CN111886022B

CN111886022B - 葎草花粉重组疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN111886022B
Application number: CN201980019111.8A
Authority: CN
Inventors: 周俊雄; 尹佳; 李欣
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2018-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2039-03-22
Also published as: WO2019179510A1; CN111886022A

Abstract

本发明涉及一种重组混合葎草花粉变应原疫苗及其制备方法，用于有效诊断由葎草花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。本发明重组疫苗涵盖了15种葎草花粉变应原蛋白，可以有效诊断由葎草花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

Description

葎草花粉重组疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及多种葎草花粉变应原以及一种通过注射脱敏来治疗葎草花粉症的重组疫苗及其制备方法。

背景技术

变态反应性疾病是全球性重大卫生问题之一。工业化国家超过25％的人口被变应性哮喘、变应性鼻结膜炎及变应性皮炎困扰，其中以变应性哮喘最为常见。吸入致敏花粉是引发变应性哮喘及其他呼吸道变态反应性疾病的最重要因素。VRTA—L.A等调查发现近50％的变态反应性疾病患者对草类花粉过敏。据今年国内调查，中国人群变态反应患病率伴随着经济生活水平提高有逐年增多的趋势。

葎草(HumμLus japonicus)主要分布在北半球温带和亚热带地区，远东地区报道较为多见。我国除新疆、青海外的各省区(包括台湾)均有分布，朝鲜、日本、俄罗斯、越南以及欧洲、美国东南部、加拿大西部地区亦有分布。上世纪八十年代我国第一次全国性气传致敏花粉调查中，在79个花粉收集点中有53个点可收集到葎草花粉，仅次于蒿属花粉，其分布范围基本上覆盖全国，播散高峰为八、九月，日播散高峰为下午两点至四点。

近年来发现葎草花粉已成为我国及东亚地区夏秋季节仅次于蒿属花粉的重要致敏。1990年对北京地区夏秋季主要致敏花粉的研究表明，夏秋季花粉症患者葎草花粉皮试≥++者达68％，血清sIgE阳性率达59％。1993年，孙秀珍报道对西安地区支气管哮喘的患者以葎草花粉浸液做皮试试验，54％的患者有阳性反应，仅次于藜草和蒿属花粉。2002年，王清菊等调查显示，沂蒙山区儿童过敏性哮喘患者吸入性变应原皮试试验中，夏秋花粉阳性率26.64％，其中葎草花粉阳性率为50.77％，占调查者总数的13.52％，占沂蒙山区致敏花粉的第三位。重庆、贵阳、淄博等地也对致敏花粉进行了流行病学调查，发现葎草草花粉在所调查地区均排在致敏花粉的第二位。有报告辽沈地区是我国葎草分布最多的地区，由葎草花粉引起的花粉症也已在所有测试花粉中位于第二位。2007年，姚丽娜等对北京花粉曝片研究发现，北京地区秋季气传花粉主要由大麻葎草属、蒿属花粉构成，其构成比分别为51％，31％；在花粉季节主要致敏花粉日平均浓度和最高浓度大麻葎草属均高于蒿属花粉。在韩国，6.1％～14％哮喘、鼻炎和结膜炎患者对葎草花粉过敏。在韩国苹果种植农民群体中，该花粉过敏12％。

对于葎草花粉变应原特异性免疫治疗(allergen specific immunotherapy,SIT)需要葎草花粉体内诊断制剂及治疗制剂。本研究通过葎草花粉cDNA表达文库的构建及大规模测序生物信息学分析，从而筛选出潜在的致敏蛋白病进行表达纯化，从而得到重组变应原疫苗。

目前用于变态反应疾病诊断及特异性免疫治疗的变应原仍为粗制浸出液，存在诸多问题：(1)成分复杂，其包含主要次要变应原，非致敏或毒性蛋白组分以及其他大分子、小分子物质；(2)安全隐患，在粗制浸出液制作过程中容易被外源性的毒性物质或病原微生物污染，影响其安全性；(3)其成分和浓度不稳定，难以进行变应原标准化；(4)产品的自发沉淀；(5)在治疗过程中长期使用可能会造成高敏体质的病人出现严重的IgE介导的过敏反应，可引起局部或者全身不良反应，严重者可致死亡；(6)由原料储存问题所带来的产量下降；(7)产品有效期无法明确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗葎草花粉过敏性疾病的重组疫苗。

本发明的另一目的在于提供上述疫苗的制备方法。

为实现上述目的，本发明通过DSN均一化文库构建法，构建得到酵母双杂交葎草花粉cDNA文库，通过筛选鉴定得到葎草变应原的15种蛋白的氨基酸序列，其序列分别是SEQID No.5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33。

基于此，本发明首先提供葎草花粉重组蛋白，其包括上述所示氨基酸序列的各蛋白，或者所述蛋白序列经插入、缺失或替换一个或几个氨基酸得到的具有同等功能的由所述蛋白衍生的蛋白。

进一，本发明提供包含上述任一所述蛋白的葎草花粉变应原疫苗，或者含有两个或两个以上所述蛋白的重组混合葎草花粉变应原疫苗。

进一步，本发明提供含有所述葎草花粉重组蛋白的治疗或诊断制剂。所述制剂中的各蛋白由体外重组表达获得，经配置获得所述制剂。由于本发明中的重组蛋白是通过体外重组表达获得，因此所述的制剂可以有确定和恒定的配比。

进一步地，所述制剂为疫苗。所述制剂还包括合适的佐剂。

进一步，本发明提供编码所述蛋白的基因。优选地，其核苷酸序列如所示SEQ IDNO.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32。

进一步，本发明提供含有所述基因的载体。该载体可以是克隆载体或表达载体，例如pPIC9K-attR1-CmR-ccd-attR2。

进一步，本发明提供含有所述载体的宿主细胞。例如酵母、大肠杆菌。

进一步，本发明提供一种制备所述蛋白的方法，其通过培养所述的宿主细胞，诱导表达，并分离得到所述蛋白。通过分别培养所述的宿主细胞，诱导表达，并分离得到所述蛋白，可以得到不同的蛋白，再经配置得到比例恒定的制剂。

本发明一种葎草花粉cDNA酵母表达文库构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)从pDEST-22中扩增目的片段attR1-Cm^R-ccd-attR2，并按SnaBI和AvrII克隆到目的载体pPIC9K上，得到终载体pPIC9K-attR1-Cm^R-ccd-attR2；

(2)Trizol法提取葎草花粉总RNA；

(3)从(2)提取的总RNA中分离mRNA；

(4)以(3)所得的mRNA为模板进行使用Superscript Full length libraryconstruction kit II进行DSN均一化全长cDNA文库的构建；

(5)将(4)所得到的初级全长均一化文库质粒中抽制备，再将初级均一化文库混合质粒通过LR反应重组到酵母载体pPIC9K-attR1-CmR-ccd-attR2上，然后将重组产物转化DH10B感受态细胞，并进行用抗性LB平板检测检测库容量，得到全长均一化酵母表达库。

上述方法所得到的cDNA文库为全长均一化文库，特点为能降低高峰度表达基因100倍以上，有效富集低丰度表达基因，且均一化后平均插入片段大小无明显变化。

所述的葎草花粉cDNA酵母表达文库构建方法，将pPIC9K-attR1-Cm^R-ccd-attR2酵母表达库菌液质粒中抽制备，将所得质粒电转化到甲醇酵母Pichia Pastoris GS115中，并在抗性平板上进行阳性筛选；随机选取克隆对插入片段进行PCR扩增，通过对比SDS-PAGE电泳结果选取片段大小不一致的克隆进行测序鉴定，得到其中40种如下插入片段的cDNA序列，并预测所获得的潜在成为葎草变应原的15种蛋白的氨基酸序列。

在上述基础上进一步制备葎草花粉重组疫苗：依据选择筛选出的cDNA，构建并筛选合适的表达菌株。培养并诱导表达目标蛋白，利用蛋白酶(TEV)切除纯化标签(6His)并纯化目标蛋白；对于没有标签的蛋白可以用其他常规纯化方法进行纯化。纯化所得到的15种蛋白经血清学验证为葎草花粉的主要致敏蛋白或次要变应原。并确定主要致敏蛋白与次要变应原以恒定比存在，再加以合适的佐剂得到标准化的葎草花粉重组变应原疫苗。

本发明还提供所述的葎草花粉重组疫苗在特异性免疫治疗中的应用，所述的过敏性疾病选自过敏性哮喘、变应性鼻炎、过敏性皮炎和慢性荨麻疹。

本发明还提供纯化所得的15种蛋白或其组合在诊断变态反应疾病的应用，所述的过敏性疾病选自过敏性哮喘、变应性鼻炎、过敏性皮炎和慢性荨麻疹。

本发明还提供葎草花粉重组疫苗进行精准特异性免疫治疗的应用，依据病人的过敏性疾病使用所述的重组疫苗进行诊断，确诊病人的葎草花粉过敏原组分，并生产相应组分的重组疫苗对病人进行精准特异性免疫治疗。

