KR20180120476A - Vegfr3 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VEGFR3(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3) 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 신장 내 지방독성의 감소, 신장 내 섬유화 및 염증세포의 침윤 억제를 통한 산화스트레스 및 세포사멸 감소에 의하여 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

VEGFR3 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic microvascular complications comprising VEGFR3 inhibitors as active ingredient}
본 발명은 VEGFR3 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 전 세계적으로 흔히 나타나는 대표적인 만성 질병의 하나로 우리나라에서도 식습관의 변화 및 인구의 고령화 등으로 그 유병률이 지속적으로 증가하고 있다. 당뇨병은 탄수화물 대사에 관여하는 인슐린 작용의 이상에 의해 나타나는 만성 고혈당증과 지질대사 이상을 수반하는 질환으로, 크게는 췌장 β-세포의 파괴성 병변에 의해 인슐린이 결핍되어 생기는 제1형 당뇨병과 인슐린 분비 저하와 인슐린 저항성으로 인해 생기는 제2형 당뇨병으로 분류된다.
당뇨병은 기본적으로 탄수화물과 지방대사의 이상이 문제이나, 이로 인해 체내의 모든 영양소 대사가 영향을 받게 되므로 여러 합병증을 유발한다. 당뇨병 혈관합병증은 크게 미세혈관 합병증과 거대혈관 합병증으로 나눠볼 수 있는데, 망막 및 신장의 미세혈관 합병증은 각각 당뇨병성 망막병증 및 신증(diabetic nephropathy)을 야기하며, 신경혈관의 미세혈관 합병증은 신경병증(diabetic peripheral neuropathy)을 유발한다. 거대혈관합병증은 동맥경화증, 당뇨병성 심장병, 당뇨병성 뇌혈관병 등이 있다. 이러한 혈관합병증은 당뇨발병 연령층이 점차 낮아지면서 더욱 심각한 문제가 되고 있으나, 현재 이에 대한 완전한 치료가 존재하지 않는다. 특히, 고혈당과 고혈당에 의해 유발되는 지질대사 이상으로 인한 주요 장기 내 지방 성분이 증가에 의한 당지방독성은 신장을 포함한 각 장기의 정상적 기능을 손상시킬 수 있다.
당뇨병성 신증은 제1형 및 제2형 당뇨병 모두에서 심각한 미세혈관 합병증이며 전 세계적으로 중요한 공중보건 문제이며, 또한 우리나라 말기신부전의 가장 중요한 원인이다(Jin DC, Ha IS, Kim NH, et al. Brief report: renal replacement therapy in Korea. Kidney Res Clin Pract 2010;31:62-71). 당뇨병성 신증의 치료는 철저한 당조절과 지질이상 조절 및 안지오텐신 전환효소 억제제 또는 안지오텐신 II 수용체 차단제를 사용하여 혈압조절을 하는 이외에 아직 특별한 치료가 없는 상태이다. 최근 여러 보고에 의하면 신장 내 림프혈관과 림프관신생이 당뇨병성 신증을 포함한 이식신 기능부전, 일차성 섬유화 신질환, 단백뇨와 신장 내 염증반응에 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 림프관신생억제를 통한 당뇨병성 신증의 신장 보호효과에 대해 알려진 것이 없다.
SAR131675는 VEGF-R3-TK 억제제로 VEGF-R1/R2 억제 효과보다 50배와 10배 이상 선택성이 있어, 항림프관신생, 항종양성 및 항전이 효과 등이 알려져 있다(Alam A, et al. SAR131675, a potent and selective VEGF-R3-TK inhibitor with antilymphangiogenic, antitumoral, and antimetastatic activities. Mol Cancer Ther 2012;11:1637-1649). SAR131675는 강력하고 선택적인 VEGF-R3 억제제로 VEGF-R3 tyrosine kinase 활성화를 억제하여, VEGF-R3의 자가인산화를 억제함으로써 작용하며, VEGF-C와 VEGF-D의 리간드(ligand)로서 새로운 림프관신생에 관여한다. 그러므로, VEGF-C, VEGF-D 또는 VEGF-R3를 차단함으로써 신생림프관 형성을 억제할 수 있다고 보고되었다(Roberts N, et al. Inhibition of VEGFR-3 activation with the antagostic antibody more potentially suppressed lymph node and distatant metastases than inactivation of VEGFR-2. Cancer Res 2006;66:2650-2657, Norman C, et al. Bilogical basis of therapeutic lymphangiogenesis. Circulation 2011;123:1335-1351).
