BRPI0620459A2

BRPI0620459A2 - composição, e kit para prevenir e inibir uma resposta alérgica contra uma proteìna alergenica, e, método para prevenir e inibir uma reação alérgica a uma proteìna alergenica em um indivìduo

Info

Publication number: BRPI0620459A2
Application number: BRPI0620459-7A
Authority: BR
Inventors: Bin Wang; Huali Jin; Youmin Kang; Hsien-Jue Chu; Kaleung Ng
Original assignee: Univ China Agricultural; Wyeth Corp
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2011-11-08
Also published as: WO2007076084A2; JP2010513220A; AU2006330880A1; WO2007076084A3; CA2631467C; US20130230551A1; AU2006330880B2; KR20080078850A; US20170112918A9; EP1963513A2; EP1963513B1; US20150086593A1; CN1824291A; US20070166335A1; NZ596043A; CN100374152C; US8349333B2; US8795675B2; CA2631467A1; EP1963513A4

Abstract

COMPOSIçãO, E KIT PARA PREVENIR E INIBIR UMA RESPOSTA ALéRGICA CONTRA UMA PROTEìNA ALERGeNICA, E, MéTODO PARA PREVENIR E INIBIR UMA REAçãO ALéRGICA A UMA PROTEINA ALERGeNICA EM UM INDIVìDUO. Composições e kits para inibir uma resposta alérgica contra uma proteína alergenica são descritos. As composições compreendem um vetor de expressão de célula eucariótica contendo seqUencias de nucleotídeos codificando uma proteína alergenica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigenico de referida proteína alergenica, e uma proteína alergenica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigenico da proteína alergenica. Os kits compreendem um primeiro recipiente que compreende um vetor de expressão de célula eucariótica contendo sequencias de nucleotídeos codificando uma proteína alergenica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigenico da proteína alergenica e um segundo recipiente que compreende uma proteína alergenica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigenico da referida proteína alergenica. As composições e kits para inibir uma resposta alérgica contra uma proteína alergenica de pulga, uma proteína alergenica de felino, uma proteína alergenica de canino, uma proteínaalergenica de ácaro de poeira, uma proteína alergenica de amendoim, uma proteína alergenica de cedro japones, e uma proteína alergenica de blomia tropicalis são descritos. Os métodos de usar estas composições e kits são também descritos.

Description

"COMPOSIÇÃO, KIT E MÉTODO PARA PREVENIR E INIBIR UMA RESPOSTA ALÉRGICA CONTRA UMA PROTEÍNA ALERGÊNICA, PARA PREVENIR E INIBIR UMA RESPOSTA ALÉRGICA CONTRA UMA PROTEÍNA ALERGÊNICA" CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à composições e kits que são úteis para prevenir e inibir reações alérgicas contra alérgenos, e a métodos de usar tais composições e kits. A presente invenção provê composições, kits e métodos para prevenir e inibir dermatite devido à alergia a pulga, reações alérgicas a pêlo ou raivas de caninos e gatos e, ácaros, de poeira, amendoins, pólen de cedro japonês e alérgenos de blomia tropicalis.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Reações alérgicas a vários alérgenos representam significantes preocupações com a saúde, particularmente em exemplos em que a reação alérgica induz reações severas e/ou hipersensibilidade imediata induzida por alérgeno (AIH).

Alergia é considerada como a conseqüência de persistente ativação de células T dirigindo inflamação patogênica contra derme de hospedeiro por alérgenos específicos. Diversas abordagens são usadas para melhorar AIH e essas incluem fármacos imunossupressivos não específicos ou anticorpos monoclonais marcados para células T ou B (A. J. Van Oosterhout et al, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 17, 386 (1 de Setembro de 1997); P. Proksch et al, J Immunol 174, 7075 (1 de Junho de 2005)). Entretanto, esta situação é comprometida como recipientes tratados em longo prazo podem tornar-se geralmente comprometidos em sua habilidade para combater infecções. Redirecionar imunidade de tipo de Th2 a tipo de Thl tem também sido demonstrado com sucesso limitado (S. Jilek, C. Barbey, F. Spertini, B. Corthesy, J Immunol 166, 3612 (1 de Março de 2001)). Uma descoberta recente de células T regulatórias, incluindo as células Treg de CD4+CD25+ derivadas de timo ocorrendo naturalmente (I. M. de Kleer et al, J Immunol 172, 6435 (15 de Maio de 2004); D. Lundsgaard, T. L. Holm, L. Hornum, H. Markholst, Diabetes 54, 1040 (1 de Abril de 2005); M. J. McGeachy, L. A. Stephens, S. M. Anderton, J Immunol 175, 3025 (1 de Setembro de 2005); I. Bellinghausen, B. Klostermann, J. Knop, J. Saloga, J Allergy Clin Immunol 111, 862 (1 de Abril de 2003); Ε. M. Ling et al, Lancet 363, 608 (21 de Fevereiro de 2004); e J. Kearley, J. E. Barker, D. S. Robinson, C. M. Lloyd. J. Exp. Med., jem.20051166 (28 de Novembro de 2005)), células Th3 induzidas mucosais e células Tr de CD4+CD25- induzidas por antígeno têm sido propostas para serem usadas como imuno- reguladores ou supressores ou patogênese auto-reativa (H. Fukaura et al, J. Clin. Invest. 98, 70 (1 de Julho de 1996)). Várias abordagens têm sido exploradas para induzir células T regulatórias a reprimir as células T auto- reativas. Preferencialmente, indução de células T regulatórias de antígeno específico marcadas para alergia, asma e antígenos de doença autoimune são consideradas uma estratégia promissora. Várias linhas de evidência têm indicado que indução de célula T regulatória de específica de antígeno 1 (TO) é possível via utilidade de DCs não amadurecidos, imunogenes subótimos ou bloqueio parcial das moléculas co-estimulatórias em DCs (A. Kumanogoh et al., J Immunol 166, 353 (1 de Janeiro de 2001); Μ. K. Levings et al, Blood 105, 1 162 (1 de Fevereiro de 2005); e S. K. Seo et al, Nat Med 10, 1088 (1 de Outubro de 2004)). Todas essas abordagens são feitas cada in vitro ou em condições experimentais. Indução de células Tr que podem inibir a função de células T de específicas de antígeno in vivo por co-inoculação de DNA correspondido a antígeno e antígenos de proteína como vacinas co- administradas (H. Jin et al, Virology 337, 183 (20 de Junho de 2005)).

A característica principal da pulga não hospedeira é que é um parasita hematofágico que pode ser encontrado no corpo de quaisquer espécies de mamífero ou aves de animais. Ctenocephalides felis é um parasita que ocorre principalmente em gatos e cães, enquanto Ctenocephalides canis é limitada a cães domésticos e cães selvagens. Dermatite devido à alergia a pulga (FAD) é a mais freqüentemente vista doença de pele em gatos e cães. FAD resulta quando um parasita de pulga morde e sua saliva serve como um irritante e elícita uma reação alérgica. A localização da mordida apresenta-se vermelha, inchada, irritada e coçando. Freqüentemente o animal coçará na mordida com suas patas, levando o ferimento a virar uma ulceração cutânea e elitar ainda infecções bacterianas e fungicas. Isto coloca um grande perigo para o cão ou gato e atualmente nenhum método farmacoterapêutico preventivo efetivo existem para esta doença.

Em geral, alérgeno de pulga refere-se às várias proteínas dimensionadas diferentemente de antígenos de pulga que causam uma reação alérgica. Em algumas partes da literatura isto é referido como proteína alergênica de saliva de pulga de felino FSAl ou Cte f 1. GeneBank AF 102502, que é incorporado aqui por referência, descreve as seqüências de nucleotídeo (SEQ ID NO:l) codificando a proteína FSAl ou Cte f 1 derivada da glândula salivar de pulga de Ctenocephalides felis. A seqüência de nucleotídeo 653 inclui seqüências de codificação 1-531 que incluem seqüências de codificação para o peptídeo de sinal (1-54) e seqüência de proteína madura (55-528). GeneBank AAD 17905, que é incorporado aqui por referência, descreve as seqüências de amini (SEQ ID NO:2) da proteína FSAl ou Cte fl derivada da glândula salivar de pulga de Ctenocephalides felis. Incluindo o peptídeo de sinal (1- 18) e seqüência de proteínas maduras (19-176).

A proteína principal alergênica de felino é Fel dl. GeneBank M74953, que é incorporado aqui por referência, descreve a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeos (SEQ ID NO:3) codificando a proteína Fel dl derivada do alérgeno principal do gato doméstico. Possui a seqüência de peptídeo de secreção B secundária. Esta seqüência de Fel dl é 416 bp mRNA incluindo a região não traduzida 5' composta de seqüências 1-25 e a seqüência de codificação sendo seqüências 26- 292 codificando 88 aminoácidos (SEQ ED NO:4; GeneBank AAC41617, que é incorporado aqui por referência). O peptídeo de sinal é codificado por 26-79 e a proteína madura é codificada por 80-289. A região não traduzida 3' é 293-416. GeneBank M74952, que é incorporado aqui por referência, descreve o aminoácido de seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:5) codificando a proteína Fel dL derivada do alérgeno principal do gato doméstico. Esta seqüência de Fel dL é 410 bp mRNA incluindo a região não traduzida 5' composta de seqüências 1-7 e a seqüência de codificação sendo seqüências 8- 286 codificando 92 aminoácidos (SEQ ID NO:6; GeneBank AAC37318, que é incorporado aqui por referência). O peptídeo de sinal é codificado por 8-73 e a proteína madura é codificada por 74-283. A região não traduzida 3' é 287- 410.

As principais proteínas alergênicas de caninos são os promotores lipídicos salivares Can f1 e Can f2. GeneBank AF027177, que é incorporado aqui por referência, descreve a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeos (SEQ ID NO:7) codificando a proteína Cn f1 derivada das proteínas lipocalinas salivares do alérgeno principal do cão doméstico. Esta seqüência de Can f1 tem 525 bp mRNA codificando 174 aminoácidos (SEQ ID NO:8; GeneBank AAC48794, que é incorporado aqui por referência).

GeneBank AF027178, que é incorporado aqui por referência, descreve a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeos (SEQ ID NO.9) codificando a proteína Can f2 derivada das proteínas lipocalinas salivares do alérgeno principal do cão doméstico. Esta seqüência de Can f2 é 791 bp mRNA incluindo uma seqüência de codificação de 195-737 codificando 180 aminoácidos (SEQ ID NO: 10; GeneBank AAC48795, que é incorporado aqui por referência).

GeneBank Ul 1695, que é incorporado aqui por referência, descreve a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeos (SEQ ID NO: 11) codificando o antígeno de proteína de fonte de alergia aos ácaros Der P 1. Esta seqüência de Der Pl é 1099 bp mRNA, incluindo uma seqüência de codificação de 50- 1012 codificando 180 aminoácidos (SEQ ED NO: 12;

GeneBank AAB60125, que é incorporado aqui por referência). A seqüência de codificação inclui seqüências de codificação 50-109 que codificam um peptídeo de sinal e seqüências de codificação 344-1009 que codificam o peptídeo maduro. GeneBank AAB60125 descreve um peptídeo de sinal que inclui aminoácidos 1-20 e a proteína madura que inclui aminoácidos 99-320.

GeneBank L77197, que é incorporado aqui por referência, descreve a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeos (SEQ ID NO: 13) codificando o antígeno de proteína de fonte de alergia ao amendoim Ara h II. Esta seqüência de Ara h II é seqüência de 717 bp codificando 110 aminoácidos e incluindo um sinal de poliA 562-567.

GeneBank AF059616, que é incorporado aqui por referência, descreve a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeos (SEQ ID NO: 14) codificando o antígeno de proteína de fonte de alergia ao amendoim Ara h H. Esta seqüência de Ara h 5 é seqüência de 743bp incluindo uma seqüência de codificação de 17- 412. GeneBank AAD55587, que é incorporado aqui por referência, descreve a proteína de 131 aminoácidos (SEQ ID NO: 15).

GeneBank AB081309, que é incorporado aqui por referência, descreve a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeos (SEQ ID NO: 16) codificando o antígeno de origem de alergia ao cedro japonês (<cryptomeria japonica) Cry j 1.1. Esta seqüência de Cry j 1.1 é seqüência de 1295 bp incluindo uma seqüência de codificação de 62-1 186 em que um peptídeo de sinal é codificado por 62-124 e a proteína madura é codificada por 125-1 183 e um sítio de poliA em 1295. GeneBank BAB86286, que é incorporado aqui por referência, descreve a proteína de 374 aminoácidos (SEQ ID NO: 17) incluindo um peptídeo de sinal de aminoácidos 1-21 e uma proteína madura de 22-374 aminoácidos.

GeneBank AB081310, que é incorporado aqui por referência, descreve a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeos (SEQ ED NO: 18) codificando o antígeno de origem de alergia ao cedro japonês (cryptomeria japonica) Cry j 1.2. Esta seqüência de Cry j 1.2 é uma seqüência de 1313 bp incluindo a seqüência de codificação de 46-1 170 em que um peptídeo de sinal é codificado por 46-108 e a proteína madura é codificada por 109-1 167 e um sítio de poliA em 1313. GeneBank BAB86287, que é incorporado aqui por referência, descreve a proteína de 374 aminoácidos (SEQ ID NO: 19) incluindo um peptídeo de sinal de aminoácidos 1-21 e uma proteína madura de aminoácidos 22-374.

GeneBank U59102, que é incorporado aqui por referência, descreve a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeos (SEQ ID N0:20) codificando o antígeno de proteína de fonte de alergia a blomia tropicalis Blo t 5. Esta seqüência de Blo t 5 é seqüência de 537 bp incluindo uma seqüência de codificação de 33-437. GeneBank AAD 10850, que é incorporado aqui por referência, descreve a proteína de 134 aminoácidos (SEQ ID NO:21).

Permanece a necessidade de composições e métodos de prevenir e inibir as reações alérgicas induzidas por estes alérgenos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à composições para prevenir e inibir uma resposta alérgica contra uma proteína alergênica. As composições compreendem:

a) um vetor de expressão de célula eucariótica contendo seqüências de nucleotídeos codificando uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica; e,

b) uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica. A presente invenção provê composições para prevenir e inibir uma resposta alérgica contra uma proteína alergênica selecionada dentre o grupo consistindo de: uma proteína alergênica de pulga; uma proteína alergênica de felino; uma proteína alergênica de canino; uma proteína alergênica de ácaro; uma proteína alergênica de amendoim; uma proteína alergênica de cedro japonês; e uma proteína alergênica de blomia tropicalis.

A presente invenção ainda refere-se a kits para prevenir e inibir uma resposta alérgica contra uma proteína alergênica. Os kits compreendem:

a) um primeiro recipiente compreendendo um vetor de expressão de célula eucariótica contendo seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica; e

b) um segundo recipiente uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica.

A presente invenção provê kits para prevenir e inibir uma resposta alérgica contra uma proteína alergênica selecionada dentre o grupo consistindo de: uma proteína alergênica de pulga; uma proteína alergênica de felino; uma proteína alergênica de canino; uma proteína alergênica de ácaro; uma proteína alergênica de amendoim; uma proteína alergênica de cedro japonês; e uma proteína alergênica de blomia tropicalis.

A presente invenção ainda refere-se a métodos de prevenir e inibir uma reação alérgica para uma proteína alergênica em um indivíduo. Os métodos compreendem a etapa ou etapas de administrar a um indivíduo

a) um vetor de expressão de célula eucariótica contendo seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica; e b) uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica.

A presente invenção provê prevenir e inibir uma reação alérgica a uma proteína alergênica em um indivíduo onde referida proteína alergênica é selecionada dentre o grupo consistindo de: um proteína alergênica de pulga; uma proteína alergênica de ácaro; uma proteína alergênica de amendoim; uma proteína alergênica de cedro japonês; e uma proteína alergênica de blomia tropicalis.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figuras 1a-1c referem-se a um modelo de alergia a pulga em camundongos. Camundongos C57b/6 foram iniciados duas vezes bissemanalmente com antígenos de pulga ou solução salina como um controle negativo, desafiado com os antígenos de pulga, ou PBS como o controle negativo, histamina como o controle positivo intradermicamente. Na Figura 1a, as reações locais após o teste de pele foram medidos em 30 min após o desafio. Figura 1b mostra antígenos anti-pulga de produção de IgB. Na Figura 1c, respostas de proliferação de células T de CD4+ estimuladas por antígenos de pulga in vitro, foram testadas em camundongos. Resultados são representativos de pelo menos três experimentos. * P<0.05, comparado com grupos de controle nativos como indicado.

Figuras 2a-2d mostram que co-imunização de DNA e proteína suprimem o desenvolvimento de reação de hiper-sensitividade imediata. Figura 2a mostra dados de testes de pele de camundongos após co-imunização com F ou pcDFlOO+F. Figura 2b mostra que respostas de pele dependente de dose em camundongos após co-imunização com pcDFlOO+F é mostrada. Figura 2c mostra níveis de antígeno de anti-pulga de IgE e IgG 1 após indução e tratamento. Figura 2d mostra respostas de proliferação de células T de CD4+ estimuladas por antígenos específicos de pulga in vitro. Resultados são representativos de pelo menos três experimentos. * P<0.05, comparado com grupos de vacinação V+F e F como indicado.

Figuras 3a-3c mostram que células T de CD4+CD25- são responsáveis para a supressão observada. Na Figura 3a, 5 X 105 de células T de CD3+ foram isoladas dos baços de camundongos imunizados de antígeno de pulga e adicionados a placas de 96 cavidades. Ao mesmo tempo, 1 X 105 de esplenócitos de camundongos, nativos, F, V+F e imunizados com pcDF100+F foram também adicionados à mesma placa. Similarmente, 1 X 105 de células não T ou células T, CD8+ purificado, CD4+ ou células T de CD4+CD25- foram isoladas do baço de camundongos imunizados com V+F ou pcDF100+F. Essas co- culturas foram estimuladas com antígeno de pulga (50ug/ml) na presença de 1 X 105 de DCs derivados de medula óssea por 48 h in vitro. Proliferação foi examinada por MTS-PMS (Promega) de acordo com instruções de fabricantes e índice de estimulação (SI) foi determinado pela fórmula: contagens de antígenos de pulga estimulados/contagens de culturas não estimuladas). Na Figura 3b, 1 X 106 de esplenócitos de camundongos nativos, F, e imunizados com V+F e pcDF100+F foram adotivamente transferidos nos camundongos nativos C57. Similarmente, 1 χ 106 de células não T ou células Τ, 1 χ 106 de CD8+purificado, CDA+, 5 χ 105 de células T de CD4+CD25- e CD4+CD25+ foram isoladas dos baços de camundongos de controle nativos ou imunizados com pcDF100+F, V+F, F e foram adotivamente transferidos nos camundongos iniciados com antígenos de pulga singenêicos e respostas de teste de pele foram examinadas. Figura 3c mostra que co-administração de DNA e proteína induz supressão de antígeno específico. 1 χ 106 de células T de CD4+CD25- foram isoladas dos baços de camundongos de controle nativos ou imunizados com pcDF100+F, V+F e foram adotivamente transferidas nos camundongos nativos, que foram então imunizados com antígeno específico de pulga ou proteína de OVA não específica 24 horas após transferência, então células T CD4+ foram isoladas e sua proliferação foi analisada. Resultados mostrados na figura são representativos de dois experimentos. * P<0.05 comparado com transferências de V+F e F como indicado.

Figuras 4a-4c mostram que DCs de camundongos co- imunizados de pcDFlOO+ induzem células Tr in vitro. Figura 4a mostra atividades estimulatórias de MLR restritas à co-imunização de pcDFlOO+F nos DCs. 48h após imunização, DCs isolados do baço de camundongos foram usados para estimular a proliferação de células T em MLR. Proliferação de células T foi medida por atividade de CFSE. Resultados são representativos de um ou dois experimentos respectivos. * P<0,05 comparado com grupos de vacinação de V+F e F como indicado. Figura 4b mostra dados de DCs isolados dos baços de camundongos de controle nativos ou imunizados de pcDFlOO+F, V+F, F co-cultivados com células T de CD4+ de nativos. As células T foram reestimuladas pelo menos uma vez por dois dias para 3 ciclos, usando DCs frescos, e foram então analisadas após cada ciclo de estimulação para números de células positivas de IL-10, IL-4 e TFN -γ, e para a habilidade para atividades estimulatórias de MLR regulado. Na Figura 4c, MLR foi realizado com APC de camundongos de C57 e células T de camundongos Balb/c. Proliferação de células T foi medida por CFSE. Resultados são representativos de dois experimentos individuais. * P<0.05 comparado com grupos de vacinação de V+F e F como indicado.

Figuras 5a-5c mostram dados de escores no exame dermatológico.

Figura 6 mostra resultados de testes de pele antes de co- imunização.

Figura 7 mostra resultados de testes de pele após co- imunização.

Figura 8 mostra dados de escores no exame dermatológico após co-imunização.

Figuras 9A-9F mostram dados demonstrando efeitos terapêuticos de co-imunização nos gatos FAD.

Figuras IOA-IOC mostram dados demonstrando efeitos terapêuticos de co-imunização nos gatos FAD.

DESCRIÇÃO DE FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS DA INVENÇÃO

A presente invenção provê composições, kits e métodos que previnem e inibem reações alérgicas, e hipersensibilidade imediata induzida por alérgenos. A presente invenção provê composições, kits e métodos que previnem e inibem dermatite devido à alergia a pulga, composições, kits e métodos que previnem e inibem alergia aos felinos, composições, kits e métodos que previnem e inibem alergia aos caninos, composições, kits e métodos que previnem e inibem alergia aos ácaros, composições, kits e métodos que previnem e inibem alergia ao amendoim, composições, kits e métodos que previnem e inibem alergia ao cedro japonês e composições, kits e métodos que previnem e inibem alergia a blomia tropicalis.

