JP2010513220A - アレルギー抑制剤の組成物及びキットならびにその使用方法 - Google Patents

Abstract

アレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を抑制するための組成物及びキットが開示される。組成物は、アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクターと、アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドとを含む。キットは、アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクターを含む第１の容器と、アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドを含む第２の容器とを含む。

Description

（発明の分野）
本発明は、アレルゲンに対するアレルギー反応を防止及び抑制するために有用である組成物及びキット、ならびに、そのような組成物及びキットを使用する方法に関する。本発明は、ノミアレルギー皮膚炎、ネコ及びイヌの毛又は鱗屑、チリダニ（dust mite）、ピーナッツ、スギ花粉、ならびに、ネッタイタマニクダニ（Blomia tropicalis）のアレルゲンに対するアレルギー反応を防止及び抑制するための組成物、キット及び方法を提供する。

（発明の背景）
様々なアレルゲンに対するアレルギー反応は、特に、アレルギー反応が重篤な反応及び／又はアレルゲン誘導の即時型過敏症（ＡＩＨ）を誘導する場合には、著しい健康問題である。

アレルギーは、特定のアレルゲンによる宿主の皮膚に対する病原性の炎症を生じさせる持続したＴ細胞活性化の結果であるとみなされる。いくつかのアプローチが、ＡＩＨを改善するために使用され、これらには、非特異的な免疫抑制剤、あるいは、Ｔ細胞又はＢ細胞を標的とするモノクローナル抗体が含まれる（A. J. Van Oosterhout他、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.、17、386 (1997年9月1日)；P. Proksch他、J Immunol、174、7075 (2005年6月1日)）。しかしながら、この状況では、長期間投与されたレシピエントは、一般的には、感染と闘うためのその能力を損なう場合があり、抵抗性が低下する。免疫をＴｈ２型からＴｈ１型に向けさせることもまた、限定的ではあるが成功例により証明されている（S. Jilek、C. Barbey、F. Spertini、B. Corthesy、J Immunol、166、3612 (2001年3月1日)）。Ｔ調節細胞（自然発生の胸腺由来のＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇ細胞（I. M. de Kleer他、J Immunol、172、6435 (2004年5月15日)；D. Lundsgaard、T. L. Holm、L. Hornum、H. Markholst、Diabetes、54、1040 (2005年4月1日)；M. J. McGeachy、L. A. Stephens、S. M. Anderton、J Immunol、175、3025 (2005年9月1日)；I. Bellinghausen、B. Klostermann、J. Knop、J. Saloga、J Allergy Clin Immunol、111、862 (2003年4月1日)；E. M. Ling他、Lancet、363, 608 (2004年2月21日)；及び、J. Kearley、J. E. Barker、D. S. Robinson、C. M. Lloyd、J. Exp. Med.、jem.20051166 (2005年11月28日)）を含む）の近年における発見により、粘膜の誘導されたＴｈ３細胞、及び、抗原により誘導されたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔｒ細胞が免疫調節因子又は免疫抑制因子あるいは自己反応性の病原として使用されることが提案されている（H. Fukaura他、J. Clin. Invest.、98、70 (1996年7月1日))。様々なアプローチが、Ｔ調節細胞を誘導して自己反応性Ｔ細胞を抑制するために検討されている。好ましくは、アレルギー、喘息及び自己免疫疾患の抗原を標的とする抗原特異的なＴ調節細胞の誘導が有望なストラテジーであると考えられる。いくつかの証拠から、抗原特異的な調節性Ｔ細胞１（ＴＯ）の誘導が、未成熟なＤＣ、部分的に至適な免疫原、又は、ＤＣにおける共刺激分子を部分的にブロックすることの有用性によって可能であることが示されている（A. Kumanogoh他、J Immunol、166、353 (2001年1月1日)；M. K. Levings他、Blood、105、1162 (2005年2月1日)；及び、S. K. Seo他、Nat Med、10、1088 (2004年10月1日)）。これらのアプローチはすべてがインビトロ又は実験的条件のいずれかで行われている。Ｔｒ細胞の誘導は、抗原特異的なＴ細胞の機能を、抗原がマッチしたＤＮＡ及びタンパク質抗原を同時投与ワクチンとして同時に接種することによってインビボで抑制することができる（H. Jin他、Virology、337、183 (2005年6月20日)）。

非宿主性であるノミ（non-host flea）の最も重要な特徴は、ノミは、動物のうちで任意の哺乳動物種又は鳥類種の身体に見出され得る吸血性の寄生虫であることである。Ctenocephalides felisは、主にネコ及びイヌに存在する寄生虫であり、一方、Ctenocephalides canisは飼い犬及び野良犬に限定される。ノミアレルギー皮膚炎（ＦＡＤ）は、ネコ及びイヌにおける最も多く見られる皮膚の病気である。ＦＡＤは、ノミ寄生虫が咬み、その唾液が刺激物として働き、アレルギー反応を引き起こすときに起こる。咬傷の場所は、赤くなって、腫脹、炎症を起こして、痒くなって現れる。多くの場合、動物は咬傷部を自分の足で引っ掻き、これによる傷が皮膚の潰瘍化の原因となり、また、さらに細菌感染及び真菌感染を引き起こす。このことはイヌ又はネコに大きな危険をもたらしており、現在、この疾患に対する効果的な薬物治療方法又は防止方法はない。

一般的に、ノミアレルゲンは、アレルギー反応を引き起こすノミ抗原に由来する、異なるサイズを有する様々なタンパク質をさす。一部の文献では、ノミアレルゲンが、ネコノミの唾液のアレルゲンタンパク質（ＦＳＡ１又はＣｔｅ ｆ１）として示されている。ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＦ１０２５０２は、参考として本明細書中に組み込まれており、Ctenocephalides felisのノミ唾液腺に由来するＦＳＡ１タンパク質又はＣｔｅ ｆ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を開示する。その６５３ヌクレオチドの配列は、シグナルペプチド（１〜５４）及び成熟タンパク質配列（５５〜５２８）についてのコード配列を含むコード配列１〜５３１を含む。ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＡＤ１７９０５は、参考として本明細書中に組み込まれており、シグナルペプチド（１〜１８）及び成熟タンパク質配列（１９〜１７６）を含む、Ctenocephalides felisのノミ唾液腺に由来するＦＳＡ１タンパク質又はＣｔｅ ｆ１タンパク質のアミニ（amini）配列（配列番号２）を開示する。

最も重要なネコアレルゲンタンパク質が、Ｆｅｌ ｄＩである。ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｍ７４９５３は、参考として本明細書中に組み込まれており、飼い猫の主たるアレルゲンに由来するＦｅ１ ｄＩタンパク質のアミノ酸配列、及び、Ｆｅ１ ｄＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を開示する。Ｆｅ１ ｄＩタンパク質は二次的なＢ分泌ペプチド配列を有する。このＦｅ１ ｄＩ配列は、配列１〜２５から構成される５’非翻訳領域と、８８個のアミノ酸をコードする配列２６〜２９２であるコード配列とを含む４１６ｂｐのｍＲＮＡである（配列番号４；ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＡＣ４１６１７、これは参考として本明細書中に組み込まれる）。シグナルペプチドが２６〜７９によってコードされ、成熟タンパク質が８０〜２８９によってコードされる。３’非翻訳領域が２９３〜４１６である。ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｍ７４９５２は、参考として本明細書中に組み込まれており、飼い猫の主たるアレルゲンに由来するＦｅ１ ｄＩタンパク質のアミノ酸配列、及び、Ｆｅ１ ｄＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を開示する。このＦｅ１ ｄＩ配列は、配列１〜７から構成される５’非翻訳領域と、９２個のアミノ酸をコードする配列８〜２８６であるコード配列とを含む４１０ｂｐのｍＲＮＡである（配列番号６；ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＡＣ３７３１８、これは参考として本明細書中に組み込まれる）。シグナルペプチドが８〜７３によってコードされ、成熟タンパク質が７４〜２８３によってコードされる。３’非翻訳領域が２８７〜４１０である。

最も主要なイヌアレルゲンタンパク質が、唾液脂質プロモーターのＣａｎ ｆ１及びＣａｎ ｆ２である。ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＦ０２７１７７は、参考として本明細書中に組み込まれており、飼い犬の主たるアレルゲンの唾液リポカリンタンパク質に由来するＣａｎ ｆ１タンパク質のアミノ酸配列、及び、Ｃａｎ ｆ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を開示する。このＣａｎ ｆ１配列は、１７４個のアミノ酸をコードする５２５ｂｐのｍＲＮＡである（配列番号８；ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＡＣ４８７９４、これは参考として本明細書中に組み込まれる）。

ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＦ０２７１７８は、参考として本明細書中に組み込まれており、飼い犬の主たるアレルゲンの唾液リポカリンタンパク質に由来するＣａｎ ｆ２タンパク質のアミノ酸配列、及び、Ｃａｎ ｆ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を開示する。このＣａｎ ｆ２配列は、１８０個のアミノ酸をコードする１９５〜７３７のコード配列を含む７９１ｂｐのｍＲＮＡである（配列番号１０；ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＡＣ４８７９５、これは参考として本明細書中に組み込まれる）。

ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｕ１１６９５は、参考として本明細書中に組み込まれており、チリダニのアレルギー源タンパク質抗原のＤｅｒ Ｐ１のアミノ酸配列、及び、Ｄｅｒ Ｐ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を開示する。このＤｅｒ Ｐ１配列は、１８０個のアミノ酸をコードする５０〜１０１２のコード配列を含む１０９９ｂｐのｍＲＮＡである（配列番号１２；ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＡＢ６０１２５、これは参考として本明細書中に組み込まれる）。コード配列は、シグナルペプチドをコードするコード配列５０〜１０９と、成熟ペプチドをコードするコード配列３４４〜１００９とを含む。ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＡＢ６０１２５は、アミノ酸１〜２０を含むシグナルペプチドと、アミノ酸９９〜３２０を含む成熟タンパク質とを開示する。

ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｌ７７１９７は、参考として本明細書中に組み込まれており、ピーナッツのアレルギー源タンパク質抗原のＡｒａ ｈＩＩのアミノ酸配列、及び、Ａｒａ ｈＩＩをコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を開示する。このＡｒａ ｈＩＩ配列は、１１０個のアミノ酸をコードし、ポリＡシグナル５６２〜５６７を含む、７１７ｂｐの配列である。

ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＦ０５９６１６は、参考として本明細書中に組み込まれており、ピーナッツのアレルギー源タンパク質抗原のＡｒａ ｈＩＩのアミノ酸配列、及び、Ａｒａ ｈＩＩをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を開示する。このＡｒａ ｈ５配列は、１７〜４１２のコード配列を含む７４３ｂｐの配列である。ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＡＤ５５５８７は、参考として本明細書中に組み込まれており、１３１アミノ酸のタンパク質（配列番号１５）を開示する。

ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＢ０８１３０９は、参考として本明細書中に組み込まれており、スギ（cryptomeria japonica）のアレルギー源抗原のＣｒｙ ｊ１．１のアミノ酸配列、及び、Ｃｒｙ ｊ１．１をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を開示する。このＣｒｙ ｊ１．１配列は、シグナルペプチドが６２〜１２４によってコードされ、成熟タンパク質が１２５〜１１８３によってコードされる６２〜１１８６のコード配列と、１２９５におけるポリＡ部位とを含む１２９５ｂｐの配列である。ＧｅｎｅＢａｎｋ ＢＡＢ８６２８６は、参考として本明細書中に組み込まれており、アミノ酸１〜２１のシグナルペプチドと、アミノ酸２２〜３７４の成熟タンパク質とを含む３７４アミノ酸のタンパク質（配列番号１７）を開示する。

ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＢ０８１３１０は、参考として本明細書中に組み込まれており、スギ（cryptomeria japonica）のアレルギー源抗原のＣｒｙ ｊ１．２のアミノ酸配列、及び、Ｃｒｙ ｊ１．２をコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）を開示する。このＣｒｙ ｊ１．２配列は、シグナルペプチドが４６〜１０８によってコードされ、成熟タンパク質が１０９〜１１６７によってコードされる４６〜１１７０のコード配列と、１３１３におけるポリＡ部位とを含む１３１３ｂｐの配列である。ＧｅｎｅＢａｎｋ ＢＡＢ８６２８７は、参考として本明細書中に組み込まれており、アミノ酸１〜２１のシグナルペプチドと、アミノ酸２２〜３７４の成熟タンパク質とを含む３７４アミノ酸のタンパク質（配列番号１９）を開示する。

ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｕ５９１０２は、参考として本明細書中に組み込まれており、ネッタイタマニクダニのアレルギー源タンパク質抗原のＢｌｏ ｔ５のアミノ酸配列、及び、Ｂｌｏ ｔ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号２０）を開示する。このＢｌｏ ｔ５配列は、３３〜４３７のコード配列を含む５３７ｂｐの配列である。ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＡＤ１０８５０は、参考として本明細書中に組み込まれており、１３４アミノ酸のタンパク質（配列番号２１）を開示する。

これらのアレルゲンによって誘導されるアレルギー反応を防止及び抑制する組成物及び方法が今日もなお求められている。

（発明の要旨）
本発明は、アレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を防止及び抑制するための組成物に関する。本発明の組成物は、
ａ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクター；及び
ｂ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチド
を含む。

本発明は、ノミのアレルゲンタンパク質、ネコのアレルゲンタンパク質、イヌのアレルゲンタンパク質、チリダニのアレルゲンタンパク質、ピーナッツのアレルゲンタンパク質、スギのアレルゲンタンパク質及びネッタイタマニクダニのアレルゲンタンパク質からなる群より選択されるアレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を防止及び抑制するための組成物を提供する。

本発明はさらに、アレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を防止及び抑制するためのキットに関する。本発明のキットは、
ａ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクターを含む第１の容器；及び
ｂ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドを含む第２の容器
を含む。

本発明は、ノミのアレルゲンタンパク質、ネコのアレルゲンタンパク質、イヌのアレルゲンタンパク質、チリダニのアレルゲンタンパク質、ピーナッツのアレルゲンタンパク質、スギのアレルゲンタンパク質及びネッタイタマニクダニのアレルゲンタンパク質からなる群より選択されるアレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を防止及び抑制するためのキットを提供する。

本発明はさらに、アレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を個体において防止及び抑制する方法に関する。本発明の方法は、
ａ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクター；及び
ｂ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチド
を個体に投与する工程（１つ又は複数）を含む。

本発明は、アレルゲンタンパク質が、ノミのアレルゲンタンパク質、チリダニのアレルゲンタンパク質、ピーナッツのアレルゲンタンパク質、スギのアレルゲンタンパク質及びネッタイタマニクダニのアレルゲンタンパク質からなる群より選択される、アレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を個体において防止及び抑制する方法を提供する。

（発明の好ましい実施形態の説明）
本発明は、アレルギー反応及びアレルゲン誘導の即時型過敏症を防止及び抑制する組成物、キット及び方法を提供する。本発明は、ノミアレルギー皮膚炎を防止及び抑制する組成物、キット及び方法、ネコアレルギーを防止及び抑制する組成物、キット及び方法、イヌアレルギーを防止及び抑制する組成物、キット及び方法、ダニアレルギーを防止及び抑制する組成物、キット及び方法、ピーナッツアレルギーを防止及び抑制する組成物、キット及び方法、スギアレルギーを防止及び抑制する組成物、キット及び方法、ならびに、ネッタイタマニクダニアレルギーを防止及び抑制する組成物、キット及び方法を提供する。

本発明の組成物は、アレルゲンタンパク質、あるいは、アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質と、アレルゲンタンパク質、あるいは、アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質をコードする発現ベクターとを含む。

本発明のキットは、アレルゲンタンパク質、あるいは、アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む容器と、アレルゲンタンパク質、あるいは、アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質をコードする発現ベクターを含む容器とを含む。

本発明の方法は、アレルギー反応又はアレルゲン誘導の即時型過敏症を有する個体、あるいは、アレルギー反応又はアレルゲン誘導の即時型過敏症に対して敏感な個体に本発明の組成物及び／又は本発明のキットの構成成分を組み合わせて投与することを含む。

組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質、ならびに、組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質は、それらがエピトープを共有するようにアミノ酸配列の重なりを有する。すなわち、組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質の少なくとも１つのエピトープは、組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質の少なくとも１つのエピトープと同じである。いくつかの実施形態において、組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質は、組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質と同じである。いくつかの実施形態において、本発明の組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質は、組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質のフラグメントである。いくつかの実施形態において、組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質は、組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質のフラグメントである。いくつかの実施形態において、組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質は、組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質のフラグメントである。いくつかの実施形態において、１）組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質、及び、２）組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質の一方又は両方が、アレルゲンである天然に存在するタンパク質と同一である。いくつかの実施形態において、１）組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質、及び、２）組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質の両方が、アレルゲンである天然に存在するタンパク質と同一である。いくつかの実施形態において、１）組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質、及び、２）組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質の一方又は両方が、アレルゲンである天然に存在するタンパク質のフラグメントと同一である。いくつかの実施形態において、１）組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質、及び、２）組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質の両方が、アレルゲンである天然に存在するタンパク質のフラグメントと同一である。いくつかの実施形態において、組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質は、アレルゲンである天然に存在するタンパク質のフラグメントと同一であり、かつ、組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質は、アレルゲンである天然に存在するタンパク質と同一である。いくつかの実施形態において、組成物又はキットに存在し、その方法で使用されるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質は、アレルゲンである天然に存在するタンパク質と同一であり、かつ、組成物又はキットに存在し、その方法で使用される発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、そのアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質は、アレルゲンである天然に存在するタンパク質のフラグメントと同一である。

いくつかの実施形態において、組成物又はキットは、アレルゲンタンパク質（例えば、病原体、食品、環境因子又は刺激物に由来するタンパク質など）を含む。いくつかの実施形態において、組成物又はキットは、アレルゲンタンパク質（例えば、病原体、食品、環境因子又は刺激物に由来するタンパク質など）の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む。同様に、いくつかの実施形態において、組成物又はキットは、アレルゲンタンパク質（例えば、病原体、食品又は刺激物に由来するタンパク質など）をコードする発現ベクターを含み、また、いくつかの実施形態において、組成物又はキットは、アレルゲンタンパク質（例えば、病原体、食品、環境因子又は刺激物に由来するタンパク質など）の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質をコードする発現ベクターを含む。

