CN117547603A - 一种芒果花粉变应原浸提物、浸液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芒果花粉变应原浸提物、浸液及其制备方法和应用，该芒果花粉变应原浸提物其中含有芒果花粉变应原蛋白如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；其浸液经芒果花粉收集、干燥、研磨、淘洗、脱脂、干燥、提取、过滤等工艺方法制得，该浸液具有特异性高、芒果花粉致敏蛋白组分提取充分且比例恒定、有效期长、无菌、无毒、效果好的特点，采用该芒果花粉变应原浸液进行诊断，可尽早为芒果花粉过敏患者明确过敏原，并指导其进行相应的精准预防及治疗，在改善患者生活质量的同时，减少其医疗耗费和负担。

Description

一种芒果花粉变应原浸提物、浸液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种芒果花粉变应原浸提物、浸液及其制备方法和应用。

背景技术

早在公元130～200年，希腊医学家Galen在他的著作中提到：有患者在接触花草后引发喷嚏发作，这可能是花粉过敏的最早描述。花粉症是指特异性体质的患者对空气中的花粉过敏，是由特异性免疫球蛋白E(specific Immunoglobulin E，sIgE)介导的非特异性炎症反应，引发一系列过敏性鼻炎、哮喘、过敏性结膜炎、荨麻疹等过敏性疾病。国内对花粉症的发现和研究已逾六十余年。目前花粉症发病已超7500万人，且人数仍不断上升。风媒花粉被认为是主要的花粉过敏原，但虫媒花粉也可引起花粉症。研究表明：我国特别是南方地区部分虫媒花粉过敏可占过敏人群的10％-50％不等。

芒果(学名：Mangifera indica L.)是漆树科、杧果属植物，被子植物门，双子叶植物纲，又称杧果，其圆锥花序长20-35厘米，多花密集，被灰黄色微柔毛。分布于中国南方、印度、孟加拉、中南半岛和马来西亚等地，为良好的庭园和行道树种，分布数量较多。芒果的花期为每年3-5月，花序数量大，授粉季节大气中可检测到花粉飘散。因此芒果花粉是春季花粉症的重要过敏原。芒(杧)果是热带、亚热带地区常见的虫媒植物，其花粉可引起流清涕、鼻塞、鼻痒等变应性鼻炎症状。据不完全统计，自上世纪以来，芒(杧)果花粉过敏的比例正不断增加。1997年，泰国地区发现变应性鼻炎人群中芒果花粉过敏阳性率为16.7％。2005年，孟光等发现海口地区55％的变应性疾病患者对芒果花粉过敏。2013年，谢伟伟等也发现52.6％的变应性鼻炎患者对芒果花粉过敏。同年，李江丽等也发现百色市变应性鼻炎及哮喘成人患者中芒果花粉皮肤点刺阳性率高达44.5％，认为芒果花粉与呼吸道变态反应性疾病有关。2020年，Sabit M等在菲律宾发现64％的花粉症患者对芒果花粉过敏。以上流行病学调查结果显示，芒果花粉过敏广泛分布于亚洲地区，是亚洲地区的重要过敏原。目前，花粉症过敏原的诊断方式分为体内试验和体外试验两种，包括点刺试验、激发试验、血清特异性IgE检测等。但由于目前国内缺乏标准化的诊断试剂(我武公司已停产)，无法进行芒果花粉过敏的诊断，芒果花粉过敏的人群未能尽早明确芒果花粉过敏原，因而未能进行相应的精准预防及治疗。芒果花粉过敏发作在影响患者生活质量的同时，还增加了过敏群体的医疗耗费和负担。

