CN106916842B

CN106916842B - 一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原fsa1的表达方法

Info

Publication number: CN106916842B
Application number: CN201710184041.4A
Authority: CN
Inventors: 赵兵; 李延鹏; 陈瑞爱; 温良海
Original assignee: South China Agricultural University; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: South China Agricultural University; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2037-03-24
Also published as: CN106916842A

Abstract

本发明公开一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法，包括以下步骤：1)使用如SEQ ID No.1和PCR SEQ ID No.2所示的引物对进行PCR扩增；2)构建原核表达载体；3)筛选；4)诱导表达；5)纯化和6)复性。该方法各步骤操作简单，快速高效，是一种针对跳蚤唾液过敏原FSA1原核表达蛋白的纯化工艺，该工艺克服了已有工艺复性后复性浓度小，蛋白易聚集的缺陷，并且大大提高生产效率，降低生产成本，适合工业化大规模生产。

Description

一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法

技术领域

本发明涉及一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

跳蚤是世界农场动物以及犬、猫等家养动物最重要的、最常见外寄生昆虫，对犬、猫等小动物的感染率极高,危害极大。跳蚤过敏性皮炎(Flea allergy dermatitis,FAD)是由跳蚤叮咬引起的一种过敏性的皮肤病，造成犬、猫及其它动物的皮炎、剧烈瘙痒以及抓挠导致的二次感染。随着社会经济的快速发展，城市逐渐兴起了宠物热，犬猫的跳蚤问题也成为了人类所面临的问题。根据文献提供的数据，在美国每年用于防治宠物跳蚤的费用超过10亿美元。跳蚤侵扰不仅损害动物健康而且给人类造成大量的经济损失。

猫桎首蚤是跳蚤中分布最广、宿主多的蚤种，在北京郊区猫的猫桎首蚤感染率达到100％，因此也是危害最大的一种蚤类。它的唾液中含有多种过敏原物质，其中最主要的一种是跳蚤唾液过敏原(Flea salivary antigen 1，FSA1)，能诱导机体产生IgE介导的I型过敏反应和IV型过敏反应。

临床诊断FAD可以通过跳蚤提取物的皮试反应，及针对FAD的ELISA检测血清特异性IgE。但是跳蚤提取物依赖于进口，费用昂贵，因此需要找到一种专一性好，价格低廉，检出效果好的替代方法。

经试验证实，利用rFSA1能引发跳蚤过敏性皮炎患犬阳性的皮内测试反应，阳性检出率达到80％。利用rFSA1能刺激FAD患病犬猫外周血T淋巴细胞的增殖。利用rFSA1作为包被抗原，建立的跳蚤过敏性皮炎ELISA检测方法阳性检出率达到80％以上。利用rFSA1和与之编码相匹配的核酸疫苗预防或治疗跳蚤过敏性皮炎可取得理想效果。采用基因工程技术获得过敏原单一组分，其成分单一，纯度高、特异性好、价格低廉，可以提高诊断的精准性，同时能用于犬猫FAD的防治。因此，如何提供一种FSA1过敏原基因克隆、表达、纯化的方法，提高产物的纯度，提高阳性率是本领域技术人员亟待解决的技术问题。不仅具有重要的经济意义，而且具有重要的社会意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速、高效、稳定的猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法，包括以下步骤：

1)PCR扩增：以人工合成的FSA1基因为模板，用如SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；

SEQ ID No.1：5’-CGGGAATTCATGGAAGATATTTGG-3’；

SEQ ID No.2：5’-CGGCTCGAGTTATTTATTTTTTGG-3’；

其中划线部分为酶切位点；

2)构建原核表达载体：将步骤1)得到的扩增产物用EcoR I、Xho I双酶切，与载体质粒连接，得到重组表达质粒；

3)筛选：将步骤2)得到的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，种入LB平板培养基，筛选出含有FSA1重组质粒的阳性大肠杆菌；

4)诱导表达：将所述阳性大肠杆菌种于含有卡那抗性的LB培养基，置于恒温振荡培养箱中培养，得到含有FSA1蛋白的菌体；

5)纯化：将步骤4)的菌体从培养基中分离，重悬破碎，离心收集包涵体，洗涤包涵体，加入变性剂，通过柱层析去除杂质，得到含纯化的FSA1蛋白的洗脱液；

6)复性：将步骤5)得到的含纯化的FSA1蛋白的洗脱液浓缩，滴入蛋白复性缓冲液中复性，透析，获得纯化的rFSA1蛋白。

作为优选，步骤1)中，PCR扩增体系25μL：Exteq酶12.5μL，DNA模板1μL，上游引物和下游引物各0.5μL，补加ddH₂O至25μL。

作为优选，步骤1)中，PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃30s，53℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。

作为优选，步骤2)中，载体质粒为pET28a。

作为优选，步骤4)中，待OD600＝0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1mM进行诱导表达，

作为优选，步骤5)中，所述变性剂为Buffer A。

作为优选，步骤5)中，柱层析的柱体为Ni-NTA柱，先采用5倍体积Buffer A平衡层析柱，接着用Buffer A+B洗脱杂蛋白，最后用Buffer B洗脱收集目的蛋白，其中Buffer A+B为v(Buffer A)：v(Buffer B)＝1:(5-16)。