いくつかの実施形態において、発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質は、組成物又はキットに含まれるアレルゲンタンパク質、あるいは、アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質と同一である。いくつかの実施形態において、発現ベクターによってコードされるアレルゲンタンパク質、あるいは、アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質は、組成物又はキットに含まれるアレルゲンタンパク質、あるいは、アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質と異なる。いくつかの実施形態において、組成物に含まれるペプチド又はタンパク質はアレルゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、組成物に含まれるペプチド又はタンパク質は、アレルゲンタンパク質のフラグメントである。いくつかの実施形態において、発現ベクターによってコードされるペプチド又はタンパク質は、アレルゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、発現ベクターによってコードされるペプチド又はタンパク質は、アレルゲンタンパク質のフラグメントである。本発明によれば、本発明の方法は、個体がそのようなタンパク質にその後に晒されるとき、アレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を抑制するために十分な量で組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態において、本発明はノミアレルギー皮膚炎のための抑制剤を提供する。本発明のノミアレルギー皮膚炎抑制剤は、ノミの唾液のアレルゲンタンパク質（例えば、ネコの唾液抗原１（ＦＳＡ１又はＣｔｅ ｆ１）など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む真核細胞発現ベクターを、ノミの唾液アレルゲンタンパク質（例えば、ネコの唾液抗原１（ＦＳＡ１又はＣｔｅ ｆ１）など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質と組合せて含む。

いくつかの実施形態において、本発明はネコアレルギーのための抑制剤を提供する。本発明のネコアレルギー抑制剤は、ネコのアレルゲンタンパク質（例えば、Ｆｅｌ ｄＩなど）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む真核細胞発現ベクターを、ネコのアレルゲンタンパク質（例えば、Ｆｅｌ ｄＩなど）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質と組合せて含む。

いくつかの実施形態において、本発明はイヌアレルギーのための抑制剤を提供する。本発明のイヌアレルギー抑制剤は、イヌのアレルゲンタンパク質（例えば、Ｃａｎ ｆ１又はＣａｎ ｆ２など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む真核細胞発現ベクターを、イヌのアレルゲンタンパク質（例えば、Ｃａｎ ｆ１又はＣａｎ ｆ２など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質と組合せて含む。

いくつかの実施形態において、本発明はチリダニアレルギーのための抑制剤を提供する。本発明のチリダニアレルギー抑制剤は、チリダニアレルギーのアレルゲンタンパク質（例えば、Ｄｅｒ Ｐ１又はＤｅｒ Ｆ１など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む真核細胞発現ベクターを、ダニアレルギーのアレルゲンタンパク質（例えば、Ｄｅｒ Ｐ１又はＤｅｒ Ｆ１など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質と組合せて含む。

いくつかの実施形態において、本発明はピーナッツアレルギーのための抑制剤を提供する。本発明のピーナッツアレルギー抑制剤は、ピーナッツアレルギーのアレルゲンタンパク質（例えば、Ａｒａ ＨＩＩ又はＡｒａ Ｈ５など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む真核細胞発現ベクターを、ピーナッツアレルギーのアレルゲンタンパク質（例えば、Ａｒａ ＨＩＩ又はＡｒａ Ｈ５など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質と組合せて含む。

いくつかの実施形態において、本発明はスギアレルギーのための抑制剤を提供する。本発明のスギアレルギー抑制剤は、スギアレルギーのアレルゲンタンパク質（例えば、Ｃｒｙ ｊ１．１又はＣｒｙ ｊ１．２など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む真核細胞発現ベクターを、スギアレルギーのアレルゲンタンパク質（例えば、Ｃｒｙ ｊ１．１又はＣｒｙ ｊ１．２など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質と組合せて含む。

いくつかの実施形態において、本発明はネッタイタマニクダニアレルギーのための抑制剤を提供する。本発明のネッタイタマニクダニアレルギー抑制剤は、ネッタイタマニクダニアレルギーのアレルゲンタンパク質（例えば、Ｂｌｏ ｔ５など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む真核細胞発現ベクターを、ネッタイタマニクダニアレルギーのアレルゲンタンパク質（例えば、Ｂｌｏ ｔ５など）、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質と組合せて含む。

アレルゲンタンパク質は大腸菌細胞又は真核細胞（例えば、酵母細胞又はＣＨＯ細胞など）において発現させることができ、例えば、アレルゲンタンパク質のコード配列を対応する発現ベクターに組み込み、これにより、タンパク質産物が、大腸菌細胞システム、酵母細胞システム又はＣＨＯ細胞システムによって発現することを生じさせるために、分子クローニング方法が使用される。その後、精製が、アレルゲンタンパク質を得るために使用される。同様に、アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質をデザインすることができる。そのようなペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに組み込み、そのようなペプチド又はタンパク質を発現する宿主細胞において産生させることができ、これらは次いで精製されるか、またはペプチドが合成され得る。あるいは、アレルゲンタンパク質を天然の供給源から精製することができる。

本発明の組成物又はキットに含まれる真核細胞発現ベクターは、プラスミド発現ベクター、ウイルス発現ベクター又はバクテリオファージ発現ベクターから構成される発現ベクターであり得る。プラスミドＤＮＡ発現ベクター、及び、染色体ＤＮＡフラグメントから形成される発現ベクター、及び、他の発現ベクターが遺伝子工学の分野では周知であり、一般的に使用される。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が使用される。いくつかの実施形態において、ＣＭＶプロモーター、ｈＣＧリーダー及びウシ成長ホルモンのポリＡを有するプラスミドベクターのｐｒｏｖａｘが使用される。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターは、ヒトサイトメガロウイルスの前初期（immediate-early）（ＣＭＶ）プロモーター、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル（ＢＧＨポリＡ）、Ｔ７配列、ＣｏｌＥ１複製起点、及び、ＪＥウイルスのシグナル配列を含むｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。

真核細胞発現ベクターにおいて、アレルゲンタンパク質、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質についてのコード配列は、真核生物での発現のために必要とされる調節配列に作動可能に連結される。好適なプロモーターの例には、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーターなど）、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えば、ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなど）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ならびに、ヒト遺伝子（例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒトメタロチオネイン（metalothionein）など）に由来するプロモーターが含まれる。本発明を実施するために有用なポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡ発現のために必要とされる調節エレメントに加えて、他のエレメントもまた、ＤＮＡ分子に含めることができる。そのようなさらなるエレメントには、エンハンサーが含まれる。エンハンサーを、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びウイルスエンハンサー（例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶに由来するエンハンサーなど）（これらに限定されない）を含む群より選択することができる。

いくつかの実施形態において、アレルゲンタンパク質、あるいは、そのようなアレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質に対する真核細胞発現ベクターの割合は１：５〜５：１であり、好ましい選択肢は１：１である（モル比は１〜２０：１００，０００であり、好ましいモル比は１５：１００，０００である）。

いくつかの実施形態において、抑制剤組成物、又は、キット構成成分の組合せが、筋肉内に、皮内に（intracutaneously/intradermally）、経皮的に、皮下に、静脈内に、及び、注入、ネブライザー／エアロゾル／噴霧、点鼻薬、点眼薬、経口、舌下、口内、膣、浸透、吸収、物理的又は化学的な手段により粘膜組織を介して生物に導入される；あるいは、抑制剤組成物、又は、キット構成成分の組合せは、他の物理的混合物又はパッケージ物によって生物に導入することができる。キットの構成成分は一緒に送達される必要はなく、あるいは、同じ部位に、又は、同じ投与経路によって送達される必要もない。

医薬組成物を様々な手段によって導入することができ、そのような手段には、例えば、注射針による注入、無針注入器、遺伝子銃、エレクトロポレーション及び微粒子銃（microprojectile bombardment）が含まれる。

組成物及びキット構成成分は、当業者によって、選ばれた投与形態に依存して選択された組成物とともに配合することができる。好適な医薬用キャリアが、この分野における標準的な参考教書であるRemington's Pharmaceutical Sciences(A.Osol)の最新版に記載されている。

非経口投与のために、配合物は、医薬的に許容しうる非経口用ビヒクルと合わせて溶液、懸濁物、乳化物又は凍結乾燥粉末物として提供され得る。そのようなビヒクルの例には、水、生理的食塩水及びデキストロース溶液が含まれる。リポソーム及び非水ビヒクル（例えば、固定油など）もまた使用することができる。ビヒクル又は凍結乾燥粉末物は、等張性を維持する添加物（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）、及び、化学的安定性を維持する添加物（例えば、緩衝剤及び保存剤）を含有することができる。配合物は、一般的に使用される技術によって滅菌される。注射可能な組成物は無菌及び発熱物質非含有であり得る。

投与される投薬量は、様々な要因（例えば、薬力学的特徴；その投与様式及び投与経路；レシピエントの年齢、健康状態及び体重；症状の性質及び程度；併用処置の種類；ならびに処置頻度など）に依存して変化する。いくつかの実施形態において、使用される組成物の量、又は、キット構成成分の組合せの量は、一般的には１２５０μｇ／ｋｇ体重／投与であり、組成物又はキット構成成分は１日毎〜３０日毎に１回投与され、好ましくは、７日毎〜１４日毎に１回投与される。いくつかの実施形態において、１回だけの服用が施される。いくつかの実施形態において、多数回の服用が施される。いくつかの実施形態において、合計で２回〜３回の投与が施される。

いくつかの実施形態において、組成物又はキットは、アレルギー反応を患う個体に投与される。いくつかの実施形態において、組成物又はキットは、アレルギー反応を患ってはいないが、アレルゲンに晒されている個体、又は、アレルゲンに晒されている可能性がある個体に投与される。いくつかの実施形態において、組成物又はキットは、アレルギー反応を患ってはいないが、アレルゲンに対してアレルギー性であることが知られている個体、すなわち、アレルゲンに対するアレルギー反応を以前に有したことがある個体に投与される。

本発明の方法はヒト医療及び獣医医療の両方の分野で有用である。従って、本発明は、哺乳動物、鳥類及び魚類におけるアレルギー反応の処置及び防止に関する。本発明の方法は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ及びネコの種をはじめとする哺乳動物種のために特に有用であり得る。

下記に示す実施例には、本発明の態様の代表的な例が含まれる。下記の実施例は、本発明の範囲を限定をすることは意図されず、むしろ、例示的目的を果たすことが意図される。加えて、本発明の様々な態様が下記の記載によって要約され得る。しかしながら、この記載は、本発明の範囲を限定することは意図されず、むしろ、本発明の様々な態様を強調することが意図される。当業者は本発明のさらなる態様及び実施形態を容易に理解することができる。

（実施例１：ノミの唾液アレルゲンペプチドのポリペプチド合成及びその発現のための真核細胞発現ベクターの構築）
記載しているノミの唾液アレルゲンペプチド（ＦＳＡ）は、配列番号２に記載しているようなアミノ酸残基を有する。

配列番号２２に記載しているアミノ酸残基を含む合成されたポリペプチドがｐｅｐ６６と名付けられる。配列番号２３に記載しているアミノ酸を含む合成されたポリペプチドがｐｅｐ１００と名付けられる。

ｐｅｐ６６をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２４に記載しているヌクレオチド配列を有し、ＦＡＤ６６と名付けられる。

ｐｅｐ１００をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２５に記載しているヌクレオチド配列を有し、ＦＡＤ１００と名付けられる。

ｐｅｐ６６及びｐｅｐ１００をコードする真核生物用ベクターは、配列番号２４又は配列番号２５に記載している少なくとも１つのヌクレオチド配列を有し、ｐｃＤＦ６６又はｐｃＤＦ１００とそれぞれ名付けられる。

ノミの唾液アレルゲンタンパク質をＧｒｅｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｌｅｎｏｉｒ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、合衆国）から購入し、Ｌｅｅ他によって、Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９：１３〜１９、１９９７に記載している体系的なノミ培養方法によって配合した。１成虫年（one adult year）が終了したとき、メスのノミを感染動物の単離した唾液腺から得た。唾液腺細胞をＳＤＳ還元緩衝液に懸濁し、振動器で３０秒間攪拌した。細胞を粉砕し、粗タンパク質を−２０℃で保存した。

ＦＳＡエピトープのｐｅｐ６６及びｐｅｐ１００をコードするヌクレオチド配列を含む記載された真核細胞発現ベクターは、ｐｃＤＦ６６又はｐｃＤＦ１００とそれぞれ名付けられる。

（１．ＦＳＡポリペプチド（ｐｅｐ６６、ｐｅｐ１００）及びそのコードされる遺伝子の合成）
本発明者らは、Ｅｐｉｔｌｏｔソフトウエアを使用して、ＦＳＡのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、ならびに、化学合成されたペプチドのｐｅｐ６６及びｐｅｐ１００のアミノ酸配列を確認した。新たに合成された遺伝子及びタンパク質産物の配列を下記に示す：
ペプチド６６〜８０：ＱＥＫＥＫＣＭＫＦＣＫＫＶＣＫ（配列番号２２）（これはｐｅｐ６６と呼ばれる）；
ペプチド１００〜１１４：ＧＰＤＷＫＶＳＫＥＣＫＤＰＮＮ（配列番号２３）（これはｐｅｐ１００と呼ばれる）。

ｐｅｐ６６及びｐｅｐ１００をコードするヌクレオチド配列がＦＡＤ６６及びＦＡＤ１００とそれぞれ名付けられている。これらのヌクレオチド配列は下記の配列を含む：
ＦＡＤ６６：ＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧ ＡＡＡＡＡＴＧＴＡＴ ＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣ ＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴ ＧＣＡＡＡ（配列番号２４）、
ＦＡＤ１００：ＧＧＴＣＣＴＧＡＴＴ ＧＧＡＡＡＧＴＡＡＧ ＣＡＡＡＧＡＡＴＧＣ ＡＡＡＧＡＴＣＣＣＡ ＡＴＡＡＣ（配列番号２５）。

（２．ＦＡＤ６６発現ベクター及びＦＡＤ１００発現ベクターの構築）
発現ベクターｐＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ）をテンプレートとして購入した。本発明者らは、ＦＳＡヌクレオチド配列を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子により標識するためにＦＳＡヌクレオチド配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行った。プライマー伸張を、Ｐ６６Ｆプライマー及びＰＲプライマー、ならびに、Ｐ１００Ｆプライマー及びＰＲプライマーの使用によって完了した。クローニング方法で使用されたプライマーについての配列は下記の通りである：
Ｐ６６Ｆ：５’−ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡ ＴＧＣＡＡＧＡＧＡＡ ＡＧＡＡＡＡＡＴＧＴ ＡＴＧＡＡＡＴＴＴＴ ＧＣＡＡＡＡＡＡＧＴ ＴＴＧＣＡＡＡＧＧＴＡＣＣ ＧＣＣＡＴＧＧ ＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧ ＣＧＡＧＧＡ−３’（配列番号２６）
（前記配列における増幅産物の５’末端から１３番目の部位〜５７番目の部位の塩基群がＦＡＤ６６である；増幅産物の５’末端から５８番目の部位〜６３番目の部位の塩基群がＫｐｎＩ認識部位である；増幅産物の５’末端から１番目〜６番目の塩基ヌクレオチドがＨｉｎｄＩＩＩ認識部位である）；
ＰＲ：５’−ＴＴＡ ＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣ ＴＴＧＴＡＣ ＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２７）
（前記配列における増幅産物の５’末端から４番目の部位〜９番目の部位の塩基群がＫｐｎＩ認識部位である）、
Ｐ１００Ｆ：５’−ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡ ＴＧ ＧＧＴＣＣＴＧＡ ＴＴＧＧＡＡＡＧＴＡ ＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴ ＧＣＡＡＡＧＡＴＣＣ ＣＡＡＴＡＡＣＧＧＴ ＡＣＣ ＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ−３’（配列番号２８）
（前記配列における増幅産物の５’末端から１３番目の部位〜５７番目の部位の塩基群がＦＡＤ６６である；増幅産物の５’末端から５８番目の部位〜６３番目の部位の塩基群がＫｐｎＩ認識部位である；前記配列における増幅産物の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＨｉｎｄＩＩＩ認識部位である）、
ＰＲ：５’−ＴＴＡ ＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣ ＴＴＧＴＡＣ ＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２７）
（増幅産物の５’末端から４番目の部位〜９番目の部位の塩基群がＫｐｎＩ認識部位である）。
ＰＣＲ産物及び真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen Corp.、Carlsbad、CA、U.S.A.）を、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用して消化した。Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを使用して増幅産物をプラスミドに連結し、その後、大腸菌Ｔｏｐ１０に形質転換した。大腸菌をインキュベーターで成長させた後、プラスミドＤＮＡを抽出し、ＫｐｎＩを使用して制限消化を行って、陽性クローンを得た。陽性クローンは、ＦＡＤ６６遺伝子及びＧＦＰ遺伝子を含有するプラスミドｐｃＤＦ６６−ＧＦＰ、ならびに、ＦＡＤ１００遺伝子及びＧＦＰ遺伝子を含有するプラスミドｐｃＤＦ１００−ＧＦＰを含んでいた。ｐｃＤＦ６６−ＧＦＰ及びｐｃＤＦ１００−ＧＦＰをＫｐｎＩ消化のために使用した後、低融点アガロースゲルでの電気泳動を使用して、大きいフラグメントを回収した。その後、自己結合を行う。最後に、産物を大腸菌Ｔｏｐ１０に形質転換し、プラスミドを抽出し、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩによる消化アッセイを使用して、陽性クローンを得る。得られたクローンはＦＡＤ６６発現ベクターのｐｃＤＦ６６及びＦＡＤ１００発現ベクターのｐｃＤＦ１００を含んでいた。

正常なサル腎臓細胞（ＣＶ１細胞）（Institute of Cell Biology(Shanghai)から購入）を、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭにおいて５％ＣＯ₂及び３７℃の下で培養した。ｐｃＤＦ６６−ＧＦＰ及びｐｃＤＦ１００−ＧＦＰのトランスフェクションを２．５ｘ１０⁵細胞／ｍｌ及び２ｍｌ／デッシュにより３５ｍｍの培養皿においてＣＶ１細胞に対して行った。プラスミドの精製を、Guidebook for Molecular Cloning Experimentation（第３版）（中国語翻訳）（Ｈｕａｎｇ Ｐｅｉｔａｎｇ他による翻訳、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、２００２年９月発行）に記載の方法に従って行った。陽イオンリポソーム培地（Lipofectamine^TM2000、Invitrogen）を使用して、ＣＶ１細胞を製造者（Invitrogen、CA、USA）の説明書に従ってトランスフェクションし、培養した。２４時間のインキュベーションの後、細胞培養物を、ｐｃＤＦ１００−ＧＦＰ及びｐｃＤＦ６６−ＧＦＰが真核細胞において発現したことを示す蛍光顕微鏡観察により観察する。結果から、ｐｃＤＦ１００−ＧＦＰ及びｐｃＤＦ６６−ＧＦＰもまた真核細胞において発現し得ることが証明される。