1. 한국공개특허 제10-2016-0083121호
본 발명의 목적은 VEGFR3(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3) 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VEGFR3(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3) 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 SAR131675, Axitinib, Telatinib, MGCD-265, Lenvatinib, Nintedanib 및 Pazopanib 으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 당뇨병성 미세혈관 합병증은 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy) 또는 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy)인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 신장 내 지방독성을 감소시키고, 신장 내 섬유화 및 염증세포의 침윤을 억제시키는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 SAR131675는 신장 내 지방독성의 감소, 신장 내 섬유화 및 염증세포의 침윤 억제를 통한 산화스트레스 및 세포사멸 감소에 의하여 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 db/db 마우스 또는 db/dm 마우스에 SAR131675의 처리/무처리 후 신장 내 피질 및 수질에서의 VEGF-C, VEGF 수용체인 VEGF-R1, VEGF-R2 및 VEGF-R3의 단백질 발현량을 웨스턴블럿으로 측정한 결과를 나타낸 것이다(*: db cont군과 다른 군과 p<0.05; **: db cont군과 다른 군과 p<0.01; 및 #: db cont군과 다른 군과 p<0.001).
도 2는 db/db 마우스 또는 db/dm 마우스에 SAR131675의 처리/무처리 후 신장 내 지방변화를 Oil-red 염색으로 확인한 결과이고(왼쪽 패널), 신장조직 내 총콜레스테롤(total cholesterol), 자유지방산(free fatty acid) 및 중성지방(triglyceride)의 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다(오른쪽 패널)(*: db cont군과 다른 군과 p<0.05; **: db cont군과 다른 군과 p<0.01; 및 #: db cont군과 다른 군과 p<0.001).
도 3a는 db/db 마우스 또는 db/dm 마우스에 SAR131675의 처리/무처리 후 사구체 내 경화, 섬유화 및 콜라겐 IV 발현을 이중 면역형광염을 수행한 결과를 나타낸 것이다(*: db cont군과 다른 군과 p<0.05; **: db cont군과 다른 군과 p<0.01; 및 #: db cont군과 다른 군과 p<0.001).
도 3b는 db/db 마우스 또는 db/dm 마우스에 SAR131675의 처리/무처리 후 TGF-β1 및 TUNEL-양성 세포의 이중 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다(*: db cont군과 다른 군과 p<0.05; **: db cont군과 다른 군과 p<0.01; 및 #: db cont군과 다른 군과 p<0.001).
도 3c는 db/db 마우스 또는 db/dm 마우스에 SAR131675의 처리/무처리 후 Bcl-2/Bax 비, MCP-1 및 F4/80의 이중 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다(*: db cont군과 다른 군과 p<0.05; **: db cont군과 다른 군과 p<0.01; 및 #: db cont군과 다른 군과 p<0.001).
도 4a는 db/db 마우스 또는 db/dm 마우스에 SAR131675의 처리/무처리 후 Trichrome-양성 부분, TGF-β1 및 콜라겐 IV의 이중 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다(*: db cont군과 다른 군과 p<0.05; **: db cont군과 다른 군과 p<0.01; 및 #: db cont군과 다른 군과 p<0.001).
도 4b는 db/db 마우스 또는 db/dm 마우스에 SAR131675의 처리/무처리 후 α-SMA, LYVE-1 및 podoplanin의 이중 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다(*: db cont군과 다른 군과 p<0.05; **: db cont군과 다른 군과 p<0.01; 및 #: db cont군과 다른 군과 p<0.001).
도 4c는 db/db 마우스 또는 db/dm 마우스에 SAR131675의 처리/무처리 후 신장의 피질 및 수질에서의 피브로넥틴 및 α-SMA의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다(*: db cont군과 다른 군과 p<0.05; **: db cont군과 다른 군과 p<0.01; 및 #: db cont군과 다른 군과 p<0.001).
도 4d는 db/db 마우스 또는 db/dm 마우스에 SAR131675의 처리/무처리 후 신장의 피질 및 수질에서의 LYVE-1 및 Podoplanin의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다(*: db cont군과 다른 군과 p<0.05; **: db cont군과 다른 군과 p<0.01; 및 #: db cont군과 다른 군과 p<0.001).
