)分析数据。

结果

跳蚤唾液变应原FSA1已经被鉴定，并作为病因之一参与了猫和狗中观察到的变应性皮炎。评估速发型皮内跳蚤抗原反应性的皮肤反应程度或皮内试验(TDT)可通过皮内跳蚤变应性攻击实现。如所预计的，向小鼠给予跳蚤抗原诱导了显著的皮肤反应(图1a)，诱导了肥大细胞活化，诱导了同时的IgE产生(图1b)，并与未刺激对照小鼠相比，皮内攻击后在C57小鼠中诱导了强的CD4+T细胞增殖应答。这些数据证明，跳蚤抗原变应性模型可用于针对AIH的新治疗策略的评价。

这种模型被用于研究共孵育策略使跳蚤变应原攻击后的动物免于速发型超敏反应的能力。让C57/BL6小鼠以各种测试疫苗预先致敏，并且以跳蚤提取物皮下攻击动物，或者采用组胺攻击作为阳性对照，或采用PBS攻击作为阴性对照。在14天前与编码FSA1表位(aa100-114)的质粒DNA pcDF100和总跳蚤蛋白(称为pcDF100+F)共孵育而免疫的组中，速发型超敏反应被阻断(图2a)。

为了确认所观察到的抑制作用是否是因为质粒骨架或者是与编码FSA1另一区域的DNA构建体相关。在载体对照加跳蚤蛋白(称为V+F)或也与跳蚤蛋白混合的编码FSA1另一区域aa66-80(pD66)的DNA构建体(称为pcDF66+F，图2a)免疫的小鼠中观察到攻击位点的强烈炎症。我们还研究了朝向Th1型的宿主免疫平衡对pcDF100预处理的和跳蚤蛋白加强的动物(称为pcDF100—>F；图2a)的抑制变态反应的影响。攻击后在pcDF100预处理的和F加强的小鼠中观察到严重反应(图2a)，说明诱导强免疫应答恶化了变态反应。

组织学分析揭示了淋巴细胞和肥大细胞在F或V+F免疫的小鼠皮肤损伤中在攻击位点的渗透；然而，以pcDF100+F免疫的小鼠显示了正常的皮内结构，没有炎性细胞。

我们接着分析了该共孵育诱导的对免疫反应的阻断是否是剂量依赖的。剂量25、50、100和200的pcDF100分别与100μg的跳蚤蛋白联合免疫。剂量50μg的pcDF100显示了对皮内反应的限制抑制，在100μg时达到最大抑制。25μg的剂量仅显示了对损伤形成的最低作用，因为这些动物出现了严重反应，类似于在F或V+F孵育动物(图2b)中或阳性对照中观察到的。

高水平的IL-4、IL-5和IL-13为变态反应特征性的，这些免疫调节剂参与了变应严重性。研究了与共孵育方案有关的细胞因子的不同状况。以F或V+F共孵育的小鼠产生了更高水平的IL-4、IL-5和IL-13mRNA表达；然而，以pcDF100+F联合免疫的小鼠产生了相对较低水平的这些细胞因子，提示抗炎性免疫调节功能源于pcDF100+F的共孵育。在共孵育方案中，在IL-2或IFN-γ水平上未发现显著差异，但是IFN-γ稍高于经pcDF100预处理和F加强的小鼠。这种结果再一次提示，联合免疫诱导的变态反应抑制不是由于变应原特异的T辅助细胞引起的不平衡Th2和Th1应答所致。

由于对跳蚤抗原触发的IgE介导的变应性有很好了解，研究了pcDF100+F的共孵育抑制抗跳蚤诱导的IgE产生的能力。在第14、28和42天测量了血清中抗跳蚤IgE和IgG的水平，与V+F或F单独免疫的组相比，pcDF100+F联合免疫小鼠中的稍有降低(图2c)，说明该共孵育不影响IgE产生。

已知增殖性CD4⁺T细胞参与了速发型超敏反应的产生。研究了在第二次免疫后的第14天从经F、V+F或pcDF100+F联合免疫的小鼠脾中分离的CD4⁺T细胞在体外对跳蚤抗原的回忆增殖应答。F和V+F的免疫导致CD4⁺T细胞的强烈增殖；而从pcDF100+F免疫小鼠分离的CD4⁺T细胞显示了应答跳蚤抗原刺激极弱(如果有的话)的增殖(图2d)。这些结果提示，通过pcDF100+F联合免疫而观察到的对超敏反应的抑制与非反应性抗原特异的CD4⁺T细胞相关。

结果表明，用pcDF100和跳蚤蛋白抗原联合免疫通过下调跳蚤皮内攻击诱导的炎性细胞因子和CD4⁺细胞的水平而诱导了对变态反应的抑制。这提示对变应性的防止很可能是抗原特异的，由于抗原错配的组合物不产生相同效果。

