JPWO2018008750A1 - インターロイキン6、インターロイキン13、tnf、g−csf、cxcl1、cxcl2、又はcxcl5に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法、及びインターロイキン6、インターロイキン13、tnf、g−csf、cxcl1、cxcl2、又はcxcl5に起因する疾病の予防又は治療剤 - Google Patents
インターロイキン6、インターロイキン13、tnf、g−csf、cxcl1、cxcl2、又はcxcl5に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法、及びインターロイキン6、インターロイキン13、tnf、g−csf、cxcl1、cxcl2、又はcxcl5に起因する疾病の予防又は治療剤 Download PDFInfo
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Abstract
MEX3B遺伝子又はMEX3Bタンパク質の発現の変化、及びMEX3Bタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも1つを指標として、インターロイキン6、インターロイキン13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法。
Description
しかし、喘息が悪化して死に至るのはほとんどが高齢の患者であり、これらの重症喘息患者の気道炎症部位にはアレルギー反応により集積する好酸球ではなくむしろ感染防御に関わる好中球が多く見受けられるのが特徴である。近年の免疫学の進歩から、これら重症喘息患者におけるTh17型の免疫細抱(IL−17を主に分泌して感染防御に対応する免疫反応を担う)が病態の根幹を担うことが明らかとなってきた(例えば、非特許文献2)。
重症患者ほど、サイトカインの一種である血清中のIL−17(インターロイキン17)が高レベルであることも報告されている。IL−17は肺組織からのケモカイン類(CXCL1、CXCL2、CXCL5など)分泌を亢進させ、これらのケモカインは好中球を炎症部位に呼び寄せる。好中球浸潤は慢性炎症を繰り返し誘導し、平滑筋肥厚、気道粘膜線維化や粘膜下腺過形成などが進むと結果的には不可逆的な気道リモデリングが引き起こされる。このような状態になれば容易に呼吸困難に陥りやすくなり、治療が非常に困難になる。
IL−6が、標的細胞表面に発現しているIL−6受容体サブユニットとgp130(シグナル伝達サブユニット)との複合体に結合することによりIL−6細胞内シグナルが伝達され、そのシグナルによりIL−6が誘導する様々な生命現象に深く関与する標的遺伝子を活性化することが知られている。
獲得免疫系の活性化においてはIL−6シグナルはTGF−βシグナルと協調してTh17細胞を誘導する。重症喘息はステロイド耐性の病態を示し、その炎症部位には好中球の顕著な浸潤が見られるが、これらステロイド耐性重症喘息患者の血清中にはIL−17が顕著に高値で検出されることからTh17細胞の過剰な反応により重症喘息が引き起こされるということが近年判明している。
また、IL−13、TNF(中でも、TNF−α)、G−CSFも、喘息の重症化に関与することが知られている(例えば、非特許文献4)。
IL−13は、炎症性サイトカインとして末梢組織でのアレルギー性炎症をより増強する役割を担うことが知られており、アレルギー性喘息の主な要因であるアレルギー反応を促進するという側面のみならず、ステロイド剤が効かなくなるという喘息の難治化に関与することが知られている。またIL−13は、喘息のみならず、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎においてもその病態形成に関与している(例えば、非特許文献5、6)。
また、G−CSFは顆粒球産出の促進、好中球の機能を高める作用があることが知られている。
気道粘膜における過剰な炎症の亢進により肺組織からCXCL1、CXCL2、CXCL5が分泌された場合には、CXCL1、CXCL2、CXCL5の受容体であるCXCR2を高発現する好中球の浸潤が促される。結果的にはステロイド耐性の好中球浸潤が重症喘息を引き起こすことにより気道の不可逆的なリモデリングを誘導する慢性炎症を誘発する。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法、及びIL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤の提供を目的とする。
具体的には、本発明は以下の通りである。
MEX3B遺伝子又はMEX3Bタンパク質の発現の変化、及びMEX3Bタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも1つを指標として、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法である。
MEX3B遺伝子若しくはMEX3Bタンパク質の発現の低下物質、又はMEX3Bタンパク質の阻害物質を含む、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤である。
本発明によれば、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤を提供することができる。
本発明の第1の態様に係るスクリーニング方法において、MEX3B遺伝子又はMEX3Bタンパク質の発現の変化、及びMEX3Bタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも1つを指標とすることにより、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。
IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングすることが好ましく、IL−6又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングすることがより好ましい。
MEX3B遺伝子又はMEX3Bタンパク質の発現の低下、及びMEX3Bタンパク質の機能の低下よりなる群から選択される少なくとも1つを指標とすることにより、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5発現増加に起因する疾病(例えば、重症喘息、関節リウマチ、大腸炎、クローン病、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん等の中でもIL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する重症喘息、関節疾患(関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎)、糖尿病、炎症性腸疾患(大腸炎、クローン病)、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん(卵巣がん、乳がん)、精神疾患(うつ、双極性障害、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症)、心血管疾患(心不全、動脈硬化)、呼吸器疾患(気管支喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害)、二型糖尿病、腎疾患(虚血性腎障害、移植後拒絶反応、糸球体腎炎)等(例えば、Int Immunol.2015 Jan;27(1):21−9、Cancer Discov. 2016 Jan;6(1):80−95.等))の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。