与粗制浸出液相比，重组变应原具有以下优点：(1)可以大规模精确生产，表达可以达到毫克或者微克级别，并且能保持极高的纯度，具有良好的批次一致性，满足了医学上对于变应原的质量要求；(2)利用发酵技术生产大大降低了生产成本；(3)可定量化，稳定性好，易于质控、标准化生产；(4)可以将产品的免疫原性与其致敏性区分开，进而大幅度提高重组变应原的治疗指数；(5)重组变应原的生物药效率及给药途径均优于粗制浸出变应原；(6)特异性高，提高了诊断敏感性，并推进了特异性免疫治疗便利试剂的发展。

本发明中所使用的Easy Select Pichia Expression System具有以下优点：(1)属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达；(2)AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平；(3)酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产；(4)可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化；(5)可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。

本发明通过对葎草cDNA表达文库测序及生物信息学分析，从而筛选出一系列潜在的变应原并进行表达，从而得到的重组变应原疫苗，不仅涵盖所有的潜在性变应原，可以安全高效得进行葎草花粉精准特异性免疫治疗，同时还可以精确有效诊断由葎草花粉诱发的变态反应疾病。针对不同的患者群体或个体，可以进行个性化治疗以达到治疗效果最大化最优化和副作用最小化。本产品还可将所有重组变应原按1:1比例组合给药；或根据天然浸出液中各组分致敏蛋白比例配比给药。

重组变应原的生物药效率及给药途径均优于粗制浸出变应原，特异性高，诊断敏感性高，便于储存运输，易于推广使用，成本低，见效快，周期短，能大大减轻轻患者的医疗负担，有利于推进特异性免疫治疗便利试剂的发展。

附图说明

图1是库容量鉴定情况(稀释度1:1000，涂布量50uL，克隆数310)；

图2是24个克隆菌落PCR SDS-PAGE电泳图；

图3是pDEST-22Vector质粒图谱；

图4是pPIC9K Vector质粒图谱；

图5是NC膜重组蛋白活性结果；

图6是重组混合葎草变应原疫苗对天然葎草变应原浸液的ELISA结合抑制试验结果；

图7重组混合葎草变应原疫苗嗜碱性粒细胞活化试验验证；

图8a单一组分葎草重组变应原对大鼠进行免疫治疗时，特异性sIgG 2a抗体升高，图中柱状图从上至下与图例从上至下的顺序一致；

图8b 15个组分混合葎草重组变应原对大鼠进行免疫治疗时，总的特异性sIgG 2a抗体升高。

具体实施方法

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 DSN均一化全长cDNA文库的构建

DSN均一化全长cDNA文库的构建参照Superscript Full length libraryconstruction kit II说明书进行。步骤如下：

1.pPICK9K载体改造：

从pDEST-22(图3)中扩增目的片段(attR1-Cm^R-ccd-attR2)并按SnaBI和AvrII克隆到目的载体pPIC9K(图4)上，得到终载体pPIC9K-attR1-Cm^R-ccd-attR2。

2.total RNA的提取：

Trizol法提取总RNA，并用SDS-PAGE及Thermo nanodrop核酸分析仪测定totalRNA浓度及纯度。

3.mRNA分离：

使用

MAG mRNA isolation Kit从第二阶段提取的total RNA中分离mRNA，并用SDS-PAGE及Thermo nanodrop核酸分析仪进行mRNA浓度及纯度的质量检测。

4.使用Superscript Full length library construction kit II进行DSN均一化全长cDNA文库的构建：

(1)以第三阶段得到的mRNA为模板进行cDNA第一链的合成；

(2)对(1)得到的cDNA进行RNaseI处理，再用biotin标记的cap抗体针富集带5’帽子结构的一链cDNA；

Biotin-DSN-attB2-Oligo(dT)Primer Sequence:(SEQ ID NO.1)

Biotin-GTTAAGCAGTGGATCAACGCAGAGTGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGT(T)19

PCR primer M1 attB2

(3)以(2)中带5’帽子结构的一链cDNA为模板PCR合成cDNA第二链；

5’接头Adapter Sequences:(SEQ ID NO.2、3)

5’-TCGTCAAGCAGTGGATCAACGCAGAGTGGCCACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG-3’

3’-CAGTTCGTCACCTAGTTGCGTCTCACCGGTGTTGAAACATGTTTTTTCAACC-5’

PCR primer M1 attB1

(4)对(3)中得到的cDNA进行杂交，并进行cDNA双链的DSN均一化处理；

(5)对(4)中DSN均一化处理后的cDNA进行线性化PCR扩增，根据SDS-PAGE电泳结果确定最佳的DSN处理样本；再根据之前确定的处理样本及其循环数，使用相应合适的内参基因对其在同样条件下进行PCR扩增，保证电泳结果与之前预实验一致；

(6)对cDNA双链进行分级分离纯化；

(7)将(6)中的到的分级分离纯化的cDNA与pDONR222载体(引物见SEQ ID NO.34、35)进行Gateway重组反应；

(8)将重组产物电转化入DH10B感受态细胞以构成cDNA文库；

(9)用多种方法对cDNA文库质量进行测定：使用卡那霉素平板筛选阳性菌，菌落计数法检测文库容量(重组子克隆数目)；每个文库随机挑取32个克隆子，进行菌落PCR，电泳检测重组克隆子比例(重组率)，以及平均插入片段大小；每个文库随机挑取32个克隆子抽提质粒进行双向测序，通过序列分析判断插入片段是否含有全长ORF。

5.全长均一化酵母表达库的构建和QC

将上一阶段得到的初级全长均一化文库质粒中抽制备，再将初级均一化文库混合质粒通过LR反应重组到酵母载体pPIC9K-attR1-Cm^R-ccd-attR2上(序列见SEQ ID NO.38)，然后将重组产物转化DH10B感受态细胞(见实施例2)，并进行用抗性LB平板检测检测库容量(重组子克隆数目)，同时每个文库随机挑取24个克隆子，进行菌落PCR，电泳检测重组克隆子比例(重组率)，以及平均插入片段大小(见实施例3)。

实施例2：ppic9k酵母双杂交文库的构建

2.1初级文库的质粒抽提

取包含了5×10⁶～1×10⁷个阳性克隆的文库菌液接种到100mL含有卡那霉素(工作浓度50ug/mL)的肉汤培养中，30℃250rpm摇菌培养至OD600为1.0。使用

HiPurePlasmid Filter Midiprep Kit提取文库质粒。

2.2文库质粒重组

2.2.1将得到的初级文库质粒,稀释到300ng/μL

按下表加入各成分：

初级文库质粒(300ng/μL)	1μL
		PPIC9K(300ng/μL)	1μL
LR Clonase II Mix	4μL
		ddH<sub>2</sub>O	14μL
总体积	20μL

混匀后置于25℃,16-20小时

2.2.2于LR重组反应体系中加入2μL的Proreinase K,37℃，15min；75℃，10min；

2.2.3加入180μL dd-water、1μL Glycogen(20ug/μL)、200μL 5MNH4OAc、1000μL100％ethanol，-80℃，静置15min；14,000rpm，4℃，离心25min，去上清；

2.2.4加入1ml 70％乙醇洗涤沉淀；14,000rpm，4℃，离心3min，去上清；重复此步骤；

2.2.5室温5-10min晾干重组产物；

2.2.6用8μL的TE Buffer反复吹打30-40次，溶解重组产物；

2.2.7先将1mm电转杯-80℃预冷，在冰上，将重组产物和50μL电转感受态细胞DH10B加入电转杯，冰上置45min；

2.2.8 TX ECM 630电转化仪上电击条件设置为：

电压	2.0kV
		电阻	200欧姆
容量	25uF

电击后迅速向电转杯中加入SOC培养基1mL；

2.2.9将电转物取入到新的15mL离心管，置于37℃，225-250rpm摇床培养1小时；

2.2.10培养结束后，取菌液10μL按照1:1000稀释取50μL涂布平板用于库容量鉴定；剩余培养物加入甘油至终浓度20％存于-80℃，此即为酵母文库菌液。

实施例3酵母文库质量鉴定

3.1库容量的鉴定

取转化后细菌原液10μL稀释1000倍后，从中取出50μL涂布LB平板(含相应抗性)，37℃培养过夜第二天计数。

CFU/mL＝平板上的克隆数/50μL×1000倍×1×10³μL＝平板上的克隆数310/50uL×1000×1000uL＝6.2×10⁶cfu/mL

文库总CFU＝CFU/mL×文库菌液总体积(mL)＝6.2×10⁶cfu/mL×3mL＝1.86×10⁷cfu

3.2重组率和插入片段长度鉴定

随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定(5’AOX及3’AOX序列如SEQ ID NO.36、37所示)，配制如下反应液：

ddH<sub>2</sub>O	16.2μL
		10×PCR Buffer	2.0μL
dNTP(10mM)	0.5μL
		5’AOX(20uM)	0.5μL
3’AOX(20uM)	0.5μL
		DNA Polymerase(5U/μL)	0.3μL
Total	20μL

在AB 2720PCR仪上按以下条件进行PCR反应:

表1、24个文库插入片段长度和重组率

实施例4双膜法鉴定重组蛋白活性

用无菌牙签将40个重组表达文库接种到MM板上同时，接种已转染了不含目的肽段的pPIC9K质粒的GS115空白对照菌作为对照克隆。待长成直径约2mm的克隆后，将NC膜湿热灭菌后，贴于MM板上的克隆，做好标记，倒置，继续置29℃培养，待克隆位置被湿透后(约3～4d)，揭下NC膜，37℃干燥，形成固相抗原斑点。经质量分数1％BSA封闭1h，加入15个病人混合血清池作为一抗，37℃2h，洗涤3次，加入1：1000酶标小鼠抗人IgE，37℃1h，洗涤3次，加入ECL底物显色，观察斑点颜色，确定重组蛋白活性。并将对应转化子进行单菌落测序。有17个菌落显示阳性结果，见图5。单菌落测序结果见表2，其中发现Hum s3为本申请人此前所发现的NCBI数据库中Hum s3：ADB97919.1cDNA序列完全一致；Hum SX 2与NCBI数据库中已注册的EU088286.1cDNA序列完全一致，故未列于表2。

表2阳性单菌落测序结果

备注：NCBI的注册号暂未公开

实施例4双膜法快速筛选甲醇酵母高表达菌株

从MD板上挑出转化子，分别接种到96孔培养板中，培养孔为加G418的YPD液(1％酵母提取物、2％蛋白胨、质量分数2％葡萄糖，2.5mg/mL G418)中，29℃培养5～6d，将长出的菌落接种到另一加同样质量浓度G418的新板中，29℃培养5～6d；将长出的菌落接种到加4.0mg/mL G418的新板中，29℃培养5～6d，将长出的菌落接种到另一加同样质量浓度G418的新板中，29℃培养5～6d。各取2.5mg/mL G418和4.0mg/mL G418板中待筛选的菌液分别划线涂布在相应质量浓度的YPD-G418平板上，29℃培养至单菌落出现。用无菌牙签随机挑取不同质量浓度G418平板上的60个转化子，接种到MM板上(质量分数1.34％YNB、4×10^-5％生物素、0.5％甲醇和1.5％琼脂)，同时，接种已转染了不含目的肽段的pPIC9K质粒的GS115空白对照菌作为对照克隆。待长成直径约2mm的克隆后，将NC膜湿热灭菌后，贴于MM板上的克隆，做好标记，倒置，继续置29℃培养，待克隆位置被湿透后(约3～4d)，揭下NC膜，37℃干燥，形成固相抗原斑点。经质量分数1％BSA封闭1h，加入兔抗猪ZP3抗体，37℃2h，洗涤3次，加入1：500酶标羊抗兔IgG，37℃1h，洗涤3次，加入DAB-H₂O₂底物显色，观察斑点颜色深浅。分别挑取NC膜上斑点颜色最深(强阳性)的和显示阳性的相应克隆，按Invitrogen公司手册进行常规摇瓶培养诱导，取上清进行常规SDS-PAGE、Western Blotting鉴定。

实施例5扩大培养、诱导表达及纯化

BMG培养基中接种相应酵母株，30℃培养过夜，转接入发酵罐中培养，氨水维持pH为6.0，溶氧度维持在60％，进行高密度培养。此后菌体在BMM培养基中培养，维持甲醇浓度为1％，诱导表达3-4d。离心收集上清，适当加入PMSF作为蛋白酶抑制剂。固定Ni柱及废液收集器皿，流出柱内20％乙醇，加入PBS 1CV清洗Ni柱。清溶液上柱，控制流速在150cm/h，可适当采取注射器针、移液器枪头控制流速，接取流穿液样品，此样品做为流穿样品。取PBS配制25mM咪唑溶液1-1.5CV清洗Ni柱，接取洗杂液样品。取PBS配制200mM咪唑溶液1CV左右洗脱目的蛋白，收集至离心管中，此样品为纯化后目的蛋白。将TEV Protease加入含高浓度咪唑的刚刚纯化的目的蛋白溶液中，在4℃边透析去除咪唑边进行酶切，最终得到目的变应原蛋白。

实施例6 ELISA结合抑制试验

IgE结合抑制试验可评价2种含有相似抗原表位的抗原或抗原混合物。本实施例以此评价重组混合葎草花粉变应原疫苗(本例中以等量比例混合不同重组变应原)与天然变应原浸液之间在IgE结合表位上的相似性(交叉反应性)，以评估利用混合重组葎草花粉变应原疫苗替代葎草花粉天然变应原浸液进行免疫治疗的可行性。

1包被：包被缓冲液(Na₂CO₃ 0.16g，NaHCO₃ 0.293g，100ml，pH9.6)稀释天然葎草变应原浸液，以5μg/孔包被于96孔酶标板(A-D行,1-12列)中，封板4℃过夜包被。

2洗板：弃去液体，PBST洗板3次，每次3min，吸水纸吸干孔内液体。

3封闭：加入封闭液1％BSA-PBST，每孔200μl，室温静置2小时。

4洗板：弃去液体，洗板3次，每次3min，吸水纸吸干孔内液体。

5抑制物样品制备：

稀释液将天然葎草变应原浸液稀释至5μg/ml作为第一稀释度，布置在A3-12，B3-12(复孔)，以3×倍比稀释，50μl/孔；

将重组混合葎草变应原疫苗稀释至0.05μg/ml作为第一稀释度，布置在C3-12，D3-12(复孔)，以3×倍比稀释，50μl/孔。

6阴、阳性血清池稀释液制备：

稀释液将阳性血清池(15例葎草过敏患者血清等比例混合)1：5稀释。50μl/孔加入到A2-A12，B2-12，C2-12，D2-12。

稀释液将阴性血清池(健康对照5例，等比例混合)1：5稀释。50μl/孔加入到A1-D1。

然后加入50μl/孔1％BSA-PBST稀释液至A1-D1、A2-D2使阴性、阳性对照的血清滴度与A3-A12，B3-12，C3-12，D3-12血清滴度相同。

7一抗孵育：封板37℃、2h后，4℃过夜孵育。

8洗板：弃去液体，洗板3次，每次3min，水纸吸干孔内液体。

9孵育生物素标记的羊抗人IgE抗体(二抗)：稀释液1:1000稀释抗体，每孔100μl，室温1h。

10洗板：弃去液体，洗板3次，每次3min，水纸吸干孔内液体。

11孵育辣根酶标记链亲和素：稀释液1:500稀释二抗，每孔100μl，室温0.5h。

12洗板：弃去液体，洗板3次，每次3min，水纸吸干孔内液体。

13显色：加入显色液，每孔100ul，室温避光5min。

14终止：加入终止液，每孔50ul，30分钟内450nm读数。

数据分析时，以Log稀释度为横坐标，以抑制率为纵坐标作图。OD_阴性对照＝(A1+B1+C1+D1)/4；OD_阳性对照＝(A2+B2+C2+D2)/4；每个竞争抑制稀释度的OD值取复孔均值；每个竞争抑制稀释度的抑制率％＝(OD_阳性对照-OD_{稀释度均值})/(OD_阳性对照-OD_阴性对照)*100％。以A3-A12，B3-12考察梯度稀释的天然葎草花粉变应原浸液对包被在酶标板的天然葎草花粉变应原与葎草花粉过敏患者血清IgE抗体反应时的竞争抑制效应；以C3-12，D3-12考察梯度稀释的重组葎草花粉变应原疫苗对包被在酶标板的天然葎草花粉变应原与葎草花粉过敏患者血清IgE抗体反应时的竞争抑制效应。

结果见图6所示，可见本实施例中，第一稀释度时，天然葎草花粉变应原(5μg/ml)对包被的天然葎草花粉变应原达到97.5％抑制，而重组混合葎草疫苗(0.05μg/ml)对包被的天然葎草花粉变应原达到69％的抑制。结果表明，重组混合葎草疫苗与天然葎草花粉变应原约有69％/97.5％＝70.8％的相似度，说明二者之间相似度较高，交叉反应大，在人IgE抗原识别方面，重组混合葎草疫苗基本能替代天然葎草花粉浸液；另外表明，重组混合葎草疫苗在达到天然葎草花粉浸液70.8％的效价时，其浓度只需天然葎草花粉浸液的1％(0.05μg/ml/5μg/ml)，说明在同浓度条件下，重组混合葎草疫苗由于去除了葎草花粉中非变应原组分，其生物活性大大较高。由于重组混合葎草疫苗成分清楚、各组分含量便于精确控制，且易于单组分纯化及组合，因此代表了该变应原精准分子诊疗的发展方向。

实施例7嗜碱性粒细胞活化试验

本发明的制备的重组葎草花粉变应原疫苗对葎草花粉过敏患者全血进行嗜碱性粒细胞活化试验，从而验证其具有结合sIgE抗体、活化嗜碱性粒细胞脱颗粒的变态反应生物学功能。从理论上也证实其具备了特异性免疫治疗疫苗的特点。因此，其具有成为重组变应原疫苗的功能。