为了测试抗原特异的Tr细胞是否已由跳蚤DNA和蛋白疫苗的联合免疫诱导，从联合免疫的C57B/6小鼠收集脾细胞并将其与同基因小鼠的跳蚤抗原特异的效应子T细胞混合，以检测它们在体外抑制回忆增殖应答的能力

如图3a所示，来自pcDF100+F联合免疫的小鼠的脾细胞显著抑制了T细胞回忆免疫应答。相反，来自经F或V+F免疫的小鼠以及来自未刺激小鼠的脾细胞未能抑制抗原特异的T细胞增殖应答(图3a)。这表明，很可能在动物联合免疫期间产生的脾细胞群内的细胞可抑制这种抗原特异的T细胞增殖。鉴定了从pcDF100+F联合免疫的小鼠肾纯化的非T细胞、T细胞或T细胞亚群，并单独测试对回忆增殖的抑制。从经pcDF100+F联合免疫的小鼠纯化的T细胞、纯化的CD4⁺细胞、或纯化的CD4⁺CD25”细胞的反应观察到显著抑制，而不是从其它细胞亚群观察到(图3a)。但是，来自CD4⁺CD25⁺细胞的抑制通常被认为是独立于抗原致敏，然而这种反应的CD4⁺CD25”细胞抑制作用为抗原依赖的方式(图3a)。

为了进一步研究这个问题，利用了过继转移。用分离自经pcDF100+F、F或V+F联合免疫的C57B/6小鼠的总脾细胞、T、CD4⁺或CD8⁺细胞分别过继转移至未经抗原刺激的同基因受体小鼠。所有的受体小鼠随后通过跳蚤提取物皮内攻击以诱导超敏反应。来自pcDF100+F而不是F或V+F免疫的小鼠的脾细胞、T和CD4⁺T细胞都能够抑制速发型超敏反应的出现(图3b)。相反，从所有三个实验组和未刺激对照小鼠分离的CD8⁺T细胞都不抑制这种反应。体外和体内结果都表明CD4⁺CD25^-Tr细胞可介导这种抑制。

为了研究所观察的CD4⁺CD25^-Tr抗原特异性的作用，将从pcDF100+F联合免疫C57B/6小鼠取得的CD4⁺C25^-Tr细胞过继转移进同基因受体小鼠，这些小鼠随后用跳蚤抗原或弗氏完全佐剂(FCA)中的OVA每两周免疫一次，免疫两次。在最后免疫后的第14天，分离T细胞，并测试它们应答跳蚤抗原或OVA而在体外增殖的能力。来自经跳蚤抗原免疫的受体小鼠的T细胞在体外不应答跳蚤抗原刺激；然而，来自经OVA-FCA免疫的受体小鼠的T细胞与OVA刺激很好地应答，但是在体外不应答跳蚤抗原刺激。作为对照，经跳蚤抗原免疫的未经刺激小鼠很好地应答跳蚤抗原刺激，但是在体外不应答OVA刺激，反之亦然(图3c)。这种结果表明，过继转移的CD4⁺C25^-Tr细胞仅抑制体内跳蚤抗原特异的T细胞启动和增殖；而无关抗原特异的T细胞的应答不受影响。

合起来，这些数据证明CD4⁺C25^-Tr细胞被DNA和蛋白疫苗联合免疫所诱导。这些看起来是独特的CD4+Tr细胞，因为它们以抗原特异的方式起作用。

为了确定共孵育诱导的Tr细胞是否如之前所记载的表达某些类型的细胞因子和与Tr细胞有关的独特标志物(J.D.Fontenot，M.A.Gavin，A.Y.Rudensky，Nat Immunol 4，330(April 1，2003)；M.G.Roncarolo，R.Bacchetta，C.Bordignon，S.Narula，M.K.Levings，Immunol Rev 182，68(August 1，2001)；以及P.Stock et al，Nat Immunol 5，1149(November 1，2004))，在免疫后第1、3、7和14天从经F、V+F或pcDF100+F免疫的小鼠分离CD4⁺CD25^-细胞，随后通过特异荧光标记抗体的细胞内染色监测T细胞状况。在联合免疫后的第1、3、7和14天，从经F、V+F和pcDF100+F免疫的小鼠分离CD4⁺CD25^-T细胞，并通过流式细胞计量术评估细胞内细胞因子IL-10、IFN-γ和IL-4的表达。分析从F、V+F、pcDF100+F和作为对照的未经刺激小鼠分离的CD4⁺CD25^-T细胞的CD69、CD44和CD62L表达，以及它们的FoxP3表达。Tr细胞表达T-bet，但不表达gata-3。免疫后的第14天，从来自所有三个组的CD4⁺CD25^-T细胞提取总RNA，并将RT-PCR用于检测HPRT、T-bet和gata-3的表达。在14天期间，从pcDF100+F联合免疫小鼠分离的CD4⁺CD25”T细胞表达高水平的IL-10、IFN-γ、FoxP3、以及微量的IL-4。相反，来自经F或V+F免疫的小鼠的CD4⁺CD25”T细胞产生高水平的IL-4，而不表达FoxP3、IL-10或IFN-γ。由于转录因子Foxp3已被证实为Tr细胞的标志，所以共接种诱导的CD4⁺CD25^-Tr细胞可被分类至调节T细胞种类，但是它们具有独特的表型。在经免疫组中T细胞活化标志物的表达一样高，包括CD44和CD69，而CD62L低，提示所诱导的CD4⁺CD25^-Tr细胞被该免疫完全活化。