また、上記低下の程度としては統計的に有意な低下であれば特に制限はないが、被験物質の非存在下(例えば、被験物質の投与前の系(例えば、野生型)、又は陰性対照(MEX3B遺伝子若しくはMEX3Bタンパク質の発現又は機能に影響しない物質を投与した対照)の系)におけるMEX3B遺伝子若しくはMEX3Bタンパク質の発現又は機能に対して、1/2以下であることが好ましく、1/4以下であることがより好ましく、1/10以下であることがさらに好ましく、発現又は機能がなくなることが特に好ましい。
また、上記増加の程度としては統計的に有意な増加であれば特に制限はないが、被験物質の非存在下(例えば、被験物質の投与前又は陰性対照の系)におけるMEX3B遺伝子若しくはMEX3Bタンパク質の発現又は機能に対して、1.5倍以上であることが好ましく、2倍以上であることがより好ましい。
スクリーニング方法としては、上記を指標とする限り、インビボ(in vivo)、インビトロ(in vitro)、インシリコ(in silico)等の任意のスクリーニング方法であってもよい。スクリーニング方法の好ましい一例としては、MEX3B遺伝子を発現する細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質の有無に応じたMEX3B遺伝子又はMEX3Bタンパク質の発現の変化、及びMEX3Bタンパク質の機能の変化を指標として、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングすることが挙げられる。
マウス胚由来繊維芽細胞は単純継代することで細胞老化(Senescence)を誘導することができる。
MEF系は細胞老化に伴う様々な生命現象の変化を検証するうえで用いられる手法の一つである。継代初期(例えば、passage3)では顕著に産生されない炎症性サイトカインやケモカインは継代後期(例えば、passage13〜15)では著しく誘導されることが知られている。気道粘膜の細胞老化の再構成系実験としてMEF細胞におけるMEX3B遺伝子の欠損とサイトカインないしケモカイン産生の変化との関係について解析することができる。
本発明者らは、MEX3Bの発現が低下した細胞では、分泌因子(IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、CXCL5等)が有意に低下し得ることを見出した。
IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、CXCL5は、上述のように重症喘息の病態に深く関与し得る。
また、MEX3B遺伝子のmRNAレベルでの発現量の測定も、RT−PCR、ノザンブロット、サザンブロット等の常法により行うことができる。
また、MEX3Bタンパク質の機能の変化の分析は、MEX3Bタンパク質のmRNAへの結合能の有無または程度の測定、MEX3Bタンパク質が結合するmRNAの機能発現の有無または程度の測定、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、及び/又はCXCL5発現の有無または程度を測定することにより分析することができる。
MEX3Bタンパク質のmRNAへの結合能の有無または程度の測定は、競争的阻害試験等任意の分析でおこなうことができる。
MEX3Bタンパク質が結合するmRNAの機能発現の有無または程度についてのタンパク質レベルでの発現量の測定は、ウェスタンブロット又はELISA等の通常の免疫分析により行なうことができる。IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、及び/又はCXCL5発現のmRNAレベルでの発現量の測定は、ノザンブロット、サザンブロット又はRT−PCR等の常法により行うことができる。具体的には、モレキュラークローニング第2版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。
被験物質は、好ましくは低分子化合物(例えば、化合物ライブラリー)、核酸分子、ゲノム編集用の人工ヌクレアーゼ又は抗体であり、MEX3B遺伝子又はタンパク質に対して特異性が高い観点から、核酸分子又は抗体がより好ましく、MEX3B遺伝子(エクソン中のコーディング領域(CDS)若しくは非翻訳領域(UTR)又はイントロン)中又は上記遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸分子又はMEX3Bタンパク質に選択的に結合するアプタマー又は抗体であることが更に好ましい。
MEX3B遺伝子はエクソン1、イントロン及びエクソン2を含み、この構成はヒト、マウス、その他の哺乳類において高度に保存されている。また、エクソン1及びエクソン2にはCDS及びUTRが含まれる。
エクソン中のアミノ酸をコードしない非翻訳領域(UTR)としては、開始コドンより上流に5’UTRが存在し、終始コドンより下流に3’UTRが存在する。
ヒトMEX3BのmRNAをコードするヒトMEX3B遺伝子は後記の配列番号1で表される配列を有する。
配列番号1において、437〜2146番目の塩基配列がCDSであり、1〜436番目の塩基配列が5’UTRであり、2147〜3532番目の塩基配列が3’UTRである。
後記の配列番号2はヒトMEX3B遺伝子の転写開始点から上流約36キロ塩基の発現制御領域を含む配列を示す。後記の配列番号3はヒトMEX3B遺伝子のイントロン領域の836塩基を示す。ヒトMEX3B遺伝子において、上記イントロン領域は、配列番号1で表される配列における694番目の塩基と695番目の塩基との間に存在する。
配列番号15は、スプライシング前のヒトMEX3BのプレmRNAをコードする塩基配列を示す。配列番号15で表されるヒトMEX3BのプレmRNAをコードする配列における437〜692番目及び1529〜2982番目の塩基配列がCDSであり、1〜436番目の塩基配列が5’UTRであり、2983〜4368番目の塩基配列が3’UTRであり、693〜1528番目の領域が、配列番号3で表されるヒトMEX3B遺伝子のイントロン領域に相当する。
配列番号4において、319〜2049番目の塩基配列がCDSであり、1〜318番目の塩基配列が5’UTRであり、2050〜3416番目の塩基配列が3’UTRである。
また、MEX3Bタンパク質(例えば、後記の配列番号5又は6で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質)をコードする遺伝子は全てMEX3B遺伝子に属する。
MEX3B遺伝子は元来TGF−βにより活性化される遺伝子として同定され、その後の解析から、MEX3Bタンパク質は種々のmRNAに結合してそれらmRNAの機能(つまりタンパク質への翻訳)を制御する分子であることが知られている(例えば、Nucleic Acids Res.2007;35(4):1289−300.)。