（実施例２．ノミアレルギー皮膚炎のための治療としてのノミアレルギー皮膚炎抑制剤）
Ｋｕｎｍｉｎｇ白マウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスが、ＦＳＡタンパク質と、ＦＳＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含むベクター、又は、そのタンパク質により免疫化される実験では、免疫化がノミアレルギー皮膚炎のための効果的な治療であることが証明される。免疫化のための有用なベクターは、ＦＳＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む真核細胞発現ベクター（例えば、ｐｃＤＦ６６又はｐｃＤＦ１００）と、ＦＳＡの合成ペプチド（ｐｅｐ６６又はｐｅｐ１００）又はＦＳＡタンパク質（ノミの唾液アレルゲンタンパク質）のいずれかとを含むことができる。免疫化効果は、ＦＳＡペプチド又はＦＳＡタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含んでいた真核細胞発現ベクターを単に含む免疫化ベクターの免疫化効果よりも優れている。抑制研究では、異なるエピトープをコードするＤＮＡ配列が異なる効果を有することが証明される。例えば、ＦＡＤ１００の方が、ノミアレルギー皮膚炎を抑制することにおいて強い治療効果を有すると考えられる。個々のマウス系統における結果は類似していた。このことは、免疫化の免疫抑制活性がＭＨＣの遺伝的背景に制限されないことを示している。従って、本発明者らは、ＦＳＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む真核細胞発現ベクターと、ＦＳＡタンパク質又はＦＳＡペプチドのいずれかとを含むＦＡＤ抑制剤の使用により、ノミアレルギー皮膚炎を効果的に抑制することが可能であると、上記の結果から直接に推論することができる。

Ｔ細胞増殖実験及び関連したサイトカイン拡大実験では、ＦＳＡタンパク質をコードする真核細胞発現ベクターと、ＦＳＡタンパク質又はＦＳＡペプチドとを含むＦＡＤ抑制剤が、抗原特異的なＴ細胞の増殖を抑制し、それにより、アレルギー反応を抑制することが証明される。免疫抑制をＩＬ−１０により誘導することができ、従って、これにより、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及び他のサイトカインの発現レベルを抑制することができる。本発明におけるＦＡＤ抑制剤は、ノミアレルギー皮膚炎（特に、Ctenocephalides felisによって引き起こされるそのような事例）を効果的に防止及び／又は処置することができる。

（１．Ｋｕｎｍｉｎｇ白マウスでの実験）
３６０匹のメスのＫｕｎｍｉｎｇ白マウスを等しい数の合計で１２の群に分けた。第１群の各マウスを、１００マイクログラムのｐｃＤＦ６６を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。第２群の各マウスを、１００マイクログラムのｐｅｐ６６を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。第３群の各マウスを、５０マイクログラムのｐｃＤＦ６６及び５０マイクログラムのｐｅｐ６６を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。第４群の各マウスを、１００マイクログラムのｐｃＤＦ１００を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。第５群の各マウスを、１００マイクログラムのｐｅｐ１００を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。第６群の各マウスを、５０マイクログラムのｐｃＤＦ１００及び５０マイクログラムのｐｅｐ１００を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。第７群の各マウスを、５０マイクログラムのｐｃＤＦ６６及び５０マイクログラムのｐｅｐ１００を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。第８群の各マウスを、５０マイクログラムのｐｃＤＦ１００及び５０マイクログラムのｐｅｐ６６を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。第９群の各マウスを、１００マイクログラムの不活性化されたノミ抗原（Greer Lab Company（North Carolina、合衆国）から購入）を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。第１０群の各マウスを、５０マイクログラムの不活性化されたノミ抗原（Greer Lab Company（North Carolina、合衆国）から購入）及び５０マイクログラムのｐｃＤＦ６６を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。第１１群の各マウスを、５０マイクログラムの不活性化されたノミ抗原（Greer Lab Company（North Carolina、合衆国）から購入）及び５０マイクログラムのｐｃＤＦ１００を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。第１２群の各マウスを、対照として役立たせるために、１００マイクログラムのｐｃＤＮＡ３を含有する１００マイクロリットルの０．９％ＮａＣｌ水溶液により免疫化した。最初の免疫化の後１４日目に、ブースター免疫を同じ投薬量で行った。ブースター免疫の後７日目に、皮膚試験を、下記の方法を使用して行った。

腹側のマウス胸腔から毛を除き、１μｇ／ｕｌのＦＳＡタンパク質の３０μｌの接種物の皮下注射を１０匹の被験体に注射した。同時に、ヒスタミン溶液（０．０１％ヒスタミンの濃度）及びＰＢＳを、陽性対照及び陰性対照として役立たせるために、等しい量で注射した。１０匹の被験体がそれぞれの対照群について存在した。それぞれの注射の後２０分で、本発明者らは水疱の直径をマイクロメーターで測定した。ｔ検定の結果から、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ１００による複合免疫法（第６群）が、ｐｃＤＦ１００による単独免疫法（第４群）又はｐｅｐ１００による単独免疫法（第５群）と比較したとき、顕著な相違（ｐ＜０．０５）を有することを明らかにしたことを示した。顕著な相違（ｐ＜０．０５）が、ｐｃＤＦ６６及びｐｅｐ６６による複合免疫法（第３群）と、ｐｃＤＦ６６による単独免疫法（第１群）との間で認められ、一方、ｐｅｐ６６による単独免疫法（第２群）に関しては顕著な相違がなかった。ノミ抗原及びｐｃＤＦ６６（第１０群）又はｐｃＤＦ１００（第１１群）による複合免疫法は、ノミ抗原単独（第９群）によって生じた結果と顕著に異なった（ｐ＜０．０５）。第１０群及び第１１群は、ｐｃＤＦ６６による免疫化（第１群）又はｐｃＤＦ１００による免疫化（第４群）と比較したとき、何ら顕著な相違を示さなかった。発現ベクター又はエピトープポリペプチドによる単独免疫群（群１、群２、群３及び群４）と比較したとき、第６群及び第７群において測定された水疱の直径には相違がなかった。

前記の皮膚試験結果に基づいて、本発明者らは、ＦＳＡタンパク質、又は、ＦＳＡペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクター、及び、前記ＦＳＡペプチド、あるいは、ＦＳＡタンパク質、又は、ＦＳＡペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクター、及び、ＦＳＡタンパク質は、抗原特異的な方法で皮膚アレルギーを軽減すると結論することができる。これらの結果は、皮膚におけるアレルギー反応の軽減が免疫抑制によって誘導されるかもしれないことを示している。

（２．ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７Ｂ／６マウスでの皮膚試験結果）
Ｋｕｎｍｉｎｇ白マウスにより上記で得られた結果をさらに確認するために、マウスの２つの純系（ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７Ｂ／６）を、ＦＡＤの免疫抑制がＭＨＣ制限であったかどうかを判定するために試験した。実験方法は、Ｋｕｎｍｉｎｇ白マウスで行われた方法と同じであった。ｔ検定の結果から、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ１００による免疫化（第６群）は、ｐｃＤＦ１００による単独免疫法（第４群）又はｐｅｐ１００による単独免疫法（第５群）と比較したとき、顕著な相違を有していなかったこと（Ｐ＜０．０５）が示される。ノミ抗原及びｐｃＤＦ１００による複合免疫法（第１１群）から得られた結果は、ノミ抗原の免疫化（第９群）又はｐｃＤＦ１００の免疫化（第４群）によって得られた結果と比較したとき、非常に著しい相違（Ｐ＜０．０１）を明らかにした。ノミ抗原及びｐｃＤＦ６６による免疫化（第１０群）、ノミ抗原による免疫化単独（第９群）又はｐｃＤＦ６６による免疫化単独（第１群）の免疫化の間には著しい相違がなかった。ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ６６による免疫化（第８群）、ｐｃＤＦ１００による免疫化単独（第４群）又はｐｅｐ６６による免疫化単独（第２群）の間には著しい相違がなかった。

前記の結果は、抗アレルギー性の免疫抑制が抗原特異的であることを示している。例えば、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ１００による免疫化は、ｐｃＤＦ１００単独又はｐｅｐ１００単独による免疫化と比較したとき、より効果的であった。ノミ抗原及びｐｃＤＦ１００による免疫化は、１つの成分のみを含んでいたどの免疫化ベクターよりも効果的であった。

相違はまた、ＦＡＤを効果的に処置したそのような群の間での免疫抑制のレベルにおいても存在する。例えば、ノミ抗原及びｐｃＤＦ１００による複合免疫群は、単独免疫群のいずれよりも効果的な免疫抑制効果を有した。ｔ検定の結果から、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ１００による複合免疫性（第６群）は、ｐｃＤＦ１００を単独で使用する免疫化（第４群）又はｐｅｐ１００を単独で使用する免疫化（第５群）の結果と比較したとき、著しく異なること（Ｐ＜０．０５）が示される。著しい相違が、ｐｃＤＦ１００単独（第４群）又はｐｅｐ６６単独（第２群）と比較したとき、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ６６による複合免疫性（第８群）により行われた免疫化の免疫抑制効果において認められる（Ｐ＜０．０５）。極めて著しい相違（Ｐ＜０．０１）が、ノミ抗原単独（第９群）又はｐｃＤＦ１００単独（第４群）と比較したとき、ノミ抗原及びｐｃＤＦ１００を使用する免疫化（第１１群）において認められた。

本発明者らは、これらの結果を解釈して、抗アレルギー性の免疫抑制が抗原特異的であると結論する。例えば、免疫化は、ｐｃＤＦ１００による単独免疫群又はｐｅｐ１００による単独免疫群と比較したとき、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ１００による複合免疫群ではより効果的であった。加えて、ｐｅｐ６６ペプチド及びｐｅｐ１００ペプチドは交差反応性を有し得る。例えば、免疫化は、ｐｃＤＦ１００による単独免疫群又はｐｅｐ６６による単独免疫群と比較したとき、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ６６による免疫化の場合はより効果的であった。ノミ抗原及びｐｃＤＦ６６による複合免疫性を使用する免疫化は明らかな免疫抑制をもたらさなかった。これらの結果は、ＢＡＬＢ／ｃ群で得られた結果と一致している。免疫化の有効性におけるわずかな相違が、調べられたマウスのそれぞれの系統の間で認められるが、これら３つの異なるマウス系統の実験結果は同じ結論である。ＦＳＡタンパク質、又は、ＦＳＡペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む真核細胞発現ベクターと、ＦＳＡペプチドとを含む免疫化ベクター、あるいは、ＦＳＡタンパク質、又は、ＦＳＡペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクターと、ＦＳＡタンパク質とを含む免疫化ベクターは、効果的な抗アレルギー性の免疫抑制を開始させることができる。

（実施例３．免疫化されたマウスにおけるＴ細胞の増殖）
３６０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス及び３６０匹のＣ５７Ｂ／６マウスをそれぞれ、群あたり３０匹の１２の群に分けた。免疫化を、実施例２に記載している方法に従って行った。ブースター免疫後７日目に、脾臓のＴ細胞を単離し、Ｔ細胞の増殖活性を調べた。具体的な方法は下記の通りであった。無菌条件下、脾細胞をマウスから採取し、単一細胞懸濁物液を形成するために使用した。溶血溶液を使用して、赤血球を除き、その後、赤血球を、ＰＢＳ液を使用して３回洗浄した。細胞を遠心分離し、細胞数を計数した。細胞密度を１ｘ１０⁶細胞／ｍｌに調節し、それぞれの動物から得られたそれぞれの細胞懸濁物を４つの実験群に分割し、９６ウエル培養プレートにまいた。１つの群には、１００μｌのＣｏｎ−Ａ（有糸分裂促進因子）を５μｇ／ｍｌの最終濃度に加えた。特異的な抗原（ノミ抗原）を、刺激因子として働かせるために、第２の群に５μｇ／ｍｌの最終濃度に加えた。陰性対照群については刺激因子を何ら加えず、１００μｌのＢＳＡを、別の非関連の抗原として働かせるために、２μｇ／ｍｌの最終濃度に加えた。ＣＯ₂培養器において３７℃で４８時間インキュベーションした後、１００μｌのＭＴＳを５ｍｇ／ｍｌの最終濃度でそれぞれのウエルに加えた。４時間のインキュベーションの後、酵素標識（labelaer）を使用して、４９２ｎｍにおけるＯＤ値を読み取り、刺激指数（ＳＩ＝試験後ＯＤ÷非刺激ＯＤ）を計算した。ＢＡＬＢ／ｃマウスについてのＴ細胞増殖の結果は、ノミ唾液のＦＳＡペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクター、及び、前記ＦＳＡペプチドにより、ＦＡＤの顕著な抗原特異的な免疫抑制が生じることを示した。例えば、免疫化は、１つだけの成分を含むベクターによる免疫化と比較したとき、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ１００を含むベクター（第６群）、ならびに、ノミ抗原及びｐｃＤＦ１００を含むベクター（第１１群）からはより効果的であった。加えて、明らかな免疫抑制は、対応する単独免疫群と比較したとき、ｐｃＤＦ６６及びｐｅｐ６６を含む免疫化ベクターによる群（第３群）、ノミ抗原及びｐｃＤＦ６６を含む免疫化ベクターによる群（第１０群）によっては証明されなかった。ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ１００による複合免疫群を含むベクター、ならびに、ノミ抗原及びｐｃＤＦ１００による複合免疫群を含むベクターを使用する結果は、皮膚試験によって示された免疫抑制効果と一致している。極めて著しい相違（Ｐ＜０．０１）が、対応する単独免疫群において見られる免疫抑制効果と比較したとき、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ６６を含む免疫化ベクター（第８群）の免疫抑制効果において認められた。

Ｃ５７Ｂ／６のＴ細胞増殖の結果は、ＦＳＡペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する真核細胞発現ベクター、及び、前記ＦＳＡペプチドにより、明らかな抗原特異的な免疫抑制がもたらされ得ることを示している。例えば、明らかな相違（Ｐ＜０．０５）が、対応する単独免疫群（第１群及び第２群）と比較したとき、ｐｃＤＦ６６及びｐｅｐ６６による複合免疫性（第３群）の免疫化の効果において認められる。加えて、極めて著しい相違（Ｐ＜０．０１）が、対応する単独免疫群（第４群及び第５群）と比較したとき、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ１００による複合免疫性（第６群）における免疫化の効果において認められた。ノミ抗原及びｐｃＤＦ６６を含むベクターを使用するマウスの免疫化（第１０群）は、対応する単独免疫群（第９群及び第１群）よりも明らかに効果的である（Ｐ＜０．０５）。極めて著しい相違（Ｐ＜０．０１）が、対応する単独免疫群（第９群及び第４群）と比較したとき、ノミ抗原及びｐｃＤＦ１００による複合免疫群（第１１群）の免疫化の効果において認められた。加えて、交差反応がこれら２つのエピトープの間に存在する。例えば、明らかな相違（Ｐ＜０．０５）が、ｐｃＤＦ６６及びｐｅｐ１００による複合免疫群（第７群）、ならびに、対応する単独免疫群（第１群及び第５群）に関してＴ細胞の増殖プロフィルにおいて認められる。明らかな相違（Ｐ＜０．０５）がまた、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ６６による複合免疫群（第８群）、ならびに、対応する単独免疫群（第４群及び第２群）のＴ細胞の増殖プロフィルにおいて認められる。ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ１００による複合免疫群、ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ６６による複合免疫群、ならびに、ノミ抗原及びｐｃＤＦ１００による複合免疫群におけるＴ細胞の増殖プロフィルはすべてが皮膚試験の結果と一致していた。

（実施例４．免疫化されたマウスのサイトカインレベルにおける変化）
３６０匹のＫｕｎｍｉｎｇ白マウス、３６０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス及び３６０匹のＣ５７Ｂ／６マウスを用い、被験体系統のそれぞれの組を、３０匹のマウスからなる１２の群に分けた。免疫化を、実施例２に記載している方法に従って行った。ブースター免疫後７日目に、脾臓を切除し、総ＲＮＡ（TRIZOL、Dingguo Biological Company）を単離した。ｃＤＮＡのための逆転写を、Dalianbao Biological CompanyのＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ操作ハンドブックに従って行った。簡潔に述べると、１μｇの精製された総ＲＮＡを２５０μＬの遠心分離チューブに入れた。その後、下記の試薬を順に加えた。４μｌのＭｇＣｌ₂、２μｌの１０ｘ緩衝液溶液、８．５μｌのＤＥＰＣ水、２μｌのｄＮＴＰ混合物、０．５μｌのＲＮａｓｅ抑制剤、０．５μｌのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．５μｌのオリゴ（ｄＴ）₁₂プライマー。応答条件は、４２℃で３０分間、９９℃で５分間及び５℃で５分間であった。遺伝子ファミリーのヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を供給源の内部発現標準物として使用した。様々な群のｃＤＮＡ濃度を調節して、すべてのサンプル濃度を一定にした。その後、２μｌのｃＤＮＡを使用して、３つのサイトカイン遺伝子（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０）の発現レベルを評価するＰＣＲ増幅を行った。反応に必要とされるプライマー及びＰＣＲ反応条件は、表１に示す通りである。（遺伝子ファミリーＨＰＲＴは、インビボでは一定した発現を有するので、対照の供給源の内部発現標準物のためのテンプレートとして使用される）。

Ｂｉｏ−Ｒａｄ画像ソフトウエア（Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ４．２．０）を使用して、ＰＣＲ産物の電気泳動ゲルの得られた画像を分析した。得られた発現プロフィルの結果は一般的に、マウスのそれぞれの系統において一致していた。ｐｃＤＦ６６及びｐｅｐ６６による複合免疫性（群３）におけるＩＬ−１０の発現レベルは、ｐｃＤＦ６６による単独免疫性（群１）及びｐｅｐ６６による単独免疫性（群２）よりも高かった。ｐｃＤＦ１００及びｐｅｐ１００による複合免疫性（群６）におけるＩＬ−１０の発現レベルは、ｐｃＤＦ１００による単独免疫群（群４）又はｐｅｐ１００による単独免疫群（群５）よりも高かった。ノミ抗原及びｐｃＤＦ６６による複合免疫群（群１０）におけるＩＬ−１０の発現レベルは、ノミ抗原による単独免疫性（群９）又はｐｃＤＦ６６による単独免疫性（群１）よりも高かった。ノミ抗原及びｐｃＤＦ６６による複合免疫群（群１１）におけるＩＬ−１０の発現レベルは、ノミ抗原による単独免疫性（群９）又はｐｃＤＦ１００による単独免疫性（群４）よりも高かった。ＩＬ−４及びＩＦＮ−γの発現レベルにおける明らかな相違が様々な群の間にはなかった。これらの結果から、ＦＳＡをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクター、及び、前記ＦＳＡタンパク質又は前記ＦＳＡペプチド化合物により行われた免疫化はＩＬ−１０の発現レベルを高めたことが示唆される。