为了基于观察到的上述细胞因子表达模式来分析所诱导的CD4⁺CD25^-Tr细胞的Th表型，通过RT-PCR方法分析来自经F、V+F或pcDF100+F免疫的小鼠的CD4⁺CD25^-T细胞T-bet和gata-3基因的表达。结果显示，来自经pcDF100+F免疫的小鼠而不是经F或V+F免疫的小鼠的CD4⁺CD25^-T细胞表达高水平的Th1细胞标志物T-bet。相反，来自经F和V+F免疫的小鼠的CD4⁺CD25^-T细胞表达高水平的gata-3，这是Th2细胞的特征。

总之，这些数据证实DNA和蛋白疫苗联合免疫诱导的CD4⁺CD25^-T细胞是作为适应性Th1表型Tr细胞，其可抑制抗原特异的CD4⁺T细胞增殖功能。

由于抗原呈递细胞(APC)活化T细胞来促进适应性，CD4⁺CD25^-Tr细胞的诱导显然是通过DNA+蛋白疫苗的共孵育导致的特异APC活化所引起。为了研究这个问题，进行了与上述实验类似的实验，以评估树突状细胞(DC)功能和表型，以及它们对未经刺激T细胞的影响。分析了共孵育对DC成熟的影响。研究了经联合免疫小鼠的DC上的共刺激分子的表达。分离肾细胞并染色，用于通过在pcDF100+F、V+F或F联合免疫后48小时选择CD11阳性细胞而观察DC上表面标志物的表达。pcDF100+F的联合免疫不影响DC的成熟，因为在联合免疫后48h从脾分离的DC表达高且类似水平的CD80、CD86、MHC II、L-12、IL-6、IL-la/f3、IFN-a/8和TNF-a，它们为成熟DC特征性的；而来自未经刺激对照小鼠的未成熟DC上的分子仍保持以低水平表达，提示共孵育使得未成熟DC被诱导成熟。但是，我们观察到，与所有其它组相比，pcDF100+F联合免疫小鼠中CD40表达水平显著降低，提示独特表型的DC可能参与了对所观察到的Tr的诱导。来自经V+F或F免疫的小鼠的DC被观察到具有活化异质T细胞增殖的能力，而如所预期的，未经刺激小鼠的未成熟DC不具有这种能力(图4a)。有趣的是，来自经pcDF100+F联合免疫的小鼠的DC具有活化T细胞增殖的有限能力，提示其它的Tr诱导机制在联合免疫组中被诱导。为了研究联合免疫小鼠的DC是否能够将未经刺激T细胞转化为Tr表型，将从被pcDF100+F联合免疫后小鼠获得的DC在体外与同基因未经刺激CD4⁺T细胞共培养，随后通过FACS表征所得到的CD4⁺T细胞。这些T细胞上调了较高水平的CD44和CD69，而不是较低水平的CD62L，提示DC再一次获得了活化T细胞的能力。从对来自V+F或F联合免疫小鼠的DC的分析得到了类似的结果。此外，pcDF100+F组中活化的CD4⁺T细胞产生了显著更高水平的IL-10和IFN-γ，但降低了IL-4(图4b)。但是，来自V+F或F免疫组的活化T细胞产生显著水平的IL-4，但几乎不产生IL-10和IFN-γ(图4b)。在以分离自D+F免疫小鼠的新鲜DC三轮重复刺激后，分析了细胞因子的产生。这些研究证明了T细胞中IL-10产生的增加，这种调节T细胞的特征之一。为了进一步表征它们的调节功能，在DC刺激后分离IL-10⁺T细胞，并进行MLR，以观察它们在MLR中是否阻断应答T细胞增殖。如所示，应答T细胞的增殖被IL-10⁺T细胞的存在所抑制，但是不被分离自与经V+F和F免疫的小鼠或对照小鼠的DC共培养的T细胞所抑制(图4c)。这些数据表明来自D+F共刺激小鼠的DC在体外产生大群的T调节细胞。