作为优选，步骤5)中，洗涤所采用的洗涤液为含有10-100mM Tris-HCl、1-10mMEDTA、1-5vt％Triton-X100、20-200mM NaCl的水溶液，洗涤液的pH为7.5-9.0。

作为优选，步骤5)中，所述变性剂为含有60-600mM的KCl、终浓度10-100mM的KH₂PO₄、终浓度6-10M的尿素的水溶液，该包涵体变性剂的pH为7.5-9.0。

作为优选，步骤6)中，所述复性缓冲液为含有1mM的EDTA、250-700mM的L-Arg，该复性缓冲液pH为8.0-9.0。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明在整个工艺中所采用的试剂可以通过多种商业途径得到，且各步骤操作简单，快速高效，是一种针对跳蚤唾液过敏原FSA1原核表达蛋白的纯化工艺，该工艺克服了已有工艺复性后复性浓度小，蛋白易聚集的缺陷，并且大大提高生产效率，降低生产成本，适合工业化大规模生产。

附图说明

图1为实施例1的PCR扩增结果图；

图2为实施例1的重组表达质粒pET28a-FSA1双酶切鉴定；

图3为实施例2的重组FSA1的诱导结果图；

图4为实施例3的rFSA1纯化结果图；

图5为rFSA1蛋白对T淋巴细胞增殖反应的影响图；

图6为血清中特异性IgE结果图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

以下具体实施方式中，如未特殊说明，所采用的试剂或器材均可通过市售方式或常规试验手段获得。

实施例1：重组FSA1表达质粒的构建

以人工合成FSA1为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2作为特异性引物进行PCR扩增；取5μL反应产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统检测扩增结果，扩增结果如图1所示。

SEQID No.1：5’-CGGGAATTCATGGAAGATATTTGG-3’；

SEQ ID No.2：5’-CGGCTCGAGTTATTTATTTTTTGG-3’；

PCR扩增体系25μL：Exteq酶12.5μL，DNA模板1μL，上游引物和下游引物各0.5μL，补加ddH₂O至25μL；

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃30s，53℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。

将得到的PCR扩增产物用胶回收纯化试剂盒纯化后，用EcoR I和Xho I双酶切扩增产物，同时pET28a也用EcoR I和Xho I双酶切，双酶切鉴定结果如图2所示，切胶回收纯化经双酶切目的基因和pET28a载体片段，目的基因的序列如SEQ ID No.3所示，放置于连接仪16℃过夜连接，得到重组质粒pET28a-FSA1，将所述重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布LB平板，挑取单个菌落，接种于LB培养基中培养，碱裂解法抽提质粒，经双酶切和PCR鉴定后，获得包含重组质粒pET28a-FSA1的阳性重组大肠杆菌。

实施例2：FSA1原核表达蛋白的诱导表达和粗纯化

将实施例1得到的阳性重组大肠杆菌划线接种于卡那抗性的LB平板培养，37℃培养过夜，次日挑取单菌落接种于10mL LB培养液中，200rpm振荡培养，培养至OD600达0.6。加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L进行诱导表达，诱导表达4h后，将诱导表达的菌液进行超声波破碎，经超声波破碎后的所述诱导表达的菌液离心并收集包涵体，用洗涤液洗涤包涵体，洗涤液为含有终浓度50mM Tris-HCl、1mM EDTA、体积比1％Triton-X100、100mM NaCl的水溶液，该包涵体洗涤液的pH为8.0。洗涤后8000rpm/min离心10min倒去上清，连续3次；最后用含变性剂溶解包涵体，变性剂为含有终浓度300mM的KCl、终浓度50mM的KH₂PO₄、终浓度5-10M的尿素的水溶液，该包涵体变性剂的pH为8.0；过夜搅拌溶解，包涵体的电泳条带图如图3所示。用0.45μm孔径的滤膜过滤后即得溶液澄清、杂质少的包涵体变性可溶性蛋白。

实施例3：FSA1原核表达蛋白Ni-NTA柱亲和层析精纯化

用5倍柱体积Buffer A平衡亲和层析柱，将实施例2得到的可溶性蛋白通过Ni-NTA柱亲和层析纯化以吸附目的蛋白，然后再用5倍柱体积Buffer A平衡层析柱，接着用10倍柱体积Buffer A+B洗脱杂蛋白，最后用Buffer B洗脱收集目的蛋白，所收集的目的蛋白溶液经蛋白显色液检测为接近无色确认收集完成。Buffer A为含有终浓度300mM的KCl、终浓度50mM的KH₂PO₄、终浓度5-10M的尿素的水溶液；Buffer B为含有终浓度300mM的KCl、终浓度50mM的KH₂PO₄、终浓度8M的尿素、500mM咪唑的溶液，Buffer A+B为V(Buffer A)：V(BufferB)＝1:10。目的蛋白的蛋白电泳条带图如图4所示。