试验原理：变应原与患者全血细胞反应可以模拟人体内变态反应过程：即特异性IgE抗体通过与相应的变应原桥联结合到细胞表面，激活细胞内信号级联导致嗜碱性粒细胞(CCR3持续表达于嗜碱性粒细胞，是其特异性标记)的活化脱颗粒。在这个脱颗粒的过程中，细胞内复合物影响跨膜蛋白CD63(gp53)，使其外表达于细胞表面，并暴露于细胞外基质中，因此可以依赖流式细胞术原理(使用抗人趋化因子受体CCR3-藻红蛋白(anti-CCR3-PE)对嗜碱性粒细胞进行标记，使用抗人CD63单克隆抗体-异硫氰酸荧光素(anti-CD63-FITC)对活化状态的嗜碱性粒细胞进行标记，非特异性细胞活化剂fMLP作为一种阳性质控)，并以嗜碱性粒细胞脱颗粒的百分数变化来判断对照是否对特定变应原过敏。方法：选择健康对照、葎草过敏患者，取其EDTA抗凝全血样本，以刺激缓冲液(阴性对照)、重组葎草花粉变应原疫苗混合物(对各组分以均等比例混合，稀释至2×10-7mg/ml)、fMLP刺激液(阳性质控)作为嗜碱性粒细胞的激活物，加入到全血中，然后加入anti-CD63-FITC、anti-CCR3-PE染色，48h内上流式细胞仪进行检测。结果：见图7。健康对照以阴性对照、重组葎草花粉变应原疫苗、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、＜15％、≥15％，葎草花粉过敏患者以阴性对照、重组葎草花粉变应原疫苗、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、≥15％、≥15％。结论：该重组葎草花粉变应原疫苗能有效结合sIgE抗体、活化嗜碱性粒细胞脱颗粒，因此具备抗原性和相应生物学功能，既能有效应用于葎草花粉过敏患者的特异性诊断，也可作为潜在的治疗性疫苗，具有开发应用前景。

实施例8重组混合葎草花粉变应原疫苗对小鼠过敏性哮喘模型免疫治疗评价

目的：(1)建立混合重组葎草花粉变应原过敏的哮喘小鼠模型；(2)利用葎草花粉变应原重组混合疫苗(包含表2所述的15种葎草致敏蛋白，以及按本发明所述实施例4、5所得到的Hum s 3和Hum SX 2两种致敏蛋白分子)过敏的哮喘小鼠特异性免疫治疗。方法：(1)使用颈后皮下致敏加雾化激发的方法进行混合重组葎草花粉变应原过敏的哮喘小鼠模型建立；(2)给予建模成功小鼠，使用颈后皮下注射方法，给予混合重组葎草花粉变应原过敏的哮喘小鼠一定时间的特异性免疫治疗。结果：(1)研究发现模型组sRAW值较对照组明显升高，特别是在乙酰胆碱浓度为25mg/ml和50mg/ml时(p<0.01)，证明小鼠哮喘模型建立成功。经特异性免疫治疗后，治疗组sRAW值较模型组降低，特别是在乙酰胆碱浓度为25mg/ml和50mg/ml时(p<0.01)，证明以重组混合葎草花粉变应原疫苗对小鼠哮喘模型进行免疫治疗降低、改善了小鼠的气道高反应性。(2)模型组炎症细胞总数，中性粒细胞数，淋巴细胞数，单个核细胞数，嗜酸性粒细胞数数量相比于对照组都明显升高(P＜0.01)；说明模型组小鼠的气道发生了严重的炎症反应，且炎症细胞的浸润以EOS为主，EOS％也明显增高(P＜0.01)，说明建模成功。经过特异性免疫治疗后，治疗组炎症细胞总数，中性粒细胞数，淋巴细胞数，嗜酸性粒细胞数数量相比于模型组都明显降低(P＜0.01)，EOS％也明显下降(P＜0.01)，说明免疫治疗有效的抑制小鼠气道炎症，减少细胞浸润。(3)研究发现模型组小鼠的总IgE和混合重组葎草花粉变应原sIgE的水平均显著高于对照组小鼠(P＜0.01)，证明本实验建模成功，可以诱导小鼠产生大量IgE。经过特异性治疗后，治疗组总IgE和混合重组葎草花粉变应原sIgE的表达量相对于模型组明显降低(P＜0.01)，证明免疫治疗成功抑制了IgE的产生。另外，治疗组混合重组葎草花粉变应原疫苗sIgG的表达量相对于模型组明显升高(P＜0.01)，证明免疫治疗成功诱导了sIgG抗体的产生。(4)肺组织HE染色发现模型组小鼠肺部气管和周围血管有大量炎性细胞浸润，形成多层细胞环，同时伴有气道增厚和水肿。对照组未见特殊异常。经特异性免疫治疗后，小鼠肺部气管和周围血管炎症细胞浸润和水肿明显缓解；肺组织AB-PAS染色发现：模型组气道壁广泛被染成蓝紫色，气道内也可以看到弥散的蓝紫色，说明产生大量的粘液物质；气道上皮中增生的杯状细胞占气道上皮细胞总数＞75％。对照组未见明显异常，气道上皮中增生的杯状细胞占气道上皮细胞总数<25％。治疗组气道壁部分被染成蓝紫色，气道上皮中增生的杯状细胞占气道上皮细胞总数<50％。结论：(1)混合重组葎草花粉变应原疫苗过敏的哮喘小鼠模型建立成功；(2)混合重组葎草花粉变应原疫苗过敏的哮喘小鼠特异性免疫治疗有效。

实施例9葎草花粉重组疫苗个体化治疗

目的：评价单一及其混合葎草花粉重组分子疫苗重复皮下注射给予SD大鼠的免疫保护反应及毒性反应，评价单一及其混合葎草花粉重组疫苗在动物体内引起与人体相关的体液免疫应答，为葎草花粉重组疫苗个体化分子治疗的临床试验和临床应用提供药理和安全性方面的动物试验资料。

方法：选用健康的SPF级SD大鼠204只，雌雄各半。按体重和性别随机分为17组，每组12只。编号#1-15组为葎草单分子重组疫苗给药处理组，分别对应本发明Hum SC 1-15的重组蛋白(对应前述表2，分别酵母诱导、表达、纯化、冻干)；编号#16组为葎草混合重组疫苗给药处理组，将本发明Hum SC1-15的重组蛋白等比例混合后组成；编号#17组为溶媒对照组(0.2％-0.4％苯酚，4.5-5.5g/L氯化钠，0.025％-0.035％人血清白蛋白)。给药途径：皮下注射。给药浓度及体积：#1-15组，每只注射0.05ug/ml*1.0ml。#16组，每只注射0.06ug/ml*1.0ml(相当于Hum SC1-15每种葎草重组致敏蛋白0.0015ug/ml*1.0ml给药量之和)。给药频率：每周给药2次，间隔2-3天。连续给药6个月，恢复期：停药恢复1个月。在整个实验期间对实验动物进行以下检查：一般症状观察、注射部位刺激性、体重、摄食量检查。并于连续给药后6个月和恢复期停药1个月结束时对动物分别安乐死(3只/性别/组)，动物大体解剖及病理组织学检查，测定血清IgG2a含量以评估抗原免疫效果。大鼠血清IgG2a含量检测用RatIgG2a ELISA Kit((江莱生物))。

结果：(1)动物一般症状观察：在整个试验期间各组动物未见呼吸、运动、眼睑指征、粪便、尿道、皮肤、毛发、唾液分泌等方面的异常症状，以及与供试品相关的濒死和死亡的毒性反应。(2)注射部位刺激性：肉眼观察：在给药6个月期间及恢复期，各组大鼠注射部位局部，均未出现充血、水肿、硬结、坏死等局部反应。(3)体重及摄食量：给药6个月和停药1个月，各组雄性大鼠、雌性大鼠体重均增长，与CN对照组动物比较，差异未见统计学意义(P>0.05)。(4)组织病理学检查结果：各动物大体解剖实质性脏器形态及色泽正常，质地均匀，无肿块。空腔脏器粘膜完整，色泽正常。镜下观察结果，给药结束和恢复期结束各组动物各受检脏器(给药部位皮下组织除外)未见与供试品有关的病理改变。(5)给药6个月和停药1个月，各组雄性大鼠、雌性大鼠总IgG2a(total IgG2a，即tIgG2a)没有显著变化，但葎草变应原各组分特异性IgG2a(specific IgG2a，即sIgG2a，例如Hum SC1 sIgG2a，Hum SC2sIgG2a，Hum SC3 sIgG2a……,Hum SC15 sIgG2a)含量给药组与对照组间均有统计学差异(P<0.05)，且葎草重组混合疫苗(Hum SC1-15等量混合)的给药组与对照组的sIgG2a含量有统计学差异(P<0.05)，详见附图8a、图8b。

结论：本发明涉及的葎草单分子变应原重组疫苗Hum SC 1-15以及葎草变应原混合重组疫苗(Hum SC 1-15各组分含量均一)在本实施例方案下，大鼠的一般症状观察、体重、摄食、脏器重量、脏器系数、大体解剖检查等结果均未见与相关单分子疫苗、混合疫苗及溶媒对照品有关的毒理学改变，说明本发明重组的单分子疫苗及混合疫苗具有较好的安全性。大鼠在接受免疫治疗后，单分子疫苗及混合疫苗均产生了较高滴度的具有免疫保护作用的IgG2a抗体(在人免疫治疗中，产生的是高滴度的IgG4抗体，与IgE竞争性结合，减轻过敏炎症反应)，且在恢复期停药1个月后，保护性IgG2a抗体仍持续存在，证实本发明所述的单一及混合葎草重组变应原疫苗免疫治疗具有长期疗效和保护作用，且安全性好。