As composições da invenção compreendem uma proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreendem um epítopo antigênico da proteína alergênica e um vetor de expressão que codifica uma proteína alergênica ou um peptídeo, ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica.

Os kits da invenção compreendem um recipiente que compreende uma proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica e recipiente que compreende um vetor de expressão que codifica uma proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica.

Os métodos da invenção compreendem administrar as composições da invenção e/ou os componentes de um kit da invenção em combinação para um indivíduo que tem ou é suscetível às reações alérgicas, ou hipersensibilidade imediata induzida por alérgeno.

A proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usada no método, e proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método tem superposição de seqüência de aminoácido tal que elas compartilham epítopos, isto é, pelo menos um epítopo da proteína alergênica JO ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usado no método é a mesma como pelo menos um epítopo da proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método. Em algumas formas de realização, a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usado no método é a mesma que a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método. Em algumas formas de realização, a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usado no método é um fragmento da proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método. Em algumas formas de realização, a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método é um fragmento da proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usado no método. Em algumas formas de realização, a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usado no método é um fragmento da proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método. Em algumas formas de realização, uma ou ambas: 1) proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usado no método e 2) a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método é idêntica a uma proteína ocorrendo naturalmente que é um alérgeno. Em algumas formas de realização, ambas: 1) a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usado no método e 2) a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método são idênticas a uma proteína ocorrendo naturalmente que é um alérgeno. Em algumas formas de realização, uma ou ambas, 1) a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usado no método e 2) a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método é idêntica a um fragmento de uma proteína ocorrendo naturalmente que é um alérgeno. Em algumas formas de realização, ambas, 1) a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usado no método e 2) a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método são idênticas a um fragmento de uma proteína ocorrendo naturalmente que é um alérgeno. Em algumas formas de realização, a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usado no método é idêntica a um fragmento de uma proteína ocorrendo naturalmente que é um alérgeno e a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método é idêntica a uma proteína ocorrendo naturalmente que é um alérgeno. Em algumas formas de realização, a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica presente na composição ou kit e usado no método é idêntica a uma proteína ocorrendo naturalmente que é um alérgeno e a proteína alergênica ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico da proteína alergênica codificado pelo vetor de expressão presente na composição ou kit e usado no método é idêntica a um fragmento de uma proteína ocorrendo naturalmente que é um alérgeno.

Em algumas formas de realização, a composição ou kit inclui uma proteína alergênica tal como uma proteína de um patógeno, alimento, fator ambiental ou irritante. Em algumas formas de realização, a composição ou kit inclui um peptídeo ou proteína que inclui um epítopo antigênico de uma proteína alergênica tal como uma proteína de um patógeno, alimento, fatores ambientais ou irritantes. Similarmente, em algumas formas de realização, a composição ou kit inclui um vetor de expressão que codifica uma proteína alergênica tal como uma proteína de um patógeno, alimento ou irritante, e em algumas formas de realização, a composição ou kit inclui um vetor de expressão que codifica um peptídeo ou proteína que inclui um epítopo antigênico de uma proteína alergênica tal como uma proteína de um patógeno, alimento, fator ambiental ou irritante.

Em algumas formas de realização, uma proteína alergênica ou peptídeo ou proteína que inclui um epítopo antigênico de uma proteína alergênica que é codificado pelo vetor de expressão é idêntica à proteína alergênica ou peptídeo ou proteína que inclui um epítopo antigênico de uma proteína alergênica incluída na composição ou kit. Em algumas formas de realização, uma proteína alergênica ou peptídeo ou proteína que inclui um epítopo antigênico de uma proteína alergênica que é codificado pelo vetor de expressão é diferente da proteína alergênica ou peptídeo ou proteína que inclui um epítopo antigênico de uma proteína alergênica incluída na composição ou kit. Em algumas formas de realização, o peptídeo ou proteína incluída na composição é a proteína alergênica. Em algumas formas de realização, o peptídeo ou proteína incluída na composição é um fragmento da proteína alergênica. Em algumas formas de realização, o peptídeo ou proteína codificado pelo vetor de expressão é a proteína alergênica. Em algumas formas de realização, o peptídeo ou proteína codificado pelo vetor de expressão é um fragmento da proteína alergênica. De acordo com a invenção, os métodos compreendem administrar as composições em quantidades suficientes para suprimir a reação alérgica contra a proteína alergênica quando o indivíduo é subseqüentemente exposto a tal proteína.

Em algumas formas de realização, a presente invenção provê inibidores para dermatite devido à alergia a pulga. O inibidor de dermatite devido à alergia a pulga da presente invenção compreende um vetor de expressão de célula eucariótica contendo proteína alergênica salivar de pulga (tal como antígeno salivar de felis 1 (FSA1 ou Cte fl)) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica, em combinação com uma proteína alergênica salivar de pulga (tal como antígeno salivar de felis 1 (FSA1 ou Cte fl)) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica.

Em algumas formas de realização, a presente invenção provê inibidores para alergia aos felinos. O inibidor de alergia aos felinos da presente invenção compreende um vetor de expressão de célula eucariótica contendo proteína alergênica de felino (tal como Fel dl) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica, em combinação com uma proteína alergênica de felino (tal como Fel dl) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica.

Em algumas formas de realização, a presente invenção provê inibidores para alergia aos caninos. O inibidor de alergia aos caninos da presente invenção compreende um vetor de expressão de célula eucariótica contendo proteína alergênica de canino (tal como Can fl ou Can f2) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica, em combinação com uma proteína alergênica de canino (tal como Can fl ou Can f2) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica.

Em algumas formas de realização, a presente invenção provê inibidores para alergia aos ácaros. O inibidor de alergia aos ácaros da presente invenção compreende um vetor de expressão de célula eucariótica contendo proteína alergênica de alergia aos ácaros (tal como Der Pl ou Der Fl) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica, em combinação com uma proteína alergênica de alergia aos ácaros (tal como Der Pl ou Der Fl) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica.

Em algumas formas de realização, a presente invenção provê inibidores para alergia ao amendoim. O inibidor de alergia ao amendoim da presente invenção compreende um vetor de expressão de célula eucariótica contendo uma proteína alergênica de alergia ao amendoim (tal como Ara HII ou Ara H5) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica, em combinação com uma proteína alergênica de proteína de amendoim (tal como Ara HII ou Ara H5) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica.

Em algumas formas de realização, a presente invenção provê inibidores para alergia ao cedro japonês. O inibidor de alergia ao cedro japonês da presente invenção compreende um vetor de expressão de célula eucariótica contendo uma proteína alergênica de alergia ao cedro japonês (tal como Cry j 1.1 ou Cry j 1.2) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica, em combinação com uma proteína alergênica de alergia ao cedro japonês (tal como Cry j 1.1 ou Cry j 1.2) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica.

Em algumas formas de realização, a presente invenção provê inibidores para alergia a blomia tropicalis. O inibidor de alergia a blomia tropicalis da presente invenção compreende um vetor de expressão de célula eucariótica contendo uma proteína alergênica de alergia a blomia tropicalis (tal como Blo t5) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica, em combinação com uma proteína alergênica de alergia a blomia tropicalis (tal como Blo t5) ou um peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica.

A proteína alergênica pode ser expressada em Escherichia coli ou células eucarióticas (por exemplo, células de levedura ou CHO), por exemplo, metodologia de clonagem molecular é usada para incorporar a seqüência de codificação da proteína alergênica no vetor de expressão correspondente, levando o produto da proteína ser expressado através da Eseheriehia coli, sistemas celulares de levedura ou CHO. Purificação é usada então para obter a proteína alergênica. Similarmente, peptídeos ou proteínas podem ser projetados que incluem epítopos antigênicos de proteínas alergênicas. Seqüências de ácido nucléico codificando tais peptídeos ou proteínas podem ser incorporadas nos vetores de expressão e produzidas em células de hospedeiro onde elas expressam o peptídeo ou proteína que é então purificado ou peptídeos podem ser sintetizados. Alternativamente, a proteína alergênica pode ser purificada de fontes naturais.

O vetor de expressão de célula eucariótica incluída nas composições ou kits da invenção pode ser um vetor de expressão composto de um vetor de expressão de plasmídeo, um vetor de expressão viral ou vetor de expressão de bacteriófago. DNA de plasmídeo e vetor de expressão formada de fragmento de DNA de cromossomo e outros vetores de expressão são bem conhecidos e comumente usados no campo da engenharia genética. Em algumas formas de realização, o vetor de plasmídeo pVAXl (Invitrogen) é usado. Em algumas formas de realização, o vetor de plasmídeo provax que tem o promotor de CMV, um líder de hCG e de hormônio de crescimento bovino poli A é usado. Em algumas formas de realização, o vetor de plasmídeo é um plasmídeo de pcDNA3 (Invitrogen) que compreende um promotor prematuro imediato de citomegalovírus de humano (CMV), sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (polyA de BGH), seqüência de T7, origem de replicação de CoIEl, e a seqüência de sinal de vírus de JE.

Nos vetores de expressão de célula eucarióticas, a seqüência de codificação para a proteína alergênica ou peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica é operativamente ligada as seqüências regulatórias requeridas para expressão eucariótica. Exemplos de promotores adequados incluem um promotor de RSV (vírus de sarcoma Rous), um promotor de CMV (citomegalovírus) tal como o promotor prematuro imediato de CMV, um promotor de vírus de SV40, promotor de vírus de tumor Mamário de Camundongo (MMTV), vírus de imunodeficiência Humana (HTV) tal como o promotor de repetição terminal longa de HIV (LTR), vírus de Moloney, ALV, vírus de Epstein Barr (EBV), bem como promotores de genes humanos tal como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano e melationeina humana. Exemplos de sinais de poliadenilação úteis para praticar a presente invenção, incluem mas não estão limitados a sinais de poliadenilação de SV40 e sinais de poliadenilação de LTR. Em adição aos elementos regulatórios requeridos para expressão de DNA, outros elementos podem também ser incluídos na molécula de DNA. Tais elementos adicionais incluem melhoradores. O melhorador pode ser selecionado do grupo incluindo mas não limitado a: actina humana, niosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano e melhoradores virais tais como aqueles de CMV, RSV e EBV.

Em algumas formas de realização, a proporção de vetor de expressão de célula eucariótica para proteína alergênica ou peptídeo ou proteína que compreende um epítopo antigênico de tal proteína alergênica é 1:5-5: 1; a opção preferida é: 1:1 (a razão de moles é 1 -20: 100.000; a relação molar preferida é 15:100.000).

Em algumas formas de realização, a composição de inibidor ou combinação de componentes de kit é introduzida no organismo intramuscularmente, intracutaneamente/ intradermicamente,

transdermicamente, subcutaneamente, intravenosamente e através de tecido de mucosa por meio de injeção, nebulizador/aerossol/pulverização, gotas de nariz, colírios, oralmente, sublingual, bucal, vaginal, penetração, absorção, meios físicos ou químicos; ou pode ser introduzida no organismo através de outra mistura física ou embalagem. Os componentes do kit não têm de ser distribuídos juntos, nem têm de ser distribuídos no mesmo sítio ou pela mesma via de administração.

A composição farmacêutica pode ser introduzida por vários meios incluindo, por exemplo, a injeção de agulha, injetor sem agulha, pistola de gene, eletroporação, e bombardeamento de microprojétil.

A composição e componentes de kit podem ser formuladas por versado na técnica com composições selecionadas dependendo do modo escolhido de administração. Adequados veículos farmacêuticos estão descritos em mais recente edição de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto de referência padrão nesse campo.

Para administração parenteral, formulações podem ser providas como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais veículos são água, solução salina e de dextrose. Lipossomas e veículos não aquosos tais como óleos fixos podem também ser usados. O veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantêm isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e preservativos). A formulação é esterilizada por técnicas comumente usadas. Composições injetáveis podem ser estéreis e livres de pirogênios.

A dosagem administrada varia dependendo de fatores tais como: características farmacodinâmicas; seu modo e via de administração; idade, saúde, e peso do recipiente; natureza e extensão de sintomas; tipo de tratamento concorrente; e freqüência de tratamento. Em algumas formas de realização, a quantidade de composição usada ou a quantidade de combinação de componentes de kit é geralmente 1250 μg/kg peso do corpo/administração; com a composição ou componentes do kit administrados pelo menos uma vez todos 1-30 dias, preferivelmente pelo menos uma vez todos 7-14 dias. Em algumas formas de realização, uma dose simples é administrada. Em algumas formas de realização, doses múltiplas são administradas. Em algumas formas de realização, um total de 2-3 administrações são administradas.

Em algumas formas de realização, as composições ou kits são administradas a indivíduos que estão sofrendo de uma reação alérgica. Em algumas formas de realização, as composições ou kits são administradas a indivíduos que não estão sofrendo de uma reação alérgica mas que foram expostos ao alérgeno ou provavelmente foram expostos ao alérgeno. Em algumas formas de realização, as composições ou kits são administradas a indivíduos que não estão sofrendo de uma reação alérgica mas que são conhecidos por serem alérgicos ao alérgeno, isto é, que já possuíam previamente respostas alérgicas ao alérgeno.

Os métodos da presente invenção são úteis nos campos tanto de medicina humana como veterinária. Conseqüentemente, a presente invenção refere-se a tratamento e prevenção de reações alérgicas em mamíferos, pássaros e peixe. Os métodos da presente invenção podem ser particularmente úteis para espécies de mamíferos incluindo espécies humana, bovina, ovina, suína, eqüina, canina e felina.

Os exemplos definidos abaixo incluem exemplos representativos de aspectos da presente invenção. Os exemplos não são destinados para limitar o escopo da invenção mas sim servir aos fins de exemplos. Além disso, vários aspectos da invenção podem ser resumidos pela seguinte descrição. Entretanto, esta descrição não é destinada a limitar o escopo da invenção mas sim destacar vários aspectos da invenção. Um versado na técnica pode facilmente apreciar aspectos adicionais e formas de realização da invenção da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Síntese de polipeptídeos de peptídeos alergênicos salivares de pulga e construções de vetores de expressão de células eucarióticas para expressão dos mesmos

A proteína alergênica salivar de pulga (FSA) possui a seqüência de resíduo de aminoácido como descrito em SEQ ID NO: 2.

O polipeptídeo sintetizado que compreende os resíduos de aminoácido descrito em SEQ ID NO: 22 é chamado de pep66. O polipeptídeo sintetizado que compreende os aminoácidos descritos em SEQ ID NO: 23 é chamado de peplOO.

Seqüências de nucleotídeo que codificam pep66 têm a seqüência de nucleotídeo descrita em SEQ ID NO 24 e são chamadas de FAD66.

Seqüências de nucleotídeo que codificam peplOO têm a seqüência de nucleotídeo descrita em SEQ ID NO 25 e são chamadas de FAD100.

Vetores eucarióticos que codificam pep66 e peplOO compreendem pelo menos uma seqüência de nucleotídeo descrita em SEQ ID NO 24 ou SEQ ID NO: 25 e são chamados de pcDF66 ou pcDFlOO, respectivamente.

A proteína alergênica salivar de pulga foi adquirida de Greer Laboratory Company (Lenoir, North Carolina, Estados Unidos) e foi formulada pelos métodos de cultivo sistemático de pulgas, descritos por Lee, et al., in Parasite Immunology 19: 13 - 19, 1997. No final de um ano de idade, as pulgas fêmeas foram obtidas de glândulas salivares isoladas de animais infectados. As células da glândula salivar foram colocadas em suspensão em tampão de redução - SDS e agitadas em um oscilador durante 30 segundos.

As células foram pulverizadas e a proteína bruta foi armazenada a -20°C.

Os vetores de expressão de células eucarióticas descritos compreendendo as seqüências de nucleotídeo que codificam epítopos FSA pep66 e peplOO são chamados de pcDF66 ou pcDFlOO, respectivamente. 1. Síntese de polipeptídeos FSA pep66, peplOO, e seus genes codificados

Os requerentes verificaram as seqüências de aminoácido de epítopos de classe II MHC de FSA e os peptídeos pep66 e peplOO quimicamente sintetizados usando software Epitlot. As seqüências dos genes recentemente sintetizados e produtos de proteína estão abaixo: Peptídeo 66 - 80: QEKEKCMKFCKKVCK (SEQ ID NO: 22), chamado de pep66;

Peptídeo 100-114: GPDWKVSKECKDPNN (SEQ ID NO: 23), chamado de peplOO.

As seqüências de nucleotídeo que codificam pep66 e peplOO foram chamadas de FAD66 e FAD100, respectivamente. A seqüências de nucleotídeo compreendem as seguintes seqüências:

FAD66: CAAGAGAAAG AAAAATGTAT GAAATTTTGC AAAAAAGTTT GCAAA (SEQ ID NO: 24

FAD100: GGTCCTGATT GG AAAGT AAG CAAAGAATGC AAAGATCCCA ATAAC (SEQ ID NO: 25).

2. Construção de vetores de expressão FAD66 e FAD100

Vetor de expressão pGFP (Clontech, Mountain View, CA, U.S.A) foi adquirido como um gabarito. Os requerentes conduziram a amplificação por reação de cadeia polimerase (PCR) de seqüências de nucleotídeo FSA para rotular a seqüência de nucleotídeos FSA com o gene de proteína fluorescente verde (GFP). A extensão do iniciador foi completada pelo uso dos iniciadores P66F e PR assim como dos iniciadores P100F e PR. Seqüências para os iniciadores usados no método de clonagem são como a seguir: P66F: 5' - AAGCTTGCCA TGCAAGAGAA AGAAAAATGT ATGAAATTTT GCAAAAAAGT TTGCAAAGGTACC GCCATGG TGAGCAAGGG CGAGGA-3' (SEQ ID NO: 26) ( o grupo básico do 13° sítio - 572 sítio a partir da extremidade 5' terminal do produto de amplificação da referida seqüência é FAD66; o grupo básico do 582 sítio - 63— sítio da extremidade 5' terminal do produto de amplificação é o sítio de reconhecimento Kpnl, o primeiro até o sexto nucleotídeo básico da extremidade 5' terminal do produto de amplificação é o sítio de reconhecimento Hind III); PR: 5' - TTA GGTACCTTAC TTGTAC AGCTCGTCCAT- 3' (SEQ ID NO: 27) o grupo básico do 4o ao 9o sítio da extremidade 5' terminal do produto de amplificação é o sítio de reconhecimento Kpn I), P100F: 5' - AAGCTTGCCA TG GGTCCTGA TTGGAAAGTA AGCAAAGAAT GCAAAGATCC CAATAACGGT ACC GCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3' (SEQ ID NO: 28) (o grupo básico do 13° sítio - 57° sítio da extremidade 5' terminal do produto de amplificação na referida seqüência é FAD66; o grupo básico do 58° sítio - 63 0 sítio da extremidade 5' terminal do produto de amplificação é o sítio de reconhecimento Kpn I; o grupo básico do I0 sítio - 6o sítio da extremidade 5' terminal do produto de amplificação na referida seqüência é o sítio de reconhecimento Hind III), PR: 5' - TTA GGTACCTTAC TTGTAC AGCTCGTCCAT- 3' (SEQ ID NO: 27) (o grupo básico do 4o sítio - 9o sítio da extremidade 5' terminal do produto de amplificação é o sítio de reconhecimento de Kpn I). O produto de PCR e vetor de expressão eucariótico pcDNA3 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, U.S.A.) foram digeridos usando BamH I e Hind III. O produto de amplificação foi ligado no plasmídeo usando T4 DNA ligase, e então transformado em Escherichia coli Top 10. Depois E. coli foi cultivado em incubadoras, plasmídeo de DNA foi extraído e a digestão de restrição foi realizada usando Kpn I para obter um clone positivo. Os clones positivos incluído plasmídeo pcDF66-GFP contendo genes FAD66 e GFP e plasmídeo pcDF 100-GFP contendo genes FADlOO e GFP. Depois usando pcDF66-GFP e pcDF 100-GFP para digestão com Kpn I, eletroforese de gel agarose de ponto de fusão baixo foi usado para recuperar os fragmentos grandes, e então auto-ligação é conduzida. Finalmente, o produto é transformado em Eseheriehia coli Top 10, o plasmídeo é extraído e o teste de digestão de Kpn I endonuclease é usado para obter um clone positivo. Os clones obtidos incluíam vetor de expressão FAD66 pcDF66 e o vetor de expressão FADlOO pcDFlOO.

Células de rim de símio normais (células CV1) (adquirida do Institute of Cell Biology, Shanghai) foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro de bezerro fetal sob 5% de CO2, e 37 0C. Transfecções de pcDF66-GFP e pcDFIOO-GFP foram realizadas nas células CVl em um disco de cultura de 35 mm com 2,5 χ IO5 células por/ml e 2 ml por disco. A purificação dos plasmídeos foi realizada de acordo com a metodologia descrita no Guidebook for Molecular Clonagem Experimentation (3 a. edição) (tradução chinesa) (traduzido por Huang Peitang et al., Science Publishing Company, publicado em setembro de 2002). Um meio de lipossoma de íon positivo (Lipofectamine™ 2000, Invitrogen) foi usado para transfectar e cultivar as células CVl de acordo com as instruções de fabricante (Invitrogen, CA, USA). Após 24 horas de incubação, a cultura da célula é observada sob microscopia de fluorescência mostrando pcDFl 00-GFP e pcDF66-GFP foi expressada em células eucarióticas. Os resultados demonstram que pcDFl 00- GFP e pcDF66-GFP também podem ser expressos em células eucarióticas. Exemplo 2. Inibidor de dermatite devido à alergia a pulga como terapia para dermatite devido à alergia a pulga

Experimentos em que camundongos brancos, Kunming, BALB/c e C57BL/6 são imunizados com um vetor compreendendo proteína FSA e seqüências de nucleotídeo que codificam as proteínas FSA, ou proteínas dos mesmos, demonstram que a imunização é uma terapia efetiva para dermatite devido à alergia a pulga. Vetores utilizáveis para imunização podem compreender um vetor de expressão de célula eucariótica ainda compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando proteína FSA (por exemplo, pcDF66 ou pcDFlOO), e ou peptídeos sintetizados FSA (pep66 ou pep100) ou proteína FSA (proteína alergênica salivar de pulga). A eficácia de imunização é superior à de um vetor de imunização apenas compreendendo um vetor de expressão de célula eucariótica que incluía seqüências de nucleotídeo que codificam ou peptídeos FSA ou proteína FSA. Estudos de inibição demonstram que as seqüências de DNA codificando epítopos diferentes têm eficácia diferente. Por exemplo, FADlOO parece ter um efeito terapêutico mais forte na supressão da dermatite devido à alergia a pulga. Resultados em cada cepa de camundongo foram similares, indicando que a atividade imunossupressora da imunização não é limitada aos antecedentes genéticos MHC. Assim, os requerentes claramente deduziram, a partir dos resultados acima, que através do uso de um inibidor FAD compreendendo um vetor de expressão de célula eucariótica que ainda compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica proteína FSA e ou uma proteína FSA ou um peptídeo F SA, é possível inibir efetivamente a dermatite devido a alergia a pulga.