据不完全统计，国内外均曾有进行芒果花粉诊断试剂的研发，但效果不一。早于1997年即有文献报道(PMID:9579610)，Greer公司提供了芒果花粉的点刺试剂，并获得16％的芒果花粉阳性率。2005年，孟光等(孟光,李春林,蔡琼香,谢春梅.海口地区热带植物花粉致敏性调查[J].临床耳鼻咽喉科杂志,2005(22):40-41.)采集花粉粗加工后，交由北京协和医院诊断试剂厂按照临床使用变应原标准制成花粉变应原，获得55％的芒果花粉阳性率。然而上述技术均未能获取具体点刺液制备方法，亦未明确芒果花粉点刺液相关的蛋白浓度及致敏蛋白分布，未能进一步开展临床脱敏治疗，限制了深入的科学研究。2010年，印度学者(PMID:20919456)为获取不同品种的芒果花粉进行低温保存从而长期育种，提出一种改进的芒果花粉获取办法，利用镊子夹取芒果花粉的花药，并通过种子试管培养、荧光反应以及田间授粉结果等实验验证花粉活性良好。但该芒果花粉采集方式效率低，且未进一步生成芒果花粉过敏相关诊断、治疗等试剂。2013年，国内曾产出芒果花粉诊断试剂。李江丽等人(李江丽,刘积平,覃继新,文玉敏,黄丽伟.过敏性鼻炎及哮喘患者吸入性过敏原调查[J].环境与健康杂志,2013,30(08):707-708.)报道我武生物科技有限公司可提供芒果花粉吸入性过敏原“畅点”标准化皮肤点刺试剂。同年，谢伟伟等人(谢伟伟,孟光,刘硕,蔡琼香,龙绮,林秀联.海口市花粉变应原与变应性鼻炎关系的研究[J].中国病原生物学杂志,2013,8(05):436-438+441.)也报道北京协医诊断试剂厂可提供芒果花粉变应原点刺液。但均未从文献中获知相关蛋白浓度及致敏蛋白分布等信息，也未能进一步为芒果花粉过敏患者提供新的治疗策略。

2020年，菲律宾学者(PMID:32922458)报道了其芒果花粉点刺液的生产过程。首先，获取芒果花，干燥后逐级通过网筛(150,75,50和25μm)，并通过镜检确认是芒果花粉，随后加入干燥剂并保存于4℃冰箱。以1：20的质量体积比加入乙醚，过夜搅拌提取。该悬浊液以4000rpm的转速离心10min，沉淀物干燥过夜。随后加入等体积PBS，搅拌过夜，以13,000rpm,4℃的条件下离心30min。上清液转移至6–8kD的透析管中，随后通过0.2μm的滤菌器，分装后-20℃保存。利用Bio-Rad ProteinAssay Kit II进行总蛋白浓度测定。使用该芒果花粉提取液时，用PBS稀释为10μg/ml的工作浓度进行皮肤点刺及血清特异性ELISA。关于该菲律宾学者所用方法有以下几个不足：第一，芒果花粉的直径范围在(20.5-26.6)24.8μm×20.2(18.5-22.7)μm(《种子植物花粉电镜图志》)，干燥后的芒果花经过25μm的网筛时，会损失一大部分芒果花粉，存在一定损耗率。第二，PBS溶液并未有明确报道可直接用于临床，且未对该提取液所含成分进行检测，特别是提取后总蛋白浓度未见说明。第三，发明人使用1：10的重量体积比，以PBS进行提取作为对比，结果显示该蛋白提取方案所得总蛋白浓度低于本专利方案。

上述为目前所能检索到的芒果花粉变应原点刺液相关的技术方案。其他花粉均为风媒花粉，其变应原点刺液如圆柏花粉变应原浸液(ZL201910061091.2)的技术方案，互相类似但均相对复杂、步骤繁琐，且均不针对虫媒花粉，存在一定的适用范围。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明目的之一在于提供一种芒果花粉变应原浸提物。

本发明目的之二在于提供一种含有上述芒果花粉变应原浸提物的浸液，该浸液具有特异性高、芒果花粉致敏蛋白组分提取充分且比例恒定、有效期长、无菌、无毒、效果好的特点，其可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断芒果花粉诱发的变态反应性疾病并对其进行特异性免疫治疗。

本发明目的之三在于提供一种上述芒果花粉变应原浸液的制备方法，相比于现有技术方案，本发明的技术方案具有可行、步骤相对简单、流程完整等优点。

本发明目的之四在于提供一种上述芒果花粉变应原浸提物、芒果花粉变应原浸液、芒果花粉冻干粉的应用，将其用于制备治疗芒果花粉过敏性疾病的药物，如皮肤点刺液、变应原斑贴、变应原浸液稀释液、注射液等，用于诊断变应性鼻炎、过敏性哮喘、特应性皮炎和慢性荨麻疹等变态反应疾病。