加えて、発現プロフィルがこれら３タイプのマウスにおいてＩＬ−５及びＩＬ−１３について得られた。結果から、ＦＳＡペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクター、及び、前記ＦＳＡタンパク質又はＦＳＡペプチドについて（群３、群６、群１０及び群１１）、ＩＬ−５及びＩＬ−１３のレベルがそれぞれの単独免疫群のレベルよりも明らかに低かったことが示された。

（実施例５．免疫化されたマウスにおける血中ＩｇＥレベルの検出）
３６０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス及び３６０匹のＣ５７Ｂ／６マウスの２つの群をそれぞれ、それぞれが３０匹の１２の群に分け、免疫化を実施例２に記載しているように行った。血液を、免疫化前、及び、ブースター免疫の後１４日目に眼窩から静脈内採取した。血液を遠心分離によって分離し、ＩｇＥレベルを、ＥＬＩＳＡを使用して評価した。ＥＬＩＳＡプレートで使用された被覆抗原は、Greer Laboratory（Lenoir、North Carolina、合衆国）から購入したノミ抗原であった。ＥＬＩＳＡプレートにおける第１の成分は分離血清であり、結合のために使用された第２の成分は、西洋ワサビペルオキシダーゼ抗酸化酵素により標識されたヒツジ抗マウスＩｇＥ抗体であった。抗体を抗原に結合させた後で基質を系に加え、酵素標識を使用して、４９２ｎｍにおけるＯＤ値を読み取った。免疫化後のＫｕｎｍｉｎｇ白マウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７Ｂ／６マウスにおけるＩｇＥ産生は大まかには３つすべてのマウス群について一致している。ノミ抗原による単独免疫群（第９群）を除いて、各群についてのＩｇＥレベルは比較的低かった。ノミ抗原による単独免疫群（第９群）による免疫化の後に産生されたＩｇＥレベルはすべてのマウス組にわたって最も高いレベルであった。ＩｇＥレベルが、ノミ抗原による単独免疫群（第９群）と比較した場合、ノミ抗原及びｐｃＤＦ６６により免疫化された群（第１０群）、ならびに、ノミ抗原及びｐｃＤＦ１００により免疫化された群（第１１群）では大きく低下した。このことは、ＦＳＡペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクター、及び、前記ＦＳＡタンパク質により、ＩｇＥレベルが免疫化後に低下することを示している。

（実施例６．ネコアレルゲンタンパク質抗原Ｆｅ１ ｄ．Ｉ．１（小さいＢリーダーを伴うＦｅ１ ｄＩ）のコードされた遺伝子クローン及び真核生物発現アッセイ）
１．下記の配列をＦｅ１ ｄＩ．１プライマーとして使用した。プライマーを人工的に合成した：
（ａ）Ｆｅ１ ｄＩ．１ Ｐ１ ５’プライマー：ＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＴＴＡＧＡＣＧＣ（配列番号３７）
（ｂ）Ｆｅ１ ｄＩ．１ Ｐ２ ３’プライマー：ＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣ（配列番号３８）

（２．Ｆｅ１ ｄＩ．１発現ベクターの構築）
Ｆｅ１ ｄＩ．１のｃＤＮＡを、Ｆｅ１ ｄＩ．１ Ｐ１及びＦｅ１ ｄＩ．１ Ｐ２を使用してＦｅ１ ｄＩ．１遺伝子をＰＣＲ増幅するためのテンプレートとして使用した。これらのプライマーは下記にさらに記載している：
（ａ）Ｆｅ１ ｄＩ．１ Ｐ１ ５’−ＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＴＴＡＧＡＣＧＣ−３’（配列番号３７）
（この配列におけるプライマーの５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位である；９番目の部位〜１１番目の部位が元の開始コードである）；
（ｂ）Ｆｅ１ ｄＩ．１ Ｐ２ ５’−ＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣ−３’（配列番号３８）
（この配列におけるプライマーの５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＫｐｎＩの認識部位である；７番目の部位〜９番目の部位が元の終止コードである）。

ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを、ＰＣＲ産物及び真核生物発現ベクターｐＶＡＸ１（Invitrogen Corp.）を消化するためにそれぞれ使用した。その後、消化されたヌクレオチドフラグメントを、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。得られたプラスミド産物を大腸菌Ｔｏｐ１０に形質転換し、最大コピー数のために成長させ、その後、プラスミドを、当業者によって知られている方法を使用して単離した。本発明者らは、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩのエンドヌクレアーゼを使用して制限消化を行った。ｐＶＡＸ１−Ｆｅ１ ｄＩ．１と名付けられる選択されたプラスミドクローンは、ｐＶａｘプラスミド配列及びＦｅ１ ｄＩ．１遺伝子を含んでいた。連続した分析（Augct Co.Ltd.、Beijing、中国）によって、さらなる分析を行って、最終的なＦｅ１ ｄＩ．１ Ｐ１発現ベクターのｐＦｅ１ｄＩ．１を得た。

（３．ｐＦｅ１ｄＩ．１の真核生物発現）
正常なサル腎臓細胞（ＣＶ１細胞、Shanghai Cell Instituteから購入）を、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭにおいて５％ＣＯ₂及び３７℃の条件の下で培養した。２．５ｘ１０⁵細胞／ｍｌを２ｍＬの体積で３５ｍｍ培養皿にピペットで入れた。トランスフェクションを、標準的な方法を使用して行った。簡潔に述べると、プラスミドの精製を、Guidebook for Molecular Cloning Experimentation（第３版、中国語翻訳）（Ｈｕａｎｇ Ｐｅｉｔａｎｇ他による翻訳、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、２００２年９月発行）の方法に従って行った。陽イオンリポソーム培地（Lipofectamine^TM2000、Invitrogen）を使用して、培養されたＣＶ１細胞を製造者の説明書（Invitrogen、CA、USA）に従ってトランスフェクションした。２４時間のトランスフェクションの後、細胞を採取し、ＲＮＡ抽出試薬（（TRIZOL、Dingguo Biological Company）を使用して、総細胞ＲＮＡを単離した。混入を防止するために、総抽出ＲＮＡを別々に数個のＥＰチューブに入れた。マイクロピペットを使用して、総細胞ｃＤＮＡを拡大するために使用される２ｕｌの抽出された総ＲＮＡ及びＲＴ−ＰＣＲ試薬を注意深く吸引した。試料を加えた後、逆転写を４２℃で３０分間〜６０分間行い、変性を９９℃で５分間行った。反応チューブを、使用のための抽出に先立って、５℃で５分間傍らに置いた。単離したｃＤＮＡを遺伝子増幅のためのテンプレートとして使用して、ＰＣＲを、Ｆｅ１ｄＩ．１Ｐ１及びＦｅ１ｄＩ．１Ｐ２をプライマーとして使用して行った。ＰＣＲ産物を低融点アガロースゲル分析に供して、Ｆｅ１ｄＩ．１の陽性バンドを検出した。結果は、Ｆｅ１ｄＩ．１が真核細胞において発現することを明らかにする。

（実施例７．ネコアレルゲンタンパク質抗原Ｆｅ１ ｄ．Ｉ．２の遺伝子クローン及び真核生物発現アッセイ）

１．下記の配列をＦｅ１ ｄＩ．２プライマーとして使用した。プライマーを人工的に合成した：
（ａ）Ｆｅ１ ｄＩ．２ Ｐ１ ５’プライマー：ＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＧＧＣＴＣ（配列番号３９）
（ｂ）Ｆｅ１ ｄＩ．２ Ｐ２ ３’プライマー：ＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣ（配列番号４０）

（２．Ｆｅ１ ｄＩ．２発現ベクターの構築）
Ｆｅ１ ｄＩ．２のｃＤＮＡを、Ｆｅ１ ｄＩ．２ Ｐ１プライマー及びＦｅ１ ｄＩ．２ Ｐ２プライマーを使用するＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用して、Ｆｅ１ ｄＩ．２遺伝子の複製を作製した。これらのプライマーは下記にさらに記載している：
（ａ）Ｆｅ１ ｄＩ．２ Ｐ１ ５’−ＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＧＧＣＴＣ−３’（配列番号３９）
（プライマーの５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位である；プライマーの末端から９番目の部位〜１１番目の部位が元の開始コードである）；
（ｂ）Ｆｅ１ ｄＩ．２ Ｐ２ ５’−ＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣ−３’（配列番号４０）
（プライマーの５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＫｐｎＩの認識部位である；プライマーの末端から７番目の部位〜９番目の部位が元の終止コードである）。

ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを連続して、ＰＣＲ産物及び真核生物発現ベクターｐＶＡＸ１（Invitrogen Corp.）を消化するために使用した。消化されたプラスミド及びＰＣＲ産物を、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。産物を大腸菌Ｔｏｐ１０に形質転換し、プラスミドを抽出し、制限エンドヌクレアーゼのＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる消化アッセイを行って、陽性クローン（すなわち、Ｃａｎ ｆ１遺伝子を含有するプラスミドｐＶＡＸ−Ｆｅ１ ｄＩ．２）を得た。連続した分析（Augct Co.Ltd.、Beijing、中国）によって、さらなるアッセイ補正を行って、Ｆｅ１ ｄＩ．２発現ベクターのｐＦｅ１ｄＩ．２を得た。

（３．ｐＦｅ１ｄＩ．２の真核生物発現）
ｐＦｅ１ｄＩ．２発現ベクターを、実施例６の第３節において以前に記載している消化プロトコル、形質転換プロトコル、単離プロトコル及び連結プロトコルに供した。単離したＰＣＲ産物を低融点アガロースゲル試験に供して、Ｆｅ１ｄＩ．２の陽性バンドを確認した。結果は、Ｆｅ１ｄＩ．２が真核細胞において発現することを証明する。

（実施例８．イヌアレルゲンタンパク質抗原Ｃａｎ ｆ１の遺伝子クローン及び真核生物発現アッセイ）
（１．Ｃａｎ ｆ１プライマーの合成）
下記の配列をＣａｎ ｆ１プライマーとして使用した。プライマーを人工的に合成した：
Ｃａｎ ｆ１ Ｐ１ ５’プライマー：ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣ（配列番号４１）
Ｃａｎ ｆ１ Ｐ２ ３’プライマー：ＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣ（配列番号４２）

（２．Ｃａｎ ｆ１発現ベクターの構築）
Ｃａｎ ｆ１のｃＤＮＡを、Ｃａｎ ｆ１ Ｐ１プライマー及びＣａｎ ｆ１ Ｐ２プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行うためのテンプレートとして使用して、Ｃａｎ ｆ１遺伝子の複製を作製した。これらのプライマーは下記にさらに記載している：
（ａ）Ｃａｎ ｆ１ Ｐ１ ５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣ−３’（配列番号４１）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位である；プライマー配列の末端から７番目の部位〜９番目の部位が元の開始コードである）；
（ｂ）Ｃａｎ ｆ１ Ｐ２ ５’−ＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣ−３’（配列番号４２）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＫｐｎＩの認識部位である；配列の％’末端から７番目の部位〜９番目の部位が元の終止コードである）。

ＰＣＲフラグメント及びｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）を、実施例７の第２節に記載しているような消化方法、形質転換方法、単離方法及び連結方法に供した。陽性クローンを選択し、実施例７の第２節で説明している連続した分析を使用して分析して、Ｃａｎ ｆ１発現ベクターのｐＣａｎｆ１を得た。

（３．ｐＣａｎｆ１の真核生物発現）
ｐＣａｎｆ１発現ベクターを、実施例６の第３節において以前に記載しているようなトランスフェクションプロトコル、総ＲＮＡ単離プロトコル及びＲＴ−ＰＣＲプロトコルに供した。単離したＰＣＲ産物を低融点アガロースゲル試験に供して、ｐＣａｎｆ１の陽性バンドを確認した。結果は、ｐＣａｎｆ１が真核細胞において発現することを証明する。

（実施例９．イヌアレルゲンタンパク質抗原Ｃａｎ ｆ２の遺伝子クローン及び真核生物発現アッセイ）

（１．Ｃａｎ ｆ２プライマーの合成）
下記の配列をＣａｎ ｆ２プライマーとして使用した。プライマーを人工的に合成した：
Ｃａｎ ｆ２ Ｐ１ ５’プライマー：ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＴＧＣＴＧ（配列番号４３）
Ｃａｎ ｆ２ Ｐ２ ３’プライマー：ＧＧＴＡＣＣＣＴＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＣ（配列番号４４）

（２．Ｃａｎ ｆ２発現ベクターの構築）
Ｃａｎ ｆ２のＣＤＮＡｃＤＮＡを、Ｃａｎ ｆ２ Ｐ１プライマー及びＣａｎ ｆ２ Ｐ２プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行うためのテンプレートとして使用して、Ｃａｎ ｆ２遺伝子の複製を作製した。これらのプライマーは下記にさらに記載している：
（ａ）Ｃａｎ ｆ２ Ｐ１ ５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号４３）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位である；７番目の部位〜９番目の部位が元の開始コードである）；
（ｂ）Ｃａｎ ｆ２ Ｐ２ ５’−ＧＧＴＡＣＣＣＴＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号４４）
（このプライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＫｐｎＩの認識部位である；７番目の部位〜９番目の部位が元の終止コードである）。

ＰＣＲフラグメント及びｐＶＡＸ１（Invitrogen Inc.）を、実施例７の第２節に記載しているような消化方法、形質転換方法、単離方法及び連結方法に供した。陽性クローンを選択し、実施例７の第２節で説明している連続した分析を使用して分析して、Ｃａｎ ｆ２発現ベクターのｐＣａｎｆ２を得た。

（３．ｐＣａｎｆ２の真核生物発現）
ｐＣａｎｆ２発現ベクターを、実施例６の第３節において以前に記載しているようなトランスフェクションプロトコル、総ＲＮＡ単離プロトコル及びＲＴ−ＰＣＲプロトコルに供した。単離したＰＣＲ産物を低融点アガロースゲル試験に供して、ｐＣａｎｆ２の陽性バンドを確認した。結果は、ｐＣａｎｆ２が真核細胞において発現することを証明する。

（実施例１０．チリダニアレルゲンタンパク質抗原Ｄｅｒ ｐ１の遺伝子クローン及び真核生物発現アッセイ）
（１．Ｄｅｒ ｐ１プライマーの合成）
下記の配列をＤｅｒ ｐ１プライマーとして使用した。プライマーを人工的に合成した：
Ｄｅｒ ｐ１ Ｐ１ ５’プライマー：ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＧＴＴＴＴＧＧ（配列番号４５）
Ｄｅｒ ｐ１ Ｐ２ ３’プライマー：ＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＣＡＴ（配列番号４６）

（２．Ｄｅｒ ｐ１発現ベクターの構築）
Ｄｅｒ ｐ１のｃＤＮＡを、Ｄｅｒ ｐ１ Ｐ１プライマー及びＤｅｒ ｐ１ Ｐ２プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行うためのテンプレートとして使用して、Ｄｅｒ ｐ１遺伝子の複製を作製した。これらのプライマーは下記にさらに記載している：
（ａ）Ｄｅｒ ｐ１ Ｐ１ ５’−ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧ−３’（配列番号４５）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位である；１０番目の部位〜１２番目の部位が元の開始コードである）；
（ｂ）Ｄｅｒ ｐ１ Ｐ２ ５’−ＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＣＡＴ−３’（配列番号４６）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＫｐｎＩの認識部位である；９番目の部位〜１１番目の部位が元の終止コードである）。

ＰＣＲフラグメント及びｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）を、実施例７の第２節に記載しているような消化方法、形質転換方法、単離方法及び連結方法に供した。陽性クローンを選択し、実施例７の第２節で説明している連続した分析を使用して分析して、Ｄｅｒ ｐ１発現ベクターのｐＤｅｒｐ１を得た。

（３．Ｄｅｒ ｐ１の真核生物発現）
ｐＤｅｒｐ１発現ベクターを、実施例６の第３節において以前に記載しているようなトランスフェクションプロトコル、総ＲＮＡ単離プロトコル及びＲＴ−ＰＣＲプロトコルに供した。単離したＰＣＲ産物を低融点アガロースゲル試験に供して、ｐＤｅｒｐ１の陽性バンドを確認した。結果は、ｐＤｅｒｐ１が真核細胞において発現することを証明する。

（実施例１１．ピーナッツアレルゲンタンパク質抗原Ａｒａ ｈＩＩの遺伝子クローン及び真核生物発現アッセイ）
（１．Ａｒａ ｈＩＩプライマーの合成）
下記の配列をＡｒａ ｈＩＩプライマーとして使用した。プライマーを人工的に合成した：
Ａｒａ ｈＩＩ Ｐ１ ５’プライマー：ＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴ（配列番号４７）
Ａｒａ ｈＩＩ Ｐ２ ３’プライマー：ＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＴＡＴＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４８）

（２．Ａｒａ ｈＩＩ発現ベクターの構築）
Ａｒａ ｈＩＩのｃＤＮＡを、Ａｒａ ｈＩＩ Ｐ１プライマー及びＡｒａ ｈＩＩ Ｐ２プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行うためのテンプレートとして使用して、Ａｒａ ｈＩＩ遺伝子の複製を作製した。これらのプライマーは下記にさらに記載している：
（ａ）Ａｒａ ｈＩＩ Ｐ１ ５’−ＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴ−３’（配列番号４７）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位である；１０番目の部位〜１２番目の部位が元の開始コードである）、
Ａｒａ ｈＩＩ Ｐ２ ５’−ＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＴＡＴＣＴＧＴＣＴＣ−３’（配列番号４８）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＫｐｎＩの認識部位である；プライマー配列の５’末端から７番目の部位〜９番目の部位が元の終止コードである）。

ＰＣＲフラグメント及びｐＶＡＸ１（Invitrogen Inc.）を、実施例７の第２節に記載しているような消化方法、形質転換方法、単離方法及び連結方法に供した。陽性クローンを選択し、実施例７の第２節で説明している連続した分析を使用して分析して、Ａｒａ ｈＩＩ発現ベクターのｐＡｒａｈＩＩを得た。

（３．Ａｒａ ｈＩＩの真核生物発現）
ｐＡｒａｈＩＩ発現ベクターを、実施例６の第３節において以前に記載しているようなトランスフェクションプロトコル、総ＲＮＡ単離プロトコル及びＲＴ−ＰＣＲプロトコルに供した。単離したＰＣＲ産物を低融点アガロースゲル試験に供して、ｐＡｒａｈＩＩの陽性バンドを確認した。結果は、ｐＡｒａｈＩＩが真核細胞において発現することを証明する。

（実施例１２．ピーナッツアレルゲンタンパク質抗原Ａｒａ ｈ５の遺伝子クローン及び真核生物発現アッセイ）
（１．Ａｒａ ｈ５プライマーの合成）
下記の配列をＡｒａ ｈ５プライマーとして使用した。プライマーを人工的に合成した：
Ａｒａ ｈ５ Ｐ１ ５’プライマー：ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＡＣ（配列番号４９）
Ａｒａ ｈ５ Ｐ２ ３’プライマー：ＧＧＴＡＣＣＴＡＡＡＧＡＣＣＣＧＴＡＴＣ（配列番号５０）

