CN103200959A - 预防和治疗自身免疫性疾病的联合抗原和dna疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用含有抗原和编码所述抗原的DNA的联合疫苗治疗和预防变态反应、哮喘、自身免疫性疾病和移植排斥的症状。

Description

预防和治疗自身免疫性疾病的联合抗原和DNA疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年9月27日提交的美国临时申请号61/386,839和2011年3月23日提交的美国临时申请号61/466,741的权益，其各自的内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含已经以ASCII格式提交并通过引用据此整体并入的序列表。2011年9月23日创建的所述ASCII拷贝命名为VGX0119W.txt。

技术领域

本发明涉及使用含有抗原和编码所述抗原的DNA的疫苗治疗和预防变态反应、哮喘、自身免疫性疾病和移植排斥的症状。

发明背景

调节性T(Treg)细胞是耐受性的重要调节因子，其在自身免疫性疾病治疗中起重要作用。特别地，诱导靶向变态反应、哮喘和自身免疫性疾病抗原的抗原特异性Treg(iTreg)细胞为相关病状提供了有效免疫调节治疗策略。提供Treg细胞的已知方法是过继转移天然胸腺源CD4⁺CD25⁺Treg(nTreg)细胞。然而，这种方法在nTreg细胞中产生低水平的胰岛特异性Treg细胞，并且因此抑制无效。

通过在外周部分的致耐受性抗原呈递由常规CD4⁺T细胞产生可诱导调节性T(iTreg)细胞。与天然调节性T(nTreg)细胞相反，可使用蛋白质抗原和编码所述相同抗原的DNA疫苗联合免疫来诱导致耐受性抗原呈递。同时暴露于蛋白质和DNA基抗原的组合产生CD40^低IL-10^高树突细胞，所述树突细胞以抗原特异性方式介导CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTerg细胞的诱导。这些iTreg将对抑制Th₁和Th₂诱导的免疫途径，例如变态反应、自身免疫性疾病、哮喘和移植排斥有用。

然而，不知道如何设计用于抗原呈递的抗原表位或疫苗以便最大化iTreg的诱导。因此，在本领域中需要对抗自身免疫性疾病的抗原基疫苗和抗此类疾病的有效疫苗的抗原选择和设计的更好方法，包括其有效施用途径。

发明概述

本文提供了包含抗原肽和编码所述肽的DNA的疫苗。所述抗原肽和DNA刺激iTreg细胞。所述抗原可与病状，例如变态反应、哮喘或自身免疫性疾病相关。所述抗原可为屋尘螨(dermatophagoidespteronyssinus)1肽、其片段或其变体并且可与变态反应或哮喘相关。所述抗原可为胰岛素肽、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白和少突胶质细胞特异性蛋白、透明带蛋白肽、屋尘螨1肽、α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽、A群链球菌(streptococcal)M5蛋白肽、(Q/R)(K/R)RAA、II型胶原蛋白肽、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、乙酰胆碱受体肽、人S抗原、其片段或其变体，并且可与自身免疫性疾病相关。载体可包含编码所述肽的DNA。所述载体可为pVAX、pcDNA3.0或provax载体。所述载体和抗原肽质量比可为5:1和1:5；或1:1和2:1。

本文还提供了一种疫苗接种试剂盒。所述疫苗接种试剂盒可含有疫苗施用设备和本文所述的疫苗。所述疫苗接种设备可为疫苗枪、针或电穿孔设备。

本文还提供了一种治疗自身免疫性疾病的方法。所述方法可包括向有需要的患者施用本文所述的疫苗。所述自身免疫性疾病可为I型糖尿病、多发性硬化、自身免疫性卵巢疾病、尘螨变态反应、心肌炎、类风湿性关节炎、甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性葡萄膜炎或哮喘。如果要将所述疫苗用于治疗I型糖尿病，所述疫苗的抗原可为胰岛素肽、其片段或其变体。如果要将所述疫苗用于治疗多发性硬化，所述疫苗的抗原可为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、其片段或其变体。如果要将所述疫苗用于治疗自身免疫性卵巢疾病，所述疫苗的抗原可为透明带蛋白肽、其片段或其变体。如果要将所述疫苗用于治疗心肌炎，所述疫苗的抗原可为屋尘螨1肽、其片段或其变体。如果要将所述疫苗用于心肌炎，所述疫苗的抗原可为α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽、A群链球菌M5蛋白肽、其片段或其变体。如果要将所述疫苗用于治疗类风湿性关节炎，所述疫苗的抗原可为肽(Q/R)(K/R)RAA、II型胶原蛋白、其片段或其变体。如果要将所述疫苗用于治疗甲状腺炎，所述疫苗的抗原可为甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、其片段或其变体。如果要将所述疫苗用于治疗重症肌无力，所述疫苗的抗原可为乙酰胆碱受体肽、其片段或其变体。如果要将所述疫苗用于治疗自身免疫性葡萄膜炎，所述疫苗的抗原可为人S抗原、其片段或其变体。

附图简述

图1显示，MHC-II阻滞降低了CD25^-iTreg诱导。在抗MHC-II阻滞mAb存在或缺乏时，与从经联合免疫的Balb/c小鼠纯化的致耐受性树突细胞(DC)一起培养从Balb/c DO11.10小鼠或OVA(卵清蛋白)_323-339-致敏Balb/c小鼠纯化的CD4⁺T细胞。在第7天计数CD25^-iTreg细胞(CD4⁺CD25^-Foxp3⁺)占CD4⁺CD25^-T细胞的百分比，*，p<0.05。示出了有相似结果的3次独立实验之一。每个点表示一只小鼠。

图2显示，OVA_323-339突变降低了对T细胞的抗原性。图2A.OVA_323-339突变总结、其预测MHC-II结合亲和力和来自四聚物竞争测定的实验结果。如以下计算四聚物结合百分比：在竞争肽表位存在时四聚物阳性T细胞的数量/在竞争肽表位缺乏时四聚物阳性T细胞的数量×100%。图2B.与呈递指定表位的致耐受性树突细胞(“DC”)一起共同培养4天的CFSE标记的DO11.10CD4⁺T细胞的增殖。线性图总结了来自3次独立实验的结果。**，p<0.01。

图3显示，经联合免疫诱导CD25^-iTreg细胞取决于表位亲和力。图A.通过流式细胞术计数联合免疫后在Balb/c小鼠体内诱导的CD25^-iTreg(CD4⁺CD25^-Foxp3⁺(叉头框P3))和nTreg(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)并分别计算在CD4⁺CD25^-和CD4⁺CD25⁺T细胞中Foxp3⁺细胞的百分比。首次接受试验的非免疫小鼠。**，p<0.01。每个点表示一只小鼠。示出了有相似结果的3次独立实验之一。图3B.经联合免疫诱导高度抑制性CD25^-iTreg细胞取决于表位抗原性。在OVA_323-339存在下，与联合免疫诱导的CD25^-iTreg一起共同培养CFSE标记的DO11.10CD4⁺T细胞。通过流式细胞术，根据分裂KJ1-26⁺细胞与总KJ1-26⁺细胞之比测定增殖。**，p<0.01。每个点表示一只小鼠。示出了有相似结果的3次独立实验之一。

图4显示，过继转移CD25^-iTreg细胞抑制了受体小鼠的T细胞应答。将来自经OVA_323-339、MT1或MT2联合免疫或首次接受试验的Balb/c的CD4⁺CD25^-T细胞过继转移至首次接受试验的Balb/c。通过用于IFA中的OVA_323-339使受体致敏评估供体CD25^-iTreg的活性。图4A.致敏后从受体中分离出CD4⁺T细胞。用羟基荧光素琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记细胞并且在培养物中用OVA_323-339再刺激。通过CFSE稀释鉴定分裂细胞并通过流式细胞术计数。将结果表示为占总CFSE⁺T细胞的百分比。示出了有相似结果的3次独立实验之一。图4B.致敏后从受体中分离出CD4⁺T细胞并且在细胞内对于IFN-γ免疫染色。通过流式细胞术计数IFN-γ⁺CD4⁺T细胞并计算占总CD4⁺T细胞的百分比。示出了有相似结果的3次独立实验之一。图4C和D.再刺激T细胞上清液中的IFN-γ和IL-10分泌。在阳性对照中用抗CD3mAb(KT3)或KT3+IL-2+IL-4诱导指定细胞因子。示出了有相似结果的3次独立实验之一。*，p<0.05，**，p<0.01。

图5显示，P100对T细胞的刺激比P66更强。在培养物中用P100或P66(5μg/ml)再刺激来自经蚤抗原免疫的C57BL/6小鼠的脾CD4⁺T细胞。通过基于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-联苯四唑溴化物(MTT，黄色四唑)的测定法测定T细胞增殖。分别使用伴刀豆球蛋白A(1μg/ml)和BSA(1μg/ml)作为阳性和阴性对照。*，p<0.05。示出了有相似结果的3次独立实验之一。

图6显示，经联合免疫诱导的CD25^-iTreg对皮肤反应的减弱。图6A.经蚤抗原刺激的T细胞增殖。图6B.蚤特异性皮下试验诱导的体内T细胞应答。图6C.皮肤切片的H&E染色。黑色箭头指示浸润T细胞。图6D.肥大细胞数量和通过甲苯胺蓝染色的脱粒(黑色箭头)。图6E.联合免疫7天后，计数CD25^-iTreg细胞占CD4⁺CD25^-T细胞的百分比。示出了有相似结果的3次独立实验之一。*，p<0.05，**，p<0.01。

图7显示，过继转移CD25^-iTreg抑制了体内皮肤反应。将来自经Co100或Co66免疫的小鼠的CD25^-iTreg过继转移至FSA1致敏小鼠体内。然后用蚤抗原激发受体(皮肤试验)。分别使用组胺和PBS作为皮肤试验的阳性和阴性对照。*，p<0.05。示出了有相似结果的3次独立实验之一。

图8.联合免疫抑制了HDM介导的哮喘的发展。(A)在用尘螨提取物最后一次激发24h后通过H&E染色对肺组织进行组织学检查。箭头示出了不同细胞浸润(白色箭头)。(B)在最后一次激发24h后通过ELISA测试对Der-p1有特异性的IgE的水平。(C)用Flex set检查最后一次激发24h后小鼠血清中的不同细胞因子水平。与模型组相比，*，p<0.05**，p<0.01，n=6只小鼠/组。

图9.联合免疫诱导CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg。(A)通过FACS分析第二次联合免疫后第7天CD4⁺CD25^-T细胞中的Foxp3表达。(B-C)通过在APC和刺激物的存在下，与应答T细胞(从经Der-p1刺激预处理的WT小鼠纯化的CD4⁺T细胞)一起按1:5或1:10比例共同培养72h检查对iTreg(从经联合免疫预处理的Foxp3^gfp小鼠中纯化)的抑制。通过MTT方法分析增殖水平。结果代表至少3次独立实验。如所示*，p<0.05，**，p<0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n=6只小鼠/组。

图10.iTreg的抑制能力由IL-10，而非细胞与细胞的接触介导。(A)在第二次联合免疫后第7天通过荧光活化细胞分选法(FACS)分析iTreg和nTreg的抑制性受体的表达。(B)在transwell板中，在上部腔室内用Derp1抗原(10μg/ml)刺激2×10⁵个新分离的CD4+CD25^-GFP⁺(绿色荧光蛋白)T细胞以分泌细胞因子。用Derp1抗原(10μg/ml)刺激1×10⁶个应答CD4+T细胞以在下部腔室内扩展。如所示在下部腔室内添加10μg/mL对照IgG、抗IL-10或抗TGF-β。通过MTT方法分析增殖水平。结果代表至少3次独立实验。如所示*，p<0.05，**，p<0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n=6只小鼠/组。

图11.TGF-β1对于诱导iTreg中的Foxp3表达是必需的。(A)通过RT-PCR检查在来自首次联合免疫后第3天的小鼠脾脏的CD11C⁺树突细胞中的细胞因子生成。甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达作为样品的内部对照。(B)体内阻滞TGF-β1时CD4⁺CD25^-T细胞中的叉头框P3(Foxp3)表达。连续3天在每次联合免疫后在病灶内为小鼠注射单独的抗TGF-βAb(400μg/注射)或单独的同种型对照抗体小鼠免疫球蛋白G1(IgG1)3次。在第二次联合免疫7天后通过FACS分析GFP表达。结果代表至少3次独立实验。如所示*，p<0.05，**，p<0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n=6只小鼠/组。

图12.IL-10对于iTreg的抑制能力很重要。(A)当体内阻滞IL-10时也可诱导CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg。通过FACS分析CD4⁺CD25^-T细胞中的Foxp3表达。(B)在IL-10不足时诱导的iTreg抑制能力受损。与应答T细胞一起共同培养从经抗IL-10mAb预处理的小鼠分离的iTreg。通过MTT方法分析增殖水平。(C)通过FACS评估在用抗TGF-b或抗IL-10mAb处理后iTreg分泌的IL-10的水平。结果代表至少3次独立实验。如所示*，p<0.05，**，p<0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n=6只小鼠/组。

图13.TGF-β1在体外诱导CD4⁺CD25^-初始T细胞中的Foxp3表达。(A)Dcreg中的TGF-β和IL-10模型诱导iTreg。(B)与用DNA和Der-p1蛋白共同处理的树突细胞(DC)reg一起共同培养初始T细胞7天，通过FACS评估Foxp3-GFP。(C)在不同剂量的TGF-β1存在下用板结合的抗CD3和可溶性抗CD28刺激从Foxp3^gfp小鼠纯化的初始CD4⁺CD25^-T细胞72h并通过FACS评估GFP的表达。(D)在TGF-β1或IL-10的存在下如(C)刺激并培养CD4⁺CD25^-T细胞72h并且通过FACS评估GFP的表达。结果代表至少3次独立实验。如所示*，p<0.05，**，p<0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n=6只小鼠/组。

图14.自分泌IL-10对iTreg抑制能力有影响。(A)与分别用DNA和尘螨P1蛋白(Der-p1)Der-p1蛋白或单抗原预处理的DC一起共同培养初始T细胞7天。然后通过FACS评估Foxp3-GFP。(B)如(A)从培养基中分离iTreg并与效应T细胞一起共同培养以评估其抑制能力。(C)在用DNA和蛋白质疫苗预处理后的不同天数通过FACS检测CD11⁺DC表面的IL-10R表达。(D)与用DNA、Der-p1蛋白和IL-10R siRNA预处理的DC一起共同培养初始T细胞。通过FACS评估iTreg诱导。(E)如(D)从培养基中分离iTreg细胞并且与效应T细胞一起共同培养以评估其抑制能力。通过MTT方法分析增殖水平。结果代表至少3次独立实验。如所示*，p<0.05，**，p<0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n=6只小鼠/组。

图15.研究了TGF-b和IL-10功能模型并且其涉及经联合免疫对iTreg的诱导。图15A通过蛋白质印迹显示了纯化CD4⁺CD25^-GFP⁺iTreg和CD4+CD25+GFP+nTreg中活化T细胞1和2(NFAT1和NFAT2)的核或细胞质核因子。组蛋白或GAPDH分别用作核或细胞质蛋白的装填对照。(B)TGF-β和IL-10对联合免疫的不同阶段有影响。

图16.对真核和原核表达构建体中pVAX-Der-p1表达的分析。(A)通过用Der-p1特异性引物进行的RT-PCR分析从经pVAX-Der-p1转染的幼仓鼠肾细胞(BHK21细胞)分离的RNA。泳道1，DNA分子量标准；泳道2，来自经转染BHK21细胞的RNA；泳道3，来自经转染pVAX载体BHK21细胞的RNA；泳道4，来自非转染BHK21细胞的RNA。通过SDS PAGE(B)和蛋白质印迹(C)进行对大肠杆菌(E.coli)系统中Der-p1蛋白质表达的测定。SDS PAGE结果1：未诱导pET28a-Der-p1；2：用0.1mM IPTG诱导的pET28a-Der-p1；3：用0.5mMIPTG诱导的pET28a-Der-p1；4：用1.5mM IPTG诱导的pET28a-Der-p1；5：蛋白质分子量标准。箭头指向目标条带。(C)蛋白质印迹结果1：未诱导pET28a-Der-p1；2：诱导的pET28a-Der-p1。

图17.对BAL中不同细胞的分析。最后一次激发24h后，收集BAL并通过CELL-DYN估计浸润细胞(总数)和嗜酸性细胞的数量。结果代表3次实验。与模型组相比，*，p<0.05**，p<0.01。(n=6只猫/组)。

图18.联合免疫上调源自Foxp3^gfp小鼠的CD4⁺CD25^-T细胞中的GFP表达。通过FACS分析在第二次联合免疫后第7天CD4+CD25-T细胞中的GFP表达。结果代表至少3次独立实验。

