CN109526229A - 筛选由白细胞介素6、白细胞介素13、tnf、g-csf、cxcl1、cxcl2、或cxcl5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法、及由白细胞介素6、白细胞介素13、tnf、g-csf、cxcl1、cxcl2、或cxcl5所引起的疾病的预防或治疗剂 - Google Patents

筛选由白细胞介素6、白细胞介素13、tnf、g-csf、cxcl1、cxcl2、或cxcl5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法、及由白细胞介素6、白细胞介素13、tnf、g-csf、cxcl1、cxcl2、或cxcl5所引起的疾病的预防或治疗剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供筛选由白细胞介素6、白细胞介素13、TNF、G‑CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法，及由白细胞介素6、白细胞介素13、TNF、G‑CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂。筛选由白细胞介素6、白细胞介素13、TNF、G‑CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法，所述方法以选自由MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达变化、及MEX3B蛋白质的功能变化组成的组中的至少一种作为指标。

Description

筛选由白细胞介素6、白细胞介素13、TNF、G-CSF、CXCL1、 CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法、及由白 细胞介素6、白细胞介素13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5 所引起的疾病的预防或治疗剂
技术领域
本发明涉及筛选由白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素13(IL-13)、TNF(肿瘤坏死因子：Tumor Necrosis Factor)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子：Granulocyte-ColonyStimulating Factor或colony-stimulating factor 3(CSF3，集落刺激因子3))、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法，及由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂。
背景技术
一直以来，认为过敏性呼吸道炎症是针对各种过敏原的过敏性疾病(例如非专利文献1)。
但是，哮喘恶化致死的大多为高龄患者，其特征在于，在这些重症哮喘患者的呼吸道炎症部位多观察到参与感染防御的嗜中性粒细胞，而非因过敏反应集聚的嗜酸性粒细胞。鉴于近年来免疫学的进步，逐渐明确了这些重症哮喘患者中的Th17型免疫细胞(主要分泌IL-17以承担应对感染防御的免疫反应)是决定病况的关键(例如非专利文献2)。
也已有报道称，患者症状越重，则作为细胞因子之一的IL-17(白细胞介素17)的血清中水平越高。IL-17促进从肺组织分泌趋化因子类(CXCL1、CXCL2、CXCL5等)，这些趋化因子将嗜中性粒细胞吸引至炎症部位。嗜中性粒细胞浸润反复诱导慢性炎症，使得平滑肌肥厚、呼吸道黏膜纤维化、黏膜下腺体增生等发展时，结果会引起不可逆性的呼吸道重塑。若成为这样的状态，则容易陷入呼吸困难，治疗变得非常困难。
另一方面，已知IL-6是与炎症、造血、骨代谢、肿瘤恶化等相关的重要细胞因子，其活性主要促进从急性炎症向获得性免疫应答的转变、慢性炎症性疾病的发病(例如非专利文献3)。
已知IL-6通过与在靶细胞表面表达的IL-6受体亚基和gp130(信号转导亚基)的复合体结合而传递IL-6胞内信号，并利用该信号激活与IL-6所诱导的各种生命现象密切相关的靶基因。
在获得性免疫系统的激活中，IL-6信号与TGF-β信号协调诱导Th17细胞。重症哮喘呈现类固醇抗性的病况，在其炎症部位可观察到嗜中性粒细胞的明显浸润，但近年来，根据在这些类固醇抗性重症哮喘患者的血清中以显著高值检测到IL-17的情况，判明了重症哮喘是由于Th17细胞的过度反应而引起的。
另外，已知IL-13、TNF(其中的TNF-α)、G-CSF也与哮喘的重症化相关(例如非专利文献4)。
已知IL-13作为炎性细胞因子而起到进一步增强末梢组织中的过敏性炎症的作用，除了促进作为过敏性哮喘主要因素的过敏反应的方面以外，IL-13还与哮喘治疗的困难化(类固醇剂失效)相关是已知的。另外，除了哮喘以外，IL-13在炎症性肠病、特应性皮炎中也与它们的病况形成相关(例如非专利文献5、6)。
已知TNF(其中的TNF-α)是诱发炎症反应的信号因子，该因子从感染防御的观点考虑是重要的，但另一方面，其同时也与由炎症亢进所引起的损伤相关。即，TNF在各种疾病中与病况的恶化相关，其主要与关节疾病(类风湿性关节炎、干癣性关节炎、脊柱关节炎、强直性脊柱炎)、炎症性肠病(溃疡性大肠炎、克罗恩病(Crohn disease))、癌症(卵巢癌、乳腺癌)、精神疾病(抑郁、双极性情感障碍、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症)、心血管疾病(心力衰竭、动脉硬化)、呼吸器官疾病(支气管哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤)、2型糖尿病、肾病(缺血性肾损伤、移植后排斥反应、肾小球肾炎)等相关是已知的(例如非专利文献7、8)。
另外，已知G-CSF具有促进粒细胞生成、提升嗜中性粒细胞的功能的作用。
另外，CXCL1、CXCL2、CXCL5属于炎性趋化因子CXC亚家族。炎性信号激活从各种血液细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肺泡上皮细胞等中分泌CXCL1、CXCL2、CXCL5(例如非专利文献9、10)。
在因呼吸道黏膜中的炎症过度亢进而从肺组织分泌CXCL1、CXCL2、CXCL5的情况下，高度表达CXCR2(其是CXCL1、CXCL2、CXCL5的受体)的嗜中性粒细胞的浸润被促进。结果，类固醇抗性的嗜中性粒细胞浸润引起重症哮喘，从而诱发能诱导呼吸道的不可逆性重塑的慢性炎症。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：N Engl J Med,326(1992),pp.298-304
非专利文献2：Clinical and Developmental Immunology Volume2013(2013),文章编号:609395,第9页
非专利文献3：J Asthma.2008；45Suppl 1:41-4.
非专利文献4：Thorax.1999Sep；54(9):825-57.
非专利文献5：J Allergy(Cairo).2012；2012:316049
非专利文献6：N Engl J Med 2011；365:1088-1098
非专利文献7：J Allergy Clin Immunol.2008Jan；121(1):5-10
非专利文献8：J Pathol.2008Jan；214(2):149-60.
非专利文献9：Thorax.2007Jun；62(6):475-82.
非专利文献10：Trends Immunol.2011Oct；32(10):452-60.