本发明目的之一采用如下技术方案实现：

一种芒果花粉变应原浸提物，其含有芒果花粉变应原蛋白，其相应蛋白含有如SEQID NO.4、SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

本发明目的之二采用如下技术方案实现：

一种芒果花粉变应原浸液，所述变应原浸液中含有如上述所述的芒果花粉变应原浸提物、苯酚和氯化钠，所述苯酚的体积含量＜4mg/ml，所述氯化钠的体积百分比浓度＜0.4％，所述变应原浸液的pH值为6.0～8.0，所述变应原浸液的总蛋白浓度为0.14～0.33mg/ml。

进一步地，通过SDS-PAGE和Western blotting检测，所述芒果花粉变应原蛋白主要分布在20～150kD，其中35～55kD、100～130kD为变应原主要致敏蛋白成分。

进一步地，通过全蛋白质谱检测，所述芒果花粉变应原浸液主要包含且不限于如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.100的特征性肽段。

本发明目的之三采用如下技术方案实现：

一种芒果花粉变应原浸液的制备方法，包括如下步骤：

S1、采集芒果花，烘箱干燥；

S2、对干燥后的芒果花进行粉碎、淘洗、脱脂、干燥，获得芒果花粉冻干粉，于-80℃下，放置保存；

S3、将脱脂干燥后的芒果花粉冻干粉按重量g体积ml比1：10至1：30加入提取液，常温搅拌6～8小时进行浸提，提取过程中每日搅拌不低于2小时，提取时间如2h、4h、6h、10h等，浸提液于2～8℃下保存；其中，提取液为pH8.0的缓冲盐水提取液、PBS提取液、苯酚提取液中的一种；

S4、将步骤S3的浸提液，离心取上清液，上清液过滤后，调节滤液pH值至6.00～8.00，并进行除菌过滤，滤液于2～8℃下放置保存；

S5、将步骤S4的滤液经过二次除菌过滤后，获得芒果花粉变应原浸液。

进一步地，在S2中，所述芒果花粉碎采用干粉机进行粉碎；所述花序淘洗采用无水乙醇及分样筛进行淘洗；所述花粉脱脂采用花粉悬浊液与丙酮或甲醇以1：5-1：1的体积比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清。

进一步地，在S4中，离心的条件为5000rpm、离心温度为4℃、时间为20～30min；过滤采用中速的双圈定性滤纸过滤；除菌过滤采用0.45μm和0.22μm的滤膜依次过滤。

进一步地，在S5中，除菌过滤采用0.45μm和0.22μm的滤膜依次过滤。

进一步地，在S3中，所述缓冲盐水提取液包括5g/L的氯化钠、0.036％的磷酸二氢钾、0.7％的磷酸氢二钠和0.4％的苯酚。

进一步地，在S5后，还包括分装步骤，将获得芒果花粉变应原浸液进行分装，并对所得芒果花粉变应原浸液进行无菌检查以及急性毒性试验。

进一步地，所述步骤S1还包括对原料芒果花粉进行镜检鉴别和/或DNA鉴定的步骤，其中DNA鉴定的方法为：以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2为引物，对鉴别芒果花粉原料进行PCR扩增，并检测扩增产物。

本发明还提供一种芒果花粉冻干粉，其由包括芒果花粉收集-干燥-粉碎-淘洗-脱脂-干燥的步骤制得，具体的步骤如下：

S1收集：花序采集由专业人员进行；

S2干燥：烘箱40～60℃干燥，直至花序不再粘附；

S3粉碎、淘洗：干粉机粉碎时间设置为1～2秒，花粉粉碎后使用无水乙醇淘洗，同时依次选择性过40目～200目的分样筛，收集过筛后的花粉悬浊液；

S4脱脂：将步骤S3得到的花粉悬浊液，与丙酮或甲醇以1：5～1：1的体积比进行脱脂处理，搅拌脱脂10～30分钟，静置分层，弃去上层液，加入新的丙酮或甲醇，重复脱脂至上层液澄清，弃去上层液后，室温下干燥48小时以上，获得芒果花粉冻干粉。