为了证实在体内的相同转化，将从pcDF100+F联合免疫后BALB/c小鼠收集的DC与同基因未经刺激CD4⁺T细胞一起转移进裸小鼠(nu/nu)，随后通过FACS分析这些转移的T细胞，用于IL-10和T reg标志物的细胞内染色。来自pcDF100+F联合免疫小鼠的DC在体内诱导了Tr细胞。分离自经pcDF100+F、V+F、F免疫的或未经刺激对照小鼠的脾的DC与未经刺激CD4⁺CD25^-T细胞一起过继转移。在第3和第7天分析T细胞的IL-10、IFN-γ、IL-4、FoxP3和CD25。共转移的T细胞表达更多的IL-10、FoxP3和IFN-γ，但几乎不表达IL-4。但是与来自经V+F或F免疫的小鼠的DC一起转移的T细胞表达更高水平的IL-4，但几乎不表达IL-10和IFN-γ，与体外数据一致。在以新鲜分离自D+F免疫小鼠的DC重复刺激两轮后，特异IL-10细胞因子产生增加。这些数据表明来自D+F联合免疫小鼠的DC很可能在体内驱动未经刺激T细胞成为Tr细胞。与之前的结果一致，这种转化仅在CD4⁺CD25”群内进行，由于在体内测试中未观察到CD25⁺的频率受到影响(图16e)。

最后，进行实验以鉴定哪些DC和T细胞之间相互作用中的分子在产生Tr中起作用。由于如上所证实的，Tr位于活化的T细胞区间内，所以信号应包括经典活化途径信号。这其中重要的是II型主要组织相容性复合物(MHC)和共刺激分子(CD80/CD86)，它们为未经刺激的T细胞的活化的两必需信号。为了研究这个问题，从pcDF100+F联合免疫后48小时的小鼠脾分离DC，并与来自未经刺激的同基因小鼠的未经刺激CD4⁺T细胞在存在或不存在信号阻断分子下共培养，这些信号阻断分子包括抗CD80、抗CD86、抗CD40和抗MHC-II。在重复刺激7天后，分离T细胞并加入到MLR系统以研究它们的调节功能。结果显示，抗CD40和抗MHC II mAbs可部分反转Tr细胞对MLR的抑制性效应；而针对CD80、CD86的mAbs没有阻断对抑制性表型的诱导。这些结果证明CD40和MHC II信号在跳蚤变应原诱导的速发型超敏反应中在诱导Tr方面起作用。观察了适应性Tr1细胞，其通过DC加工亚适免疫原或亚免疫原来抑制经由IL-10或TGF-b或二者的分泌而介导的正常T细胞功能。进一步证实，未成熟的DC驱动产生IL-10的Tr1细胞的分化，产生IL-10、TGF-R和IFN-γ，但是它们不产生IL-4或IL-2，它们对抗原特异的和多克隆活化剂有低反应性。此外，有证据显示微小抗原刺激对DC的亚适活化可诱导Tr1转化。这种对DC的刺激缺乏共刺激信号，由此向T细胞呈递了耐受信号。

编码跳蚤抗原的DNA与跳蚤蛋白的共接种诱导了适应性Tr细胞，其抑制了跳蚤变应原攻击诱导的变态反应。这些细胞表现出了CD4⁺CD25”Foxp3⁺表型，并通过产生IL-10和IFN-γ在体内和体外抑制了抗原特异的以及MLR免疫应答。通过这种共刺激MHC-II⁺/CD40^低DC被诱导，继而将未经刺激T细胞转化为Tr细胞。

实施例17

在猫FAD模型中测试通过疫苗联合免疫测试针对FAD变应原的预防和/或治疗手段

建立猫模型和测试联合免疫

在跳蚤唾液中存在15种以上的变应原。其中，18 kDa蛋白跳蚤唾液抗原1(FSA1)已被确认为可引起FAD的主要变应原。这种基因已被克隆并在E.coli系统中被表达。此外，也已制备了pVAX-FSA1真核细胞表达构建体。

猫FAD模型被建立，并随后用于证实FSA1+pVAX-FSA1联合免疫对猫的已形成的FAD的疗效。

确定跳蚤数量，周期持续时间

动物和寄生虫

10只无病原体猫购自华北制药基团(河北石家庄)，实验过程中被饲养在中国疾病预防控制中心(CDC)。所有的猫都生长超过一年，这是重要因素，因为更小的动物可能在该实验中可耐受跳蚤变应原。将猫分组，在品种和性别方面是随机的。无菌跳蚤由CDC提供。

为了确定侵袭和FAD症状之间的关系，将10只猫分为三组，包括实验组六只猫，两对照组各两只猫。一个对照组经烯啶虫胺处理，另一对照组不经烯啶虫胺处理。在第0天让每只实验猫分别饲养并用100跳蚤侵袭。两天后，这组的所有猫被给予烯啶虫胺以从它们的身体除去跳蚤。两只对照猫也在第0天给予这种药物。这种攻击周期每两周重复一次，共7次。

以FSA1和pVAX-FSA1作为联合免疫原对FAD诱导的或对照猫的免疫方案

将6只FAD猫分为三组。其中的两只在双侧腹部皮下以400μg FSA1i.p.和以400μg p VAX-FSA1质粒联合免疫。两只以400μg FSA1 i.p.和400μg pVAX载体皮下联合免疫。最后两只没有经免疫，用作阳性对照组。将4只非FAD猫分为两组。两只在双侧腹部皮下以400μg FSA1 i.p.和400μgpVAX-FSA1质粒联合免疫，另外两只以400μg FSA1 i.p.和400μg pVAX载体皮下免疫。两只具有烯啶虫胺的对照猫被送往不同的组。猫被免疫三次：0、9、和16天。之后，如上让猫被攻击6个周期。在第二次免疫期间，在相同时间完成攻击周期，由于我们希望将阳性猫保持在易感状态，用于后来的治疗。免疫程序如表2所示。

表2.