发明内容
发明所要解决的课题
如上文所述，近年来，逐渐明确了IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5与严重的疾病相关。
本发明是鉴于上述情况而作出的，其目的在于提供筛选由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法，及由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂。
用于解决课题的手段
本申请的发明人发现，MEX3B基因的功能决定着多方面的生命现象，MEX3B基因与由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的发病相关，从而完成了本发明。
具体而言，本发明如下所述。
本发明的第一方式为筛选由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法，所述方法以选自由MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达变化、及MEX3B蛋白质的功能变化组成的组中的至少一种作为指标。
本发明的第二方式为由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂，其含有MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达的下调物质、或者MEX3B蛋白质的抑制物质。
发明效果
本发明的第一方式涉及的筛选由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法能够对由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂进行筛选。
根据本发明，可提供由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂。
附图说明
[图1]为表示野生型BALB/c小鼠及MEX3B缺陷BALB/c小鼠的胚胎成纤维细胞中的MEX3B mRNA的表达水平的验证结果的图。
[图2]为表示野生型BALB/c小鼠及MEX3B缺陷BALB/c小鼠的胚胎成纤维细胞中的IL-6mRNA的表达水平的验证结果的图。
[图3]为表示野生型BALB/c小鼠及MEX3B缺陷BALB/c小鼠的胚胎成纤维细胞中的CXCL5mRNA的表达水平的验证结果的图。
[图4]为表示哮喘诱发试验中的野生型BALB/c小鼠及MEX3B缺陷BALB/c小鼠的各种免疫细胞的增多的验证结果的图。
[图5]为表示使用了重症哮喘诱发模型的Gapmer型反义寡核苷酸施予试验中的各种免疫细胞的增多的验证结果的图。
[图6]为表示各小鼠组中的各细胞因子及趋化因子的mRNA表达水平的定量RT-PCR试验结果的图。
[图7]为表示各小鼠组中的肺组织的病理组织图像的图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明，但本发明不限于以下的实施方式，可在本发明目的的范围内适当加以变更而实施。
＜筛选由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法＞
本发明的第一方式涉及的筛选方法中，通过以选自由MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达变化、及MEX3B蛋白质的功能变化组成的组中的至少一种作为指标，可筛选由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂。
优选对由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂进行筛选，更优选对由IL-6或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂进行筛选。
作为MEX3B蛋白质的功能，可举出与IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、及/或CXCL5等的各种mRNA结合而控制这些mRNA的功能(即翻译为蛋白质)的功能；或者诱导IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、及/或CXCL5等的表达的功能等。
通过以选自由MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达降低、及MEX3B蛋白质功能的降低组成的组中的至少一种作为指标，可筛选下述疾病的预防或治疗剂：由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5的表达增高所引起的疾病(例如，重症哮喘、类风湿性关节炎、大肠炎、克罗恩病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、癌等中的由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的重症哮喘、关节疾病(类风湿性关节炎、干癣性关节炎、脊柱关节炎、强直性脊柱炎)、糖尿病、炎症性肠病(大肠炎、克罗恩病)、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、癌症(卵巢癌、乳腺癌)、精神疾病(抑郁、双极性情感障碍、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症)、心血管疾病(心力衰竭、动脉硬化)、呼吸器官疾病(支气管哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤)、2型糖尿病、肾病(缺血性肾损伤、移植后排斥反应、肾小球肾炎)等(例如，Int Immunol.2015Jan；27(1):21-9，Cancer Discov.2016Jan；6(1):80-95.等))。
另外，作为上述降低的程度，只要是统计学上显著性的降低即可，没有特别限制，相对于被检物质的非存在条件下(例如，施予被检物质之前的体系(例如，野生型)或阴性对照(施予了不影响MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达或功能的物质的对照)的体系)的MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达或功能而言，优选为1/2以下，更优选为1/4以下，进一步优选为1/10以下，特别优选表达或功能消失。
通过以选自由MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达增高、及MEX3B蛋白质的功能增高组成的组中的至少一种作为指标，可筛选由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5的表达降低所引起的疾病(例如，病毒感染症、细菌感染症等(Immunity.2010Jul 23；33(1):106-17.)的预防或治疗剂。
另外，作为上述增高的程度，只要是统计学上显著性的增高即可，没有特别限制，相对于被检物质的非存在条件下(例如，施予被检物质之前或阴性对照的体系)的MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达或功能而言，优选为1.5倍以上，更优选为2倍以上。
优选以选自由MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达降低、及MEX3B蛋白质的功能降低组成的组中的至少一种作为指标，更优选以MEX3B基因表达的降低作为指标。
作为筛选方法，只要以上述指标作为指标，则可以是体内(in vivo)、体外(invitro)、计算机模拟(in silico)等任意的筛选方法。作为筛选方法的优选例之一，可举出下述方法：在被检物质的存在下及非存在下培养表达MEX3B基因的细胞，以对应于上述被检物质的有无而发生的MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达变化、及MEX3B蛋白质的功能变化作为指标，对由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂进行筛选。
作为第一方式涉及的筛选方法中使用的细胞，优选为来自小鼠胚胎的成纤维细胞(小鼠胚胎成纤维细胞；mouse embryonic fibroblast(MEF))。
来自小鼠胚胎的成纤维细胞可通过单纯传代而诱导细胞衰老(Senescence)。
MEF细胞系是用于验证伴随细胞衰老而出现的各种生命现象的变化的方法之一。已知在传代初期(例如，第3代)并未显著产生的炎性细胞因子、趋化因子在传代后期(例如，第13～15代)被显著诱导。作为呼吸道黏膜的细胞衰老的重建系实验，可对MEF细胞中的MEX3B基因的缺失与细胞因子或趋化因子的生成的变化之间的关系进行分析。
本申请的发明人发现，MEX3B的表达降低的细胞中，分泌因子(IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、CXCL5等)得以显著降低。
IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、CXCL5可能如上述那样与重症哮喘的病况密切相关。
只要以MEX3B基因的碱基序列信息为基础，则也可以通过计算机模拟对各种人类组织中的MEX3B基因表达进行检测。另外，在体内、体外，也可通过利用例如具有该基因的一部分或全部碱基序列的探针或引物，对各种人类组织中的MEX3B基因表达进行检测。MEX3B基因表达的检测可利用RT-PCR、Northern印迹法、Southern印迹法等常规方法实施。
另外，MEX3B基因的mRNA水平上的表达量的测定也可利用RT-PCR、Northern印迹法、Southern印迹法等常规方法实施。
实施PCR的情况下，引物只要能够仅对MEX3B基因进行特异性扩增即可，没有特别限定，可基于MEX3B基因的序列信息适当设定。例如，可使用包含MEX3B基因或上述基因的表达调控区的碱基序列中的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸、以及具有与该寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸作为探针或引物。更具体而言，可使用具有MEX3B基因或上述基因的表达调控区的碱基序列中的10～60个连续残基、优选10～40个连续残基的碱基序列的寡核苷酸、以及具有与该寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸。
上述的寡核苷酸及反义寡核苷酸可使用DNA合成仪、利用常规方法进行制造。作为该寡核苷酸或反义寡核苷酸，可举出例如相当于欲检测的mRNA的一部分碱基序列中5’末端侧的碱基序列的正义引物、相当于3’末端侧的碱基序列的反义引物等。作为正义引物及反义引物，可举出各自的熔解温度(Tm)及碱基数没有极端差异的、10～60个碱基左右的寡核苷酸，优选为10～40个碱基左右的寡核苷酸。另外，本发明中，也可使用上述的寡核苷酸的衍生物，例如，可使用该寡核苷酸的甲基体、硫代磷酸酯体等。
另外，MEX3B蛋白质的表达量可利用使用了后述抗体的Western印迹法或ELISA等通常的免疫分析进行测定。具体而言，可利用《分子克隆》(Molecular Cloning)第2版或《最新分子生物学实验方法汇编》(Current Protocols in Molecular Biology)等中记载的本领域技术人员已知的常规方法实施。
另外，MEX3B蛋白质的功能变化的分析可通过测定MEX3B蛋白质与mRNA结合的能力的有无或水平、测定MEX3B蛋白质所结合的mRNA的功能发挥的有无或水平、测定IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、及/或CXCL5表达的有无或水平来进行分析。
MEX3B蛋白质与mRNA结合的能力的有无或水平可通过竞争性抑制试验等任意的分析进行测定。
对于MEX3B蛋白质所结合的mRNA的功能发挥的有无或水平，可利用Western印迹法或ELISA等通常的免疫分析进行蛋白质水平上的表达量测定。IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、及/或CXCL5的表达的mRNA水平上的表达量可利用Northern印迹法、Southern印迹法或RT-PCR等常规方法进行测定。具体而言，可利用《分子克隆》第2版或《最新分子生物学实验方法汇编》等中记载的本领域技术人员已知的常规方法实施。
作为供于本发明的第一方式涉及的筛选方法的被检物质，可使用任意的物质。被检物质的种类没有特别限定，可以是核酸分子，可以是抗体，可以是单独的低分子合成化合物，可以是天然物提取物中存在的化合物，也可以是合成肽。也可以是后述的用于基因组编辑的人工核酸酶。或者，被检化合物还可以是化合物文库、噬菌体展示文库或组合文库(combinatorial library)。化合物文库的构建对于本领域技术人员而言是已知的，另外，也可使用市售的化合物文库。
被检物质优选为低分子化合物(例如，化合物文库)、核酸分子、用于基因组编辑的人工核酸酶或抗体，从对于MEX3B基因或蛋白质的特异性高的观点考虑，更优选为核酸分子或抗体，进一步优选为具有与MEX3B基因(外显子中的编码区(CDS)或非翻译区(UTR)或者内含子)中或上述基因的表达调控区中所含的寡核苷酸互补的序列的核酸分子、或者与MEX3B蛋白质选择性结合的适体或抗体。
(MEX3B基因)
MEX3B基因包含外显子1、内含子及外显子2，该构成在人、小鼠、其他哺乳动物中高度保守。另外，外显子1及外显子2中包含CDS及UTR。
作为外显子中不编码氨基酸的非翻译区(UTR)，在比起始密码子更靠上游处存在有5’UTR，在比终止密码子更靠下游处存在有3’UTR。
编码人MEX3B的mRNA的人MEX3B基因具有后述的序列号1所示的序列。
序列号1中，第437～2146位的碱基序列为CDS，第1～436位的碱基序列为5’UTR，第2147～3532位的碱基序列为3’UTR。
后述的序列号2表示包含人MEX3B基因的从转录起始位点起上游的约36kb的表达调控区的序列。后述的序列号3表示人MEX3B基因的内含子区的836个碱基。人MEX3B基因中，上述内含子区存在于序列号1所示序列中的第694位碱基与第695位碱基之间。
序列号15表示编码剪接前的人MEX3B的前体mRNA的碱基序列。序列号15所示的编码人MEX3B的前体mRNA的序列中的第437～692位及第1529～2982位的碱基序列为CDS，第1～436位的碱基序列为5’UTR，第2983～4368位的碱基序列为3’UTR，第693～1528位的区域相当于序列号3所示的人MEX3B基因的内含子区。
编码小鼠MEX3B的mRNA的小鼠MEX3B基因具有后述的序列号4表示的序列。
序列号4中，第319～2049位的碱基序列为CDS，第1～318位的碱基序列为5’UTR，第2050～3416位的碱基序列为3’UTR。
另外，编码MEX3B蛋白质(例如，具有后述的序列号5或6表示的氨基酸序列的蛋白质)的基因全部属于MEX3B基因。
MEX3B基因最初被鉴定为被TGF-β激活的基因，根据后来的分析已获知，MEX3B蛋白质是与各种mRNA结合从而控制这些mRNA的功能(即翻译为蛋白质)的分子(例如NucleicAcids Res.2007；35(4):1289-300.)。
作为MEX3B基因的具体例，可举出以下的(a)或(b)中任一者记载的基因，从筛选针对人的疾病的预防或治疗剂的观点、及能够直接使用人源基因而不要求额外的转化等的观点考虑，优选下述(a)的基因。
(a)包含序列表的序列号1或4中记载的碱基序列的基因；
(b)包含序列表的序列号1或4中记载的碱基序列中缺失、取代及/或添加1个或多个碱基而得到的碱基序列、且被TGF-β激活的基因；或者编码具有诱导IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、及/或CXCL5的表达的活性的蛋白质的基因
本说明书中所谓“碱基序列中缺失、取代及/或添加1个或多个碱基而得到的碱基序列”中的“1个或多个”的范围没有特别限定，表示优选为1至20个，更优选为1至10个，进一步优选为1至5个左右。
作为上述的DNA突变的程度，可举出例如与序列表的序列号1或4中记载的MEX3B基因的碱基序列具有80％以上的同源性的DNA，可举出具有优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为98％以上的同源性的DNA。
(MEX3B基因的获得)
MEX3B基因的获得方法没有特别限定。可以基于本说明书的序列表的序列号1、4或15及5或6中记载的碱基序列及氨基酸序列的信息制备合适的探针、引物，使用它们从人cDNA文库(利用表达MEX3B基因的合适的细胞，按照常规方法制备)中筛选所期望的克隆，由此分离MEX3B基因。
也可利用PCR法来获得MEX3B基因。例如，使用来自人培养细胞的染色体DNA或cDNA文库作为模板，并使用以能够扩增序列号1或4中记载的碱基序列的方式设计的1对引物，实施PCR。
PCR的反应条件可适当设定，可举出例如下述条件等：将包括94℃下30秒(变性)、55℃下30秒～1分钟(退火)、72℃下2分钟(延伸)的反应步骤作为1个循环，实施例如30个循环后，于72℃反应7分钟。接着，可将扩增得到的DNA片段克隆至能够在大肠杆菌等宿主中扩增的合适的载体(vector)中。
上述的探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选、以及目的基因的克隆等操作对于本领域技术人员而言是已知的，例如，可按照《分子克隆》第2版、《最新分子生物学实验方法汇编》等中记载的方法实施。
对于本说明书中的上述包含序列表的序列号1或4中记载的碱基序列中缺失、取代及/或添加1个或多个碱基而得到的碱基序列、且被TGF-β激活的基因、或者编码具有诱导及控制IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、及/或CXCL5的表达的活性的蛋白质的基因(突变基因)而言，可通过化学合成、基因工程方法或突变诱发等对于本领域技术人员而言已知的任意方法进行制备。例如，通过利用具有序列号1中记载的碱基序列的DNA、向这些DNA中导入突变，能够获得突变DNA。具体而言，针对具有序列号1或4中记载的碱基序列的DNA，可使用使作为突变原的药物与其接触并发挥作用的方法、照射紫外线的方法、基因工程方法等实施。作为基因工程方法之一的位点定向诱变法是能够向特定位置导入特定突变的方法，因此是有用的，可按照《分子克隆》第2版、《最新分子生物学实验方法汇编》等中记载的方法实施。