MEX3B遺伝子の具体例としては、以下の(a)又は(b)の何れかに記載の遺伝子が挙げられ、ヒトの疾病に対する予防又は治療剤をスクリーニングする観点、及びヒト由来の遺伝子をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、下記(a)の遺伝子であることが好ましい。
(a)配列表の配列番号1又は4に記載の塩基配列からなる遺伝子、
(b)配列表の配列番号1又は4に記載の塩基配列において1もしくは数個の塩基が欠失、置換及び/又は付加された塩基配列からなり、かつTGF−βにより活性化される遺伝子、又はIL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、及び/若しくはCXCL5の発現を誘導する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
上記のDNA変異の程度としては、例えば、配列表の配列番号1又は4に記載したMEX3B遺伝子の塩基配列と80%以上の相同性を有するものが挙げられ、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上の相同性を有するDNAが挙げられる。
MEX3B遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号1、4又は15及び5又は6に記載した塩基配列およびアミノ酸配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトcDNAライブラリー(MEX3B遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの)から所望クローンを選択することにより、MEX3B遺伝子を単離することができる。
PCR法によりMEX3B遺伝子を取得することもできる。例えば、ヒト培養細胞由来の染色体DNAまたはcDNAライブラリーを鋳型として使用し、配列番号1又は4に記載した塩基配列を増幅できるように設計した1対のプライマーを使用してPCRを行う。
PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、94℃で30秒間(変性)、55℃で30秒〜1分間(アニーリング)、72℃で2分間(伸長)からなる反応工程を1サイクルとして、例えば30サイクル行った後、72℃で7分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたDNA断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
上記したブローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。
MEX3Bタンパク質は、以下の何れかのタンパク質である。
(a)配列表の配列番号5又は6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列表の配列番号5又は6に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ特定のmRNAに対する結合活性を有するタンパク質、又はIL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、及び/若しくはCXCL5の発現を誘導又は制御する活性を有するタンパク質、又は
(c)配列表の配列番号5又は6に記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつTGF−βにより活性化されるタンパク質、又はIL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、及び/若しくはCXCL5の発現を誘導又は制御する活性を有するタンパク質
ヒトの疾病に対する予防又は治療剤をスクリーニングする観点、及びヒト由来のタンパク質をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、上記(a)のタンパク質であることが好ましい。
配列番号5は、ヒトMEX3Bタンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号6は、マウスMEX3Bタンパク質のアミノ酸配列を表す。
本明細書で言う「95%以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、アミノ酸の相同性が95%以上であることを意味し、相同性は好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上である。
上述の通り、配列表の配列番号1又は4に記載の塩基配列を有する遺伝子と相同性の高い変異体遺伝子にコードされるタンパク質であって、特定のmRNAに対する結合活性を有する生理活性タンパク質、又はIL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、及び/若しくはCXCL5の発現を誘導又は制御する活性を有する生理活性タンパク質は全て本発明の範囲内のものである。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の3次元構造(立体構造とも言う)に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン(Gly)とプロリン(Pro)、Glyとアラニン(Ala)またはバリン(Val)、ロイシン(Leu)とイソロイシン(Ile)、グルタミン酸(Glu)とグルタミン(Gln)、アスパラギン酸(Asp)とアスパラギン(Asn)、システイン(Cys)とスレオニン(Thr)、Thrとセリン(Ser)またはAla、リジン(Lys)とアルギニン(Arg)、等が挙げられる。
MEX3Bタンパク質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来のタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
第2の態様に係るIL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤(以下、単に「第2の態様に係る予防又は治療剤」ともいう。)は、MEX3B遺伝子若しくはMEX3Bタンパク質の発現の低下物質、又はMEX3Bタンパク質の阻害物質を含む。
第2の態様に係る予防又は治療剤は、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤であることが好ましく、IL−6又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤であることがより好ましい。
MEX3B遺伝子若しくはMEX3Bタンパク質の発現の低下物質としては、MEX3B遺伝子(エクソン中のCDS若しくはUTR又はイントロン)中又は上記遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入することによりMEX3B遺伝子の転写や翻訳を抑制することによりIL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病を予防又は治療することができる。
