JPS625124B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新しい抗脂肪動員物質の製造法、殊に
チヨウセンニンジンより糖尿病の治療に有効な薬
剤を製造する方法に関するものである。 チヨウセンニンジン（Panax Ginseng C.A.
May）はウコギ科（Araliaceae）の多年性草本
で、アジア東部地域に野生する。その根茎（以下
単に「ニンジン」と呼ぶ）は、古く後漢の時代か
ら医薬として利用され、新陳代謝を刺戟し、利
尿、鎮静、催眠、強壮等に効ありとして、今日で
も和漢薬の王者として珍重されている。従つてそ
の成分に関してもこれまでかなりの研究が行わ
れ、既知の特殊成分として配糖体（サポニン）パ
ナキロン（パナキシン）、パナツクス酸、パナチ
エンなどが分離されているが、パナキロンが人体
に保温作用を与える（及び造血作用を有する）と
される他には、特定の薬理作用関連物質は見出さ
れていない(注)（講談社刊「世界科学大事典」12巻
46頁〔1977〕参照。）。(注)ニンジンの成分に関する
学術報告としては、例えば、日本化学総覧４巻
126頁、同々457頁、同５巻260頁、薬学雑誌82巻
1634〜８頁、Chem.Pharm.Bull.11巻759〜762頁
等参照。なお前記パナキロンのアグリコンはパナ
キサトリオール（下式）と考えられている（柴田
等、Tetrahedron Letters、1965年、207頁）。 一方特許文献によればニンジンの水又はアルコ
ール抽出液をカチオン及びアニオン交換樹脂を組
み合わせて配糖体部及び塩基性部に分別する方法
（特公昭39−497号）、ニンジンのアルコール抽出
液を弱酸性イオン交換樹脂で処理して降圧成分濃
縮物を得る方法（特公昭43−12723号）、及びニン
ジンの微酸性又は微アルカリ性抽出液を硫安で塩
析してRNA合成及びタンパク質合成を促進する
物質を得る方法（特公昭43−17727号）などが報
ぜられているが、いづれも種々の成分の混合物で
あつて、特定の薬理作用又は薬理関連物質は単離
されていない。 しかるに、本発明者はニンジンが古来民間で糖
尿病に効ありとされているのに着目し、その本体
を追求した結果、本品の水溶性分画を以下述べる
新規な精製手段を用いて精製することにより、抗
糖尿病作用の本体と考えられるラツトの副〓丸脂
肪細胞で測定した活性単位が412.2（原料ニンジ
ンの約68.5倍）に達するインシユリン様ペプチド
を分離するのに成功した。 本発明はこの知見に基くものである。以下発明
の詳細を記述する。 本発明方法の要旨は、チヨウセンニンジンの根
茎を水で抽出後透析し、透析液を通常の精製手段
に加えて微結晶セルローズ（MCC）によるクロ
マトグラフイーを利用して精製することにより、
インシユリン作用（抗脂肪動員作用）を有する新
しいポリペプチドを収得する点に在る。 本発明者等が発見した新規ポリペプチドには
、の２種類があり、薄層クロマトグラフイー
及び280ｍμにおける吸光度の測定から夫々単一
の物質と推定される。そしてこれらは夫々数十個
のアミノ酸からなる酸性の直鎖状ポリペプチドで
あろうことが判明しているが、詳細に関してはな
お研究を続行中である。以下これらのポリペプチ
ドを単称するときは夫々GP、GPと略称す
る。 本発明は上述の如くMCCによるクロマトグラ
フイーを必須の操作として含むものであるが、原
料であるニンジン抽出液は糖、デンプン、粘液
質、サポニン、タンパクなど多くの夾雑物質を含
むため、実際的には水性抽出液をプロテイン、ペ
プチド、アミノ酸等に対し慣用される一般的精製
手段により予備精製する必要がある。これら予備
精製手段の中、前段階処理として特に適当である
のは透析であるが、この他塩析、イオン交換性吸