如上所述，即使在序列表的序列号1或4中记载的MEX3B基因的碱基序列中由于各种人工处理(例如导入位点特异性突变、由突变剂处理所引起的随机突变、由限制性内切酶切割所引起的DNA片段的突变·缺失·连接等)而发生局部性的DNA序列变化，只要得到的这些DNA突变体是编码被TGF-β激活的蛋白质、或者具有诱导IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、及/或CXCL5的表达的活性的蛋白质的DNA，则即使与序列号1或4所示的DNA序列存在差异，也仍然在MEX3B基因的范围内。
(MEX3B蛋白质)
MEX3B蛋白质为以下的任一种蛋白质。
(a)包含序列表的序列号5或6中记载的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含序列表的序列号5或6中记载的氨基酸序列中缺失、取代及/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列、且对特定mRNA具有结合活性的蛋白质；或者具有诱导或控制IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、及/或CXCL5的表达的活性的蛋白质；或者
(c)包含与序列表的序列号5或6中记载的氨基酸序列具有95％以上的同源性的氨基酸序列、且被TGF-β激活的蛋白质；或者具有诱导或控制IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、及/或CXCL5的表达的活性的蛋白质，
从筛选针对人的疾病的预防或治疗剂的观点、及能够直接使用人源蛋白质而不要求额外的转化等的观点考虑，优选上述(a)的蛋白质。
序列号5表示人MEX3B蛋白质的氨基酸序列。序列号6表示小鼠MEX3B蛋白质的氨基酸序列。
本说明书中所谓“氨基酸序列中缺失、取代及/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列”中的“1个至多个”的范围没有特别限定，表示优选为1至10个，更优选为1至5个，进一步优选为1至3个左右。
本说明书中所谓“具有95％以上的同源性的氨基酸序列”，表示氨基酸的同源性为95％以上，同源性优选为96％以上，更优选为97％以上。
如上所述，由与具有序列表的序列号1或4中记载的碱基序列的基因具有高同源性的突变体基因编码、且对特定mRNA具有结合活性的生理活性蛋白质、或者具有诱导或控制IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、及/或CXCL5的表达的活性的生理活性蛋白质全部在本发明的范围内。
虽然作为蛋白质构成要素的氨基酸的侧链在疏水性、电荷、大小等方面各自不同，但根据经验及实际的物理化学测定，已获知了数种在实质上不影响蛋白质整体的三维结构(也称为立体结构)的意义上具有高保守性的关系。例如，关于氨基酸残基的替换，可举出甘氨酸(Gly)与脯氨酸(Pro)、Gly与丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)与异亮氨酸(Ile)、谷氨酸(Glu)与谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)与天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)与苏氨酸(Thr)、Thr与丝氨酸(Ser)或Ala、赖氨酸(Lys)与精氨酸(Arg)等。
因此，即使是在序列表的序列号5或6中记载的MEX3B的氨基酸序列上进行取代、插入、缺失等而得到的突变蛋白质，只要该突变是MEX3B的三维结构中保守性高的突变、且该突变蛋白质是与MEX3B同样地对特定mRNA具有结合活性的生理活性蛋白质、或者具有诱导或控制IL-6及/或CXCL5的表达的活性的生理活性蛋白质，则这些全部属于MEX3B的范围内。
对于MEX3B蛋白质的获得方法没有特别限制，可以是利用化学合成而合成的蛋白质，可以是从生物试样或培养细胞等中分离的天然来源的蛋白质，也可以是利用转基因技术制备的重组蛋白质。
＜由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂＞
第二方式涉及的由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂(以下也简称为“第二方式涉及的预防或治疗剂”)含有MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达的下调物质、或者MEX3B蛋白质的抑制物质。
第二方式涉及的预防或治疗剂优选为由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂，更优选为由IL-6或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂。
(反义寡核苷酸)
作为MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达的下调物质，可举出具有与MEX3B基因(外显子中的CDS或UTR或者内含子)中或上述基因的表达调控区中所含的寡核苷酸互补的序列的上述反义寡核苷酸。
通过将上述反义寡核苷酸导入细胞来抑制MEX3B基因的转录、翻译，能够预防或治疗由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病。
例如，MEX3B基因(外显子中的CDS或UTR或者内含子)中或上述基因的表达调控区中所含的寡核苷酸、和与其互补的上述反义寡核苷酸在导入细胞后形成杂交体(hybrid)，由此能够利用对生成的杂交双链具有特异性的核酸酶(例如，RNase H)降解MEX3B的mRNA，从而抑制MEX3B基因的转录、翻译。
作为上述反义寡核苷酸，优选为具有与MEX3B基因的碱基序列(外显子中的CDS或UTR或者内含子)中或上述基因的表达调控区中的包含至少10个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，更优选为具有与包含至少11个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，进一步优选为具有与包含至少12个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，特别优选为具有与包含至少13个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，最优选为具有与包含至少14个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸。
另外，作为上述反义寡核苷酸的碱基长度的上限值，优选为具有与MEX3B基因的碱基序列(外显子中的CDS或UTR或者内含子)中或上述基因的表达调控区中的连续核苷酸为40个以下的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，更优选为具有与连续核苷酸为30个以下的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，进一步优选为具有与连续核苷酸为25个以下的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，特别优选为具有与连续核苷酸为20个以下的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，最优选为具有与连续核苷酸为17个以下的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸。
作为上述反义寡核苷酸，优选为包含至少一个下述核苷酸的反义寡核苷酸，所述核苷酸具有选自由硫代磷酸酯结构、桥连结构及烷氧基结构组成的组中的至少一种结构。
例如，通过使将核苷酸彼此连接的磷酸二酯键部具有硫代磷酸酯结构，能够获得核酸酶抗性，另外，由于疏水性提高，因此还能够提高向细胞内或核内的摄入。
另外，通过使核苷酸的糖部具有2’,4’-BNA(2’,4’-桥连核酸，2’,4’-BridgedNucleic Acid；别称LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid))、ENA(2’-O,4’-C-亚乙基桥连核酸，2’-O,4’-C-Ethylene-bridged Nucleic Acid)等桥连结构、2’-O-甲基化、2’-O-甲氧基乙基化(2’-MOE)等烷氧基结构，从而能够获得核酸酶抗性并提高mRNA的结合能力。