As experiências de proliferação de células T e experiências de expansão de citocinas relacionadas demonstram que um inibidor FAD, compreendendo um vetor de expressão de célula eucariótica que codifica proteína FSA e uma proteína FSA ou peptídeo FSA, inibe a proliferação de células T específicas de antígenos, assim suprimindo uma reação alérgica. A imunossupressão pode ser induzida através de IL-10, assim inibindo IL-5, IL- 13 e outros níveis de expressão de citocinas. O inibidor FAD na presente invenção efetivamente pode evitar e/ou tratar dermatite devido à alergia a pulga, especialmente nos casos causados por Ctenocephalides felis. 1. Experimentos com camundongos brancos Kunming

Trezentos e sessenta (360) camundongos brancos Kunming fêmeas foram divididos em um total de 12 grupos de números iguais. Cada camundongo no primeiro grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 100 microgramas de pcDF66. Cada camundongo no segundo grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 100 microgramas pep66. Cada camundongo no terceiro grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 50 microgramas de pcDF66 e 50 microgramas de pep66. Cada camundongo no quarto grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 100 microgramas de pcDFlOO. Cada camundongo no quinto grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 100 microgramas de peplOO. Cada camundongo no sexto grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 50 microgramas de pcDFlOO e 50 microgramas de peplOO. Cada camundongo no sétimo grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 50 microgramas de pcDF66 e 50 microgramas de peplOO. Cada camundongo no oitavo grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 50 microgramas de pcDFlOO e 50 microgramas de pep66. Cada camundongo no nono grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 100 microgramas de antígeno inativo de pulga (adquirido de Greer Lab Company, North Carolina, Estados Unidos). Cada camundongo no décimo grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 50 microgramas de antígeno inativo de pulga (adquirido de Greer Lab Company, North Carolina,

Estados Unidos) e 50 microgramas de pcDF66. Cada camundongo no décimo primeiro grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 50 microgramas de antígeno inativo de pulga (adquirido de Greer Lab Company, North Carolina, Estados Unidos) e 50 microgramas de pcDFlOO. Cada camundongo no décimo segundo grupo foi imunizado com 100 microlitros de solução aquosa a 0,9% de NaCl contendo 100 microgramas de pcDNA3 para servir como um controle. Quatorze dias após a primeira imunização, uma imunização de reforço foi administrada na mesma quantidade de dosagem. Sete dias após a imunização de reforço, testes de pele foram conduzidas usando os seguintes métodos.

O pêlo foi removido da cavidade do peito murino ventral e uma injeção intra-cutânea de 30 μΐ de inoculação de 1 μg/ul de proteína FSA foi injetada em 10 indivíduos. Ao mesmo tempo uma solução de histamina (com uma concentração de 0,01% de histamina) e PBS foi injetada em quantidades iguais para servir como controles positivos e controles negativos. Foram divididos 10 indivíduos em cada grupo de controle. Vinte minutos após cada injeção, os requerentes mediram os diâmetros da bolha em micrômetros. Os resultados de teste t indicaram que a imunização com compostos pcDF100 e pep100 (o sexto grupo) demonstrou uma diferença notável (P<0,05) quando comparado a imunização única pcDF100 (o quarto grupo) ou imunização única pep100 (o quinto grupo). Notou-se uma diferença notável (P<0,05) entre imunização de compostos pcDF66 e pep66 (o terceiro grupo) e imunização única de pcDF66 (o primeiro grupo), enquanto não se notou uma diferença notável com imunização única pep66 (o segundo grupo). As imunizações com antígeno de pulga e pcDF66 (o décimo grupo) ou pcDF100 (o décimo primeiro grupo) de composto foram notavelmente diferentes (P<0,05) do que os resultados gerados pelo antígeno sozinho (o nono grupo). Os décimo e décimo primeiro grupos não mostraram qualquer diferença notável como comparado com as imunizações de pcDF66 (o primeiro grupo) ou pcDF100 (o quarto grupo). Também não se notou diferença nos diâmetros das bolhas medidas nos sexto e sétimo grupos como comparado no vetor de expressão ou grupos de imunidade única de polipeptídeo epítopo (grupos 1, 2, 3 e 4).

Com base nos resultados de testes da pele precedentes, os requerentes podem concluir que um vetor de expressão de célula eucariótica compreendendo proteína FSA ou um seqüência de nucleotídeo codificando peptídeo FSA e o referido peptídeo FSA, ou um vetor de expressão de célula eucariótica compreendendo proteína FSA ou uma seqüência de nucleotídeo que codifica peptídeos FSA e proteína FSA reduz as alergias na pele em um modo específico para antígeno. Estes resultados indicam que a redução de reações alérgicas na pele pode ser induzida através de imunossupressão.

2. Resultados de testes de pele de camundongos BALB/c e C57B/6

A fim de ainda verificar os resultados obtidos acima com os camundongos brancos Kunming, duas cepas puras de camundongos (BALB/c e C57B/6) foram testadas para determinar se a imunossupressão de FAD foi limitada por MHC. Metodologias experimentais foram as mesmas como as metodologias realizadas em camundongos brancos Kunming. Os resultados de teste t indicam que imunização com pcDFlOO e peplOO (o sexto grupo) não têm diferença notável (P<0,05) como comparado a imunização única pcDFlOO (o quarto grupo) ou imunização única peplOO (o quinto grupo). Resultados da imunização com antígeno da pulga e do composto pcDFlOO (o décimo primeiro grupo) demonstraram uma diferença muito significante (P<0,01) comparado aos resultados gerados por imunizações com antígeno de pulga (o nono grupo) ou pcDFlOO (o quarto grupo). Não se notou diferença significante dentre imunizações de antígeno de pulga e imunização com pcDF66 (o décimo grupo), imunização com antígeno de pulga sozinho (o nono grupo), ou imunização com pcDF66 sozinho (o quinto grupo). Não se notou diferença significante dentre pcDFlOO e imunização com pep66 (o oitavo grupo), imunização com pcDFlOO sozinho (o quarto grupo), ou imunização com pep66 sozinho (o segundo grupo).

Os resultados precedentes indicam que a imunossupressão anti-alérgica é específica de antígeno. Por exemplo, imunização com pcDFlOO e peplOO foi mais efetiva como comparado a imunização com pcDFlOO ou peplOO sozinho. Imunização com o antígeno de pulga e pcDFlOO foi mais efetiva do que quaisquer vetores de imunização que incluíam somente um componente.

Diferenças também existem no nível de imunossupressão dentre os grupos que efetivamente trataram FAD. Por exemplo, o grupo de imunidade com antígeno de pulga e composto pcDFlOO tinham mais do que um efeito imunossupressivo efetivo quando comparado com qualquer um dos grupos de imunidade única. Os resultados de teste t indicam que imunidades com composto pcDFlOO e peplOO (o sexto grupo) são significantemente diferentes (P<0,05) quando comparado aos resultados de imunização usando pcDF100 sozinho (o quarto grupo) ou peplOO sozinho (o quinto grupo). Notam-se diferenças significantes (P<0,05) no efeito imunossupressivo das imunizações realizadas com imunidade com composto pcDF100 e pep66 (o oitavo grupo) como comparado a pcDF100 sozinho (o quarto grupo) ou pep66 sozinho (o segundo grupo). Nota-se uma diferença extremamente significante (P<0,01) em imunizações usando o antígeno de pulga e pcDF100 (o décimo primeiro grupo) como comparado ao antígeno de pulga (o nono grupo) ou pcDF100 sozinho (o quarto grupo).

Os requerentes interpretaram os resultados obtidos para concluir que a imunossupressão anti-alérgica é específica de antígeno. Por exemplo, a imunização foi mais efetiva no grupo de imunidade com composto pcDF100 e pep100 como comparado ao grupo de imunidade única com pcDF100 ou o grupo de imunidade única com pep100. Além disso, peptídeos pep66 e pep100 podem ter reatividade cruzada. Por exemplo, a imunização foi mais efetiva com imunização com pcDF 100 e pep66 como comparado ao grupo de imunidade única com pcDF100 ou o grupo de imunidade única com pep66. Imunização usando a imunidade com antígeno de pulga e com composto pcDF66 não produzir uma imunossupressão nítida. Estes resultados são consistentes com os obtidos no grupo BALB/c. Apesar de se ter diferenças leves na eficácia da imunização dentre cada cepa de camundongos estudados, resultados experimentais das três cepas diferentes de camundongos chegaram à mesma conclusão: vetores de imunização compreendendo vetores de expressão de célula eucariótica ainda compreendendo proteína FSA ou seqüências de nucleotídeo que codificam peptídeos FSA e peptídeos FSA; ou vetores de expressão de célula eucariótica compreendendo proteína FSA ou seqüências de nucleotídeo que codificam peptídeos FSA e proteína FSA podem montar uma imunossupressão anti-alérgica efetiva.

Exemplo 3. Proliferação de células T em camundongos imunizados. Trezentos e sessenta (360) camundongos BALB/c e trezentos e sessenta camundongos C57B/6 foram cada divididos em 12 grupos de 30 camundongos por grupo. Imunização foi realizada de acordo com a metodologia descrita no exemplo 2. Em sete dias após a imunização de reforço, as células T esplênicas foram isoladas e a atividade de expansão de células T foi testada. A metodologia específica foi: sob condições assépticas, células esplênicas foram tomadas de camundongos e usadas para formar um fluido de suspensão de célula única. Uma solução hemolítica foi usada para remover as células sangüíneas vermelhas, que foram então lavadas três vezes usando fluido PB S. As células foram centrifugadas e uma contagem de células retiradas. A concentração de células foi ajustada a 1 x 10^6 células/ml, e cada suspensão de célula de cada animal foi dividida em quatro grupos experimentais e colocadas em uma placa de cultura de 96 cavidades. Para um grupo, 100 μl Con-A (mitogene) foi adicionado em uma concentração final de 5 μg/ml. Antígeno específico (antígeno de pulga) foi adicionado para servir como um estimulante em uma concentração final de 5 μg/ml no segundo grupo. Nenhum estimulante foi adicionado ao grupo de controle negativo, e 100 μl de BSA foram adicionados em uma concentração final de 2 μg/ml para servir como outro antígeno não relacionado. Após serem incubados a 37 °C em uma cultura de CO2 durante 48 horas, 100 μl de MTS foram adicionados em cada cavidade em uma concentração final de 5 mg/ml. Após 4 horas de incubação, um rotulador de enzima foi usada para ler o valor OD a 492 nm e calculado o índice de estimulação (SI = OD testado + OD não estimulado). Os resultados de proliferação de células T para os camundongos BALB/c indicaram que os vetores de expressão de célula eucariótica compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica peptídeo FSA na saliva de pulga e referido peptídeo FSA geram uma notável imunossupressão específica de antígeno de FAD. Por exemplo, a imunização foi mais efetiva dos vetores compreendendo pcDF100 e pep100 (o sexto grupo) e os vetores compreendendo antígeno de pulga e pcDFlOO (o décimo primeiro grupo) pep66 (o terceiro grupo), o antígeno de pulga e o grupo pcDF66 (o décimo grupo) como comparado aos grupos de imunidade única correspondentes. Resultados usando vetores compreendendo o grupo de imunidade com compostos pcDFlOO e peplOO e o grupo de imunidade de antígeno de pulga e composto pcDFlOO são consistentes com o efeito imunossupressivo mostrado pelos testes na pele. Se nota uma diferença extremamente significante (P<0,01) no efeito imunossupressivo dos vetores de imunização compreendendo o pcDFlOO e pep66 (o oitavo grupo) como comparado ao efeito imunossupressivo visto no grupo de imunidade única correspondente.

Resultados de proliferação de células T C57B/6 indicam que os vetores de expressão de célula eucariótica contendo seqüências de nucleotídeo que codificam peptídeo FSA e o referido peptídeo FSA podem produzir uma imunossupressão específica de antígeno nítida. Por exemplo, se nota uma diferença clara (P<0,05) no efeito de imunização de imunidade com composto pcDF66 e pep66 (o terceiro grupo) como comparado aos grupos de imunidade única correspondente (o primeiro grupo e o segundo grupo).

Adicionalmente, nota-se uma diferença extremamente significante (P<0,01) no efeito de imunização no grupo de imunidade com composto pcDFlOO e pep100 (o sexto grupo) como comparado aos grupos de imunidade única correspondente (o quarto grupo e o quinto grupo). A imunização de camundongos usando vetor compreendendo o antígeno de pulga e pcDF66 (o décimo grupo) é claramente mais efetiva (P<0,05) do que com os grupos de imunidade única correspondente (o nono grupo e o primeiro grupo). Nota-se uma diferença extremamente significante (P<0,01) no efeito da imunização com antígeno de pulga e o grupo de imunidade com composto pcDFlOO (o décimo primeiro grupo) como comparado aos grupos de imunidade única correspondente (o nono grupo e o quarto grupo). Além disso, existe reatividade cruzada entre os dois epítopos. Por exemplo, nota-se uma diferença clara (P < 0,05) em perfis de proliferação de células T com o grupo de imunidade com compostos pcDF66 e pep100 (o sétimo grupo) e os grupos de imunidade única correspondente (o primeiro grupo e o quinto grupo). Nota-se também uma diferença clara (P<0,05) em perfis de proliferação de células T do grupo de imunidade com compostos pcDF100 e pep66 (o oitavo grupo) e os grupos de imunidade única correspondente (o quarto grupo e o segundo grupo). Os perfis de proliferação de células T no grupo de imunidade com compostos pcDF100 e pep100, o grupo de imunidade com compostos pcDF100 e pep66 e o antígeno de pulga e os resultados do grupo de imunidade com composto pcDF100 foram todos consistentes com os resultados de teste de pele.

Exemplo 4. Mudanças nos níveis de citocinas de camundongos imunizados.

Foram selecionados 360 camundongos brancos Kunming, 360 camundongos BALB/c, e 360 camundongos C57B/6, e cada conjunto de cepas de indivíduos foi dividido em 12 grupos de 30 camundongos. A imunização foi realizada de acordo com o método descrito no exemplo 2. Sete dias depois a imunização de reforço, o baço foi excisado e RNA total (TRIZOL, Dingguo Biological Company) isolado. A transcrição reversa para cDNA foi realizada de acordo com o manual de operação RT-PCR de RNA da Dingguo Biological Company. Brevemente, 1 μg de RNA total purificado foi colocado em um tubo de centrifuga de 250 μL. Então os seguintes reagentes foram adicionados na seqüência: 4 μl de MgCl2, 2 μL 10 x solução tampão, 8,5 μl de água DEPC, 2 μl de mistura de dNTP, 0,5 μl de inibidor de RNase, 0,5 μl transcriptase reversa M-MLV (Promega), 0,5 μL. de iniciador Oligo (dT)12. As condições de resposta foram de 42 0C durante 30 minutos, 99°C durante 5 minutos e 5°C durante 5 minutos. A família de genes hipoxantina fosforibosiltransferase (HPRT) foi usada como o padrão de expressão de fonte interna. As concentrações de cDNA de vários grupos foram ajustadas para tornar todas as concentrações de amostra consistentes.

Então, 2 μl de cDNA foram usados para conduzir a amplificação de PCR avaliando os níveis de expressão dos três genes citocina: IFN-γ, IL-4, e EL-10. O iniciador requerido para a reação e as condições de reação PCR são como indicadas na tabela 1. (Porque a família de genes HPRT tinha uma expressão fixada in vivo, ela é usada como o gabarito para o padrão de expressão da fonte interna de controle).

Tabela 1. Especificações da seqüência de iniciador HPRT, IFN-γ, IL-4 e IL-IO e de reação PCR.

Gene de Iniciador Condições de

marcação resposta

HPRT 5' GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG (SEQ ID 94 0C 30 s, 60°C NO: 29) 30 s e 72 0C 40 s

3' GAGGGTAGGCTGGCCTATGGCT (SEQ ID NO:

30)

IFN-γ 5' CATTGAAAGCCTAGAAAGTCTG (SEQ ID NO: 94 0C 30 s, 58 0C 30

31) se 72 0C40 s 3' CTCATGGAATGCATCCTTTTTCG (SEQ ID NO:

32)

IL-4 5' GAAAGAGACCTTGACACAGCTG (SEQ ID NO: 94 0C 30 s, 54 0C 30

33) s e 72 0C 40 s 3' GAACTCTTGCAGGTAATCCAGG (SEQ ID NO:

34)

IL-10 5' CCAGTTTACCTGGTAGAAGTGATG (SEQ ED 94 0C 30 s, 56 0C 30 NO: 35) s e 72 0C 40 s

3' TGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA (SEQ ID NO: 36)

Software Bio-Rad Image (Quantity One 4.2.0) foi usado para analisar imagens dos géis de eletroforese dos produtos de PCR. Os resultados dos perfis de expressão obtidos foram geralmente consistentes com cada cepa de camundongo. Níveis de expressão IL-10 na imunidade com compostos pcDF66 e pep66 (grupo 3) foram maiores do que os de imunidade com pcDF66 única (grupo 1) e de imunidade única com pep66 (grupo 2). Níveis de expressão IL-10 em imunidade com compostos pcDFlOO e peplOO (grupo 6) foram maiores do que os de grupo de imunidade única com pcDF 100 (grupo 4) ou grupo de imunidade única com peplOO (grupo 5). Níveis de expressão EL-IO com antígeno de pulga e grupo de imunidade com composto pcDF66 (grupo 10) foram maiores do que os com antígeno de pulga (grupo 9) ou grupos de imunidade única com pcDF66 (grupo 1). Níveis de expressão de IL-IO com antígeno de pulga e grupo de imunidade com composto pcDF66 (grupo 11) foram maiores do que os com antígeno de pulga (grupo 9) ou grupos de imunidade única com pcDFlOO (grupo 4). Não se nota uma diferença clara nos níveis de expressão de IL-4 e IFN-γ dentre os vários grupos. Os resultados sugerem que a imunização conduzida com vetor de expressão de células eucarióticas compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificam FSA e a referida proteína FSA ou o referido composto de peptídeo FSA melhoraram os níveis de expressão de EL-10.

Além disso, perfis de expressão foram gerados em IL-5 e IL- 13 nos três tipos de camundongos. Resultados indicaram que para vetores de expressão de células eucarióticas compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificam peptídeos FSA e a referida proteína ou peptídeo FSA (grupo 3, grupo 6, grupo 10 e grupo 11), níveis de IL-5 e IL-13 foram claramente menores do que os de grupos de imunidade única respectivos. Exemplo 5. Detecção de níveis de IgE no sangue em camundongos imunizados

Dois grupos de 360 camundongos BALB/c e 360 C57B/6 foram cada divididos em 12 grupos de 30 camundongos cada e a imunização foi realizada como descrito no exemplo 2. Sangue foi tomado intravenosamente da bolsa dos olhos antes da imunização e 14 dias após a imunização de reforço. O sangue foi separado por centrifugação e os níveis de IgE foram avaliados usando ELISA. O antígeno revestido usado nas placas ELISA foi antígeno de pulga adquirido de Greer Laboratory (Lenoir, North Carolina, Estados Unidos). O primeiro componente na placa ELISA foi separado de soro de sangue e o segundo componente usado para ligação foi anticorpo de IgE anti-camundongo de ovelha rotulado com enzima antioxidante de peroxidase de raiz-forte. O substrato foi adicionado no sistema depois o anticorpo foi ligado nos antígenos e um rotulador de enzima foi usado para ler os valores OD a 492 nm. A produção de IgE em camundongos brancos Kunming, camundongos BALB/c, camundongos C57B/6 após imunização geralmente é consistente para todos os três grupos de camundongos. Exceto para o grupo de imunidade única de antígeno de pulga (o nono grupo), níveis de IgE para os grupos foram relativamente baixos. Os níveis de IgE produzidos após imunização com o grupo de imunidade única de antígeno de pulga (o nono grupo) foram os níveis maiores através de todos os conjuntos de camundongos. Níveis de IgE foram muito reduzidos no grupo imunizado com antígeno de pulga e pcDF66 (o décimo grupo) e o grupo imunizado com o antígeno de pulga e pcDFlOO (o grupo 11) como comparado ao grupo de imunidade única de antígeno de pulga (o nono grupo). Isto indica que um vetor de expressão de célula eucariótica compreendendo seqüências de nucleotídeo que codificam peptídeos FSA e a referida proteína FSA reduz os níveis de IgE após imunização.