着剤による若しくは普通の吸着剤によるクロマト
グラフイー、等電点沈澱及び／又はゲル濾過等の
手段が用いられうる。しかしながら、これら既知
手段単独では目的の新規ポリペプチドを単離する
のは難しい。例えば公知のクロマト用吸着剤であ
るキーゼルやシリカゲルは本ポリペプチドに対す
る分離能力に欠ける。また硫安溶液により塩析で
は本ポリペプチドを沈澱させることができなかつ
た。従つて、これらの手段は目的物以外の夾雑物
を除去したり、又は目的物を夾雑物と共に濃縮し
たりする目的に利用される。さらにイオン交換ク
ロマトを行つた後は架橋デキストラン（商品名セ
フアデツクス）、透析などによる脱塩処理が不可
欠である。なお、ゲル濾過の如き分子濾過法は適
切な濾過限界を有する濾過剤が選択できれば有効
と思われるが、現在までのところ分子量が3000〜
4000（即ち本発明目的物の推定分子量範囲）のも
ののみを通すような濾過剤は開発されていない。
従つて、最終的な単離はどうしてもMCC（商品
名アビセル〔Avicel〕）に頼る必要がある。因に
MCCはこれまでシリカゲルと併用してアミノ酸
や糖類及び糖のリン酸エステルのTLCに応用さ
れた報告はあるが（D.Horton et al.、J.
chromatog.23、309（1966）：M.L.Wolfrom et
al.、ibid.17、488（1965）：J.J.Pratt et al.、
ibid.17、488（1965）等）、本発明の如く単独で
カラムクロマトグラフイーに応用した報告は見ら
れず、従つてこのものの本ポリペプチドに対する
卓抜した分離能力を発見したことが発明完成の重
要な鍵となつた。 本発明を実施するのに最も適当と思われるのは
以下の工程に従つて操作することである。

【表】 即ち、原料であるニンジンは予め抽出を容易に
するため細切又は粉砕される。この細切又は粉砕
物に適量の純水（蒸溜水又は脱イオン水）を加え
て撹拌抽出する。後の実施例に示す如く、本抽出
時の温度は４℃の低温でも充分であつて、加熱は
デンプンの糊化やペプチドの変質を起すので好ま
しくない。抽出が終れば濾過又は遠心を行つて溶
液部分を集める。次に濾液を透析して多糖類、蛋
白質などの高分子物質を除去する。若しこの透析
を行わなければ多糖類等が混入する結果、事後の
操作が困難となる。透析膜としてはセルローズ
膜、コロジオン膜、セロフアン等が用いられる
が、いづれにしても分子量5000〜10000以上の高
分子画分を通さないものであれば足りる。透析液
は必要に応じ減圧下に濃縮する。この透析液（又
はその濃縮液）を適当な水素イオン濃度（普通約
８）に保たれたDEAE−セルローズ、AEセルロ
ーズ、TEAEセルローズ又はECTEOLA−セル
ローズの如きイオン交換性吸着剤によるイオン交
換クロマトに附してから架橋デキストランの如き
ゲル濾過剤で脱塩する。実験的に適当であつたの
はセフアデツクスＧ１０で、同Ｇ２５以上のグレ
ードのものでは脱塩できなかつた。脱塩された液
は直接MCCカラムに流してもよいが、なるべく
は分子量が5000〜10000程度の物質を通すゲル濾
過層を通すのが好ましい。このゲル濾過液をPH
5.0附近の水素イオン濃度に調整してなお夾雑し
て来る高分子物質を沈澱させて除く。もちろん、
２段目のゲル濾過の代りに直接等電点沈澱を行つ
てもよい。或いはゲルの濾過の前に等電点沈澱を
行うこともできる。 最終のMCCカラムによるクロマトグラフイー
はGP及びGPを分離するため重量である。溶
出用溶媒としてはｎ−ブタノール：酢酸：水＝
３：１：１のものが好ましいが、温度によつては
４：１：１又は２：１：１の比率に変更した方が
より好ましい分離能力を示す場合もある。以上の
他フエノール／水、フエノール／水／アンモニ