（２．Ａｒａ ｈ５発現ベクターの構築）
Ａｒａ ｈ５のｃＤＮＡを、Ａｒａ ｈ５ Ｐ１プライマー及びＡｒａ ｈ５ Ｐ２プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行うためのテンプレートとして使用して、Ａｒａ ｈ５遺伝子の複製を作製した。これらのプライマーは下記にさらに記載している：
（ａ）Ａｒａ ｈ５ Ｐ１ ５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＡＣ−３’（配列番号４９）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位である；７番目の部位〜９番目の部位が元の開始コードである）；
（ｂ）Ａｒａ ｈ５ Ｐ２ ５’−ＧＧＴＡＣＣＴＡＡＡＧＡＣＣＣＧＴＡＴＣ−３’（配列番号５０）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＫｐｎＩの認識部位である；プライマー配列の５’末端から７番目の部位〜９番目の部位が元の終止コードである）。

ＰＣＲフラグメント及びｐＶＡＸ１（Invitrogen Inc.）を、実施例７の第２節に記載しているような消化方法、形質転換方法、単離方法及び連結方法に供した。陽性クローンを選択し、実施例７の第２節で説明している連続した分析を使用して分析して、Ａｒａ ｈ５発現ベクターのｐＡｒａｈ５を得た。

（３．ｐＡｒａｈ５の真核生物発現）
ｐＡｒａｈ５発現ベクターを、実施例６の第３節において以前に記載しているようなトランスフェクションプロトコル、総ＲＮＡ単離プロトコル及びＲＴ−ＰＣＲプロトコルに供した。単離したＰＣＲ産物を低融点アガロースゲル試験に供して、ｐＡｒａｈ５の陽性バンドを確認した。結果は、ｐＡｒａｈ５が真核細胞において発現することを証明する。

（実施例１３．スギ（Cryptomeria japonica）花粉アレルゲンタンパク質抗原Ｃｒｙ ｊ１．１の遺伝子クローン及び真核生物発現アッセイ）
（１．Ｃｒｙ ｊ１．１プライマーの合成）
下記の配列をＣｒｙ ｊ１．１プライマーとして使用した。プライマーを人工的に合成した：
Ｃｒｙ ｊ１．１ Ｐ１ ５’プライマー：ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＣＣＴＴＧＣＴＴＡＴ（配列番号５１）
Ｃｒｙ ｊ１．１ Ｐ２ ３’プライマー：ＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＴＡＧＡＧ（配列番号５２）

（２．Ｃｒｙ ｊ１．１発現ベクターの構築）
Ｃｒｙ ｊ１．１のｃＤＮＡを、Ｃｒｙ ｊ１．１ Ｐ１プライマー及びＣｒｙ ｊ１．１ Ｐ２プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行うためのテンプレートとして使用して、Ｃｒｙ ｊ１．１遺伝子の複製を作製した。これらのプライマーは下記にさらに記載している：
（ａ）Ｃｒｙ ｊ１．１ Ｐ１ ５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＣＣＴＴＧＣＴＴＡＴ−３’（配列番号５１）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位である；７番目の部位〜９番目の部位が元の開始コードである）；
（ｂ）Ｃｒｙ ｊ１．１ Ｐ２ ５’−ＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＴＡＧＡＧ−３’（配列番号５２）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＫｐｎＩの認識部位である；プライマー配列の５’末端から７番目の部位〜９番目の部位が元の終止コードである）。

ＰＣＲフラグメント及びｐＶＡＸ１（Invitrogen Inc.）を、実施例７の第２節に記載しているような消化方法、形質転換方法、単離方法及び連結方法に供した。陽性クローンを選択し、実施例７の第２節で説明している連続した分析を使用して分析して、Ｃｒｙ ｊ１．１発現ベクターのｐＣｒｙｊ１．１を得た。

（３．ｐＣｒｙｊ１．１の真核生物発現）
ｐＣｒｙｊ１．１発現ベクターを、実施例６の第３節において以前に記載しているようなトランスフェクションプロトコル、総ＲＮＡ単離プロトコル及びＲＴ−ＰＣＲプロトコルに供した。単離したＰＣＲ産物を低融点アガロースゲル試験に供して、ｐＣｒｙｊ１．１の陽性バンドを確認した。結果は、Ｃｒｙ ｊ１．１が真核細胞において発現し得ることを証明する。

（実施例１４．スギ（Cryptomeria japonica）花粉アレルゲンタンパク質抗原Ｃｒｙ ｊ１．２の遺伝子クローン及び真核生物発現アッセイ）
（１．Ｃｒｙ ｊ１．２プライマーの合成）
下記の配列をＣｒｙ ｊ１．２プライマーとして使用した。プライマーを人工的に合成した：
Ｃｒｙ ｊ１．２ Ｐ１ ５’プライマー：ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＣＣＴＴＧＣＴＴＡＧ（配列番号５３）
Ｃｒｙ ｊ１．２ Ｐ２ ３’プライマー：ＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＴＡＧＡＧＡＧＡＧ（配列番号５４）

（２．Ｃｒｙ ｊ１．２発現ベクターの構築）
Ｃｒｙ ｊ１．２のｃＤＮＡを、Ｃｒｙ ｊ１．２ Ｐ１プライマー及びＣｒｙ ｊ１．２ Ｐ２プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行うためのテンプレートとして使用して、Ｃｒｙ ｊ１．１遺伝子の複製を作製した。これらのプライマーは下記にさらに記載している：
（ａ）Ｃｒｙ ｊ１．２ Ｐ１ ５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＣＣＴＴＧＣＴＴＡＧ−３’（配列番号５３）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位である；プライマー配列の５’末端から７番目の部位〜９番目の部位が元の開始コードである）；
（ｂ）Ｃｒｙ ｊ１．２ Ｐ２ ５’−ＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＴＡＧＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号５４）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＫｐｎＩの認識部位である；プライマー配列の５’末端から７番目の部位〜９番目の部位が元の終止コードである）。

ＰＣＲフラグメント及びｐＶＡＸ１（Invitrogen Inc.）を、実施例７の第２節に記載しているような消化方法、形質転換方法、単離方法及び連結方法に供した。陽性クローンを選択し、実施例７の第２節で説明している連続した分析を使用して分析して、Ｃｒｙ ｊ１．２発現ベクターのｐＣｒｙｊ１．２を得た。

（３．ｐＣｒｙｊ１．２の真核生物発現）
ｐＣｒｙｊ１．２発現ベクターを、実施例６の第３節において以前に記載しているトランスフェクションプロトコル、総ＲＮＡ単離プロトコル及びＲＴ−ＰＣＲプロトコルに供した。単離したＰＣＲ産物を低融点アガロースゲル試験に供して、ｐＣｒｙｊ１．２の陽性バンドを確認した。結果は、Ｃｒｙ ｊ１．２が真核細胞において発現し得ることを証明する。

（実施例１５．ネッタイタマニクダニアレルゲンタンパク質抗原Ｂｌｏ ｔ５の遺伝子クローン及び真核生物発現アッセイ）
（１．Ｂｌｏ ｔ５プライマーの合成）
下記の配列をＢｌｏ ｔ５プライマーとして使用した。プライマーを人工的に合成した：
Ｂｌｏ ｔ５ Ｐ１ ５’プライマー：ＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣ（配列番号５５）
Ｂｌｏ ｔ５ Ｐ２ ３’プライマー：ＧＧＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＧＧＴ（配列番号５６）

（２．Ｂｌｏ ｔ５発現ベクターの構築）
Ｂｌｏ ｔ５のｃＤＮＡを、Ｂｌｏ ｔ５ Ｐ１プライマー及びＢｌｏ ｔ５ Ｐ２プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行うためのテンプレートとして使用して、Ｂｌｏ ｔ５遺伝子の複製を作製した。これらのプライマーは下記にさらに記載している：
（ａ）Ｂｌｏ ｔ５ Ｐ１ ５’−ＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣ−３’（配列番号５５）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位である；プライマー配列の５’末端から１０番目の部位〜１２番目の部位が元の開始コードである）；
（ｂ）Ｂｌｏ ｔ５ Ｐ２ ５’−ＧＧＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＧＧＴ−３’（配列番号５６）
（プライマー配列の５’末端から１番目の部位〜６番目の部位の塩基群がＫｐｎＩの認識部位である；プライマー配列の５’末端から１２番目の部位〜１４番目の部位が元の終止コードである）。

ＰＣＲフラグメント及びｐＶＡＸ１（Invitrogen Inc.）を、実施例７の第２節に記載しているような消化方法、形質転換方法、単離方法及び連結方法に供した。陽性クローンを選択し、実施例７の第２節で説明している連続した分析を使用して分析して、Ｂｌｏ ｔ５発現ベクターのｐＢｌｏｔ５を得た。

（３．ｐＢｌｏｔ５の真核生物発現）
ｐＢｌｏｔ５発現ベクターを、実施例６の第３節において以前に記載しているようなトランスフェクションプロトコル、総ＲＮＡ単離プロトコル及びＲＴ−ＰＣＲプロトコルに供した。単離したＰＣＲ産物を低融点アガロースゲル試験に供して、ｐＢｌｏｔ５の陽性バンドを確認した。結果は、ｐＢｌｏｔ５が真核細胞において発現し得ることを証明する。

（実施例１６．アレルギー反応を抑制する順応Ｔ調節細胞の誘導：ＤＮＡワクチン及びタンパク質ワクチンの同時免疫化により誘導される部分的に最適なＤＣによるＴ調節細胞の転換）
ノミ抽出物全体は即時的な皮内アレルギー反応をマウスにおいて誘導し、従って、このシステムは、ＡＩＨの改善を目指す免疫治療方法を評価するために使用することができる。ノミ抗原により誘導されるＡＩＨのこの齧歯類モデルを使用した場合、ノミの唾液の特異的な抗原（ＦＳＡ１）をコードするＤＮＡワクチン及びタンパク質ワクチンの同時免疫化により、抗原により誘導される膨疹形成（wheel formation）、高まったＴ細胞増殖、チャレンジ部位へのリンパ球及びマスト細胞の浸潤を含めて、実験的ＡＩＨが改善される。ＡＩＨの改善が、ＣＤ４⁺／ＣＤ２５^-／ＦｏｘＰ３⁺表現型（Ｔｒの特徴）を示す、ノミ抗原特異的なＴ細胞の特定の集団の誘導に直接的に関係づけられた。これらのＴｒはまた、抗原刺激後、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γ及び転写因子Ｔ−ｂｅｔを発現する。これらのＴｒは、ＤＮＡワクチン及びタンパク質ワクチンの同時免疫化によって誘導されるＭＨＣ−ＩＩ⁺／ＣＤ４０^lowのＤＣ集団によって作動させられる。これらの研究により、ＡＩＨの制御における重要な細胞プレーヤーが特定される。これらの細胞調節及びそれらの誘導を利用することにより、アレルギー性障害及び関連障害のための治療を開発するための新規な方向が提供される。

（方法）
組織学的分析。最後の免疫化の後１４日目に、マウスからの皮膚サンプルをマウスのすべての群より採取し、４％パラホルムアルデヒドにおいて固定処理し、パラフィンブロックに包埋した。４ミクロン〜５ミクロンの切片を切断し、シラン被覆された（sylan-coated）ガラス製スライドに載せ、その後、キシレン中で再水和し、アルコール溶液の濃度を低下させながら洗浄した。内因性のペルオキシダーゼ活性を３％過酸化水素によって室温で１０分間ブロッキング処理し、抗原の回復を、スライドを０．０１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）において煮沸することによって達成した。最後に、スライドをヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）により、又は、マスト細胞についてはトルイジンブルーにより染色し、組織変化について光学顕微鏡で分析した。

皮膚試験。最後の免疫化の後１４日目に、マウスを外傷のない側方の胸部皮膚において皮内に１μｇ／ｍｌのノミ唾液抗原によりチャレンジした。ＰＢＳを陰性対照として使用し、ヒスタミンを陽性対照として使用する。皮膚反応の直径を、較正したマイクロメーターを使用することによってチャレンジ後２０分以内に測定した。反応は、注射部位が、陽性対照のチャレンジ及び陰性対照のチャレンジを比較して、注射された直径の和のサイズの半分よりも大きかったときには陽性であると見なした。

Ｔ細胞リコール（recall）応答。免疫化されたマウスから１４日目に単離したＴ細胞を、ＲＰＭＩ−１０／５％ＦＣＳを含有する９６ウエルプレートにおいて三連で５ｘ１０⁴細胞／ウエルで培養し、その後、２０μｇ／ｍｌのノミ唾液抗原により４８時間刺激した。刺激後、細胞増殖を、２０ｐｌのＭＴＳ−ＰＭＳ（Promega、USA）溶液を２時間〜４時間加えた後の比色反応によって評価し、その色濃度をプレートリーダー（Magellan、Tecan Austria GmbH）によって５７０ｎｍで読み取った。

ノミ抗原特異的な抗体の測定。抗ノミのＩｇＧ１イソ型、ＩｇＧ２ａイソ型、ＩｇＧ２ｂイソ型、ＩｇＭイソ型及びＩｇＥイソ型の血清中濃度を、ＥＬＩＳＡによってノミ抗原被覆プレートを使用して、また、特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化ラット抗ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＭ抗体及びＩｇＥ抗体（SouthernBiotech、Birmingham、USA）による検出を使用して測定し、吸光度（４５０ｎｍ）を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Magellan、Tecan Austria GmbH）を使用して測定した。

ＲＴ−ＰＣＲ。総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Promega）を使用して免疫化後１４日目に脾臓及び皮膚組織から単離した。ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲを、５μｌのｃＤＮＡ及び１．０μＭの下記プライマーのそれぞれを用いて５０ｐｌの反応混合物において行った：ＨＰＲＴ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２（３８）。Ｇａｔａ３及びＴ−ｂｅｔの分析のために、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞を単離し、総ＲＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲを、下記のような特異的なプライマー配列を使用して記載している通りに行った。
Ｇａｔｅ３については、５’−ＧＧＡＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＣＣＣＧＡＡＡＣ−３’（フォワード）（配列番号５７）及び５’−ＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＧＡＣＣ−ＡＴＧＣ−３’（リバース）（配列番号５８）；ならびに、
Ｔ−ｂｅｔについては、５’−ＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＡＣＣＣ−３’（フォワード）（配列番号５９）及び５’−ＧＣＧＧＣＡＴＴＴＴＣＴＣＡＧＴＴＧＧＧ−３’（リバース）（配列番号６０）。

ＣＤ４⁺ＣＤ２５”Ｔ細胞の単離及び養子移入。単一脾細胞懸濁物をマウスの脾臓から調製し、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞を、ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔマウスＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺調節Ｔ細胞単離キットを製造者のプロトコル（R&D Systems,Inc.、USA）を使用することによって単離及び精製した。選択された細胞集団の純度は９６％〜９８％であった。精製された細胞（１ｘ１０⁶個／マウス）をＣ５７ＢＬ６マウスの静脈内に養子移入した。

細胞のＣＦＳＥ標識化及び同時培養。Ｃ５７／ＢＬ６マウスから単離したナイーブのＣＤ４⁺Ｔ細胞をＣＦＳＥ（Molecular Probes）により標識した。調節活性のアッセイのために、１ｘ１０４個の、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより誘導された調節Ｔ細胞又は対照Ｔ細胞を、ノミ抗原（１００μｇ／ｍｌ）及び１ｘ１０４個の骨髄由来ＤＣの存在下、４ｘ１０４個の精製され、ＣＦＳＥ標識されたナイーブのＣＤ４⁺Ｔ細胞と同時培養した。一部の培養については、Ｔｒ細胞を、抗ＩＬ−１０抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体又はイソ型対照抗体と１００ｇ／ｍｌで同時培養した。７２時間後、細胞を採取し、標識し、その後、ＣＦＳＥ＋細胞をフローサイトメトリーによる分析のために選択した。

フローサイトメトリー。ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞を単離し、ＣＤ４４、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌに対するＰＥコンジュゲート化抗体（eBioscience、CA、USA）と氷上でインキュベーションした。Ｔ細胞におけるサイトカイン産生及びＦｏｘＰ３発現のフローサイトメトリーを行った。単一細胞懸濁物を動物の脾臓から調製し、Ｆｃ受容体を過剰な抗Ｆｃ（BD PharMingen、USA）によりブロッキング処理した。細胞を氷冷ＰＢＳにより洗浄した。細胞内サイトカイン染色のために、Ｔ細胞を抗ＣＤ２８ｍＡｂ（BD PharMingen、USA）の存在下においてＣｏｎＡ（Sigma-Aldrich）により一晩刺激した。採取した細胞を４％パラホルムアルデヒドにより固定処理し、０．１％サポニン（Sigma-Aldrich）により透過処理した。表面のＣＤ４又は細胞質のＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ又はＦｏｘＰ３を染色するために、適切な濃度のフィコエリトリン標識された抗体（eBioscience、CA、USA）を透過処理された細胞に氷上で３０分間加え、その後、冷ＰＢＳにより２回洗浄した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して処理及びスクリーニングし、データを、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔｐｒｏソフトウエア（ＢＤ）を用いて分析した。

（結果）
ノミ唾液アレルゲン（ＦＳＡ１）が、ネコ及びイヌにおいて認められるアレルギー皮膚炎についての原因の１つとして特定されており、また、関係があるとされている。即時的な皮内のノミ抗原反応性を評価するための皮膚反応又は皮内試験（ＩＤＴ）の程度は、皮内へのノミアレルギーチャレンジによって達成することができる。予想されたように、マウスにノミ抗原を投与することにより、皮内チャレンジ後のナイーブの対照動物と比較したとき、Ｃ５７マウスにおいて、著しい皮膚反応が誘導され（図１ａ）、マスト細胞の活性化が誘導され、同時発生的なＩｇＥ産生が誘導され（図１ｂ）、強いＣＤ４＋Ｔ細胞増殖応答が誘導された（図１ｃ）。このデータから、ＡＩＨに対する新規な治療ストラテジーを評価するためのノミ抗原アレルギーモデルの有用性が証明される。