优选的是，上述反义寡核苷酸中将核苷酸彼此连接的至少一个磷酸二酯键部具有硫代磷酸酯结构，更优选上述反义寡核苷酸中的磷酸二酯键中的50％以上具有硫代磷酸酯结构，进一步优选上述反义寡核苷酸中的磷酸二酯键中的70％以上具有硫代磷酸酯结构，特别优选上述反义寡核苷酸中的磷酸二酯键中的90％以上具有硫代磷酸酯结构，最优选上述反义寡核苷酸中的全部磷酸二酯键均具有硫代磷酸酯结构。
优选的是，上述反义寡核苷酸中至少任意一个末端的核苷酸具有桥连结构或烷氧基结构，更优选上述反义寡核苷酸的两个末端的核苷酸具有桥连结构或烷氧基结构(所谓Gapmer型反义寡核苷酸)，进一步优选在上述反义寡核苷酸的两个末端中、独立地自末端起4个以下的碱基具有桥连结构或烷氧基结构，特别优选自末端起2个或3个碱基具有桥连结构或烷氧基结构。
作为向细胞导入反义寡核苷酸的方法的实施方式之一，可举出插入合适的载体中、进而导入合适的宿主细胞中的实施方式。
上述合适的载体的种类没有特别限定，可以是例如自主复制的载体(例如，质粒等)，优选为在被导入宿主细胞时整合至宿主细胞的基因组中、与经整合的染色体一同被复制的载体。
作为上述合适的载体，可以利用来自大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pUC118及其他)、来自枯草杆菌的质粒(例如，pUB110、pSH19及其他)、以及噬菌体、逆转录病毒、牛痘病毒等动物病毒等。进行重组时，也可使用合适的合成DNA接头来添加翻译起始密码子、翻译终止密码子。
另外，上述反义寡核苷酸可根据需要而与合适的终止子(例如，人生长激素终止子；或者，对于真菌宿主而言为TPI1终止子或ADH3终止子)功能性地结合。重组载体可还具有多聚腺苷酸化信号(polyadenylation signal)(例如来源于SV40或5型腺病毒E1b区的多聚腺苷酸化信号)、转录增强子序列(例如SV40增强子)及翻译增强子序列(例如编码腺病毒VARNA的序列)这样的要素。
重组载体可以还具备使该载体能够在宿主细胞内进行复制的DNA序列，作为其一例，可举出SV40复制起点(宿主细胞为哺乳动物细胞时)。
重组载体可还含有筛选标记。作为筛选标记，可举出例如其补体在宿主细胞中欠缺的基因(二氢叶酸还原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)TPI基因等)、或药物(例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素或潮霉素等)的抗性基因。
供上述反义寡核苷酸或包含其的载体导入的宿主细胞可举出高等真核细胞、细菌、酵母、真菌等，优选为哺乳动物细胞。
作为哺乳动物细胞的例子，可举出HEK293细胞、HeLa细胞、COS细胞(例如，COS-7细胞等)、BHK细胞、CHL细胞或CHO细胞、BALB/c小鼠细胞(例如，BALB/c小鼠胚胎成纤维细胞)等。对哺乳动物细胞进行转化、使导入该细胞的基因表达的方法也是已知的，可使用例如脂质体转染(lipofection)法、电穿孔法、磷酸钙法等。
从提高向细胞内的摄入的观点考虑，第二方式涉及的预防或治疗剂可以还包含脂质体转染用载体，也可以不包含脂质体转染用载体。
作为脂质体转染用载体，可举出与细胞膜的亲和性高的载体(例如脂质体(liposome)、胆固醇等)，优选Lipofectamine或Lipofectin，更优选Lipofectamine。
例如，反义寡核苷酸可与脂质体转染用载体一同以注射等方式施予至患者的患部或全身，被患者的细胞摄入从而抑制MEX3B基因的表达，由此预防或治疗由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病。
另外，通过使反义寡核苷酸具有选自由硫代磷酸酯结构、桥连结构及烷氧基结构组成的组中的至少一种结构，并将其与上述脂质体转染用载体组合使用，能够提高向患者的细胞内或核内的摄入。
作为有效成分即反义寡核苷酸的施予量，通常为每1次0.1μg～100mg/kg体重左右的范围。
(siRNA)
作为MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达的下调物质，也可举出下述双链RNA(siRNA(小干扰RNA，small interfering RNA))或编码该双链RNA的DNA，所述双链RNA包含由MEX3B基因的碱基序列转录的RNA的碱基序列中的CDS或UTR的至少20个连续核苷酸。
优选为包含由MEX3B基因的碱基序列转录的RNA的碱基序列中的CDS或UTR的至少21个连续核苷酸的双链RNA、或者编码上述双链RNA的DNA。
优选为包含由MEX3B基因的碱基序列转录的RNA的碱基序列中的CDS或UTR的30个以下连续核苷酸的双链RNA、或者编码上述双链RNA的DNA，更优选为包含由MEX3B基因的碱基序列转录的RNA的碱基序列中的CDS或UTR的25个以下连续核苷酸的双链RNA、或者编码上述双链RNA的DNA。
所谓RNAi(RNA干扰)，是指下述现象：当向细胞中导入将mRNA(其编码某靶基因的一部分)的一部分双链化而得到的RNA(双链RNA(double stranded RNA)：dsRNA)时，靶基因的表达被抑制。
作为编码双链RNA的DNA，可举出例如具有MEX3B或其部分序列的反向重复序列的DNA。
通过将具有这样的反向重复序列的DNA导入哺乳动物的细胞中，能够使得靶基因的反向重复序列在细胞内表达，从而能够利用RNAi效应抑制靶基因(MEX3B)的表达。
所谓反向重复序列，是指靶基因及其反向序列隔着适当的序列并列而成的序列。具体而言，在靶基因具有如下所示的由n个碱基序列组成的双链的情况下，
5’-X1X2......Xn-1Xn-3’
3’-Y1Y2......Yn-1Yn-5’
其反向序列具有以下的序列。
5’-YnYn-1......Y2Y1-3’
3’-XnXn-1......X2X1-5’
(此处，在X表示的碱基和Y表示的碱基中，下标数字相同的碱基为彼此互补的碱基)
反向重复序列是上述2种序列隔着适当的序列而形成的序列。作为反向重复序列，认为存在靶基因序列位于反向序列上游、和反向序列位于靶基因序列上游这两种情况。本发明中使用的反向重复序列可以为上述中的任一情况，优选反向序列存在于靶基因序列的上游。
存在于靶基因的序列和其反向序列之间的序列是在转录为RNA时形成发夹环的区域(shRNA：短发夹RNA，small hairpin RNA)。该区域的长度只要能够形成发夹环即可，没有特别限定，优选为0～300bp左右，更优选为0～100bp左右。该序列中可以存在限制性内切酶位点。
本发明中，通过在能够在哺乳动物中发挥作用的启动子序列的下游组入靶基因的反向重复序列，能够使靶基因的反向重复序列在哺乳动物的细胞内表达。本发明中使用的启动子序列只要能够在哺乳动物中发挥作用即可，没有特别限定。
例如，以注射等方式将上述双链RNA或DNA与用于辅助细胞摄入的上述脂质体转染用载体一同施予至患者的患部或全身，使患者的细胞摄入所述双链RNA或DNA，从而能够抑制重症哮喘。作为有效成分即双链RNA或DNA的施予量，通常为每1次0.1μg～10mg/kg体重左右的范围。
(人工核酸酶)
作为MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达的下调物质，也可举出CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复序列，Clusterd Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas核酸酶等用于基因组编辑的人工核酸酶，也可以是使用了转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)(TALEN)及锌指核酸酶(ZFN)的人工限制性内切酶(人工核酸酶)。
TALEN是包含TALEs及DNA切割结构域的人工核酸酶，所述TALEs是将识别4种碱基(A、T、G及C)中任一种并结合的4种单元重合而成的结构域，TALEs识别MEX3B基因中的至少部分序列并与其结合。
ZFN是包含锌指结构域及DNA切割结构域的嵌合蛋白质形式的的人工核酸酶。锌指结构域具有将多个锌指单元(zinc finger unit)(其识别特异性3碱基序列)重合而成的结构，是识别3的倍数的DNA序列并与其结合的结构域，锌指结构域识别MEX3B基因中的至少部分序列并与其结合。
CRISPR/Cas核酸酶包含引导RNA及Cas核酸酶(优选为Cas9)。
所谓引导RNA，是指具有与作为DNA切割酶的Cas核酸酶结合从而将Cas核酸酶导向靶DNA(MEX3B基因中的至少部分序列)的功能的RNA。引导RNA在其5’末端具有与靶DNA(MEX3B基因中的至少部分序列)互补的序列，并介由该互补序列与靶DNA结合，从而将Cas核酸酶导向靶DNA。Cas核酸酶作为DNA核酸内切酶发挥功能。在靶DNA存在的部位对DNA进行切割，从而能够特异性地降低例如MEX3B基因的表达。
作为靶标的MEX3B基因中的至少部分序列优选为15～25个碱基，更优选为17～22个碱基，进一步优选为18～21个碱基，特别优选为20个碱基。
通过将含有对于MEX3B基因具有特异性的引导RNA或编码引导RNA的DNA、及编码Cas核酸酶的核酸或Cas核酸酶的组合物转染至含有MEX3B基因的真核细胞或真核生物中，从而能够降低MEX3B基因的表达。