도 5는 db/db 마우스 또는 db/dm 마우스에 SAR131675의 처리/무처리 후 MCP-1 및 TNF-α의 농도를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 것이다(*: db cont군과 다른 군과 p<0.05; 및 #: db cont군과 다른 군과 p<0.001).
도 6은 db/db 마우스 또는 db/dm 마우스에 SAR131675의 처리/무처리 후 24시간 후 소변 내 8-OH-deoxyguanosine과 Isoprostane의 양을 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 것이다((*: db cont군과 다른 군과 p<0.05; 및 #: db cont군과 다른 군과 p<0.001).
도 7은 SAR131675가 당뇨병성 신증에 대한 작용기전을 도식화한 것이다.
본 발명의 용어, "SAR131675"는 VEFGR3-TK(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3-Tyrosine Kinase) 억제제로서, C18H22N4O4, 358.30의 분자량을 가지고 있고, 하기 화학식 1의 구조를 가진 물질이다.
[화학식 1]
Figure pat00001
본 발명에 따른 약학 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 SAR131675를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 포함할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험방법
1.1. 동물실험
당뇨병 동물모델인 db/db 마우스와 정상 대조군인 db/dm 마우스를 이용하였으며, 다음과 같이 4군으로 나누어 실험을 수행하였다: 비당뇨 대조군(db/dm 마우스, Non-diabetic control, n = 8), 비당뇨 SAR131675 치료군(db/dm 마우스 + SAR131675 30 mg/kg/day, n = 8), 당뇨 대조군(db/db 마우스, Diabetic control, n = 8), 당뇨 SAR131675 치료군(db/db 마우스 + SAR131675 30 mg/kg/day, n = 8).
대조군은 일반 사료를 섭취시켰으며, SAR131675 치료군에는 SAR131675 (30 mg/kg)이 포함된 사료를 생후 8주령 부터 12주 동안 섭취하도록 하였다. 실험기간 동안 체중은 매주 측정하였으며, 공복혈당은 꼬리정맥에서 혈액을 채취하고 매 2주마다 Accu-Chek meter (Roche Diagnostics, St. Louis, MO)을 이용하여 측정하였고, 당화혈색소(HbA1c)는 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하고 Pfizer 1200 automatic analyzer (Bayer healthcare LLC, IN)를 이용하여 4주마다 측정하였다. 사육실의 온도 및 습도는 각각 20~25℃ 및 50~60%로 유지 하였으며, 12시간 간격으로 점등 및 소등 하였다.
1.2. 혈청 생화학 지표측정 및 신장기능 평가
실험 종료에 대정맥 또는 좌심실에 혈액을 채취하고 원심분리 후 혈장은 -70 ℃에 보관하였다. 또한, 혈액 내 pH, pC02, hemoglobin, hematocit, HCO3, 총 CO2, Na, K, Cl, Ca, P 농도는 autoanalyzer (iSTAT Corporation, NJ)를 이용하여 측정하였다. 매 4주마다 대사케이지(Nalgene, Rochester, NY)에서 24시간 소변을 수집하여 -70℃ deep freezer에서 냉동보관 하였다. 수집된 소변에서 ELISA 방법으로 크레아틴(creatinine)과 알부민(albumin)을 측정하였다(Exocell, Philadelphia, PA).
1.3. 산화 스트레스 측정
혈청과 24시간 소변에서 산화적 스트레스를 확인하기 위해 8-OH-dG(8-hydroxy-deoxyguanosine; OXIS Health Products, Portland, OR, USA)와 8-epi-prosataglandin F2a (isoprostane; OXIS Health Products)를 ELISA법으로 측정하였다.
1.4. 조직학적 검사
신장 조직은 적출하여 무게를 측정한 후 일부는 면역염색을 위해 10% 포르말린에 고정 후 파라핀에 포매하였다. 조직절편은 4 μm 두께로 박절하였으며 신장 조직 내 사구체비대(glomerular hypertrophy)와 혈관사이간세포질 확산(mesangial expansion)은 PAS(Periodic-Schiff) 염색을 시행하여 평가하였다. 또한, streptavidinbiotin-peroxidase(Vector Laboratories)법을 이용하여 항콜라겐 IV 항체(Biodesign International, Saco, ME), 항F4/80 항체(Serotek, Oxford, UK), 항TGF-β1 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN), ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit(Chemicon International, Temecula, CA), 항F4/80 항체(Serotek, Oxford, UK), LYVE-1, podoplanin, α-SMA과 β-actin와 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)로 발색하여 발현을 확인하였다. 각각의 발현정도는 광학현미경으로 400배 시야에서 관찰한 후 사진을 촬영하였다(Olympus BX-50, Olympus Optical, Tokyo, Japan).
