CN100571786C

CN100571786C - 一种预防和/或治疗自身免疫疾病的疫苗

Info

Publication number: CN100571786C
Application number: CNB200710064769XA
Authority: CN
Inventors: 王宾; 金华利; 康友敏; 张文娟; 于杨; 李金耀
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2007-03-26
Filing date: 2007-03-26
Publication date: 2009-12-23
Anticipated expiration: 2027-03-26
Also published as: US20130089566A1; CA2681775C; JP2010522220A; JP5524823B2; CA2681775A1; WO2008116380A1; EP2140884A1; CN101020063A; US20100143401A1; EP2140884B1; EP2140884A4

Abstract

本发明公开了一种预防和/或治疗自身免疫疾病的疫苗，它的活性成分是由造成自身免疫疾病的蛋白抗原胰岛素或其表位多肽和在多克隆位点插入自身蛋白抗原胰岛素或其表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物；所述胰岛素的表位多肽是序列表中的序列1。该疫苗可抑制免疫动物和人体的T细胞增殖，诱导免疫抑制的产生，并能够有效地预防和/或治疗自身免疫疾病。

Description

一种预防和/或治疗自身免疫疾病的疫苗

技术领域

本发明涉及一种预防和/或治疗自身免疫疾病的疫苗。

背景技术

自身免疫疾病是由自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。自身免疫疾病是常见病，如I型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、卵巢炎、心肌炎、慢性甲状腺炎、重症肌无力、红斑狼疮、毒性弥漫性甲状腺肿Graves’病、干燥综合征、葡萄膜视网膜炎等。我国患病率超过5％。治疗此类疾病主要是使用免疫抑制剂，在临床上通常使用的免疫抑制剂和方法有如下几个方面：利用化学药品如：普乐可复(FK506)，环孢素A(CsA)，骁悉(MMF)，硫唑嘌呤(Aza)，强的松(Pred)，早基强的松龙(MP)；利用抗体如：抗淋巴细胞球蛋白(ALG)，抗CD4单克隆抗体(OKT4)。每年治疗费用在几十亿元。但以上的免疫抑制剂都有其毒副作用，若使用不当，一方面可因过度抑制机体免疫反应性而引发多种并发症，另一方面也可因其自身的毒副作用导致抑制器官功能衰竭。所以，目前无特效的治疗手段。

I型糖尿病以CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞和巨噬细胞浸润胰岛而造成胰岛中产生胰岛素的细胞被破坏为特征的一类自身免疫疾病。它约占所有糖尿病患者的5-10％(ADA[American Diabetes Association].1997.Report of the expert committee on thediagnosis and classification of diabetes mellitus.Diabetes Care20：1183-1197；Atkinson MA，Leiter EH.1999.The NOD mouse model of type 1diabetes：As good as it gets？Nature 5：601-604)。主要发病机理是自身反应的T淋巴细胞破坏了胰腺中产生胰岛素的细胞引起的，以CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞和巨噬细胞浸润胰岛而造成胰岛中产生胰岛素的细胞被破坏为特征的一类自身免疫疾病(Atkinson MA，Maclaren NK.1994.The pathogenesis of insulin-dependentdiabetes mellitus.N Engl J Med 331：1428-1436；Benoist C，Mathis D.1997.Autoimmune diabetes：Retrovirus as trigger，precipitator or marker？Nature388：833-834；Bjork S.2001.The cost of diabetes and diabetes care.DiabetesRes Clin Pract 54(Suppl 1)：13-18)。在欧洲后裔中发病率较高，约有200万患者。具有发病率明显的地理分布特点：芬兰儿童中I型糖尿病的发病率是委内瑞拉儿童的400倍。有报道称，I型糖尿病的全球发病率在2010年将比在1998年提高40％。这个快速的增长速度表明，环境因素作用于易患基因，共同引起了1型糖尿病的发病率上升。

人们已经发现I型糖尿病胰岛炎现象，即淋巴细胞浸润胰岛，以后相继在I型糖尿病患者中发现了抗胰岛细胞自身抗体(ICA)，对胰岛素、羧肽酶、热休克蛋白产生自主反应的T细胞，至1990年Beakkeskov证明I型糖尿病患者血清中存在的64K抗体就是谷氨酸脱羧酶(GAD)自身抗体和自主反应的T细胞，认为GAD是I型糖尿病自身免疫反应的关键抗原(Immune modulation for prevention of type 1 diabetesmellitus.Itamar Raz1，Roy Eldor2 and Yaakov Naparstek.TRENDS inBiotechnology 23：128，2005.龙秀荣，杜文斌，苏钟浦，魏庆琤.儿童糖尿病的谷氨酸脱羧酶抗体检测.中华儿科杂志.1998年第10期)。

目前临床上主要是给与胰岛素的补偿性治疗，但是还没有能够预防或延缓发病的好方法。围绕1型糖尿病的研究方向有很多，主要目标是抵抗自身免疫的发生，到晚期也有采取诱导细胞再生等方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防和/或治疗自身免疫疾病的疫苗。

本发明所提供的预防和/或治疗自身免疫疾病的疫苗，它的活性成分是下述混合物：造成自身免疫疾病的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位点插入自身蛋白抗原或其表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物；

所述自身蛋白抗原为胰岛素、谷氨酸脱羧酶、热休克蛋白、髓磷脂寡突细胞糖蛋白(MOG)、二种髓磷脂抗原(MBP和PLP蛋白脂蛋白)、卵透明带蛋白3(ZP3)、肌球蛋白、H型胶原蛋白、甲状腺球蛋白、细胞膜表面抗原、第二型胶质抗原(CA2)、乙酰胆碱受体、甲状腺细胞表面抗原(TSH)、唾液腺管蛋白、甲状腺球蛋白、抗原包括超抗原(S-Ag)或感光器间受体树脂样结合蛋白。

上述预防和/或治疗自身免疫疾病的疫苗具体可为预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗。

所述预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗，它的活性成分是下述任一种混合物：

1)I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物；

2)I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物；

3)I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物；

4)I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物；

所述I型糖尿病自身蛋白抗原为胰岛素或谷氨酸脱羧酶或热休克蛋白。

在共免疫组合物中，也可以采用I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。此混合物同样可以产生调节性T细胞而抑制I型糖尿病发生。

同样，也可以采用I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。此混合物同样可以产生调节性T细胞而抑制I型糖尿病发生。

采用以上两种混合物免疫产生的效果与I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物产生的效果相同。

其中，所述胰岛素可来源于人、狗、猫。人的胰岛素可以用于小鼠的I型糖尿病治疗。人、狗、猫和鼠的基因序列非常相似。在核酸序列水平上，鼠与人胰岛素相似性为95％，猫与人的相似性为84％，狗与人的相似性为89％。

所述谷氨酸脱羧酶可来源于人、狗、猫。人的谷氨酸脱羧酶也用于小鼠I型糖尿病治疗。在核酸序列水平上，两者的序列相似度为90％。

所述热休克蛋白可来源于人、狗、猫。

所述I型糖尿病自身蛋白抗原具体可为人胰岛素。所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽的氨基酸序列是序列表中的序列1，该多肽的名称为B9-23。用于插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原编码基因或所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体可为哺乳动物细胞表达载体，如pcDNA3.0或pVAX1或provax(涂亦娴，金华利，张馨玉，杨若耶，杨富，张富春，王宾。猪瘟病毒E2基因真核表达载体表达效率和免疫效果的比较。中国农业大学学报，2005，10(6)：37-41)。

所述预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗的活性成分具体可为人胰岛素蛋白和pVAX-insulin，还可为B9-23和pcDB9-23。

所述预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗的活性成分中，1)I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1-1∶2；

2)I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1-1∶2；

3)I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1-1∶2；

4)I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1-1∶2。

所述预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

所述预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗的用量一般为200ug-10mg活性成分/kg体重/次，每7-30天给药一次，一般共需2-5次。

小鼠实验证明，I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物，和I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物，可抑制免疫小鼠的T细胞增殖，诱导免疫抑制的产生，并能够有效地预防I型糖尿病的发生。同理，此疫苗方法和手段也可以用于对于其它由于自身抗原诱发的自身免疫性疾病。