例えば、MEX3B遺伝子(エクソン中のCDS若しくはUTR又はイントロン)中又は上記遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドと、それと相補的な上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとが、細胞に導入した後にハイブリッド形成することにより、生じたハイブリッド二本鎖に特異的なヌクレアーゼ(例えば、RNアーゼH)によりMEX3BのmRNAが分解されMEX3B遺伝子の転写や翻訳を抑制することができる。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、MEX3B遺伝子の塩基配列(エクソン中のCDS若しくはUTR又はイントロン)中又は上記遺伝子の発現制御領域中の連続する少なくとも10ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、少なくとも11ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、少なくとも12ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましく、少なくとも13ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが特に好ましく、少なくとも14ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが最も好ましい。
また、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長の上限値としては、MEX3B遺伝子の塩基配列(エクソン中のCDS若しくはUTR又はイントロン)中又は上記遺伝子の発現制御領域中の連続する40ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、連続する30ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、連続する25ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましく、連続する20ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが特に好ましく、連続する17ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが最も好ましい。
例えば、ヌクレオチド同士をつなぐリン酸ジエステル結合部がホスホロチオエート構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性を獲得することができ、また、疎水性が向上することから細胞内又は核内への取り込みも向上することができる。
また、ヌクレオチドの糖部が、2’,4’−BNA(2’,4’−Bridged Nucleic Acid;別名LNA(Locked Nucleic Acid))、ENA(2’−O,4’−C−Ethylene−bridged Nucleic Acid)等の架橋構造、2’−O−メチル化、2’−O−メトキシエチル化(2’−MOE)等のアルコキシ構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性獲得及びmRNAの結合能を向上することができる。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオチド同士をつなぐ少なくとも1つのリン酸ジエステル結合部がホスホロチオエート構造を有することが好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの50%以上がホスホロチオエート構造を有することがより好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの70%以上がホスホロチオエート構造を有することが更に好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの90%以上がホスホロチオエート構造を有することが特に好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート構造を有することが最も好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、少なくともいずれか一方の末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することがより好ましく(いわゆるギャップマー(Gapmer)型アンチセンスオリゴヌクレオチド)、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端において、独立して、末端から4塩基までが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが更に好ましく、末端から2又は3塩基が架橋構造又はアルコキシ構造を有することが特に好ましい。
上記適当なベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター(例えば、プラスミド等)でもよいが、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであることが好ましい。
上記適当なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322、pUC118その他)、枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110、pSH19その他)、さらにバクテリオファージやレトロウイルスやワクシニアウイルス等の動物ウイルス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成DNAアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加することも可能である。
組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするDNA配列を具備してもよく、その一例としてはSV40複製起点(宿主細胞が哺乳類細胞のとき)が挙げられる。
組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)またはシゾサッカロマイセス・ポンベTPI遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
哺乳類細胞の例としては、HEK293細胞、HeLa細胞、COS細胞(例えば、COS−7細胞など)、BHK細胞、CHL細胞またはCHO細胞、BALB/cマウス細胞(例えば、BALB/cマウス胎児繊維芽細胞)等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入された遺伝子を発現させる方法も公知であり、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