Exemplo 6: Clone genético codificado Fel d. 1.1 (Fel d I com o líder B menor) de antígeno de proteína alergênica de felinos e teste de expressão eucariótica

1. As seguintes seqüências foram usadas como iniciadores Fel d 1.1. Os iniciadores foram artificialmente sintetizados:

(a) Fel d I.I Pl 5' iniciador: AAGCTTGGATGTTAGACGC (SEQ ID NO 37)

(b) Fel d 1.1 P2 3' iniciador: GGTACCTTAACACAGAGGAC (SEQ ID NO 38)

2. Construção do vetor de expressão de Fel d 1.1

cDNA de Fel d 1.1 foi usado com um gabarito para amplificação PCR do gene Fel d 1.1 usando Fel d 1.1 Pl e Fel d 1.1 P2. Os iniciadores são ainda descritos abaixo:

(a) Fel d I.a Pl 5' - AAGCTTGGATGTTAGACGC - 3' (SEQ ED NO 37) (o grupo básico do 1° sítio - 6e sítio da extremidade 5' terminal do iniciador nesta seqüência é o sítio de reconhecimento de Hind III,; o 9a sítio - 11° sítio é o código do iniciador original);

(b) Fel d Ll P2 5' - GGTACCTTAACACAGAGGAC - 3' (SEQ ID NO 38) (o grupo básico do I2 sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal do iniciador nesta seqüência é o sítio de reconhecimento de Kpn I; o 7° sítio - Ψ sítio é o código de terminação original).

Kpn I e Hind III, respectivamente, foram usados para digerir o produto PCR e vetor de expressão eucariótico pVAXl (Invitrogen Corp.). Fragmentos de nucleotídeo digeridos foram então ligados usando T4 DNA ligase. O produto de plasmídeo resultante foi transformado em Escherichia coli Top 10, cultivado para número de cópias máximo, e então o plasmídeo isolado usando métodos conhecidos pelo versado na técnica. Os requerentes realizaram uma digestão de restrição usando as Kpn I e Hind III endonucleases. Os clones de plasmídeo selecionados chamados pVAXl-Fel d 1.1 compreendiam a seqüência de plasmídeos pVax e o gene Fel d 1.1. Através de análise seqüencial (Augct Co. Ltd., Beijing China), outra análise foi realizada para obter o vetor de expressão Fel d 1.1 Pl final, pFeld 1.1.

3. Expressão eucariótica de pFeldl.l

As células de rim de símios normais (células CV1, adquiridas de Shanghai Cell Institute) foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro de bezerro fetal sob condições de 5% de CO2 e 37 0C. 2,5 χ IO5 células por/ml foram pipetadas em discos de cultura de 35 mm em um volume de 2 mL. As transfecções foram realizadas usando métodos padrão. Brevemente, a purificação dos plasmídeos foi realizada de acordo com a metodologia no Guidebook for Molecular Clonagem Experimentation (3 a. edição, tradução chinesa) (traduzido por Huang Peitang et al., Science Publishing Company, publicado em setembro de 2002). Um meio de lipossomas de íons positivos (Lipofectamine™ 2000, Invitrogen) foi usado para transfectar as células CVl cultivadas de acordo com as instruções de fabricantes (Invitrogen, CA, USA).

Após 24 horas de transfecção, as células foram coletadas e um reagente de extração de RNA (TRIZOL, Dingguo Biological Company) foi usado para isolar RNA celular total. A fim de evitar contaminação, o RNA extraído total foi separadamente carregado em vários tubos EP. Uma micropipeta foi cuidadosamente usada para sucção de 2 ul de RNA total extraído e reagente RT-PCR usado para expandir cDNA celular total. Após adicionar a amostra, a transcrição reversa foi realizada a 42°C durante 30-60 minutos, desnaturação a 99°C durante 5 minutos e o tubo de reação foi colocado de lado a 5 0C durante 5 minutos anterior a extração para uso. Usando o cDNA isolado como um gabarito para amplificação de gene, PCR foi realizado usando FeldLlPl e FeldI.lP2 como os iniciadores. Os produtos de PCR foram submetidos a uma análise de gel agarose de ponto de fusão baixo para detectar as bandas positivas para FeldLl Os resultados demonstram que Fel dl.l é expressado em células eucarióticas.

Exemplo 7. Clone genético Fel d. 1.2 de antígeno de proteína alergênica de felinos e teste de expressão eucariótica

1. As seguintes seqüências foram usadas como iniciadores Fel d 1.2. Os iniciadores foram artificialmente sintetizados:

(a) Fel d 1.2 Pl 5' iniciador: AAGCTTGGATGAAGGGGGCTC (SEQ ID NO: 39)

(b) Fel d 1.2 P2 3' iniciador: GGTACCTT AACACAGAGGAC (SEQ ID NO: 40)

2. Construção do vetor de expressão Fel d 1.2 cDNA de Fel d 1.2 foi usado como um gabarito para amplificação de PCR usando iniciadores Fel d 1.2 Pl e Fel d 1.2 P2 para gerar cópias do gene Fel d 1.2. Os iniciadores são ainda descritos abaixo: (a) Fel d 1.2 Pl 5' - AAGCTTGGATGAAGGGGGCTC - 3' (SEQ ID NO: 39) (o grupo básico do Ie sítio - 6 ° sítio da extremidade 5' terminal do iniciador é o sítio de reconhecimento de Hind III; o 9a sítio - 11° sítio a partir da extremidade terminal do iniciador é o código de iniciador original); (b) Fel d 1.2 P2 5' - GGTACCTTAACACAGAGGAC. - 3' (SEQ ID NO: 40) (o grupo básico do 1° sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal do iniciador é o sítio de reconhecimento de Kpn I, o 7° sítio - 9a sítio a partir da extremidade terminal do iniciador é o código de terminação original).

Kpn I e Hind III em sucessão foram usados para digerir o produto PCR e vetor de expressão eucariótico, pVAXl (Invitrogen Corp.). O plasmídeo digerido e o produto PCR foram ligados usando T4 DNA ligase. O produto foi transformado em Escherichia coli Top 10, o plasmídeo extraído, e teste de digestão de Kpn I e Hind III de endonuclease de restrição, usado para obter um clone positivo, isto é, plasmídeo pVAXl-Fel d 1.2 contendo o gene Can f 1. Através de análise seqüencial (Augct Co. Ltd., Beijing China), outra correção de teste foi realizada para obter o vetor de expressão de Fel d 1.2, pFeld 1.2.

3. Expressão eucariótica de pFeldI.2

O vetor de expressão de pFeld 1.2 foi submetido a protocolos de digestão, transformação, isolamento, e ligação previamente descritos no exemplo 6, seção 3. Os produtos de PCR isolados foram submetidos a teste de gel agarose de ponto de fusão baixo para confirmar bandas positivas para Feldl.2. Os resultados provam que FeldI.2 é expressado em células eucarióticas.

Exemplo 8. Clone genético Can Fl de antígeno de proteína alergênica de caninos e teste de expressão eucariótica

1. Síntese do iniciador Can f 1

As seguintes seqüências foram usadas como iniciadores Can f

1. Os iniciadores foram artificialmente sintetizados: Can f 1 Pl 5' iniciador: AAGCTTATGAAGA CCCTGCTCCTCAC (SEQ ID NO: 41)

Can f 1 P2 3' iniciador: GGTACCCTACTGTCC TCCTGGAGAGC (SEQ ID NO: 42)

2. Construção do vetor de expressão Can f 1

cDNA de Can f 1 foi usado como um gabarito para realizar a amplificação PCR usando iniciadores Can f 1 P1 e Can f 1 P2 para gerar cópias do gene Can f 1. Os iniciadores são ainda descritos abaixo: (a) Can f 1 Pl 5' - AAGCTTATGAAGACCCTGCTCCTCAC - 3' (SEQ ID NO: 41) (o grupo básico do 1° sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de Hind III; o 7° sítio - 9° sítio a partir da extremidade terminal da seqüência do iniciador é o código de iniciador original); (b) Can f 1 P2 5' - GGTACCCTACTGTCCTCCTGGAGAGC - 3' (SEQ ID NO: 42) (o grupo básico 1° sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de KPn I; o 7° sítio - 9° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência é o código de terminação original).

Fragmentos de PCR e pVAXl (Invitrogen, Inc.) foram submetidos a métodos de digestão, transformação, isolamento, e ligação como descrito no exemplo 7, seção 2. Os clones positivos foram selecionados e analisados usando análise seqüencial discutida no exemplo 7, seção 2 para obter o vetor de expressão de Can f 1, pCanfl.

3. Expressão eucariótica de pCanfl

O vetor de expressão de pCanfl foi submetido a protocolos de transfecção, isolamento de RNA total, e RT-PCR como previamente descrito no exemplo 6, seção 3. Os produtos de PCR isolados foram submetidos ao teste de gel agarose de ponto de fusão baixo para confirmar bandas positivas para pCanfl. Os resultados provam que pCanfl é expressado em células eucarióticas. Exemplo 9. Clone genético Can f 2 de antígeno de proteína alergênica de caninos e teste de expressão eucariótico

1. Síntese de iniciador Can f2

As seguintes seqüências foram usadas como iniciadores Can f2. Os iniciadores foram artificialmente sintetizados:

Can f 2 Pl 5' iniciador: AAGCTTATGCAGCTCCTA CTGCTG (SEQ ID NO: 43)

Can f 2 P2 3' iniciador: GGTACCCTAGTCTCTGGAACCC (SEQ ID NO: 44)

2. Construção do vetor de expressão Can f2

cDNA de Can f 2 CDNA foi usado como um gabarito para realizar a amplificação de PCR usando iniciadores Can f 2 Pl e Can f 2 P2 para gerar cópias do gene Can f 2. Os iniciadores são ainda descritos abaixo: (a) Can f 2 Pl 5' - AAGCTT ATGCAGCTCCTACTGCTG - 3' (SEQ ID NO:43) (o grupo básico I2 sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de Hind III; o 7° sítio - sítio é o código de iniciador original); (b) Can f 2 P2 5' - GGTACCCTAGTCTCTGGAACCC - 3' (SEQ ID NO: 44) (o grupo básico Is sítio - 6" sítio da extremidade 5' terminal desta seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de KPn I, o 7° sítio - 9- sítio é o código de terminação original).

Fragmentos de PCR e pVAXl (Invitrogen, Inc.) foram submetidos a métodos de digestão, transformação, isolamento, e ligação como descrito no exemplo 7, seção 2. Os clones positivos foram selecionados e analisados usando análise seqüencial discutida no exemplo 7, seção 2 para obter o vetor de expressão Can f 2, pCanf2.

3. Expressão eucariótica de pCanf2

O vetor de expressão de pCanf2 foi submetido a protocolos de transfecção, isolamento de RNA total, e RT-PCR como previamente descrito no exemplo 6, seção 3. Os produtos de PCR isolados foram submetidos ao teste de gel agarose de ponto de fusão baixo para confirmar as bandas positivas para pCanf2. Os resultados provam que pCanf2 é expressado em células eucarióticas.

Exemplo 10. Clone genético de Der p 1 de antígeno de proteína alergênica de ácaro da poeira e teste de expressão eucariótico

1. Síntese de iniciador Der p 1

As seguintes seqüências foram usadas como iniciadores de Der p 1. Os iniciadores foram artificialmente sintetizados:

Der p 1 Pl 5' iniciador: AAGCTTAACATGAAAATT GTTTTGG (SEQ ID NO: 45)

Der p 1 P2 3' iniciador: GGTACCGTTTAGAGAAT GACAACAT (SEQ ID NO: 46)

2. Construção do vetor de expressão Der p 1

cDNA de Der p 1 foi usado como um gabarito para realizar a amplificação PCR usando iniciadores Der p 1 Pl e Der p 1 P2 para gerar cópias do gene Der p 1. Os iniciadores são ainda descritos abaixo:

(a) Der p 1 Pl 5' - AAGCTTAACATGAAAATTGGTTTTGG - 3' (SEQ ID NO: 45) (o grupo básico Ifl sítio - 62 sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de Hind III, o IOq sítio - 12a sítio é o código de iniciador original);

(b) Der p 1 P2 5' - GGTACCGTTTAGAGAATGACAACAT - 3' (SEQ ID NO: 46) (o grupo básico 1° sítio - 62 sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de KPn I, o p sítio -Ils sítio é o código de terminação original).

Fragmentos PCR e pVAXl (Invitrogen, Inc.) foram submetidos a métodos de digestão, transformação, isolamento, e ligação como descrito no exemplo 7, seção 2. Os clones positivos foram selecionados e analisados usando análise seqüencial discutida no exemplo 7, seção 2 para obter o vetor de expressão Der ρ 1, pDerpl.

3. Expressão eucariótica de Der ρ 1

O vetor de expressão de pDerpl foi submetido a protocolos de transfecção, isolamento de RNA total, e RT-PCR como previamente descritos no exemplo 6, seção 3. Os produtos de PCR isolados foram submetidos ao teste de gel agarose de ponto de fusão baixo para confirmar pDerpl bandas positivas. Os resultados provam que pDerpl é expressado em células eucarióticas.

Exemplo 11. Clone genético Ara h II de antígeno de proteína alergênica de amendoim e teste de expressão eucariótico

1. Síntese de iniciador Ara h II

As seguintes seqüências foram usadas como iniciadores Ara h

II. Os iniciadores foram artificialmente sintetizados:

Ara h II Pl 5' iniciador: AAGCTTCTCATGCAG AAGAT (SEQ ID NO: 47)

Ara h II P2 3' iniciador: GGTACCTTAGTAT CTGTCTC (SEQ ID NO: 48)

2. Construção do vetor de expressão Ara h II

cDNA de Ara h II foi usado como um gabarito para realizar amplificação PCR usando iniciadores Ara h II Pl e Ara h II P2 para gerar cópias do gene Ara h II. Os iniciadores são ainda descritos abaixo: (a) Ara h II Pl 5' - AAGCTTCTCATGCAGAAGAT - 3' (SEQ ID NO: 47) (o grupo básico I2 sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de Hind III, o 10° sítio - 12s sítio é o código de iniciador original), Ara h II P2 5' - GGTACCTTAGTATCTGTCTC - 3' (SEQ ID NO: 48) (o grupo básico 1° sítio - 62 sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de KPn I, o 7° sítio - 9° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o código de terminação original). Fragmentos PCR e pVAXl (Invitrogen, Inc.) foram submetidos a métodos de digestão, transformação, isolamento, e ligação como descrito no exemplo 7, seção 2. Os clones positivos foram selecionados e analisados usando análise seqüencial discutida no exemplo 7, seção 2 para obter o vetor de expressão Ara h II, pArahlI.

3. Expressão eucariótica de Ara h II

O vetor de expressão de pArahlI foi submetido a protocolos de transfecção, isolamento de RNA total, e RT-PCR como previamente descrito no exemplo 6, seção 3. Os produtos de PCR isolados foram submetidos a teste A O de gel agarose de ponto de fusão baixo para confirmar bandas positivas para pArahlI. Os resultados provam que pArahlI é expressado em células eucarióticas.

Exemplo 12. CIone genético Ara h 5 de antígeno de proteína alergênica de amendoim e teste de expressão eucariótico

1. Síntese de iniciador Ara h 5

As seguintes seqüências foram usadas como iniciadores Ara h

5. Os iniciadores foram artificialmente sintetizados:

Ara h 5 Pl 5' iniciador: AAGCTTATGTCGTGGCAAAC (SEQ ID NO: 49)

Ara h 5 P2 3' iniciador: GGTACCTAAAGACCCGTATC (SEQ ID NO: 50)

2. Construção do vetor de expressão Ara h 5

cDNA de Ara h 5 foi usado como um gabarito para realizar a amplificação de PCR usando iniciadores Ara h 5 Pl e Ara h 5 P2 para gerar cópias do gene Ara h 5. Os iniciadores são ainda descritos abaixo: (a) Ara h 5 Pl 5' - AAGCTTATGTCGTGGCAAAC - 3' (SEQ ID NO: 49) (o grupo básico 1- sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de Hind III; o 7a sítio - 9a sítio é o código de iniciador original); (b) Ara h 5 P2 5' - GGTACCTAAAGACCCGTATC - 3' (SEQ ID NO: 50) (o grupo básico 1- sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de KPn I; o 7° sítio - sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o código de terminação original).

Fragmentos de PCR e pVAXl (Invitrogen, Inc.) foram submetidos a métodos de digestão, transformação, isolamento, e ligação como descrito no exemplo 7, seção 2. Os clones positivos foram selecionados e analisados usando análise seqüencial discutida no exemplo 7, seção 2 para obter o vetor de expressão Ara h 5, pArah5.

3. Expressão eucariótica de pArah5

O vetor de expressão de pArah5 foi submetido a protocolos de transfecção, isolamento de RNA total, e RT-PCR como previamente descrito no exemplo 6, seção 3. Os produtos de PCR isolados foram submetidos a teste de gel agarose de ponto de fusão baixo para confirmar bandas positivas para pArah5. Os resultados provam que pArah5 é expressado em células eucarióticas.

Exemplo 13. Clone genético Cry j 1.1 de antígeno de proteína alergênica de pólen de cedro japonês {Cryptomeria japonica) e teste de expressão eucariótico

1. Síntese de iniciador Cry i 1.1

As seguintes seqüências foram usadas como iniciadores Cry j 1.1. Os iniciadores foram artificialmente sintetizados:

Cry j I. 1 Pl 5' iniciador: AAGCTTATGGATTCCCC TTGCTTAT (SEQ ID NO: 51)

Cry j I. 1 P2 3' iniciador: GGTACCATCAACAACGTTT

AGAG (SEQ ID NO: 52)

2. Construção do vetor de expressão de Cry i 1.1

cDNA de Cry j 1.1 foi usado como um gabarito para realizar a amplificação PCR usando iniciadores Cryj 1.1 Pl e Cryj 1.1 P2 para gerar cópias do gene Cryj 1.1. Os iniciadores são ainda descritos abaixo:

(a) Cry j 1.1 Pl 5'-AAGCTTATGGATTCCCCTTGCTTAT- 3' (SEQ ID NO: 51) (o grupo básico 1° sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de Hind III; o 7S sítio - 9a sítio é o código de iniciador original);

(b) Cry j 1.1 P2 5' - GGTACCATCAACAACGTTTAGAG - 3' (SEQ ID NO: 52) (o grupo básico Is sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de KPn I; o 7° sítio - 9a sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o código de terminação original).

Fragmentos de PCR e pVAXl (Invitrogen, Inc.) foram submetidos a métodos de digestão, transformação, isolamento, e ligação como descrito no exemplo 7, seção 2. Os clones positivos foram selecionados e analisados usando análise seqüencial discutida no exemplo 7, seção 2 para obter o vetor de expressão de Cry j 1.1, pCryj 1.1.

3. Expressão eucariótica pCrvi 1.1

O vetor de expressão pCryj 1.1 foi submetido a protocolos de transfecção, isolamento de RNA total, e RT-PCR como previamente descrito no exemplo 6, seção 3. Os produtos de PCR isolados foram submetidos a teste de gel agarose de ponto de fusão baixo para confirmar pCryj 1.1 bandas positivas. Os resultados provam que Cry j 1.1 pode ser expressado em células eucarióticas.

Exemplo 14. Clone genético Cry j 1.2 de antígeno de proteína alergênica de pólen de cedro japonês (Cryptomeria japonica) e teste de expressão eucariótico

1. Síntese de iniciador Cry j 1.2

As seguintes seqüências foram usadas como iniciadores Cry j

1.2. Os iniciadores foram artificialmente sintetizados

Cry j 1.2 Pl 5' iniciador: AAGCTTATGGATTCCCC TTGCTTAG (SEQ ID NO: 53)

Cry j 1.2 P2 3' iniciador: GGTACCTCAACAACGTTTA GAGAGAG (SEQ ID NO: 54)

2. Construção do vetor de expressão de Cry i 1.2

cDNA de Cry j 1.2 foi usado como um gabarito para realizar a amplificação de PCR usando iniciadores Cryj 1.2 Pl e Cryj 1.2 P2 para gerar cópias do gene Cryj 1.1. Os iniciadores são ainda descritos abaixo:

(a) Cry j 1.2 Pl 5'- AAGCTTATGGATTCCCCTTGCTTAG - 3' (SEQ ID NO: 53) (o grupo básico 1- sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de Hind III; o 7° sítio - 9~ sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o código de iniciador original);

(b) Cry j 1.2 P2 5' GGTACCTCAACAACGTTTAGAGAGAG - 3' (SEQ ID NO: 54) (o grupo básico I2 sítio - 6~ sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de KPn I; o 72 sítio - 9a sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o código de terminação original).

Fragmentos de PCR e pVAXl (Invitrogen, Inc.) foram submetidos a métodos de digestão, transformação, isolamento, e ligação como descrito no exemplo 7, seção 2. Os clones positivos foram selecionados e analisados usando análise seqüencial discutida no exemplo 7, seção 2 para obter o vetor de expressão de Cry j 1.2, pCryj 1.2.

3. Expressão eucariótica de pCryi 1.2

O vetor de expressão de pCryj 1.2 foi submetido a protocolos de transfecção, isolamento de RNA total, e RT-PCR como previamente descrito no exemplo 6, seção 3. Os produtos de PCR isolados foram submetidos ta teste de gel agarose de ponto de fusão baixo para confirmar pCryj 1.2 bandas positivas. Os resultados provam que Cry j 1.2 pode ser expressado em células eucarióticas. Exemplo 15. Clone genético BIo t 5 de antígeno de proteína alergênica de Blomia tropicalis e teste de expressão eucariótico.

1. Síntese de iniciador Blot 5

As seguintes seqüências foram usadas como iniciadores Blo t 5. Os iniciadores foram artificialmente sintetizados

Blot 5 P2 3' iniciador: AAGCTTACAATGAAGTTCGC (SEQ ID NO: 55)

Blot 5 P2 3' iniciador: GGTACCAATTTTTATTGGGT (SEQ ID NO: 56)

2. Construção do vetor de expressão Blo t 5

cDNA de Blo t 5 foi usado como um gabarito para realizar a amplificação de PCR usando iniciadores Blo t 5 P1 e Blot 5 P2 para gerar cópias do gene Blo t 5. Os iniciadores são ainda descritos abaixo:

(a) Blot 5 P1 5' - AAGCTTACAATGAAGTTCGC - 3' (SEQ ID NO: 55) (o grupo básico 1° sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de Hind III; o 10°. - 12° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o código de iniciador original);

(b) Blot 5 P2 5' - GGTACCAATTTTTATTGGGT - 3' (SEQ ID NO: 56) (o grupo básico 1°- sítio - 6° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o sítio de reconhecimento de KPn I; o 12° sítio - 14° sítio da extremidade 5' terminal da seqüência do iniciador é o código de terminação original).