编码Cas核酸酶的核酸或Cas核酸酶、及引导RNA或编码引导RNA的DNA可利用本技术领域中已知的各种方法(例如，显微注射、电穿孔、DEAE-葡聚糖处理、脂质体转染、纳米颗粒介导的转染、蛋白质转导结构域介导的转导、病毒介导的基因转移、及PEG介导的原生质体转染等)而植入细胞内，但不限于这些方法。另外，编码Cas核酸酶的核酸或Cas核酸酶及引导RNA可利用注入等本技术领域中已知的各种用于施予基因或蛋白质的方法而植入生物内。可将编码Cas核酸酶的核酸或Cas蛋白质以与引导RNA形成的复合体的形态、或分别地植入细胞内。另外，与Tat等蛋白质转导结构域融合的Cas核酸酶也能够高效地递送至细胞内。
优选的是，对真核细胞或真核生物同时转染或连续转染Cas9核酸酶及引导RNA。
连续转染可通过首先转染编码Cas核酸酶的核酸、然后利用裸引导RNA进行二次转染而实施。优选的是，二次转染为3、6、12、18、24小时后，但不限于此。
引导RNA的表达也可使用引导RNA表达单元。作为引导RNA表达单元，优选为包含靶序列(MEX3B基因的部分序列)和引导RNA的CRISPR-Cas9体系的转录单元，优选具有用于表达引导RNA的启动子区域(RNA聚合酶III的启动子(例如，选自U6启动子及H1启动子的启动子))、靶序列(MEX3B基因)及引导RNA，更优选将启动子、与靶序列(MEX3B基因的至少部分序列)互补的序列及引导RNA无缝连接。
对于CRISPR/Cas核酸酶而言，为了防止脱靶，也可使用仅切割双链DNA中一条链的Cas9突变体作为切口酶。作为单链切割型Cas9突变体，可举出例如Cas9(D10A)。例如，将具有与靶DNA的一条链互补的靶序列的引导RNA、和与其紧邻的具有与另一条链互补的靶序列的引导RNA组合使用时，单链切割型Cas9突变体特异性切割一条链的20个碱基，并且特异性切割另一条链的20个碱基，因此，以共计40个碱基的特异性来切割DNA，从而能够大幅度提高靶标的特异性。
作为有效成分即上述人工核酸酶或编码上述人工核酸酶的核酸的施予量，通常为每1次0.1μg～10mg/kg体重左右的范围。
第二方式涉及的由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂可通过口服或非口服而全身或局部性地施予。作为非口服的施予方法，可举出滴注等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等。可根据患者的年龄、症状选择适当的施予方法。其施予量根据年龄、施予途径、施予次数的不同而不同，本领域技术人员可适当选择。
作为适于非口服施予的制剂形态，可举出例如含有稳定剂、缓冲剂、防腐剂、等渗剂等添加剂的形态，也可以还含有药学上允许的载体、添加物。作为这样的载体及添加物的例子，可举出水、有机溶剂、高分子化合物(胶原蛋白、聚乙烯醇等)、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、表面活性剂等，但不限于这些。
(与MEX3B蛋白质选择性结合的适体或抗体)
作为MEX3B蛋白质的抑制物质，只要抑制MEX3B蛋白质的功能，则可以是高分子化合物(核酸等)、抗体、低分子化合物等任意的物质。
作为MEX3B蛋白质的抑制物质的优选方式之一，可举出使用了与MEX3B蛋白质选择性结合的适体的、由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂。
所谓适体，是指由单链RNA或DNA构成的、基于其立体结构而与靶蛋白质结合并抑制其功能的核酸医药品。
适体对于靶蛋白质的结合性及特异性高、免疫原性低，可通过化学合成进行制造，保存稳定性也高。
作为与MEX3B蛋白质选择性结合的适体的碱基长度，只要与MEX3B蛋白质特异性结合即可，没有特别限制，优选为15～60个碱基，更优选为20～50个碱基，进一步优选为25～47个碱基，特别优选为26～45个碱基。
与MEX3B蛋白质选择性结合的适体可通过SELEX(指数富集的配体系统进化，Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)法获得。
作为MEX3B蛋白质的抑制物质的另一优选方式，可举出使用了与MEX3B蛋白质选择性结合的抗体的、由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂。只要能够与上述MEX3B蛋白质特异性结合，则可以是多克隆抗体或单克隆抗体中的任一者。
多克隆抗体可通过对从经过抗原免疫的动物中得到的血清进行分离、纯化而制备。单克隆抗体可通过下述方法制备：使从经过抗原免疫的动物中得到的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合而制备杂交瘤，培养该杂交瘤、或向动物施予该杂交瘤而使该动物患腹水癌，并对上述培养液或腹水进行分离、纯化。
抗原可通过下述方法制备：从各种人培养细胞中提纯MEX3B蛋白质；或者，将含有编码具有MEX3B蛋白质的氨基酸序列、或其突变序列、或前述序列的一部分的蛋白质的DNA的重组载体导入大肠杆菌、酵母、动物细胞或昆虫细胞等宿主中，使该DNA表达，对得到的蛋白质进行分离、纯化。另外，抗原也可通过使用氨基酸合成仪、合成具有MEX3B蛋白质的氨基酸序列的部分序列的肽来制备。
作为免疫方法，可向兔、山羊、大鼠、小鼠或仓鼠等非人哺乳动物的皮下、静脉内或腹腔内直接施予抗原，优选将抗原与透孔螺血蓝蛋白(日文：スカシガイヘモシアニン)、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等高抗原性的载体蛋白质结合并进行施予，或者与弗氏完全佐剂(Complete Freund’s Adjuvant)、氢氧化铝凝胶、百日咳菌疫苗等合适的佐剂一同施予。
抗原的施予可在第1次施予后以1～2周的间隔实施3～10次。在各施予后第3～7天从眼底静脉丛采血，基于酶免疫测定法对抗体效价进行测定，由此调查该血清是否与免疫中使用的抗原进行反应。可将血清针对免疫中使用的抗原显示充分的抗体效价的非人哺乳动物用作血清或抗体生成细胞的供给源。多克隆抗体可通过对上述血清进行分离、纯化而制备。
单克隆抗体可通过下述方法制备：使该抗体生成细胞与来自非人哺乳动物的骨髓瘤细胞融合而制备杂交瘤，培养该杂交瘤、或向动物施予该杂交瘤而使该动物患腹水癌，并对上述培养液或腹水进行分离、纯化。作为抗体生成细胞，可使用脾细胞、淋巴结、末梢血中的抗体生成细胞，可特别优选使用脾细胞。
作为骨髓瘤细胞，可使用作为8-氮鸟嘌呤抗性小鼠(来自BALB/c)骨髓瘤细胞株的P3-X63Ag8-U1(P3-U1)株[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1-7(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)株[European J.Immunology,6,511-519(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)株[Nature,276,269-270(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)株[J.Immunology,123,1548-1550(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)株[Nature,256,495-497(1975)]等来自小鼠的株化细胞。
杂交瘤细胞可利用以下的方法进行制备。首先，将抗体生成细胞和骨髓瘤细胞混合，在HAT培养基[向正常培养基中添加次黄嘌呤、胸苷及氨基蝶呤得到的培养基]中悬浮后，培养7～14天。培养后，取一部分培养上清液，利用酶免疫测定法等，筛选与抗原反应、且与不含抗原的蛋白质不反应的细胞。接着，利用有限稀释法实施克隆，利用酶免疫测定法筛选稳定地呈现高抗体效价的细胞作为生成单克隆抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体可通过下述方法制备：从培养杂交瘤细胞而得到的培养液、或者向动物的腹腔内施予杂交瘤细胞使该动物患腹水癌而得到的腹水中进行分离、纯化。
作为分离、纯化多克隆抗体或单克隆抗体的方法，可举出单独或组合下述方法进行处理的方法：离心分离、硫酸铵沉淀、辛酸沉淀、或基于使用DEAE-琼脂糖柱、阴离子交换柱、蛋白A柱或蛋白G柱、或凝胶过滤柱等的色谱等方法。
本说明书中，提及抗体的情况下，不仅包括全长的抗体，也包括抗体的片段。抗体的片段优选为功能性的片段，可举出例如F(ab’)2、Fab’等。F(ab’)2、Fab’是通过将免疫球蛋白用蛋白酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)处理而制备的，是在铰链区中2条H链之间存在的硫醚键附近处进行消化而生成的抗体片段。
以对人施予为目的使用抗体的情况下，为了降低免疫原性，优选使用人型化抗体或人源化抗体。上述人型化抗体、人源化抗体可使用转基因小鼠等哺乳动物进行制备。关于人型化抗体，记载于例如Morrison,S.L.等人〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)〕、野口浩〔Journal of Clinical and Experimental Medicine,167:457-462(1993)〕。人源化嵌合抗体可通过利用基因重组将小鼠抗体的V区和人抗体的C区结合来制备。人源化抗体可通过以人源序列对小鼠的单克隆抗体中互补决定区(CDR)以外的区域进行取代而制备。