附图说明

图1a为pVAX-insulin的EcoR I和Xho I酶切鉴定结果。

图1b为pcDB9-23载体的EcoR I和Xho I酶切鉴定结果。

图1c为RT-PCR方法分析pVAX-insulin在BHK21细胞中的表达。

图2a为刺激48小时的pcDB9-23和B9-23共免疫组的T细胞增情况。

图2b为刺激96小时的pcDB9-23和B9-23共免疫组的T细胞增情况。

图3a为刺激48小时的各免疫组的T细胞增情况

图3b为在图3a中各免疫组的T细胞增情况比较。

图3c为在不同共免疫组中不同免疫剂量的T细胞增情况比较。

图4为预防NOD小鼠发病的比较实验。

图5为免疫的NOD小鼠的胰腺组织切片HE染色结果。

图6a为小鼠MZP3基因序列与绒猴、人、狗、猫、二花脸猪和亚洲原牛同的核酸源性分析。MZP3：小鼠；Marmosets：绒猴；Human：人；Canis familiaris：狗；felis catus：猫；Sus scrofa：二花脸猪；Bos taurus：亚洲原牛。

图6b为小鼠MZP3基因序列与绒猴、人、狗、猫、二花脸猪和亚洲原牛的氨基酸序列同源性分析。MZP3：小鼠；Marmosets：绒猴；Human：人；Canis familiaris：狗；felis catus：猫；Sus scrofa：二花脸猪；Bos taurus：亚洲原牛。

图7为真核表达载体pcDmzp3的鉴定及表达分析。(a)载体用EcoR I和Xho I进行酶切分析。M：DNA标准分子量(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)；1，2：重组质粒pcDmzp3用EcoR I和Xho I进行酶切。(b)RT-PCR方法分析pcDmzp3在BHK21细胞中的表达。M：DNA标准分子量(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)；1：pcDmzp3转染的细胞MZP3的表达；2：未转染的细胞对照。

图8为原核表达载体pGEX-4T-1/MZP3的鉴定，蛋白表达及纯化。(a)重组质粒pGEX-4T-1/MZP3的酶切鉴定。M：DNA标准分子量(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)；1，2：重组质粒pGEX-4T-1/MZP3用EcoR I和Xho I进行酶切。(b)蛋白的诱导表达。M：蛋白标准分子量；1：未经IPTG诱导的全菌蛋白；2：IPTG诱导的全菌蛋白；3：超声破碎的上清蛋白；4：超声破碎的沉淀蛋白。(c)纯化后的MZP3蛋白。M：蛋白标准分子量；1：纯化后的蛋白蛋白样品。箭头指向目的条带。

图9a为自身免疫疾病卵巢炎的发病率和严重程度。C57BL/6小鼠通过脚掌和肌肉注射100ul PBS为阴性对照组，只注射100ul弗氏完全佐剂(CFA)的小鼠为佐剂组，注射100ul的含100μg MZP3蛋白的CFA乳化液。

图9b为注射后14天检测卵巢组织学变化。C57BL/6小鼠通过脚掌和肌肉注射100ul PBS为阴性对照组，只注射100ul弗氏完全佐剂(CFA)的小鼠为佐剂组，注射100ul的含100μg MZP3蛋白的CFA乳化液。阴性对照组，正常卵巢组织；CFA，只注射CFA的小鼠卵巢组织，卵巢没有炎症反应；长箭头表示正在生长的卵泡，箭头表示原始卵泡(放大倍数为100和400倍)；MZP3，卵巢出现了炎症细胞的浸润，严重的丢失了卵子。

图9c为抗体滴度(每组3只小鼠)。C57BL/6小鼠通过脚掌和肌肉注射100μgMZP3蛋白和CFA，对照为只注射CFA的小鼠。注射14天后收集血清并通过ELISA的方法检测抗体，抗体滴度根据OD值进行计算。

图9d为来自腿弯处淋巴结淋巴细胞对MZP3蛋白的特异性T细胞反应。C57BL/6小鼠通过脚掌和肌肉注射100ul PBS为阴性对照组，只注射100ul弗氏完全佐剂(CFA)的小鼠为佐剂组，注射100ul的含100μg MZP3蛋白的CFA乳化液。T细胞从小鼠中分离(每组3只)，体外用MZP3蛋白作为特异性抗原进行刺激并用CFSE方法进行检测。图中的百分数为增殖程度，数值越大表明增殖程度越高，M1表示细胞增值的百分比。

图10a为细胞因子IL-2的表达。C57BL/6小鼠通过脚掌和肌肉注射100ul PBS为阴性对照组(

)，只注射100ul CFA的小鼠为佐剂组，注射100ul的含100μgMZP3蛋白的CFA乳化液。

图10b为用流式细胞仪分析IFN-γ的表达。注射14天后，T细胞从C57BL/6小鼠的脾脏和腿弯处淋巴结分离并用MZP3蛋白在体外刺激8小时。用胞内染色的方法分析CD4+细胞INF-γ的表达和总细胞IL-12的表达。阳性细胞的百分率显示在图中。a，淋巴节；b，脾脏。

图10c为用流式细胞仪分的IL-12的表达。注射14天后，T细胞从C57BL/6小鼠的脾脏和腿弯处淋巴结分离并用MZP3蛋白在体外刺激8小时。用胞内染色的方法分析CD4+细胞INF-γ的表达和总细胞IL-12的表达。阳性细胞的百分率显示在图中。a，淋巴节；b，脾脏。

图11a为和对照组相比，共免疫pcDmzp3和MZP3蛋白组AOD被减轻了。

图11b为第二次免疫后第7天的卵巢组织学检测

图11c为用流式细胞仪检测细胞因子IL-12的表达。A，淋巴结；B，脾脏。

图11d为用流式细胞仪检测细胞因子INF-γ的表达。A，淋巴结；B，脾脏。

图11e为共免疫DNA和蛋白诱导了抗原特异性的免疫抑制。比较共免疫了抗原匹配型和抗原错配型DNA和蛋白小鼠的T细胞扩增情况。第二次免疫后第7天分离T细胞，体外用特异性抗原MZP3蛋白重新刺激，BSA作为无关蛋白对照，Con A作为阳性对照。用MTT方法进行检测并以刺激指数的方式表示。

图11f为用ELISA法检测血清中的抗体水平。

图12a为共免疫诱导的调节性T细胞表达IL-10。第二次免疫后第7天分离T细胞并用流式细胞仪分析细胞因子IL-10和FoxP3的表达。A，淋巴结；B，脾脏。

图12b为共免疫诱导的调节性T细胞表达FoxP3。第二次免疫后第7天分离T细胞并用流式细胞仪分析细胞因子IL-10和FoxP3的表达。A，淋巴结；B，脾脏。

图13为共免疫没有改变CD4⁺CD25⁺细胞的数量。从免疫不同组合的小鼠中分离T细胞，抗CD4和抗CD25的单克隆抗体进行染色，用流式细胞仪进行分析。A，淋巴结；B，脾脏。

图14为质粒T-MOG352c的酶切鉴定结果。

图15为质粒pVAXMOG352c的酶切鉴定结果。

图16为质粒pVAXMOG352c在BHK21细胞的瞬时表达结果。

图17为免疫诱导小鼠EAE模型的发病情况，纵坐标为发病指数，横坐标为天数。

图18为阴性小鼠经过继转移发病小鼠脾脏来源的T细胞后，在皮下一次免疫CFA佐剂乳化的MOG抗原200ug后的发病情况，纵坐标为发病指数，横坐标为天数。

图19为阴性小鼠经过继转移发病小鼠的淋巴结来源T细胞，在皮下一次免疫CFA佐剂乳化的MOG抗原200ug后的发病情况，纵坐标为发病指数，横坐标为天数。

图20为诱导小鼠发病后针对自身MOG抗原的T细胞扩增情况。

图21为诱导小鼠发病后针对自身MOG抗原的T细胞内部表达一些细胞因子的情况。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗

本实施例中预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗有4种：1)由人胰岛素蛋白(Sigma公司，I-9278)和pVAX-insulin组成，2)由人胰岛素中B链上的9-23蛋白(B9-23)和pcDB9-23组成，3)由人胰岛素蛋白(Sigma公司，I-9278)和pcDB9-23组成，4)由B9-23和pVAX-insulin组成。

B9-23的氨基酸序列是：S H L V E A L Y L V C G E R G(序列1)。胰岛素中B链上的9-23蛋白(B9-23)由北京aoke公司合成。

其中，pVAX-insulin和pcDB9-23按照如下方法构建：

取人胰腺组织，利用购自Takara公司的RNA提取试剂盒，在TrizoL试剂中充分研磨，并根据说明书进行总RNA的提取。根据已发表的基因序列设计引物，引物序列为：