リポフェクション用担体としては、細胞膜との親和性の高い担体(例えばリポソームやコレステロール等)が挙げられ、リポフェクトアミン又はリポフェクチンが好ましく、リポフェクトアミンがより好ましい。
例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポフェクション用担体と一緒に患者の患部又は全身に注射などにより投与し、患者の細胞に取り込ませてMEX3B遺伝子の発現を抑制することにより、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病を予防又は治療することができる。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも1つの構造を有することと、上記リポフェクション用担体とを組み合わせて用いることにより患者の細胞内又は核内への取り込みを向上させることができる。
有効成分であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量としては、一般的には一回につき体重1kgあたり0.1μg〜100mg程度の範囲である。
MEX3B遺伝子若しくはMEX3Bタンパク質の発現の低下物質としては、MEX3B遺伝子の塩基配列から転写されるRNAの塩基配列中のCDS又はUTRの連続する少なくとも20ヌクレオチドを含む二本鎖RNA(siRNA(small interfering RNA))又は上記二本鎖RNAをコードするDNAも挙げられる。
MEX3B遺伝子の塩基配列から転写されるRNAの塩基配列中のCDS又はUTRの連続する少なくとも21ヌクレオチドを含む二本鎖RNA又は上記二本鎖RNAをコードするDNAであることが好ましい。
MEX3B遺伝子の塩基配列から転写されるRNAの塩基配列中のCDS又はUTRの連続する30ヌクレオチド以下を含む二本鎖RNA又は上記二本鎖RNAをコードするDNAであることが好ましく、MEX3B遺伝子の塩基配列から転写されるRNAの塩基配列中のCDS又はUTRの連続する25ヌクレオチド以下を含む二本鎖RNA又は上記二本鎖RNAをコードするDNAであることがより好ましい。
二本鎖RNAをコードするDNAとしては、例えば、MEX3Bまたはその部分配列の逆向き反復配列を有するDNAを挙げることができる。
このような逆向き反復配列を有するDNAを哺乳動物の細胞に導入することにより、細胞内で標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができ、これによりRNAi効果により標的遺伝子(MEX3B)の発現を抑制することが可能になる。
逆向き反復配列とは、標的遺伝子並びにその逆向きの配列が適当な配列を介して並列している配列を言う。具体的には、標的遺伝子が、以下に示すn個の塩基配列から成る2本鎖を有する場合、
5’−X1X2......Xn−1Xn−3’
3’−Y1Y2......Yn−1Yn−5’
その逆向き配列は以下の配列を有する。
5’−YnYn−1......Y2Y1−3’
3’−XnXn−1......X2X1−5’
(ここで、Xで表される塩基とYで表される塩基において、添え字の数字が同じものは互いに相補的な塩基である)
標的遺伝子の配列とその逆向き配列の間に存在する配列は、RNAに転写された際にヘアピンループを形成する領域である(shRNA:small hairpin RNA)。この領域の長さは、ヘアピンループを形成できる限り特には限定されないが、好ましくは0〜300bp程度、より好ましくは0〜100bp程度である。この配列の中には制限酵素部位が存在していてもよい。
MEX3B遺伝子若しくはMEX3Bタンパク質の発現の低下物質としては、CRISPR(Clusterd Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Casヌクレアーゼ等のゲノム編集用の人工ヌクレアーゼも挙げられ、Transcription Activator−Like Effector Nuclease(TALEN)及びジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を用いた人工制限酵素(人工ヌクレアーゼ)であってもよい。
TALENは4種類の塩基(A、T、G及びC)のいずれかを認識して結合する4種類のユニットを重合させてなるドメインであるTALEs及びDNA切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼであり、TALEsがMEX3B遺伝子中の少なくとも部分配列を認識し結合する。
ZFNはジンクフィンガードメイン及びDNA切断ドメインを含むキメラタンパク質の形態の人工ヌクレアーゼである。ジンクフィンガードメインは、特異的な3塩基配列を認識するジンクフィンガーユニットを、複数重合した構造を有し、3の倍数のDNA配列を認識し結合するドメインであり、ジンクフィンガードメインがMEX3B遺伝子中の少なくとも部分配列を認識し結合する。
ガイドRNAとは、DNA切断酵素であるCasヌクレアーゼと結合して、Casヌクレアーゼを標的DNA(MEX3B遺伝子中の少なくとも部分配列)に導く機能を有するRNAを意味する。ガイドRNAは、その5’末端に標的DNA(MEX3B遺伝子中の少なくとも部分配列)に相補的な配列を有し、該相補的な配列を介して標的DNAに結合することにより、Casヌクレアーゼを標的DNAに導く。Casヌクレアーゼは、DNAエンドヌクレアーゼとして機能し、標的DNAが存在する部位でDNAを切断し、例えば、MEX3B遺伝子の発現を特異的に低下させることができる。
標的となるMEX3B遺伝子中の少なくとも部分配列は、15〜25塩基であることが好ましく、17〜22塩基がより好ましく、18〜21塩基がさらに好ましく、20塩基であることが特に好ましい。
Casヌクレアーゼをコードする核酸又はCasヌクレアーゼ、及びガイドRNA又はガイドRNAをコードするDNAは、当技術分野において公知の様々な方法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、DEAE−デキストラン処理、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、タンパク質形質導入ドメイン媒介性形質導入、ウイルス媒介性遺伝子送達、およびプロトプラストへのPEG媒介性トランスフェクションなどによって、細胞内に移入されうるが、これらに限定されない。また、Casヌクレアーゼをコードする核酸又はCasヌクレアーゼ及びガイドRNAは、注入などの遺伝子もしくはタンパク質を投与するための、当技術分野において公知の様々な方法によって、生物内に移入されうる。Casヌクレアーゼをコードする核酸又はCasタンパク質は、ガイドRNAとの複合体の形態で、もしくは別々に、細胞内に移入されうる。Tatなどのタンパク質形質導入ドメインと融合されたCasヌクレアーゼもまた、細胞内に効率的に送達され得る。
好ましくは、真核細胞又は真核生物は、Cas9ヌクレアーゼ及びガイドRNAが同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトされる。