皮肤病学评分

方法：

在停止各侵袭后两天时，通过皮肤学评估对猫进行评分。该评估包括红斑、丘疹、痂、鳞屑、脱毛、脱皮。每只猫的身体分为三个部分，以评估哪个部分可能具有最严重的临床结果。根据之前的文献报告，三个部分包括：(1)背部，从头至尾的背侧表面；(2)双侧腹部，从肩胛至尾；(3)胸部和下侧，从喉至caudomedial大腿。

猫外周血细胞的涂片计数

方法

在0、2、16、30、44、58、62天从实验组以及在0、14、28、42、56、60天从对照组收集抗凝血外周血2ml。在免疫后收集相同样品。将一滴血涂在干净玻璃载玻片上。在涂片干燥后，以Wright-Giemsa染色剂染色15min。在去离子水洗涤后，用Kimwipe纸轻轻干燥涂片，以96％和100％乙醇脱水，每次处理10秒钟。然后用二甲苯处理载玻片30min。

染色后，通过蓝色和粉色染色区分血细胞的核和细胞质。以光学显微镜视野中200细胞总数对每种类型细胞百分比计数。

治疗方法

除了从单核细胞(分离自每组第三次免疫后第7天时的外周血)提取总RNA之外，使用如上的相同方法。

统计分析

方差分析(ANOVA)被用于检测三组之间的差异，这些差异包括来自每个周期的皮肤病学评分、各种损伤评分和不同位点评分。皮肤测试和IgE水平的差异也通过ANOVA确定。其它统计分析采用Student t检验进行。这些分析中，将数据转换为对数图。如果P<0.05，则表明有显著差异。

也采用Student t检验进行统计分析。在这些分析中，数据被转化为log。如果P<0.05，则表明了显著差异。

结果

观察和猫的皮肤病学评分

根据损伤的类型、位置、大小和数量进行评分。

对各组分析总评分，并评估实验组的损伤和位点。FAD组比其它组记录了更多分。这些评分在第四侵袭周期增加，随后保持在5.0的水平。FAD组的评分显著高于其它对照组的评分(P<0.01)。这些结果支持了这样的结论：猫FAD模型在评估针对变态反应的治疗性或预防性处理方面是有效和可行的。

为了评估什么地方损伤出现最多，什么类型，以及何时发生，进行了统计分析，发现丘疹和脱毛是最常见的增加FAD组中皮肤病学评分的因素。红斑读数不是起作用的因素，由于红斑在第44天达到顶峰，但是在实验结束时降低，表明没有持续性。另一方面，丘疹增加，在44天后仍保持在高水平，并在第86天达到顶峰(P<0.05)，说明了其持续性。类似地，在44天后脱毛仍保持在高水平(P<0.05)。这两种读数被用来作为反映FAD的良好开始的指示。来自其它损伤的评分是随机分布的，在两对照组中不一致，其中没有观察到损伤的显著差异。

尽管与其它部位相比，在第44天时大部分的皮肤损伤趋于位于背部和头部(P<0.05)，但是在实验结束时损伤扩展到整个身体。这种观察结果与之前关于狗的报告不同，其中胸部和下侧趋于具有最多的损伤。这可能是由于猫和狗的习惯差异所致。

为了消除烯啶虫胺处理的干扰，评估了经烯啶虫胺处理的个体和未处理的个体之间的任何差异。从皮肤学评分而言，在对照组中没有看到显著差异(图5)。

通过血液涂片分析的外周血细胞百分比

对来自不同组的外周血中每种细胞类型数目的比较显示，实验组中嗜酸性细胞的数量大于对照组。对每个侵袭周期都进行血液涂片，但是在第三周期后每种类型细胞的百分比变得恒定。作为在表3中显示的第58天的结果，在三组之间嗜酸性细胞的数量出现了显著差异。由于如之前所报道的，嗜酸性细胞的增加与变应性疾病有关，这些结果表明实验组中的猫对跳蚤侵袭更敏感。两对照组之间没有明显差异，烯啶虫胺看起来不干扰猫外周血中的细胞数量。

表3.外周血中的细胞类型和它们的百分比

	淋巴细胞(％)	单核细胞(％)	嗜中性细胞(％)	嗜碱性细胞(％)	嗜酸性细胞(％)
	淋巴细胞(％)	单核细胞(％)	嗜中性细胞(％)	嗜碱性细胞(％)	嗜酸性细胞(％)	实验组	23.4	2.6	61.5	1.0	11.5
具有烯啶虫胺的对照组	21.8	3.6	70.5	0.7	3.4	实验组	23.4	2.6	61.5	1.0	11.5
具有烯啶虫胺的对照组	21.8	3.6	70.5	0.7	3.4	没有烯啶虫胺的对照组	23.1	3.6	68.3	0.6	4.4