ア、ｉ−アミルアルコール／ピリジン／水、ｉ−
プロパノール／ピリジン／水又はｎ−ブタノー
ル／ピリジン／酢酸／水系溶媒の利用も考慮され
てよい。カラムを通過して来る溶出液は次々とフ
ラクシヨンコレクターで一定量宛採取し、自記光
電比色計を用いて280nｍにおいて吸収を示すフ
ラクシヨンを集める。３ml宛フラクシヨンを分画
した一例では、GPはカラム番号190〜217、GP
はカラム番号237〜260の間に溶出のピークが見
られた。このようにして集めたフラクシヨンを濃
縮後、凍結乾燥すると粗製のポリペプチドが得ら
れるが、純化のためにはさらに夫々数回程度
MCCカラムを用いて再クロマトする必要があ
る。このようにして得られたGP及びGPは、
共にやや湿つた感じの無定形淡黄褐色（カラーア
トラスの色記号3A2程度）の物質であつて、夫々
数十個の単位アミノ酸からなる酸性ポリペプチド
であると推定されているが、詳細はなお研究中で
ある。 本発明により得られるGP及びGPは共にイ
ンシユリン様の脂肪動員抑制作用を有し、ラツト
副〓丸脂肪組織を用いて行つた細胞レベルの試験
管内実験では、アドレナリンに対する拮抗作用か
ら計算して夫々20及び140ミリインシユリン単位
（20ｍＵ及び140ｍＵ）示した。従つて、本品は類
インシユリン様物質として血糖降下作用を有する
ものと推定され、将来経口糖尿病治療剤としての
薬効が期待されるものである。 以下実施例を掲げ発明実施の態様を説明する。
但し本発明は前記の通りニンジンの水性抽出液を
MCCカラムを用いて精製することを骨子とする
ものであるから、本例は単に例示に過ぎず、何等
発明思想の限定を意味するものではない。例え
ば、細胞培養によりニンジン細胞から形成された
カルス体も当然栽培ニンジンの均等物である。 実施例 １ ニンジン粉末１Kgに蒸溜水9000mlを加え、４℃
で24時間撹拌しつつ抽出した抽出物（スラリー）
を8000r.p.mで20分間遠心し、上清を集めた。こ
の上清を分子量10000に対応する平均孔径を有す
る円筒形セルローズ膜中に入れ、蒸溜水を外液と
して１夜透析後、外液を減圧下に100ml容まで濃
縮した。 上の濃縮液を10ｍＭ重炭酸アンモニウム
（ABC）緩衝液（PH8.0）で飽和されたDEAEセル
ロースに吸着させ、次いで1M ABC緩衝液（PH
8.0）で抽出した。 上の抽出液を順次セフアデツクスＧ−１０及び
セフアデツクスＧ−５０をつめた２つのカラム
（各カラムの大きさは2.5×45cm及び2.5×76cm）
を通して脱塩及びゲル濾過を行い、最終通過液を
稀塩酸でPH5.0に補正し、４℃で一夜放置後遠心
して上清を集めた。 上の上清液をMCCカラム（3.7×90cm）に負荷
し、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３：１：１の混
液で溶出し、被溶出液を３ml毎にフラクシヨンコ
レクターで補集して280nｍにおける吸光を示す
２つの画分（フラクシヨンNo.190〜217及び237
〜260）を集めた。これら両画分を前者はｎ−ブ
タノール：酢酸：水＝４：１：１、後者は上の溶
出液と同一の組成液を用いて夫々３回宛MCCに
よる再クロマトに附し、夫々のピークフラクシヨ
ンをセフアデツクスＧ−１０カラム（2.0×39
cm）を用いて脱塩後、凍結乾燥に附し、GP及
びGPの精製物を得た。以上の工程における各
工程毎の収量及び生成物の比活性は以下のとおり
であつた。因みに活性（Ｕ）は後述活性測定法に
より測定された値である。

【表】 実施例 ２ ニンジン粉末100ｇを用いて前例と全く同様に
操作し、GP18.9mg（活性7292U）を得た。 参考例 （活性測定法） ロツドベル（Rodbell）の方法（J.Biol.Chem.