本发明目的之四采用如下技术方案实现：

一种应用，其特征在于，将如上述芒果花粉变应原浸提物、芒果花粉变应原浸液、芒果花粉冻干粉用于制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗制剂、用于制备治疗芒果花粉过敏性疾病的药物中的应用。

进一步地，所述芒果花粉变应原浸液用于制备皮肤点刺液、变应原斑贴、变应原浸液稀释液及注射液；所述诊断变态反应疾病包括变应性鼻炎、过敏性哮喘、特应性皮炎和慢性荨麻疹；所述用于治疗芒果花粉过敏性疾病的药物的剂型选自(皮下)注射剂、气雾剂、鼻腔剂或皮肤点刺剂的液体剂型。

具体而言，采用本发明提供的芒果花粉变应原浸液或冻干品按治疗有效量或诊断有效量的芒果花粉变应原、以及药学上可接受的载体可制备用于治疗芒果花粉过敏性疾病的药物。

用于治疗芒果花粉过敏性疾病的药物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者年龄、体重和大致疾病状况等因素确定对病人有益的剂量进行施用。用于治疗芒果花粉过敏性疾病的药物的剂型选自(皮下)注射剂、气雾剂、鼻腔剂或皮肤点刺剂等液体剂型。其中，(皮下)注射剂一般是作为特异性免疫治疗时常用的剂型，而皮肤点刺剂是作为体内变应原检测时常用的剂型。

当采用本发明芒果花粉变应原浸液应用于诊断由芒果花粉引起的过敏性疾病时(即变应原皮肤点刺诊断试验)，除了本发明芒果花粉变应原浸液外，一般还应包括阴性对照液、阳性对照液、以及点刺针。阴性对照液一般为对人体无过敏性反应的液体(例如生理盐水溶液等)，阳性对照液一般为磷酸组胺/盐酸组胺溶液。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的芒果花粉标准化变应原浸液可以有效诊断由芒果花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

2、本发明提供的技术方案较现有技术方案可行，步骤相对简单，流程完整。所得芒果花粉变应原浸液总蛋白浓度为0.14-0.33mg/ml，具有特异性高、芒果花粉致敏蛋白组分提取充分且比例恒定、有效期长、无菌、无毒、效果好的特点。

3、采用发明提供的芒果花粉变应原浸液进行皮肤点刺试验，符合变态反应专科医生临床综合特异性诊断，与鼻腔激发试验结果符合，安全性好。

4、采用本发明提供的芒果花粉变应原浸液进行诊断，可尽早为芒果花粉过敏患者明确过敏原，并指导其进行相应的精准预防及治疗，在改善患者生活质量的同时，减少其医疗耗费和负担。

附图说明

图1为芒果花粉原料镜检结果；

图2为芒果花粉及芒果花粉冻干粉的DNA特异性序列的电泳结果；

图3为芒果花粉变应原浸液SDS-PAGE蛋白电泳结果；

图4为芒果花粉变应原浸液与芒果花粉过敏患者血清Western blotting反应检测结果；

图5为芒果花粉变应原浸液成品pH值在长期稳定性试验中的测试结果；

图6为芒果花粉变应原浸液成品苯酚浓度在长期稳定性试验中的测试结果；

图7为芒果花粉变应原浸液成品总蛋白浓度在长期稳定性试验中的测试结果；

图8为芒果花粉变应原浸液成品急性毒性试验结果。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：芒果花粉原料的鉴别

由于原料的鉴别和纯度对于后续变应原诊断及治疗制剂极为重要，本实施例采用显微镜检及DNA特异性序列检测对芒果花粉原料进行鉴别及质控。

1、芒果花粉的显微镜检

花粉近球形到长球形，极面观为3裂圆形，大小平均为20×27μm，3孔沟，花粉外壁为条纹状纹饰。镜检结果如图1所示。

2、芒果花粉DNA特异性序列检测

(1)芒果花粉DNA提取

采用诺唯赞植物DNA提取试剂盒(诺唯赞DC104)。

提取方法：称取100μg芒果花粉样品、冻干粉置于1.5ml离心管中，加入BufferA1400μl后，用一次性研磨杵，将样品彻底研碎后加入BufferA2130μl，冰上5min，离心机14000r/min离心5min后，取上清液于新的离心管，并加入1.5倍上清体积的Buffer A3，立即吹打混匀。随后转移至吸附柱中，离心机12000r/min离心30sec，加入Buffer AW 600μl，离心机12000r/min离心30sec、150sec各一次。加入50μl预热Elution Buffer，室温放置2min，离心机12000r/min离心1min，所得DNA提取液作为DNA模板备用，并以该ElutionBuffer为空白试剂测定所得DNA提取液的DNA浓度。