另外，抗体可作为固定于固相载体等不溶性载体上的固定化抗体使用、或作为以标记物质进行了标记的标记抗体使用。这样的固定化抗体、标记抗体全部在本发明的范围内。
上述抗体之中能够与MEX3B蛋白质特异性结合并抑制其功能的抗体可作为由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂使用。
将抗体作为由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂而以医药组合物的形态使用时，可使用上述抗体作为有效成分，并使用药学上允许的载体、稀释剂(例如，免疫原性佐剂等)、稳定剂或赋形剂等制备医药组合物。对于含有抗体的由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂而言，可进行过滤灭菌及冷冻干燥，在给药瓶或稳定化水性制剂中制剂化以成为给药形态。
可通过例如动脉内注射、静脉内注射、皮下注射等对于本领域技术人员而言已知的方法对患者进行施予。施予量根据患者的体重、年龄、施予方法等而变化，本领域技术人员可适当选择合适的施予量。作为有效成分即抗体的施予量，通常为每1次0.1μg～100mg/kg体重左右的范围。
实施例
以下，示出实施例进一步具体地说明本发明，但本发明的范围不限于这些实施例。
《实施例1》
(MEX3B缺陷(敲除)BALB/c小鼠的制备)
MEX3B基因的基因组DNA利用了导入至BAC克隆(RP23-272F2)中的DNA。通过替换MEX3B基因的外显子1和外显子2的DNA区域的方式将新霉素抗性基因盒导入该BAC克隆中，从而构建靶向载体。将构建体(construct)通过电穿孔法导入至来自BALB/c的ES细胞(由大阪大学安居博士提供)中，利用抗生素(G418)进行筛选。通过PCR法、FISH法及Southern印迹法分析有无同源重组，鉴定出4个ES克隆。将筛选出的上述ES细胞注入C57BL/6小鼠的胚囊中，为了得到嵌合小鼠而移植至代孕母鼠。得到的雄性嵌合小鼠与BALB/c的雌鼠交配，通过PCR鉴定以杂合形式具有MEX3B突变的F1小鼠，相互交配而得到纯合的F2。F2小鼠的基因型利用PCR进行了确认。
(胚胎成纤维细胞的分离及传代培养)
将胰蛋白酶粉末(GIBCO公司制)以成为0.25％(W/V)的方式溶解于PBS(磷酸缓冲生理盐水)中，通过0.45微米过滤器(Advantec公司制)进行过滤灭菌(用时制备)。自小鼠开始交配当天起13.5天后，用70％乙醇对C57BL/6雌性小鼠的全身进行酒精消毒，在开腹后取出包含胚胎的子宫。用剪刀剪断脐带根部后，从子宫中逐只取出胚胎，浸于PBS中。从胚胎除去头、内脏、爪部、尾巴后，移至1mL经冰冷却的胰蛋白酶溶液中，使用锋利的剪刀切碎至2～3毫米。移至15mL管中，用胰蛋白酶溶液使液量为每1只胚胎5mL，在37℃、60～100个周期(cycle)/分钟的条件下，一边观察消化程度一边振荡10分钟。为了终止胰蛋白酶的反应，加入1mL牛血清(FBS)并充分悬浮后，进一步使用100mm细胞过滤网(Cell Strainer)(Falcon公司制)的筛网对其进行过滤以除去细胞块。对过滤后的细胞悬浮液进行离心(280×g、5分钟、4℃)后，除去上清液，将得到的沉淀在基础培养基(DMEM(高糖)(杜氏改良Eagle培养基：日水公司制)、10％FBS、青霉素链霉素溶液)中悬浮，以每1只胚胎为1孔的比例接种于100mm培养皿中。翌日，更换培养基，经过胰蛋白酶处理后重新接种，用于实验。
使用含有5％FBS的DMEM(杜氏改良Eagle培养基：日水公司制)(其含有2.5μg/mL的Fungizone)，在35mm细胞培养皿(BD Faloon：353001)中，在二氧化碳孵育器内(37℃、空气中5％CO2)分别培养野生型BALB/c小鼠的胚胎成纤维细胞、和MEX3B缺陷BALB/c小鼠的胚胎成纤维细胞，在细胞呈汇合状态后，进行传代培养。
(定量RT-PCR试验)
对于野生型小鼠、MEX3B缺陷小鼠，分别使用溶解缓冲液TRIsure(BIOLINE公司制)，回收传代初期(第3代)的细胞、和传代后期(第13～15代)的细胞的总RNA。利用Primescript(TAKARA公司制)进行逆转录反应，得到cDNA。
然后，使用Light Cycler480(ROCHE公司制)实施定量RT-PCR。实施大于3次的独立试验，进行定量统计分析。
定量RT-PCR试验中使用的引物序列如下。
MEX3B引物Fw1：
5’-CGTCGTCCTCTGTGGTCTTTCCCGGGGGTG-3’(序列号7)
MEX3B引物Rv1：
5’-TCAGGAAAAAATGCGGATGGCCTGAGTGAC-3’(序列号8)
小鼠GAPDH引物Fw1：
5’-AGAGACAGCCGCATCTTCTT-3’(序列号9)
小鼠GAPDH引物Rv1：
5’-GACAAGCTTCCCATTCTCGG-3’(序列号10)
小鼠IL-6引物Fw1：
5’-GCTACCAAACTGGATATAATCAGGA-3’(序列号11)
小鼠IL-6引物Rv1：
5’-CCAGGTAGCTATGGTACTCCAGAA-3’(序列号12)
小鼠CXCL5引物Fw1：
5’-CAGAAGGAGGTCTGTCTGGA-3’(序列号13)
小鼠CXCL5引物Rv1：
5’-TGCATTCCGCTTAGCTTTCT-3’(序列号14)
图1为表示利用定量RT-PCR对野生型BALB/c小鼠及MEX3B缺陷BALB/c小鼠的胚胎成纤维细胞中的MEX3B mRNA的表达水平进行验证的结果的图。图1为6只野生型小鼠的平均值、7只MEX3B缺陷小鼠的平均值，p值(＜0.05)为显著性水平的值。Y轴为针对各野生型小鼠的传代初期即第3代的实际数据、将定量对象基因量除以GAPDH量得到的数值作为“1”时的相对数值。后述的图2及3中也是同样的。
由图1可见，对野生型小鼠、MEX3B缺陷小鼠的胚胎成纤维细胞的传代初期(第3代)和后期(第13～15代)的细胞进行了分析，结果，在来源于MEX3B缺陷小鼠的细胞中，传代初期和后期的细胞均未观察到Mex3B的表达。
另外，图2为表示利用定量RT-PCR对野生型BALB/c小鼠及MEX3B缺陷BALB/c小鼠的胚胎成纤维细胞中的IL-6mRNA的表达水平进行验证的结果的图。
图3为表示利用定量RT-PCR对野生型BALB/c小鼠及MEX3B缺陷BALB/c小鼠的胚胎成纤维细胞中的CXCL5mRNA的表达水平进行验证的结果的图。
由图2及3可见，对野生型小鼠、MEX3B缺陷小鼠的胚胎成纤维细胞的传代初期和后期的细胞进行了分析，结果，在来源于MEX3B缺陷小鼠的细胞中，IL-6及CXCL5的表达在传代后期细胞中显著降低。
如以上的图2及图3所示，缺失Mex3B基因的细胞中，存在衰老趋势的传代后期成纤维细胞中的IL-6及CXCL5的表达降低，由该结果表明，Mex3B正向调控IL-6及CXCL5，反之，这也表明通过抑制MEX3B基因产物的功能，可抑制由IL-6或CXCL5所引起的疾病(例如，重症哮喘)的发病、重症化。
(重症哮喘诱发试验)
使用50μl弗氏完全佐剂(CFA：Sigma-Aldrich公司)及20μg卵清白蛋白(OVA：Sigma-Aldrich公司)(已在50μl PBS中乳化)，分别针对8周龄的野生型BALB/c雌性小鼠及MEX3B缺陷BALB/c雌性小鼠在第0天进行皮下致敏。
在第21天及第22天，使全部小鼠(6只以上小鼠/组)吸入含有0.1％OVA(PBS中)的气雾剂(aerosol)。另外，作为对照，使小鼠吸入含有PBS的气雾剂。在第23天测定支气管肺泡清洗液内的各种免疫细胞数量。
图4为表示重症哮喘诱发试验中的野生型BALB/c小鼠及MEX3B缺陷BALB/c小鼠的支气管肺泡清洗液内的各种免疫细胞(巨噬细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞)的增多的验证结果的图。
图4中，PBS+/+表示作为对照而吸入了PBS的野生型BALB/c小鼠的细胞数量，PBS-/-表示作为对照而吸入了PBS的MEX3B缺陷BALB/c小鼠的细胞数量，OVA+/+表示吸入了OVA的野生型BALB/c小鼠的细胞数量，OVA-/-表示吸入了OVA的MEX3B缺陷BALB/c小鼠的细胞数量。
由图4所示的结果可见，吸入了OVA的野生型BALB/c小鼠及MEX3B缺陷BALB/c小鼠的总细胞数量及巨噬细胞数量均较之对照而言增多，实现了OVA致敏。另外，吸入了OVA的野生型BALB/c小鼠中，嗜中性粒细胞数量及淋巴细胞数量增多，表明诱发了重症哮喘。
相对于此，吸入了OVA的MEX3B缺陷BALB/c小鼠中，嗜中性粒细胞数量及淋巴细胞数量显著降低，表明缓解了重症哮喘的症状。
由以上所示的结果可知，对抑制MEX3B蛋白质的功能的物质(低分子化合物、蛋白质、核酸等)的探索作为筛选由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法是有用的。
《实施例2》
(重症哮喘诱发模型中的Gapmer型反义寡核苷酸施予试验)