Fragmentos de PCR e ρVAXl (Invitrogen, Inc.) foram submetidos a métodos de digestão, transformação, isolamento, e ligação como descrito no exemplo 7, seção 2. Os clones positivos foram selecionados e analisados usando análise seqüencial discutida no exemplo 7, seção 2 para obter o vetor de expressão de Blo t 5, pBlot5.

3. Expressão eucariótica de pBlot5 O vetor de expressão de pBlot5 foi submetido a protocolos de transfecção, isolamento de RNA total, e RT-PCR como previamente descrito no exemplo 6, seção 3. Os produtos de PCR isolados foram submetidos ao teste de gel agarose de ponto de fusão baixo para confirmar bandas positivas para pBlot5. Os resultados provam que pBlot5 pode ser expressado em células eucarióticas.

Exemplo 16 Indução de células regulatórias T adaptativas que suprimem a resposta alérgica: Conversão de células regulatórias T por DCs subótimos que são induzidas por co-imunização de vacinas de DNA e proteínas

Os extratos de pulga totais incluem reações alérgicas intradérmicas imediatas em camundongos, assim este sistema pode ser usado para avaliar métodos imuno-terapêuticos visados para a melhora de AEH.

Usando este modelo de roedor de AIH induzido por alérgenos de pulga, co- imunização de vacinas de DNA e proteína codificando o antígeno específico salivar de pulga (FSAl) melhora alH experimental, incluindo formação de pústulas induzidas por antígeno, proliferação de células T elevada, infiltração de linfócitos e células-tronco para o sítio de desafio. A melhora de AIH foi diretamente relacionada com a indução de uma população específica de células T específicas antigênicas de pulga demonstrando um fenótipo CD4+/CD257FoxP3+, uma característica de Tr. Este Tr também expressa IL- 10, IFN-γ e o fator transcripcional T-bet após o estímulo com antígeno. Estes Tr são dirigidos por populações de CD de MHC-II++/CD40baixo que são induzidos pela co-imunização de vacinas de DNA e proteína. Estes estudos identificam jogadores celulares importantes no controle de AIH. A exploração destas regulações celulares e sua indução irão prover uma nova direção para desenvolver as terapias para distúrbios alérgicos e relacionados.

Métodos

Análise de histologia. No dia 14, após a última imunização, amostras de pele de camundongos foram coletadas e fixadas em 4% de paraformaldeído, incrustadas em blocos de parafina de cada grupo de camundongos. Seções de quatro a cinco micrômetros foram cortados e colocados em lâminas de vidro revestidas com sylan, antes de serem reidratadas em xileno e lavados como concentrações diminuídas de soluções de álcool. A atividade de peroxidase endógena foi bloqueada por 3% de peróxido de hidrogênio em temperatura ambiente durante 10 minutos e a recuperação do antígeno foi obtida por ebulição das lâminas em 0,01 M de tampão de citrato (pH 6,0). Por último, as lâminas foram coloridas com hematoxilina e eosina (H&E) ou azul de toluidina para células-tronco e analisadas sob um microscópio luminoso para mudanças de histologia.

Teste de pele. No dia 14, após a última imunização, os camundongos foram desafiados com 1 μg/ml de antígeno de saliva de pulga em pele do tórax lateral não lesional intradermicamente, PBS é usado como um controle negativo e histamina é usada como um controle positivo. O diâmetro da reação da pele foi medido em 20 min após desafio usando um micrômetro calibrador. A reação foi considerada como um positiva quando o sítio de injeção foi maior do que metade o tamanho das somas dos diâmetros injetados comparando os desafios de controle positivo e negativo.

Respostas de revocação de células T. As células T isoladas de camundongos imunizados no dia 14 foram cultivadas a 5 χ 10^4 células/ cavidade em triplicata em placas de 96 cavidades contendo RPMI-10/5% de FCS e então estimuladas com 20 μg/ml de antígeno contido na saliva de pulga durante 48 h. Após a estimulação, a proliferação de células foi testada por uma reação colorimétrica após a adição de 20 pl de uma solução de MTS- PMS (Promega, USA) durante 2-4 horas e sua densidade em cor foi lida a 570 nm por leitora de placa (Magellan, Tecan Áustria GmbH).

Medida de anticorpos específicos para antígeno. A concentração no soro de isotipos de IgGl, IgG2a, IgG2b, IgM e IgE anti- pulga foi medida usando placas revestidas com antígeno de pulga por ELISA e detecção com anticorpos anti IgGl, IgG2a, IgG2b, IgM e IgE de rato conjugados a peroxidase de raiz forte específicos (SouthernBiotech5 Birmingham, USA), absorbância (450 nm) foi medida usando uma leitora de placa ELISA (Magellan, Tecan Áustria GmbH).

RT-PCR. RNA total foi isolado de tecido de baço e pele 14 dias após imunização usando reagente TRIzol (Promega). cDNA foi sintetizado e PCR foi realizado em uma mistura de reação de 50 p 1 com 5 μl cDNA e 1,0 μΜ de cada dos seguintes iniciadores: HPRT, IL-2, IFN-γ, IL-4, EL-5, IL-13, EL-IO e IL-12(38). Para análise de Gata3 e T-bet, as células CD4+CD25" foram isoladas e o RNA total foi preparado. RT-PCR foi feito como descrito usando as seqüências de iniciador específicas como a seguir para Gata3, 5'- GGAGGCATCCAGACCCGAAAC-3' (dianteiro) (SEQ ID NO: 57) e 5'- ACCATGGCGGTGACC-ATGC-3' (reverso) (SEQ ID NO: 58); para T-bet, 5'- TGAAGCCCACACTCCTACCC-3' (dianteiro) (SEQ ID NO: 59); e 5'- GCGGCATTTTCTCAGTTGGG-3' (reverso) (SEQ ID NO: 60).

Isolamento de células T CD4+CD25" e transferência adotiva. Suspensões de esplenócitos únicos foram preparadas de baço de camundongos e células T CD4+CD25" foram isoladas e purificadas por uso de kit de isolamento de células T regulatórias CD4+CD25+ de camundongos MagCEllect de acordo com o protocolo do fabricante (R&D Systems, Inc., USA). A pureza das populações de célula selecionada foi de 96 - 98%. As células purificadas (1 x 106 por camundongo) foram transferidas adotivamente intravenoso em camundongos C571BL6.

Rotulação de CFSE e co-cultura de células. As células T CD4+ nativas isoladas de camundongos C57/BL6 foram rotuladas com CFSE (Molecular Probes). Para teste de atividade reguladora, 1 x 104 células T de controle ou regulatórias induzidas por pcDF 100+F foram co-cultivadas com 4 χ 104 células T CD4+ nativas rotuladas com CFSE e purificadas na presença de antígeno de pulga (100 μg/ml) e 1 χ 104 DCs derivados de medula óssea. Para algumas culturas, as células Tr foram co-cultivadas com anti-IL-10, anti- IFN-γ ou anticorpo de controle de isotipo a 100 g/ml. Após 72 horas, as células foram coletadas e rotuladas então as células CFSE+ foram selecionadas para análise por citometria de fluxo.

Citometria de fluxo. As células T CD4+CD25" foram isoladas e incubadas em gelo com anticorpos conjugados a PE para CD44, CD69, CD62L (eBioscience, CA, USA). Citometria de fluxo de produção de citocinas e expressão de FoxP3 em células T foram realizadas, suspensões de célula única foram preparadas a partir dos baços dos animais e receptores de Fc foram bloqueados com anti-Fc em excesso (BD PharMingen, USA). As células foram lavadas com PBS resfriado com gelo. Para coloração de citocinas intracelulares, células T foram estimuladas durante a noite com Con

A (Sigma- Aldrich) na presença de anti-CD28 mAb (BD PharMingen, USA). As células coletadas foram fixadas com 4% de paraformaldeído e permeabilidade com 0,1% de saponina (Sigma-Aldrich). Para a coloração de superfície de CD4 ou IL-IO citoplásmico, IL-4, IFN-γ ou FoxP3, as concentrações apropriadas de anticorpos rotulados com ficoeritrina (eBioscience, CA, USA) foram adicionados em células permeabilizadas durante 30 minutos em gelo seguido por lavagem duas vezes com PBS frio. As amostras foram processadas e tríadas usando FACSCalibur e dados foram analisados com software Cell Questpro (BD).

Resultados

Um alérgeno salivar de pulga, FSAl, foi identificado e implicado como uma das causas de dermatite alérgica observada em gatos e cachorros. O grau de reação de pele ou teste intradérmico (IDT) para aliviar a reatividade intradérmica do antígeno de pulga pode ser obtido por desafio de alergia à pulga intradermicamente. Como esperado, a administração ao camundongo de antígeno de pulga induziu reações significantes na pele. (Fig. 1a), induziu ativação de células tronco, induziu a produção de IgE coincidente (figura 1b), e induziu respostas de proliferação de células T CD4+ fortes (Fig. 1c) em camundongos C57 quando comparados com animais de controle nativos após o desafio intradérmico. Estes dados demonstram a utilidade do modelo de alergia ao antígeno de pulga para avaliação de novas estratégias terapêuticas contra ΑIΗ.

Este modelo foi usado para examinar a capacidade da estratégia de co-inoculação para proteger animais da hipersensibilidade imediata após o desafio com o alérgeno de pulga. Camundongos C57/BL6 foram pré-sensibilizados com várias vacinas de teste e os animais foram desafiados intradermicamente com os estratos de pulga, ou com histamina como o controle positivo ou usando PBS como controle negativo. A reação de hipersensibilidade imediata foi bloqueada no grupo imunizado 14 dias antes da co-inoculação de um DNA plasmídeo, pcDF100, codificando um epítopo de FSAl (aa100-114) misturado com as proteínas de pulga total (designado como pcDF100+F) (Fig 2a). Para determinar se a inibição observada foi devido à estrutura dorsal do plasmídeo ou ao contrário estava relacionada com uma construção de DNA codificando outra região de FSAl. A inflamação robusta dos sítios desafiados foi observada nos camundongos imunizados com ou controle de vetor mais proteínas de pulga (designado como V+F), ou uma construção de DNA codificando outra região de FSA1 a aa66-80, pD66, novamente misturado com as proteínas de pulga (designado como pcDF66+F, fig 2a). Os requerentes também examinaram a influência de equilíbrio imune do hospedeiro para o tipo Th1 sobre a inibição de reação alérgica, o pcDF100 iniciado nos animais reforçados com proteína de pulga (designados como pcDF100—>F; fig 2a). A reação severa após desafio foi observada em camundongos iniciados com pcDF100 e reforçados com F (Fig 2a), sugerindo que a indução de uma resposta imune forte piora a reação alérgica. A análise histológica revelou infiltrações por leucócitos e células -tronco nas lesões de pele de camundongos imunizados com F ou V+ F nos sítios de desafio; enquanto, camundongos imunizados com pcDFlOO+F mostraram uma estrutura intradérmica normal que está livre de células inflamatórias.

Os requerentes a seguir analisaram se o bloqueio da reação imune induzida pela co-inoculação foi dependente da dose. pcDFlOO em dose de 25, 50, 100 e 200 μg foi co-imunizado com 100 μg de proteínas de pulga, respectivamente. Dosagem a 50 μg de pcDFlOO mostrou inibição significante da reação intradérmica que alcançou uma inibição máxima a 100 μg. Uma dosagem de 25 μg demonstrou somente um efeito mínimo na formação de lesão, como os animais desenvolveram severas reações similares às observadas em animais inoculados com ou F ou V+F (Fig. 2b) ou controles positivos.

Níveis elevados de IL-4, IL-5 e IL-13 são as características de reações alérgicas e estes moduladores imunes estão implicados em severidade de alergia. Diferentes perfis das citocinas associadas com os regimes co- inoculados foram examinados. Camundongos co-inoculados com F ou V+F produziram nível maior de expressões de mRNA para IL-4, IL-5 e IL-13; enquanto, camundongos co-imunizados com pcDFlOO+F produziram níveis baixos relativos destas citocinas, sugerindo que uma função regulatória imune anti-inflamatória foi derivada da co-inoculação de pcDFlOO+F. Não foram encontradas diferenças significantes nos níveis de IL-2 ou IFN-γ dentre os regimes co-inoculados, mas IFN-γ foi levemente maior em camundongos iniciados com pcDFlOO e reforçados por F. Este resultado novamente sugere que a inibição induzida da região alérgica por co-imunização não é devido a uma resposta de Th2 a Thl não equilibrada pelas células auxiliares T específicas alergênicas.

Uma alergia mediada por IgE desencadeada por antígeno de pulga é bem caracterizada, a habilidade de co-inoculação de pcDFlOO+F para inibir produção de IgE induzida por anti-pulga foi examinada. Os níveis de IgE e IgG anti- pulga nos soros foram medidos nos dias 14, 28 e 42 e foram reduzidos levemente em camundongos co-imunizados com pcDFlOO+F comparado com grupos imunizados com V+F ou F sozinho (Fig. 2c), sugerindo que a co-inoculação não influencia a produção de IgE.

Células T CD4+ proliferativas são conhecidas como estando envolvidas no desenvolvimento de hipersensibilidade imediata. As células T COA+ isoladas do baço de camundongos co-imunizados com F, V+F ou pcDFlOO+F foram examinadas no dia 14 após a segunda imunização para suas respostas proliferativas de revocação aos antígenos de pulga in vitro.

Imunizações de F e V+F resultaram na proliferação forte de células T CD4+; enquanto as células T CD4+ isoladas de camundongos imunizados com pcDFlOO+F mostraram uma pequena, se alguma, proliferação em resposta ao estímulo pelo antígeno de pulga (Fig. 2d). Estes resultados sugerem que a inibição de hipersensibilidade observada por co- imunização de pcDFlOO+F está relacionada com as células T CD4+ específicas de antígeno não responsivo.

Os resultados indicam que a co-imunização com pcDFlOO e antígeno de proteínas de pulga induzem uma inibição da reação alérgica via regulação negativa dos níveis de citocinas inflamatórias e células CD4+ induzida por desafio intradérmico de pulga. Isto sugere que a prevenção de alergia é provavelmente específica de antígeno porque as combinações não correspondidas de antígenos não produzem o mesmo efeito.

Para testar se células Tr específicas de antígeno foram induzidas pela co-imunização de vacinas de DNA e proteína de pulga, esplenócitos foram coletados de camundongos C57B/6 co-imunizados e misturados com células T efetuadoras específicas de antígeno de pulga de camundongos singenêicos para examinar sua capacidade de inibir respostas proliferativas de revocação in vitro. Como mostrado na fig. 3a, esplenócitos de camundongos co-imunizados com pcDF100+F significantemente inibiram as respostas imunes de revocação de células T. Em contraste, esplenócitos de camundongos imunizados com F ou V+F assim como de camundongos nativos deixaram de inibir as respostas proliferativas de células T específicas (Fig. 3 a). Isto indica, que as células dentro da população de esplenócitos provavelmente geradas durante a co-imunização de animais podem suprimir a proliferação de células T específicas de antígenos. As células T não purificadas, células T ou sub-conjuntos de células T do baço de camundongos co-imunizados com pcDF100+F foram identificadas e testadas individualmente para supressão da proliferação de revocação. Inibição significante foi observada de reações de ou células T purificadas, células CD4 purificadas, ou células CD4 CD25 purificadas dos camundongos co- imunizados com pcDF100+F, mas não de outros subconjuntos de células (Fig. 3a). No entanto, as inibições de células CD4+CD25+ são em geral consideradas como sendo independentes da sensibilização do antígeno, enquanto a inibição de células CD4 CD25 desta reação é um modo dependente de antígeno (Fig. 3a).

Para ainda examinar esta questão in vivo, transferência adotiva foi usada. Os camundongos recipientes singenêicos nativos de antígenos foram transferidos adotivamente ou com células de esplenócitos totais, células T, CD4+ ou CD8+ isoladas de camundongos C57B/6 co-imunizados com pcDF100+F, F ou V+F, respectivamente. Todos os camundongos recipientes foram a seguir desafiados intradermicamente por extrato de pulga para induzir a hipersensibilidade. Células de esplenócitos, T e T CD4+ de camundongos imunizados com o pcDF100+F, mas não com o F ou V+F; foram todos capazes de suprimir o desenvolvimento da reação de hipersensibilidade imediata (Fig. 3b). Em contrate, as células T CD8+ isoladas de todos os camundongos dos grupos de experiências e de controle nativos não suprimiram esta reação. Ambos os resultados in vitro e in vivo indicam que as células Tr CD4+CD25" podem mediar esta supressão.

Para investigar o papel observado de especificidade de antígeno Tr CD4+CD25", as células Tr CD4+C25" retiradas de camundongos C57B/6 co-imunizados com pcDFlOO+F foram transferidas adotivamente nos camundongos recipientes singenêicos que foram subseqüentemente imunizados duas vezes a um intervalo bi-semanal com antígeno de pulga ou OVA em adjuvante completo de Freund (FCA). NO dia 14 após a última imunização, as células T foram isoladas e testadas para sua habilidade de proliferar ou em antígeno de pulga ou OVA in vitro. As células T de camundongo recipientes imunizados com antígeno de pulga não respondem ao estímulo com antígeno de pulga in vitro; ao contrário, as células T de camundongos recipientes imunizados com OVA-FCA responderam bem ao estímulo com OVA, mas não ao estímulo in vitro com antígenos de pulga. Como os controles, os camundongos nativos imunizados com antígeno de pulga respondem bem ao estímulo com antígeno de pulga, mas não ao estímulo com OVA in vitro e vice-versa (Fig. 3c). Este resultado indica que as células Tr CD4+C25" transferidas adotivamente somente inibem a iniciação de células T específicas de antígeno de pulga e a proliferação in vivo; apesar das respostas de células T específicas de antígeno irrelevantes não serem afetadas.

Tomados em conjunto, estes dados demonstram que as células Tr CD4+CD25" foram induzidas pela co-imunização de vacinas de DNA e de proteína. Estas parecem ser as únicas células Tr CD4+ porque elas funcionam em um modo específico de antígeno.

Para determinar se as células Tr induzidas por co-inoculação expressam alguns tipos de citocinas e marcadores únicos associados com células Tr, como previamente documentado (J. D. Fontenot. M. A. Gavin, A. Y. Rudensky, Nat Immunol 4, 330 (1 de abril de 2003); M. G. Roncarolo, R. Bacchetta, C. Bordignon, S. Narula, Μ. K. Levings, Immunol Rev 182, 68 (1 de agosto de 2001); e P. Stock et al., Nat Immunol 5, 1149 (1 de novembro de 2004)), as células CD4+CD25" foram isoladas dos camundongos imunizados com F, V+F ou pcDFlOO+F nos dias 1, 3, 7 e 14 após a imunização perfis de células T foram seguidos por coloração intracelular com anticorpos rotulados fluorescentes específicos. Após co-imunização, nos dias 1, 3, 7 e 14, as células T CD4+CD25" foram isoladas de camundongos imunizados com F, V+F e pcDFlOO+F e produção de citocinas intracelulares para expressão de IL-10, IFN-γ e IL-4 foi avaliada por citometria de fluxo. As células Tr CD4+CD25" isoladas de camundongos F, V+F, pcDFlOO+F e nativos como controles foram analisadas para expressão de CD69, CD44 e CD62L, e para sua expressão de FoxP3. As células Tr expressam T-bet mas não gata-3. No dia 14 após imunização, RNA total foi extraído de células T CD4+CD25" de todos os três grupos e RT-PCR foi usado para testar a expressão de HPRT, T- bet e gata-3. Durante o curso de 14 dias, as células T CD4 CD25" isoladas de camundongos co-imunizados com pcDFlOO+F expressaram níveis elevados de IL-10, IFN-γ, FoxP3, e uma quantidade mínima de EL-4. Em contraste, as células T CD4+CD25" produziram um nível maior de IL-4 e nenhuma expressão de FoxP3, IL-10, ou IFN-γ dos camundongos imunizados com F ou V+F. Porque o fator de transcrição Foxp3, demonstrou ser uma marca característica de células Tr, a co-vacinação induziu que as células Tr CD4+CD25" podiam ser categorizadas na classe regulatória de células T mas elas têm um fenótipo único. Os marcadores de ativação de células T são expressados igualmente em teor elevado, incluindo CD44 e CD69, e baixo para CD62L dentre os grupos imunizados, sugerindo que as células Tr CD4 CD25" induzidas são completamente ativadas pela imunização.

Para analisar o fenótipo Th para as células Tr CD4+CD25" induzidas com base nos padrões de expressão de citocinas observados, como descrito acima, a expressão de ambos os genes T-bet e gata-3 das células T CD4+CD25" de camundongos imunizados com F, V+F ou pcDFlOO+F foi analisada pelo método de RT-PCR. Os resultados mostram que as células T CD4+CD25" dos camundongos imunizados com pcDFlOO+F, mas não dos camundongos imunizados com F ou V+F, expressaram um nível maior de T- bet, uma marca característica das células Th 1. Em contraste, as células T CD4+CD25" dos camundongos imunizados com F e V+F expressaram níveis maiores de gata-3, uma característica de células Th2.

Coletivamente, estes dados demonstram que a célula T CD4+CD25" induzida pela co-imunização de vacinas de DNA e de proteína tem um célula Tr fenotípica de Thl adaptativa que pode suprimir a função proliferativa de células T CD4+ específica de antígeno.