、239、375（1964））によりラツト〓丸脂肪細胞
を以下の如く調製する。 体重約150ｇの雄ラツト５匹から約４ｇの副〓
丸脂肪組織を採り、これを細切して10mlKRB(1)
中に懸濁し、１時間37℃でインキユベートナイロ
ンフイルターで濾過し、濾液を300r.p.m.で30秒
遠心して上清を集める。この上清に適量のＫＲＰ
(2)を加えて２回洗滌後KRP10ml中に懸濁する。 以上の如くして得た脂肪細胞懸濁液0.5mlに試
料0.1ml、トリプシンインヒビター（10mg／ml）
0.1ml、KRP（５％のアルブミン添加、PH7.4）
0.5ml及びアドレナリン（１μｇ／0.01ml）0.01ml
を加え、２時間37℃でインキユベート後、EM溶
液(3)を加え５分間振盪して反応を停止させる。 次に上液にｎ−ヘプタン３ml及び水２mlを加え
５分間振盪後２〜３分放置した。上層のヘプタン
層３mlを吸引採取し、これにTM溶液(4)１mlを加
え、0.008Nのアルコール性苛性ソーダ溶液で滴
定し、遊離脂肪酸量を求める。 脂肪酸量(F)＝0.008NNaOH消費量（ml）×50 〔μEq／ｇ〕 ｇ：脂肪細胞１ｇ当り Ｕ＝アドレナリンによる(F)−試料による(F)／アドレナ
リンによる(F)×10 (注) (1) KRB まずリン酸カリウム163mg、塩化カリウム350
mg、塩化ナトリウム0.9及び炭酸水素ナトリウ
ム2.1ｇを蒸留水に溶解させ、900mlとする。
〔１〕次に塩化カルシウム・二水塩368mgを蒸留
水に溶解させ、100mlとする。〔２〕この〔１〕
液と〔２〕液を併せてKRB緩衝液と呼ぶ。 さらにブドウ糖５mg、コラゲナーゼ10mgおよ
びアルブミン0.4ｇをKRB援衝液10mlに溶解し
て、PH7.4に調整したものを脂肪細胞の調製に
使用する。 (2) KRP 塩化ナトリウム6.3ｇ、塩化カリウム0.32ｇ
及び硫酸マグネシウム0.27ｇ蒸留水500mlに溶
解させ、またリン酸ナトリウム．12水塩13.43
ｇを蒸留水に溶解させ、両液を合わせてPHを
7.4に調整し、全量を882mlにする。 (3) EM溶液 イソプロパノール、ｎ−ヘプタン及びIN硫
酸を400：100：10の割合で混合したものを使用
する。 (4) TM溶液 チモールブルー30mgを蒸留水30mlに溶解し、
エタノールで300mlに稀釈する。

【図面の簡単な説明】

第１図はMCCカラムによるGPとGPの分離
状況を示す溶出曲線図、第２図は粗製のGPを
３回MCCカラムによるクロマトグラフイーを施
した後における溶出曲線図、第３図はGPを３
回MCCによるクロマトグラフイーを施した後に
おける溶出曲線図、第４図はGPのTLC結果を
示す図、第５図はGPの赤外吸収スペクトルで
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ チヨウセンニンジン（Panax Ginseng C.A.
   May）の根茎を水で抽出後透析し、透析液を通常
   の精製手段に加えて微結晶セルローズによるクロ
   マトグラフイーを用いて精製することを特徴とす
   る新規抗脂肪動員物質の製造法。