(2)引物设计及合成

引物序列如下：

rbcL-a F(SEQ ID NO.1):5'-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3'

rbcL-a R(SEQ ID NO.2):5'-CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC-3'

引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。合成后分装-20℃保存。

(3)PCR反应体系

对提取的DNA采用如下体系，PCR反应体系见表1。

表1.芒果花粉rbcL-a序列PCR反应体系

(4)PCR反应条件见表2。

表2.芒果花粉rbcL-a序列PCR反应条件

对PCR扩增后的反应液进行1％琼脂糖电泳(加Gel red核酸染料)，150V、30min电泳观察，电泳结果如图2所示。

(5)测序

将PCR扩增后的反应液进行测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示。

CATGTACGGCGTTAAGACTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATATAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCGGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACAACATTGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATATGTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAGGATCTACGAATCCCTACCGCGTATATAAAAACTTTCCAAGGACCACCGCATGGGATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCGAAATTAGGTTTATCCGCTAAGAACTACGGTAGAGCTGGTTATGAATGTCTACGTGGTGGACTTGACTTTACCAAAGACGATGAGAACGTGAACTCCCAACCATTTATGCGTTGGAGAGACCGTTTCCTATTTTGTGCGGAAGCTCTTTTTAAAGCGCAGGCTGAAACAGGTGAAATTAAAGGTCATGACTTGAGGTTACTGGGGGGCC

实施例2：芒果花粉变应原浸液成品制备工艺

1、收集：芒果花采集由专业人员进行。

2、干燥：烘箱40-60℃干燥，直至不再芒果花粘附。

3、粉碎、淘洗：干粉机粉碎时间设置为1-2秒，花粉粉碎后使用无水乙醇淘洗，本实施例中依次过40目、80目、120目、160目、180目、200目分样筛，收集过筛后的花粉悬浊液。

4、脱脂：将得到的花粉悬浊液，与丙酮以1：5-1：1的体积比进行脱脂处理，本实施例中体积比为1：1，搅拌脱脂10-30分钟，静置分层，弃去上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液澄清，弃去上层液后室温下干燥48小时以上，获得芒果花粉冻干粉。

5、提取：将芒果花粉冻干粉按重量体积比1：10至1：30加入pH8.0的缓冲盐水提取液，常温下搅拌6-8小时进行浸提，取提取后的浸提液，在离心力5000rpm、离心温度4℃、离心时间20～30min下进行离心，收取上清液。其中以配制1000ml缓冲盐水提取液(pH 8.0)为例的配方如表3。

表3缓冲盐水提取液(pH 8.0)配方

6、过滤分装：将得到的上清液，用中速的双圈定性滤纸过滤，再将滤液通过0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。在A级洁净条件下，滤液进行0.20μm滤膜的二次除菌过滤，经无菌分装为成品，得到pH6.0～8.0浅黄色至棕色液体即为芒果花粉变应原浸液成品。

实施例3芒果花粉变应原浸液成品质量控制

1、实施例2制备的芒果花粉标准化变应原浸液总蛋白成分SDS-PAGE法鉴别

采用还原型SDS-PAGE法，分离胶浓度为8～15％，银染染色。结果如图3所示。M为Fermentas 26616 Marker，C为Greer G257A01 Mango Blossom allergenic extracts，S为芒果花粉变应原浸液，其蛋白分布主要在20-150kD。

2、芒果花粉变应原浸液总变应原成分Western Blotting法鉴别

采用还原型SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为8～15％，0.2μm PVDF Immobilon R-PSQ转印膜。5％BSA-TBST室温封闭1h。一抗血清反应稀释度1：5，置于4℃冰箱杂交过夜，1×PBST洗3次，10min/次。二抗Ms mAb to Hu IgE(ab99806)1：1000室温杂交1h，1×PBST洗3次，10min/次。将ECL显影液A液和B液1:1混匀后曝光显色。