图19.用mAb处理后小鼠血清中TGF-β1或IL-10的水平。(A)用ELISA试剂盒检查在第二次联合免疫后第3天小鼠血清中的TGF-β1水平。(B)用Flex Set检查在第二次联合免疫后第3天小鼠血清中的IL-10水平。结果代表至少3次独立实验。与模型组相比，*p<0.05**，p<0.01，n=6只小鼠/组。

图20.TGF-β受体抑制剂抑制Foxp3诱导。与用DNA、Der-p1蛋白和TGF-β受体预处理的DC一起共同培养初始T细胞。通过FACS评估iTreg诱导。结果代表至少3次独立实验。

图21.IL-10对由DCreg诱导Treg的阶段无影响。用抗IL-10，通过DCreg诱导iTreg，并且然后在7天之后分离。通过效应T细胞的增殖水平评估这些iTreg的抑制功能。通过MTT方法分析增殖水平。结果代表至少3次独立实验。

图22.研究了IL-10R siRNA对DC的影响。在用IL-10R siRNA或对照siRNA处理后第2天测定DC表面的IL-10R水平。结果代表至少3次独立实验。

图23.CD40低是联合免疫诱导的DCreg的标志。A)为小鼠肌肉注射指定免疫原。第二天通过对于CD11c和CD40-PE进行双重染色，接着进行流式细胞术检查脾脏DC。为CD11c+细胞分类。将首次接受试验的小鼠用作阴性对照。示出了有相似结果的独立实验。B)为纯化CD11c+DC和JAWS II细胞供给指定免疫原24h并通过流式细胞术检查CD40的表达。未经处理的DC或JAWS II细胞用作阴性对照。C)为JAWS II细胞供给pOVA323+OVA323或pVAX+OVA32324h，然后与从已使其对OVA敏感的小鼠制备的CFSE-CD4+T细胞一起共同培养5天。通过FACS分析Foxp3和IL-10的表达。为CD4+细胞分类。将Foxp3+或IL-10+细胞的数量计算为分类细胞的百分比。示出了有相似结果的独立实验。D)为JAWS II细胞供给所示荧光标记免疫原24h，并且然后对于CD40进行免疫染色。通过共聚焦显微镜术分析免疫原摄取和CD40表达的相关性(上图)。使用Nikon EZ-C13.00FreeViewer软件分析平均PE荧光(下图)。细胞数量为10个/组。

图24.DC通过网格蛋白和小窝介导的胞吞作用同时摄取DNA和蛋白质免疫原。A)在37℃下用PBS、MDC(50μM)或菲律平(filipin)(10μg/ml)预处理JAWS II细胞30分钟，然后供给Cy5-pOVA323+FITC-OVA323或Cy5-pVAX+FITC-OVA32324h。用抗CD40-PE对细胞染色并通过流式细胞术分析。示出了Cy5/FITC双阳性细胞(分类)的CD40染色。B)示出了实验结果总结。

图25.联合免疫活化Cav-1介导的阴性途径。在分析前2天从首次接受试验的小鼠或用指定免疫原免疫的小鼠的脾脏DC中提取总蛋白质或RNA。对指定蛋白质和基因进行蛋白质印迹(A、C和D)和RT-PCR分析。

图26.使Cav-1和Tollip沉默防止了DCreg的诱导。A)为WT和Cav-1和/或Tollip敲除DC供给pOVA323+OVA323或pVAX+OVA32324h并且分析CD40和IL-10的表达。使用未供给任何免疫原的WT DC作为对照(未经处理)。B)与来自对OVA敏感的小鼠的CFSE-CD4+T细胞一起共同培养供给了pOVA323+OVA323或pVAX+OVA32324h的DC。测定T细胞增殖和Foxp3+和IL-10+T细胞的数量。

图27.缺乏Cav-1和/或Tollip的DC在体内并无致耐受性。将缺乏Cav-1和/或Tollip的JAWS II细胞过继转移至同系小鼠体内(第0天)。然后在第0和7天用IFA中的OVA使小鼠免疫。在第14天，试验DTH反应。在第15天，测定T细胞增殖、T细胞中Foxp3的表达和上清液中的IL10水平。

图28.联合免疫诱导的DCreg改善炎症性支气管炎。A)实验设计：在第0和7天经腹膜内为Balb/c小鼠注射0.1ml的1mg/ml OVA/明矾复合物并且随后在第14、16和18天在气管内用100μg OVA激发以建立“模型”。在第14、16和18天使对照小鼠经气管内接受PBS并且指定为“虚假”对照。在第21天，将5×105个来自同系供体小鼠的CD11c+细胞经静脉转移至模型小鼠体内，每天一次，连续3天。(n=3只/组)。转移之前，用或不用菲律平预处理从首次接受试验的小鼠的脾脏纯化的供体CD11c+细胞并且随后用pOVA+OVA或pVAX+OVA共同处理24h。在最后转移后第14天，取血清样品以分析IgE或细胞因子生成的水平。制作肺组织切片以评估疾病严重程度。B)在过继转移指定DC后通过ELISA分析抗原特异性IgE的水平。C)在转移指定DC之前通过CBA检查IL-4和IL-5的生成。D)通过H&E染色检查肺部切片并且在光学显微镜下以×100和×200放大倍数记录。

图29.联合免疫诱导的DCreg改善自身免疫性卵巢疾病。A)实验设计：在爪垫上为C57BL/6小鼠注射乳化于CFA中的mZP3蛋白以诱导AOD。14天后，将5×105个JAWS II细胞经静脉转移至这些经诱导的AOD小鼠体内，每天一次，连续3天。(n=6只/组)。转移之前，为JAWS II细胞供给pcD-mZP3+mZP3或pcD-OVA+mZP324h，接着在37℃下进行丝裂霉素C(Mitomycin C)处理(50μg/ml)20分钟。在最后转移后第14天，取血清以分析细胞因子生成并且固定卵巢并切片用于评估疾病严重程度。B)通过CBA分析IFN-γ、TNF-α和IL-5的生成。示出了有相似结果的实验。*，C)通过对来自每只动物的组织切片的病理分析评估疾病的程度。图中的每个点表示一只动物。D)在最后转移后第14天，对于CD4、Foxp3和IL-10进行三重染色每个受体的脾细胞并通过流式细胞术分析。为CD4+细胞分类。

图30.阿米洛利(amiloride)对JAWS II细胞中CD40表达的影响。在37℃下用阿米洛利(5mM)预处理JAWS II细胞10分钟，并且然后用Cy5-pOVA323+FITC-OVA323或Cy5-pVAX+FITC-OVA323共同处理24h。用抗CD40-PE对细胞染色并通过流式细胞术分析。

图31.对JAWS II细胞中Cav-1和Tollip的调节。为JAWS II细胞供给指定免疫原24h。然后提取总蛋白或RNA并通过蛋白质印迹(A)或RT-PCR(B)分析。

图32.通过RNAi对Cav-1和Tollip的沉默。A)用Cav-1或Tollip特异性siRNA转染JAWS II细胞。在24h时，通过实时RT-PCR检测Cav-1和Tollip的mRNA水平。B)为WT和Cav-1敲除DC供给pOVA+OVA或pVAX+OVA24h。通过蛋白质印迹检测NF-κB的易位。

图33.最后DC过继转移后第14天对卵巢组织的组织学检查。在光学显微镜下以×40和×100放大倍数观察样品。实心箭头指无炎症性细胞浸润的卵泡；空心箭头指有炎症性细胞浸润的卵泡。

图34显示了编码流感核蛋白(“NP”)和M2抗原的质粒表达载体和相应线性表达盒的图谱。线性表达盒pcrNP或pcrM2含有CMV启动子、用于剪接的内含子、具有终止密码子和多腺苷酸化信号的NP或M2的全长基因。

发明详述

本发明涉及这样的发现，通过施用抗原和编码所述抗原的DNA疫苗的组合有效诱导抗特异性抗原的iTreg细胞。这种诱导比单独的抗原或DNA疫苗好很多。本发明还涉及这样的发现，如果抗原对致耐受性树突细胞(DC)上表达的II类MHC有高亲和力，可进一步提高iTreg细胞诱导的效率。提供的疫苗含有对II类MHC有高亲和力的肽抗原和表达所述肽的DNA的组合，并且这些疫苗可诱导能够抑制自身免疫性疾病和变态反应的iTreg群。因为iTreg细胞有抗原特异性并且因此更有效地抑制抗原特异性T细胞功能，所以iTreg诱导处理伴有比其它处理方法更少的副作用。

本文提供了包含抗原肽和编码所述肽的DNA的疫苗。所述肽的IC₅₀为100nM，并且对II类MHC的IC₅₀可为50nM或更低。II类MHC可在致耐受性树突细胞上表达。所述DNA可包含能够表达所述肽的表达载体。所述载体可选自本领域中的可用载体，并且可包括pVAX、pcDNA3.0或provax。所述肽可为选自以下的蛋白质中所含的氨基酸序列：胰岛素、FSA1、Der-p1、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、葡萄糖6-磷酸酶、透明带1、2或3、人肌球蛋白、柯萨奇病毒B4结构蛋白VP1、VP2、VP3或VP4、A群链球菌M5蛋白、II型胶原蛋白、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、Pendrin、乙酰胆碱受体α亚单位、人S抗原和人IRBP。胰岛素肽可包含氨基酸序列MRLLPLLALLA(SEQ ID NO:5)或SHLVEALYLVCGERG(SEQ IDNO:191)。MOG肽可包含选自HPIRALVGDEVELP(SEQ ID NO:36)、VGWYRPPFSRVVHLYRNGKD(SEQ   ID   NO:37)、LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLL(SEQ   ID   NO:38)、MOG1-22(SEQ ID NO:17)、MOG34-56(SEQ ID NO:18)和MOG64-96(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列。甲状腺球蛋白肽可包含选自NIFEXQVDAQPL(SEQ   ID   NO:155)、YSLEHSTDDXASFSRALENATR(SEQ   ID   NO:156)、RALENATRDXFIICPIIDMA(SEQ   ID   NO:157)、LLSLQEPGSKTXSK(SEQ   ID   NO:158)和EHSTDDXASFSRALEN(SEQ ID NO:159)的氨基酸序列，其中X为3,5,3’,5’-四碘甲腺原氨酸(甲状腺素)。TPO肽可包含选自LKKRGILSPAQLLS(SEQ ID NO:160)、SGVIARAAEIMETSIQ(SEQID   NO:161)、PPVREVTRHVIQVS(SEQ   ID   NO:162)、PRQQMNGLTSFLDAS(SEQ   ID   NO:163)、LTALHTLWLREHNRL(SEQ   ID   NO:164)、HNRLAAALKALNAHW(SEQ   ID   NO:165)、ARKVVGALHQIITL(SEQ   ID   NO:166)、LPGLWLHQAFFSPWTL(SEQ   ID   NO:167)、MNEELTERLFVLSNSST(SEQ ID NO:168)、LDLASINLQRG(SEQ IDNO:169)、RSVADKILDLYKHPDN(SEQ   ID   NO:170)和IDVWLGGLAENFLP(SEQ ID NO:171)的氨基酸序列。Pendrin肽可包含选自QQQHERRKQERK(SEQ   ID   NO:172)和PTKEIEIQVDWNSE(SEQ ID NO:173)的氨基酸序列。葡萄糖6-磷酸酶肽可包含选自IGRP_13–25(QHLQKDYRAYYTF)(SEQ ID NO:8)、IGRP_23–35(YTFLNFMSNVGDP)(SEQ   ID   NO:9)、IGRP_226–238(RVLNIDLLWSVPI)(SEQ   ID   NO:10)、IGRP_247–259(DWIHIDTTPFAGL)(SEQ   ID   NO:11)、G6Pase-α_228–240(KGLGVDLLWTLEK)(SEQ   ID   NO:12)、G6Pase-α_249–261(EWVHIDTTPFASL)(SEQ   ID   NO:13)、UGRP_218–230(FTLGLDLSWSISL)(SEQ   ID   NO:14)和UGRP_239–251(EWIHVDSRPFASL)(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列。PLP肽可包含选自PLP30-49(SEQ ID NO:28)、PLP40-60(SEQ ID NO:29)、PLP180-199(SEQ ID NO:30)、PLP184-199(SEQ ID NO:31)和PLP190-209(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。MBP肽可包含选自MBP66-88(SEQ ID NO:21)、MBP85-99(SEQ ID NO:22)、MBP86-105(SEQ ID NO:23)、MBP143-168(SEQ ID NO:24)、MBP83-97(SEQ ID NO:25)和MBP85-96(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列。透明带3肽可包含选自ZP3330-342(NSSSSQFQIHGPR)(SEQ IDNO:42)、ZP3 335-342(QFQIHGPR)(SEQ ID NO:43)和ZP3330-340(NSSSSQFQIHG)(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列。人肌球蛋白肽可包含选自SLKLMATLFSTYASADTGDSGKGKGGKKKG(氨基酸614-643；其中Ac为乙酰基)(SEQ ID NO:46)、GQFIDSGKAGAEKL(氨基酸735-747)(SEQ ID NO:47)和DECSELKKDIDDLE(氨基酸947-960)(SEQ ID NO:48)的α-肌球蛋白肽。柯萨奇病毒B4结构蛋白肽选自表1。群链球菌M5肽可包含选自NT4(GLKTENEGLKTENEGLKTE)(SEQ   ID   NO:94)、NT5(KKEHEAENDKLKQQRDTL)(SEQ   ID   NO:95)、B1B2(VKDKIAKEQENKETIGTL)(SEQ   ID   NO:96)、B2(TIGTLKKILDETVKDKIA)(SEQ   ID   NO:97)、B3A(IGTLKKILDETVKDKLAK)(SEQ   ID   NO:98)和C3(KGLRRDLDASREAKKQ)(SEQ ID NO:99)的氨基酸序列和选自表2的肽。所述肽可包含氨基酸序列(Q/R)(K/R)RAA(SEQ ID NO:190)。II型胶原蛋白肽可包含选自II型胶原蛋白的残基263-270(SEQ IDNO:152)、184-198(SEQ ID NO:153)和359-369(SEQ ID NO:154)的氨基酸序列。AChR肽可包含选自人AChRα亚单位的氨基酸37-429、149-156、138-167、149-163、143-156、1-181和1-437的氨基酸序列。人S抗原可包含选自肽19(181-VQHAPLEMGPQPRAEATWQF-200)(SEQ ID NO:183)、肽35(341-GFLGELTSSEVATEVPFRLM-356)(SEQ ID NO:184)和肽36(351-VATEVPFRLMHPQPEDPAKE-370(SEQ ID NO:185)的氨基酸序列。所述DNA可包含能够表达所述肽的表达载体。

所述载体选自pVAX、pcDNA3.0和provax。

本文还提供了治疗I型糖尿病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含胰岛素肽。治疗I型糖尿病的方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含抗原胰岛素肽和编码胰岛素肽的DNA，并且其中所述肽对II类MHC的IC₅₀为50nM或更低。II类MHC可在致耐受性树突细胞上表达。所述肽可由氨基酸序列MRLLPLLALLA(SEQ   ID   NO:5)或SHLVEALYLVCGERG(SEQ ID NO:191)组成。

本文进一步提供了治疗多发性硬化的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含多发性硬化自身抗原肽和编码所述肽的DNA，并且其中所述肽对II类MHC的IC₅₀为50nM或更低。所述疫苗可包含髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)或少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)；并且所述肽为MOG的肽。同样，所述肽可由选自HPIRALVGDEVELP、VGWYRPPFSRVVHLYRNGKD和LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLL的氨基酸序列组成。

本文还提供了治疗自身免疫性卵巢疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含透明带蛋白肽。本文进一步提供了治疗屋尘螨变态反应的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含抗原屋尘螨1肽。

本文还提供了治疗哮喘的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗包含Der-p1、卵清蛋白或其它变应原。

本文进一步提供了治疗心肌炎的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽或A群链球菌M5蛋白肽。本文还提供了治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含肽(Q/R)(K/R)RAA(SEQ ID NO:190)或II型胶原蛋白肽。本文进一步提供了治疗甲状腺炎的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白或Pendrin肽。本文还提供了治疗重症肌无力的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含乙酰胆碱受体肽。本文进一步提供了治疗自身免疫性葡萄膜炎的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含人S抗原肽。

本文还提供了治疗屋尘螨变态反应的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含抗原屋尘螨1肽和编码所述肽的DNA，并且其中所述肽对II类MHC的IC₅₀为50nM或更低。

1.定义

本文使用的术语仅仅是为了描述特殊实施方案的目的而非旨在限制。如说明书和所附权利要求中所使用，除非上下文另有明确指示，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。