实施例10葎草花粉重组疫苗个性化治疗方案

10.1精确诊断

使用葎草花粉所有潜在变应原的点刺液对患者进行点刺试验，用生理盐水作阴性对照，组胺作阳性对照。所有患者进行皮试前均停用抗过敏药物及激素1周。皮肤点刺部位选用前臂曲侧，采用酒精消毒后，在皮肤上每间隔3cm进行1种过敏原点刺。点刺8min后观察组胺反应，15～20min观察变应原反应。根据变应原风团块范围与标准组织胺风团范围的比较，确诊病人的葎草花粉过敏原组分。

10.2个性化治疗

根据病人对葎草花粉变应原点刺试验的诊断结果，确定重组疫苗的组分与配比。将纯化后的变应原按照病人所需配置并加入佐剂制成各种不同浓度的重组疫苗，经反复注射或舌下含服或通过其它给药途径与患者反复接触，剂量由小到大，浓度由低到高，达到维持剂量后，维持足够的疗程，从而提高患者对该种变应原的耐受性，当再次接触此种变应原时，过敏现象得以减轻或不再产生过敏现象。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> 葎草花粉重组疫苗及其制备方法

<130> P1810112P

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

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<220>

<221> CDS

<222> (1)..(516)

<400> 14

atg gca aaa gca aaa gcc aga gca gtt att gca aag aag gac ctc aaa 48

Met Ala Lys Ala Lys Ala Arg Ala Val Ile Ala Lys Lys Asp Leu Lys

1 5 10 15

tcc tca aat ttc act ccg gcg ctc cat cct cct tac ata gag atg gtc 96

Ser Ser Asn Phe Thr Pro Ala Leu His Pro Pro Tyr Ile Glu Met Val

20 25 30

tgc aat gcg ata ttg gcg ttg aag gag agg agc ggg tca agc cag caa 144

Cys Asn Ala Ile Leu Ala Leu Lys Glu Arg Ser Gly Ser Ser Gln Gln

35 40 45

gcg atc gcg aaa gcc att gaa gag aag tac cag aag gtt ttg cct atg 192

Ala Ile Ala Lys Ala Ile Glu Glu Lys Tyr Gln Lys Val Leu Pro Met

50 55 60

aat ttc aag aaa ctt tta tcg gtt caa ttg aag aag ttc gtc aaa tca 240

Asn Phe Lys Lys Leu Leu Ser Val Gln Leu Lys Lys Phe Val Lys Ser

65 70 75 80

gaa agg ctc gtc aag gtg aag aac tcg ttc aaa att tcc tcc act gaa 288

Glu Arg Leu Val Lys Val Lys Asn Ser Phe Lys Ile Ser Ser Thr Glu

85 90 95

aaa ctg aaa ctc acc att agc gaa gac ctg aag atc aag aag aaa gag 336

Lys Leu Lys Leu Thr Ile Ser Glu Asp Leu Lys Ile Lys Lys Lys Glu

100 105 110

caa tct gca ctg ccg aag gaa aag tca gtc gag aaa gtc tcg cgc atg 384

Gln Ser Ala Leu Pro Lys Glu Lys Ser Val Glu Lys Val Ser Arg Met

115 120 125

ggg gta aag acc aag agg ttg agc cag gtt aag act ccg aaa ggc ctt 432

Gly Val Lys Thr Lys Arg Leu Ser Gln Val Lys Thr Pro Lys Gly Leu

130 135 140

aag aag ccg gcg gtg gcg atc aag aag atg aag gcg ttg act gag gtc 480

Lys Lys Pro Ala Val Ala Ile Lys Lys Met Lys Ala Leu Thr Glu Val

145 150 155 160

aat acc cct gaa ggg ctg aag aag aag agg act taa 516

Asn Thr Pro Glu Gly Leu Lys Lys Lys Arg Thr

165 170

<210> 15

<211> 171

<212> PRT

<213> HumμLus japonicus

<400> 15

Met Ala Lys Ala Lys Ala Arg Ala Val Ile Ala Lys Lys Asp Leu Lys

1 5 10 15

Ser Ser Asn Phe Thr Pro Ala Leu His Pro Pro Tyr Ile Glu Met Val

20 25 30

Cys Asn Ala Ile Leu Ala Leu Lys Glu Arg Ser Gly Ser Ser Gln Gln

35 40 45

Ala Ile Ala Lys Ala Ile Glu Glu Lys Tyr Gln Lys Val Leu Pro Met

50 55 60

Asn Phe Lys Lys Leu Leu Ser Val Gln Leu Lys Lys Phe Val Lys Ser

65 70 75 80

Glu Arg Leu Val Lys Val Lys Asn Ser Phe Lys Ile Ser Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Leu Lys Leu Thr Ile Ser Glu Asp Leu Lys Ile Lys Lys Lys Glu

100 105 110

Gln Ser Ala Leu Pro Lys Glu Lys Ser Val Glu Lys Val Ser Arg Met

115 120 125

Gly Val Lys Thr Lys Arg Leu Ser Gln Val Lys Thr Pro Lys Gly Leu

130 135 140

Lys Lys Pro Ala Val Ala Ile Lys Lys Met Lys Ala Leu Thr Glu Val

145 150 155 160

Asn Thr Pro Glu Gly Leu Lys Lys Lys Arg Thr

165 170

<210> 16

<211> 537

<212> DNA

<213> HumμLus japonicus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(537)

<400> 16

atg atg agg tct caa aaa atg tct cta aat aat gag gcc tca aca aaa 48

Met Met Arg Ser Gln Lys Met Ser Leu Asn Asn Glu Ala Ser Thr Lys

1 5 10 15

gtt ttg ttg gta gga caa atg ttg atg gtg atg atg gtg atc gct act 96

Val Leu Leu Val Gly Gln Met Leu Met Val Met Met Val Ile Ala Thr

20 25 30

gct gcg aaa cca ttc ccg acg gat aat aag tcc tct cac aag gcc tac 144

Ala Ala Lys Pro Phe Pro Thr Asp Asn Lys Ser Ser His Lys Ala Tyr

35 40 45

ctc gat gcc cac aac gcc gtc cga gca aag gtg ggc gtt ggc cca atg 192

Leu Asp Ala His Asn Ala Val Arg Ala Lys Val Gly Val Gly Pro Met

50 55 60

act tgg aac aag acc cta gag gat tac gca caa aaa tac gcc aac tca 240

Thr Trp Asn Lys Thr Leu Glu Asp Tyr Ala Gln Lys Tyr Ala Asn Ser

65 70 75 80

agg cta agt aat aaa tgt gag ttt gag cac tcc gga ggg cct tac ggc 288

Arg Leu Ser Asn Lys Cys Glu Phe Glu His Ser Gly Gly Pro Tyr Gly

85 90 95

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Glu Asn Leu Cys Glu Gly Tyr Gly Glu Met Pro Gly Glu Gln Ala Val

100 105 110

aag tat tgg gca gat gag aag tcc cat tat gat tac gcc tcc aac tcg 384

Lys Tyr Trp Ala Asp Glu Lys Ser His Tyr Asp Tyr Ala Ser Asn Ser

115 120 125

tgt gtg gga ggg gag tgc ggc cac tac act cag ttg gtg tgg cgc aac 432

Cys Val Gly Gly Glu Cys Gly His Tyr Thr Gln Leu Val Trp Arg Asn

130 135 140

tcc gtt caa ctt ggc tgc gcc agg acc atg tgc tcc aat ggc tgg atg 480

Ser Val Gln Leu Gly Cys Ala Arg Thr Met Cys Ser Asn Gly Trp Met

145 150 155 160

ttc gtc att tgc agc tat tat ccc ccg ggc aat tat tta gac caa cga 528

Phe Val Ile Cys Ser Tyr Tyr Pro Pro Gly Asn Tyr Leu Asp Gln Arg

165 170 175

ccc tat taa 537

Pro Tyr

<210> 17

<211> 178

<212> PRT

<213> HumμLus japonicus

<400> 17

Met Met Arg Ser Gln Lys Met Ser Leu Asn Asn Glu Ala Ser Thr Lys

1 5 10 15

Val Leu Leu Val Gly Gln Met Leu Met Val Met Met Val Ile Ala Thr

20 25 30

Ala Ala Lys Pro Phe Pro Thr Asp Asn Lys Ser Ser His Lys Ala Tyr

35 40 45

Leu Asp Ala His Asn Ala Val Arg Ala Lys Val Gly Val Gly Pro Met

50 55 60

Thr Trp Asn Lys Thr Leu Glu Asp Tyr Ala Gln Lys Tyr Ala Asn Ser

65 70 75 80

Arg Leu Ser Asn Lys Cys Glu Phe Glu His Ser Gly Gly Pro Tyr Gly

85 90 95

Glu Asn Leu Cys Glu Gly Tyr Gly Glu Met Pro Gly Glu Gln Ala Val

100 105 110

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115 120 125

Cys Val Gly Gly Glu Cys Gly His Tyr Thr Gln Leu Val Trp Arg Asn

130 135 140

Ser Val Gln Leu Gly Cys Ala Arg Thr Met Cys Ser Asn Gly Trp Met

145 150 155 160

Phe Val Ile Cys Ser Tyr Tyr Pro Pro Gly Asn Tyr Leu Asp Gln Arg

165 170 175

Pro Tyr

<210> 18

<211> 330

<212> DNA

<213> HumμLus japonicus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(330)