連続トランスフェクションは、最初にCasヌクレアーゼをコードする核酸によるトランスフェクション、続いて裸のガイドRNAによる第二のトランスフェクションによって行われうる。好ましくは、第二のトランスフェクションは、3、6、12、18、24時間後であるが、それらに限定されない。
ガイドRNAの発現は、ガイドRNA発現ユニットを用いてもよい。ガイドRNA発現ユニットとしては、標的配列(MEX3B遺伝子の部分配列)とガイドRNAとを含むCRISPR−Cas9系の転写ユニットとすることが好ましく、ガイドRNAを発現するためのプロモーター領域(RNAポリメラーゼIIIのプロモーター(例えば、U6プロモーターおよびH1プロモーターから選択されるプロモーター))、標的配列(MEX3B遺伝子)及びガイドRNAを有することが好ましく、プロモーター、標的配列(MEX3B遺伝子の少なくとも部分配列)に相補的な配列及びガイドRNAがシームレスに連結していることがより好ましい。
CRISPR/Casヌクレアーゼは、オフターゲットを防ぐために、ニッカーゼとして二本鎖DNAの一方の鎖のみを切断するCas9変異体を用いることもできる。一本鎖切断型Cas9変異体としては、例えば、Cas9(D10A)が挙げられる。一本鎖切断型Cas9変異体は例えば、標的DNAの一方の鎖に相補的な標的配列を有するガイドRNAと、そのごく近傍の他方の鎖に相補的な標的配列を有するガイドRNAとを組み合わせて用いると、一方の鎖を20塩基の特異性で切断し、他方の鎖をさらに20塩基の特異性で切断するため、併せて40塩基の特異性でDNAを切断することになり、標的の特異性を大幅に向上させることが可能となる。
非経口投与に適した製剤形態として、例えば安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有したものは挙げられ、さらに薬学的に許容される担体や添加物を含むものでもよい。このような担体及び添加物の例として、水、有機溶剤、高分子化合物(コラーゲン、ポリビニルアルコールなど)、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン(HSA)、マンニトール、ツルビトール、ラクトース、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
MEX3Bタンパク質の阻害物質としては、MEX3Bタンパク質の機能を阻害する限り、高分子化合物(核酸等)、抗体、低分子化合物等任意の物質であってもよい。
MEX3Bタンパク質の阻害物質の好ましい態様の1つとして、MEX3Bタンパク質に選択的に結合するアプタマーを用いたIL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤が挙げられる。
アプタマーとは、一本鎖RNA又はDNAで構成され、その立体構造により標的タンパク質と結合して機能を阻害する核酸医薬品をいう。
アプタマーは標的タンパク質に対する結合性及び特異性が高く、免疫原性が低く、化学合成により製造することができ、保存安定性も高い。
MEX3Bタンパク質に選択的に結合するアプタマーの塩基長としては、MEX3Bタンパク質に特異的に結合する限り特に制限はないが、15〜60塩基であることが好ましく、20〜50塩基であることがより好ましく、25〜47塩基であることが更に好ましく、26〜45塩基であることが特に好ましい。
MEX3Bタンパク質に選択的に結合するアプタマーはSELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)法により取得することができる。
ポリクローナル抗体は、抗原を免疫した動物から得られる血清を分離、精製することにより調製することができる。モノクローナル抗体は、抗原を免疫した動物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、上記の培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
抗原は、各種ヒト培養細胞からMEX3Bタンパク質を精製するか、MEX3Bタンパク質のアミノ酸配列またはその変異配列またはそれらの一部を有するタンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターを大腸菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などの宿主に導入して、該DNAを発現させて得られるタンパク質を分離、精製することにより調製できる。また、抗原は、MEX3Bタンパク質のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドをアミノ酸合成機を用いて合成することによって調製することもできる。
免疫方法としては、抗原をウサギ、ヤギ、ラット、マウスまたはハムスター等などの非ヒト哺乳動物の皮下、静脈内または腹腔内にそのまま投与してもよいが、抗原をスカシガイヘモシアニン、キーホールリンペットヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛チログロブリン等の抗原性の高いキャリアタンパク質と結合して投与したり、完全フロイントアジュバント(Complete Freund’s Adjuvant)、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等の適当なアジュバントとともに投与することも好ましい。
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を使用することができ、特に好ましくは脾細胞を使用することができる。
ハイブリドーマ細胞は、以下の方法により作製できる。先ず、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、HAT培地[正常培地にヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた培地]に懸濁したのち、7〜14日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原に反応し、抗原を含まないタンパク質には反応しないものを選択する。次いで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として選択する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養して得られる培養液、またはハイブリドーマ細胞を動物の腹腔内に投与して該動物を腹水癌化させて得られる腹水から分離、精製することにより調製できる。
本明細書で抗体と言う場合、全長の抗体だけではなく抗体の断片も包含するものとする。抗体の断片とは、機能性の断片であることが好ましく、例えば、F(ab’)2、Fab’などが挙げられる。F(ab’)2、Fab’とは、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素(例えば、ペプシン又はパパイン等)で処理することにより製造されるもので、ヒンジ領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体断片である。
また、抗体は、固相担体などの不溶性担体上に固定された固定化抗体として使用したり、標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体も全て本発明の範囲内である。