对于本文数值范围的叙述，明确涵盖了其间有相同精确程度的每个区间值。例如，对于6-9的范围而言，除6和9外还涵盖数值7和8，并且对于范围6.0-7.0而言，明确涵盖了数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

“肽”或“多肽”为连接的氨基酸序列并且可为天然的、合成的或天然和合成的修改或组合。

当提到保护动物免于疾病时，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”指预防、抑制、压制或完全消除疾病。预防疾病牵涉在疾病发作之前向动物施用本发明的组合物。抑制疾病牵涉在疾病诱导后，但是在其临床表现之前向动物施用本发明的组合物。压制疾病牵涉在疾病的临床表现之后向动物施用本发明的组合物。

“大体上相同”可指第一和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100个氨基酸的区域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。

“变体”可指因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而使氨基酸序列不同，但是保持至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或引起免疫应答的能力。变体也可指氨基酸序列与具有保持至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质大体上相同的蛋白质。在本领域中认为氨基酸的保守性取代，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电区的程度和分布)的不同氨基酸置换氨基酸通常牵涉小量电荷。可通过考虑氨基酸的亲疏水性指数部分鉴定这些小量电荷。见Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知，可取代具有相似亲疏水性指数的氨基酸并且仍保持蛋白质功能。一方面，取代亲疏水性指数为±2的氨基酸。氨基酸的亲水性也可用于揭示将产生保持生物功能的蛋白质的取代。在肽的情况下对氨基酸亲水性的考虑允许计算所述肽的最大局部平均亲水性，是已经报道的与抗原性和免疫原性极其相关的有用方法，如通过引用全部并入本文的美国专利号4,554,101中所讨论。正如本领域中所了解，取代具有相似亲水性值的氨基酸可产生保持生物活性，例如免疫原性的肽。可用亲水性值在相互的±2范围内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值均受所述氨基酸的特殊侧链影响。与观测一致，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质所揭示，了解到可与生物功能相容的氨基酸取代取决于氨基酸的相对相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链。

2.疫苗

本文提供了由抗原和编码所述抗原的DNA组成的疫苗。所述疫苗可诱导抑制抗原特异性T细胞功能的抗原特异性iTreg细胞。疫苗中抗原和编码所述抗原的DNA的组合有效诱导iTreg细胞抗特异性抗原，比包含单独的抗原或其相应DNA的疫苗好得多。所述疫苗进一步增强II类MHC呈递和表达以进行iTreg细胞诱导。

a.抗原

所述疫苗可包含自身免疫性疾病抗原或其变体和编码所述抗原的DNA。所述抗原可为自身抗原，并且可诱导抑制抗原特异性T细胞功能的抗原特异性iTreg细胞。用序列匹配DNA和蛋白质抗原联合免疫在体外和体内诱导CD11c⁺CD40^低IL-10⁺表现型的调节性DC(DCreg)，其转而介导抗原特异性耐受性。

常规DC(DC)为可广泛分类为CD11c⁺CD8a⁺和CD11c⁺CD8a^-亚型的特化抗原呈递细胞(APC)，二者在免疫性或耐受性的诱导中均有显著功能可塑性，这取决于其成熟情况。未成熟的DC(iDC)可通过将初始T细胞转化为CD4⁺Foxp3⁺调节性T细胞(Treg)提高耐受性。来自疫苗的DNA构建体和序列匹配蛋白的信号可以协同方式作用以活化将正常DC转化为DCreg的调节信号。

DNA和蛋白质抗原联合免疫通过使同一DC主要经小窝介导的胞吞作用同时摄取DNA和蛋白质免疫原来诱导DCreg。这一事件下调Cav-1的磷酸化而上调Tollip，其转而发起上调SOCS1而下调NF-κB和STAT-1α的下游信号转导。NF-κB的下调解释了联合免疫诱导的DCreg的CD40低和IL-10+表现型。可在体外于原代DC和DC系中通过为其供给DNA和蛋白质免疫原短至24h来产生DCreg。体外产生的DCreg可能通过诱导抗原特异性CD25-iTreg，对治疗炎症性和自身免疫性疾病有效。

Cav-1是形成小窝的关键蛋白。Cav-1还通过区室化许多信号转导分子来调节信号转导。Cav-1、Tollip和IRAK-1形成复合体以抑制静息状况期间IRAK-1的激酶活性。一旦磷酸化，Cav-1就从复合体中分离，导致细胞溶质中的IRAK-1磷酸化和下游信号转导级联的活化，包括NF-κB25易位。DNA和蛋白质的同时摄取下调了Cav-1的磷酸化，从而防止NF-κB活化。因此，DNA抗原和序列匹配蛋白质抗原可将正常DC转化为DCreg。为获得DCreg表现型和功能需要相同DC并且同时摄取事件引发上调SOCS1而下调NF-κB和STAT-1α的Cav-1和Tollip相互依赖型信号转导。

Tollip在先天反应的抑制和静息状态的维持中起重要作用。DNA和蛋白质抗原的同时摄取上调了Tollip并且Tollip或Cav-1的沉默部分防碍了DC向DCreg的分化，表明Tollip可能在下调NF-κB中独立于Cav-1作用。

iTreg细胞可为CD4⁺CD25⁺并且也表现出Foxp3的高表达。iTreg细胞能够特异性防止在无一般免疫抑制时受有害免疫性的干扰。可通过高剂量的白细胞间素2(IL-2)诱导iTreg细胞的增殖。iTreg细胞能够凭借活化的CD4⁺效应T细胞上CD80和CD86配体的存在抑制效应T细胞。一旦iTreg细胞被T细胞受体配体活化，抗原呈体细胞的存在在效应T细胞的抑制中可必要或不必要。抗原刺激后，iTreg细胞可回到排出抗原的淋巴结内并且可通过以与初始T细胞相同的速率的细胞分裂进行积聚。

iTreg细胞的产生可需要在皮质上皮细胞上表达II类MHC。受体可受MHC限制，并且iTreg细胞可对抗原有特异性。可能通过基于IL-10的机制诱导iTreg细胞以参与旁观者介导的调节。iTreg细胞引起炎症性T_辅助和T_杀伤细胞减少。iTreg抑制可通过与抗原呈递细胞相互作用而发生，包括例如在肺部或其它器官中的DC和上皮细胞，其中通过减少其外出分子S1P1的表达保留抗原特异性iTreg细胞。相互作用上调了抗原特异性APC的趋化IP-10的表达，其将CXCR3⁺炎症性T细胞捕获至上皮细胞(即T_H1、T_K1等)内。这些捕获T细胞的20%经历细胞凋亡，并且然后少数转化为表达IL10和TGF-β的Treg细胞。因此，炎症性T细胞在气管，如肺部中减少，并且病状例如哮喘得到改善。

抗原可与变态反应、哮喘或自身免疫性疾病相关。抗原可影响哺乳动物，所述哺乳动物可为人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。抗原可含于来自哺乳动物的蛋白质中，所述哺乳动物可为人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、小鼠或大鼠。

(1)FSA1

所述抗原可为蚤变应原FSA1的肽或其变体，其可具有FSA1的氨基酸66-80或氨基酸100-114。

(2)Der-p1

所述抗原也可为Der-p1的肽或其变体。Der-p1可具有基因库登记号EU092644的序列，其内容通过引用并入本文。这种抗原可能与哮喘和/或变态反应有关。

(3)1型糖尿病

所述抗原可为牵涉于1型糖尿病的自身抗原或其变体。所述抗原可为胰岛素的肽，并且可为胰岛素原。胰岛素原抗原可具有序列MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:192)，其可由基因库登记号NM_000207中所含的序列编码，其内容通过引用并入本文。所述抗原可为人B9-23。胰岛素抗原也可具有序列MRLLPLLALLA(SEQ ID NO:5)、SHLVEALYLVCGERG(SEQ IDNO:191)或LYLVCGERG(SEQ ID NO:6)。所述抗原也可为Wong SF，TRENDS在Molecular Medicine,2005;11(10)中公开的胰岛素抗原，其内容通过引用并入本文。胰岛素抗原可具有氨基酸序列GIVEQCCTSICSLYQ(SEQ ID NO:7)。

所述抗原可为葡萄糖6-磷酸酶(G6P)的序列，如Journal ofImmunology，2006;176:2781-9中所述，其内容通过引用并入本文。G6P抗原可具有IGRP_13–25(QHLQKDYRAYYTF)(SEQ ID NO:8)、IGRP_23–35(YTFLNFMSNVGDP)(SEQ   ID   NO:9)、IGRP_226–238(RVLNIDLLWSVPI)(SEQ   ID   NO:10)、IGRP_247–259(DWIHIDTTPFAGL)(SEQ   ID   NO;11)、G6Pase-α_228–240(KGLGVDLLWTLEK)(SEQ   ID   NO:12)、G6Pase-α_249–261(EWVHIDTTPFASL)(SEQ   ID   NO:13)、UGRP_218–230(FTLGLDLSWSISL(SEQ   ID   NO:14)和UGRP_239–251(EWIHVDSRPFASL)(SEQ ID NO:15)的序列。

所述抗原也可为谷氨酸脱羧酶或热休克蛋白的肽。

(4)多发性硬化

所述抗原可为牵涉于多发性硬化(MS)的自身抗原。所述抗原可为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)或少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)的肽或其变体。MBP抗原可为MBP66-88(SEQ IDNO:21)、MBP85-99(SEQ ID NO:22)、MBP86-105(SEQ ID NO:23)、MBP143-168(SEQ ID NO:24)、MBP83-97(SEQ ID NO:25)或MBP85-96(SEQ ID NO:26)。PLP抗原可为PLP30-49(SEQ ID NO:28)、PLP40-60(SEQ ID NO:29)、PLP180-199(SEQ ID NO:30)、PLP184-199(SEQ ID NO:31)或PLP190-209(SEQ ID NO:32)。MOG抗原可为MOG1-22(SEQ ID NO:17)、MOG34-56(SEQ ID NO:18)或MOG64-96(SEQ ID NO:19)。MOG抗原也可具有序列HPIRALVGDEVELP(SEQID NO:36)、VGWYRPPFSRVVHLYRNGKD(SEQ ID NO:37)或LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLL(SEQ ID NO:38)。MS抗原也可具有Schmidt S，Mult Scler.，1999;5(3):147-60中描述的序列，其内容通过引用并入本文。

(5)自身免疫性卵巢疾病

所述抗原可为牵涉于自身免疫性卵巢疾病的自身抗原。所述抗原可为透明带(ZP)1、2或3中所含的肽。ZP肽可具有NCBI参考序列NP_003451.1(SEQ ID NO:39)、NP_009086.4(SEQ ID NO:40)或NP_997224.2(SEQ ID NO:41)的序列。ZP抗原可为具有序列ZP3330–342(NSSSSQFQIHGPR)(SEQ   ID   NO:42)、ZP3335–342(QFQIHGPR)(SEQ   ID   NO:43)或ZP3330–340(NSSSSQFQIHG)(SEQ ID NO:44)的ZP3肽。ZP抗原可为LouY，The Journal of Immunology，2000;164:5251–7中公开的肽，其内容通过引用并入本文。

(6)心肌炎

所述抗原可为牵涉于心肌炎的自身抗原。所述抗原可为SmithSC，Journal of Immunology，1991;147(7):2141-7中所述的肽，其内容通过引用并入本文。所述抗原可为人肌球蛋白中所含的肽，其可具有基因库登记号CAA86293.1(SEQ ID NO:45)的序列。所述抗原可为α-肌球蛋白中所含的肽，并且可具有序列Ac-SLKLMATLFSTYASADTGDSGKGKGGKKKG(氨基酸614–643；其中Ac为乙酰基)(SEQ ID NO:46)、GQFIDSGKAGAEKL(氨基酸735-747)(SEQ ID NO:47)或DECSELKKDIDDLE(氨基酸947-960)(SEQ ID NO:48)，如Pummerer,CL，J.Clin.Invest.1996;97:2057-62中所公开，其内容通过引用并入本文。所述抗原也可为具有下列序列之一的柯萨奇病毒B4结构蛋白肽。

表1

柯萨奇病毒B4结构蛋白	氨基酸	序列	SEQ ID NO.
				VP4	1–20	MGAQVSTQKTGAHETSLSAS	49
VP4	21–40	GNSIIHYTNINYYKDAASNS	50
				VP4	31–50	NYYKDAASNSANRQDFTQDP	51
VP4	41–60	ANRQDFTQDPSKFTEPVKDV	52
				VP4	51–70	SKFTEPVKDVMIKSLPALNS	53
VP2	61–80	MIKSLPALNSPTVEECGYSD	54
				VP2	71–90	PTVEECGYSDRVRSITLGNS	55
VP2	81–100	RVRSITLGNSTITTQECANV	56
				VP2	91–110	TITTQECANVVVGYGVWPDY	57
VP2	111–130	LSDEEATAEDQPTQPDVATC	58
				VP2	121–140	QPTQPDVATCRFYTLNSVKW	59
VP2	131–150	RFYTLNSVKWEMQSAGWWWK	60
				VP2	151–170	FPDALSEMGLFGQNMQYHYL	61
VP2	161–180	FGQNMQYHYLGRSGYTIHVQ	62
				VP2	171–190	GRSGYTIHVQCNASKFHQGC	63
VP2	181–200	CNASKFHQGCLLVVCVPEAE	64
				VP2	211–230	AYGDLCGGETAKSFEQNAAT	65
VP2	221–240	AKSFEQNAATGKTAVQTAVC	66
				VP2	231–250	GKTAVQTAVCNAGMGVGVGN	67
VP2	251–270	LTIYPHQWINLRTNNSATIV	68
				VP2	261–280	LRTNNSATIVMPYINSVPMD	69
VP2	271–290	MPYINSVPMDNMFRHNNFTL	70
				VP2	281–300	NMFRHNNFTLMIIPFAPLDY	71
VP3	321–340	YNGLRLAGHQGLPTMLTPGS	72
				VP3	351–370	SPSAMPQFDVTPEMNIPGQV	73
VP3	361–380	TPEMNIPGQVRNLMEIAEVD	74
				VP3	371–390	RNLMEIAEVDSVVPINNLKA	75
VP3	381–400	SVVPINNLKANLMTMEAYRV	76
				VP3	391–410	NLMTMEAYRVQVRSTDEMGG	77
VP3	401–420	QVRSTDEMGGQIFGFPLQPG	78
				VP3	411–430	QIFGFPLQPGASSVLQRTLL	79
VP3	421–440	ASSVLQRTLLGEILNYYTHW	80
				VP3	431–450	GEILNYYTHWSGSLKLTFVF	81
VP3	441–460	SGSLKLTFVFCGSAMATGKF	82
				VP3	511–530	DDKYTASGFISCWYQTNVIV	83
VP3	541–560	MCFVSACNDFSVRMLRDTQF	84
				VP1	671–690	LRRKMEMFTYIRCDMELTFV	85
VP1	721–740	VPTSVNDYVWQTSTNPSIFW	86
				VP1	731–750	QTSTNPSIFWTEGNAPPRMS	87
VP1	741–760	TEGNAPPRMSIPFMSIGNAY	88

VP1	751–770	IPFMSIGNAYTMFYDGWSNF	89
				VP1	771–790	SRDGIYGYNSLNNMGTIYAR	90
VP1	781–800	LNNMGTIYARHVNDSSPGGL	91
				VP1	791–810	HVNDSSPGGLTSTIRIYFKP	92
VP1	831–850	SVNFDVEAVTAERASLITTG	93

所述抗原可为柯萨奇病毒B4结构蛋白中所含的肽，如Marttila J，Virology，2000;293:217-24中所公开，其内容通过引用整体并入本文。

所述抗原也可为来自A群链球菌M5蛋白的肽。M5肽可具有下列序列之一：NT4(GLKTENEGLKTENEGLKTE)(SEQ ID NO:94)、NT5(KKEHEAENDKLKQQRDTL)(SEQ   ID   NO:95)、B1B2(VKDKIAKEQENKETIGTL)(SEQ   ID   NO:96)、B2(TIGTLKKILDETVKDKIA)(SEQ   ID   NO:97)、B3A(IGTLKKILDETVKDKLAK)(SEQ   ID   NO:98)和C3(KGLRRDLDASREAKKQ)(SEQ ID NO:99)。所述抗原也可为来自下表的M5肽。

表2

所述肽也可为Cunningham MW，INFECTION AND IMMUNITY，1997;65(9):3913–23中公开的序列，其内容通过引用整体并入本文。