结果见图4所示。其中，M为Fermentas 26616 Marker，N为浸液与健康受试者血清反应条带，P分别浸液样本与10例临床确诊的芒果花粉过敏阳性患者(皮试≥++，典型的夏季花粉症病史)混合血清反应条带结果图，可见其中35-55kD、100-130kD为变应原主要致敏蛋白条带。

3、质谱检测

对芒果花粉变应原浸液经SDS-PAGE初步分离后所得的胶条取样进行质谱鉴定，其主要包含且不限于以下肽段：

表4芒果花粉变应原浸液质谱鉴定肽段及蛋白结果

4、理化性质检测

该芒果花粉变应原浸液成品经理化性质检验后，其质量标准如表5：

表5芒果花粉变应原浸液理化性质质量标准

5、无菌检查

该芒果花粉变应原浸液成品经培养后，其培养结果如表6：

表6芒果花粉变应原浸液培养结果

实施例4：芒果花粉变应原浸液成品稳定性试验

对实施例2制备的芒果花粉变应原浸液成品在2-8℃下进行长期稳定性研究试验，分别对三个批次样品在0至12月内，不定期进行pH值变化、苯酚含量变化、总蛋白浓度的变化的监测，结果如图5至图7所示。

从上述稳定性结果中，可以发现在12个月长期试验中，芒果花粉变应原浸液各质控参数虽有不规则波动，可能是实验误差导致，但均在质量标准质控范围内，这说明按照本发明所述的芒果花粉变应原浸液成品，在2-8℃条件下，至少12月内能稳定地保存。因此，芒果花粉变应原浸液成品的效期合理预计在24个月。

实施例5：芒果花粉变应原浸液成品急性毒性试验

对实施例2制备的芒果花粉变应原浸液成品在三级无特殊病原体(SPF)动物实验室进行急性毒性试验。用抗原溶媒按1：20的比例稀释芒果花粉变应原浸液。所用实验动物为SPF级NIH系小鼠(体重18～22克)共24只，雌雄各半，均分两组。实验组每只小鼠注射等量稀释液，对照组每只注射等量的抗原溶媒，注射部分相同。观察7天，每天记录小鼠的体重、精神、行动、大便等情况。观察满第7天后，没有小鼠死亡，小鼠精神、行动、大便等未见明显异常，毒性实验成功。小鼠体重变化结果如图8所示。

实施例6：评价应用

对实施例2制备的芒果花粉变应原浸液成品用于芒果花粉过敏进行临床诊断的有效性和安全性。方法：选择2022年7月1日至2023年5月，于中山大学附属第三医院变态反应科就诊的、有过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎、特应性皮炎、荨麻疹等过敏性疾病的门诊患者312例。对受试者进行芒果花粉皮肤点刺试验(Skinprick test，SPT)，采用原液进行，15min后测定平均风团直径(mean wheal diameter,MWD)为判读标准。同时记录不良事件，评估安全性。结果，受试者中皮肤点刺试验结果阳性患者，合并存在芒果花粉过敏病史，符合变态反应专科医生临床综合特异性诊断。年龄最小9岁，年龄最大65岁。其中，5例患者自报芒果花粉鼻腔激发试验结果阳性，与SPT结果相符。312例患者中有2例出现3次不良事件，不良事件发生率0.64％(2/312)，主要表现为流涕、喷嚏、点刺局部皮肤反应等。无严重不良事件。结论：本发明提供的芒果花粉变应原浸液用于诊断芒果花粉过敏有效，安全性好，可作为芒果花粉过敏原特异性体内诊断的临床检查方法。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种芒果花粉变应原浸提物，其特征在于，其含有芒果花粉变应原蛋白，其相应蛋白含有如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

2.一种芒果花粉变应原浸液，其特征在于，所述变应原浸液中含有如权利要求1所述的芒果花粉变应原浸提物、苯酚和氯化钠，所述苯酚的体积含量＜4mg/ml，所述氯化钠的体积百分比浓度＜0.4％，所述变应原浸液的pH值为6.0～8.0，所述变应原浸液的总蛋白浓度为0.14～0.33mg/ml。