扩增人胰岛素cDNA基因的引物：

mInsulinp1 atggccctgttggtgcacttcctac

mInsulinp2 ttagttgcagtagttctccagctgg

扩增人胰岛素B链上自氨基末端第9至23位氨基酸残基组成的多肽B9-23的引物：

B9-23p1： agcaggaagcctatcttccaggtta

B9-23p2： gcagaggggtaggctgggtagtggt

B9-23的氨基酸序列是：S H L V E A L Y L V C G E R G。

依照TaKaRa RNA PCR Kit操作指南进行，反转录用Oligo(dT)作下游引物，反应条件：42℃30min，99℃5min，5℃5min。PCR反应用基因序列设计特异性引物，扩增参数：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃70s 35个循环；72℃10min，反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明人胰岛素的RT-PCR产物得到一条约750bp的条带，B9-23的RT-PCR产物得到一条约250bp的条带。

利用Takara公司PCR Fragment Recovery Kit按其说明书进行PCR产物的回收。回收的cDNA片段与pMD 18-T载体(购自Takara公司)在T₄DNA连接酶的作用下16℃过夜，使人胰岛素的cDNA或B9-23的编码序列连接到pMD 18-T的载体上。连接产物转化感受态细胞，感受态细胞的制备及转化和质粒的提取按参考文献(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(2^nded).New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.19-56)。提取后的质粒用EcoR I和Hind III双酶切进行重组质粒的鉴定，酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，正确的克隆进行质粒的大量提取。为鉴定克隆的cDNA序列，对重组质粒进行纯化，并用BcaBEST primer RV-M和BcaBEST primer M13-47对cDNA在PE377全自动测序仪进行双向DNA序列测定，所得序列用PE公司SeqEd v1.0.3软件进行分析。将经酶切和测序鉴定含有核苷酸序列是GenBank Accession NumberAY899304的自5′端第56位至388位脱氧核糖核苷酸的人胰岛素cDNA基因的质粒命名为pMD-insulin，含有核苷酸序列是GenBank Accession Number AY899304的自5′端第152位至196位脱氧核糖核苷酸的B9-23的cDNA基因的质粒命名为pMD-B9-23。

用EcoR I和Xho I从pMD-insulin和pMD-B9-23分别切下人胰岛素基因片段和B9-23片段，人胰岛素基因片段连接到同样酶切的真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)上，B9-23片段连接到同样酶切的真核表达载体pcDNA3.0(Invitrogen公司)上，重组质粒用EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定和测序鉴定。将经酶切和测序鉴定含有核苷酸序列GenBank Accession Number AY899304的自5′端第56位至388位脱氧核糖核苷酸的人胰岛素脱氧核糖核苷酸的人胰岛素cDNA基因的质粒命名为pVAX-insulin，含有核苷酸序列GenBank Accession Number AY899304的自5′端第152位至196位脱氧核糖核苷酸的B9-23的cDNA基因的质粒命名为pcDB9-23。

pVAX-insulin的EcoR I和Xho I酶切鉴定结果如图1a所示，0.7％琼脂糖凝胶电泳表明pVAX-insulin经EcoR I和Xho I酶切后，得到约750bp的人胰岛素cDNA基因片段。图1a中，1：DNA标准分子量(10000bp、5000bp、2500bp、1000bp和250bp，购自Takara公司)；2，3：重组质粒pVAX-insulin用EcoR I和Xho I进行酶切。

pcDB9-23载体的EcoR I和Xho I酶切鉴定结果如图1b所示，0.7％琼脂糖凝胶电泳表明pcDB9-23经EcoR I和Xho I酶切后，得到约250bp的B9-23 cDNA基因片段。图1b中，3是DNA标准分子量(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，购自Takara公司)；2：重组质粒pCDB9-23用EcoR I和Xho I进行酶切。

pVAX-insulin参照lipofectamine产品说明书利用脂质体转染法转染BHK21细胞(美国ATCC公司)。转染细胞48h后收集细胞，提取总RNA以mInsulinp1和mInsulinp2为引物用RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果如图1c所示，表明转染细胞中有750bp的人胰岛素cDNA基因片段，说明pVAX-insulin在mRNA水平能有效在体外表达。1：DNA标准分子量(10000bp、5000bp、2500bp、1000bp和250bp，购自Takara公司)；2、3：pVAX-insulin转染的细胞insulin的表达；4：未转染的细胞对照。

实施例2、预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗的效果试验

分别免疫实验用的Balb/c小鼠和NOD小鼠。肌肉注射。Balb/c小鼠每组3只。NOD小鼠每组16只。

一、Balb/c小鼠实验

1、在Balb/c小鼠上的细胞免疫反应

Balb/c小鼠9只，均分为3组，每组3只，第1组(pcDB9-23免疫组)每只分别免疫含100微克pcDB9-23的0.9％NaCl水溶液100微升，第2组(B9-23免疫组)每只分别免疫含100微克B9-23的0.9％NaCl水溶液100微升，第3组(pcDB9-23和B9-23共免疫组)每只分别免疫含100微克pcDB9-23和100微克B923的0.9％NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第7天按如下方法进行T细胞增殖实验。

利用T细胞增殖试验，CFSE染色，流式细胞仪检测，用来反映T淋巴细胞针对特定抗原的增殖能力。集体内淋巴细胞在收到抗原等特异或非特异的刺激后，导致细胞活化，细胞因子合成、细胞因子受体表达及活化的细胞发生增殖。细胞增殖反应在一定的程度上可以反映细胞的功能状态。

具体方法如下：1，脱臼处死小鼠，用70％乙醇浸泡15分钟；2，在提前紫外灯灭菌20分钟的超净工作台中，无菌条件下取出小鼠脾脏于提前加有2ml RPMI1640培养液的细胞培养皿中；3，将铜网灼烧后降温放入平皿中，利用无菌注射器将脾脏磨碎，制成细胞悬浮液，并过滤到13ml细胞离心管内；4，将离心管口用封口膜封好，离心2000转，10分钟；5，弃上层培养液，加2～3ml红细胞裂解液，悬浮细胞，裂解2分钟后，加等体积RPMI1640培养基(或胎牛血清)中止反应，将离心管口用封口膜封好，离心2000转，10分钟；6，弃上层培养液，加3～4ml RPMI1640(含2％胎牛血清)培养基悬浮细胞；7，用玻璃棉37℃慢慢滤过细胞，保证细胞充分和玻璃棉结合以除去B细胞；8，用血球计数板细胞计数；9，用PBS洗掉培养基，并最终用PBS溶液1ml悬浮2×10⁷个细胞；10，加入3uM CFSE储备液至终浓度为1.5uM，室温下轻轻振荡8分钟；11，加入等体积胎牛血清终止反应，将细胞放入水浴10分钟，2000rpm 5分钟离心，弃上清，悬浮细胞，并用1ml每10⁶个细胞的含有PBS溶液洗细胞，离心弃上清，重复3次；12，将每组细胞悬液分4份加入96孔培养板中。其中一份加入100μl Con A(有丝分裂原)至终浓度为5μg/ml，一份加入相应的特异性抗原(B9-23)作为刺激物至终浓度为5μg/ml，一份不加刺激物，一份加入100μlBSA至终浓度为2μg/ml作为无关抗原。同时设有不加刺激物和不用CFSE染色的细胞对照；13，将细胞放入细胞培养箱，37℃，5％CO₂培养，分别在48，96小时用流式细胞仪检测细胞增殖情况。

48小时和96小时的检测结果表明，pcDB9-23和B9-23共免疫组的T细胞增殖程度(增殖0.08％)明显低于pcDB9-23免疫组(增殖22.32％)和B9-23免疫组(增殖8.94％)，证明pcDB9-23和B9-23共免疫组出现了免疫抑制现象。图2a和图2b中的百分数为增殖程度，数值越大表明增殖程度越高，M1表示细胞增值的百分比。

2、细胞免疫反应的特异性

为了进一步探索免疫抑制反应是否具有专一性，即只有对胰岛素抗原的蛋白和DNA之间才会产生抑制现象。将Balb/c小鼠21只，均分为7组，每组3只，第1组(阴性对照组)每只分别免疫0.9％NaCl水溶液100微升，第2组(pVAX-insulin免疫组)每只分别免疫含100微克pVAX-insulin的0.9％NaCl水溶液100微升，第3组(人胰岛素蛋白免疫组)每只分别免疫含100微克人胰岛素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第4组(pVAX1免疫组)每只分别免疫含100微克pVAX1的0.9％NaCl水溶液100微升，第5组(pVAX-insulin和VP1共免疫组)每只分别免疫含100微克pVAX-insulin和100微克口蹄疫病毒VP1(按照文献：金华利，张富春，单文娟，张爱莲，李轶杰，王宾.口蹄疫vp1蛋白在酵母中的表达及免疫原性分析.细胞与分子免疫学杂志，2004年，20(5)513-516中描述的方法制备)的0.9％NaCl水溶液100微升，作为对照组；第6组(pVAX1和人胰岛素蛋白共免疫组)每只分别免疫含100微克pVAX1和100微克人胰岛素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第7组(pVAX-insulin和人胰岛素蛋白共免疫组)每只分别免疫含100微克pVAX-insulin和100微克人胰岛素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第7天按找上述步骤1的方法进行T细胞增殖实验。刺激后48小时的结果如图3a和3b所示，表明只有当胰岛素蛋白与其对应的DNA混合在一起时(pVAX-insulin和人胰岛素蛋白共免疫组)，才出现免疫抑制现象，其它混合组与对照组比较，T细胞活性没有明显的下降。说明共免疫是同种抗原的蛋白与DNA之间存在免疫抑制现象的特异性关系。图3a中的百分数为增殖程度，数值越大表明增殖程度越高，M1表示细胞增值的百分比。图3b中，pI表示pVAX-insulin免疫组，Insulin表示人胰岛素蛋白免疫组，pVAX表示pVAX1免疫组，pI+VP1表示pVAX-insulin和VP1共免疫组，pVAX+In表示pVAX1和人胰岛素蛋白共免疫组，pI+In表示pVAX-insulin和人胰岛素蛋白共免疫组，