组织病理学检查

首先，分析了正常皮肤和具有损伤的皮肤之间的差异。在第58天时从所有组选择进行皮肤活检。但是，来自一只猫的皮肤活检也可能显示某种程度的差异，尤其是对于损伤差异。这不足以表明经跳蚤侵袭的猫是否会被诱导成FAD。因为这种原因，在用跳蚤提取物进行的IDT之后收集来自每组的皮肤活检，由于跳蚤进行的IDT提供了抗原特异的回忆免疫应答。

皮肤测试评估猫是否对跳蚤提取物敏感

在IDT注射后15分钟时测量疹块或水疱的直径。由于每只猫对IDT具有不同水平的敏感性，记录了来自每只动物的结果。图6显示了所有组中的皮肤反应。如果IDT值超过阈值平均值(盐水和组胺的总和除以2)，则认为已经发生了变态反应，如果IDT值低于平均阈值平均值，则没有发生变态反应。结果显示在表4中。皮肤病学评分在5.0或以上的猫被鉴定为FAD阳性。

表4以皮内皮肤测试(IDT)比较皮肤病学评估

猫编号	实验组	具有烯啶虫胺的对照组	没有烯啶虫胺的对照组	皮肤病学评分	阳性临床评分	以BSA进行的阳性皮肤测试	以跳蚤提取物进行的阳性皮肤测试	以FS进行的阳性皮肤测试	以FSA1进行的阳性皮肤测试
猫编号	实验组	具有烯啶虫胺的对照组	没有烯啶虫胺的对照组	皮肤病学评分	阳性临床评分	以BSA进行的阳性皮肤测试	以跳蚤提取物进行的阳性皮肤测试	以FS进行的阳性皮肤测试	以FSA1进行的阳性皮肤测试	1	否	是	否	0	-	-	-	-	-
2	否	否	是	1	-	-	-	-	-	1	否	是	否	0	-	-	-	-	-
2	否	否	是	1	-	-	-	-	-	4	否	是	否	1	-	-	-	-	-
5	否	否	是	0	-	-	-	-	-	4	否	是	否	1	-	-	-	-	-
5	否	否	是	0	-	-	-	-	-	3	是	否	否	7	+	-	+	-	+
7	是	否	否	6	+	-	+	-	-	3	是	否	否	7	+	-	+	-	+
7	是	否	否	6	+	-	+	-	-	8	是	否	否	8	+	-	+	-	+
9	是	否	否	2	-	-	+	-	+	8	是	否	否	8	+	-	+	-	+
9	是	否	否	2	-	-	+	-	+	10	是	否	否	6	+	-	+	-	+
11	是	否	否	3	-	-	+	-	+	10	是	否	否	6	+	-	+	-	+

皮肤测试以确定FSA1和pVAX-FSA1联合免疫的效果

具有FAD的猫被FSA1+pVAX-FSA1或载体+FSA1联合免疫，如图18和表2中实验设计B中所描述的。免疫前后，以各种跳蚤抗原或对照抗原通过IDT测试猫。在最后免疫后的第7天记录的IDT读数总结在图7和表5中。

结果显示以FSA1+pVAX-FSA1联合免疫的FAD猫对跳蚤提取物或跳蚤特异抗原(例如FSA1蛋白)攻击具有较小的皮肤反应，而以载体+FSA1免疫的猫对相同攻击具有更强的皮肤反应。

比较免疫前后的差异，我们观察到联合免疫组中免疫后皮肤反应比免疫前小得多，如图7所示，提示联合免疫显著降低了对跳蚤攻击的敏感性。相反，在经FSA1和pVAX载体免疫的组中没有观察到明显效果，说明猫保持了它们的变应性状态。所有猫的状态都列在表5中。

表5

猫编号	阳性对照	FSA1和pVAX	FSA1+pVAX-FSA1	以BSA进行的IDT	以跳蚤提取物进行的IDT	以FSA1进行的IDT	免疫前的FE状态
猫编号	阳性对照	FSA1和pVAX	FSA1+pVAX-FSA1	以BSA进行的IDT	以跳蚤提取物进行的IDT	以FSA1进行的IDT	免疫前的FE状态	I	否	是	否				-
2	否	否	是				-	I	否	是	否				-
2	否	否	是				-	4	否	否	是				-
5	否	是	否				-	4	否	否	是				-
5	否	是	否				-	3	是	否	否	-	+	-	+
7	是	否	否	-	+	-	+	3	是	否	否	-	+	-	+
7	是	否	否	-	+	-	+	8	否	否	是	-	-	-	+
9	否	是	否	-	+	-	+	8	否	否	是	-	-	-	+
9	否	是	否	-	+	-	+	10	否	是	否	-	+	-	+
11	否	否	是	-	-	-	+	10	否	是	否	-	+	-	+