このモデルを使用して、同時接種のストラテジーが、ノミアレルゲンによるチャレンジの後で動物を即時型過敏症から保護する能力を調べた。Ｃ５７／ＢＬ６マウスを様々な試験ワクチンにより前感作し、動物を、ノミ抽出物により、又は、陽性対照としてのヒスタミンにより、又は、ＰＢＳを陰性対照として使用して皮内にチャレンジした。即時型過敏症反応は、ノミタンパク質全体と混合された、ＦＳＡ１のエピトープ（ａａ１００〜１１４）をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＦ１００）を同時接種する１４日前に免疫化された群（ｐｃＤＦ１００＋Ｆとして示す）においてブロックされた（図２ａ）。認められた抑制がプラスミド骨格のためであったか、又は、むしろ、ＦＳＡ１の別の領域をコードするＤＮＡ構築物に関連したかを判定すること。チャレンジ部位の頑強な（robust）炎症が、ベクター対照＋ノミタンパク質（Ｖ＋Ｆとして示す）、又は、ノミタンパク質と混合された、ａａ６６〜８０でのＦＳＡ１の別の領域をコードするＤＮＡ構築物（ｐＤＦ６６）（ｐｃＤＦ６６＋Ｆとして示す）のいずれかにより免疫化されたマウスにおいて認められた（図２ａ）。本発明者らはまた、ｐｃＤＦ１００により初回免疫刺激され、ノミタンパク質によりブーストされた動物のアレルギー反応の抑制に対するＴｈ１型に向かう宿主の免疫バランスの影響を調べた（ｐｃＤＦ１００→Ｆと示す；図２ａ）。チャレンジ後の重篤な反応が、ｐｃＤＦ１００により初回免疫刺激され、Ｆによりブーストされたマウスにおいて認められた（図２ａ）。このことは、強い免疫応答の誘導がアレルギー反応を悪化させることを示唆する。

組織学的分析では、チャレンジ部位での、Ｆ又はＶ＋Ｆにより免疫化されたマウスの皮膚病変部における白血球及びマスト細胞による浸潤が証明され、これに対して、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスは、炎症性細胞が存在しなかった正常な皮内構造を示した。

次に、本発明者らは、同時接種により誘導される免疫反応のブロッキングが用量依存的であったかを分析した。２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ及び２００μｇの用量でのｐｃＤＦ１００を１００μｇのノミタンパク質とともにそれぞれ同時免疫化した。５０μｇのｐｃＤＦ１００での投薬量は皮内反応を顕著に抑制し、その皮膚反応は１００μｇで最も抑制された。２５μｇの投薬量は、動物が、Ｆ又はＶ＋Ｆ（図２ｂ）又は陽性対照のいずれかが接種された動物において認められた反応と類似する重篤な反応を発症したので、病変部形成に対するごくわずかな影響を示しただけであった。

高いレベルのＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３がアレルギー反応の特徴であり、これらの免疫調節因子がアレルギーの重篤度に関係する。同時接種レジメンに伴うこれらのサイトカインの異なるプロフィルを調べた。Ｆ又はＶ＋Ｆが同時接種されたマウスは、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３についてより高いレベルのｍＲＮＡ発現をもたらし、これに対して、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスは比較的低いレベルのこれらのサイトカインをもたらした。このことは、抗炎症性の免疫調節機能がｐｃＤＦ１００＋Ｆの同時接種に由来したことを示唆する。著しい相違は、同時接種レジメンの中で、ＩＬ−２又はＩＦＮ−γのレベルにおいて何ら見出されず、しかし、ＩＦＮ−γが、ｐｃＤＦ１００により初回免疫刺激され、Ｆによってブーストされたマウスではわずかに高くなった。この結果は、再度ではあるが、同時免疫化によるアレルギー反応の誘導された抑制が、アレルゲン特異的なＴヘルパー細胞による片寄った、Ｔｈ２からＴｈ１への応答に起因しないことを示唆する。

ノミ抗原により誘発されたＩｇＥ媒介のアレルギーは十分に特徴づけられるので、ｐｃＤＦ１００＋Ｆの同時接種が抗ノミの誘導されたＩｇＥ産生を抑制する能力を調べた。血清における抗ノミのＩｇＥ及びＩｇＧのレベルを１４日目、２８日目及び４２日目に測定した。それらのレベルは、Ｖ＋Ｆ又はＦ単独により免疫化された群と比較して、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスではわずかに低下した（図２ｃ）。このことから、同時接種はＩｇＥの産生に影響を及ぼさないことが示唆される。

増殖性のＣＤ４⁺Ｔ細胞は、即時型過敏症の発症に関与することが知られている。Ｆ、Ｖ＋Ｆ、又は、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスの脾臓からの単離したＣＤ４⁺Ｔ細胞を、インビトロでのノミ抗原に対するそのリコール増殖応答について２回目の免疫化の後１４日目に調べた。Ｆの免疫化及びＶ＋Ｆの免疫化はＣＤ４⁺Ｔ細胞の強い増殖をもたらし、これに対して、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから単離したＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ノミ抗原の刺激に対する応答において、増殖がたとえある場合でも、ほとんど増殖を示さなかった（図２ｄ）。これらの結果は、ｐｃＤＦ１００＋Ｆの同時免疫化によって認められる過敏性の抑制が非応答性の抗原特異的なＣＤ４⁺Ｔ細胞に関係づけられることを示唆する。

これらの結果は、ｐｃＤＦ１００及びノミタンパク質抗原による同時免疫化では、アレルギー反応の抑制が、ノミ皮内チャレンジによって誘導される炎症性サイトカイン及びＣＤ４⁺細胞のレベルをダウンレギュレートすることにより誘導されることを示している。このことは、抗原が一致しない組合せでは、同じ効果がもたらされなかったことから、アレルギーの防止が抗原特異的である可能性があることを示唆する。

抗原特異的なＴｒ細胞がノミのＤＮＡワクチン及びタンパク質ワクチンの同時免疫化によって誘導されているかを調べるために、脾細胞を、同時免疫化されたＣ５７Ｂ／６マウスから採取し、同系マウスのノミ抗原特異的なエフェクターＴ細胞と混合して、リコール増殖応答をインビトロで抑制するその能力を調べた。図３ａに示すように、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスから得られた脾細胞はＴ細胞のリコール免疫応答を著しく抑制した。対照的に、Ｆ又はＶ＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られた脾細胞、ならびに、ナイーブのマウスから得られた脾細胞は、抗原特異的なＴ細胞の増殖応答を抑制することができなかった（図３ａ）。このことは、動物の同時免疫化の期間中に生じた可能性がある脾細胞集団内の細胞により、この抗原特異的なＴ細胞の増殖が抑制され得ることを示している。ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスの脾臓からの精製された非Ｔ細胞、Ｔ細胞、又は、Ｔ細胞のサブセットを特定し、リコール増殖の抑制について個々に調べた。著しい抑制が、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスに由来する精製されたＴ細胞、精製されたＣＤ４⁺細胞、又は、精製されたＣＤ４⁺ＣＤ２５”細胞のいずれかの反応から認められ、細胞の他のサブセットからは認められなかった（図３ａ）。しかしながら、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺細胞からの抑制は一般的には、抗原感作に依存していないと考えられ、これに対して、この反応のＣＤ４⁺ＣＤ２５”細胞の抑制は抗原依存的な様式である（図３ａ）。

この問題をインビボでさらに調べるために、養子移入を利用した。抗原ナイーブの同系のレシピエントマウスを、ｐｃＤＦ１００＋Ｆ、Ｆ、又は、Ｖ＋Ｆによりそれぞれ同時免疫化されたＣ５７Ｂ／６マウスから単離した脾細胞全体、Ｔ細胞、ＣＤ４⁺細胞又はＣＤ８⁺細胞のいずれかにより養子移入した。次いで、すべてのレシピエントマウスを、過敏症を誘導するためにノミ抽出物によって皮内にチャレンジした。Ｆ、又は、Ｖ＋Ｆではなく、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られた脾細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細胞はすべてが、即時型過敏症反応の発症を抑制することができた（図３ｂ）。対照的に、３つすべての実験群及びナイーブの対照マウスから単離したＣＤ８⁺Ｔ細胞はこの反応を抑制しなかった。インビトロ及びインビボの両方の結果は、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔｒ細胞がこの抑制を媒介することができることを示している。

ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔｒの抗原特異性の観察された役割を調べるために、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたＣ５７Ｂ／６マウスから採取されたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔｒ細胞を同系のレシピエントマウスに養子移入し、続いて、このマウスを、ノミ抗原、又は、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）におけるＯＶＡにより２週間の間隔で２回免疫化した。最後の免疫化の後１４日目に、Ｔ細胞を単離し、ノミ抗原又はＯＶＡのいずれかに対してインビトロで増殖するその能力について調べた。ノミ抗原により免疫化されたレシピエントマウスから得られたＴ細胞はインビトロでノミ抗原刺激に応答せず、これに対して、ＯＶＡ−ＦＣＡにより免疫化されたレシピエントマウスから得られたＴ細胞はインビトロでＯＶＡ刺激により十分に応答し、しかし、ノミ抗原刺激には応答しなかった。対照として、ノミ抗原により免疫化されたナイーブのマウスはインビトロでノミ抗原刺激に十分に応答し、しかし、ＯＶＡ刺激には応答せず、また、逆もまた同様であった（図３ｃ）。この結果は、養子移入されたＣＤ４⁺Ｃ２５^-Ｔｒ細胞はノミ抗原特異的なＴ細胞の初回免疫刺激及び増殖をインビボで抑制するだけであることを示しており、一方、関連性がない抗原特異的なＴ細胞からの応答は影響されなかった。

まとめると、これらのデータから、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔｒ細胞がＤＮＡワクチン及びタンパク質ワクチンの同時免疫化によって誘導されたことが証明される。これらは、抗原特異的な形態で機能するような特異なＣＤ４＋Ｔｒ細胞であると考えられる。

同時接種によって誘導されたＴｒ細胞が、以前に報告されたように（J. D. Fontenot、M. A. Gavin、A. Y. Rudensky、Nat Immunol、4、330 (2003年4月1日)；M. G. Roncarolo、R. Bacchetta、C. Bordignon、S. Narula、M. K. Levings、Immunol Rev、182、68 (2001年8月1日)；及び、P. Stock他、Nat Immunol、5、1149 (2004年11月1日))、Ｔｒ細胞に関連するある種のタイプのサイトカイン及び特異なマーカーを発現するかを判定するために、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-細胞を、Ｆ、Ｖ＋Ｆ、又は、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから、免疫化後の１日目、３日目、７日目及び１４日目に単離し、Ｔ細胞のプロフィルを、特異的な蛍光標識された抗体による細胞内染色によって追跡した。同時免疫化後、１日目、３日目、７日目及び１４日目に、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞を、Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、及び、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから単離し、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の発現についての細胞内サイトカイン産生をフローサイトメトリーによって評価した。Ｆによるマウス、Ｖ＋Ｆによるマウス、ｐｖＤＦ１００＋Ｆによるマウス、及び、対照としてのナイーブのマウスから単離したＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔｒ細胞を、ＣＤ６９、ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの発現について、また、ＦｏｘＰ３のそれらの発現について分析した。Ｔｒ細胞はＴ−ｂｅｔを発現し、しかし、ｇａｔａ−３を発現しない。免疫化後１４日目に、総ＲＮＡを、３つすべての群より得られたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＨＰＲＴ、Ｔ−ｂｅｔ及びｇａｔａ−３の発現を調べた。１４日間にわたって、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスから単離したＣＤ４⁺ＣＤ２５”Ｔ細胞は高いレベルのＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＦｏｘＰ３を発現し、最少量のＩＬ−４を発現した。対照的に、Ｆ、又は、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウスからの場合、ＣＤ４⁺ＣＤ２５”Ｔ細胞はより高いレベルのＩＬ−４を産生し、ＦｏｘＰ３、ＩＬ−１０又はＩＦＮ−γの発現をもたらさなかった。転写因子のＦｏｘｐ３は、Ｔｒ細胞の特徴であることが証明されているので、同時ワクチン接種により誘導されたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔｒ細胞はＴ細胞の調節性クラスに類別することができ、しかし、それらは特異な表現型を有する。Ｔ細胞活性化のマーカーが、免疫化された群では等しく発現し、ＣＤ４４及びＣＤ６９などは高く、ＣＤ６２Ｌについては低い。このことは、誘導されたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔｒ細胞が免疫化によって完全に活性化されることを示唆する。

誘導されたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔｒ細胞についてのＴｈ表現型を、上記で記載しているような観察されたサイトカイン発現パターンに基づいて分析するために、Ｆ、Ｖ＋Ｆ、又は、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞のＴ−ｂｅｔ遺伝子及びｇａｔａ−３遺伝子の両方の発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって分析した。結果は、Ｆ、又は、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウスからではなく、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞がより高いレベルのＴ−ｂｅｔ（Ｔｈ１細胞についての特徴）を発現したことを示す。対照的に、Ｆにより免疫化されたマウス、及び、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞はより高いレベルのｇａｔａ−３を発現した（特徴的なＴｈ２細胞）。

まとめると、これらのデータから、ＤＮＡワクチン及びタンパク質ワクチンの同時免疫化によって誘導されたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞は、抗原特異的なＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖機能を抑制することができる順応的なＴｈ１表現型のＴｒ細胞を有することが証明される。

抗原提示細胞（ＡＰＣ）はＴ細胞を活性化して、順応免疫性を増進させるので、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔｒ細胞の誘導は明らかに、ＤＮＡワクチン＋タンパク質ワクチンの同時接種による特異的なＡＰＣ活性化を介してである。この問題を調べるために、上記で記載しているのと類似した実験を、樹状細胞（ＤＣ）の機能及び表現型、ならびに、ナイーブのＴ細胞に対するその影響を評価するために組み立てた。ＤＣの成熟化に対する同時接種の影響を分析した。同時免疫化されたマウスから得られたＤＣにおける共刺激分子の発現を調べた。脾細胞を単離し、ｐｃＤＦ１００＋Ｆ、Ｖ＋Ｆ、又は、Ｆによる同時免疫化後４８時間でＣＤ１１陽性細胞に対してゲート処理することによってＤＣにおける表面マーカーの発現について染色した。ｐｃＤＦ１００＋Ｆの同時免疫化は、同時免疫化後４８時間で脾臓から単離したＤＣが、成熟したＤＣの特徴である高い類似したレベルのＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩＩ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−１ａ／ｆ３、ＩＦＮ−ａ／８及びＴＮＦ−ａを発現したので、ＤＣの成熟化に影響を及ぼさなかった。これに対して、ナイーブの対照マウスから得られた未成熟なＤＣにおけるこれらの分子は比較的低いレベルで発現したままである。このことから、同時接種は、未成熟なＤＣを成熟体に誘導することを可能にすることが示唆される。しかしながら、本発明者らは、ＣＤ４０発現のレベルが、すべての他の群と比較して、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスでは劇的な低下を観察した。このことは、ＤＣの特異な表現型が、観察されたＴｒの誘導に関与しているかもしれないことを示唆する。Ｖ＋Ｆ、又は、Ｆにより免疫化されたマウスから得られたＤＣは、異種のＴ細胞を活性化して、増殖させる能力を有することが観察されたが、これに対して、ナイーブのマウスの未成熟なＤＣは、予想されたようにそのような能力を有していない（図４ａ）。興味深いことに、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスから得られたＤＣは、Ｔ細胞を活性化して、増殖させる限定された能力を有していた（図４ｂ）。このことは、Ｔｒ誘導の代替的な機構が同時免疫化群では誘導されることを示唆する。同時免疫化されたマウスのＤＣがナイーブのＴ細胞をＴｒ表現型に転換することができるかを調査するために、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化された後のマウスから得られたＤＣを同系のナイーブのＣＤ４⁺Ｔ細胞とインビトロで同時培養し、その後、得られたＣＤ４⁺Ｔ細胞をＦＡＣＳによって特徴づけた。これらのＴ細胞はより高いレベルのＣＤ４４及びＣＤ６９をアップレギュレートし、しかし、ＣＤ６２Ｌのレベルはより低かった。このことから、ＤＣは、再度ではあるが、Ｔ細胞を活性化する能力を有することが示唆される。類似する結果が、Ｖ＋Ｆ、又は、Ｖにより同時免疫化されたマウスから得られたＤＣの分析から得られた。さらには、ｐｃＤＦ１００＋Ｆの群における活性化されたＣＤ４⁺Ｔ細胞は著しいより高いレベルのＩＬ−１０及びＩＦＮ−γを産生し、しかし、ＩＬ−４を低下させた（図４ｂ）。しかしながら、Ｖ＋Ｆ、又は、Ｆにより免疫化された群よりの活性化されたＴ細胞は著しいレベルのＩＬ−４を産生し、しかし、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γをほとんど産生しない（図４ｂ）。サイトカイン産生を、Ｄ＋Ｆにより免疫化されたマウスから単離した新鮮なＤＣによる３回の再刺激の後に分析した。これらの研究から、Ｔ細胞におけるＩＬ−１０の産生における増大（これは調節Ｔ細胞の特徴の１つである）が証明された。その調節機能をさらに特徴づけるために、ＩＬ−１０⁺Ｔ細胞をＤＣ刺激後に単離し、ＭＬＲに供して、ＩＬ−１０⁺Ｔ細胞がＭＬＲにおいてレスポンダーＴ細胞の増殖をブロックするかを調べた。示すように、レスポンダーＴ細胞の増殖がＩＬ−１０⁺Ｔ細胞の存在によって抑制され、しかし、Ｖ＋Ｆより免疫化されたマウス、及び、Ｆより免疫化されたマウス、又は、対照動物のＤＣとの同時培養から単離したＴ細胞からは抑制されなかった（図４ｃ）。これらのデータから、Ｄ＋Ｆにより同時免疫化されたマウスから得られたＤＣがＴ調節細胞の大きな集団をインビトロで発生させることが証明される。

同じ転換をインビボで証明するために、ｐｃＤＦ１００＋Ｆによる同時免疫化の後のＢＡＬＢ／ｃマウスから採取したＤＣを同系のナイーブのＣＤ４⁺Ｔ細胞とともにヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に同時移入し、その後、これらの移入されたＴ細胞をＩＬ−１０及びＴｒｅｇマーカーについての細胞内染色についてＦＡＣＳによって分析した。ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスから得られたＤＣはＴｒ細胞をインビボで誘導した。ｐｃＤＦ１００＋Ｆ、Ｖ＋Ｆ、Ｆにより免疫化されたマウス、又は、ナイーブの対照マウスの脾臓から単離したＤＣを、ナイーブのＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞とともに同時養子移入した。Ｔ細胞を、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＦｏｘＰ３及びＣＤ２５について３日目及び７日目に分析した。同時移入されたＴ細胞は、より多くのＩＬ−１０、ＦｏｘＰ３及びＩＦＮ−γを発現し、しかし、ＩＬ−４をほとんど発現しなかった。しかしながら、Ｖ＋Ｆ、又は、Ｆにより免疫化されたマウスから得られたＤＣを伴う同時移入されたＴ細胞は、より高いレベルのＩＬ−４を発現し、しかし、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γをほとんど発現しなかった。このことはインビトロでのデータを裏付けている。特異的なＩＬ−１０サイトカイン産生が、Ｄ＋Ｆにより同時免疫化されたマウスから新たに単離したＤＣによる２回の再刺激の後に上昇した。これらのデータから、Ｄ＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られたＤＣが、インビボでおそらくはナイーブのＴ細胞をＴｒ細胞にすることが証明される。以前の結果と一致して、そのような転換はＣＤ４⁺ＣＤ２５”集団内で行われたにすぎない。なぜならば、ＣＤ２５⁺の頻度は、インビボで試験したとき、影響されることが認められなかったからである（図１６ｅ）。