实施例4：FSA1原核表达蛋白的复性与透析除盐

将实施例3收集的目的蛋白溶液经孔径为10kd超滤柱浓缩后，以v(目的蛋白)：v(蛋白复性液)＝1：20逐滴加入蛋白复性液中复性48h，复性缓冲液的各组分终浓度分别为1mM的EDTA、500mM的L-Arg，该复性缓冲液pH为8.5。复性完成后对所述蛋白复性液置于透析袋中透析除盐。将复性蛋白装入透析袋(孔径为6kd)中，透析袋置于含有PBS透析液的装置，并不断缓慢搅拌，PBS进液管与初夜管流量保持相同，4℃持续透析36h，得到纯化的rFSA1蛋白。

检测实施例

1：FSA1原核表达蛋白的具体应用

使用MTT法检测实施例4得到的纯化的rFSA1蛋白的T淋巴细胞增殖反应，结果如图5所示。该rFSA1蛋白对FAD患病猫外周血T淋巴细胞增殖活性检测影响如图，添加了rFSA1蛋白作为刺激药物组的T淋巴细胞增殖活性显著高于添加BSA作为刺激药物的对照组，说明rFSA1具有生物活性。

2.检测患FAD猫血清特异性IgE

以实施例4得到的纯化的rFSA1蛋白作为包被抗原，利用ELISA法检测的FAD患病猫的血清特异性IgE，其结果如图6所示，显示实验组的OD值显著高于健康猫对照组，说明该rFSA1蛋白具有较高的猫血清特异性IgE浓度。

以下优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过下述优选实施例己对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东温氏大华农生物科技有限公司

<120> 一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法

<130> 一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgggaattca tggaagatat ttgg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggctcgagt tatttatttt ttgg 24

<210> 3

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggaagata tttggaaagt taataaaaaa tgtacatcag gtggaaaaaa tcaagataga 60

aaactcgatc aaataattca aaaaggccaa caagttaaaa tccaaaatat ttgcaaatta 120

atacgcgata aaccacatac aaatcaagag aaagaaaaat gtatgaaatt ttgcaaaaaa 180

gtttgcaaag gttatagagg agcttgtgat ggcaatattt gctactgcag caggccaagt 240

aatttaggtc ctgattggaa agtaagcaaa gaatgcaaag atcccaataa caaagattct 300

cggcctacgg aaatagttcc atatcggcaa caattagcaa ttccaaatat ttgcaaacta 360

aaaaattcag agaccaatga agattccaaa tgcaaaaaac attgcaaaga aaaatgtcgt 420

ggtggaaatg atgctggatg tgatggaaac ttttgttatt gtcggccaaa aaataaataa 480

Claims

1.一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法，包括以下步骤：

1）PCR扩增：以人工合成的FSA1基因为模板，用如SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQID No.2所示的下游引物，进行PCR扩增，得到扩增产物, 目的基因的序列如SEQ ID No.3所示；

SEQ ID No.1：5’-CGGGAATTCATGGAAGATATTTGG-3’；

SEQ ID No.2：5’-CGGCTCGAGTTATTTATTTTTTGG-3’；

2）构建原核表达载体：将步骤1）得到的扩增产物用EcoR I、Xho I双酶切，与pET28a载体质粒连接，得到重组表达质粒；

3）筛选：将步骤2）得到的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，种入LB平板培养基，筛选出含有重组质粒的阳性大肠杆菌；

4）诱导表达：将所述阳性大肠杆菌种于含有卡那抗性的LB培养基，置于恒温振荡培养箱中培养，得到含有FSA1蛋白的菌体；

5）纯化：将步骤4）的菌体从培养基中分离，重悬破碎，离心收集包涵体，洗涤包涵体，加入变性剂，通过柱层析去除杂质，得到含纯化的FSA1蛋白的洗脱液；所述变性剂为含有终浓度300mM的KCl、终浓度50mM的KH₂PO₄、终浓度6-10M的尿素的水溶液，该包涵体变性剂的pH为7.5-9.0；

6）复性：将步骤5）得到的含纯化的FSA1蛋白的洗脱液浓缩，滴入蛋白复性缓冲液中复性，透析，获得纯化的rFSA1蛋白；

所述复性缓冲液为含有1mM的EDTA、500mM的L-Arg，该复性缓冲液pH为8.0-9.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，53℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中，待OD600=0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1mM进行诱导表达。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）中，柱层析的柱体为Ni-NTA柱，先采用5倍体积Buffer A平衡层析柱，接着用Buffer A+B洗脱杂蛋白，最后用Buffer B洗脱收集目的蛋白，其中Buffer A+B为v（Buffer A）：v（Buffer B）=1:（5-16）；其中，Buffer A为含有终浓度300mM的KCl、终浓度50mM的KH₂PO₄、终浓度5-10M的尿素的水溶液；Buffer B为含有终浓度300mM的KCl、终浓度50mM的KH₂PO₄、终浓度8M的尿素、500mM咪唑的溶液。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）中，洗涤所采用的洗涤液为含有10-100mM Tris-HCl、1-10mM EDTA、1-5vt%Triton-X100、20-200mM NaCl的水溶液，洗涤液的pH为7.5-9.0。