患者への投与は、たとえば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などの当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。有効成分である抗体の投与量としては、一般的には一回につき体重1kgあたり0.1μg〜100mg程度の範囲である。
(MEX3B欠損(ノックアウト)BALB/cマウスの作製)
MEX3B遺伝子のゲノムDNAはBACクローン(RP23−272F2)に導入されたものを利用した。ターゲッティングベクターは、このBACクローンにネオマイシン耐性遺伝子カセットをMEX3B遺伝子のエクソン1とエクソン2のDNA領域に入れ替える様式にて導入して構築した。コンストラクトはエレクトロポレーションでBALB/c由来のES細胞(大阪大学安居博士から供与)に導入し、抗生物質(G418)で選択した。相同組換えの有無をPCR法、FISH法およびサザンブロットで解析し、4つのESクローンを同定した。選択した上記ES細胞をC57BL/6マウスの胚盤胞に注入し、キメラマウスを得るために仮親に移植した。得られた雄のキメラマウスはBALB/cのメスと交配し、MEX3B突然変異をヘテロ接合で有するF1マウスをPCRで同定し、相互交配しホモ接合のF2を得た。F2マウスの遺伝子型はPCRによって確認した。
トリプシン粉末(GIBCO社製)を0.25%(W/V)となるようにPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に溶かし、0.45マイクロメーターフィルター(Advantec社製)に通して濾過滅菌した(要時調製)。マウス交配を開始した日から13.5日後、C57BL/6雌マウスの全身を70%エタノールでアルコール消毒し、開腹後に胎児の入った子宮を取り出した。臍帯の付け根をはさみで切断後、子宮から胎児を一匹ずつ取り出してPBSに浸した。胎児から頭、内臓、手足、尻尾を除いた後、氷冷したトリプシン溶液1mLに移し、鋭利なはさみを用いて2〜3ミリメートルにミンスした。15mLチューブに移し、トリプシン溶液で液量を胎児1匹あたり5mLに合わせ、37℃で60〜100サイクル/分で消化具合を見ながら10分間振盪した。トリプシンの反応を止めるため、牛血清(FBS)を1mL加えてよく懸濁し、さらに細胞塊を除くためこれを100mmセルストレーナー(Falcon社製)のメッシュを用いて濾した。濾過された細胞懸濁液を遠心(280×g、5分間、4℃)後、上清を除き、得られた沈殿を基本培地(DMEM(High Glucose)(Dulbecco’s modified Eagle medium:日水社製)、10%FBS、ペニシリンストレプトマイシン溶液)で懸濁して100mm培養皿に胎児1匹当たり1ウェルの割合で播いた。翌日、培地交換を行い、トリプシン処理により播き直して実験に用いた。
野生型マウス、MEX3B欠損マウスそれぞれについて、継代初期(passage3)の細胞と、継代後期(passage13〜15)の細胞とを溶解バッファーTRIsure(BIOLINE社製)を用いて全RNAを回収した。Primescript(TAKARA社製)により逆転写反応を行いcDNAを得た。
その後、Light Cycler480(ROCHE社製)を用いて定量的RT−PCRを行った。定量統計解析は3回を上回る独立した実験にて行った。
MEX3BプライマーFw1:5’−CGTCGTCCTCTGTGGTCTTTCCCGGGGGTG−3’(配列番号7)
MEX3BプライマーRv1:5’−TCAGGAAAAAATGCGGATGGCCTGAGTGAC−3’(配列番号8)
マウスGAPDHプライマーFw1:5’−AGAGACAGCCGCATCTTCTT−3’(配列番号9)
マウスGAPDHプライマーRv1:5’−GACAAGCTTCCCATTCTCGG−3’(配列番号10)
マウスIL−6プライマーRv1:5’−CCAGGTAGCTATGGTACTCCAGAA−3’(配列番号12)
マウスCXCL5プライマーFw1:5’−CAGAAGGAGGTCTGTCTGGA−3’(配列番号13)
マウスCXCL5プライマーRv1:5’−TGCATTCCGCTTAGCTTTCT−3’(配列番号14)
図1から明らかなように、野生型マウス、MEX3B欠損マウスの胎児繊維芽細胞の継代初期(passage3)と後期(passage13〜15)の細胞を解析した結果、継代初期と後期の細胞ともにMEX3B欠損マウス由来細胞では、Mex3Bの発現は見られなかった。
図3は、野生型BALB/cマウス及びMEX3B欠損BALB/cマウスの胎児繊維芽細胞におけるCXCL5 mRNAの発現レベルの定量的RT−PCRによる検証結果を示す図である。
図2及び3から明らかなように、野生型マウス、MEX3B欠損マウスの胎児繊維芽細胞の継代初期と後期の細胞を解析した結果、MEX3B欠損マウス由来細胞において、IL−6及びCXCL5の発現は継代後期細胞では著しく低下していた。
8週齢の野生型BALB/cマウス及びMEX3B欠損BALB/cマウスの雌を、それぞれ、完全フロイントアジュバント(CFA:Sigma−Aldrich社)50μl及びPBS50μl中に乳化した卵白アルブミン(OVA:Sigma−Aldrich社)20μgで0日目に皮下感作した。
21日目及び22日目に、全てのマウス(6マウス以上/群)をPBS中0.1%OVAからなるエアロゾルを吸入させた。また、対照として、PBSからなるエアロゾルを吸入させた。23日目に気管支肺胞洗浄液内の各種免疫細胞数を測定した。
図4中、PBS+/+は対照としてPBSを吸入させた野生型BALB/cマウスにおける細胞数を示し、PBS−/−は対照としてPBSを吸入させたMEX3B欠損BALB/cマウスにおける細胞数を示し、OVA+/+はOVAを吸入させた野生型BALB/cマウスにおける細胞数を示し、OVA−/−はOVAを吸入させたMEX3B欠損BALB/cマウスにおける細胞数を示す。
図4に示した結果から明らかなように、OVAを吸入させた野生型BALB/cマウス及びMEX3B欠損BALB/cマウスはいずれも総細胞数及びマクロファージ数が対照に対して増加しており、OVAに対して感作されている。また、OVAを吸入させた野生型BALB/cマウスでは好中球数及びリンパ球数が増加していて重症喘息が誘発されていることが示唆される。
これに対し、OVAを吸入させたMEX3B欠損BALB/cマウスでは好中球数及びリンパ球数が有意に低下しており、重症喘息の症状を緩和することが示唆される。
以上示した結果から、MEX3Bタンパク質の機能を阻害する物質(低分子化合物、たんぱく質、核酸など)を模索することが、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする手法として有用であることが分かる。
(重症喘息誘発モデルにおけるギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチド投与試験)
8週齢の野生型BALB/cマウスの雌をCFA(Sigma−Aldrich社製)50μl及びPBS50μl中に乳化したOVA(Sigma−Aldrich社製)20μgで0日目に皮下感作した。