联合免疫对FAD猫的疗效

为了确定联合免疫对FAD猫损伤的疗效，在第一次免疫后的53天期间记录了损伤，并显示在图8中。联合免疫组的损伤评分从5.5显著降低到2(图8，曲线上的方块点)。然而，对经FSA1和pVAX载体免疫的组的效果减弱，至较低程度(图8，曲线上的三角形点)。该结果提示该联合免疫对猫中形成的FAD具有治疗作用。

联合免疫对FAD猫上损伤类型影响的关联性

为了将损伤减小的类型与联合免疫联系起来，分析了每组中每种损伤类型的评分，并将结果显示在图9A-9F中。只有丘疹评分从4.0减少至0.5，与FSA1+pVAX-FSA1的联合免疫一致(图9B，曲线上的方块点)。实验组中其它类型的损伤保持不变。

联合免疫对FAD猫上损伤部位影响的关联性

联合免疫对FAD猫的治疗作用

在分析关联性后，数据显示治疗组中双侧腹部的评分在FSA1+pVAX-FSA1联合免疫后从1.5降低到0(图10B)，而对其它位置没有影响，如图10A-10C中所显示的。经FSA1和pVAX载体免疫的治疗组显示了延迟的应答(图10B，三角形点)。以FSA1和pVAX载体免疫的FAD猫的皮肤病学评分在最后免疫后的7天时从1.5降低到0.5。相反，以FSA1+pVAX-FSA1联合免疫的那些在其首次免疫后就快速下降，并一直保持低水平(图10B，方块点)

总结

这些数据证明了通过跳蚤侵袭在猫中成功诱导了FAD模型。FAD猫中的生理或病理参数已被表征，其可用作模型来评价免疫疗法或预防手段的处理。

FSA1+pVAX-FSA1疫苗的联合免疫被证实在猫中抑制形成的FAD。这种抑制看起来是抗原特异的，其支持了在小鼠研究中观察到的结果。

实施例18 pVAX1-K-FSA1

质粒pVAX1-K-FSA1包含与质粒骨架pVAX(Invitrogen)中的Kozak序列连接的FSA1编码序列。K-FSA1插入序列的序列为SEQ ID NO：61。核苷酸1-9对应于Kozak序列，FSA1开放阅读框加上失去的8氨基酸在核苷酸10处开始。质粒pVAX1-K-FSA1的图谱显示在图11中。