(7)类风湿性关节炎

所述抗原可为牵涉于类风湿性关节炎(RA)的自身抗原。所述抗原可为Fox DA，Arthritis and Rheumatism，1997;40(4):598-609，MackayIR，J Rheumatol，2008;35;731-733或Hill JA，The Journal ofImmunology，2003;171:538-41中描述的具有序列Q/R、K/R、R、A和A序列的肽，其内容通过引用整体并入本文。所述抗原可为II型胶原蛋白的肽，所述肽可具有II型胶原蛋白的氨基酸263-270(SEQ IDNO:152)或184-198(SEQ ID NO:153)的序列。II型胶原蛋白抗原可为Staines NA，Clin.Exp.Immunol.，1996;103:368-75或Backlund J，PNAS，2002;99(15):9960-5中公开的肽，其内容通过引用整体并入本文。II型胶原蛋白抗原也可具有II型胶原蛋白的氨基酸残基359–369[C1^III](SEQ ID NO:154)的序列，如Burkhardt,H，ARTHRITIS&RHEUMATISM，2002;46(9):2339-48中所公开，其内容通过引用整体并入本文。

(8)甲状腺炎

所述抗原可为牵涉于甲状腺炎的自身抗原，并且可为甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白或Pendrin中所含的肽。所述抗原可在Daw K，Springer SeminImmunopathol，1993，14:285-307；“Autoantigensin autoimmune thyroid diseases，The Japanese Journal of ClinicalPathology，1989;37(8):868-74；Fukuma N，Clin.Exp.Immunol.，1990;82(2):275–83；或Yoshida A，The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism，2009;94(2):442-8有描述，其内容通过引用整体并入本文。

甲状腺球蛋白抗原可具有序列NIFEXQVDAQPL(SEQ IDNO:155)、YSLEHSTDDXASFSRALENATR(SEQ ID NO:156)、RALENATRDXFIICPIIDMA(SEQ ID NO:157)、LLSLQEPGSKTXSK(SEQ ID NO:158)或EHSTDDXASFSRALEN(SEQ ID NO:159)，其中X为3,5,3’,5’-四碘甲腺原氨酸(甲状腺素)。TPO抗原可具有序列LKKRGILSPAQLLS(SEQ ID NO:160)、SGVIARAAEIMETSIQ(SEQID NO:161)、PPVREVTRHVIQVS(SEQ   ID   NO:162)、PRQQMNGLTSFLDAS(SEQ   ID   NO:163)、LTALHTLWLREHNRL(SEQ   ID   NO:164)、HNRLAAALKALNAHW(SEQ ID NO:165)、ARKVVGALHQIITL(SEQID NO:166)、LPGLWLHQAFFSPWTL(SEQ ID NO:167)、MNEELTERLFVLSNSST(SEQ ID NO:168)、LDLASINLQRG(SEQ IDNO:169)、RSVADKILDLYKHPDN(SEQ ID NO:170)或IDVWLGGLAENFLP(SEQ ID NO:171)。Pendrin抗原可具有序列QQQHERRKQERK[人pendrin中的氨基酸34-44(基因库AF030880)](SEQ ID NO:172)、PTKEIEIQVDWNSE[人pendrin中的氨基酸630-643](SEQ ID NO:173)或NCBI基因库登记NP_000432.1(SEQ ID NO:174)。

(9)重症肌无力

所述抗原可为牵涉于重症肌无力(MG)的自身抗原，并且可含于乙酰胆碱受体(AChR)中。所述抗原可为Protti MA，ImmunologyToday，1993;14(7):363-8；Hawke S，Immunology Today，1996;17(7):307-11中描述的肽，其内容通过引用并入本文。AChR抗原可为人AChRα亚单位的氨基酸37-429(SEQ ID NO:176)、149-156(SEQ ID NO:177)、138-167(SEQ ID NO:178)、149-163(SEQ IDNO:179)、143-156(SEQ ID NO:180)、1-181(SEQ ID NO:181)或1-437(SEQ ID NO:182)。

(10)自身免疫性葡萄膜炎

所述抗原可为牵涉于自身免疫性葡萄膜炎(AU)的自身抗原，并且可含于人S抗原中。所述抗原可具有肽19(181-VQHAPLEMGPQPRAEATWQF-200)(SEQ ID NO:183)、肽35(341-GFLGELTSSEVATEVPFRLM-356)(SEQ ID NO:184)或肽36(351-VATEVPFRLMHPQPEDPAKE-370)(SEQ ID NO:185)的序列。所述抗原可在de Smet MD，J Autoimmun.1993;6(5):587-99中有描述，其内容通过引用并入本文。所述抗原也可含于人IRBP中，并且可具有序列521-YLLTSHRTATAAEEFAFLMQ-540(SEQ ID NO:186)。所述抗原可在Donoso LA，J Immunol.，1989;143(1):79-83中有描述，其内容通过引用整体并入本文。

(11)其它抗原

所述抗原也可为美国专利申请公布号20100143401中公开的抗原，其内容通过引用整体并入本文。

(12)II类MHC结合亲和力

所述抗原可对II类MHC(MHC-II)有高亲和力，这可增强对iTreg细胞的诱导。抗原的MHC-II亲和力可为IC₅₀小于或等于50nM。亲和力也可为IC₅₀小于或等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM。

可使用计算机算法预测抗原对MHC-II的亲和力。算法可为MHCPred，如Guan P、Doytchinova IA、Zygouri C、Flower DR，MHCPred：bringing a quantitative dimension to the online prediction ofMHC binding，Appl Bioinformatics.20032:63-66；Guan P、DoytchinovaIA、Zygouri C、Flower DR，MHCPred：A server for quantitativeprediction of peptide-MHC binding，Nucleic Acids Res.200331:3621-3624；和Hattotuwagama CK、Guan P、Doytchinova IA、ZygouriC、Flower DR，Quantitative online prediction of peptide binding to themajor histocompatibility complex，J Mol Graph Model.200422:195-207描述的，其内容通过引用整体并入本文。算法也可为NN-比对或SMM-比对，如Nielsen M和Lund O，NN-align，a neural network-basedalignment algorithm for MHC class II peptide binding prediction，BMCBioinformatics.2009;10:296；和Nielsen M、Lundegaard C、Lund O，Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align,or a novelstabilization matrix alignment method，BMC Bioinformatics.2007;8:238描述的，其内容通过引用整体并入本文。

b.DNA

本文还提供了编码所述抗原的DNA。所述DNA可包括编码所述抗原的编码序列。所述DNA也可包括编码连接子的附加序列或通过肽键与所述抗原连接的标签序列。

c.载体

本文进一步提供了包括所述DNA的载体。所述载体能够表达所述抗原。所述载体可为表达构建体，其通常为用于将特定基因引入靶细胞内的质粒。一旦表达载体在细胞内部，就通过细胞转录和翻译机制核糖体复合物生成由所述基因编码的蛋白质。常常将质粒工程化为含有用作增强子和启动子区并导致表达载体上所携带的基因有效转录的调节序列。本发明的载体表达大量稳定信使RNA，并因此表达蛋白质。

所述载体可具有表达信号，例如强启动子、强终止密码子，启动子和克隆基因之间距离的调节，和转录终止序列和PTIS(便携式翻译起始序列)的插入。

i.表达载体

所述载体可为环形质粒或线性核酸疫苗。环形质粒和线性核酸能够在适当受试细胞中定向表达特定的核苷酸序列。所述载体可具有与编码抗原的核苷酸序列可操作地连接的启动子，其可与终止信号可操作地连接。所述载体也可能含有核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，意味着其至少一种组分与其至少一种其它组分异源。核苷酸序列在表达盒中的表达可受组成型启动子或诱导型启动子的控制，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时开始转录。在多细胞生物的情况下，启动子也可对特定组织或器官或发育阶段有特异性。

ii.环形和线性载体

所述载体可为环形质粒，其可通过整合至细胞基因组中转化靶细胞或在染色体外存在(例如具有复制起点的自主复制质粒)。

所述载体可为pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达DNA并且使细胞能够将序列翻译为由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。所述载体可与抗原按5:1和1:5之间，或1:1和2:1之间的质量比结合。

本文还提供了能够通过电穿孔有效递送至受试者中并表达一种或多种所需抗原的线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)。LEC可为无任何磷酸骨架的任何线性DNA。所述DNA可编码一种或多种抗原。LEC可含有启动子、内含子、终止密码子、多腺苷酸化信号。抗原的表达可受启动子控制。LEC可能不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可能不含与所需抗原基因表达无关的其它核酸序列。

LEC可源自能够被线性化的任何质粒。所述质粒能够表达抗原。所述质粒可为pNP(波多黎各/34)或pM2(新喀里多尼亚/99)。见图1。质粒可为pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达DNA并且使细胞能够将序列翻译为由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。

LEC可为pcrM2。LEC可为pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别源自pNP(波多黎各/34)和pM2(新喀里多尼亚/99)。见图34。LEC可与抗原按5:1和1:5之间，或1:1和2:1之间的质量比结合。

iii.启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号

所述载体可具有启动子。启动子可为能够驱动基因表达并调节分离核酸的表达的任何启动子。此类启动子为通过依赖DNA的RNA聚合酶转录，转录本文所述抗原序列所需的顺式作用序列元件。对用于定向表达异源核酸的启动子的选择取决于特定应用。启动子在载体中可定位在与其在自然环境中距转录起始位点的大约相同距离。然而，该距离的变化可能不受启动子功能的缺失调节。

启动子可与编码抗原的核酸序列和转录产物的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号可操作地连接。启动子可为CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子、多角体蛋白启动子或所示对于在真核细胞中表达有效的另一启动子。

所述载体可包括增强子和具有功能剪接供体和受体位点的内含子。所述载体可含有结构基因下游的转录终止区以提供有效终止。终止区可从与启动子序列相同的基因获得或可从不同基因获得。

d.疫苗的其它组分-佐剂、赋形剂

所述疫苗可进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可为功能性分子，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可为转染促进剂，其可包括表面活性剂(例如免疫刺激复合物(ISCOMS))、弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant)、包括单磷酰脂A的LPS类似物、胞壁肽、醌类似物、囊泡(例如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。转染促进剂为聚-L-谷氨酸盐，并且聚-L-谷氨酸盐可以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂也可包括表面活性剂(例如免疫刺激复合物(ISCOMS))、弗氏不完全佐剂、包括单磷酰脂A的LPS类似物、胞壁肽、醌类似物和囊泡(例如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸也可连同基因构建体施用使用。DNA质粒疫苗也可包括转染促进剂，例如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，如DNA-脂质体混合物(见，例如W09324640)，钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。疫苗中转染剂的浓度低于4mg/ml，低于2mg/ml，低于1mg/ml，低于0.750mg/ml，低于0.500mg/ml，低于0.250mg/ml，低于0.100mg/ml，低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。

药学上可接受的赋形剂可为佐剂。所述佐剂可为在替代性质粒中表达或作为蛋白质与疫苗中的上述质粒结合递送的其它基因。佐剂可选自：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括信号序列缺失的IL-15并任选包括来自IgE的信号肽。佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

可为有用佐剂的其它基因包括编码以下的基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、灭活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。

所述疫苗可进一步包含1994年4月1日提交的美国序列号021,579中描述的基因疫苗促进剂，其通过引用全部并入。

可根据待使用的施用模式配制所述疫苗。可注射疫苗药物组合物可无菌、无热原且无微粒。可使用等渗制剂或溶液。等渗性添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。所述疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗可进一步包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可使制剂在室温或环境温度下稳定更长时间，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

3.接种方法

本文提供了使用疫苗为患者接种以治疗或预防变态反应、哮喘、自身免疫性疾病或移植排斥症状的方法。变态反应可为蚤过敏性皮炎或屋尘螨变态反应。自身免疫性疾病可为I型糖尿病、多发性硬化、自身免疫性卵巢疾病、心肌炎、类风湿性关节炎、哮喘、甲状腺炎、重症肌无力或自身免疫性葡萄膜炎。

疫苗剂量可为1μg至10mg活性组分/kg体重/次，并且可为20μg至10mg组分/kg体重/次。可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或3天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量数可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

a.施用

可根据制药领域的技术人员众所周知的标准技术配制疫苗。可考虑如特殊受试者的年龄、性别、体重和状况和施用途径等因素，按医学领域中技术人员众所周知的剂量和技术施用此类组合物。受试者可为哺乳动物，例如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。

可预防性或治疗性地施用疫苗。在预防性施用中，可按足以诱导iTreg应答的量施用疫苗。在治疗性应用中，可按足以产生治疗效果的量向有需要的受试者施用疫苗。将足以实现这一目的的量定义为“治疗有效剂量”。对该用途有效的量将取决于(例如)施用疫苗方案的特定组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况和处方医师的判断。

可通过如Donnelly等(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner等(1996年12月3日发布的美国专利号5,580,859)；Felgner(1997年12月30日发布的美国专利号5,703,055)；和Carson等(1997年10月21日发布的美国专利号5,679,647)中描述的本领域众所周知的方法施用疫苗，其内容通过引用整体并入本文。疫苗的DNA可复合为可(例如)使用疫苗枪施用给个体的颗粒或珠。本领域的技术人员将了解，药学上可接受的载体，包括生理学上可接受的化合物的选择取决于(例如)表达载体的施用途径。

可通过多种途径递送疫苗。典型递送途径包括肠胃外施用，例如皮内、肌肉或皮下递送。其它途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。尤其对于疫苗的DNA而言，可将疫苗递送至个体组织的胞间隙(Felgner等，美国专利号5,580,859和5,703,055，所有专利的内容通过引用整体并入本文)。也可将疫苗施用至肌肉，或可通过皮内或皮下注射，或经皮，例如通过离子电渗疗法施用。也可采用疫苗的表皮施用。表皮施用可牵涉机械或化学刺激表皮的最外层以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等，美国专利号5,679,647，其内容通过引用整体并入本文)。

也可配制疫苗用于通过鼻通道施用。其中载体为固体的适合鼻腔施用的制剂可包括粒度(例如)在约10至约500微米范围内的粗粉，以服用鼻烟的方式，即通过鼻通道从接近鼻子的粉末容器中迅速吸入施用所述粗粉。所述制剂可为鼻喷雾剂、滴鼻剂，或通过喷雾器经气溶胶施用。所述制剂可包括疫苗的水或油溶液。

所述疫苗可为液体制剂，例如混悬剂、糖浆或酏剂。所述疫苗也可为供肠胃外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，注射施用)的制剂，例如无菌混悬剂或乳剂。

可将所述疫苗并入脂质体、微球或其它聚合物基质中(Felgner等，美国专利号5,703,055；Gregoriadis，Liposome Technology，I至III卷(1993年第2版)，其内容通过引用整体并入本文)。脂质体可由磷脂或其它脂质组成，并且可为制备和施用相对简单的无毒、生理学上可接受并且可代谢的载体。

可通过电穿孔，例如通过其内容通过引用并入本文的美国专利号7,664,545中描述的方法施用所述疫苗。电穿孔可通过美国专利号6,302,874；5,676,646；6,241,701；6,233,482；6,216,034；6,208,893；6,192,270；6,181,964；6,150,148；6,120,493；6,096,020；6,068,650；和5,702,359中描述的方法和/或仪器进行，其内容通过引用整体并入本文。可通过微创设备进行电穿孔。

微创电穿孔设备(“MID”)可为用于将上述疫苗和相关流体注射至机体组织内的仪器。所述设备可包括空心针、DNA盒和流体递送装置，其中所述设备适于驱动使用的流体递送装置以便在将针插入所述机体组织时同时(例如，自动)将DNA注射至机体组织内。这样的优点在于，在插入针的同时能够逐渐注射DNA和相关流体，导致流体在机体组织更均匀的分布。由于注射DNA在更大区域分布，注射时经受的疼痛可减轻。

MID可将疫苗注射至组织内，无需使用针。MID可注射如细流或射流的疫苗，以这种力使得疫苗刺入组织表面并进入下层组织和/或肌肉。细流或射流后面的力可通过压缩气体(例如二氧化碳)在一瞬间通过微型孔的膨胀提供。公开的美国专利申请号20080234655；美国专利号6,520,950；美国专利号7,171,264；美国专利号6,208,893；美国专利号6,009,347；美国专利号6,120,493；美国专利号7,245,963；美国专利号7,328,064；和美国专利号6,763,264中描述了微创电穿孔设备的实例及其使用方法，其各自的内容通过引用并入本文。

MID可包括产生无痛刺入组织的高速液体射流的注射器。此类无针注射器在市场上可买到。本文可用的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783；4,447,223；5,505,697；和4,342,310中描述的无针注射器，其各自的内容通过引用并入本文。

可使用无针注射器，通常通过使组织表面与注射器接触，以便用足以使疫苗穿透至组织内的力驱动试剂射流的递送，将呈适于直接或间接电迁移形式的所需疫苗引入(例如，注射)至待治疗的组织中。例如，如果待治疗组织为粘膜、皮肤或肌肉，用足够的力将试剂射向粘膜或皮肤表面以使试剂穿透角质层并进入真皮层，或分别进入下层组织和肌肉。