表示阴性对照组。

3、细胞免疫反应的剂量关系实验

为了进一步探索抑制现象出现最佳效果时蛋白与DNA之间的剂量关系。将Balb/c小鼠24只，均分为8组，每组3只，第1组(阴性对照组)每只分别免疫0.9％NaCl水溶液100微升，第2组(pVAX-insulin免疫组)每只分别免疫含100微克pVAX-insulin的0.9％NaCl水溶液100微升，第3组(人胰岛素蛋白免疫组)每只分别免疫含100微克人胰岛素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第4组(pVAX-insulin和人胰岛素蛋白1∶4共免疫组)每只分别免疫含25微克pVAX-insulin和100微克人胰岛素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第5组(pVAX-insulin和人胰岛素蛋白1∶2共免疫组)每只分别免疫含50微克pVAX-insulin和100微克人胰岛素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第6组(pVAX-insulin和人胰岛素蛋白1∶1共免疫组)每只分别免疫含100微克pVAX-insulin和100微克人胰岛素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第7组(pVAX-insulin和人胰岛素蛋白2∶1共免疫组)每只分别免疫含200微克pVAX-insulin和100微克人胰岛素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第8组(pVAX-insulin和人胰岛素蛋白4∶1共免疫组)每只分别免疫含400微克pVAX-insulin和100微克人胰岛素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第7天按找上述步骤1的方法进行T细胞增殖实验。刺激后48小时的结果如图3c所示，当质粒与蛋白之间的比例是2∶1，抑制现象最明显。图3c中，

表示阴性对照组，pI表示pVAX-insulin免疫组，In表示人胰岛素蛋白免疫组，1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1分别表示pVAX-insulin和人胰岛素蛋白1∶4共免疫组、pVAX-insulin和人胰岛素蛋白1∶2共免疫组、pVAX-insulin和人胰岛素蛋白1∶1共免疫组、pVAX-insulin和人胰岛素蛋白2∶1共免疫组和pVAX-insulin和人胰岛素蛋白4∶1共免疫组。

二、NOD小鼠上共免疫预防实验

将64只雌性NOD小鼠均分为4组，每组16只，第1组(阴性对照组)每只分别免疫0.9％NaCl水溶液100微升，第2组(pVAX-insulin免疫组)每只分别免疫含100微克pVAX-insulin的0.9％NaCl水溶液100微升，第3组(人胰岛素蛋白免疫组)每只分别免疫含100微克人胰岛素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第4组(pVAX-insulin和人胰岛素蛋白共免疫组)每只分别免疫含100微克pVAX-insulin和100微克人胰岛素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后每周用血糖仪(购自北京怡成公司)检测小鼠的血糖变化并记录。若连续两周小鼠的血糖水平超过200mg/dl，即认为此NOD患有糖尿病。

如图4所示，统计每组NOD小鼠的发病率，正常情况下，雌性NOD小鼠的糖尿病的发病率是60％左右。在pVAX-insulin和人胰岛素蛋白共免疫组里，NOD小鼠的发病率有了明显的将低，只有一只小鼠发病，并且发病的时间也有了明显的延迟。说明共免疫pVAX-insulin和人胰岛素蛋白可有效地预防I型糖尿病。图4中，NOD表示阴性对照组小鼠，Insulin表示人胰岛素蛋白免疫组小鼠，pVAX-insulin表示pVAX-insulin免疫组小鼠，Insulin+pVAX-insulin表示pVAX-insulin和人胰岛素蛋白共免疫组小鼠。

对阴性对照组小鼠、已发病的糖尿病小鼠和pVAX-insulin和人胰岛素蛋白共免疫组的胰腺组织进行切片、HE染色，结果也表明，在pVAX-insulin和人胰岛素蛋白共免疫组的胰岛组织中，淋巴细胞的浸润比其它发病组的情况要轻微，与正常的未发病的NOD小鼠(阴性对照组小鼠)相近(图5)。

该实验证明了共免疫胰岛素DNA和蛋白，能够有效地预防I型糖尿病的发生。在本次实验中重复验证了共免疫现象的免疫抑制性。尤其在NOD小鼠上，能够预防I型糖尿病的发生。

总之，该实验证明了一种预防I型糖尿病的新方法。进一步探讨相关机制可能会发展出对人和动物自身免疫疾病治疗的新方法。

实施例3、采用共免疫的方法治疗/预防自主性卵巢炎

摘要自身免疫卵巢疾病(AOD：autoimmune ovarian disease)是人类早期卵巢败育(POF：premature ovarian failure)的诱因之一。AOD的自身蛋白抗原有卵透明带蛋白(ZP3)。

用MZP3蛋白和CFA诱导的AOD小鼠模型，我们探讨了一个更实用的治疗卵巢炎的技术。根据我们以前观察到的结果-共免疫匹配的DNA和蛋白可以诱导T细胞反应的免疫抑制，我们采用共免疫的方法来改善AOD。结果显示，共免疫MZP3DNA和蛋白改善了AOD，并且抑制了抗原特异性的T细胞反应，减低了炎症因子IL-12和INF-γ的表达水平，这些作用可能是由于共免疫诱导出了一群特异性的调节性T细胞来完成的。这群调节性T细胞的特征是CD4⁺/CD25^-/FoxP3⁺，并能表达IL-10。我们第一次报道了用共免疫DNA和蛋白的方法来治疗自身免疫疾病。

近百年来，近年来研究发现免疫系统和生殖系统之间存在着密切而复杂的关系^[1，2]。据此关系建立了新型免疫不育技术，该技术是利用基因重组等分子生物学技术为基础，以生殖过程中的关键因子为靶抗原的疫苗，利用免疫系统对外加的靶抗原产生相应的免疫应答，使体内的靶生殖抗原丧失功能，阻断过度繁殖动物的生育力，破坏过度繁殖动物的正常生殖过程，维持生物物种之间及其与环境之间的动态平衡^[3]。鼠的卵膜外都有由一层卵透明带所完全包围。卵透明带是在初级卵母细胞成熟过程中的早期，由卵母细胞和初级卵母细胞分泌而形成的一层含糖蛋白的嗜酸性膜，由ZP1、ZP2、ZP3组成^[4]。卵透明带在受精过程中有两个重要作用：一是使精子附着在卵透明带上，二是在精子结合以后诱导精子的顶体反应使精子进入卵中^[5]，其中ZP3是ZP中的一种主要糖蛋白，作为精子的初级受体，在精卵结合过程中更为重要，已被认为是一种理想的不育疫苗^[6]。

但是在免疫不育疫苗的制备工程中发现常伴随卵巢炎的发生，Dunbar等^[7]用天然的猪ZP糖蛋白和去糖基的ZP蛋白主动免疫雌性个体而导致阻断受精。但是，研究表明免疫后的动物在排卵周期、激素水平和卵巢中卵泡发育方面，有的出现了短暂的变化，有的出现了不可逆的改变。

妇女更年期的正常年龄一般为50岁，如果在40岁以前丧失了卵泡的功能就可被认为是患有早期卵巢败育(POF：premature ovarian failure)，这种疾病在妇女中的发病率一般为1-2％，严重的可能在十几岁就会患这种疾病^[8]。自身卵巢免疫疾病(AOD：autoimmune ovarian disease)被认为是POF的主要诱因之一^[9-11]；Rhim等采用脚底和皮下注射MZP3的一段短肽(330 to 342)建立了一个新的小鼠实验动物模型用于卵巢自身免疫疾病的研究，这个模型可在一定程度上模拟妇女早期卵巢败育^[12]。这种自身免疫疾病是由CD4+T细胞介导的，并且Lou等发现自身抗体的产生可以改变T细胞介导的炎症反应的分布，并且会导致靶器官功能单位的丧失^[13]。