<400> 18

atg aaa ggg gag ttt gcc cca atc tac ttg ggg atg gga agg ggg ttg 48

Met Lys Gly Glu Phe Ala Pro Ile Tyr Leu Gly Met Gly Arg Gly Leu

1 5 10 15

gct gcc ctg aca agg gca acc cac acg gca aag cac cac ctg ttg cat 96

Ala Ala Leu Thr Arg Ala Thr His Thr Ala Lys His His Leu Leu His

20 25 30

tcc ccc tct gtc agc ggg agc aaa aaa aaa aaa aaa aca agg gcc aag 144

Ser Pro Ser Val Ser Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Thr Arg Ala Lys

35 40 45

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Gly Glu Tyr Pro Asp Ala Val Ile Ser Ser Ala Asp Lys Phe Val Asn

50 55 60

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Lys Ser Phe Leu Lys Lys Gly Ala His Ile Gln Asn Pro Asn Pro Pro

65 70 75 80

ctc cct gac cct att caa cca aac ccc ttt act caa tct aga ggg gca 288

Leu Pro Asp Pro Ile Gln Pro Asn Pro Phe Thr Gln Ser Arg Gly Ala

85 90 95

gaa aca ctt aaa aca gtc ggt gtg aac cca agc cgc cgt tga 330

Glu Thr Leu Lys Thr Val Gly Val Asn Pro Ser Arg Arg

100 105

<210> 19

<211> 109

<212> PRT

<213> HumμLus japonicus

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Met Lys Gly Glu Phe Ala Pro Ile Tyr Leu Gly Met Gly Arg Gly Leu

1 5 10 15

Ala Ala Leu Thr Arg Ala Thr His Thr Ala Lys His His Leu Leu His

20 25 30

Ser Pro Ser Val Ser Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Thr Arg Ala Lys

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Gly Glu Tyr Pro Asp Ala Val Ile Ser Ser Ala Asp Lys Phe Val Asn

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Lys Ser Phe Leu Lys Lys Gly Ala His Ile Gln Asn Pro Asn Pro Pro

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Leu Pro Asp Pro Ile Gln Pro Asn Pro Phe Thr Gln Ser Arg Gly Ala

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Glu Thr Leu Lys Thr Val Gly Val Asn Pro Ser Arg Arg

100 105

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<211> 222

<212> DNA

<213> HumμLus japonicus

<220>

<221> CDS

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<400> 20

atg ctg atg agg aag gtc acg acg att acg aga aca gtt gcg gct gga 48

Met Leu Met Arg Lys Val Thr Thr Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Gly

1 5 10 15

aac gaa gag agt act gcg att ccc atg ctt ccc tgt gag ctg acc gta 96

Asn Glu Glu Ser Thr Ala Ile Pro Met Leu Pro Cys Glu Leu Thr Val

20 25 30

tgt cat gtg cag agg aag cag act gct gta aca aca atg gca gag aca 144

Cys His Val Gln Arg Lys Gln Thr Ala Val Thr Thr Met Ala Glu Thr

35 40 45

gat tgc acc aat gac gct cgt tgc agg tat cat aga cca gga cca agg 192

Asp Cys Thr Asn Asp Ala Arg Cys Arg Tyr His Arg Pro Gly Pro Arg

50 55 60

att gag act cct agc acg cca acg aca taa 222

Ile Glu Thr Pro Ser Thr Pro Thr Thr

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<211> 73

<212> PRT

<213> HumμLus japonicus

<400> 21

Met Leu Met Arg Lys Val Thr Thr Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Gly

1 5 10 15

Asn Glu Glu Ser Thr Ala Ile Pro Met Leu Pro Cys Glu Leu Thr Val

20 25 30

Cys His Val Gln Arg Lys Gln Thr Ala Val Thr Thr Met Ala Glu Thr

35 40 45

Asp Cys Thr Asn Asp Ala Arg Cys Arg Tyr His Arg Pro Gly Pro Arg

50 55 60

Ile Glu Thr Pro Ser Thr Pro Thr Thr

65 70

<210> 22

<211> 432

<212> DNA

<213> HumμLus japonicus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(432)

<400> 22

atg cct gct ctt agt gta aaa atg ttg gca tta tta caa aca tgt att 48

Met Pro Ala Leu Ser Val Lys Met Leu Ala Leu Leu Gln Thr Cys Ile

1 5 10 15

att gtc aca aca ttg ttt tct tgc gca caa gca acc aaa aat gaa aca 96

Ile Val Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ala Gln Ala Thr Lys Asn Glu Thr

20 25 30

aaa att gag caa gtt gat gta agg aac gtt ttg gat gga aaa caa gac 144

Lys Ile Glu Gln Val Asp Val Arg Asn Val Leu Asp Gly Lys Gln Asp

35 40 45

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Leu Ser Val Tyr Cys Lys Ser Arg Asn Asn Glu Phe Asn Thr Gln Ile

50 55 60

ctg tcc tac aaa ggc act cga act cta aat ttc acg caa acc ttt aac 240

Leu Ser Tyr Lys Gly Thr Arg Thr Leu Asn Phe Thr Gln Thr Phe Asn

65 70 75 80

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Asn Thr Glu Ile His Cys Ser Phe Ser Trp Asp Arg Glu Phe His Asn

85 90 95

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Val Gln Ile Phe Met Pro Glu Ser Leu Asn Cys Arg Val Pro Asp Lys

100 105 110

tgc ttt tgg tat atc aat ctt ttt ggg att tgt cta tct cat act aaa 384

Cys Phe Trp Tyr Ile Asn Leu Phe Gly Ile Cys Leu Ser His Thr Lys

115 120 125

tct ttt aca ttt gat tgc ttt gat tgg ggc aaa caa gtt ttt ggg tga 432

Ser Phe Thr Phe Asp Cys Phe Asp Trp Gly Lys Gln Val Phe Gly

130 135 140

<210> 23

<211> 143

<212> PRT

<213> HumμLus japonicus

<400> 23

Met Pro Ala Leu Ser Val Lys Met Leu Ala Leu Leu Gln Thr Cys Ile

1 5 10 15

Ile Val Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ala Gln Ala Thr Lys Asn Glu Thr

20 25 30

Lys Ile Glu Gln Val Asp Val Arg Asn Val Leu Asp Gly Lys Gln Asp

35 40 45

Leu Ser Val Tyr Cys Lys Ser Arg Asn Asn Glu Phe Asn Thr Gln Ile

50 55 60

Leu Ser Tyr Lys Gly Thr Arg Thr Leu Asn Phe Thr Gln Thr Phe Asn

65 70 75 80

Asn Thr Glu Ile His Cys Ser Phe Ser Trp Asp Arg Glu Phe His Asn

85 90 95

Val Gln Ile Phe Met Pro Glu Ser Leu Asn Cys Arg Val Pro Asp Lys

100 105 110

Cys Phe Trp Tyr Ile Asn Leu Phe Gly Ile Cys Leu Ser His Thr Lys

115 120 125

Ser Phe Thr Phe Asp Cys Phe Asp Trp Gly Lys Gln Val Phe Gly

130 135 140

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<212> DNA

<213> HumμLus japonicus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(414)

<400> 24

atg aaa ggc gag ttt gcc cca atc tac tgg ggg agg gga agg ggg ttg 48

Met Lys Gly Glu Phe Ala Pro Ile Tyr Trp Gly Arg Gly Arg Gly Leu

1 5 10 15

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Ala Ala Leu Thr Arg Ala Thr His Thr Ala Lys His His Leu Leu His

20 25 30

tcc ccc tct gtc agc ggg agc aaa aaa aaa aaa aaa aca agg gcc aag 144

Ser Pro Ser Val Ser Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Thr Arg Ala Lys