无针注射器很适合将疫苗递送至所有类型的组织，尤其是皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可用于将含有疫苗的液体推至表面并进入受试者的皮肤或粘膜中。可使用本发明方法治疗的各类组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽喉、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。

MID可具有使组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列中多对电极之间产生脉冲，例如呈矩形或正方形模式的设置提供了比在一对电极之间产生脉冲改善的结果。例如，标题为“Needle Electrodes forMediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利号5,702,359中公开了针阵列，其中在治疗期间可使多对针产生脉冲。在如同全面阐述地通过引用并入本文的所述申请中，将针布置成圆形阵列，但是具有使得能够在反向针电极对之间产生脉冲的连接器和转换仪器。可使用用于将重组表达载体递送至细胞的针电极对。在美国专利号6,763,264中描述了此类设备和系统，其内容通过引用并入本文。可选地，可使用单针设备，以允许用类似于普通注射针的单针注射DNA和电穿孔并且施加比目前使用的设备递送的脉冲电压低的脉冲，从而减轻患者经受的电感觉。

MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括两根或多根具有相同直径或不同直径的针。所述针均匀或不均匀地间隔开。所述针可在0.005英寸和0.03英寸之间，在0.01英寸和0.025英寸之间；或在0.015英寸和0.020英寸之间。所述针的直径可为0.0175英寸。所述针可间隔0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。

MID可由脉冲发生器和一步递送疫苗和电穿孔脉冲的两针或多针疫苗注射器组成。脉冲发生器可允许通过闪存卡操作的个人计算机灵活编程脉冲和注射参数，以及全面记录并存储电穿孔和患者数据。脉冲发生器可在短时间内递送多种电压脉冲。例如，脉冲发生器可在持续期间递送3个100ms的15V脉冲。此类MID的实例为InovioBiomedical Corporation的Elgen1000系统，其在内容通过引用并入本文的美国专利号7,328,064中有描述。

MID可为CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals，Blue Bell PA)设备和系统，这是促进将高分子(例如DNA)引入机体或植物中的所选组织的细胞内的模块化电极系统。模块化电极系统可包括多个针电极；皮下注射针；提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针电极的导电连接的电连接器；和电源。操作者可紧握固定在支撑结构上的多个针电极并将其牢牢插入机体或植物中的所选组织内。然后通过皮下注射针将高分子递送至所选组织中。活化可编程恒流脉冲控制器并将恒流电脉冲施加于多个针电极。施加的恒流电脉冲促进将高分子引入多个电极之间的细胞内。通过借助恒流脉冲限制组织内的功率消耗将由于细胞过热导致的细胞死亡减到最少。美国专利号7,245,963中描述了Cellectra设备和系统，其内容通过引用并入本文。

MID可为Elgen1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen1000系统可包括提供了空心针的设备；和流体递送装置，其中所述仪器适于驱动使用的流体递送装置以便在针插入所述机体组织过程中同时(例如自动)将流体(本文所述疫苗)注射至机体组织内。优点是在插入针的同时能够逐渐注射流体，导致流体在机体组织更均匀的分布。还认为，由于注射流体体积在更大区域的分布，注射时经受的疼痛减轻。

另外，自动注射流体促进了自动监测并记录注射的实际流体剂量。若需要，可用文档编制目的的控制单元存储该数据。

应了解，注射速率可为线性或非线性并且可在将针插入待治疗受试者的皮肤后和将其进一步插入机体组织的同时进行注射。

可通过本发明的仪器将流体注入其中的适合组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但是可为肌肉组织。

所述仪器进一步包括用于指导将针插入机体组织内的针插入装置。流体注射速率受针插入速率控制。这样的优点在于，可控制针插入和流体的注射，以致可使插入速率与所需注射速率匹配。还使得仪器易于为使用者操作。若需要，可提供用于自动将针插入机体组织内的装置。

使用者可选择何时开始流体注射。然而理想的是，当针尖到达肌肉组织时开始注射并且所述仪器可包括用于感觉针已经插入开始流体注射的足够深度的装置。这意味着，当针已到达所需深度(通常为肌肉组织开始的深度)时可自动提示开始流体注射。例如可取肌肉组织开始的深度为预设针插入深度，例如将认为足够使针通过皮肤层的值4mm的值。

感受装置可包括超声探针。感受装置可包括用于感受阻抗或电阻变化的装置。在这种情况下，所述装置可能不会同样记录针在机体组织内的深度，但是将更适于感受当针从不同类型的机体组织移至肌肉内时阻抗或电阻的变化。这些替代方案的任一种提供了相对精确和操作简单的感受可开始注射的装置。若需要，可进一步记录针的插入深度并且可用于控制流体的注射，以致在记录针插入的深度时确定待注射的流体体积。

所述仪器可进一步包括：支撑针的底座；和将底座容纳于其中的壳，其中所述底座相对于所述壳可移动，以致当底座相对于壳处于第一向后位置时针缩回在所述壳内，并且当底座处于壳内的第二向前位置时针伸出壳外。这对于使用者而言有利，因为可在患者的皮肤上将壳对准，然后可通过相对于底座移动壳将针插入患者的皮肤内。

如上所述，可取的是实现流体注射速率控制，以致当针插入皮肤时使流体均匀地分布于针的长度。流体递送装置可包括适于按控制速率注射流体的活塞传动装置。例如可用伺服电机驱动活塞传动装置。然而，可通过相对于壳在轴向移动的底座驱动活塞传动装置。应了解，可提供用于流体递送的替代装置。因此，例如，可提供可挤压以按控制或非控制速率进行流体递送的密闭容器代替注射器和活塞系统。

上述仪器可用于任何类型的注射。然而，设想在电穿孔领域中尤其有用，所以其进一步包括用于向针施加电压的装置。这允许针不仅用于注射，而且在电穿孔期间用作电极。这特别有利，因为这意味着向与注射流体相同的区域施加电场。电穿孔一直存在的问题在于，很难使电极与先前注射的流体精确对准，所以使用者往往在更大区域注射大于所需体积的流体并且向更大区域施加电场以试图保证注射物质和电场之间的重叠。使用本发明，在实现电场和流体之间的良好切合的同时可减小注射流体的体积和施加电场的大小。

本发明具有多个方面，通过下列非限制性实施例说明。

实施例1

使用组合肽/DNA疫苗治疗皮炎

该实施例证明了CD25^-iTreg的高抗原性表位的特征，包括用抗MHC-II抗体阻滞致耐受性DC对CD25^-iTreg的诱导的能力。进一步地，CD25^-iTreg的数量和抑制活性与表位对活性T细胞的明显抗原性正相关。最后，在皮炎的小鼠模型中，来自蚤变应原的高抗原性表位不但诱导更多CD25^-iTreg，而且比弱抗原性表位更有效地防止对变应原的变态反应。同时，CD25^-iTreg的有效诱导需要高抗原肽表位。这些结果证明，对MHC-II具有较高亲和力的高抗原性表位应用于有效诱导iTreg细胞以供临床应用。

诱导调节性T细胞或iTreg与天然调节性T细胞(nTreg)的不同之处在于，前者在外周通过遇到环境抗原而生成。还认为，在调节外周耐受性中，iTreg相对于nTreg起非重叠作用。迄今报道的多数iTreg为CD25⁺细胞(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)，并且明确确定其诱导需要次最适刺激T细胞受体(TCR)和细胞因子TGF-β和IL-2。因此CD25⁺iTreg似乎主要源自经弱刺激的CD4⁺T细胞。

已经鉴定了为CD25^-(CD4⁺CD25^-Foxp3⁺)的不同亚类的iTreg。在使用蛋白质抗原和编码所述抗原的DNA疫苗联合免疫后诱导了CD25^-iTreg。与CD25⁺iTreg的诱导不同，CD25-iTreg的诱导牵涉CD40^低IL-10^高致耐受性树突细胞(DC)的生成，其依次以抗原特异性方式介导CD25^-iTreg的诱导。在小鼠模型中，这一亚类的iTreg可能用作对变应性疾病和自身免疫性疾病，例如哮喘、蚤过敏性皮炎(FAD)和1型糖尿病(T1D)的治疗剂。

虽然明确确定对于CD25⁺iTreg的诱导需要弱抗原刺激，但是尚不清楚对于CD25^-iTreg的诱导而言是否同样如此。解决这一问题将不但使两个亚类的iTreg进一步分化，而且通过选择适当抗原性的T细胞表位最大化联合免疫的致耐受性。

实施例2

CD25^-iTreg的诱导需要MHC-Ag:TCR相互作用

为测试CD25^-iTreg的诱导是否需要MHC-Ag:TCR相互作用，采用体外iTreg诱导系统。其牵涉培养CD4⁺T细胞与呈递鸡卵清蛋白OVA_323-339(SEQ ID NO:187)的优势表位的经联合免疫诱导的致耐受性DC。使用来自DO11.10Balb/c小鼠的克隆型CD4⁺T细胞或来自卵清蛋白致敏Balb/c小鼠的多克隆CD4⁺T细胞，发现在任何情况下CD25^-iTreg的诱导可受抗MHC-II抗体阻滞，并且因此，依赖于MHC-II。因此，对于CD25^-iTreg的诱导而言抗原刺激是必需的(图1)。

实施例3

高活性CD25^-iTreg的有效诱导需要高抗原性表位

为进一步确定抗原性如何影响CD25^-iTreg诱导，由OVA_323-339(SEQ ID NO:187)生成一系列突变表位。使用基于四聚物染色的表位竞争测定，评估每个突变表位对MHC II的亲和力。结果显示亲和力的顺序为OVA_323-339>MT1>MT2=MT3(图2A)(SEQ ID NO:187)。与该结果一致，使用DO11.10CD4⁺T细胞的体外T细胞增殖测定显示了T细胞刺激活性的相似顺序(图2B)。因此选择所选表位OVA_323-339、MT1和MT2作为抗原性研究的探针。

为了达到这个目的，通过使用与OVA_323-339(SEQ ID NO:187)、MT1或MT2表位(指定为Co323、CoMT1或CoMT2)相应的DNA和蛋白质组合联合免疫来处理Balb/c小鼠(I-Ad⁺)。处理7天后，分离脾细胞并分析CD25^-iTreg诱导。当与未处理的对照小鼠(图3A)比较时，处理小鼠显示在CD4⁺CD25^-(CD25^-iTreg)，而非CD4⁺CD25⁺(nTreg)细胞群中有增加频率的Foxp3⁺细胞。重要的是，增长幅度按顺序Co323>CoMT1>CoMT2，表明通过联合免疫有效诱导CD25^-iTreg需要高抗原性表位。

为进一步确定抗原性对CD25^-iTreg功能的影响，使用体外抑制测定比较Co323、CoMT1和CoMT2诱导的CD25^-iTreg的抑制活性。正如预期的，所有CD25^-iTreg细胞均抑制共同培养物中报告CD4⁺T细胞的OVA_323-339特异性增殖。然而，其相对抑制活性按相同顺序Co323>CoMT1>CoMT2(图3B)，表明更强抗原表位也功能性诱导了更具活性的CD25^-iTreg细胞。

为在体内重复这种观察，将用不同表位诱导的CD25^-iTreg过继转移至Balb/c小鼠体内，并且然后尝试用于弗氏不完全佐剂(IFA)中的OVA_323-339使动物致敏。一周后，从致敏小鼠分离出脾CD4⁺T细胞并且通过体外再刺激测定测量CD4⁺T效应细胞的活化恢复。虽然所有转化CD25^-iTreg均一定程度上阻滞了T细胞的增殖恢复，其相对有效性随诱导表位变化，顺序为Co323>CoMT1>CoMT2(图4A)。这些结果与在体外所见的结果相似。而且，从受体分离的脾CD4⁺T细胞显示IFN-γ表达减少而IL-10表达增加，其程度也按相同顺序(图4，B-D)。总之，这些结果显示，为了更有效的诱导高抑制性CD25^-iTreg需要高抗原性表位。

实施例4

更有效预防蚤过敏性皮炎也需要高抗原性表位

蚤过敏性皮炎是由CD4⁺T效应细胞介导的对蚤变应原的变态反应。对于疾病模型的以上发现，选择来自蚤变应原FSA1的两个抗原表位，即P66(氨基酸66-80)(SEQ ID NO:189)和P100(氨基酸100-114)(SEQ ID NO:188)。预测P100对MHC II(I-Ab)的亲和力比P66高。通过用全长FSA1致敏C57BL/6小鼠(I-Ab⁺)，接着使用表位之一进行体外再刺激测定确认这种预测。P100确实明显诱导了比P66更强的T细胞增殖(图5)。

为了解抗原性的差异是否影响这两种表位对CD25^-iTreg细胞的诱导，使用DNA和靶向每种表位(指定为Co100或Co66)的蛋白质疫苗的组合经联合免疫预防性治疗C57BL/6小鼠。联合免疫7天后，用蚤唾液提取物使动物致敏，接着通过延迟型过敏性测定以确定预防联合免疫防止变态反应发展的程度。粒度分析和组织学检查显示Co100的保护作用比Co66强，如反应部位的疹块直径较小(图6B)和单核细胞浸润较少(图6C)所示。经Co100处理的小鼠在反应部位也具有较少肥大细胞和较低水平的脱粒(图6D)。体外活化恢复也确认了Co100组的较弱T细胞应答(6A)。重要的是，P100也比P66诱导了更多的CD25^-iTreg(图6E)，表明P100通过诱导更多CD25^-iTreg更有效地保护动物。

为确定是否事实的确如此，将Co100或Co66诱导的CD25^-iTreg细胞过继转移至FSA1致敏小鼠体内并且用蚤抗原激发受体。同样，接受了经Co100诱导的CD25^-iTreg细胞的受体显示DTH应答比接受了经Co66诱导的对应物的受体显著减少(图7)。总之，这些结果确认，在该疾病模型中，为了更有效诱导治疗性CD25^-iTreg需要高抗原表位。

以上结果确定，高活性CD25^-iTreg细胞的有效诱导需要对T细胞的高抗原表位。结论基于1)抗MHC-II mAb阻滞了体外CD25^-iTreg细胞的诱导(图1)；2)对T细胞的抗原性降低的OVA^323-339突变体显示诱导活性CD25^-iTreg细胞的能力降低(图2-4)；和3)在蚤过敏性皮炎的小鼠模型中获得相似观察，其中在防止疾病的发展中，由更强抗原表位诱导的CD25^-iTreg细胞也更有效(图5-7)。

iTreg细胞可能用作变态反应、自身免疫性疾病和移植排斥的治疗剂。因此本研究通过揭露需要选择用于有效诱导CD25^-iTreg的高抗原表位，具有转化重要性。目前，免疫抑制剂治疗是控制免疫失调和病理学的唯一方式，不幸的是伴有许多副作用，包括感染和癌症的风险升高。体外诱导具抗原特异性的CD25^-iTreg细胞提供了在避免全面免疫抑制的同时控制免疫性疾病的方式。可通过靶向一种或多种疾病相关或特异性抗原的联合免疫，并且通过选择对T细胞的抗原性最高的抗原表位作为免疫原来诱导高度治疗有效性CD25^-iTreg。

实施例5

方法

动物和试剂

从北京维通实验动物技术有限公司(Beijing Vital LaboratoryAnimal Technology Company,Ltd.)(中国北京)购买Balb/c和C57/B6小鼠并且Balb/c、DO11.10来自SLAC实验动物公司(SLAC LaboratoryAnimal)(中国上海)并且养在无病原体的条件下。肽由科肽有限公司(Scipeptide Ltd.)(中国上海)合成。从BD Biosciences(CA,USA)购买用于流式细胞术的抗体。从中国医药公司(China MedicinesCorporation)(中国北京)购买蚤唾液提取物。

表位设计

如用在线服务器MHCPred和NetMHCII所报道和预测，鸡卵清蛋白对I-Ad(OVA_323-339：ISQAVHAAHAEINEAGR)(SEQ ID NO:187)的优势表位突变，MHCPred和NetMHCII在本领域中众所周知。使用MHCPred选择蚤唾液抗原1(FSA1，Swiss-Prot：Q94424.3)对I-Ab(P100：GPDWKVSKECKDPNN(SEQ ID NO:188))和P66：QEKEKCMKFCKKVCK(SEQ ID NO:189))的表位。用pVAX1载体构造编码OVA_323-339、MT1、MT2、P100和P66的相应DNA疫苗，指定为pVAX1-OVA、pVAX1-MT1、pVAX1-MT2、D100和D66。