Porque as células apresentando antígeno (APC) ativam as células T para promover uma imunidade adaptativa, a indução de célula Tr CD4+CD25" é aparentemente através de uma ativação de APC específica pela co-inoculação de vacinas de DNA + proteína. Para investigar esta questão, as experiências similares descritas como acima foram configuradas para avaliar a função de células dendríticas (DC) e fenótipo e sua influência em células T nativas. Os efeitos de co-inoculação sobre o amadurecimento de DC foi analisado. A expressão de moléculas co-estimulatórias em DCs de camundongos co-imunizados por examinada. Os esplenócitos foram isolados e coloridos para expressão de marcadores de superfície em DCs ao ligar em células positivas CDl 1 48 horas após co-imunização de pcDFlOO+F, V+F ou F. Co-imunização de pcDFlOO+F não afeta o amadurecimento de DCs como os DCs isolados do baço 48 h após a co-imunização expressaram níveis elevados e similares de CD80, CD86, MHC II, IL-12, IL-6, IL-la/f3, IFN-a/8 e TNF-a que são as características de DCs maduros; enquanto estas moléculas sobre os DCs imaturos de camundongos de controle nativos permanecem expressados em níveis relativamente baixos, sugerindo que a co-inoculação permanece que o DC imaturo seja induzido a amadurecer. No entanto, os requerentes observaram que o nível de expressão de CD40 foi dramaticamente reduzido em camundongos co-imunizados com pcDFlOO+F comparados com todos os outros grupos, sugerindo um fenótipo único de CD pode estar envolvido na indução do Tr observado. Os DCs de camundongos imunizados com V+F ou F foram observados como tendo a habilidade de ativar células T heterogêneas a proliferar; enquanto que os DCs imaturos de camundongos nativos não tem esta habilidade como esperado (Fig. 4a). De modo interessante, DCs de camundongos co-imunizados com pcDFlOO+F tem uma capacidade limitada de ativar as células T a proliferar (Fig. 4b), sugerindo que um mecanismo alternativo de indução de Tr é induzido no grupo de co-imunização. Para explorar se o DC de camundongos co- imunizados é capaz de converter células T nativas em um fenótipo de Tr5 DCs obtidos de camundongos após terem sido co-imunizados com pcDFlOO+F foram co-cultivados com células T CD4+ nativas singenêicas in vitro e subseqüentemente caracterizaram as resultantes células T CD4+ por FACS. Estas células T regularam de modo positivo níveis maiores de CD44, e CD69, mas níveis menores de CD62L, sugerindo que DC novamente tem a capacidade de ativar as células T. Resultados similares foram obtidos da análise de DCs de camundongos co-imunizados com V+F ou F. Além disso, as células T CD4+ ativadas no grupo pcDFlOO+F produziram um nível maior significante de IL-IO e IFN-γ, mas reduziram IL-4 (Fig. 4b). No entanto, as células T ativadas de grupos imunizados com V +F ou F produzem nível significante de IL-4, mas pouco IL-IO e IFN-γ (Fig. 4b). A produção de citocinas foi analisada após três ciclos de re-estímulo com DCs novos isolados de camundongos imunizados com D+F. Estes estudos demonstraram um aumento na produção de IL-IO em células T, que é uma das características de células T regulatórias. Para ainda caracterizar sua função regulatória, as células T IL-10+ foram isoladas após estímulo com DC e submetidas a MLR para verificar se elas bloqueiam a proliferação de células T respondentes no MLR. Como mostrado, a proliferação de células T respondentes foi inibida pela presença de células T IL-IO+' mas não de células T isoladas de co-cultura de DCs de camundongos imunizados com V+F e F, ou os animais de controle (Fig 4c). Estes dados demonstram que DCs dos camundongos co-imunizados com D+F desenvolveram grandes populações de células regulatórias T in vitro.

Para demonstrar a mesma conversão in vivo, DCs coletados de camundongos BALB/c após co-imunização com pcDFlOO+F foram co- transferidos com células T CD4+ nativos singenêicos em camundongos nu (nu/nu) e subseqüentemente foram analisadas estas células T transferidas por FACS para coloração intracelular para marcadores IL-IO e T reg. DCS de camundongos co-imunizados com pcDFlOO+F induziram células Tr in vivo. Os DCs isolados de baços de camundongos imunizados com pcDFlOO+F, V+F, F ou nativos de controle foram a transferência co-adotiva com células T CD4+CD25" nativas. As células T foram analisadas para IL-10, IFN-γ, IL-4, FoxP3 e CD25 no dia 3 e 7. As células T co-transferidas expressam mais IL- 10, FoxP3 e IFN-γ, mas pouco IL-4. No entanto, as células T co-transferidas com DCs de camundongos imunizados com V+F ou F expressaram níveis maiores de IL-4, mas pouco IL-10, e IFN-γ, sustentando os dados in vitro. A produção de citocinas IL-IO específica foi elevada após 2 ciclos de re- estímulo com os DCs recentemente isolados de camundongos imunizados com D+F. Estes dados demonstram que DCs de camundongos co-imunizados com D+F dirigem provavelmente células T nativas em células Tr in vivo. Consistente com os resultados anteriores, esta conversão foi somente feita dentro da população de CD4+CD25" porque a freqüência de CD25+ não foi observada como sendo influenciada em teste in vivo (Fig. 16e).

Finalmente, experimentos foram realizados para identificar que moléculas na interação entre células DC e T desempenham um papel no desenvolvimento de Tr. Porque o Tr está dentro do compartimento de células T ativadas, como mencionado acima, os sinais devem incluir sinais de via de ativação clássicos. Importantes dentre estes são a regulação positiva de classe II de complexo de histocompatibilidade principal (MCH) e moléculas co- estimulatórias (CD80/CD86), que provêem os dois sinais requeridos para a ativação de células T nativas. Para estudar este aspecto, DCs foram isolados de baço de camundongos 48 h após a co-imunização com pcDFlOO+F e co- cultivados com células T CD4+ nativas de camundongos singenêicos nativos na presença ou ausência de reagentes para bloquear as moléculas de sinalização incluindo anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40 e anti-MHC-II. Após sete dias de re-estimulação, as células T foram isoladas e adicionadas no sistema MLR para examinar suas funções regulatórias. Os resultados mostraram que ambos mAbs anti-CD40 e anti-MHC II podem parcialmente reverter os efeitos supressivos em MLR pelas células TR; enquanto mAbs contra CD80, CD86 e não tinham a habilidade de bloquear a indução do fenótipo de supressão. Estes resultados demonstram que ambos sinais de CD40 e MHC II desempenham papéis na indução de Tr no modelo de hipersensibilidade imediata induzida por alérgeno de pulga.

As células Trl adaptativas foram observadas e induzidas pelos DCs processando um imunogene ou subimunogene subótimo para inibir a função de células T normais mediada via secreção de IL-IO ou TGF-b ou ambos. Foi ainda demonstrado que DCs imaturos dirigem a diferenciação de células Trl produzindo IL-10, com produção de IL-10, TGF-R, e IFN-γ, mas elas não produzem IL-4 ou IL-2, elas são hipo-respondentes a ativação policlonal e específica de antígeno. Além disso, evidência demonstrou que a ativação subótima de DC por uma estimulação de antígeno diminuta pode induzir a conversão de Trl. Esta estimulação de DCs falta a sinalização de co- estimulação e, assim apresenta um sinal de tolerância para células T.

A co-inoculação de DNA codificando um antígeno de pulga e proteína de pulga induz células Tr adaptativas que inibem a reação alérgica induzida por desafio com alérgeno de pulga. As células demonstram um fenótipo de CD4+CD25"Foxp3+ e suprimem ín vivo e m vitro as respostas específicas de antígeno, assim como as respostas de MLR imune através da produção de populações de DC com IL-IO e EFN-γ. MHC-lf/CD40baixo são induzidas por esta co-imunização e, por sua vez, para converter células T nativas em células Tr.

Exemplo 17 - Teste de prevenção e/ou abordagens terapêuticas contra alérgeno de FAD através de co-imunização com vacinas em um modelo FAD de felinos estabelecendo a co-imunização de teste e de modelo de felinos

Existem mais de 15 tipos de alérgenos na saliva da pulga. Dentre estes, uma proteína 18 kDa, antígeno de saliva de pulga I (FSA1), foi determinado como sendo um alérgeno principal que pode causar FAD. Este foi clonado e expressado no sistema de E. coli. Além disso, a construção de expressão eucariótica ρVAX-FSAl foi também preparada.

Um modelo FAD de gato foi estabelecido e subseqüentemente usado para demonstrar que o efeito terapêutico de co- imunização de FSA 1+pVAX-FSAl sobre o FAD estabelecido em gatos. Determinação de número depulgas, duração de um ciclo Animal e parasita

Dez gatos livres de patógenos foram adquiridos de North China Pharmaceutical Group (Shijiazhuang, Hebei) e alojados em instalações no Center for Disease Control and Prevention of China (CDC) no curso da experiência. Todos os gatos tinham mais de um ano deidade, o que é um fator importante porque os animais mais jovens podem ser toleráveis ao alérgeno de pulga nesta experiência. Os gatos foram agrupados com raça e seco aleatoriamente. As pulgas estéreis foram fornecidas pelo CDC.

Para determinar a relação de infestação e sintomas FAD, 10 gatos foram separados em três grupos, incluindo um grupo de experiência com seis gatos e dois grupos de controle com dois gatos cada. Um grupo de controle foi tratado com nitenpiram, e outro não foi tratado com o nitenpiram. Cada gato de experiência foi colocado separado no dia 0 e infestado com 100 pulgas. Após dois dias, todos os gatos neste grupo receberam nitenpiram para remover as pulgas de seus corpos. Dois dos gatos e controle também receberam este remédio no dia 0. Este ciclo de desafio foi repetida semana sim, semana não, durante 7 vezes.

Esquema de imunização para os gatos de controle e induzidos com FAD com FSA1 epVAX-FSAl como co- imunogenes

Os 6 gatos FAD foram separados em três grupos. Dois deles foram co-imunizados com 00 μg de FSA 1 i.p. e 400 μg plasmídeo ρ V AX- FSAl no abdome lateral duplo subcutaneamente. Dois foram co-imunizados com 400 μg de FSAl i.p. e 400 μg vetor pVAX subcutaneamente. Os dois últimos não foram imunizados e usados como o grupo de controle positivo. Os 4 gatos sem FAD foram separados em dois grupos. Dois foram co- imunizados com 400 μg de FSAl i.p. e 400 μg plasmídeo pVAX-FSAl em abdome lateral duplo subcutaneamente e os outros dois foram imunizados com 400 μg de FSAl i.p. e 400 μg vetor pVAX subcutaneamente. Os dois gatos de controle com nitenpiram foram enviados a grupos diferentes. Os gatos foram imunizados três vezes: nos dias 0, 9, e 16. Após isto, os gatos foram desafiados para 6 ciclos como acima. Durante a segunda imunização, um ciclo de desafio foi feito ao mesmo tempo, porque os requerentes desejavam manter os gatos positivos no estado suscetível para próxima terapia. O programa de imunização foi como na tabela 2. Tabela 2.

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Contagens de exames dermatológicos

Método

Os gatos foram classificados pelas avaliações dermatológicas dois dias após cessar cada infestação. As avaliações incluíram eritema, pápulas, crostas, escamas, alopecia, escoriação. O corpo de cada gato foi dividido em três porções para avaliar qual parte pode ter o surto clínico mais severo. De acordo com o relatório documentado anterior, três partes consistiam de (1) o dorso, da cabeça até o rabo da superfície dorsal, (2) abdome lateral duplo, da escápula até o rabo, (3) peito e parte inferior, da laringe até os quartos traseiros caudiomediais. Contagens de esfregaços de células de sangue periférico dos gatos Método

O sangue periférico anti-coagulante a 2 ml foi coletado em dias 0, 2, 16, 30, 44, 58, 62 do grupo de experiência e dia 0, 14, 28, 42, 56, 60 dos grupos de controle. As mesmas amostras foram coletadas após a imunização. Uma gota de sangue foi esfregada em uma lâmina de vidro limpa. Após o esfregaço ter secado, as células foram coloridas com coloração Wright- Giemsa durante 15 min. Após um enxágüe em água deionizada, o esfregaço foi levemente secado com papel Kimwipe, e desidratado por 96% e 100% etanol com cada tratamento de 10 segundos. A lâmina foi então tratada com xileno durante 30 minutos. Após a coloração, núcleo e citoplasma de células de sangue foram distintos por uma coloração azul e rosa. A porcentagem de cada tipo de células foi contada por um úmero total de 200 células em uma vista sob um microscópio luminoso.

Abordagens terapêuticas

Os mesmos métodos como acima foram usados exceto que RNA total foi extraído das células mononucleares que foram isoladas de sangue periférico no dia 7 após a terceira imunização de cada grupo. Análise estatística

Análise de variância (ANOVA) foi usada para detectar as diferenças que incluíram os escores no exame dermatológico de cada ciclo, os escores de várias lesões e escores em diferentes sítios dentre estes três grupos. As diferenças de testes de pele e nível de IgE foram determinados também por ANO VA. Análises estatísticas de outros foram realizadas usando o teste t de Student. Nestas análises, dados foram convertidos em gráfico logarítmico. Se P<0,05, indica uma diferença significante.

Análises estatísticas dos mesmos também foram realizadas usando o teste t de Student. Nestas análises, os dados foram convertidos em log. Se P<0,05, os dados indicam diferenças significantes. Resultados:

Observação e escores de exames dermatológicos dos gatos

Lesões foram classificadas de acordo com seus tipos, locais, tamanhos e números.

Os escores totais foram analisados dos grupos, e as lesões e sítios para o grupo experimental foram avaliados. O grupo PAD registrou mais escores do que outros grupos. Os escores foram aumentados no quarto ciclo de infestação, e então permaneceram em um nível de 5,0. Os escores no grupo FAD foram significantemente maiores do que em outros grupos de controle (P<0,01). Estes resultados suportam a conclusão que o modelo FAD de gato foi válido e possível para avaliar um tratamento terapêutico ou profilático contra a reação alérgica.

Para avaliar onde as lesões ocorrem principalmente, qual tipo, e quando ocorre, análises estatísticas foram feitas e verificou-se que pápulas e perda de pêlo foram os fatores mais comuns para contribuir para os escores do exame dermatológico no grupo FAD. A leitura do eritema não foi um fator que contribuiu, porque o eritema alcançou o pico no dia 44, mas caiu no final desta experiência, indicando falta de persistência. Por outro lado, as pápulas foram aumentadas, e permaneceram em um nível elevado após 44 dias e alcançaram o pico no dia 86 (P<0,05), sugerindo sua persistência. Similarmente, a perda de pêlo foi mantida em alto nível após o dia 44 (P<0,05). Estas duas leituras são indicadas como um bom início para refletir FAD. Os escores de outras lesões foram distribuídos aleatoriamente e inconsistentes nos dois grupos de controle, em que não foram observadas diferenças significantes de lesões.

Apesar da maior parte das lesões dermatológicas tenderem a estar localizadas nos dorsos e cabeças comparado com outros sítios no dia 44 (P<0,05), as lesões foram estendidas em todo o corpo no final da experiência. Esta observação foi diferente dos relatos anteriores em cachorros, dos quais o peito e a parte inferior tenderam a ter a maior parte das lesões. Isto pode ser devido às diferenças habituais entre gatos e cachorros.

Para eliminar a interferência do tratamento com nitenpiram, quaisquer diferenças entre estes tratados com nitenpiram e os sem tratamento foram avaliados. A partir dos escores do exame dermatológico, não foi vista uma diferença significante nos grupos de controle. Assim, o tratamento com nitenpiram não influenciou os resultados obtidos das experiências dos requerentes (figura 5).

Porcentagem celular em sangue periférico por análise de esfregaço de sangue Uma comparação do número de cada tipo de células em sangue periférico de diferentes grupos mostrou que o número de eosinófilos foi maior no grupo de experiência do que os dos grupos de controle. Os esfregaços de sangue foram realizados para cada ciclo de infestação, mas a porcentagem de cada tipo de células se tornou constante após o terceiro ciclo. Como resultado do dia 58, mostrado na tabela 3, as mudanças significantes ocorreram no número de eosinófilos dentre os três grupos. Porque o aumento de eosinófilos está relacionado com doenças alérgicas como previamente documentado, estes resultados indicam que os gatos no grupo de experiência foram mais suscetíveis à infestação de pulgas. Não se nota uma diferença óbvia entre os dois grupos de controle, o com nitenpiram parece não ter interferência nos números de células no sangue periférico do gato.

Tabela 3: Tipos de célula e sua percentagem em sangue periférico

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Exame hisíopatológico

Primeiro, as diferenças entre as peles normais e as com lesões foram analisadas. As biópsias de pele foram selecionadas de todos os grupos no dia 58. No entanto, as biópsias de pele de um gato podem também mostrar as diferenças em algum grau, especialmente os com lesões. Isto não foi suficiente para indicar se os gatos infestados com pulgas foram induzidos para ter FAD. Por esta razão, as biópsias de pele de cada grupo foram coletadas após o IDT com os estratos de pulga, porque IDT com pulga provê respostas imunes revocadas específicas de antígeno.

Teste de pele para avaliar se os gatos eram alérgicos aos extratos de pulga

O diâmetro da bolha ou pústulas foi medido 15 min após a injeção de IDT. Porque cada gato tem um nível diferente de sensibilidade ao EDT, os resultados de cada animal individual foram relatados. A figura 6 mostra as reações de pele em todos os grupos. Uma reação alérgica foi considerada como tendo ocorrido se o valor de EDT estiver acima da média de limiar (a soma de solução salina e histamina é dividida por 2), ou não ocorreu, se um valor IDT estiver abaixo da média do limiar. Os resultados são mostrados na tabela 4. Os gatos com escores de exame dermatológico a 5,0 ou acima foram identificados como os positivos para FAD.

Tabela 4 Comparação de avaliação dermatológica com o teste de pele intradérmico (IDT)

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Teste de pele para determinar o efeito de co-imunização de FSAl e ρ VAX- FSAl

Os gatos com FAD foram co-imunizados com FSA 1+p VAX- FSAl ou vetor + FSAl como descrito no projeto experimental B na figura 18 e tabela 2. Antes e depois das imunizações, os gatos foram testados por IDT com vários antígenos de pulga ou controle de antígenos. As leituras IDT foram registradas nos dias 7 após a última imunização, como resumido na figura 7 e tabela 5.

Os resultados mostraram que os gatos FAD co-imunizados com FSA 1+pVAX-FSAl tinham menores reações na pele aos desafios com extratos de pulga ou antígenos específicos de pulga (como proteína FSAl); ao contrário, os gatos imunizados com vetor + FSAl tinham mais reações na pele nos mesmos desafios.

Comparando as diferenças antes e após a imunização, os requerentes observaram que a reação da pele foi bem menor após a imunização do que antes no grupo co-imunizado como mostrado na figura 7, sugerindo que a co-imunização diminuiu de modo significante a sensibilidade ao desafio com pulga. Ao contrário, não foi visto efeito significante em grupos imunizados com FSAl e vetor pVAX, indicando que os gatos permaneceram com seus estado alérgico. O estado de todos os gatos foi listado na tabela 5.

Tabela 5

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Efeitos terapêuticos de co-imunização nos gatos FAD

Para determinar o efeito terapêutico de co-imunização em lesões dos gatos FAD, as lesões foram registradas durante um período de 53 dias após a primeira imunização e mostrados na figura 8. Os escores de lesões em grupo co-imunizado foram dramaticamente reduzidos de 5,5 a 2 (figura 8, pontos quadrados em linha). Ao contrário, os efeitos sobre o grupo imunizados com FSAl e vetor ρVAX foi reduzido mas em uma menor extensão ( figura 8, pontos em triângulo em linha). O resultado sugeriu que a co-imunização tinha um efeito terapêutico sobre o FAD estabelecido em gatos.

Correlação do tipo de lesões afetadas pela co-imunização em gatos FAD

Para correlacionar qual tipo de lesões reduziu com a co- imunização, os escores em cada tipo de lesões em cada grupo foram analisados e os resultados são mostrados na figura 9A-9F. Somente o escore das pápulas foi reduzido de 4,0 a 0,5 e coincidente com a co-imunização de FSAl+pVAX-FSAl (figura 9B, pontos quadrados em linha). Outro tipo de lesões em grupo experimental permaneceu inalterado. Correlação do local de lesões afetadas pela co-imunização nos gatos FAD Efeitos terapêuticos de co-imunização nos gatos FAD

Após análise da correlação, os dados mostraram que os escores de abdome lateral duplo em grupo terapêutico foram reduzidos de 1,5 a 0 (figura 10B) após a co-imunização de FSAl+p V AX-FSAl, mas sem efeito nos outros locais, como mostrado nas figuras 1OA-IOC. O grupo terapêutico imunizado com FSAl e vetor pVAX mostrou uma resposta hesitante (figura 10B, pontos em triângulo). Os escores de exame dermatológico de gatos FAD imunizados com FSAl e vetor pVAX foram reduzidos de 1,5 a 0,5 após 7 dias da última imunização. Em contraste, os em co-imunizados com FSAl+pVAX-FSAl foram reduzidos prontamente após sua primeira imunização e permaneceram em baixo nível o tempo todo (figura 10B, pontos quadrados). Sumário

Estes dados demonstram a indução bem sucedida de um modelo FAD em felinos por infestações de pulgas. Os parâmetros fisiológicos ou patogênicos nos felinos FAD foram caracterizados, que podem ser usados como um modelo para avaliar o tratamento de abordagens imunoterapêuticas ou profiláticas.

A co-imunização de vacinas FSA 1+p VAX-FS Al foi demonstrada como suprimindo o FAD estabelecido em gatos. Esta supressão parece ser específica antigênica, o que sustenta os resultados observados em estudos com camundongos.