最後に、実験を、ＤＣと、Ｔ細胞との間での相互作用において、どのような分子がＴｒの発達において役割を果たすかを特定するために行った。Ｔｒは、上記で証明されたように、活性化されたＴ細胞の区画に存在するので、シグナルは古典的な活性化経路シグナルを含むはずである。これらの中で重要なものが、ナイーブのＴ細胞を活性化するための２つの必要不可欠なシグナルを提供する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子及び共刺激分子（ＣＤ８０／ＣＤ８６）のアップレギュレーションである。この問題を調べるために、ＤＣをｐｃＤＦ１００＋Ｆによる同時免疫化後の４８時間でマウスの脾臓から単離し、シグナル伝達分子をブロックするための試薬（これには、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ４０及び抗ＭＨＣ−ＩＩを含む）の存在下又は非存在下、ナイーブの同系マウスから得られたナイーブのＣＤ４⁺Ｔ細胞と同時培養した。７日間の再刺激の後、Ｔ細胞を単離し、ＭＬＲシステムに加えて、その調節機能を調べた。結果は、抗ＣＤ４０ｍＡｂ及び抗ＭＨＣＩＩｍＡｂはともに、ＭＲＬに対する抑制的影響をＴｒ細胞によって部分的に打ち消すことができることを示し、これに対して、ＣＤ８０、ＣＤ８６に対するｍＡｂは、抑制表現型の誘導をブロックする能力を有していなかった。これらの結果から、ＣＤ４０のシグナル及びＭＨＣＩＩのシグナルはともに、ノミアレルゲン誘導の即時型過敏症モデルにおけるＴｒの誘導において役割を果たすことが証明される。

順応的Ｔｒ１細胞が認められており、また、部分的に最適な免疫原又はサブ免疫原をプロセシングするＤＣによって誘導され、ＩＬ−１０又はＴＧＦ−ｂ又は両者の分泌により媒介される正常なＴ細胞の機能を抑制する。未成熟のＤＣが、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−Ｒ及びＩＦＮ−ｙを産生させるとともに、ＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の分化を行わせ、しかし、それらはＩＬ−４又はＩＬ−２を産生せず、それらは、抗原特異的及びポリクローナルな活性化に対して応答性が低いことがさらに証明されている。さらなる証拠では、極めて小さい抗原刺激によるＤＣの部分的に最適な活性化がＴｒ１の転換を誘導し得ることが示されている。ＤＣのこの刺激は共刺激のシグナル伝達を有しておらず、従って、寛容性のシグナルをＴ細胞に提示する。

ノミ抗原をコードするＤＮＡをノミタンパク質とともに同時接種することにより、ノミアレルゲンのチャレンジによって誘導されるアレルギー反応を抑制する順応的Ｔｒ細胞が誘導される。この細胞はＣＤ４⁺ＣＤ２５”Ｆｏｘｐ３⁺の表現型を示し、インビボ及びインビトロでの抗原特異的な免疫応答、ならびに、ＭＬＲ免疫応答を、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの産生により抑制する。ＭＨＣ−ＩＩ⁺／ＣＤ４０^lowのＤＣ集団がそのような同時免疫化によって誘導され、その結果として、ナイーブのＴ細胞をＴｒ細胞に転換する。

（実施例１７）
（ネコＦＡＤモデルにおけるワクチンによる同時免疫化によるＦＡＤアレルゲンに対する防止方法及び／又は治療的方法の試験）
（ネコモデルの確立及び同時免疫化の試験）
ノミの唾液には１５種類を越えるアレルゲンが存在する。それらの中で、１８ｋＤａのタンパク質であるノミ唾液抗原１（ＦＳＡ１）が、ＦＡＤを引き起こし得る主たるアレルゲンであることが判明している。この遺伝子はクローン化され、大腸菌システムにおいて発現している。加えて、ｐＶＡＸ−ＦＳＡ１真核生物発現用構築物もまた調製されている。

ネコＦＡＤモデルが確立され、ネコにおける確立されたＦＡＤに対するＦＳＡ１＋ｐＶＡＸ−ＦＳＡ１の同時免疫化の治療効果を実証するために続いて使用された。

（ノミの数、サイクルの持続期間の決定）
（動物及び寄生虫）
１０匹の無菌ネコをNorth China Pharmaceutical Group（Shijiazhuang、Hebei）から購入し、実験の期間中、Center for Disease Control and Prevention of China（CDC）における動物施設に収容した。すべてのネコが１歳を超えていた。より若い動物は本実験においてノミアレルゲンに対して耐え得ることがあるので、これは重要な要因である。ネコを品種及び性別により無作為にグループ分けした。無菌のノミ（sterile fleas）がＣＤＣによって提供された。

外寄生（infestation）及びＦＡＤ症状の関係性を求めるために、１０匹のネコを、６匹のネコを有する実験群と、それぞれが２匹のネコを有する２つの対照群とを含む３つの群に分けた。１つの対照群をニテンピラムにより処置し、別の対照群はニテンピラムにより処置しなかった。それぞれの実験ネコを０日目に分け、それぞれのネコに１００匹のノミを寄生させた。２日後、この群におけるすべてのネコに、ニテンピラムを、ノミをその身体から除くために与えた。対照ネコの２匹にもまた、この薬を０日目に与えた。このチャレンジサイクルを隔週毎に７回繰り返した。

（同時免疫原としてのＦＳＡ１及びｐＶＡＸ−ＦＳＡ１によるＦＡＤ誘導ネコ又は対照ネコのための免疫化スキーム）
６匹のＦＡＤネコを３つの群に分けた。それらの２匹を、ｉ．ｐ．での４００μｇのＦＳＡ１、及び、両側の側腹部における皮下での４００μｇのｐＶＡＸ−ＦＳＡ１プラスミドにより同時免疫化した。２匹を、ｉ．ｐ．での４００μｇのＦＳＡ１、及び、皮下での４００μｇのｐＶＡＸベクターにより同時免疫化した。最後の２匹は免疫化せず、陽性対照群として使用した。４匹の非ＦＡＤネコを２つの群に分けた。２匹を、ｉ．ｐ．での４００μｇのＦＳＡ１、及び、両側の側腹部における皮下での４００μｇのｐＶＡＸ−ＦＳＡ１プラスミドにより同時免疫化し、残りの２匹を、ｉ．ｐ．での４００μｇのＦＳＡ１、及び、皮下での４００μｇのｐＶＡＸベクターにより同時免疫化した。ニテンピラムによる２匹の対照ネコを異なる群に入れた。これらのネコを、３回、すなわち、０日目、９日目及び１６日目に免疫化した。その後、ネコを上記のように６サイクルにわたってチャレンジした。２回目の免疫化の期間中に、本発明者らは陽性ネコを次の治療のための感受性状態で保つことを欲したので、チャレンジのサイクルを同時に行った。免疫化プログラムは表２の通りであった。

（皮膚スコア）
方法：
ネコを、それぞれの外寄生を中断した後の２日目に皮膚学的評価によってスコア化した。評価には、紅斑、丘疹、痂皮、鱗屑、脱毛、爪痕が含まれた。それぞれのネコの身体を、どの部分が最も重篤な臨床的結果を有し得るかを評価するために３つの部分に分けた。以前の報告された報告に従って、３つの部分は、（１）背中（背側表面の頭部から尾まで）、（２）両側の側腹部（肩甲骨から尾まで）、（３）胸部及び裏側（咽頭から尾側正中（caudomedial thigh）の大腿まで）からなった。

（ネコからの末梢血細胞の塗沫標本化カウント）
方法：
２ｍｌでの凝固防止末梢血を、実験群からは０日目、２日目、１６日目、３０日目、４４日目、５８日目、６２日目に採取し、対照群からは０日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、６０日目に採取した。同じサンプルを免疫化後に採取した。１滴の血液を清浄なガラス製スライドの上に塗沫標本とした。塗沫標本を乾燥した後、細胞をWright-Giemsa染色により１５分間染色した。脱イオン水でのリンスの後、塗沫標本をＫｉｍｗｉｐｅペーパーにより穏やかに乾燥し、それぞれ１０秒間の処理による９６％及び１００％のエタノールによって脱水した。その後、スライドをキシレンにより３０分間処理した。

染色後、血液細胞の核及び細胞質を青色染色及びピンク色染色によって識別した。細胞のそれぞれのタイプの百分率を、光学顕微鏡で、視野内の合計で２００個の細胞によって計数した。

治療的方法：
総ＲＮＡを、それぞれの群から３回目の免疫化の後７日目に末梢血から単離した単核細胞から抽出したことを除いて、上記と同じ方法を使用した。

（統計学的分析）
分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、それぞれのサイクルから得られた皮膚スコア、様々な病変部のスコア、及び、種々の部位におけるスコアを含む相違を３つの群の間で検出するために使用した。皮膚試験及びＩｇＥレベルの相違もまたＡＮＯＶＡによって決定した。他の相違の統計学的分析を、スチューデントのｔ検定を使用して行った。これらの分析では、データを対数プロットに変換した。ｐ＜０．０５であれば、著しい相違があることが示される。

統計学的分析はまた、スチューデントｔ検定を使用して行った。これらの分析では、データをｌｏｇに変換した。ｐ＜０．０５であれば、データは著しい相違があることが示される。

結果：
ネコの観察及び皮膚スコア
病変部を、そのタイプ、場所、サイズ及び数に従ってスコア化した。

総スコアを群から分析し、実験群についての病変部及び部位を評価した。ＦＡＤ群は他の群の場合よりも大きいスコアを記録した。スコアが４回目の外寄生サイクルにおいて増大し、その後は５．０のレベルで留まった。ＦＡＤ群におけるスコアは他の対照群の場合よりも著しく大きかった（Ｐ＜０．０１）。これらの結果は、このネコＦＡＤモデルが、アレルギー反応に対する治療的処置又は予防的処置を評価するために有効かつ実行可能であったという結論を裏付けている。

病変部がどこに最も多く存在するか、どのようなタイプが最も多く存在するか、及び、いつ生じたかを評価するために、統計学的分析を行った。丘疹及び毛喪失が、ＦＡＤ群における皮膚スコアに寄与するための最も一般的な因子であったことが見出された。紅斑は４４日目にピークに達し、しかし、本実験の終了時には低下し、このことは、持続性がないことを示していたので、紅斑の示度は寄与因子ではなかった。他方で、丘疹は増大し、４４日後には高いレベルで維持され、８６日目にピークに達した（Ｐ＜０．０５）。このことはその持続性を示唆する。同様に、毛喪失が４４日後で高いレベルで維持された（Ｐ＜０．０５）。これら２つの読み取りはＦＡＤを反映するための良好な開始として示される。他の病変部からのスコアは、病変部の著しい相違が何ら認められなかった２つの対照群では不規則に分布し、一致していなかった。

皮膚病変部のほとんどが、４４日目には他の部位と比較して、背中及び頭部に位置する傾向があった（Ｐ＜０．０５）が、病変部は実験終了時には身体全部に広がっていた。この観察結果は、胸部及び裏側がほとんどの病変部を有する傾向があるイヌにおける以前の報告とは異なっていた。それは、ネコ及びイヌの習慣的違いのためであるかもしれない。

ニテンピラム処置による干渉を除くために、ニテンピラムにより処置されたものと、処置を伴わないものとの間における何らかの相違を評価した。皮膚スコアからは、著しい相違が対照群において何ら見られなかった。従って、ニテンピラム処置は、本発明者らの実験から得られた結果に影響しなかった（図５）。

（血液塗沫標本の分析による末梢血における細胞割合）
異なる群より得られた末梢血における細胞の各タイプの数の比較では、好酸球の数が、実験群において、対照群における数よりも大きいことが示された。血液塗沫標本をそれぞれの外寄生サイクルについて行ったが、細胞の各タイプの割合が３回目のサイクルの後では一定になった。５８日目からの結果が表３において示すように、著しい変化が３つの群の間で好酸球の数において生じた。好酸球の増大は、以前に報告されたようにアレルギー疾患に関係づけられるので、これらの結果は、実験群におけるネコがノミの外寄生に対してより感受性であったことを示している。明らかな相違が２つの対照群の間では認められず、ニテンピラムは、ネコの末梢血において細胞数に干渉しないと考えられる。

（組織学的検査）
最初に、正常な皮膚と、病変部を有する皮膚との間における相違を分析した。皮膚の生検物を５８日目にすべての群より選んだ。しかしながら、１匹のネコから得られた皮膚生検物はまた、ある程度の相違を示すことがある（特に、病変部を有する皮膚）。それは、ノミが外寄生したネコが、ＦＡＤを有するように誘導されたかどうかを示すためには十分ではなかった。この理由から、それぞれの群からの皮膚生検物をノミ抽出物によるＩＤＴの後に採取した。なぜならば、ノミによるＩＤＴは抗原特異的な復活した免疫応答を提供するからである。

（ネコがノミ抽出物に対してアレルギー性であったかどうかを評価するための皮膚試験）
膨疹又はブレブの直径をＩＤＴ注射後１５分で測定した。それぞれのネコがＩＤＴに対する異なったレベルの感受性を有したので、それぞれの個々の動物からの結果を記録した。図６はすべての群における皮膚反応を示す。アレルギー反応は、ＩＤＴ値が閾値の平均（生理的食塩水とヒスタミンの和を２で割る）を超えている場合、生じていると見なし、又は、ＩＤＴ値が閾値の平均を下回っている場合、生じていないと見なした。結果を表４に示す。皮膚スコアが５．０以上であるネコを、ＦＡＤについて陽性であるとして特定した。

（ＦＳＡ１及びｐＶＡＸ−ＦＳＡ１の同時免疫化の影響を求めるための皮膚試験）
ＦＡＤのネコを、図１８及び表２において実験デザインＢに記載しているように、ＦＳＡ１＋ｐＶＡＸ−ＦＳＡ１、又は、ベクター＋ＦＳＡ１により同時免疫化した。免疫化の前後で、ネコを様々なノミ抗原又は対照抗原によりＩＤＴによって調べた。ＩＤＴの読み取りを、図７及び表５に要約するように、最後の免疫化の後７日目に記録した。

結果から、ＦＳＡ１＋ｐＶＡＸ−ＦＳＡ１により同時免疫化されたＦＡＤネコは、ノミ抽出物又はノミ特異的抗原（例えば、ＦＳＡ１タンパク質など）のチャレンジに対してより少ない皮膚反応を有し、これに対して、ベクター＋ＦＳＡ１により免疫化されたネコは、同じチャレンジに対してより多い皮膚反応を有したことが示された。

免疫化の前後における相違を比較したとき、本発明者らは、皮膚反応が、図７に示すように、同時免疫化群では、免疫化後において、免疫化前よりもはるかに小さかったことを認めた。このことは、同時免疫化がノミチャレンジに対する感受性を著しく低下させたことを示唆する。これに反して、著しい影響が、ＦＳＡ１及びｐＶＡＸベクターにより免疫化された群では何ら見られなかった。このことは、これらのネコが依然としてそのアレルギー状態にあったことを示している。すべてのネコの状態を表５に示す。

（ＦＡＤネコに対する同時免疫化の治療効果）
ＦＡＤネコの病変部に対する同時免疫化の治療効果を判定するために、病変部を最初の免疫化の後５３日間にわたって記録し、図８に示した。同時免疫化群における病変部スコアが５．５から２に劇的に低下した（図８、線上の四角点）。一方、ＦＳＡ１及びｐＶＡＸベクターにより免疫化された群に対する効果は、より小さい程度ではあったが、低下した（図８、線上の三角点）。結果から、同時免疫化が、ネコにおける確立されたＦＡＤに対する治療効果を有したことが示唆された。

（ＦＡＤネコに対する同時免疫化によって影響される病変部のタイプの相関）
どのタイプの病変部が同時免疫化により減少したかを相関させるために、すべての群におけるそれぞれのタイプの病変部に対するスコアを分析した。結果を図９Ａ〜図９Ｆに示す。丘疹のスコアのみが４．０から０．５に低下し、ＦＳＡ１＋ｐＶＡＸ−ＦＳＡ１の同時免疫化と一致していた（図９Ｂ、線上の四角点）。実験群における他のタイプの病変部は変化しないままであった。

（ＦＡＤネコに対する同時免疫化によって影響される病変部の場所の相関）
（ＦＡＤネコに対する同時免疫化の治療効果）
相関を分析した後、データは、治療群における両側の側腹部のスコアがＦＳＡ１＋ｐＶＡＸ−ＦＳＡ１の同時免疫化の後では１．５から０に低下し（図１０Ｂ）、しかし、他の場所では、図１０Ａ〜図１０Ｃに示すように、効果がなかったことを示した。ＦＳＡ１及びｐＶＡＸベクターにより免疫化された治療群は応答が消えにくかった（図１０Ｂ、三角点）。ＦＳＡ１及びｐＶＡＸベクターにより免疫化されたＦＡＤネコの皮膚スコアは最後の免疫化の７日後で１．５から０．５に低下した。対照的に、ＦＳＡ１＋ｐＶＡＸ−ＦＳＡ１による同時免疫化における皮膚スコアはその最初の免疫化の後に直ちに低下し、期間中、低いレベルのままであった（図１０Ｂ、四角点）。

（要約）
これらのデータから、ノミの外寄生によるネコにおけるＦＡＤモデルの成功した誘導が証明される。ＦＡＤネコにおける生理学的パラメーター又は病原的パラメーターが特徴づけられており、このことは、免疫治療的又は予防的なアプローチの治療を評価するためのモデルとして使用することができる。

ＦＳＡ１ワクチン＋ｐＶＡＸ−ＦＳＡ１ワクチンの同時免疫化は、ネコにおける確立されたＦＡＤを抑制することが証明された。そのような抑制は抗原特異的であるようであり、このことは、マウスでの研究で認められた結果を裏付けている。

（実施例１８ ｐＶＡＸ−Ｋ−ＦＳＡ１）
プラスミドｐＶＡＸ−Ｋ−ＦＳＡ１は、Ｋｏｚａｋ配列に連結されたＦＳＡ１コード配列をプラスミド骨格ｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含む。Ｋ−ＦＳＡ１挿入物の配列は配列番号６１である。ヌクレオチド１〜９がＫｏｚａｋ配列に対応する。ＦＳＡ１＋欠失された８アミノ酸のオープンリーディングフレームがヌクレオチド１０から始まる。プラスミドｐＶＡＸ−Ｋ−ＦＳＡ１のマップを図１１に示す。