35 40 45

ggg gaa tac cct gat gct gtt att acc tcg gct gac aag ttc gcc aac 192

Gly Glu Tyr Pro Asp Ala Val Ile Thr Ser Ala Asp Lys Phe Ala Asn

50 55 60

aag tcc ttt ctc aaa aaa ggg gcc cac atc caa aac ccc aac ccc cct 240

Lys Ser Phe Leu Lys Lys Gly Ala His Ile Gln Asn Pro Asn Pro Pro

65 70 75 80

ctc cct gac cct att caa cca aac ccc ttt act caa tct aaa gag gca 288

Leu Pro Asp Pro Ile Gln Pro Asn Pro Phe Thr Gln Ser Lys Glu Ala

85 90 95

aaa cca ctt aaa aca gtc ggt gtg aac cca acc ccc cgg gga gta agg 336

Lys Pro Leu Lys Thr Val Gly Val Asn Pro Thr Pro Arg Gly Val Arg

100 105 110

tgc cat atc tct aac caa cac agg ttc cgt gtt tct ata tat gta cat 384

Cys His Ile Ser Asn Gln His Arg Phe Arg Val Ser Ile Tyr Val His

115 120 125

aaa att att tgt ttt att tat ttt ttg taa 414

Lys Ile Ile Cys Phe Ile Tyr Phe Leu

130 135

<210> 25

<211> 137

<212> PRT

<213> HumμLus japonicus

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Met Lys Gly Glu Phe Ala Pro Ile Tyr Trp Gly Arg Gly Arg Gly Leu

1 5 10 15

Ala Ala Leu Thr Arg Ala Thr His Thr Ala Lys His His Leu Leu His

20 25 30

Ser Pro Ser Val Ser Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Thr Arg Ala Lys

35 40 45

Gly Glu Tyr Pro Asp Ala Val Ile Thr Ser Ala Asp Lys Phe Ala Asn

50 55 60

Lys Ser Phe Leu Lys Lys Gly Ala His Ile Gln Asn Pro Asn Pro Pro

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Leu Pro Asp Pro Ile Gln Pro Asn Pro Phe Thr Gln Ser Lys Glu Ala

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Lys Pro Leu Lys Thr Val Gly Val Asn Pro Thr Pro Arg Gly Val Arg

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Cys His Ile Ser Asn Gln His Arg Phe Arg Val Ser Ile Tyr Val His

115 120 125

Lys Ile Ile Cys Phe Ile Tyr Phe Leu

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<220>

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<222> (1)..(432)

<400> 26

atg ttg agg tta tta caa aca tgt att atg gtc acg aca ttg ttt tct 48

Met Leu Arg Leu Leu Gln Thr Cys Ile Met Val Thr Thr Leu Phe Ser

1 5 10 15

tgc gca caa gca atc gtt aac gaa agg cct caa ccc cca acc caa gat 96

Cys Ala Gln Ala Ile Val Asn Glu Arg Pro Gln Pro Pro Thr Gln Asp

20 25 30

aga aca ctc gaa caa gtt gag ata aag aac att ttg gat gga aaa caa 144

Arg Thr Leu Glu Gln Val Glu Ile Lys Asn Ile Leu Asp Gly Lys Gln

35 40 45

gac cta agc gtt cac tgt aaa tct ggg gac gac gat ttc ggc gtc cac 192

Asp Leu Ser Val His Cys Lys Ser Gly Asp Asp Asp Phe Gly Val His

50 55 60

aat ttg agc tac aac gcc act tac agt ctc agt ttc agg cgc aac ttt 240

Asn Leu Ser Tyr Asn Ala Thr Tyr Ser Leu Ser Phe Arg Arg Asn Phe

65 70 75 80

agg ggc acg act ctg att gaa tgt ggg ttc agt tgg gat tgg gga aag 288

Arg Gly Thr Thr Leu Ile Glu Cys Gly Phe Ser Trp Asp Trp Gly Lys

85 90 95

cag tct cac cat acc gat att tac acg cct gaa ggt ccc aac tgt agg 336

Gln Ser His His Thr Asp Ile Tyr Thr Pro Glu Gly Pro Asn Cys Arg

100 105 110

gct cca aat aag tgc ttg tgg tat atc att cct tct ggg cct tgt ctt 384

Ala Pro Asn Lys Cys Leu Trp Tyr Ile Ile Pro Ser Gly Pro Cys Leu

115 120 125

tct cat tcc aac tct ttt gaa tat cgt tgc ttt cct tgg gac aag tga 432

Ser His Ser Asn Ser Phe Glu Tyr Arg Cys Phe Pro Trp Asp Lys

130 135 140

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<211> 143

<212> PRT

<213> HumμLus japonicus

<400> 27

Met Leu Arg Leu Leu Gln Thr Cys Ile Met Val Thr Thr Leu Phe Ser

1 5 10 15

Cys Ala Gln Ala Ile Val Asn Glu Arg Pro Gln Pro Pro Thr Gln Asp

20 25 30

Arg Thr Leu Glu Gln Val Glu Ile Lys Asn Ile Leu Asp Gly Lys Gln

35 40 45

Asp Leu Ser Val His Cys Lys Ser Gly Asp Asp Asp Phe Gly Val His

50 55 60

Asn Leu Ser Tyr Asn Ala Thr Tyr Ser Leu Ser Phe Arg Arg Asn Phe

65 70 75 80

Arg Gly Thr Thr Leu Ile Glu Cys Gly Phe Ser Trp Asp Trp Gly Lys

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Gln Ser His His Thr Asp Ile Tyr Thr Pro Glu Gly Pro Asn Cys Arg

100 105 110

Ala Pro Asn Lys Cys Leu Trp Tyr Ile Ile Pro Ser Gly Pro Cys Leu

115 120 125

Ser His Ser Asn Ser Phe Glu Tyr Arg Cys Phe Pro Trp Asp Lys

130 135 140

<210> 28

<211> 291

<212> DNA

<213> HumμLus japonicus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(291)

<400> 28

atg gct cgc tct ttc tcc agc gct aag att ttc acc tct ctc gtc gtt 48

Met Ala Arg Ser Phe Ser Ser Ala Lys Ile Phe Thr Ser Leu Val Val

1 5 10 15

gat ggc ttc tct aac gca atc agc agg cgt gga tac tcg gct gca tca 96

Asp Gly Phe Ser Asn Ala Ile Ser Arg Arg Gly Tyr Ser Ala Ala Ser

20 25 30

caa gga gtt gtg tcg agc gta gca aga ggg gga gcc aca gca gct tct 144

Gln Gly Val Val Ser Ser Val Ala Arg Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ser

35 40 45

aga aag gcg acg aag aaa tct gtg gaa gag aac acc gag aag gtg tca 192

Arg Lys Ala Thr Lys Lys Ser Val Glu Glu Asn Thr Glu Lys Val Ser

50 55 60

tgg att cca gac ccg gtc acc ggt tac tac aga ccg gat aat ggt gcc 240

Trp Ile Pro Asp Pro Val Thr Gly Tyr Tyr Arg Pro Asp Asn Gly Ala

65 70 75 80

cca gaa atc gac gtg gcc gag ctt cgt gct acg ctc ttg aag aag cac 288

Pro Glu Ile Asp Val Ala Glu Leu Arg Ala Thr Leu Leu Lys Lys His

85 90 95

taa 291

<210> 29

<211> 96

<212> PRT

<213> HumμLus japonicus

<400> 29

Met Ala Arg Ser Phe Ser Ser Ala Lys Ile Phe Thr Ser Leu Val Val

1 5 10 15

Asp Gly Phe Ser Asn Ala Ile Ser Arg Arg Gly Tyr Ser Ala Ala Ser

20 25 30

Gln Gly Val Val Ser Ser Val Ala Arg Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ser

35 40 45

Arg Lys Ala Thr Lys Lys Ser Val Glu Glu Asn Thr Glu Lys Val Ser

50 55 60

Trp Ile Pro Asp Pro Val Thr Gly Tyr Tyr Arg Pro Asp Asn Gly Ala

65 70 75 80

Pro Glu Ile Asp Val Ala Glu Leu Arg Ala Thr Leu Leu Lys Lys His

85 90 95

<210> 30

<211> 709

<212> DNA

<213> HumμLus japonicus

<220>

<221> CDS

<222> (150)..(329)

<400> 30

gaagggttct ctcgagaaag agaggctgaa gcttacgtaa caagtttgta caaaaaagtt 60

ggggggacaa ctttgtacaa aaaagttggc ctctcaatcc caatcacatt ttctctctga 120

atttttttgc aaaaattttc caagagaaa atg gag tca aaa tct atg atg atg 173

Met Glu Ser Lys Ser Met Met Met

1 5

atg atg gtg ttg ttg gtt gtg gtg atg atg gcc ttt tca gcc atc cca 221

Met Met Val Leu Leu Val Val Val Met Met Ala Phe Ser Ala Ile Pro

10 15 20

atg gcc tca gct gct gat gca cca gcc cca agc ccc acc tca gat gcc 269

Met Ala Ser Ala Ala Asp Ala Pro Ala Pro Ser Pro Thr Ser Asp Ala

25 30 35 40

acc caa ttc atg cca gcc ttc ttt gca tct ctt ctg gct ttg gct ttt 317

Thr Gln Phe Met Pro Ala Phe Phe Ala Ser Leu Leu Ala Leu Ala Phe

45 50 55

ggc tta gtc ttc taagctcttc atcatcttca tcttcatcac catttttcaa 369

Gly Leu Val Phe

60

tcacattttt tgcttagata tatatatata tatatgtatg tatgtatact tgtctttgca 429

aattttgttc aatgttgatc atggtggggt tggtttgttt tccaatgtgg gaggaaagtg 489

ttgtttatgt aatattgtaa tatatgaaat tcttttgtat ttaataaatt tttttttcta 549

ttaattttgc aattttctac ttttgttggt tttgtgggaa tgtggggttt ggaaatacat 609

ttctatagat ggtaaatttc ataattattt aaagtattgt cattctaatt ttttttatat 669

attaataaaa aaccattatt aactcttaaa aaaaaaaaaa 709

<210> 31

<211> 60

<212> PRT

<213> HumμLus japonicus

<400> 31

Met Glu Ser Lys Ser Met Met Met Met Met Val Leu Leu Val Val Val

1 5 10 15

Met Met Ala Phe Ser Ala Ile Pro Met Ala Ser Ala Ala Asp Ala Pro

20 25 30

Ala Pro Ser Pro Thr Ser Asp Ala Thr Gln Phe Met Pro Ala Phe Phe

35 40 45

Ala Ser Leu Leu Ala Leu Ala Phe Gly Leu Val Phe

50 55 60

<210> 32

<211> 444

<212> DNA

<213> HumμLus japonicus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(444)