序列表

<110>China Agricultural University

Wyeth

Wang，Bin

Jin，Huali

Kang，Youmin

Chu，Hsien-Jue

Ng，Kalaung

<120>变应性抑制剂组合物和试剂盒及其使用方法

<130>WANG0003-500

<150>PCT/CN200510132381

<151>2005-12-23

<160>61

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>640

<212>DNA

<213>Ctenocephalides felis

<400>1

<210>2

<211>176

<212>PRT

<213>Ctenocephalides felis

<400>2

<210>3

<211>416

<212>DNA

<213>Ctenocephalides felis

<400>3

<210>4

<211>88

<212>PRT

<213>Ctenocephalides felis

<400>4

<210>5

<211>410

<212>DNA

<213>Ctenocephalides felis

<400>5

<210>6

<211>92

<212>PRT

<213>Ctenocephalides felis

<400>6

<210>7

<211>525

<212>DNA

<213>Ctenocephalides canis

<400>7

<210>8

<211>174

<212>PRT

<213>Ctenocephalides canis

<400>8

<210>9

<211>791

<212>DNA

<213>Ctenocephalides canis

<400>9

<210>10

<211>180

<212>PRT

<213>Ctenocephalides canis

<400>10

<210>11

<211>1099

<212>DNA

<213>Dermatophagoides pteronyssinus

<400>11

<210>12

<211>320

<212>PRT

<213>ESCherichia coli

<400>12

<210>13

<211>717

<212>DNA

<213>Arachis hypogaea

<400>13

<210>14

<211>766

<212>DNA

<213>Arachis hypogaea

<400>14

<210>15

<211>131

<212>PRT

<213>Arachis hypogaea

<400>15

<210>16

<211>1295

<212>DNA

<213>Cryptomeria japonica

<400>16

<210>17

<211>374

<212>PRT

<213>Cryptomeria japonica

<400>17

<210>18

<211>1313

<212>DNA

<213>Cryptomeria japonica

<400>18

<210>19

<211>374

<212>PRT

<213>Cryptomeria japonica

<400>19

<210>20

<211>537

<212>DNA

<213>Blomia tropicalis

<400>20

<210>21

<211>134

<212>PRT

<213>Blomia tropicalis

<400>21

<210>22

<211>15

<212>PRT

<213>人工肽

<220>

<223>pep66 肽

<400>22

<210>23

<211>15

<212>PRT

<213>人工肽

<400>23

<210>24

<211>45

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>FAD66引物

<400>24

<210>25

<211>45

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>FAD100引物

<400>25

<210>26

<211>86

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>P66F引物

<400>26

<210>27

<211>30

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>PR引物

<400>27

<210>28

<211>86

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>P100F引物

<400>28

<210>29

<211>25

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>HPRT 5′引物

<400>29

<210>30

<211>22

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>HPRT3′引物

<400>30

<210>31

<211>22

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>IFN-gamma 5’引物

<400>31

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>IFN-gamma 3′引物

<400>32

<210>33

<211>22

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>IL-4 5’引物

<400>33

<210>34

<211>22

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>IL-4 3’引物

<400>34

<210>35

<211>24

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>IL-10 5′引物

<400>35

<210>36

<211>30

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>IL-10 3′引物

<400>36

<210>37

<211>19

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Fel d I.1 P1 5′引物

<400>37

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Fel d I.1 P2 3’引物

<400>38

<210>39

<211>21

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Fel d I.2 P1 5′引物

<400>39

<210>40

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Fel d I.2 P2 3′引物

<400>40

<210>41

<211>26

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Can f 1 P1 5’引物

<400>41

<210>42

<211>26

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Can f 1 P2 3’引物

<400>42

<210>43

<211>23

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Can f 2 P1 5’引物

<400>43

<210>44

<211>22

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Can f 2 P2 3’引物

<400>44

<210>45

<211>25

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Der p 1 P1 5′引物

<400>45

<210>46

<211>25

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Der p 1 P2 3′引物

<400>46

<210>47

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Ara h II P1 5′引物

<400>47

<210>48

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Ara h II P2 3’引物

<400>48

<210>49

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Ara h 5 P1 5’引物

<400>49

<210>50

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Ara h 5 P2 3′引物

<400>50

<210>51

<211>25

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Cry j 1.1 P1 5’引物

<400>51

<210>52

<211>23

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Cry j l.1 P2 3′引物

<400>52

<210>53

<211>25

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Cry j l.2 P1 5’引物

<400>53

<210>54

<211>26

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Cry j l.2 P2 3′引物

<400>54

<210>55

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Blo t 5 P1 5′引物

<400>55

<210>56

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Blo t 5 P2 3’引物

<400>56

<210>57

<211>21

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>Gata 3 5′引物

<400>57

<210>58

<211>19

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>GATA 3 3’引物

<400>58

<210>59

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>T-bet 5’引物

<400>59

<210>60

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>T-bet 3′引物

<400>60

<210>61

<211>489

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>K-FSA1插入物

<400>61

Claims

1.防止和抑制针对变应原蛋白的变态反应的组合物，包含：

(b)变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽，

其中所述变应原蛋白选自：跳蚤变应原蛋白；猫变应原蛋白；犬变应原蛋白；尘螨变应原蛋白；花生变应原蛋白；日本雪松变应原蛋白；以及热带无爪螨变应原蛋白。

2.防止和抑制针对变应原蛋白的变态反应的试剂盒，包括：

(a)包含真核细胞表达载体的第一容器，所述载体含有编码变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽的核苷酸序列；和

(b)第二容器，其包含变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽，

3.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中所述变应原蛋白为跳蚤变应原蛋白，选自FSA1蛋白和其变应原片段。

4.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中所述变应原蛋白为跳蚤变应原蛋白，并且所述含有编码所述跳蚤变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽的核苷酸序列的真核细胞表达载体为pcDF66或pcDF100。

5.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中所述变应原蛋白为猫变应原蛋白，选自Fel d I蛋白和其变应原片段。

6.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中所述变应原蛋白为犬变应原蛋白，选自：Can f 1蛋白、Can f 2蛋白和它们的变应原片段。

7.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中所述变应原蛋白为尘螨变应原蛋白，选自Der p 1蛋白、Der F 1蛋白和它们的变应原片段。

8.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中所述变应原蛋白为花生变应原蛋白，选自：Ara H II、Ara H5和它们的变应原片段。

9.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中所述变应原蛋白为日本雪松变应原蛋白，选自Cry j 1.1蛋白、Cry j 1.2蛋白和它们的变应原片段。

10.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中所述变应原蛋白为热带无爪螨变应原蛋白，选自Blo t 5蛋白及其变应原片段。

11.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中所述真核细胞表达载体包含可操作地连接到选自RSV、CMV和SV40启动子的启动子的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽。

12.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中真核细胞表达载体与变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽的重量比例为1:5至5:1。

13.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中真核细胞表达载体与变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽的重量比例为1:1。

14.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中真核细胞表达载体与变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽的摩尔比例为1:100,000至20:100,000。

15.权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒，其中真核细胞表达载体与变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽的摩尔比例为15:100,000。

16.防止和抑制个体中针对变应原蛋白的变态反应的方法，包括向所述个体给予如下物质的步骤：

(b)变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽，

17.权利要求16的方法，其中所述个体为选自人、牛、羊、猪、马、犬和猫物种的物种。

18.权利要求16的方法，其中在给予所述真核细胞表达载体和变应原蛋白或包含所述变应原蛋白的抗原表位的多肽之前，所述个体具有对变应原蛋白的变态反应。