Exemplo 18 pVAXl-K-FSAl

Plasmídeo pVAX I-K-FSAl compreendia a seqüência de codificação de FSAl ligada a uma seqüência Kozak em estrutura dorsal de plasmídeo pVAX (Invitrogen). A seqüência do inserto K-FSAl é SEQ ID NO: 61. Nucleotídeos 1-9 correspondem à seqüência de Kozak. A matriz de leitura aberta de um FSAl positivo faltando 8 aminoácidos começa no nucleotídeo 10. Um mapa de plasmídeos, plasmídeo ρVAXl-K-FSA1, é mostrado na figura 11. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> china Agricultura! Uftiversity Wyeth Wang, Bin Jiη, Huali Kang, Voumin Chu, Hs1en-3ue Ng, Kaleung

<130> WANGOOO 3-500

<150> PCT/CN200510132381 <151> 2005-12-23

<160> 61

.<170> patentin reisã® 3,3

<210> 1 <211> 640 <212> ONA

<213> ctenocephalides felis <400> 1

atgaattatt gttttttagt atttttagta tatttagtat ttgcagttaa tggggaagat 60

atttggaaag ttaataaaaa atgtacatca ggtggaaaaa atcaagatag aaaactcgat 120

caaataattc aaaaaggcca acaagttaaa atccaaaata tttgcaaatt aatacgagat 180

aaaccacata caaatcaaga gaaagaaaaa tgtatgaaat tttgcaaaaa agtttgcaaa 240

ggttatagag gagcttgtrga tggcaatart tgetactgca gcaggccaag taatttaggt 300

cctgattgga aagtaagcaa agaatgcaaa gatcccaata acaaagattc tcgtcctacg 360

gaaatagttc catatcgaca acaattagca attccaaata tttgcaaact aaaaaattca 420

gagaccaatg aagattccaa atgcaaaaaa cattgcaaag aaaaatgtcg tggtggaaat 480

gatgctggat gtgatggaaa cttttgttat tgtcgaccaa aaaataaata ataattataa 540

taaataaatt gttatagtta ttagttatcc çatçacatat tagaaaagtg gcttataatt 600

tatgaacaat ataacacata aattagttgt gtaaaaaaaa 640

<210^ 2

<211> 176 <212> PRT

<213?- ctenocephalides felis

<400> 2

Met Asn Tyr Cys Phe Leu vai Phe Leu vai Tyr Leu vai Phe Ala vai ί S 10 15

Asn Gly Glu Asp Xle Trp Lys vai Asn Lys Lys cys Thr ser Gly el y 20 25 30

Lys Asn Gln Asp Arg Lys Leu Asp 01« Ile lie Gln Lys Gly Gln Gln 35 40 45

Val Lys Ile Glii Asn Ile Cys Lys Leu Ile Arg Asp Lys Pro Hfs Thr 50 55 60

Asn GTn Glu Lys Glu L^s Cys Met Lys Phe c^s Lys Lys vai Cys Lgs

Gly Tyr Arg Gly ATa Cys Asp Gly Asn Ile cys Tyr Cys ser Arg Pro 85 90 95

Ser ASn Leu Gly Pro Asp Trp Lys vai ser Lys Glu Cys Lys Asp Pro 100 105 110

asa Asri Lys Asp ser Arg Pro Thr Glu lie vai Pro Tyr Arg Gln Gln 115 120 125

Leu Ala lie Pto Asn Il e Cys Lys Leu Lys Asn ser Glu Thr Asn Glu 130 135 140

Asp Ser Lys cys Lys Lys Nis cys Lys Glu Lys Cys Arg Gly Gly Asn 145 150 155 160

Asp Ala Gly cys Asp Gly Asn Phe cys Tyr Cys Ars Pro Lys Asn Lys 165 170 17S

<2lG> 3 <211> 416 <212> DMA

<213> Ctenocephalides felis <400> 3

ggcctggcgg tgctectgga aaaggatgtt agacgcagcc ctcccaccct gccctactgt 60 tgcggccaca gcagattgtg aaatttgccc agccgtgaag agggatgttg acctattcct 120 gacgggaacc cccgacgaat atgttgagca agtggcacaa tacaaagcac tacctgtagt 180 attggaaaat gccagaatac tgaagaactg cgttgatgca aaaatgacag aagaggataa 240 ggagaatgct ctcagcttgc tggacaaaat atacacaagt cctctgtgtt aaaggagcca 300 tcactgccag gagccctaag gaagccactg aactgatcac taagtagtct cagcagcctg 360 ccatgtccag gtgtcttact agaggattcc agcaataaaa gccttgcaat tcaaac 416

<210> 4 <211> 88 <212> PRT <213> ctenocephalides felis <400> 4 Met Leu ASp

Asp Cys Glu

Tti r Gl y Thr 35

Leu Pro vai 50

Ala cys Met 65

Lys ile Tyr

<210> 5

<2ΧΧ> 410

<212> ONA

<2X3> ctenocephalides felis

<400> S

ctgcatcatg aagggggctc gtgttctcgt gcttctetgg gctgccttgc tcttgatctg 60

gggtggaaat tgtgaaattt gcceagccgt gaagagggat gttgacctat tcctgacggg 120

aacccccgac gaatatgttg agcaagtggc aeaatacaaa gcactacctg tagtattgga X80

aaatgccaga atactgaaga actgcgttga tgcaaaaatg acagaagagg ataaggagaa 240

tgctctcagc ttgctggaca aaatatacac ãagtcctctg tgttaaagga gccatcactg 300

ccaggagccc taaggaágçc actgaactga teaetaagta gtctcagcag ectgccatgt 360

ccaggtgtct tactagagga ttccagcaat aaaagccttg caattcaaac 410

<210> 6 <2X1> 92 <212> PRT

<213> Ctenocephalides felis <400> 6

Met uys Gly Ala Arg vai Leu vai Leu Leu Trp Ala Ala Leu Leu Leu

Ala Ala Leu pro Pro Cys Pro Thr Val Ala Ala Thr Ala 5 20 X5

xle Cys pro Ala vai Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu 20 25 30

pro Asp Glu Tyr vai Glu Gln vai Ala Gln Tyr Lys Ala 40 45

vai Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu L^s Asn Cys vai Asp

55

Ttir Glu Glu Asp Lys Glu Asri Ala Leu ser Leu Leu Asp 70 75 80

Thr ser pro Leu cy$ 85

lie Trp Gly Gly ASη Cys Glu ile cys Pro Ala Val Lys Arg Asp vai 20 25 30 Asp Leu Phe Leu Thr GTy Tbr pro Asp Glu Tyr Val Glu Gln VaT Ala 35 40 45

Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Val Val Leu Glu Asit Ala Arg Ile Leu Lys 50 55 60

Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr GTu Glu ASp Lys GTu Asn ATa Leu 65 70 75 80

Ser Leu Leu Asp Lys ITe Tyr Thr ser Pro Leu Cys 85 90

<210> 7 <211> 525 <212> DNA

<213> Ctenocephalides canis <400> 7

atgaagaccc tgctcctcac catcggcttc agcctcattg cgatcctgca ggcccaggat 60 accccagcct tgggaáagga cactgtggct gtgtcaggga aatggtatct gaaggccatg 120 acagcagacc aggaggtgcc tgagaagcct gactcagtga ctcccatgat cctcaaagcc 180 cagaaggggg gcaacctgga agccaagatc accatgctga caaatggtca gtgccagaac 240 atcacggtgg tcctgcacaa aacctctgag cctggcaaat acacggcata cgagggccag 300 cgtgtcgtgt tcatccagcc gtccccggtg agggaccact aeattctcta çtgcgagggc 360 gagctccatg ggaggcagat ccgaatggcc aagcttctgg gaagggatcc tgagcagagc 420 caagaggcct tggaggattt tcgggaattc tcaagagcca aaggattgaa ccaggagatt 480 ttggaactcg cgcagagcga aacctgctct ccaggaggac agtag 525

<210> 8 <211> 174 <212> PRT

<213> Ctenocephalides canis <400> 8

Met Lys Thr Leu Leu Leu Thr Ile Gly Phe ser Leu Ile Ala Ile Leu 1 5 10 15

GTn ATa Gln Asp Tttr Pro Ala Leu GTy Lys ASp Thr vai Ala VaT ser 20 25 BO

Gly Lys Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr ATa Asp Gln Glu Val Pro Glu 35 40 45

Lys pro Asp Ser Val Tfir pro Met JTe Leu Lys ATa Gln Lys Gly Gly 50 55 60 Asn Leu Glu Ala Lys Ile Thr Met Leu Thr Asn Gly Gln Cys Clsn Asn 65 70 75 80

Ile Thr vai vai teu His LysiTtir Ser Glit Pro Gly Lys Tyr Thr Ala 85 90 95

Tyr Glu Gly Gln Arg Val Val Phe Ile Gln Pro Ser Pro Val Arg ASρ 100 105 110

H-is Tyr Ile Leu Tyr Cys Glu Gly Glu léu His Gly Arg Gln lie Arg 115 120 125

Met Ala Lys Leu teu Gly Arg Asp Pro Glt* Gln Ser Gln Glu Ala Leu 130 135 140

Glu Asp Phe Arg Glu Phe Ser Arg Ala Lys Gly Leu Asn Gln Glu Ile 145 150 155 160

Leu Glu Leu Ala Gln ser Glu Tfir cys Ser Pro Gly Gly Gln 165 170

<210> 9 <211> 791 <212> DMA

<2!3> Ctenocephalides canis

<40Q> 9

agagctggat ccgtgtgtgt gctggccaai gagecctgga gggtccgget ccagagtaec 60 ctcttggcac agggccgagt ccatcgggac agatgaacct agaggactcc actgccctcc 120 catccaeggg gccgggtcac cagactctgc aagtctccag ctgtcgccaa acccagacag 180 aaggtgctgt ggacatgcag ctcctactgc tgaccgtggg cctggcactg atctgtggcc 240 tccaggctca ggagggaaac catgaggagc CCcãgggãgg Cdtagaggag ctgtctggga 300 ggtggcactc cgttgccctg gcccccaaca agtccgatct gatcaaaccc tgggggcact 360 tcagggtttt catccacagç atgagcgcaa aggacggcaa cctgcacggg gatatcctta 420 taccgcagga cggccagtgc gagaaagtct ccctçactgc gttcaagact gccaecagca 480 acaaatttga cctggagtac tggggacaca atgacctgta cctggcagag gtagacceca 540 agagctacct gattctctac atgatcaacc agtacaacga tgacaccagc Ctggtggcte «00 acttgatggt ccgggacçtc agcaggcagc aggacttect gccggcattc gaatctgtat «60 gtgaagacat cggtctgcac aaggaccaga ttgtggttct gagcgatgac gatcgctgcc 720 agggttccag agactagggc ctcagccacg eagagagcca agcagcagga tctcacctgc 780 ctgagtacgg t 791 <210> 10

<211> 150

.<212> PRT

<213» Ctenocephalides canis

<400> 10

Met GTn Leu Leu Leu Leu Thr Val Gly Leu Ala Leu lie Cys Gly Leu 1 5 10 15

GTn ATa GTn GTu GTy Asn His GTu Glu Pro Gln GTy Gly Leu Glu GTu 20 25 30

Leu Ser Gly Aro Trp His Ser VaT ATa Leu Ala ser Asn Lys Ser Asp 35 40 45

Leu Ile Lys Pro Trp GTy His Phe Arg VaT Phe ITe His Ser Met Ser 50 55 60

Ala Lys ASp GTy Asn Leu His Gly Asp Ile Leu Ile Pro Gln Asp Gly 55 70 75 80

Gln Cys GTu Lys Val ser Leu Thr Ala Phe Lys Thr ATa Thr ser Asn 85 90 95

Lys Phe Asp Leu Glu Tyr Trp Gly His Asn Asp Leu Tyr Leu Ala GTu 100 105 110

vai ASp Pro Lys ser Tyr Leu Ile Leu Tyr Met ϊΐβ Asn GTn Tyr Asn 115 120 125

Asp Asp Thr ser Leu Val Ala His Leu Met Val Arg Asp Leu ser Arg 130 135 140

Gln GTn Asp Phe Leu Pro Ala Pfse Glu ser Val Cys Glu Asp Ile GT 145 150 155

Leu Hi

Gly 160

i s Lys Asp Gln Ile Val Val Leu Ser Asp as ρ Asp Arg Cys Gln 165 170 175

Gly ser Arg Asr 18C

<210> 11

<2H> 1099

<212> PNA

<213> Dermatophagoides pterortyssinus

<400> 11 gaattccttt ttttttcttt ctctctctaa aatctaaaat ccatccaaca tgaaaattgt 60 tttggccatc gcctcattgt tggcattgag cgctgtttat gctcgtccat catcgatcaa 120 aaettttgaa gaatacaaaa aagccttcaa caaaagttat gctaccttcg aagatgaaga 180 agctgcccgt aaaaactttt tggaatcagt aaaatatgtt caatcaaatg gaggtgccat 240 caaccatttg tccgatttgt cgttggatga attcaaaaac cgatttttga tgagtgcaga 300 agcttttgaa cacctcaaaa ctcaattcga trtgaatgct gaaactaacg cctgcagtat 360 caatggaaat gctccagctg aaatcgattt gcgacaaatg cgaactgtca ctcccattcg 420 tatgcaagga ggctgtggtt catgttgggc tttctçtggt gttgccgcaa ctgaatcagc 480 ttatttggct taccgtaatc aatcattgga tcttgctgaa caagaattag tcgattgtgc 540 ttcccaacac ggttgtcatg gtgataccat tccacgtggt attgaataca tccaacataa 600 tggtgtcgtc caagaaagct actatcgata cgttgcacga gaacaatcat gccgacgacc 660 aaaxgcacaa cgtttcggta tctcaaacta ttgccaaatt tacccaccaa atgtaaacaa 720 aattcgtgaa gctttggctc aaacccacag cgctattgcc gtcattattg gcatcaaaga 780 tttagacgca ttccgtcatt atgatggccg aacaatcatt caacgcgata atggttacca 840 accaaactat cacgctgtca acattgttgg ttacagtaac gcacaaggtg tcgattattg 900 gatcgtacga aacagttggg ataccaattg gggtgataat ggttaeggtt attttgctgc 960 caacatcgat ttgatgatga ttgaagaata tccatatgtt gtcattctct aaacaaaaag 1020 acaatttctt atatgattgt cactaattta tttaaaatca aaatttttag aaaatgaata 1080 aattcattca caaaaatta 1099

<210> 12

<211> 320

<212> PRT

<213> Escherichi a coti

<400> 12

Met Lys ite vat Leu Ala Ile Ala ser Leu Leu Ala Leu ser Ala vai 1 5 10 15

Tyr Ala Ara ρro ser ser lie Lys Thr Phe Glu Gtu Tyr Lys Lys Ala 20 25 30

Phe Asn Lys ser Tyr Ala Thr Phe Glu Asp Gtu Glu Ala Ala Arg Lys

35 40 45

Asn Phe Leu Glu ser vai Lys Tyr Vat Gln Ser Asn Gly Gly Ala Ile 50 55 60

Asn Mis Leu ser Asp Leu ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Phe teu 65

70

75

80

Met ser Ala Glu Ala Phe aiU Hls Leu Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn 85 90 95

Ala Glu Thr Asn Ala Cys Ser lie Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile 100 105 . 110

Asp Leu Arg Gln Met Arg Thr vai Ttir Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly 115 120 125

Cys Glg ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala

135

140

Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu 145 150 155 160

Val Asp Cys Ala ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr lie Pro Arg 16 S 170 175

Gly Ile Glu Tyr Ile Gln His Asn Gly vai vai Gln Glu ser Tyr TVr 1&0 185 190

Arg Tyr Val Ala Arg Glu Gln ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg 195 ZOO 205

Phe Gfly Ile ser Asπ Tyr Cys Gln He .Tyr Pro Pro Asn Val Asn Lys 210 215 220

Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gln Thr His Ser Ala Ile Ala vai He ile 225 230 235 240

Gly Ile Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile 245 250 255

Xle Gln Arg ASp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr Mis Ala vai Asn Il e 260 265 270

vai Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly vai Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn 275 280 285

Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Alia 290 H 295 30o

Asn He Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr vai Val He Leu 305 310 315 320 <210> IB <211> 717 <2Χ2> DlMA

Arachls hypogaea

<400> 13

gctcacca-ta ctagtagccc tcgccctttt gcagtgggaa ctccaaggãg acagaagatg gccctgcgag caacatctca tgcagaagat cccgtacagc cetagtcagg atccgtacag atcctctcag caccaagaga ggtgttgcaa gtgcatgtgc gaggcattgc aacagatcât gcaacaggag caacagttca agagggagct ggcaccacag cgttgcgact tggacgtcga tatctoaaaa aaagaaaaga aaagaaaaga gttatgttta gttttggtaa taataaagat acraaggcaa gcttaggtta tatgagcacc tttgttgetg cagagttgta accatcttga

<2Í0> 14 <211> 766 <212> ONA

<213> Arachls hypogaea <400> 14

agaaagagaa gacaagatgt cgtggcaaac cgaaggcgac cacctctcct ccgccgcaat gagctctcat ttccctcagt teaagcctga tgagcctgga tcgctcgcce ctaccgggtt ccaaggtgaa cccggagcta tcattccagg gaagacgaat caggcgttaa tcatcggaat caacatgart gttgaaaggc tgggtgatta tgttatttct tgttatetge ttgctcattt tgtgccaaga gaatgctcga ttgtagtgta atgggatctg cgtctaggga agaagxtatg tctgttgttg tgctttttag cgggtatctg gggcataaat gggcattaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

cctcctcgct gcccacgcat etgegaggca 60 ccagagccag ctcgagaggg cgaacctgag 120 ccaacgrgac gaggattcat atgaacggga 180 ccctagtcca tatgatcgga gaggcgctgg 240 tgagctgaac gagtttgaga acaaccaaag 300 ggagaaccag agcgataggt tgcaggggag 360 caggaacttg cctcaacagt gcggccttag 420 aagtggcggc agagaeagat actaaaeacc 480 aaatagctta tatataagct attatctatg 540 catcactata tgaatgtgtt gatcgtgtta 600 tttagagtgc ttttatggcg ttgtctatgt 660 aataatataa aaagatcatg ttttgtt 717 ctacgtcgat aaccaeettc tctgcgaaat 60 cctcggccaa gaeggcggtg tttgggetea 120 ggaaattact gctatcatga acgactttgc 180 gtacctcggt ggcaccaaat acatggttat 240 gaagaagggt cctggtggtg ttaccattga 300 ctacgataag ççaatgactc cggggcagtg 360 tctcattgat acgggtcttt aagtcctctt 420 cactggctcc tatacgaggc ttcgcatcga 480 ataatattaa ttgatgggta ttcâaaagtc 540 gtg Cttgag agtgaatgat aactatcatc 600 tatacaattt acaagtggtt ttaatgctgt 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa. 720 aaaaaaaaaa aaaaaa 766 <210> 15 <211> 131 <212> PRT

<213> Arachis hypogaea <400> 15

Met ser Trp Gln Thr Tyr vai Asp Asn His Leu Leu cys Glu Ile Glu 1 5 10 IS

Gly Asp His Ley Ser ser ATa Ala Ile Leu Gly Gln Asp Gly Gly Val 20 25 BO

Trp Ala Gln ser ser His Phe Pro Glti Phe Lys Pro Glu Glu Ile Thr 35 40 45

Ala Xle wet Asn Asp Phe Ala Glu Pro Gly ser Leu Ala Pro Thr Gly 50 55 60

Leu Tyr Leu Gly Gly Thr Lys Tyr Met vai Ile Gln Gly Glu Pro Gly 65 70 75 80

Ala lie Xle Pro Gly Lys LyS Gly Pro Gly Gly Val Thr lie Glu Lys 85 90 95

Thr Asn Gln Ala Leu Ile Ile Gly lie Tyr Asp tys Pro Met Thr Pro 100 105 110

Gly Gltt Cys Asn Met lie Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu Ile Asp 115 120 125

Thr Gly Leu 130

<210> 16 <211> 1295 <212> DNA

<213> cryptomeria japonica <400> 16

aatctgctca taatcstagc atagccgtat agaaagaaat tctacactct gctaccaaaa 60 aatggattcc ccttgcttag tagcattact ggttttctct tttgtaattg gatcttgetx 120 ttctgataat cccatagaca gctgctggag aggagactca aactgggcac aaaacagaat 180 gaagctcgca gattgtgcag tgggcttcgg aagctceacc atgggaggca agggaggaga 240 tctttatacg gtcacgaact cagatgacga ceetgtgaat cctgcaccag gaactctgcg 300 ctatggagca acccgagata ggcccctgtg gataattttc agtgggaata tgaatataaa 360 gctcaaaatg cctatgtaca ttgctgggta taagactttt gatggcaggg gagcacaagt 420 ttatattggc aatggcggtc cctgtgtgtt tatcaagaga gttagcaatg ttatcataca 480 Cggtttgtat ctgtacggct gtagtactag tgttttgggg aatgttttga taaacgagag 540 ttttggggtg gagcctgttc atcctcagga tggcgatgct cttactctge gcactgctac 600 aaatatttgg attgatcata attctttctc caattcttct gatggtctgg tcgatgtcac 660 tcttacttcg actggagtta ctatttcaaa caatcttttt ttcaaccatc ataaagtgat 720 gttgttaggg catgatgatg catatagtga tgacaaatcc atgaaggtga cagtggcgtt 780 caateaatrtt ggacctaact gtggacaaag aatgcccagg gcacgatatg gacttgtaca 840 tgttgcaaac aataattatg acccatggac tatatatgca attggtggga gttcaaatcc 900 aaccattcta agtgaaggga atagtttcac tgcaccaaat gagagctaca agaagcaagt 960 aaccatacgt attggatgca aaacatcatc atcttgttca aattgggtgt ggcaatctac 1020 acaagatgtt ttttataatg gagcttattt tgtatcatca gggaaatatg aagggggtaa 1080 tatatacaca aagaaagaag ctttcaatgr tgagaatggg aatgcaactc etcaattgac 1140 aaaaaatgct g999tttrtaa catgctetct ctetaaacgt tgttgatgat gcatatattc 1200 tagcatgttg tactatctaa attaacatca acaagaaata tatcatgatg tatattgttg 1260 tattgatgtc aaaataaaaa tgttctttta ctatt 1295