作为机体免疫系统的调控者——调节性T细胞可以负调控机体对自身抗原的免疫反应，从而使机体免受自身免疫疾病的伤害。天然的调节性T细胞一般为CD4+CD25+双阳性T细胞，这类细胞可以表达一种功能性转录因子——FoxP3，这种细胞因子是正常免疫系统重要的细胞组成成分^[14]。这类细胞的存在使得研究者使用抗原特异性的调节性T细胞去治疗自身免疫疾病和同种异体移植排斥^[15-17]。Samy等使用抗原依赖性的CD4+CD25+双阳性调节T细胞控制了自身免疫疾病——卵巢炎的发生^[18]。Jin等发现采用蛋白和DNA共免疫的方法可以抑制抗原特异性的细胞反应^[19]，这种抑制功能可能与诱导出了抗原特异性的调节性T细胞有关，所以本论文以小鼠为动物模型，利用蛋白和DNA共免疫抑制细胞免疫反应的方法探索治疗自身免疫疾病——卵巢炎的方法及相应的机理。

1材料和方法

1.1材料和试剂

pMD18-T测序载体购自Takara公司，大肠杆菌DH5α菌株为我们实验室保藏菌种。RNA提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、DNA marker、限制性内切酶、exTaq酶以及RT-PCR和PCR引物均购自Takara公司；测序试剂盒购自美国PE公司，其它试剂均为分析纯。

1.2mzp3基因的克隆

取性成熟小鼠卵巢，在Trizo中充分研磨，并根据说明书进行总RNA的提取。根据已发表的基因序列(GenBank number：BC103585)设计引物，引物序列为：

MZP3 P1：AATGAATTCATGAATTCCCAGACTCTGTGGC

MZP3 P2：TTACTCGAGTTAAGTCCAGCCTTCCACAGTCT

扩增片段为MZP3的核酸序列第63到1143位碱基。

依照TaKaRa RNA PCR Kit操作指南进行，反转录用Oligo(dT)作下游引物，反应条件：42℃30min，99℃5min，5℃5min。PCR反应用mzp3基因序列设计特异性引物，扩增参数：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃70s 35个循环；72℃10min，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。按Takara公司PCR Fragment Recovery Kit说明书进行PCR产物的回收。回收的mzp3 cDNA片段与pMD 18-T载体在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜，使mzp3 cDNA连接到pMD 18-T的载体上。连接产物转化感受态细胞，感受态的制备及转化按参考文献(Sambrook J等1989)^[20]。按相关的参考文献(Sambrook J等1989)进行质粒DNA的小量提取，提取后的质粒用BamH I和HindIII双酶切进行重组质粒的鉴定，酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，正确的克隆进行质粒的大量提取。为鉴定克隆的cDNA序列，对重组质粒进行纯化，并用BcaBEST primer RV-M和BcaBEST primer M13-47对mzp3 cDNA在PE377全自动测序仪进行双向DNA序列测定，所得序列用PE公司SeqEd v1.0.3软件进行分析。

1.3真核表达载体的构建及组质粒在BHK21细胞中的瞬时表达

将上述经EcoR I和Xho I双酶切，连接到同样酶切的真核表达载体pcDNA3，该载体命名为pcDmzp3，经序列鉴定正确的重组质粒进行真核转染实验。具体转染方法参照lipofectamine产品说明书。利用脂质体转染法将pcDmzp3转染BHK21细胞，具体操作步骤见说明书。转染细胞48h后收集细胞，提取总RNA以MZP3 P1和MZP3 P2为引物用RT-PCR方法检测目的基因的表达。

1.4原核表达载体的构建、蛋白表达及蛋白纯化

重组质粒pMD18-T/MZP3经EcoR I和Xho I双酶切，连接到同样酶切的真核表达载体pGEX-4T-1，经序列鉴定正确的重组质粒进行蛋白表达。挑取单个菌落，接种于新鲜的LB(含Amp⁺50mg/L)培养基中，于37℃培养过夜。次日，按1％的接种量转种于新鲜的LB(含Amp⁺50mg/L)培养基中。当A600达到0.6～0.8时，在1.0mmol/LIPTG的诱导下，于37℃表达5h。取1mL菌液离心收集菌体，再用双蒸水洗1次，悬于1×SDS样品加样液中，置沸水浴中煮10min。以12000g离心2min，取15μL上清液进行100g/L SDS-PAGE，并以考马斯亮蓝染色。

离心收集诱导后的E.coli BL21(DE3)菌体，用PBS洗涤后，用1/20原培养体积的细胞裂解液L1(10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1mmol/L EDTA和200mmol/L NaCl)重悬细菌沉淀，冰浴15min后，超声裂解细菌至菌液不再粘稠。然后4℃，12000g离心10min去上清，收集沉淀获得初制的MZP3包涵体蛋白。将初制包涵体蛋白用L1和4M尿素洗涤，70℃保温10min，4℃，12000g离心5min，重复3次。用L3(10mmol/LTris-HCl、1mol/L NaCl、8M尿素、5mmol/L β-巯基乙醇和5mmol/L DTT，pH10)溶解包涵体蛋白，55℃保温10min，4℃，12000g离心5min去除沉淀，上清装入透析袋中在含4M尿素的L2(10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)和1mol/L NaCl)中透析8h，之后在含2M尿素的L2中透析8h，逐级递减尿素的浓度，直至将尿素从蛋白溶液中除去，用Bradford测定蛋白含量。

1.5卵巢炎模型的诱导

6-8周龄，雌性，C57BL/6小鼠，购于中国医学科学院实验动物研究所。将浓度为2mg/ml蛋白与完全傅式佐剂(CFA：complete Freund’s adjuvant)1∶1混合，乳化完全后每只小鼠通过脚掌和肌肉免疫100μl，既每只小鼠免疫100μg蛋白。只免疫CFA的小鼠作为对照。14天后采血，收集血清，间接ELISA检测相应的抗体滴度。以纯化的GST-MZP3融合蛋白作为标准抗原，ELISA法检测小鼠血清中MZP3蛋白的特异性抗体水平。将蛋白稀释成5μg/ml，96孔酶标板用100μl/孔包被4℃过夜；弃去包被液PBST洗板3次，5％脱脂奶粉-PBST在37℃封闭1h；洗板后加入不同稀释度的小鼠血清37℃孵育2h；洗板后加入1∶1000辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(HRP-IgG)，50μl/孔，37℃孵育2h后弃去；洗板，加入50μL/孔TMB室温避光显色反应30min；2mol/L硫酸中止反应，用酶标仪测定OD450/650的值。组织学评价卵巢疾病：卵巢在Bouin’s固定液中固定24小时，进行石蜡包埋，然后连续切片(5μm)并进行H.E(hematoxylin and eosin)染色。按严重程度对卵巢病理学进行分级，1间质区域出现炎症；2和3增加的多个位点的炎症反应或卵泡之间和内部的肉芽肿；4卵泡消失和卵巢闭锁。抗原特异性淋巴细胞增殖反应：免疫后14d将小鼠处死，无菌取出腿弯处淋巴节，将淋巴节研碎，2000rpm离心5min后弃去上清，用培养基重悬细胞；用血球计数板计数后，调整细胞浓度到1x10⁷/mL。取2x10⁷个细胞，2000rpm离心5min后弃去上清，用无菌PBS重悬细胞，加入1.5μlCFSE(1mmol/ml)，37℃轻摇10min，加入等体积的牛血清终止反应，2000rpm离心5min后弃去上清，用PBS洗涤3次；最后用1ml培养基重悬细胞，每空加100μl细胞，用MZP3(10μg/ml)蛋白来刺激T细胞增殖，用BSA(2μg/ml)作为非特异性抗原对照，ConA(10μg/ml)作为阳性对照，用流式细胞仪检测增殖情况。采用胞内染色的方法检测细胞因子IL-12和INF-γ：免疫后14d将小鼠处死，无菌取出脾脏，将脾脏组织研碎，2000rpm离心5min后弃去上清，用1-2mL红细胞裂解液处理细胞2-3min，加6-12mL含4％血清的RPMI 1640培养基终止，2000rpm，离心5min后弃去上清，用培养基重悬细胞，用血球计数板计数后，调整细胞浓度到2x10⁶/mL。淋巴节单细胞悬液的制备同上，每孔加入2x10⁶个细胞(100μl)，用10μg/ml的MZP3蛋白刺激4-6个小时，加入莫轮菌素(monencin)抑制1-2小时。然后进行胞内染色，用流式细胞仪检测细胞因子的表达情况。具体过程如下：(1)小鼠在免疫后21天处死，制备脾脏单细胞悬液，加入2ml红细胞裂解液溶解红细胞，用洗液洗一遍，离心重悬细胞进行计数；(2)抗Fcg抗体封闭：各组取1×10⁶个细胞，加入适量抗Fcg抗体(用量见试剂说明书)，封闭30分钟；(3)加入2-3ml洗液，2000rpm离心5分钟，弃去上清，各管加入适量荧光标记抗体充分混匀，4℃避光反应30分钟；(4)加入2-3ml洗液，2000rpm离心5分钟，弃去上清，加入0.2ml 4％多聚甲醛于4℃固定20分钟；(5)加入2-3ml洗液，2000rpm离心5分钟，弃去上清，加入0.2ml破膜剂细胞打孔，充分混匀，室温避光反应15分钟；(6)加入2-3ml洗液，充分混匀，2000rpm离心5分钟，弃去上清，各管加入适量的细胞内标记的荧光标记单克隆抗体(用量按试剂说明书取用)，做细胞胞内分析物的标记；(7)细胞内染色抗体与细胞充分混匀，室温避光反应30分钟；(8)加入2-3mL洗液，充分混匀，500×g离心5分钟，弃去上清，每管加入300μL洗液重悬细胞；(9)流式细胞仪分析。采用RT-PCR方法检测细胞因子IL-2：按照TRIZOLReagent(Gibco)说明书，每组取10⁷个细胞，用1ml TRIzol Reagent裂解，然后加200μl氯仿，混匀后，12000r/min，4℃离心15min，取上层水相转移至新的EP管，加500μl异丙醇，混匀后室温静置10min，12000r/min，4℃离心10min，弃去上清，RNA沉淀用75％的乙醇洗涤后，溶于20μl经DEPC处理的超纯水中，-80℃储存。取1μl RNA样品加599μl超纯水，在紫外分光光度计上比色，读取A260和A280的OD值。根据试剂盒操作说明进行RT-PCR，扩增后的产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6共免疫治疗卵巢炎