使用50μl的CFA(Sigma-Aldrich公司)及20μg OVA(Sigma-Aldrich公司)(已在50μl PBS中乳化)，针对8周龄的野生型BALB/c雌性小鼠在第0天进行皮下致敏。
自第16天起连续5天以吸入方式施予Gapmer型反义寡核苷酸(使用雾化器将5ml的10μM溶液制成气雾剂并充满容器内，暴露于小鼠20分钟)。
作为Gapmer型反义寡核苷酸，以吸入方式施予对照Gapmer或小鼠MEX3B特异性Gapmer。以下，也分别称为“OVA吸入-Gapmer(对照)吸入组”、“OVA吸入-MEX3B特异性Gapmer吸入组”。
作为小鼠MEX3B特异性Gapmer，使用了与表示小鼠Mex3B基因的序列号4中的3’UTR所含的第3135～3149位的碱基序列互补的Gapmer型反义寡核苷酸(5’-ACATAAACGAGTGGT-3’：序列号16；全长为15个碱基)。
需要说明的是，在各Gapmer型反义寡核苷酸的两个末端配置2个碱基的LNA(2’,4’-BNA)，填充除此以外的片段的碱基为通常的DNA，将各核苷酸连接的磷酸二酯键进行了硫代磷酸酯化。
在第21天、第22天及第23天，使全部小鼠(7只小鼠/组)吸入含有0.1％OVA(PBS中)的气雾剂。另外，作为对照组，使小鼠吸入含有PBS的气雾剂(4只小鼠/组)。
在第24天回收样品，测定支气管肺泡清洗液内的各种免疫细胞数量。
结果示于图5。
图5中，对照组表示作为对照而吸入了PBS的小鼠的细胞数量，OVA吸入组表示吸入了OVA的小鼠的细胞数量，OVA吸入-Gapmer(对照)吸入组表示在预先吸入Gapmer(对照)后吸入了OVA的小鼠的细胞数量，OVA吸入-MEX3B特异性Gapmer吸入组表示在预先吸入MEX3B特异性Gapmer后吸入了OVA的小鼠的细胞数量。
由图5所示的结果可见，重症哮喘模型中，吸入了OVA的小鼠组的总细胞数量及巨噬细胞数量均较之对照组而言增多，实现了OVA致敏。
另外，预先吸入Gapmer(对照)的小鼠组中，嗜中性粒细胞数量增多，表明诱发了重症哮喘。
相对于此，吸入了MEX3B特异性Gapmer的小鼠组中，嗜中性粒细胞数量显著降低，表明缓解了重症哮喘的症状。
因此，这表明MEX3B特异性Gapmer作为由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂发挥功能。
(定量RT-PCR试验)
从各组的小鼠中摘出肺组织，利用Polytron均化器将上述肺组织在TRIsure(Bioline公司制)溶液中粉碎，按照制品方案采集总RNA，使用下述表1所示的PCR引物进行扩增反应，对各细胞因子(IL-6、IL-13、TNF及G-CSF)及各趋化因子(CXCL1、CXCL2、及CXCL5)的mRNA的表达水平进行测定。
结果示于图6。
[表1]
PCR引物 PCR引物的序列 序列号
小鼠GAPDH-Fw2 TGTGTCCGTCGTGGATCTGA l7
小鼠GAPDH-Rv2 TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG 18
小鼠TNF-Fw TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG 19
小鼠TNF-Rv GAGGCCATTTGGGAACTTCT 20
小鼠G-CSF-Fw CCTGGAGCAAGTGAGGAAGA 21
小鼠G-CSF-Rv GGGGTGACACAGCTTGTAGG 22
小鼠IL-6-Fw GCTACCAAACTGGATATAATCAGGA 11
小鼠IL-6-Rv CCAGGTAGCTATGGTACTCCAGAA 12
小鼠IL-13-Fw CCTCTGACCCTTAAGGAGCTTAT 23
小鼠IL-13-Rv CGTTGCACAGGGGAGTCT 24
小鼠CXCL5-Fw CAGAAGGAGGTCTGTCTGGA 13
小鼠CXCL5-Rv TGCATTCCGCTTAGCTTTCT 14
小鼠CXCL2-Fw AAAATCATCCAAAAGATACTGAACAA 25
小鼠CXCL2-Rv CTTTGGTTCTTCCGTTGAGG 26
小鼠CXCL1-Fw AGACTCCAGCCACACTCCAA 27
小鼠CXCL1-Rv TGACAGCGCAGCTCATTG 28
由图6所示的结果可见，较之PBS吸入组而言，OVA吸入组中，IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL5、CXCL1、CXCL2的表达均显著增高，确认到符合预期地诱发了重症哮喘模型。
另外，较之Gapmer(对照)施予组而言，MEX3B特异性Gapmer施予组中，IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL5、CXCL1及CXCL2的表达水平存在显著减少的趋势，表明能通过抑制MEX3B的表达来抑制这些炎性因子。
(肺组织的病理组织分析)
使用10％福尔马林溶液固定所采集的小鼠肺组织后，包埋于石蜡中(Tissue-Tek)。使用切片机(LEICA公司制)切成薄片，将切片贴附于带APS(氨基硅烷)涂层的载玻片(Matsunami公司制)，按照标准方案实施H&E染色(苏木精·曙红染色)(参考文献CellRep.2016 Aug 30；16(9)：2456-71.)。
使用OLYMPUS显微镜系统拍摄病理组织图像。结果示于图7。
图7为表示各小鼠组中的肺组织的病理组织图像的图，示出了肺组织中炎症反应的程度的结果。
由图7所示的结果可见，对照吸入组(吸入PBS气雾剂)中，在表观上与未实施任何处理的小鼠同样地未发生炎症反应，未观察到免疫细胞的明显浸润。OVA吸入-PBS施予组及OVA吸入-对照Gapmer施予组中，观察到呼吸道上皮细胞的肥厚及免疫细胞的明显浸润，表明引起了炎症。
另一方面，显示出Mex3b抑制效果的Gapmer施予组、即OVA吸入-MEX3B特异性Gapmer施予组中，与对照吸入组几乎相同，未发生炎症反应。
该结果表明，通过施予MEX3B特异性Gapmer，类固醇抗性哮喘的发病得到显著抑制。
因此，这表明MEX3B特异性Gapmer作为由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂发挥功能。

Claims (10)

1.筛选由白细胞介素6、白细胞介素13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂的方法，所述方法以选自由MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达变化、及MEX3B蛋白质的功能变化组成的组中的至少一种作为指标。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述指标为选自由在被检物质的存在下及非存在下培养表达MEX3B基因的细胞时、对应于所述被检物质的有无而发生的MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达变化、及MEX3B蛋白质的功能变化组成的组中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述由白细胞介素6、白细胞介素13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病为由白细胞介素6、白细胞介素13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的重症哮喘。
4.一种药剂，其为由白细胞介素6、白细胞介素13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的预防或治疗剂，其含有MEX3B基因或MEX3B蛋白质的表达的下调物质、或者MEX3B蛋白质的抑制物质。
5.如权利要求4所述的药剂，其中，所述下调物质为反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有与MEX3B基因中或所述基因的表达调控区中所含的包含至少10个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列。
6.如权利要求5所述的药剂，其中，所述MEX3B基因中所含的寡核苷酸是MEX3B基因的外显子中的编码区或非翻译区中所含的寡核苷酸、或者MEX3B基因的内含子中所含的寡核苷酸。
7.如权利要求4所述的药剂，其中，所述下调物质为双链RNA或编码所述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含由MEX3B基因的碱基序列转录的RNA的碱基序列中的编码区或非翻译区的至少20个连续核苷酸。
8.如权利要求5～7中任一项所述的药剂，其还包含脂质体转染用载体。
9.如权利要求4所述的药剂，其中，所述抑制物质为与MEX3B蛋白质选择性结合的适体或抗体。
10.如权利要求4～8中任一项所述的药剂，其中，所述疾病为由白细胞介素6、白细胞介素13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的重症哮喘。
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