<210> 17 <2Χ1> 374 <212> PRT

<213> Cryptomerla japonica <400> 17

Met Asp ser Pro cys Leu Val Ala Leu Leu Val Phe Ser Phe Val Ile 15 10 IS

Gly Ser cys Phe ser Asp Asn Pro rle Asp Ser Cys Trp Arg Gly Asp 20 25 30

Ser Asn Trp Ala Gln Asn Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala vai Gly 35 40 45

Phe Gly ser Ser Thr Met Gly Gly Lys Gly Gly Asp Leu Tyr Thr vai 50 55 60

Thr Asn Ser Asp ASp Asp Pro vai Asn Pro Ala Pro Gly Thr Leu Arg 65 70 75 80

Tyr Gly Ala Thr Arg Asp Arg Pro Leu Trp lie He Phe ser Gly Asn 85 90 95 Met ASft ile Lys Leu Lys Met Pro Met Ty·* He Alã Gly Tyr Lys Thr 1&0 105 110

Phe Asp Gly Arg Gly Ala Gln Val TVr Ile Gly Asn Gly Gly Pro Cys 115 120 125

vai Phe lie Lys Arg vai ser Asn vai Ile lie His Gly Leu Tyr Leu 130 135 140

Tyr Gly Cys Ser Thr ser Val Leu Gly Asn vai Leu Ile Asn Glu Ser 145 . 150 ISS 160

Phe Gly vai Glu Pro vai His Pro Gln Asp Gly Asp Ala Leu Thr Leu 165 170 175

Arg Thr Ala Thr Asn He Trp ile Asp His Asn Ser Phe ser Asn Ser ISO 185 190

ser Asp Gly Leu vai Asp vai Thr Leu Thr Ser Thr Gly vai Thr Ile 195 200 205

Ser Asn Asn Leu Phe Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu Gly His 210 215 220

Asp Asp Ala Tyr ser Asp Asp Lys ser Met Lys Val Thr vai Ala Phe 225 230 235 240

Asrt Gln PHe Gly Pro Asn Cys Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg Tyr 245 250 255

Gly Leu vai His Val Ala Asn Asri Asn Tyr Asp Pró Trp Thr ile Tyr 260 265 270

Ala ile Gly Gly ser ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn ser 275 280 285

Phe Ttir Ala Pro Asn GTu Ser Tyr Lys Lys Gln Val Thr lie Arg lie 290 295 300

Gly cys Lys Tlir Ser ser ser cys ser as η Trp vai Trp Gln Ser Thr 305 310 315 320

Gln Asp Val Phe Tyr Asn Gly Ala Tyr Phe vai ser ser Gly Lys Tyr 325 330 335

Glu Gly Gly aso Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe Asn vai Glu Asn 340 345 350 Gly Aso Ala Ttir Pro Gln Leu Thr Lys Asn Ala Gly Val Leu Thr Cys 355 360 365

Ser Leu Ser Lys Arg Cys 370

<210> 18

<211> 1313

<212> DNA

<213> Cryptoraeria japonica

<400> 18

tagcatagcc gtatagaaag aaartctaca ctctgctacc aaaaaatgga ttccccttgc 60 ttagtageat tactggtttt ctcttttgta attggatctt gcttttctga taatcccata 120 gacagctgct ggagaggaga ctcaaactgg geaeaaaaca gaatgaagct cgcagattgt 180 gcagtgggct tcggaagcte caccatggga ggcaagggag gagatcttta tacggtcacg 240 aactcagatg acgaccctgt gaatcctgca ccaggaactc tgcgctatgg agcaacccga 300 gataggcccc tgtggataat tttcagtggg aatatgaata taaagetcaa aãtgCCtãtg 360 tacattgcrtg ggtataagac 1Ctttgatggc aggggagcac aagtttatat xggcaatggc 420 ggtccctgtg tgtttatcaa gagagttagc aatgttatca tacacggttt gtatctgtae 480 gg«gtagta ctagtgtttt ggggaatgtt ttgataaacg agagttttgg ggtggagect 540 gttcatcctc aggatggcga tgctcttact ctgcgcactg ctacaaatat ttggattgat 600 cataattctt tctccaattc ttctgatggt ctggtcgatg tcactcttac ttcgaçtgga 660 gttactattt caaaeaatet ttttttcaac catcataaag tgatgttgtt agggcatgat 720 gatgcatata gtgatgacaa atccatgaag gtgacagtgg cgttcaatca atttggacct 780 aaetgtggae aaagaatgcc cagggcacga tatggacttg tacatgttgc aaacaataat 840 tatgacccat ggactatatá tgcaattggt gggagttcaa atccaaccat -cctaagtgaa 900 gggaatagtt tcactgcacc aaatgagagc tacaagaagc aagtaaccat aegtattgga 960 tgcaaaacat catcatcttg ttcaaattgg Qtgtggcaat ctacacaaga tgttttttat 1020 aatggagett attttgtatc atcagggaaa tatgaagggg gtaatatata cacaaagaaa 1080 gaagctttca atgttgagaa tgggaatgca actcctcaat tgacaaaaaa tgetggggtt 1140 ttaacatgct ctctctctaa acgttgttga tgatgcatat attctagcat gttgtactat 1200 ctaaattaac atcaacaaga aatatatcaT gatgtatatt gttgtattga tgtcaaaata 1260 aaaatgtatc ttttactatt tatcaacatg ttatctttga tgtgcaagtt aat 1313

<210> 19 <Z1S> 374 <212> PRT <213> Cryptoraeria japonica

<400> 19

Met Asp ser Pro Cys Leu Val Ala Leu Leu Val Phe ser Phé vai lie 1 5 10 15

Gly Ser Cys Phe Ser Asp Asn Pro lie Asp ser Cys Trp Arg Gly Asp 20 25 30

ser Asn Trp Ala Gln Asn Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala vai Gly 35 40 45

Phe Gly Ser ser Thr Mer Gly Gly Lys Gly Gly Asp Leo Tyr Thr vai 50 55 60

thr Asn Ser Asp Asp Asp Pro vai Asn Pro Ala Pro Gly Thr Leu Arg 6S 70 75 80

Tyr Gly Ala Thr Arg Asp Arg Pro Leu Trp Ile Ile phe Ser Gly Asn 85 90 95

wet Asn lie Lvs Leu Lys Met Pro «et Tyr Ile Ala Gly Tyr Lys Thr

100 105 110

Gly 125

Phe Asp Gl| Arg Gly Ala Gln V|1 Tyr Ile Gly Asn Gl^ Gly Pro Cys

vai Phe Ile Lys Arg vai ser aso Val Ile Ile Mis Gly teu Tyr Leu 130 135 140

TVr Gly cys ser Tlir Ser Val Leu Gly asn vai Leu lie aso Glu ser 145 150 155 160

Phe Gly Val Glu Pro Val Hls Pro Gln Asp Gly Asp Ala Leu Thr Leu 165 170 175

Arg Thr Ala Thr Asn Ile Trp Ile Asp His Asn Ser Phe ser Asn ser 180 185 190

Ser Asp Gly Leu vai Asp vai Thr Leu Thr ser Thr Gly vai Thr Ile 195 200 205

Ser Asn Asn Leu Phe Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu GTy His 210 215 220

Asp Asp Ala Tyr Ser Asp Asp Lys Ser Met Lys Val Thr vai Ala Phe 225 230 235 240 Asn Glii Phe Gly Pro Asn Cys Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg TVr 245 250 255

Gly Leu vai His vai Ala Asn Asn Asn Tvr as ρ pro Trp Thr He Tyr 260 265 270

Ala Ile Gly Gly ser ser Asn Pro Thr ϊΐβ Leu ser Glu Gly Asn Ser 275 280 285

Phe Thr Ala Pro Asn Glu Ser Tyr Lys Lys Gln Val Thr lie Arg Ile 290 295 300

Gly Cys Lys Thr Ser Ser Ser Cys Ser Asn Trp vai Trp Gln Ser Thr 305 310 315 320

.Gln Asp vai Phe T^r Asn Gly Ala Tyr Phe vai Ser Ser Gly L|| Tyr

Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe Asn Val Glu Asn 340 345 350

Gly Asn Ala Thr Pro Gln Leu Thr Lys Asn Ala Gly vai Leu Thr Cys 3SS 360 36S

Ser Leu Ser Lys Arg Cys

370

<210> 20 <211> 537 <212> DNA <213> sloraia Tropicalis <400> 20 aaaacactca caatccacaa actcaaacaa caatgaagtt cgccatcgtt cttattgcct 60 gctttgccgc ttcggttttg gctcaagagc acaagccaaa gaaggatgat ttccgaaacg 120 aattegatca cttgttgatc gaacaggcaa accatgctat cgaaaaggga gaacatcaat 180 tgctttactt gcaacaccaa ctcgacgaat tgaatgaaaa caagagcaag gaattgcaag 240 agaaaateat tcgagaactt gatgttgttt gcgccatgat cgaaggagcc caaggagctt 300 tggaacgtga attgaagcga actgatctta acattttgga acgattcaac tacgaagagg 360 ctcaaactct cagcaagatc ttgcrttaagg atttgaagga aaccgaacaa aaagtgaagg 420 atattcaaac ccaataaaaa tttagaattg tacaatttta catttttgát atgattaaat 480 gtcaataaat gttcaataaa taaattcaat ttttaactat aaaaaaaaaa aaaaaaa 537

<210> 21 <212> 134 <212> RRT

<213> Blomia tropicalis <400> 21

Met Lys Phe Ala tle Val Leu Ile ATa Qrs Phe Ala Ala Ser Val Leu 1 5 10 15

Ala Gln Glu His Lys Pro Lys Lys Asp Asp Phe Arg Asn Glu Phe Âsp 20 25 30

His Leu Leu Ile Gla Gln Ala Asn His Ala Ile Glu Lys Gly Glu His 35 40 45

Gln Leu Leu Tvr Leu Gln His Gln Leu Asp Glu Leu Asn Glu Asn Lys 50 55 60

ser Lys Glu Leu Gln Glu Lys Xle Ile Arg Glu Leu Asp vai Val Cys 65 70 75 80

Ala Met Ile Glu Gly Ala Glri Gly Ala Leu Glu Arg Glu Leu Lys Arg 85 90 95

'Thr Asp Leu Asn Ile Leu Glu Arg Phe Asn Tyr Glu Glu Ala Gln Thr 100 105 110

Lew Ser Lys lie Leu Leu Lys Asp Leu Lys Glu Thr Glu Gln Lys Val 115 120 125

Lys Asp Ile Gln Thr Gln

<210» 22

<211> 15

<212» PRT

<213> PerptLdeo artificial

<220>

<2 2 3> Peptideo pep66

<400> 22

Gln Glu Lys Glu Lys Cys Met Lys Phe Cys Lys Lys Val Cys Lys

1 S 10 IS

<210> 23

<211> IS

<212> PRT

<213> Peptídeo artificial

<400> 23 Gly Pro Asp Trp Lys vai ser Lys Glu Cys Lys Asp Pro Asn Asn 1 5 10 15

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador FAD66

<400> 24

caagagaaag aaaaatgtat gaaattttgc aaaaaagttt gcaaa

45

<210> 25

<211> 45

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador FADlOO

<400> 25

ggtcctgatt ggaaagtaag caaagaatgc aaagatccca ataac

45

<210> 26

<211> 86

<212> ONA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador P66F

<400> 26

aagcrtgcca tgcaagagaa agaaaaatgt atgaaatttt gcaaaaaagt ttgcaaaggt accgccatgg tgagcaaggg cgagga

60 86

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> IniciadorFR

<400> 27

ttaggtacct tacttgtaca getegtecat

30

<210> 28

<211> 86

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador PlOOF

<400> 28 aagcttgeca xgggtcctga ttggaaagta agcaaagaat gcaaagatcc caataacggt 60 accgccatgg tgagcaaggg cgagga 86

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<22Q>

<223> Iniciado r HFRT 5'

<400> 29

gttggataca ggccagactt tgttg

25

<210> 30

<211> 22

<212> ONA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador HPRT 3

<400> 30

gagggtaggc tggcctatgg et

22

<210> 31

<2ll> 22

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador IFN-gama S'

<400> 31

cattgaaagc ctagaaagtc tg

22

<210> 32

<211> 23

<212> ONA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador IFN-gama 3"

<400> 32

ctcatggaat gcatcctttt tcg

23

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<2l3> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador IL-45"

<400> 33

gaaagagacc rtgacacagc tg

22 <2lO> 34 <211> 22 <212> DNA

Tníriador artificial

<220>

<223> Iniciador IL-4 3" <400> 34

gaactcttgc aggtaatcea gg

<210> 35

<2ll> 24

<212> DMA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> IniciadorIL-IOSa

<400> 35

ccagtttacc tggtagaagt gatg

<210> 36

<211> 30

<212> DNA <213>

<220>

<223> Iniciador IL-IO 3"

<400> 36

t;gtcxaggtc ctggagtcca gcagactcaa

<210> 37

<211» 19

<212> DNA

<213> Inieiador artificial

<220>

<223> IniciadorFel d Ll Pl 5*

<400> 37

aagcttggat gttagacgc

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Inieiador Fel d Ll Ρ2 3'

<400> 38

ggtaecttaa cacagaggac

<210> 39 <211> 21

<212> DMA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador Fel d L2 Pl S1

<400> 39

aagcttggat gaagggggct c 21

<210> 40

<211> 20

<2X2> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> IniciadorFel d L2P2 3'

<400?- 40 _rt

ggtaccttaa cacagaggac 20

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> Inieiador artificial

<220>

<223> IniciadDr Can f 1 Pl 5'

<400> 41

aagcttatga agaccctgct cctcac Zo

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> Inieiador artificial

<220>

<223> Iniciador Can f 1 P2 3'

<400> 42

ggtsccctac tgtcctcctg gagagc 26

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> Ihiciadorartificial

<220>

<223> Iniciador Can f2 Pl 51

<400> 43

aagcttatgc agctertact gct 23

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> Inieiador artificial <220>

<223> can f2 Ρ2 3'

<400> 44

ggtaccctag tctctggaac cc 22

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> Ihitiador artificial

<220>

<223> Iniciador Der ρ 1 Pl 5'

<400> 45 aagcttaaca tgaaaattgt tttgg 25

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador Derp 1P2 3'

<400> 46

ggtaccgttt agagaatgac aacat 25

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador Ara h II Pl 5'

<400> 47

aagcttctca tgcagaagat 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador Ara h Π P2 3'

<400> 48

ggtaccttag tatctgtctc 20

<210» 49

<211> 20

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Inieiador Ara h5 Pl 5' <4C0> 49 aagcttatgt cgtggcaaac <210> 50 <211> 20 <2L2v DNA <213> Iniciador artificial <220> <223> Iniciador Ara h 5 P2 3" <40Õ> 50 ggtacctaaa gaeccgtatc <210> 51 <2ll> 25 c212> DNA <213> Iniciador artificial <220> <223> biiciadorCiyj T.1P15" <400> 51 aagcttatgg attccccttg ctti <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Inieiador artificial <220> <223> Iniciador Ciyj 1.1P2 3' <400» 52 ggtaccatca acaacgttta gag

<210> 53

<211> 25

<212> DMA

<213> Iniciador artifirial

<220>

<223> Iniciadorj 1.2 Pl 51 5'

<400> 53

aagctrtatgg attccccttg cttag

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<2l3> Iniciaidor artificial

<220>

<223> Iniciador Ciyj 1, 2 Ρ2 3"

<400> 54

ggtacctcaa caacgtttag agagag

22

20

25

23

25 <210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador Blo t 5 Pl 5'

<400> 55

aagcttacaa tgaagttcgc

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador Blo t 5 Ρ2 3'

<400> 56

ggtaccaatt tttattgggt

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> Iniiciador artificial

<220>

<223> Iniciadior Gata 3 5'

<400> S7

ggaggca-ccc agacccgaaa c

<210> 58

<211> 19

<212> DNA

<213> biiciador artificial

<220>

<223> IniciadorGATA 3 3'

<400> 58

accatggcgg tgaccatgc

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<21Β> Iniciador artificial

<220>

<223» Iniciador T-bet 5'

<400> 59

tgaagcccac actcctaccc

<210> 60 <211> 20

<212> ONA

<213> Inifiador artificial

<223> Iniciador T-bet 3*

<400> 60

gcggcatttt ctcagttggg 20

<210> 61

<213> 489

<212> DNA

<213> Iniciador artificial

<220>

<223> Iniciador K-FSAI

<400> 61

gccgccacca tggaagatat ttggaaagtt aataaaaaat gtacatcagg tggaaaaaat 60 caagatagaa aactcgatca aataattcaa aaaggccaac aagttaaaat ccaaaatatt 120 tgcaaattaa tacgggataa accacataca aatcaagaga aagaaaaatg tatgaaattt 180 ágcaaaaaag trttgcaaagg ttatagagga gtttgtgatg gcaatatttg ctactgcagc 240 aggccaagta atttaggtcc tgattggaaa gtaagcaaag aatgeaaaga tcccaataac 300 aaagattctc ggcctacgga aatagttcca tatcggcagc aattagcaat tccaaatatt 360 tgcaaactaa aaaattcagg gaccaatgaa gattccaaat gcaaaaaaca ttgcaaagaa 420 aaatgtcgtg gtggaaatga tgctggatgt gatggaaact tttgttattg tcggccaaaa 480 aataaataa 489

Claims

1. Composição para prevenir e inibir uma resposta alérgica contra uma proteína alergênica, caracterizada pelo fato de compreender: a) um vetor de expressão de célula eucariótica contendo seqüências de nucleotídeos codificando uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica; e b) uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica; em que referida proteína alergênica é selecionada dentre o grupo consistindo de: uma proteína alergênica de pulga, uma proteína alergênica de felino, uma proteína alergênica de canino, uma proteína alergênica de ácaro de poeira, uma proteína alergênica de amendoim, uma proteína alergênica de cedro japonês, e uma proteína alergênica de blomia tropicalis.

2. Kit para prevenir e inibir uma resposta alérgica contra uma proteína alergênica, caracterizado pelo fato de compreender: a) um primeiro recipiente compreendendo um vetor de expressão de célula eucariótica contendo seqüências de nucleotídeos codificando uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica; e b) um segundo recipiente de uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica; em que referida proteína alergênica é selecionada dentre o grupo consistindo de uma proteína alergênica de pulga, uma proteína alergênica de felino, uma proteína alergênica de canino, uma proteína alergênica de ácaro de poeira, uma proteína alergênica de amendoim, uma proteína alergênica de cedro japonês, e uma proteína alergênica de blomia tropicalis.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou o kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que referida proteína alergênica é uma proteína alergênica de pulga selecionada dentre o grupo consistindo de proteína FSAl, e fragmentos alergênicos da mesma.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína alergênica é uma proteína alergênica de pulga e o vetor de expressão de célula eucariótica contendo seqüências de nucleotídeos codificando a proteína alergênica de pulga ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica é pcDF66 ou pcDFlOO.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que referida proteína alergênica é uma proteína alergênica de felino selecionada dentre o grupo consistindo de: proteína Fel dl, e fragmentos alergênicos da mesma.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína alergênica é uma proteína alergênica de canino selecionada dentre o grupo consistindo de: proteína Can fl, proteína Can f2, e fragmentos alergênicos da mesma.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida proteína alergênica é uma proteína alergênica de ácaro da poeira selecionada dentre o grupo consistindo de: proteína Der pl, proteína Der Fl e fragmentos alergênicos da mesma.

8. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que referida proteína alergênica é uma proteína alergênica de amendoim selecionada dentre o grupo consistindo de: Ara HII, Ara H5, e fragmentos alergênicos da mesma.

9. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida proteína alergênica é uma proteína alergênica de cedro japonês selecionada dentre o grupo consistindo de: proteína Cry j 1.1, proteína Cry j 1.2, e fragmentos alergênicos da mesma.

10. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida proteína alergênica é uma realizada de blomia tropicalis selecionada dentre o grupo consistindo de: proteína Blo t5 e fragmentos alergênicos da mesma.

11. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o vetor de expressão de célula eucariótica compreende seqüências de nucleotídeos codificando uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico da referida proteína alergênica ligado operativamente a promotores selecionados dentre o grupo consistindo de promotores RSV, CMV e SV40.

12. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a relação de quantidade de vetor de expressão de célula eucariótica em peso para a quantidade de proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico da referida proteína alergênica em peso está entre 1:5 e 5:1.

13. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de a relação de quantidade de vetor de expressão de célula eucariótica em peso para a quantidade de proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica em peso é 1:1.

14. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a relação molar de vetor de expressão de célula eucariótica para proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica está entre 1:100.000 a 20:100.000.

15. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a relação molar de vetor de expressão de célula para proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico da referida proteína alergênica é 15:100.000.

16. Método para prevenir e inibir uma reação alérgica a uma proteína alergênica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de administrar ao indivíduo a) um vetor de expressão de célula eucariótica contendo seqüências de nucleotídeo codificando uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico da referida proteína alergênica; e b) uma proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica; em que referida proteína alergênica é selecionada dentre o grupo consistindo de: uma proteína alergênica de pulga, uma proteína alergênica de felino, uma proteína alergênica de canino, uma proteína alergênica de ácaro de poeira, uma proteína alergênica de amendoim, uma proteína alergênica de cedro japonês, e uma proteína alergênica de blomia tropicalis.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é uma espécie selecionada dentre o grupo consistindo de: espécies humana, bovina, ovina, porcina, eqüina, canina, e felina.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um tendo uma reação alérgica a uma proteína alergênica antes da administração do vetor de expressão de célula eucariótica e proteína alergênica ou um polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de referida proteína alergênica.