将浓度为2mg/ml蛋白与CFA1∶1混合，乳化完全后每只小鼠通过脚掌和肌肉免疫100μl，14d后通过肌肉免疫pcDmzp3+MZP3各100μg，免疫pcDNA3、pcDNA3+MZP3、pcDmzp3、pcDmzp3+OVA和MZP3作为对照组，14d后加强免疫，在加强免疫后一周，无菌取小鼠的脾脏细胞，通过MTT法进行T细胞扩增实验，MZP3蛋白抗原来刺激T细胞增殖，用BSA作为非特异性抗原对照，用ConA作为阳性对照。具体过程如下：用MTT法检测小鼠T细胞体外增殖活性

(1)取脾脏：加强免疫后7d将小鼠处死，无菌取出脾脏；(2)制成单细胞悬液：将脾脏组织研碎，2000rpm离心5min后弃去上清，用1-2mL红细胞裂解液处理细胞2-3min，加6-12mL含4％血清的RPMI 1640培养基终止；2000rpm，离心5min后弃去上清，用培养基重悬细胞。

(3)细胞计数：用血球计数板计数后，调整细胞浓度到3x10⁶/mL；(4)加入细胞板：每孔加入100μl细胞，分别加入ConA(终浓度10μg/ml)，MZP3蛋白(终浓度10μg/ml)，BSA(非特异性抗原，终浓度2μg/ml)刺激48-72h；(5)显色：每孔加入MTT溶液20μL，37℃，5％CO₂，培养3-4h，2000rpm离心5min，弃上清，每孔加100μl二甲基亚砜，37℃轻摇20-30min；(6)读数：用酶标仪(Magellan，Tecan Austria GmbH)测定595nm的OD值；(7)结果计算：刺激指数

SI＝(各刺激孔的OD值-培养基OD值)/(未刺激孔的OD值-培养基OD值)。

淋巴细胞扩增实验：无菌条件下取小鼠腿弯处淋巴节，将淋巴节研碎，2000rpm离心5min后弃去上清，用培养基重悬细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度到3x10⁶/mL，其余过程同上。

细胞因子IL-2、IL-12、INF-γ、IL-10、FoxP3和CD25的检测及卵巢炎的评价同上。

2结果

2.1基因克隆及序列分析

采用提取的总RNA，以寡聚脱氧胸腺嘧啶为引物进行反转录得到单链cDNA，再以设计的PCR引物进行扩增得到MZP3基因片段。RT-PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见一条约1200bp的条带，与我们预计的一致。RT-PCR产物与克隆载体pMD18-T连接，构建了重组质粒pMD18-T/MZP3。重组质粒用Bam H I和Hind III酶切，切出约1200bp DNA片段，与预计的连接片段大小相同。对pMD18-T/MZP3重组质粒用BcaBESTprimer RV2M和BcaBEST primer M13247进行双向测序，测序结果显示与已发表的序列同源性为99％。用DNAMAN对绒人、猴、狗、猫、猪、和牛MZP3基因进行同源性分析，其同源性到达了73％(图6a)，氨基酸序列同源性达到了71％(图6b)。

2.2真核表达载体的构建及重组质粒在BHK21细胞中的瞬时表达

重组质粒pMD18-T/MZP3及真核表达载体pcDNA3用EcoR I和Xho I进行双酶切，回收纯化后进行连接，将MZP3基因克隆入真核表达载体pcDNA3中获得重组载体pcDmzp3。重组质粒以EcoR I和Xho I进行双酶切，经0.7％琼脂糖凝胶电泳显示在大约1200bp处有一个条带(图7中a)，说明重组质粒pcDmzp3构建成功。将纯化并定量好的质粒用脂质体转染生长状态良好的BHK21细胞，并且72h收集细胞，以MZP3p1和MZP3p2为引物用RT-PCR方法检测目的基因的表达情况，在1200bp处出现相应条带如图7中b，表明重组载体在mRNA水平能有效在体外表达。

2.3原核表达载体的构建，蛋白表达及纯化

重组质粒pMD18-T/MZP3及真核表达载体pGEX4T-1用EcoR I和Xho I进行双酶切，回收纯化后进行连接，将MZP3基因克隆入真核表达载体pGEX4T-1中获得重组载体pGEX4T-1/MZP3。重组质粒以EcoR I和Xho I进行双酶切，经0.7％琼脂糖凝胶电泳显示在大约1200bp处有一个条带(见图8中a)，说明重组质粒pGEX4T-1/MZP3构建成功。将纯化并定量好的质粒转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，将构建的E.coliBL21(DE3)/MZP3转化子在新鲜LB培养基中培养，经IPTG诱导后收集转化菌。取其全菌蛋白进行SDS-PAGE。蛋白电泳结果表明，MZP3基因在E.coli BL21(DE3)中得到了大量表达(图8中b)。收集诱导表达后的菌体按超声裂菌处理。SDS-PAGE结果表明诱导表达的蛋白质条带存在于细菌裂解物的沉淀中，说明蛋白是以包含体的方式表达的。我们用纯化包含体的方法对蛋白进行了溶解，洗涤和复性，得到了纯度较高的蛋白(图8中c)。

2.4自主免疫疾病——卵巢炎的诱导

将上述纯化的MZP3蛋白的浓度调整到2mg/ml和等体积的完全弗氏佐剂(CFA)完全乳化，通过脚掌和肌肉注射的方法免疫8-10周龄雌性C57BL/6小鼠，每只小鼠100μl，注射100ul弗氏完全佐剂(CFA)的小鼠为佐剂对照组，注射100ul PBS为阴性对照组。14天后处死小鼠，取出卵巢，在Bouin’s固定液中固定24小时，然后用石蜡包埋，进行连续切片和H.E(hematoxylin and eosin)染色。结果表明，免疫MZP3蛋白和CFA的小鼠8只中有7只出现了不同程度的卵巢炎，发病率为87.5％(图9a)。在卵巢的间质和正在生长的以及成熟的卵泡中均发现了炎症反应。卵泡被炎症细胞浸润并且严重的导致了卵子的丢失(图9b)。相比而言，只注射CFA的小鼠没有出现卵巢炎。

我们用ELISA法对采集的血清检测了抗MZP3的抗体，免疫14天后，与对照组相比血清中出现了MZP3抗体，抗体滴度达到了25600(图9c)。免疫MZP3蛋白和CFA引起了强烈的T细胞反应(图9d)，细胞因子IL-2(图10a)，INF-γ(图10b)和IL-12(图10c)的表达水平得到了提高，这表明Th1型的免疫反应被激活了。这些结果显示卵巢炎被成功诱导，并且能够用来评价这种方法的治疗效果。