抗原致敏

通过在第0和7天皮下(s.c.)注射100μg乳化于100μlIFA(Sigma-Aldridge Inc.San Louis,USA)中的肽两次使小鼠免疫。

致耐受性联合免疫

第0和14天为Balb/c小鼠肌肉内(i.m.)注射各100μg的OVA_323-339和pVAX1-OVA、MT1和pVAX1-MT1或MT2和pVAX1-MT2。类似地为C57BL/6小鼠注射P100和D100或P66和D66。

MHC-II阻滞

与从经联合免疫的(pVAX1-OVA+OVA_323-339)Balb/c小鼠纯化的DC(1×10⁵个，Miltenyi Biotec,Gladbach,Germany,130-052-001)一起培养从Balb/c DO11.10小鼠或OVA_323-339致敏Balb/c小鼠纯化的CD4⁺T细胞(5×10⁵个，R&D System,Minneapolis,USA,MAGM202)。用或不用抗MHC II mAb(M5/114.15.2，eBioscience,San Diego,USA)培养细胞7天。

流式细胞术

通过用抗CD4-FITC、抗CD25-APC和抗Foxp3-PE mAb免疫染色来检测CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg。通过用抗IFN-γ-PE mAb在细胞内染色在经莫能菌素阻滞和经抗CD3和抗CD28刺激的T细胞中检测到细胞内IFN-γ。用BD FACSCalibur收集数据并且用Flowjo(Tree Star,Ashland,USA)分析。还使用FlexSet Beads Assay(BD Biosciences)分析了培养的T细胞上清液的IFN-γ和IL-10。

四聚物竞争测定

通过一起培育2×10⁵个DO11.10T细胞、OVA_323-339四聚物和竞争肽5分钟，使载有PE偶联OVA_323-339的I-Ad四聚物(NIH Tetramer CoreFacility)与OVA_323-339或突变肽竞争。添加5个体积含10%FCS的培养基以终止竞争。洗涤细胞3次并立即用流式细胞仪分析PE阳性T细胞。

T细胞增殖

如前所述进行基于MTT和基于CFSE的T细胞增殖测定。

体外抑制测定

用CFSE(应答细胞)标记来自DO11.10小鼠脾脏的OVA_323-339特异性CD4⁺T细胞并且按1:1比例(各2×10⁵个)与经联合免疫诱导的CD4⁺CD25^-T细胞一起共同培养。在第4天通过CFSE稀释，使用FACScalibur分析应答细胞的OVA_323-339特异性增殖。为阻滞体内nTreg，在CD25^-iTreg分离前-48h和-24h向联合免疫小鼠静脉内(i.v.)注射两个10μg剂量的抗CD25mAb(克隆3c7，eBioscience)。

体内抑制测定

在第0天为Balb/c小鼠(i.v.)注射经联合免疫诱导的CD25^-iTreg(2×10⁶个)。在第1和8天，重复使小鼠对相同抗原致敏。在第15天，处死小鼠并分离脾T细胞并通过T细胞增殖测定分析活化恢复。

皮下试验(IDT)和组织学

在非病灶性侧胸部皮肤用10μg的FSA(Greer Laboratories)经皮内(i.d.)激发抗原致敏C57BL/6小鼠。PBS用作虚假对照而组胺用作阳性对照。在激发后30分钟内使用校准千分尺测量皮肤反应的直径。在抗原激发30分钟内收集皮肤样品，于4%多聚甲醛中固定，埋在石蜡中并切片。通过在0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸载玻片，接着用H&E为T细胞或用甲苯胺蓝为肥大细胞染色实现抗原修复。

统计分析

使用学生t检验进行成对比较。通过ANOVA检验进行3个或更多个组之间的比较。如果p<0.05，则认为差异在统计上显著。

实施例6

TGF-β和IL-10在抗哮喘的DNA和蛋白质疫苗诱导的CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg的发育和抑制功能中的不同作用

DNA疫苗和同源蛋白一起联合免疫可诱导致耐受性树突细胞，致耐受性树突细胞可进一步诱导在CD4⁺CD25^-T细胞中的Foxp3表达并且在鼠模型中预防多种变应性或自身免疫性疾病。该实施例证明了通过共同接种编码Derp1抗原和Derp1蛋白的DNA对尘螨诱导的变应性哮喘的经联合免疫诱导和iTreg介导的抑制的免疫调节作用。结果显示，联合免疫不但有助于显著限制肺部的炎症反应，而且有助于抑制Th2细胞因子和生成IgE。此外，可通过抑制细胞因子，例如IL-10而非细胞与细胞接触，诱导CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg来介导抑制。另外，联合免疫3天后，可由从致耐受性DC分泌的TGF-β1发起由初始T细胞转化iTreg。TGF-β1阻滞后可破坏在初始T细胞中对Foxp3表达的这种诱导。同时，自分泌IL-10可通过DC上的IL-10R增强TGF-β介导的iTreg的抑制能力。在体外，TGF-β1也可在抗CD3/抗CD28存在下诱导CD4⁺CD25^-初始T细胞中的Foxp3表达。因此，这种联合免疫方案诱导将初始T细胞进一步转化为iTreg的分泌TGF-β1和IL-10的致耐受性DC。

气道高反应性是可由环境空气变应原引起的支气管哮喘的主要病理生理学特征。主要空气变应原之一为已经证实有助于肺部的速发型过敏反应和慢性哮喘的屋尘螨(HDM)。最重要的变应原是屋尘螨(Der-p1)，一种源自螨肠道的半胱氨酸蛋白酶。已经证明对Der-p1过敏的患者的变应原特异性IgE的血清水平升高并引起炎性细胞局部浸润。近年来，关于T调节细胞(Treg)对哮喘和变应原免疫疗法调整的常识已迅速发展。

T调节细胞(Treg)是免疫系统中的关键抑制性和稳态组分之一并且保持对各种免疫病症，例如自身免疫性疾病、慢性病毒感染和癌症中的自身抗原的免疫耐受性。已经提出将T调节细胞(Treg)，包括天然胸腺源CD4⁺CD25⁺Treg细胞、适应性Tr1和粘膜诱导Th3细胞用于临床试验。最近已经在老龄小鼠或全身性红斑狼疮(SLE)患者体内发现以CD4⁺CD25^-Foxp3⁺表征的新型Treg亚群。在先前的研究中，已经证明，将蛋白质抗原和编码所述抗原的质粒DNA联合免疫接种至小鼠体内可诱导在CD4⁺CD25^-T细胞中的Foxp3表达。然而，该亚型的iTreg如何作用的机制未知。Treg通过几种制剂控制免疫应答，包括生成抑制细胞因子例如IL-10和TGF-β；由CTLA-4、GITR和PD-1的阴性调节因子介导的依赖于细胞与细胞接触的抑制；诱导半熟DC。在该实施例中表明，这些iTreg的抑制能力需要IL-10，而非TGF-β或细胞与细胞接触以抑制效应T细胞应答。

TGF-β1和IL-10不但是牵涉于免疫耐受性诱导的关键性抑制细胞因子，而且可在抗CD3/抗CD28的存在下将外周初始T细胞转化为Treg。在该实施例中，确定了联合免疫将未成熟树突细胞(DC)诱导为也可分泌IL-10和TGF-β，并且在体内将初始T细胞转化为iTreg的DCreg。通过中和DC分泌的TGF-β破坏对这些iTreg的诱导并且当抗争IL-10信号时抑制能力降低。

因此，证明在啮齿动物由尘螨介导的哮喘模型中，通过Der-p1DNA疫苗和Der-p1蛋白质的联合免疫显著改善了临床发作和变态反应。还用抗原特异性CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg证明了对抑制的介导。此外，TGF-β1和IL-10在CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg的诱导和抑制能力中起不同作用。

实施例7

材料和方法

疫苗制剂。合成来自全长屋尘螨1(Der-p1，基因库登记号EU092644)的DNA序列并克隆至pVAX1载体(Invitrogen Inc.USA)中。将重组Der-p1蛋白克隆至pET28a中并且在大肠杆菌系统中表达。72h后通过由转染BHK21细胞的总RNA进行RT-PCR分析鉴定pVAX-Der-p1表达。根据先前的方法从pET28a-FSA1转化的大肠杆菌BL21(DE3)中纯化Der-p1蛋白。按1mg/ml将质粒和重组蛋白溶于盐水中并且在使用前储存在-80℃下。

小鼠和免疫。从中国医学科学院动物研究所(Animal Institute ofChinese Medical Academy)(中国北京)购买6-8周龄的雌性C57BL/6和BALB/C小鼠。从杰克逊实验室(Jackson Laboratory)购买Balb/c.Foxp3^gfp小鼠。所有小鼠均接受无病原体的水和食物。在第0和14天，按疫苗方案向胫骨前肌分别为C57BL/6、BALB/C.Foxp3^gfp小鼠免疫接种质粒DNA(100μg/只动物)或蛋白质(100μg/只动物)或其组合(各100μg/只动物)。

HDM诱导的变应性发病机制。可如先前所述诱导变应原诱导的哮喘。在第1和7天，通过腹膜内注射为C57BL/6小鼠免疫接种4000U于0.1ml PBS中的HDM抗原(Greer Laboratories,Lenoir,NC)或单独的PBS，接着在第14、16、18、20和22天用2000U于100μl PBS中的HDM抗原或作为对照的等体积PBS在气管内激发。在最后一次激发1天后，收集BAL，并收获组织用于免疫组织病理学分析或体外培养。

组织学分析。最后一次气管内激发二十四小时后，从每一组收集来自小鼠的肺样品并且于4%多聚甲醛中固定并埋于石蜡块中。然后切片并固定。通过在0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸载玻片，接着用苏木精和伊红(H&E)染色实现抗原修复并且在光学显微镜下分析以测定组织学变化。

Der-p1特异性IgE的测量。收集血清样品并通过ELISA检查Der-p1特异性抗体的水平。在4℃下为96孔板涂上重组Der-p1蛋白过夜。用PBST洗涤后，添加血清并且在37℃下培育1h，然后用特异性辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgE抗体(SouthernBiotech,Birmingham,USA)检测。使用ELISA酶标仪(Magellan,Tecan AustriaGmbH)测量450nm下的吸光度。

流式细胞(FACS)分析。对于细胞内染色，用Der-p1蛋白(10μg/ml)刺激T细胞8h，并且随后在体外用莫能菌素(3μM)处理2h。在用4%多聚甲醛固定和用皂甙渗透化之前，在4℃下用于PBS中的Fc块(BDPhamingen,San Diego,USA)阻滞细胞30分钟。在4℃下分别用适当浓度的抗体，包括APC标记的抗Foxp3、PECy5标记的抗CD25、FITC标记的抗CD4、PE标记的抗IL-10、PE标记的抗GITR、PE标记的抗CTLA4、PE标记的抗PD-1抗体为细胞在细胞内染色30分钟。使用Cell QuestPro软件(BD Bioscience)，用FACScalibur分析细胞。

体外增殖/抑制测定。在增殖测定中，在第二次免疫后第7天从每一组的脾脏中获得单淋巴细胞悬浮液。在Der-p1(10μg/ml)或PMA(50ng/ml)/离子霉素(ionomycin)(500ng/ml)体外刺激后，通过MTT方法进行T细胞增殖48h。对于悬浮液测定，用高速细胞分选仪(MoFloCell Sorter,Beckman Coulter,USA)，用PE标记的抗CD4和APC标记的抗CD25纯化CD4⁺CD25^-GFP⁺、CD4⁺CD25⁺GFP⁺和CD4⁺CD25^-GFP^-T细胞。检查分选细胞纯度并达到97%以上。与从先前用乳化于CFA(弗氏完全佐剂)中的重组Der-p1初敏化的BALB/C小鼠获得的CD4⁺CD25^-应答T细胞(2×10⁵个)一起共同培养纯化的抑制T细胞(4×10⁴个或2×10⁴个)，并且用乳化于IFA(弗氏不完全佐剂)中的重组Der-p1增强一次。在96孔板中用Der-p1(10μg/ml)和APC(1×10⁴个)刺激应答T细胞72h。刺激后，在添加20μl的MTT-PMS(Pormaga,USA)溶液后通过比色反应4h评估细胞增殖。在添加100μlDMSO(AMRESCO,USA)5分钟后，在595nm下用96孔酶标仪(Magellan,Tecan Austria GmbH)测定其色密度。

Transwell实验。在24孔板中进行Transwell实验。在抗IL-10和抗TGF-β缺乏或存在时，在下部transwell中用Der-p1(10μg/ml)和APC(2×10⁵个)刺激如以上分离的CD4⁺CD25^-应答T细胞(1×10⁶个)。在上部transwell腔(0.4μm；Millipore,USA)内与APC(4×10⁴个)一起共同培养纯化的CD4⁺CD25^-GFP⁺iTreg(2×10⁵个)、CD4⁺CD25⁺GFP⁺nTreg(2×10⁵个)和CD4⁺CD25^-GFP^-T细胞。3天后如以上通过MTT方法评估细胞增殖。

细胞因子生成的分析。通过RT-PCR检测由CD11C⁺树突细胞表达的抑制细胞因子。使用TRIzol试剂(Promega)首次联合免疫3天后从C57BL/6小鼠脾脏的CD11C⁺细胞分离总RNA。合成cDNA并且用以下每种引物进行PCR：GAPDH、TGF-β1、IL10、RALDH1、RALDH2、RALDH3。根据生产商的说明(TaKaRa RNA PCR试剂盒)用每种引物进行RT-PCR。根据生产商的说明，用IL-4、IL-5、IL-10和IL-13流式微球测定Flex Set(BD Bioscience)测量来自经处理或未处理小鼠诱导哮喘模型的血清中的细胞因子。

体内阻滞TGF-β1或IL-10。为测量TGF-β1对体内iTreg诱导的影响，在每次联合免疫后为C57BL/6小鼠腹膜内注射抗TGF-β1mAb(2G7)、抗IL-10mAb(JES-2A5)或于0.5ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中作为对照的同种型匹配小鼠免疫球蛋白G1(IgG1)连续3天，每次注射400μg。根据生产商的方法使用Emax免疫测定系统(Promega,Madison,WI)或IL-10流式微球测定Flex Set(BD Bioscience)测量血清中抗TGF-β1mAb和抗IL-10mAb的中和功能。

体外T细胞初敏测定。为在体外生成CD4⁺CD25^-Foxp3⁺细胞，在6孔板中培养初始CD11c⁺树突细胞(2×10⁵个)，并且在抗IL10或TGF-β存在下用pVAX-Derp1(10μg/ml)+Derp1蛋白质(10μg/ml)刺激48h。向RPMI1640中有初始CD4⁺CD25^–T细胞(1×10⁶个)的培养基中添加3组预处理树突细胞3次，每次48h。然后通过FACS分析CD4⁺CD25^–T细胞中的GFP表达。为检验DCreg诱导iTreg期间细胞因子的作用，我们共同培养了经pVAX-Derp1(10μg/ml)+Derp1蛋白质(10μg/ml)预处理的CD11c⁺DC和初始T细胞，同时加上抗IL-10、抗TGF-β或TGF-β受体抑制剂、SB-525334(14.3nM)3次，每次48h。为了检测TGF-β和IL-10诱导CD4+CD25-Foxp3+Treg的能力，在滴定rhTGF-β1或rmIL10(PeproTech,USA)存在或缺乏时，用板结合抗CD3(3μg/ml)/抗CD28(1μg/ml)刺激初始CD4+CD25-T细胞(1×10⁶个)。

NFAT1和NFAT2的蛋白质印迹。用NE-PER核或细胞质试剂盒(Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL,USA)将RPMI中的纯化CD4⁺CD25^-GFP⁺、CD4⁺CD25⁺GFP⁺Treg或CD4⁺CD25^-GFP^-T细胞(5×10⁶个)分成几个部分。使溶解产物在8.0%SDS-PAGE凝胶上进行试验，转移到硝化纤维素膜上，并且然后用有0.1%吐温(Tween)的TBS中的5.0%乳液阻断。然后用抗小鼠NFAT1、NFAT2、GADPH和组蛋白(全部来自Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)探查膜。

统计分析。使用学生t检验进行统计分析。在这些分析中，将数据转化为对数。如果P<0.05，数据表示差异显著。

实施例8

联合免疫抑制HDM诱导的变应性哮喘的发展

为证明用DNA和重组蛋白疫苗联合免疫对预防哮喘的功效，克隆并构造基于尘螨变应原、屋尘螨1(Derp1，图16A-C)的序列的DNA和蛋白质疫苗，然后在小鼠的尘螨介导的哮喘或AHR中试验。用与联合免疫组一样的pVAX-Derp1DNA疫苗和重组Der-p1蛋白(pVAX-Derp1+Derp1)或其它免疫原以两周一次的间隔经肌肉内预处理C57BL/6小鼠两次。为了消除无关载体和蛋白质对反应的影响，与不匹配的联合免疫对照一样，用pVAX-Derp1+BSA或Derp1蛋白+pVAX载体联合免疫小鼠。随后，诱导除阴性对照外的所有动物并且用HDM在气管内激发以诱导如先前所述的哮喘。组织学分析揭示，与注射了PBS的阴性对照小鼠的肺组织相比，如AHR的成功诱导所示，在未处理小鼠的肺部(图8A)有大量炎性细胞浸润。经联合免疫预处理的小鼠表现出炎性细胞浸润和正常肺部结构显著减少(图8A)。最后一次激发24h后分析支气管肺泡灌洗(BAL)中不同细胞亚型的百分比。在联合免疫小鼠体内嗜酸性细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞显著减少并且与以上观察一致(图17)。