16日目から5日間連続してギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチドを吸入投与(10μM溶液5mlをネブライザーでエアロゾル化させて容器内に満たして、20分間マウスに暴露)した。
ギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、コントロールGapmer又はマウスMEX3B特異的Gapmerを吸入投与した。以下、それぞれ、「OVA吸入−Gapmer(コントロール)吸入群」、「OVA吸入−MEX3B特異的Gapmer吸入群」ともいう。
マウスMEX3B特異的Gapmerとして、マウスMex3B遺伝子を表す配列番号4中の3’UTRに含まれる3135〜3149番目の塩基配列に相補的なギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチド(5’−ACATAAACGAGTGGT−3’:配列番号16;全長15塩基)を用いた。
なお、各ギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端には2塩基のLNA(2’,4’−BNA)を配置し、それ以外の間を埋める塩基は通常のDNAとし、各ヌクレオチドを結ぶリン酸ジエステル結合はホスホロチオエート化した。
24日目にサンプル回収を行い、気管支肺胞洗浄液内の各種免疫細胞数を測定した。
結果を図5に示す。
図5に示した結果から明らかなように、重症喘息モデルにおいて、OVAを吸入させたマウス群はいずれも総細胞数及びマクロファージ数がコントロール群に対して増加しており、OVAに対して感作されている。
また、Gapmer(コントロール)をあらかじめ吸入させたマウス群では好中球数が増加していて重症喘息が誘発されていることが示唆される。
これに対し、MEX3B特異的Gapmerを吸入させたマウス群では好中球数が有意に低下しており、重症喘息の症状を緩和することが示唆される。
したがって、MEX3B特異的Gapmerは、IL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤として機能することが示唆される。
各群のマウスから肺組織を摘出し、上記肺組織をTRIsure(Bioline社製)溶液中でポリトロンホモジナイザーにより粉砕し、製品プロトコールに従ってtotalRNAを採取し、下記表1に示すPCRプライマーを用いて増幅反応を行い、各サイトカイン(IL−6、IL−13、TNF及びG−CSF)及び各ケモカイン(CXCL1、CXCL2、及びCXCL5)のmRNAの発現レベルを測定した。
結果を図6に示す。
また、Gapmer(コントロール)投与群と比較すると、MEX3B特異的Gapmer投与群ではIL−6、IL−13、TNF、G−CSF、CXCL5、CXCL1及びCXCL2の発現レベルは有意に減少傾向にあり、MEX3Bの発現を阻害することによりこれらの炎症性因子を抑制することが示された。
採取したマウス肺組織は10%ホルマリン溶液にて固定後にパラフィンに包埋した(Tissue−Tek)。ミクロトーム(LEICA社製)にて薄切を行い、切片はAPS(アミノシラン)コート付きスライドガラス(Matsunami社製)に貼り付け、標準のプロトコルに従ってH&E染色(ヘマトキシリン・エオシン染色)を行った(参考文献:Cell Rep.2016 Aug 30;16(9):2456−71.)。
病理組織画像はオリンパス顕微鏡システムで撮影した。結果を図7に示す。
図7に示した結果から明らかなように、コントロール吸入群(PBSエアロゾル吸入)では見かけ上は何も処理を施していないマウスと同様に炎症反応は起きておらず、免疫細胞の顕著な浸潤は見られない。OVA吸入−PBS投与群及びOVA吸入−コントロールGapmer投与群では気道上皮細胞の肥厚及び免疫細胞の著しい浸潤が観察されており、炎症が引き起こされていることが明らかである。
一方、Mex3b抑制効果を示すGapmer投与群であるOVA吸入−MEX3B特異的Gapmer投与群ではコントロール吸入群とほぼ同等であり炎症は起きていない。
この結果はMEX3B特異的Gapmer投与によりステロイド耐性喘息の発症が劇的に抑制されたことを示唆している。
したがって、MEX3B特異的Gapmerは、IL−6、IL−13、、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤として機能することが示唆される。
Claims (10)
- MEX3B遺伝子又はMEX3Bタンパク質の発現の変化、及びMEX3Bタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも1つを指標として、インターロイキン6、インターロイキン13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法。
- 前記指標が、MEX3B遺伝子を発現する細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、前記被験物質の有無に応じたMEX3B遺伝子又はMEX3Bタンパク質の発現の変化、及びMEX3Bタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも1つである、請求項1に記載の方法。
- 前記インターロイキン6、インターロイキン13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病がインターロイキン6、インターロイキン13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する重症喘息である、請求項1又は2に記載の方法。
- MEX3B遺伝子若しくはMEX3Bタンパク質の発現の低下物質、又はMEX3Bタンパク質の阻害物質を含む、インターロイキン6、インターロイキン13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する疾病の予防又は治療剤。
- 前記低下物質がMEX3B遺伝子中又は前記遺伝子の発現制御領域中に含まれる連続する少なくとも10ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の剤。
- 前記MEX3B遺伝子中に含まれるオリゴヌクレオチドが、MEX3B遺伝子のエクソン中のコーディング領域若しくは非翻訳領域に含まれるオリゴヌクレオチド、又はMEX3B遺伝子のイントロン中に含まれるオリゴヌクレオチドである、請求項5に記載の剤。
- 前記低下物質がMEX3B遺伝子の塩基配列から転写されるRNAの塩基配列中のコーディング領域又は非翻訳領域の連続する少なくとも20ヌクレオチドを含む二本鎖RNA又は前記二本鎖RNAをコードするDNAである、請求項4に記載の剤。
- リポフェクション用担体を更に含む、請求項5〜7のいずれか1項に記載の剤。
- 前記阻害物質がMEX3Bタンパク質に選択的に結合するアプタマー又は抗体である、請求項4に記載の剤。
- 前記疾病がインターロイキン6、インターロイキン13、TNF、G−CSF、CXCL1、CXCL2、又はCXCL5に起因する重症喘息である、請求項4〜8のいずれか1項に記載の剤。
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