2.5共免疫MZP3DNA和蛋白抑制了AOD的发生

我们用构建的AOD模型检测共免疫策略治疗卵巢炎的能力。C57BL/6小鼠先通过脚掌和肌肉注射MZP3蛋白和CFA，14天后，肌肉免疫MZP3蛋白和质粒pcDmzp3，两周后加强免疫。二免后7天检测卵巢炎的发病情况。结果发现，只有共免疫质粒pcDmzp3和MZP3蛋白(命名为pcDmzp3+MZP3)的小鼠才出现了AOD的抑制现象(图11a)。为了排除非特异性因素的影响，如质粒的骨架序列或无关蛋白等，我们同时设立了免疫空质粒pcDNA3和MZP3蛋白共免(命名为pcDNA3+MZP3)、质粒pcDmzp3和OVA蛋白共免(命名为pcDmzp3+OVA)组作为对照。结果显示对照组并没有出现AOD的抑制现象，说明只有共免pcDmzp3+MZP3的小鼠才能抑制AOD的发生，进而说明这种抑制是抗原特异性的。组织学分析也揭示了免疫pcDNA3+MZP3或pcDmzp3+OVA的小鼠卵巢出现了炎症细胞浸润，而免疫pcDmzp3+MZP3的小鼠卵巢没有炎症细胞浸润(图11b)。

IL-2、IL-12和INF-γ高水平表达是Th1型CD4+T细胞反应的特点并且这些免疫调节因子在几种自主免疫疾病中起了重要作用^[21-26]。我们检测了共免pcDmzp3+MZP3的小鼠这些细胞因子的表达是否发生了变化。免疫pcDNA3+MZP3或pcDmzp3+OVA的小鼠IL-12和INF-γ的表达没有被抑制，而免疫pcDmzp3+MZP3的小鼠IL-12(图11c)和INF-γ(图11d)的表达被抑制。这就暗示了共免pcDmzp3+MZP3的小鼠出现了抗炎症免疫调节的功能。

T细胞反应被认为参与了AOD的发生，所以我们检测了从小鼠脾脏中分离的T细胞，这些小鼠首先被免疫了MZP3蛋白和CFA，14天后免疫pcDNA3、pcDNA3+MZP3、pcDmzp3、pcDmzp3+MZP3、pcDmzp3+OVA和MZP3，两周后加强免疫，在二免后第7天取出脾脏。这些T细胞被用来分析对MZP3蛋白抗原的反应能力。从免疫pcDmzp3+MZP3的小鼠中分离的T细胞基本上没有扩增能力，而从其它组分离的T细胞显示出了很强的扩增能力(图11e)。这些结果显示共免疫pcDmzp3+MZP3出现的AOD抑制现象与没有抗原特异性的T细胞反应是相关的。进一步说明共免疫pcDmzp3+MZP3出现的AOD抑制现象是通过下调炎症因子的表达和抑制T细胞反应产生的。总的来说，AOD的抑制是抗原特异性的，因为错配的组合没有产生同共免疫pcDmzp3+MZP3一样的结果。

MZP3自主抗体在指导自身免疫炎症反应的分布方面起到了重要作用并且能够增强自身免疫疾病的严重程度^[13]。所以我们接下来检测了共免疫是否抑制了抗MZP3抗体的产生。然而结果显示自主抗体的滴度在免疫组pcDmzp3+MZP3、pcDNA3+MZP3或MZP3之间是相同的(图11f)。这个结果同以前的研究是一致的，如果没有T细胞反应只转移抗体不能诱导自身免疫卵巢炎疾病^[13]。

2.6定性共免疫诱导的调节性T细胞的特征

调节性T细胞能够抑制T细胞反应并且阻止自身免疫免疫疾病的发生。细胞因子IL-10和FoxP3在T细胞反应抑制过程中起到了重要作用^[27-29]。为了检测由共免疫诱导的调节性T细胞能否表达特征性的细胞因子和标志，我们从分别免疫了pcDNA3、pcDNA3+MZP3、pcDmzp3、pcDmzp3+MZP3、pcDmzp3+OVA和MZP3的小鼠中分离出T细胞。这些细胞因子或标志用特异性的荧光标记的抗体进行胞内染色，通过流式细胞仪进行分析。从免疫pcDmzp3+MZP3的小鼠中分离的T细胞能够高水平表达IL-10(图12a)和FoxP3(图12b)，相反，对照组只能表达低水平的IL-10和FoxP3。转录因子FoxP3是调节性T细胞的特征性因子^[30，31]，所以我们推测共免疫可能诱导出了一种调节性T细胞。我们检测了这类调节性T细胞是不是属于CD4⁺CD25⁺双阳性的，对CD25的表达情况进行了检测，发现各组之间CD25的表达是基本相同的(图13)。

综合以上数据，采用共免疫相同基因的DNA和蛋白我们可能诱导出了一类CD4+CD25-调节性T细胞，这类T细胞可以抑制抗原特异性的T细胞反应并能阻止自身免疫疾病的发生。

讨论

我们的研究证明了共免疫MPZ3DNA和蛋白诱导了一种调节性T细胞，这种调节性T细胞可以抑制自身免疫疾病卵巢炎的发生。这种调节性T细胞的表型为CD4⁺CD25-Foxp3⁺，表达IL-10并且能够抑制抗原特异性T细胞反应，减少细胞因子IL-12和INF-γ的表达。

卵透明带蛋白在哺乳动物中是非常保守的，在小鼠中建立AOD模型可以更好的理解其它动物尤其是人类自身免疫疾病卵巢炎的发病机理。通过脚掌和皮下注射15个氨基酸的ZPP3短肽(328-342)与CFA，在B6AF1小鼠[(C57BL/6X A/J)F1]上诱导出了自身免疫疾病卵巢炎^[12，13]，而C57BL/6小鼠没有卵巢炎的发生。通过在脚掌和肌肉注射MZP3蛋白和CFA，我们在C57BL/6小鼠上成功建立了卵巢炎模型，尽管疾病的严重程度不如以前报道的^[13]。推测以下两个原因可能造成了这一差异。(1)我们使用的MZP3蛋白含有更多的T细胞表位，这些细胞表位引起了更强的T细胞免疫反应，而AOD就是由T细胞反应引起的^[12]。(2)将皮下注射改为肌肉注射和更多的B细胞表位诱导产生了更高水平的自身免疫抗体。自身免疫抗体可以改变T细胞介导的炎症反应的分布并能加重炎症反应^[13]。

天然调节性T细胞CD4+CD25+可以抑制T细胞反应并维持了自身免疫耐受。如果将调节性T细胞去除则可引起疾病的发生^{[32，33，34]}，所以这些细胞在阻止自身免疫疾病发生中起到了重要的作用。这些特征使得调节性T细胞成为了潜在的自身免疫疾病治疗工具^[35]。最近是一些研究结果表明，调节性T细胞确实可以治疗自身免疫疾病，这些调节性T细胞可以是抗原非特异性的^[36-38]，也可以是抗原特异性的^[18，39]。之前，我们也报道过共免疫pcD-VP1和146S抗原诱导了T细胞反应免疫抑制^[19]。在这个研究中我们用这种方法去抑制AOD，既共免疫MZP3DNA和蛋白。抗原特异性的T细胞反应被抑制，并且细胞因子IL-12和INF-γ的表达也被下调，而IL-10和FoxP3的表达水平是上升的，我们推测可能诱导出了一类抗原特异性的调节性T细胞。CD25的染色结果表明，诱导的这一类调节性T细胞可能是CD25-的。因此我们得出结论，共免疫诱导出了抗原特异性的免疫抑制，这种免疫抑制是由CD4+CD25-FoxP3+IL10+调节性T细胞介导的。

总之，我们证明了一种改善自身免疫疾病的新方法。一类新的调节性T细胞可能被诱导并介导了抗原特异性的T细胞免疫抑制。因此，进一步探讨相关机制可能会发展出对人和动物自身免疫疾病治疗的新方法。

该实施例中的参考文献出处如下：

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实施例4、采用共免疫的方法治疗/预防多发型硬化症

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病的代表，属于自身免疫疾病。研究MS的最常见的动物模型称为“实验性变应性脑脊髓炎”(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)，动物的EAE临床表现及病理改变与急性多发性硬化极其相似，因此成功建立EAE动物模型是研究EAE的先决条件。

本实验题目的目的就是基于联合免疫引起的免疫抑制，在小鼠的EAE模型中进行治疗或预防EAE的发生，并在研究过程中进一步探讨MS发病的相关免疫机制。

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的自身蛋白抗原有髓磷脂寡突细胞糖蛋白(MOG)和二种髓磷脂抗原(MBP和PLP蛋白脂蛋白)。