因为变应性抗原引发可介导AHR的IgE，所以研究了是否pVAX-Derp1+Derp1可抑制抗Der-p1IgE的诱导。因此在最后一次气管内激发24h后测量了抗Der-p1特异性IgE的水平。与模型组相比，在联合免疫小鼠体内其水平显著降低(图8B)。

已经证明高水平的Th2相关细胞因子生成，包括IL-4、IL-5和IL-13与变态反应的严重程度相关，通过Flex set测量这些细胞因子在血清中的水平。诱导来自模型组、不匹配组的小鼠生成较高水平的IL-5和IL-13(图8C)；然而，经pVAX-Derp1+Derp1预处理的小鼠生成的这些细胞因子水平相对较低，但是IL-10水平高，表明联合免疫诱导对变态反应的预防作用。因此，联合免疫诱导的抑制可减弱炎症及其疾病相关的体内细胞因子生成。

实施例9

CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg有助于经联合免疫诱导的免疫耐受

为检查pVAX-Derp1+Derp1联合免疫是否可上调Foxp3表达，在第二次联合免疫7天后通过FACS分析CD4⁺CD25^-Foxp3⁺或CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的百分比。如图9A所示，与其它组相比，在经pVAX-Derp1+Derp1联合免疫的小鼠体内CD4⁺CD25^-Foxp3⁺T细胞群增多，表明产生了诱导型Treg细胞。与先前的结论一致，尽管在高水平下，在各组中观察到CD4⁺CD25⁺nTreg细胞变化，但是未观察到Foxp3表达变化，这反驳了nTreg细胞可能也有助于抑制的看法。

为了检查CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg是否有助于对联合免疫的抑制，纯化CD4⁺CD25^-细胞，并且然后在MoFlo分选仪中通过使用经各种方案(包括联合免疫)免疫后的Foxp3^gfp小鼠，分选Foxp3⁺iTreg细胞。使分选的T细胞与从先前用重组Derp1+CFA初敏化并且用重组Derp1+IFA增强的BALB/c小鼠分离的应答CD4⁺T细胞混合(图9B)。如图9C所描绘，CD4⁺CD25^-GFP^-T细胞未表现出任何体外抑制功能，然而CD4⁺CD25^-GFP⁺和CD4⁺CD25⁺GFP⁺T细胞均削弱了应答T细胞的增殖反应，细胞比例为1:5或1:10Treg:Teff。结果表明，免疫抑制仅源自CD4⁺CD25^-Foxp3⁺Treg细胞，而未源自其它CD4⁺CD25^-Foxp3^-T细胞。进一步表明，经联合免疫诱导的CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg有助于免疫耐受。

实施例10

IL-10保持了经联合免疫诱导的iTreg的抑制功能

值得注意的是，经联合免疫在CD4⁺CD25^–T细胞中获得抑制活性伴有Foxp3上调。但是仍然不知道iTreg抑制功能是否通过细胞与细胞接触产生或是否依赖于细胞因子。首先，表征具有先前用于鉴定Treg群的一系列特异性阴性受体的CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg细胞。观察到，表达IL-10的CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg细胞表现出CTLA4、GITR和PD-1在表面上的低表达(图10A)，这可区别于先前鉴定的nTreg和Tr1细胞。这表明，iTreg的抑制功能不依赖于细胞与细胞的接触机制。为了确认这种假设，在transwell板中将CD4⁺CD25^-GFP⁺iTreg与应答T细胞分开，并且然后检测抗原特异性应答T细胞的增殖水平。如图10B所示，T效应子也不能增殖，表明非接触抑制有助于iTreg介导的免疫耐受。另外，在该体系中IL-10的阻滞可显著逆转其抑制能力，并且TGF-β对抑制功能几乎无影响。缺乏细胞与细胞的接触逆转了nTreg介导的抑制，暗示nTreg抑制功能依赖于细胞因子信号转导和细胞与细胞的接触。总之，iTreg主要通过分泌IL-10的DC，而非TGF-β和阴性受体抑制应答T细胞。

实施例11

TGF-β和IL-10在CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg发育中的不同作用

据报道，IL-10，而非TGF-β为iTreg抑制功能的关键调节因子。但是，是TGF-β还是IL-10参与了iTreg的生成仍然未知。一些新近报道表明，TGF-β1可通过调节Foxp3表达促进Treg的发育，并且在自身免疫性或变应性疾病中，树突细胞自分泌的IL-10可诱导长效抗原特异耐受性。已经证实在首次联合免疫3天后可检测到iTreg，所以使用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为对RNA水平的内部对照，通过RT-PCR测定法测量CD11c⁺树突细胞中的TGF-β1和IL-10表达。如图11A所示，在pVAX-Derp1+Derp1联合免疫组中TGF-β1和IL-10的高表达水平升高。如先前所报道，视黄酸可直接促进初始T细胞经TGF-β1介导的Foxp3+Treg转化。从而通过RT-PCR检测RALDH1、RALDH2、RALDH3的表达水平，并且结果显示，在每一组中均未能检测到这3种视黄醛脱氢酶(数据未示出)，表明可能并非由这些RA转化酶引起对iTreg的诱导。

令人感兴趣的是确定中和内源性生成的TGF-β1或IL-10是否会降低对联合免疫小鼠体内iTreg的诱导。在按本领域已知的方式进行两次联合免疫的每一次后第0-3天，为小鼠重复注射抗TGF-β1mAb(2G7)、抗IL-10(2A5)或同种型对照抗体(IgG1)。通过经ELISA测量血清中的TGF-β1水平(图19A)和用Flex Set测量IL-10水平(图19B)分析各组中受抗TGF-β1mAb的中和作用。注射了对照抗体的小鼠并未影响iTreg发育。相反，在注射了抗TGF-β1mAb的小鼠体内，iTreg的发育和免疫抑制均被逆转(图11B)，表明在联合免疫期间，TGF-β1是诱导CD4⁺CD25^-iTreg中的Foxp3表达所必需的。为评估与IL-10的关系，将IL-10阻滞于iTreg的初期。结果显示，缺乏IL-10信号不能破坏CD4⁺CD25^-T细胞中的Foxp3表达(图12A)。然后检查这些iTreg是否保持了其抑制功能。为此，从经抗IL10mAb预处理的小鼠纯化CD4⁺CD25^-GFP⁺iTreg并且与应答CD4⁺T细胞一起共同培养。结果显示，IL-10信号的阻滞可部分破坏iTreg功能(图12B)，并且这种下调与iTreg分泌的IL-10减少有关(图12C)。

实施例12

DC分泌的TGF-β1直接将初始T细胞转化为iTreg

据报道，TGF-β和IL-10的阻滞可破坏iTreg的发育和抑制功能。另外，探究了这些细胞因子发挥其作用的阶段。用DCreg诱导iTreg，并且如图6a所示在不同阶段阻滞了TGF-β和IL-10。在DCreg体外诱导iTreg期间检测TGF-β和IL-10的作用。如图13A中的阶段1，与CD11C⁺DCreg共同培养72h后，在抗IL-10或抗TGF-β存在下每两天检测CD4⁺CD25^-T细胞中的GFP表达3次。用DNA和同源蛋白预处理这些DCreg48h。如图13B所示，TGF-β而非IL-10的阻滞可减少CD4⁺CD25^-GFP⁺iTreg的生成。为确认TGF-b在Foxp3诱导中的重要作用，使用SB-525334，一种有效的TGFβ受体激酶抑制剂，阻滞TGF-β信号途径。如图20所示，TGF-β受体的阻滞可降低iTreg诱导。为了检测中和IL-10时iTreg的抑制作用，在抗IL-10的存在下诱导与iTreg共同培养的应答T细胞的增殖。中和IL-10对iTreg功能没有影响(图21)。

虽然已经证明TGF-β1将外周初始CD4⁺CD25^-T细胞转化为CD4⁺CD25⁺Treg，但是其对单独CD4⁺CD25^-T细胞中Foxp3表达的诱导在很大程度上未知。为研究在抗原刺激存在下，单独的TGF-β1是否能够诱导CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg，分别在TGF-β1存在或缺乏时用抗CD3和抗CD28处理从Foxp3^gfp小鼠分离的CD4⁺CD25^-初始T细胞。如图13C所示，在TGF-β1的存在下，在CD25^-T细胞中，GFP表达以剂量依赖方式上调。为测试IL-10对Foxp3表达是否具有与TGF-β1的相似或协同作用，在上述体系中添加IL-10。如图13D所描绘，IL-10既不单独影响Foxp3的表达，也不具有与TGF-β1的协同作用。总之，由TGF-β而非树突细胞分泌的IL-10直接诱导CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg。

实施例13

自分泌IL-10调节联合免疫中DCreg的功能

基于以上结果，IL-10有助于诱导联合免疫中iTreg的抑制功能，但是并不直接对CD4+CD25-初始T细胞发挥其作用。因此，进一步检查了自分泌IL-10与DC功能的相关性。为此，如图13A所示，在阶段2检查了经抗IL-10或抗TGF-β预处理的DC指导初始T细胞分化的能力。在抗IL-10或抗TGF-β存在下用Derp1质粒和重组蛋白刺激初始CD11C⁺树突细胞，然后分3次将这些DCreg添加到初始CD4⁺CD25^-T细胞中。如图14A所示，不阻滞内源IL-10或TGF-β可使DCreg诱导CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg的能力变化。通过与应答T细胞一起共同培养来测试由不同树突细胞诱导的iTreg的功能结果。由结果发现，经抗IL-10预处理的树突细胞生成的iTreg的抑制能力显著降低(图14B)。自分泌IL-10可上调IL-10R表达，并且因此在联合免疫后的不同天数检查IL-10R表达。如图14C所示，结果证明，联合免疫后细胞表面IL-10R的量增加，并且在第3天达到峰值水平。为确认IL-10R的功能，通过经siRNA进行IL-10R的树突细胞敲低测定iTreg诱导功能。通过FACS评估对IL-10R表达的抑制作用(图22)。如图14D和E所示，在IL-10R缺乏时，树突细胞降低了增强iTreg抑制功能的能力，但是不影响Foxp3诱导。IL-10与其受体的结合导致JAK1和酪氨酸激酶2的活化，并且然后导致STAT-1和STAT-3的募集和磷酸化。对Dcreg中的蛋白质表达进行蛋白质印迹分析，并且发现在用DNA和蛋白质同时刺激后抑制了STAT-1的磷酸化，接着CD40下调。概括地说，自分泌IL-10和IL-10R作为DCreg发育的相关调节环。

该实施例证明，用DNA和蛋白质疫苗同时联合免疫诱导了展现出CD4⁺CD25^-Foxp3⁺表现型的抑制CD4T细胞亚群。在肺部由HDM诱导的变应性免疫应答中，评估了联合免疫的免疫调节作用。结果表明，联合免疫可能不仅有助于显著限制肺部的炎症反应，而且有助于Th2细胞因子的抑制和IgE的生成。

功能上，当与CD4⁺CD25^-应答T细胞一起共同培养时，CD4⁺CD25^-GFP⁺和CD4⁺CD25⁺GFP⁺Treg均可抑制靶T细胞的增殖。因为CD4⁺CD25⁺T细胞的百分比和Foxp3表达无明显上调，所以这种抑制活性可能主要归因于赋能细胞的CD25^-亚群。另外，用抗CD25mAb阻滞CD4⁺CD25⁺T细胞不可逆转经联合免疫诱导的免疫耐受。

通过FACS分析，iTreg表现型为CD4⁺CD25^-Foxp3⁺CTLA4^-GITR^-PD-1^-。在表面存在这些众所周知的nTreg标记的低表达，表明iTreg主要通过抑制细胞因子，而非细胞与细胞的接触发挥其作用。为确认这种结论，在transwell板中培养iTreg和应答T细胞，并添加IL-10或TGF-βmAb。结果证明，iTreg的抑制功能不依赖于IL-10。

Foxp3通过形成与CD25、CTLA-4和GITR靶基因的启动子结合的NFAT:Foxp3复合物调节小鼠体内CD25的表达。另外，ChIP分析还显示，当NFAT活化时稳定了Foxp3与IL-2R(CD25)、CTLA-4和Treg中其它靶基因的结合。因此，假设在Foxp3的存在下，NFAT1减少牵涉CD25、GITR和CTLA-4的下调。可将NFAT活化评定为NFAT的核易位。为测试在CD4⁺CD25^-GFP⁺和CD4⁺CD25⁺GFP⁺T细胞中NFAT活化不同的假设，对来自这些细胞的分离核和细胞质溶解产物进行免疫印迹分析。在无刺激时，在CD4⁺CD25^-GFP^-和CD4⁺CD25^-GFP⁺T细胞中仅发现低水平的核NFAT1。相反，在CD4⁺CD25⁺GFP⁺nTreg中检测到较高水平的核NFAT1。相应地，在CD4⁺CD25⁺GFP⁺的细胞质部分中看到比CD4⁺CD25^-GFP⁺和CD4⁺CD25^-GFP^-T细胞中水平更低的NFAT1(图14D)，表明在T细胞或CD4⁺CD25^-GFP⁺iTreg中保持NFAT1呈其非活性状态。另一方面，在CD4⁺CD25⁺nTreg发育中通过Smad3和NFAT2的协作来诱导Foxp3表达。因此分析了核NFAT2的水平。正如预期的，不论CD25是否表达，在来自CD4⁺GFP⁺T细胞的核部分中NFAT2的水平可检测。在所有这3种亚型的T细胞中不可检测到细胞质溶解产物中的NFAT2。总之，这些数据说明了与CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺nTreg和CD25^-Th细胞相比，对CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg中NFAT活化的差异性调节。

上述结果说明，TGF-β1有助于联合免疫中CD4⁺CD25^-T细胞中的Foxp3表达。当在抗TGF-β1中和抗体的存在下时影响了iTreg的生成。发起用体外DCreg诱导iTreg期间在不同阶段阻滞TGF-β1。结果证明，分泌TGF-β1的DC直接诱导CD4⁺CD25-Foxp3⁺iTreg。另外，在牵涉抗CD3和抗CD28刺激的条件下，TGF-β1也可诱导在单独CD4⁺CD25^-T细胞中的Foxp3表达。与TGF-β1不同，在CD4⁺CD25^-T细胞中IL-10不能诱导Foxp3，但是IL-10的阻滞可破坏iTreg的抑制功能。结果证明，IL-10有助于发起iTreg的抑制能力。自分泌IL-10削弱树突细胞DC源免疫应答。分别在初始T细胞和DC上阻滞IL-10作用。结果显示，IL-10有助于诱导未成熟的树突细胞，并且然后增强iTreg的抑制能力，而不直接影响iTreg。

概括地说，该实施例证明，用Der-p1DNA疫苗及其同源重组蛋白的联合免疫方法诱导了CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg。在联合免疫中，TGF-β1和IL-10均是这些iTreg发育的关键因素。另外，TGF-β1和IL-10对CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg的发育和抑制功能发挥其作用。因为联合免疫通过TGF-β1和IL-10诱导CD4⁺CD25^-Foxp3⁺iTreg，这公开了用于治疗自身免疫性、慢性炎症和变应性疾病的新型治疗方案。

实施例14

实施例15-19的材料和方法

小鼠和试剂

雌性BALB/c和C57BL/6小鼠(8-10周龄)来自中国医学科学院动物研究所(Animal Institute of Chinese Medical Academy)(中国北京)。所有动物均接受无病原体的水和食物。

从BD Biosciences(San Diego,CA,USA)购买Flexset IL-10和荧光标记的抗小鼠单克隆抗体，包括抗IL-10-藻红蛋白(PE)、抗FoxP3-别藻蓝蛋白(APC)、抗IL-10-APC、抗CD40-APC、抗CD11c-APC、抗CD11c-异硫氰酸荧光素(FITC)、抗CD40-PE和同型对照。从Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)购买Alexa Fluor546(AF)标记的山羊抗兔IgG。从Molecular Probes(Eugene,OR,USA)获得羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)。从Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)购买抗IRAK-1、小窝蛋白-1、磷酸-小窝蛋白-1Tyr14、Tollip、SOCS-1、NF-κB p65、磷酸-NF-κB p65^Ser536、STAT-1α、磷酸-STAT-1α^Tyr701和-STAT-1α^Ser727、CD40、GAPDH和组蛋白的抗体。从Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo,USA)购买大肠杆菌LPS、5-(N,N-二甲基)阿米洛利盐酸盐、单丹磺酰尸胺(MDC)和菲里平。