<400> 32

atg atc gcc gaa gtt att aaa cat tta aat gtt act gaa aac tta aag 48

Met Ile Ala Glu Val Ile Lys His Leu Asn Val Thr Glu Asn Leu Lys

1 5 10 15

cac aca ttg aac acg agc gct gat ttt gga gtt tgt gta gcg aat cac 96

His Thr Leu Asn Thr Ser Ala Asp Phe Gly Val Cys Val Ala Asn His

20 25 30

ttg tgt aat tgt atg gcc tta cca tat cca cct gtg att tat gct tgt 144

Leu Cys Asn Cys Met Ala Leu Pro Tyr Pro Pro Val Ile Tyr Ala Cys

35 40 45

ttg gga ggt ctg ggt ttc aag tgc atg aag gat gct ctc cat ctc acg 192

Leu Gly Gly Leu Gly Phe Lys Cys Met Lys Asp Ala Leu His Leu Thr

50 55 60

cct cat ctc ttg gct tgt gcc cta gct tgt ccc aac tcc ccc atc gtc 240

Pro His Leu Leu Ala Cys Ala Leu Ala Cys Pro Asn Ser Pro Ile Val

65 70 75 80

gat aca aac tcc acc acc att att ggt act aat aat acc acc acc att 288

Asp Thr Asn Ser Thr Thr Ile Ile Gly Thr Asn Asn Thr Thr Thr Ile

85 90 95

act ggt tct ggt tct aat acc acc gcc att att ggt act aat aat acc 336

Thr Gly Ser Gly Ser Asn Thr Thr Ala Ile Ile Gly Thr Asn Asn Thr

100 105 110

gcc atc atc aat aca aac tcc acc gct atc gat tca aac tcc act ctc 384

Ala Ile Ile Asn Thr Asn Ser Thr Ala Ile Asp Ser Asn Ser Thr Leu

115 120 125

aaa cac gat cac gag gca ctg aaa gat ttc tgc aac aac aat tgc aag 432

Lys His Asp His Glu Ala Leu Lys Asp Phe Cys Asn Asn Asn Cys Lys

130 135 140

aag aag gat tag 444

Lys Lys Asp

145

<210> 33

<211> 147

<212> PRT

<213> HumμLus japonicus

<400> 33

Met Ile Ala Glu Val Ile Lys His Leu Asn Val Thr Glu Asn Leu Lys

1 5 10 15

His Thr Leu Asn Thr Ser Ala Asp Phe Gly Val Cys Val Ala Asn His

20 25 30

Leu Cys Asn Cys Met Ala Leu Pro Tyr Pro Pro Val Ile Tyr Ala Cys

35 40 45

Leu Gly Gly Leu Gly Phe Lys Cys Met Lys Asp Ala Leu His Leu Thr

50 55 60

Pro His Leu Leu Ala Cys Ala Leu Ala Cys Pro Asn Ser Pro Ile Val

65 70 75 80

Asp Thr Asn Ser Thr Thr Ile Ile Gly Thr Asn Asn Thr Thr Thr Ile

85 90 95

Thr Gly Ser Gly Ser Asn Thr Thr Ala Ile Ile Gly Thr Asn Asn Thr

100 105 110

Ala Ile Ile Asn Thr Asn Ser Thr Ala Ile Asp Ser Asn Ser Thr Leu

115 120 125

Lys His Asp His Glu Ala Leu Lys Asp Phe Cys Asn Asn Asn Cys Lys

130 135 140

Lys Lys Asp

145

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> HumμLus japonicus

<400> 34

tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtctt 36

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> HumμLus japonicus

<400> 35

agagctgcca ggaaacagct atgaccatgt aatacgactc 40

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gcaaatggca ttctgacatc c 21

<210> 38

<211> 1845

<212> DNA

<213> HumμLus japonicus

<400> 38

acaagtttgt acaaaaaagc tgaacgagaa acgtaaaatg atataaatat caatatatta 60

aattagattt tgcataaaaa acagactaca taatactgta aaacacaaca tatccagtca 120

ctatggcggc cgctaagttg gcagcatcac ccgacgcact ttgcgccgaa taaatacctg 180

tgacggaaga tcacttcgca gaataaataa atcctggtgt ccctgttgat accgggaagc 240

cctgggccaa cttttggcga aaatgagacg ttgatcggca cgtaagaggt tccaactttc 300

accataatga aataagatca ctaccgggcg tattttttga gtcatcgaga ttttcaggag 360

ctaaggaagc taaaatggag aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat 420

ggcatcgtaa agaacatttt gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga 480

ccgttcagct ggatattacg gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt 540

atccggcctt tattcacatt cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg 600

caatgaaaga cggtgagctg gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc 660

atgagcaaac tgaaacgttt tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt 720

ttctacacat atattcgcaa gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta 780

aagggtttat tgagaatatg tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt 840

ttgatttaaa cgtggccaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat 900

attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt 960

gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc 1020

aggcggggcg taatctagag gatccggctt actaaaagcc agataacagt atgcgtattt 1080

gcgcgctgat ttttgcggta taagaatata tactgatatg tatacccgaa gtatgtcaaa 1140

aagaggtatg ctatgaagca gcgtattaca gtgacagttg acagcgacag ctatcagttg 1200

ctcaaggcat atatgatgtc aatatctccg gtctggtaag cacaaccatg cagaatgaag 1260

cccgtcgtct gcgtgccgaa cgctggaaag cggaaaatca ggaagggatg gctgaggtcg 1320

cccggtttat tgaaatgaac ggctcttttg ctgacgagaa caggggctgg tgaaatgcag 1380

tttaaggttt acacctataa aagagagagc cgttatcgtc tgtttgtgga tgtacagagt 1440

gatattattg acacgcccgg gcgacggatg gtgatccccc tggccagtgc acgtctgctg 1500

tcagataaag tcccccgtga actttacccg gtggtgcata tcggggatga aagctggcgc 1560

atgatgacca ccgatatggc cagtgtgccg gtctccgtta tcggggaaga agtggctgat 1620

ctcagccacc gcgaaaatga catcaaaaac gccattaacc tgatgttctg gggaatataa 1680

atgtcaggct cccttataca cagccagtct gcaggtcgac catagtgact ggatatgttg 1740

tgttttacag tattatgtag tctgtttttt atgcaaaatc taatttaata tattgatatt 1800

tatatcattt tacgtttctc gttcagcttt cttgtacaaa gtggt 1845

Claims

1.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.5所示氨基酸序列。

2.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.7所示氨基酸序列。

3.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.9所示氨基酸序列。

4.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.11所示氨基酸序列。

5.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.13所示氨基酸序列。

6.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.15所示氨基酸序列。

7.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.17所示氨基酸序列。

8.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.19所示氨基酸序列。

9.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.21所示氨基酸序列。

10.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.23所示氨基酸序列。

11.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.25所示氨基酸序列。

12.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.27所示氨基酸序列。

13.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.29所示氨基酸序列。

14.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.31所示氨基酸序列。

15.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括SEQ ID No.33所示氨基酸序列。

16.一种重组混合葎草花粉变应原疫苗，其中包括两种或两种以上选自下述氨基酸序列的蛋白：SEQ ID NO.5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33所示。

17.葎草花粉变应原蛋白，其为自下述氨基酸序列的蛋白：SEQ ID NO.5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33所示。

18.含有权利要求17所述葎草花粉重变应原蛋白在制备针对葎草花粉过敏的变态反应性疾病的治疗或诊断制剂。

19.根据权利要求18所述的制剂，其特征在于，

所述制剂中的各蛋白由体外重组表达获得，经配制获得所述制剂。

20.根据权利要求18所述的制剂，其特征在于，

所述制剂为疫苗。

21.根据权利要求18所述制剂，其特征在于，

所述制剂还包括佐剂。

22.编码权利要求17所述蛋白的基因。

23.含有权利要求22所述基因的载体。

24.含有权利要求23所述载体的宿主细胞。

25.一种制备权利要求17所述蛋白的方法，其通过培养权利要求24所述的宿主细胞，诱导表达，并分离得到所述蛋白。

26.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，分别培养所述的宿主细胞，诱导表达，并分离得到所述蛋白。