図１ａ〜図１ｃは、マウスにおけるノミアレルギーモデルを示す。Ｃ５７ｂ／６マウスを、隔週毎に２回、ノミ抗原により、又は、陰性対照としての生理的食塩水により初回免疫刺激し、ノミ抗原、又は、陰性対照としてのＰＢＳ、陽性対照としてのヒスタミンにより皮内にチャレンジした。図１ａにおいて、皮膚試験後の局所的反応をチャレンジ後３０分で測定した。図１ｂはＩｇＥ産生の抗ノミ抗原を示す。図１ｃにおいて、ノミ抗原によりインビトロで刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答をマウスにおいて調べた。結果は少なくとも３つの実験を表す。^*Ｐ＜０．０５（示すようなナイーブの対照群と比較した場合）。 図２ａ〜図２ｄは、ＤＮＡ及びタンパク質の同時免疫化が即時型過敏症反応の発達を抑制することを示す。図２ａは、Ｆ又はｐｃＤＦ１００＋Ｆによる同時免疫化の後におけるマウスの皮膚試験からのデータを示す。図２ｂは、ｐｃＤＦ１００＋Ｆによる同時免疫化の後でのマウスにおける用量依存的な皮膚応答を呈していることを示す。図２ｃは、誘導及び処置の後におけるＩｇＥ及びＩｇＧ１の抗ノミ抗原レベルを示す。図２ｄは、インビトロでノミ抗原特異的に刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答を示す。結果は少なくとも３つの実験を表す。^*Ｐ＜０．０５（示すようなＶ＋Ｆワクチン接種群及びＦワクチン接種群と比較した場合）。 図２ａ〜図２ｄは、ＤＮＡ及びタンパク質の同時免疫化が即時型過敏症反応の発達を抑制することを示す。図２ａは、Ｆ又はｐｃＤＦ１００＋Ｆによる同時免疫化の後におけるマウスの皮膚試験からのデータを示す。図２ｂは、ｐｃＤＦ１００＋Ｆによる同時免疫化の後でのマウスにおける用量依存的な皮膚応答を呈していることを示す。図２ｃは、誘導及び処置の後におけるＩｇＥ及びＩｇＧ１の抗ノミ抗原レベルを示す。図２ｄは、インビトロでノミ抗原特異的に刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答を示す。結果は少なくとも３つの実験を表す。^*Ｐ＜０．０５（示すようなＶ＋Ｆワクチン接種群及びＦワクチン接種群と比較した場合）。 図２ａ〜図２ｄは、ＤＮＡ及びタンパク質の同時免疫化が即時型過敏症反応の発達を抑制することを示す。図２ａは、Ｆ又はｐｃＤＦ１００＋Ｆによる同時免疫化の後におけるマウスの皮膚試験からのデータを示す。図２ｂは、ｐｃＤＦ１００＋Ｆによる同時免疫化の後でのマウスにおける用量依存的な皮膚応答を呈していることを示す。図２ｃは、誘導及び処置の後におけるＩｇＥ及びＩｇＧ１の抗ノミ抗原レベルを示す。図２ｄは、インビトロでノミ抗原特異的に刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答を示す。結果は少なくとも３つの実験を表す。^*Ｐ＜０．０５（示すようなＶ＋Ｆワクチン接種群及びＦワクチン接種群と比較した場合）。 図３ａ〜図３ｃは、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞が、観察された抑制に関わることを示す。図３ａにおいて、５Ｘ１０⁵個のＣＤ３⁺Ｔ細胞を、ノミ抗原により免疫化されたマウスの脾臓から単離し、９６ウエルプレートに加えた。同時に、ナイーブのマウス、Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、及び、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られた１Ｘ１０⁵個の脾細胞もまた同じプレートに加えた。同様に、１Ｘ１０⁵個の非Ｔ細胞又はＴ細胞、精製されたＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細胞又はＣＤ４⁺ＣＤ２５”Ｔ細胞を、Ｖ＋Ｆ又はｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスの脾臓から単離した。これらの同時培養物を、インビトロにおいて、１Ｘ１０⁵個の骨髄由来ＤＣの存在下で４８時間、ノミ抗原（５０μｇ／ｍｌ）により刺激した。増殖を製造者の説明書に従ってＭＴＳ−ＰＭＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって調べ、刺激指数（ＳＩ）を下記の式によって求めた。ノミ抗原刺激後のカウント数／非刺激培養物のカウント数。図３ｂにおいて、ナイーブのマウス、Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、及び、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られた１Ｘ１０⁶個の脾細胞をナイーブのＣ５７マウスに養子移入した。同様に、１ｘ１０⁶個の非Ｔ細胞又はＴ細胞、１ｘ１０⁶個の精製されたＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細胞、５ｘ１０⁵個のＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞及びＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞を、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｆにより免疫化されたマウス、又は、ナイーブの対照マウスの脾臓から単離し、ノミ抗原により初回免疫刺激された同系のマウスに養子移入し、皮膚試験応答を調べた。図３ｃは、ＤＮＡ及びタンパク質の同時投与が抗原特異的な抑制を誘導することを示す。１ｘ１０⁶個のＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞を、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、又は、ナイーブの対照マウスの脾臓から単離し、ナイーブのマウスに養子移入し、その後、そのマウスを移入後２４時間で特異的なノミ抗原又は非特異的なＯＶＡタンパク質により免疫化し、その後、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を単離し、その増殖を分析した。図に示された結果は２つの実験を表す。^*Ｐ＜０．０５（示すようなＶ＋Ｆ移入及びＦ移入と比較した場合）。 図３ａ〜図３ｃは、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞が、観察された抑制に関わることを示す。図３ａにおいて、５Ｘ１０⁵個のＣＤ３⁺Ｔ細胞を、ノミ抗原により免疫化されたマウスの脾臓から単離し、９６ウエルプレートに加えた。同時に、ナイーブのマウス、Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、及び、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られた１Ｘ１０⁵個の脾細胞もまた同じプレートに加えた。同様に、１Ｘ１０⁵個の非Ｔ細胞又はＴ細胞、精製されたＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細胞又はＣＤ４⁺ＣＤ２５”Ｔ細胞を、Ｖ＋Ｆ又はｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスの脾臓から単離した。これらの同時培養物を、インビトロにおいて、１Ｘ１０⁵個の骨髄由来ＤＣの存在下で４８時間、ノミ抗原（５０μｇ／ｍｌ）により刺激した。増殖を製造者の説明書に従ってＭＴＳ−ＰＭＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって調べ、刺激指数（ＳＩ）を下記の式によって求めた。ノミ抗原刺激後のカウント数／非刺激培養物のカウント数。図３ｂにおいて、ナイーブのマウス、Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、及び、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られた１Ｘ１０⁶個の脾細胞をナイーブのＣ５７マウスに養子移入した。同様に、１ｘ１０⁶個の非Ｔ細胞又はＴ細胞、１ｘ１０⁶個の精製されたＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細胞、５ｘ１０⁵個のＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞及びＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞を、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｆにより免疫化されたマウス、又は、ナイーブの対照マウスの脾臓から単離し、ノミ抗原により初回免疫刺激された同系のマウスに養子移入し、皮膚試験応答を調べた。図３ｃは、ＤＮＡ及びタンパク質の同時投与が抗原特異的な抑制を誘導することを示す。１ｘ１０⁶個のＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞を、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、又は、ナイーブの対照マウスの脾臓から単離し、ナイーブのマウスに養子移入し、その後、そのマウスを移入後２４時間で特異的なノミ抗原又は非特異的なＯＶＡタンパク質により免疫化し、その後、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を単離し、その増殖を分析した。図に示された結果は２つの実験を表す。^*Ｐ＜０．０５（示すようなＶ＋Ｆ移入及びＦ移入と比較した場合）。 図３ａ〜図３ｃは、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞が、観察された抑制に関わることを示す。図３ａにおいて、５Ｘ１０⁵個のＣＤ３⁺Ｔ細胞を、ノミ抗原により免疫化されたマウスの脾臓から単離し、９６ウエルプレートに加えた。同時に、ナイーブのマウス、Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、及び、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られた１Ｘ１０⁵個の脾細胞もまた同じプレートに加えた。同様に、１Ｘ１０⁵個の非Ｔ細胞又はＴ細胞、精製されたＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細胞又はＣＤ４⁺ＣＤ２５”Ｔ細胞を、Ｖ＋Ｆ又はｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスの脾臓から単離した。これらの同時培養物を、インビトロにおいて、１Ｘ１０⁵個の骨髄由来ＤＣの存在下で４８時間、ノミ抗原（５０μｇ／ｍｌ）により刺激した。増殖を製造者の説明書に従ってＭＴＳ−ＰＭＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって調べ、刺激指数（ＳＩ）を下記の式によって求めた。ノミ抗原刺激後のカウント数／非刺激培養物のカウント数。図３ｂにおいて、ナイーブのマウス、Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、及び、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウスから得られた１Ｘ１０⁶個の脾細胞をナイーブのＣ５７マウスに養子移入した。同様に、１ｘ１０⁶個の非Ｔ細胞又はＴ細胞、１ｘ１０⁶個の精製されたＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細胞、５ｘ１０⁵個のＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞及びＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞を、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｆにより免疫化されたマウス、又は、ナイーブの対照マウスの脾臓から単離し、ノミ抗原により初回免疫刺激された同系のマウスに養子移入し、皮膚試験応答を調べた。図３ｃは、ＤＮＡ及びタンパク質の同時投与が抗原特異的な抑制を誘導することを示す。１ｘ１０⁶個のＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞を、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、又は、ナイーブの対照マウスの脾臓から単離し、ナイーブのマウスに養子移入し、その後、そのマウスを移入後２４時間で特異的なノミ抗原又は非特異的なＯＶＡタンパク質により免疫化し、その後、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を単離し、その増殖を分析した。図に示された結果は２つの実験を表す。^*Ｐ＜０．０５（示すようなＶ＋Ｆ移入及びＦ移入と比較した場合）。 図４ａ〜図４ｃは、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスから得られたＤＣがＴｒ細胞をインビトロで誘導することを示す。図４ａは、ｐｃＤＦ１００＋Ｆによる同時免疫化がＤＣに対するＭＬＲ刺激活性を制限したことを示す。免疫化後４８時間で、マウスの脾臓から単離したＤＣを、ＭＬＲにおけるＴ細胞の増殖を刺激するために使用した。Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ活性によって測定した。結果は２つのそれぞれの実験の１つを表す。^*Ｐ＜０．０５（示すようなＶ＋Ｆワクチン接種群及びＦワクチン接種群と比較した場合）。図４ｂは、ナイーブのＣＤ４⁺Ｔ細胞と同時培養された、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｆにより免疫化されたマウス、又は、ナイーブの対照マウスの脾臓から単離したＤＣから得られたデータを示す。Ｔ細胞を、新鮮なＤＣを使用して３サイクルについて２日間に１回、再刺激し、その後、ＩＬ−１０陽性細胞、ＩＬ−４陽性細胞及びＩＦＮ−γ陽性細胞の数について、また、ＭＬＲ刺激活性を調節する能力について、それぞれの刺激サイクルの後に分析した。図４ｃにおいて、ＭＬＲを、Ｃ５７マウス由来のＡＰＣ及びＢａｌｂ／ｃマウス由来のＴ細胞を用いて行った。Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥによって測定した。結果は２つの個々の実験を表す。^*Ｐ＜０．０５（示すようなＶ＋Ｆワクチン接種群及びＦワクチン接種群と比較した場合）。 図４ａ〜図４ｃは、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより同時免疫化されたマウスから得られたＤＣがＴｒ細胞をインビトロで誘導することを示す。図４ａは、ｐｃＤＦ１００＋Ｆによる同時免疫化がＤＣに対するＭＬＲ刺激活性を制限したことを示す。免疫化後４８時間で、マウスの脾臓から単離したＤＣを、ＭＬＲにおけるＴ細胞の増殖を刺激するために使用した。Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ活性によって測定した。結果は２つのそれぞれの実験の１つを表す。^*Ｐ＜０．０５（示すようなＶ＋Ｆワクチン接種群及びＦワクチン接種群と比較した場合）。図４ｂは、ナイーブのＣＤ４⁺Ｔ細胞と同時培養された、ｐｃＤＦ１００＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｖ＋Ｆにより免疫化されたマウス、Ｆにより免疫化されたマウス、又は、ナイーブの対照マウスの脾臓から単離したＤＣから得られたデータを示す。Ｔ細胞を、新鮮なＤＣを使用して３サイクルについて２日間に１回、再刺激し、その後、ＩＬ−１０陽性細胞、ＩＬ−４陽性細胞及びＩＦＮ−γ陽性細胞の数について、また、ＭＬＲ刺激活性を調節する能力について、それぞれの刺激サイクルの後に分析した。図４ｃにおいて、ＭＬＲを、Ｃ５７マウス由来のＡＰＣ及びＢａｌｂ／ｃマウス由来のＴ細胞を用いて行った。Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥによって測定した。結果は２つの個々の実験を表す。^*Ｐ＜０．０５（示すようなＶ＋Ｆワクチン接種群及びＦワクチン接種群と比較した場合）。 図５ａ〜図５ｃは、皮膚スコアのデータを示す。 図５ａ〜図５ｃは、皮膚スコアのデータを示す。 図５ａ〜図５ｃは、皮膚スコアのデータを示す。 図６は、同時免疫化前の皮膚試験の結果を示す。 図７は、同時免疫化後の皮膚試験の結果を示す。 図８は、同時免疫化後の皮膚スコアのデータを示す。 図９Ａ〜図９Ｆは、ＦＡＤネコに対する同時免疫化の治療効果を証明するデータを示す。 図９Ａ〜図９Ｆは、ＦＡＤネコに対する同時免疫化の治療効果を証明するデータを示す。 図９Ａ〜図９Ｆは、ＦＡＤネコに対する同時免疫化の治療効果を証明するデータを示す。 図１０Ａ〜図１０Ｃは、ＦＡＤネコに対する同時免疫化の治療効果を証明するデータを示す。 図１０Ａ〜図１０Ｃは、ＦＡＤネコに対する同時免疫化の治療効果を証明するデータを示す。 図１１は、プラスミドｐＶＡＸ１−Ｋ−ＦＳＡ１のマップを示す。

Claims (18)

1. アレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を防止及び抑制するための組成物であって、
   ａ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクター；及び
   ｂ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチド
   を含み、
   前記アレルゲンタンパク質が、ノミのアレルゲンタンパク質、ネコのアレルゲンタンパク質、イヌのアレルゲンタンパク質、チリダニのアレルゲンタンパク質、ピーナッツのアレルゲンタンパク質、スギのアレルゲンタンパク質及びネッタイタマニクダニのアレルゲンタンパク質からなる群より選択される、組成物。
2. アレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を防止及び抑制するためのキットであって、
   ａ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクターを含む第１の容器；及び
   ｂ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドを含む第２の容器
   を含み、
   前記アレルゲンタンパク質が、ノミのアレルゲンタンパク質、ネコのアレルゲンタンパク質、イヌのアレルゲンタンパク質、チリダニのアレルゲンタンパク質、ピーナッツのアレルゲンタンパク質、スギのアレルゲンタンパク質及びネッタイタマニクダニのアレルゲンタンパク質からなる群より選択される、キット。
3. 前記アレルゲンタンパク質が、ＦＳＡ１タンパク質及びそのアレルゲンフラグメントからなる群より選択されるノミのアレルゲンタンパク質である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
4. 前記アレルゲンタンパク質がノミのアレルゲンタンパク質であり、ノミのアレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記真核細胞発現ベクターがｐｃＤＦ６６又はｐｃＤＦ１００である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
5. 前記アレルゲンタンパク質が、Ｆｅｌ ｄＩタンパク質及びそのアレルゲンフラグメントからなる群より選択されるネコのアレルゲンタンパク質である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
6. 前記アレルゲンタンパク質が、Ｃａｎ ｆ１タンパク質、Ｃａｎ ｆ２タンパク質、及び、そのアレルゲンフラグメントからなる群より選択されるイヌのアレルゲンタンパク質である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
7. 前記アレルゲンタンパク質が、Ｄｅｒ ｐ１タンパク質、Ｄｅｒ Ｆ１タンパク質、及び、そのアレルゲンフラグメントからなる群より選択されるチリダニのアレルゲンタンパク質である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
8. 前記アレルゲンタンパク質が、Ａｒａ Ｈ１１、Ａｒａ Ｈ５、及び、そのアレルゲンフラグメントからなる群より選択されるピーナッツのアレルゲンタンパク質である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
9. 前記アレルゲンタンパク質が、Ｃｒｙ ｊ１．１タンパク質、Ｃｔｙ ｊ１．２タンパク質、及び、そのアレルゲンフラグメントからなる群より選択されるスギのアレルゲンタンパク質である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
10. 前記アレルゲンタンパク質が、Ｂｌｏ ｔ５タンパク質、及び、そのアレルゲンフラグメントからなる群より選択されるネッタイタマニクダニのアレルゲンタンパク質である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
11. 前記真核細胞発現ベクターが、アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ＲＳＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０プロモーターからなる群より選択されるプロモーターに作動可能に連結されて含む、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
12. 真核細胞発現ベクターの重量量の、アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドの重量量に対する比率が１：５〜５：１の間である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
13. 真核細胞発現ベクターの重量量の、アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドの重量量に対する比率が１：１である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
14. 真核細胞発現ベクターの、アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドに対するモル比が１：１００，０００〜２０：１００，０００の間である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
15. 真核細胞発現ベクターの、アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドに対するモル比が１５：１００，０００である、請求項１に記載の組成物又は請求項２に記載のキット。
16. アレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を個体において防止及び抑制する方法であって、
    ａ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクター；及び
    ｂ）アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチド
    を個体に投与する工程を含み、
    前記アレルゲンタンパク質が、ノミのアレルゲンタンパク質、ネコのアレルゲンタンパク質、イヌのアレルゲンタンパク質、チリダニ（dust mite）のアレルゲンタンパク質、ピーナッツのアレルゲンタンパク質、スギのアレルゲンタンパク質及びネッタイタマニクダニ（Blomia tropicalis）のアレルゲンタンパク質からなる群より選択される、方法。
17. 前記個体が、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ及びネコの種からなる群より選択される種である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記個体が、前記真核細胞発現ベクターと、アレルゲンタンパク質、又は、前記アレルゲンタンパク質の抗原エピトープを含むポリペプチドとを投与する前に、アレルゲンタンパク質に対するアレルギー反応を有する、請求項１６に記載の方法。