目前的实验结果，仅停留在EAE小鼠模型的诱导及相关MOG基因DNA的构建上，还未深入展开，初步结果总结如下。

1、MOG35-55 2copies基因的克隆与表达

1.1材料和试剂

pMD18-T测序载体购自Takara公司，大肠杆菌DH5α菌株为我们实验室保藏菌种。PCR产物回收试剂盒、DNA marker、限制性内切酶、exTaq酶以及RT-PCR和PCR引物均购自Takara公司；测序试剂盒购自美国PE公司，其它试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1MOG35-55基因克隆

诱导动物的EAE模型常用的自身抗原为MOG(Myelin OligodendrocyteGlycoprotein)的35-55个氨基酸(氨基酸序列为：MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)，其DNA序列为：GAGGTGGGTTGGTACCGTTCTCCCTTCTCAAGAGTGGTTCACCTCTACCGAAATGGCAAG

根据基因序列，设计合成引物及DNA片断，通过Overlap PCR的方法构建两拷贝MOG35-55的质粒DNA。

Overlap DNA片断设计：

fragment1：5’-ATGGAGGTGGGTTGGTACCGTTCTCCCTTC TCAAGAGTGG-3’

fragment2：5’-CCTCCATCTTGCCATTTCGGTAGAGGTGAACCACTCTTGAGAAGGGAGAA-3’

fragment3：5’-CCGAAATGGCAAGATGGAGGTGGGTTGGTACCGTTCTCCCTTCTCAAGAG-3’

fragment4：5’-TTACTTGCCA TTTCGGTAGA GGTGAACCAC TCTTGAGAAGGGAGAACGG-3’

引物设计：

MOG35P1：5’-AAGGATCCATGGAGGTGGGTTG-3’

MOG35P2：5’-GCTCTAGATTACTTGCCATTTC-3’

PCR反应用所设计的DNA及引物，扩增参数：94℃2min；94℃30s，60℃40s，72℃35s 35个循环；72℃10min，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。按Takara公司PCR Fragment Recovery Kit说明书进行PCR产物的回收。回收的MOG35-55 2copies片段与pMD 18-T载体在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜，使其连接到pMD 18-T的载体上。构建的质粒命名为：T-MOG352c。连接产物转化DH5α菌株的感受态细胞。小量提取质粒并用EcoRI I和Hind III双酶切进行重组质粒的鉴定，酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。为鉴定克隆的DNA序列，对重组质粒进行纯化并进一步序列分析，后应用DNAMAN软件进行分析结果。

1.2.1真核表达载体的构建及组质粒在BHK21细胞中的瞬时表达

将序列分析正确的质粒经BamH I和Hind III双酶切，连接到同样酶切的真核表达载体pVAX1上，该载体命名为pVAXMOG352c，经序列鉴定正确的重组质粒进行真核转染实验。具体转染方法参照lipofectamine产品说明书。利用脂质体转染法将pVAXMOG352c转染BHK21细胞。转染细胞48h后收集细胞，提取总RNA以MOG35P1和MOG35P2为引物用RT-PCR方法检测目的基因的表达。

1.3实验结果

质粒T-MOG352c的酶切鉴定结果如图14所示。质粒pVAXMOG352c的酶切鉴定结果如图15所示，质粒pVAXMOG352c在BHK21细胞的瞬时表达结果如图16所示。

2、EAE动物模型的诱导及鉴定

2.1直接免疫的方法：

C57BL/6小鼠，背部皮下免疫用弗氏完全佐剂充分乳化的短肽MOG35-55200ug(1ug/ul，200ul，并且内含结合杆菌BCG750ug)，同时在免疫的第0、2天尾静脉注射百日咳杆菌(10^8-10⁹个)，7天后加强一次免疫MOG200ug。

评分标准：

0——无任何临床症状。

1——动物尾部无力，瘫软。

2——动物尾部无力，前肢或后肢中等无力。

3——前肢或后肢严重无力，人为翻身后不能恢复。

4——肢体麻痹，人为翻身后不能恢复。

5——濒死状态。

结果如图17(不同颜色表示不同的小鼠个体)：40天后的较严重发病率(发病指数＞2)可达70％。

☆最近免疫的一批(20只)，初免后五周发病到4的有5只。

2.2过继转移发病小鼠T细胞诱导模型：

图18为阴性小鼠经过继转移发病小鼠脾脏来源的T细胞后，在皮下一次免疫CFA佐剂乳化的MOG抗原200ug；

图19为阴性小鼠经过继转移发病小鼠的淋巴结来源T细胞，在皮下一次免疫CFA佐剂乳化的MOG抗原200ug；

结论：过继转移淋巴结来源的T细胞比脾脏来源的T细胞小鼠发病早，症状变化稳定。但转移脾脏T细胞的小鼠发病指数较高。

2.3发病小鼠的一些生理指标检测

图20显示诱导小鼠发病后针对自身MOG抗原的T细胞扩增情况。

结论：患病小鼠外周免疫器官有针对自身抗原MOG的强烈的T细胞扩增反应。

图21显示诱导小鼠发病后针对自身MOG抗原的T细胞内部表达一些细胞因子的情况。

3、联合免疫治疗EAE小鼠3.1策略

按照2.1的方法，用C57小鼠诱导EAE模型，记录临床症状，至所有小鼠的临床指数达到3以上水平。将患病小鼠分组如下，分别进行免疫，免疫方法为肌肉注射。

1、MOG35-55肽100ul(与弗氏完全佐剂1∶1混合完全乳化至浓度1ug/ul)

2、pVAXMOG352c质粒DNA 100ul(浓度为1ug/ul)

3、pVAXMOG352cMOG35-55肽+pVAXMOG352c分别100ul(浓度同上)

4、pVAXMOG352cMOG35-55肽+pVAX1分别100ul(浓度同上)

5、不治疗组

14天后加强一次免疫。

自第一次治疗免疫起观察记录临床发病症状，并评分。加强免疫后7天，无菌取各实验组小鼠脾脏，通过MTT法进行T细胞扩增实验。同时取小鼠大脑，小脑，脊髓用4％多聚甲醛固定组织，进行组织切片的制作，镜检病变情况。

IL-1、IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10、FoxP3、IL17、TGF等细胞因子的检测：分为脾脏细胞细胞因子的表达情况以及脑脊液中细胞因子的表达情况两种。

下一步实验是在动物模型建立健全的基础上进行免疫学实验验证共免疫的应用。

序列表

<160>1

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly

1 5 10 15

Claims

1、一种预防和/或治疗自身免疫疾病的疫苗，它的活性成分是由造成自身免疫疾病的蛋白抗原胰岛素或其表位多肽和在多克隆位点插入自身蛋白抗原胰岛素或其表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物；所述胰岛素的表位多肽是序列表中的序列1。

2、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述预防和/或治疗自身免疫疾病的疫苗为预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗；该疫苗的活性成分是下述混合物之一：

1)由胰岛素和在多克隆位点插入所述胰岛素编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物；

2)由胰岛素表位多肽和在多克隆位点插入所述胰岛素表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物；

3)由胰岛素和在多克隆位点插入所述胰岛素表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物；

4)由胰岛素表位多肽和在多克隆位点插入所述胰岛素编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。

3、根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于：所述胰岛素来源于人、狗或猫。

4、根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：用于插入所述胰岛素编码基因或所述胰岛素表位多肽编码基因的真核细胞表达载体为哺乳动物细胞表达载体。

5、根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述哺乳动物细胞表达载体为pcDNA3.0或pVAX1或provax。

6、根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于：所述预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗的活性成分是人胰岛素蛋白和pVAX-insulin。

7、根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于：所述预防和/或治疗I型糖尿病的疫苗的活性成分是B9-23和pcDB9-23；其中，所述B9-23的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。

8、根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于：1)所述胰岛素和在多克隆位点插入所述胰岛素编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；

2)所述胰岛素表位多肽和在多克隆位点插入所述胰岛素表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；

3)所述胰岛素和在多克隆位点插入所述胰岛素表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；

4)所述胰岛素表位多肽和在多克隆位点插入所述胰岛素编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1。

9、根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于：1)所述胰岛素和在多克隆位点插入所述胰岛素编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶1-1∶2；

2)所述胰岛素表位多肽和在多克隆位点插入所述胰岛素表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶1-1∶2；

3)所述胰岛素和在多克隆位点插入所述胰岛素表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶1-1∶2；

4)所述胰岛素表位多肽和在多克隆位点插入所述胰岛素编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶1-1∶2。