疫苗制剂

通过消化分别将完整鸡卵清蛋白(OVA)的编码DNA序列或其优势表位(在aa323-339区)插入pVAX1(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA,USA)的Xba I和Hind III位点来获得DNA疫苗、pVAX-OVA(指定为pOVA)和pVAX-OVA323(指定为pOVA323)。将OVA编码序列的反向链克隆至pVAX中并获得非表达pVAX-OVArev(指定为pOVArev)。制备编码小鼠透明带3(ZP3)的pcD-mZP3和在大肠杆菌中表达的mZP3重组蛋白并且在我们先前的报道13中有描述。从Sigma-Aldrich购买OVA并且由吉尔生化有限公司(GL Biochem Co.,Ltd.)(中国上海)合成OVA肽(aa323-339，命名为OVA₃₂₃)或FITC标记的OVA₃₂₃。用无内毒素质粒大量提取试剂盒(EndoFree Plasmid Maxi Kit)(QIAGEN,日本东京)纯化全部质粒以去除内毒素并通过按2mg/ml溶于PBS中用作DNA疫苗。按2mg/ml将重组蛋白和肽溶于PBS中并通过过滤灭菌。

JAWS II树突细胞的培养和刺激

从美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)(ATCC,Manassas,VA,USA)购买JAWS II小鼠DC系并且保持于含有具有核糖核苷、脱氧核糖核苷、4mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA,USA)的最低必需培养基(MEM)α并且补充了20%胎牛血清(ATCC)和5ng/ml鼠重组GM-CSF(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN,USA)的完全生长培养基中。在37℃、5%CO2下培育细胞并且用不同抗原(10μg/ml)，例如pVAX、pOVA、OVA、pOVA323和OVA323处理24h。对于抑制剂处理，在37℃下分别用菲里平(10μg/ml)、MDC(50μM)预处理JAWS II细胞30分钟，或在37℃下用阿米洛利(5mM)预处理JAWS II细胞10分钟，并且用培养基洗涤，然后用抗原刺激。

JAWS II中Cav-1和Tollip的沉默和用DNA和蛋白质处理

用10μg/ml pOVA₃₂₃和OVA₃₂₃或pVAX和OVA₃₂₃共同处理野生型(WT)或Cav-1和/或Tollip缺陷型DC24h。对于DCreg的体外功能，从用于弗氏不完全佐剂(IFA)中的OVA免疫的小鼠脾脏中纯化CD4+T细胞并且用CFSE标记。CFSE-CD4+T细胞与经共同处理的DC一起共同培养5天，并且然后检测T细胞增殖和Foxp3和IL-10表达。对于DCreg的体内功能，将2×10⁶个经共同处理的DC转移至同系C57BL/6小鼠体内并且在第0和7天用IFA中的OVA使这些小鼠免疫。在第14天，向爪垫为小鼠注射25μg OVA以测试迟发型超敏(DTH)反应。在第15天，处死小鼠以检测T细胞增殖和Foxp3和IL-10表达。

对细胞因子的半定量RT-PCR分析

使用TRIzol试剂(Promega,Wisconsin,USA)从约5×10⁶个细胞分离出总RNA。通过半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞因子特异性mRNA的量。使用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、管家基因或细胞因子基因的引物。表S1中列出了引物的序列和PCR条件。

蛋白质印迹

通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质样品，接着转移至硝化纤维素膜上并且用作为上样参考的特异性抗体和抗肌动蛋白Ab检测。对于NF-κB的检测，提取细胞质和核蛋白。通过免疫印迹分析核和细胞质提取物。用ECL(GE HealthcareEurope,Uppsala,Sweden)方法进行蛋白质检测。

对小鼠炎症性支气管炎和自身免疫性卵巢疾病(AOD)的诱导

如先前所述并做一些修改对BALB/c小鼠诱导炎症性支气管炎。简言之，在第0和7天经腹膜内为小鼠注射100μg OVA(0.1ml于PBS中的1mg/ml OVA/明矾复合物)。接着在某些天经气管内向每只动物递送100μg(100μl，1mg/ml)OVA。对照小鼠接受PBS。如先前所述11对C57BL/6小鼠诱导AOD。

组织学分析

将肺部或卵巢于4%多聚甲醛或布安溶液(Bouin’s solution)中固定并埋在石蜡块中。切片并且用苏木精和伊红(H&E)染色。在光学显微镜下评估肺部或卵巢的组织病理学。

流式细胞术(FACS)分析

根据先前的研究，在4℃下用于PBS中的适当PE、FITC或APC偶联mAb为DC或T细胞染色30分钟。用FlowJo分析细胞。

使用多重流式细胞测定法(Th1/Th2细胞因子CBA试剂盒，BDBiosciences)测试免疫小鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF)-γ、IL-4、IL-5和干扰素(IFN)-γ的生成。

统计学

用学生t检验进行数据分析。如果p<0.05，认为差异在统计上显著。

实施例15

CD40^低是联合免疫诱导DCreg的标志

经证明在序列匹配DNA和蛋白质免疫原联合免疫后在体内诱导了CD11c+CD40低IL-10高DCreg。为测试低CD40表达是否是联合免疫诱导DCreg的可靠表现型，构造编码全长鸡卵清蛋白(pOVA)的真核表达构建体并且与蛋白质(OVA)结合使用。向一组小鼠经肌肉内共同注射pOVA和OVA(pOVA+OVA)。作为基因特异性的对照，向另一组小鼠共同注射含有OVA非编码链的DNA构建体(pOVArev)和OVA(pOVArev+OVA)。在第2天，从两个组和一组未注射小鼠(首次接受实验)分离DC，并通过FACS比较其CD40表达。pOVA+OVA组中CD40的表达比首次接受实验的组高，但是比pOVArev+OVA组低(图30A)，确认了CD40低表现型。我们还测试了DNA和蛋白质免疫原的另外组合，由编码鼠ZP3的DNA构建体和ZP3蛋白组成，并且观察到相似结果(图23A)。这些结果表明，低CD40表达是经序列匹配DNA和蛋白质免疫原联合免疫诱导的一致表现型。

在培养物中用原代DC和DC系JAWS II重复实验。将pOVA和OVA或pVAX和OVA(对照)直接添加到新分离的CD11c+细胞和JAWS II细胞中24h。结果显示，在两种细胞类型中，在pOVA+OVA处理后CD40表达比在对照处理后低(图23B)，表明也可在培养的原代DC和DC系中体外诱导CD40低表现型。

我们先前的研究显示，经联合免疫在体内诱导的DCreg可在体内和体外将初始T细胞转化为Treg。为确定体外诱导的CD40^低DC是否也可一样，我们通过使其与来自OVA致敏的CFSE标记同系CD4+T细胞共同培养测试了CD40^低JAWS II细胞的活性。共同培养5天后，分析CFSE+细胞中Foxp3和IL-10的表达。结果显示，CD40^低JAWS II细胞引起Foxp3+和IL-10+T细胞扩展(图23C)，确认了体外生成的CD40^低DC实际上是DCreg。

因为CD40^低表现型的出现需要DNA和蛋白质之间序列匹配，所以可能需要由相同DC摄取DNA和蛋白质。为测试这一假设，用具有FITC的Cy5和OVA₃₂₃(OVA_323-339肽)标记pOVA₃₂₃(编码OVA_323-339优势表位的DNA构建体)和pVAX(空载体)。如图23D所描绘，如通过共聚焦显微镜术所观察到的，仅在摄取Cy5-pOVA₃₂₃和FITC-OVA₃₂₃的单独DC中观察到CD40的低表达。总之，这些结果表明，CD40^低是经联合免疫生成的DCreg的可靠标志，因为这种标志的呈现需要共同摄取序列匹配DNA和蛋白质免疫原。

实施例16

DC通过网格蛋白和小窝介导的胞吞作用共同摄取DNA和蛋白质免疫原

DC通过各种机制，包括网格蛋白介导的胞吞作用、小窝介导的胞吞作用和巨胞饮作用摄取外源性抗原。为明确DNA和蛋白质免疫原的共同摄取牵涉哪些途径，在用pOVA₃₂₃+OVA₃₂₃处理之前，用MDC(网格蛋白形成的特异性抑制剂)或菲里平(小窝运输的抑制剂)预处理JAWS II细胞。使用CD40^低作为标志，并且虽然MDC和菲里平均可防止CD40^低表现型，但是菲里平比MDC更有效。这表明，CD40^低表现型主要是小窝介导的胞吞作用的结果(图24，A&B)。另一种抑制剂，阿米洛利，一种巨胞饮作用的抑制剂，对CD40表达没有影响(图30)。

实施例17

联合免疫通过活化负信号途径下调NF-κB和STAT-1α

转录因子NF-κB调节CD4023、24和IRAK-1的表达，调节NF-κB的活化。有趣的是，先前经证实小窝的一种组分，小窝蛋白-1(Cav-1)与Tollip形成复合物以抑制IRAK-1在稳态条件下的激酶活性。与从经pOVA、OVA或pVAX+OVA处理的小鼠分离的脾脏DC相比，在从经pOVA+OVA处理的小鼠分离的脾脏DC中Cav-1Tyr14的磷酸化受强烈抑制(图25A)。在培养中供给了pOVA+OVA的JAWS II细胞中也看到缺乏磷酸化Cav-1(图31A)。

之后，我们研究了响应于pOVA+OVA联合免疫在脾脏DC中Tollip的表达和IRAK-1的活化。我们观察到，在联合免疫小鼠中Tollip、TGF-γ和IL-10的转录也上调；然而CD40和TNF-γ的转录下调(图25B)。在培养中供给了pOVA+OVA的JAWS II细胞中也观察到相似结果(图31B)。在联合免疫小鼠中IRAK-1的磷酸化也受显著抑制(图25A)，这与Cav-1磷酸化抑制和Tollip增多很好吻合。

因为SOCS负向调节IRAK和JAK-STAT途径的活化，所以分析了SOCS1蛋白质的水平。响应于pOVA+OVA联合免疫，SOCS1显著增多(图25A)。总之，这些结果表明，联合免疫改变了Cav-1的磷酸化和Tollip和SOCS1的表达以活化负信号转导。

接下来，分析了转录因子NF-κB和STAT-1α的活化。在pOVA+OVA联合免疫小鼠中NF-κB p65^Ser536和STAT-1α^Tyr701的磷酸化受强烈抑制(图25C)。因为在联合免疫组中，核中NF-κB p65和STAT-1α的浓度降低，所以NF-κB和STAT-1α的易位也受到抑制(图25D)，表明联合免疫后NF-κB和STAT-1α的活化下调。

总之，这些结果证明，联合免疫活化了Cav-1介导的负向途径，导致NF-κB和STAT-1α的活性下调并且CD40表达减少。

实施例18

Cav-1和Tollip沉默防止了DCreg的诱导

为了确定Cav-1和Tollip在DCreg诱导中的作用，我们使用RNA干扰(RNAi)使Cav-1和Tollip的表达沉默。对于JAWS II细胞中的两种基因而言，RNAi效率达到约80%(图32a)。当供给pOVA323+OVA323时，通过依据沉默后CD40表达增加和IL-10生成减少判断，Cav-1和Tollip的沉默彻底防止了JAWS II细胞分化为DCreg，然而单独的Cav-1或Tollip的沉默部分有效(图26a)。进一步地，Cav-1沉默后，NF-κB的易位增强而Tollip的生成减少(图32b)。

功能上，在共同培养测定中Cav-1和/或Tollip缺陷型和经pOVA323+OVA323处理的JAWS II细胞不能抑制应答T细胞的增殖，或诱导iTreg转化或IL-10表达(图26b)。这些数据显示，联合免疫后Cav-1和Tollip均在DCreg表现型的诱导和功能上起关键作用。

实施例19

Cav-1和/或Tollip缺陷型DC在体内无致耐受性

为确定Cav-1和/或Tollip缺陷型JAWS II细胞是否已经失去其在体内促进耐受性的能力，在用pOVA323+OVA323处理后我们将其转化至同系小鼠体内。然后用于IFA中的OVA通过免疫激发受体小鼠。虽然用经pOVA323+OVA323处理的野生型JAWS II细胞转化的对照小鼠抑制DTH和OVA反应性T细胞的诱导并且增强了CD4+CD25-T细胞(CD25-iTreg)中Foxp3的表达和IL-10的生成，但是沉默JAWS II并不如此(图27)。该结果确认沉默JAWS II细胞无致耐受性。

实施例20

联合免疫诱导的DCreg改善了小鼠的炎症性支气管炎和自身免疫性卵巢疾病

为评估联合免疫诱导的DCreg作为炎症性和自身免疫性疾病的治疗剂的可能性，我们为培养的原代DC供给pOVA+OVA并使用所得DCreg治疗有OVA诱导型炎症性支气管炎的BALB/c小鼠(图28A)。过继转移DCreg使受体小鼠体内IgE的水平显著降低(图28B)。虽然并未达到统计显著性，但是在受体小鼠体内IL-4和IL-5的水平也降低(图28C)。对来自小鼠的肺部切片的组织学分析揭示出无细胞浸润的近正常肺部形态(图28D)。正如预期的，如果用菲里平预处理DC，则经pOVA+OVA处理的DC没有抗炎作用。

为确定是否可用DC系重现相似治疗效果，我们为培养的JAWSII细胞供给pcD-mZP3、编码小鼠ZP3蛋白的DNA构建体和mZP3蛋白(pcD-mZP3+mZP3)。将所得DCreg过继转移至有mZP3诱导的自身免疫性卵巢疾病(AOD)的C57BL/6小鼠体内(图29A)。随后，我们观察到受体小鼠体内IFN-γ、IL-5和TNF-α生成减少(图29B)和AOD严重程度降低(图29C)。对卵巢切片的组织学分析揭示无明显细胞浸润的近正常组织结构(图33)。对脾脏的FACS分析进一步显示IL-10+和Foxp3+CD4+T细胞的频率增加(图29D)。总之，这些结果表明，通过为原代DC或DC系供给序列匹配的DNA和蛋白质免疫原在培养物中生成的DCreg可能对过继性免疫疗法有用。

Claims (30)

1.一种能够抑制自身免疫性疾病的疫苗，包含抗原肽和编码所述肽的DNA，其中所述抗原肽/DNA刺激iTreg细胞。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原与选自变态反应、哮喘和自身免疫性疾病的病状相关。

3.根据权利要求2所述的疫苗，其中所述抗原与变态反应或哮喘相关并且选自屋尘螨1肽、其片段及其变体。

4.根据权利要求2所述的疫苗，其中所述抗原与自身免疫性疾病相关并且选自胰岛素肽、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白和少突胶质细胞特异性蛋白、透明带蛋白肽、屋尘螨1肽、α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽、A群链球菌M5蛋白肽、(Q/R)(K/R)RAA、II型胶原蛋白肽、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、乙酰胆碱受体肽、人S抗原、其片段及其变体。

5.根据权利要求1所述的疫苗，其中载体包含所述DNA。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述载体选自pVAX、pcDNA3.0和provax。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其中所述载体和抗原肽的质量比选自5∶1和1∶5；和1∶1和2∶1。

8.一种疫苗接种试剂盒，包含疫苗施用设备和根据权利要求1所述的疫苗。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述疫苗施用设备选自疫苗枪、针和电穿孔设备。

10.一种治疗自身免疫性疾病的方法，包括向有需要的患者施用根据权利要求1所述的疫苗。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为I型糖尿病。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗原选自胰岛素肽、其片段或其变体。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为多发性硬化。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗原选自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白和少突胶质细胞特异性蛋白。

15.根据权利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为自身免疫性卵巢疾病。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗原选自透明带蛋白肽、其片段及其变体。

17.根据权利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为尘螨变态反应。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗原选自屋尘螨1肽、其片段及其变体。

19.根据权利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为心肌炎。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗原选自α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽、A群链球菌M5蛋白肽、其片段及其变体。

21.根据权利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗原选自肽(Q/R)(K/R)RAA、II型胶原蛋白肽、其片段及其变体。

23.根据权利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为甲状腺炎。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗原选自甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、其片段及其变体。

25.根据权利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为重症肌无力。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗原选自乙酰胆碱受体肽、其片段及其变体。

27.根据权利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为自身免疫性葡萄膜炎。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗原选自人S抗原、其片段及其变体。

29.根据权利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为哮喘。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗原选自屋尘螨1肽、其片段及其变体。

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