3.根据权利要求2所述的芒果花粉变应原浸液，其特征在于，通过SDS-PAGE和Westernblotting检测，所述芒果花粉变应原蛋白主要分布在20～150kD，其中35～55kD、100～130kD为变应原主要致敏蛋白成分。

4.根据权利要求3所述的芒果花粉变应原浸液，其特征在于，通过全蛋白质谱检测，所述芒果花粉变应原浸液主要包含且不限于如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.100的特征性肽段。

5.一种如权利要求2-4任一项所述的芒果花粉变应原浸液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、采集芒果花，烘箱干燥；

S2、对干燥后的芒果花进行粉碎、淘洗、脱脂、干燥，获得芒果花粉冻干粉，于-80℃下，放置保存；

S3、将脱脂干燥后的芒果花粉冻干粉按重量g体积ml比1：10至1：30加入提取液，常温搅拌6～8小时进行浸提，提取过程中每日搅拌不低于2小时，浸提液于2～8℃下保存；其中，提取液为pH 8.0的缓冲盐水提取液、PBS提取液、苯酚提取液中的一种；

S4、将步骤S3的浸提液，离心取上清液，上清液过滤后，调节滤液pH值至6.00～8.00，并进行除菌过滤，滤液于2～8℃下放置保存；

S5、将步骤S4的滤液经过二次除菌过滤后，获得芒果花粉变应原浸液。

6.根据权利要求5所述的芒果花粉变应原浸液的制备方法，其特征在于，在S2中，所述芒果花粉碎采用干粉机进行粉碎；所述花序淘洗采用无水乙醇及分样筛进行淘洗；所述花粉脱脂采用花粉悬浊液与丙酮或甲醇以1：5-1：1的体积比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清；

在S4中，离心的条件为5000rpm、离心温度为4℃、时间为20～30min；过滤采用中速的双圈定性滤纸过滤；除菌过滤采用0.45μm和0.22μm的滤膜依次过滤；

在S5中，除菌过滤采用0.45μm和0.22μm的滤膜依次过滤；

所述步骤S1还包括对原料芒果花粉进行镜检鉴别和/或DNA鉴定的步骤，其中DNA鉴定的方法为：以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2为引物，对鉴别芒果花粉原料进行PCR扩增，并检测扩增产物。

7.根据权利要求5所述的芒果花粉变应原浸液的制备方法，其特征在于，在S3中，所述缓冲盐水提取液包括5g/L的氯化钠、0.036％的磷酸二氢钾、0.7％的磷酸氢二钠和0.4％的苯酚。

8.根据权利要求5所述的芒果花粉变应原浸液的制备方法，其特征在于，所述芒果花粉冻干粉由包括芒果花粉收集-干燥-粉碎-淘洗-脱脂-干燥的步骤制得，具体的步骤如下：

S1收集：花序采集由专业人员进行；

S2干燥：烘箱40～60℃干燥，直至花序不再粘附；

S3粉碎、淘洗：干粉机粉碎时间设置为1～2秒，花粉粉碎后使用无水乙醇淘洗，同时依次选择性过40目～200目的分样筛，收集过筛后的花粉悬浊液；

S4脱脂：将步骤S3得到的花粉悬浊液，与丙酮或甲醇以1：5～1：1的体积比进行脱脂处理，搅拌脱脂10～30分钟，静置分层，弃去上层液，加入新的丙酮或甲醇，重复脱脂至上层液澄清，弃去上层液后，室温下干燥48小时以上，获得芒果花粉冻干粉。

9.一种应用，其特征在于，将如权利要求1的芒果花粉变应原浸提物、如权利要求2-4任一项所述芒果花粉变应原浸液、如权利要求8的芒果花粉冻干粉用于制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗制剂、用于制备治疗芒果花粉过敏性疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述芒果花粉变应原浸液用于制备皮肤点刺液、变应原斑贴、变应原浸液稀释液及注射液；所述诊断变态反应疾病包括变应性鼻炎、过敏性哮喘、特应性皮炎和慢性荨麻疹；所述用于治疗芒果花粉过敏性疾病的药物的剂型选自(皮下)注射剂、气雾剂、鼻腔剂或皮肤点刺剂的液体剂型。