1.5. 웨스턴블럿 분석
단백질은 Pro-Prep Protein Extraction Solution(Intron Biotechnology, Gyeonggi-Do, Korea)을 사용하여 추출하였으며, SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시하였다. 이렇게 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Amersham Co., Buckinghamshire, England)에 이동시켜 3% skim milk를 함유한 TBS-T(0.1% Tween-20 in Tris buffer saline, pH 7.5)로 1시간 동안 블러킹시킨 후, 블럿은 VEGF-C, VEGF-R1, VEGF-R2, VEGF-R3, BCL-2(B cell leukaemia/lymphoma 2), BAX(BCL-2-associated X protein), fibronectin, α-SMA, LYVE-1, podoplanin 및 β-actin 에 대한 일차항체 용액에 넣어 반응시킨 후 세척하고, 각각의 1차 항체에 대항하는 이차항체를 반응시킨 뒤 ECL(Pierce, Rockford IL)을 통해 감광하여 밴드를 확인하였다. 각 단백질의 발현량은 β-actin에 맞추어 표준화하였다.
1.6. 조직 내 염증반응 측정
신장조직 내 염증반응을 측정하기 위해 신장조직을 분쇄한 후 조직 ml당 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 농도를 ELISA 법으로 측정하였다.
1.7. 통계처리
결과 값은 평균과 표준편차로 표시하였고, 각 군 간의 차이는 SPSS 19.0 프로그램을 이용하였다(SPSS, Chicago, IL, USA). 각 군 간의 평균값의 비교는 일원변량분석(one-way ANOVA) 및 Bonferroni 사후검정(post hoc multiple comparison)을 이용하여 분석하였고, P 값이 0.05 이하인 경우를 의미있는 것으로 정의하였다.
실시예 2. SAR131675 를 처리한 db/m 및 db/db 마우스의 신체적 및 생화학적 특성
SAR131675 처리와 무관하게 db/m 마우스 그룹에 비해 db/db 마우스 그룹에서 체중, 신장 무게, 공복혈당 및 당화혈색소(HbA1c)가 상당히 증가하였다(표 1). 혈청 크레아틴 및 혈중요소질소 농도는 모든 실험그룹에서 변화가 없었다. 또한, SAR131675 처리는 db/db 마우스에서 dm cont 및 dm+SAR 마우스에 비해 증가된 콜레스테롤, 자유지방산과 중성지방의 혈중 농도와 단백뇨(albuminuria)를 현저히 감소시켰다(표 1).
Figure pat00002
* db cont군과 다른 군과 p<0.05.
** db cont군과 다른 군과 p<0.01.
# db cont군과 다른 군과 p<0.001.
실시예 3. SAR131675 처리가 신장 내 수질 및 피질에서의 VEGF -C, VEGF -R1, -R2 및 -R3 발현에 미치는 영향
본 발명자들은 비당뇨 마우스와 당뇨모델 마우스에서 SAR131675를 처리한 후, 신장 내 수질 및 피질에서 VEGF에 대한 발현량의 변화를 확인하였다. 비당뇨 마우스인 db/m 마우스에서는 SAR131675 처리와 상관없이 신장 내 피질 및 수질에서 VEGF-C, VEGF-R1, -R2 및 -R3의 단백질 발현량에 어떠한 변화는 없음을 확인하였다(도 1). 또한, db/db 마우스에 SAR131675를 처리한 경우 VEGF-R1 및 VEGF-R2 발현량에는 비당뇨 대조군과 차이가 없었으나, VEGF-C 및 VEGF-R3의 발현량은 아무것도 처리하지 않은 db/db 마우스에 비하여 발현량이 현저하게 감소되었음을 확인하였다(도 1).
따라서, SAR131675 는 당뇨 마우스에서 VEGF-C 및 VEGF-R3의 발현량을 감소시킴을 확인하였다.
실시예 4. SAR131675 처리가 신장 지질 축적과 지방농도에 미치는 영향
본 발명자들은 SAR131675를 처리에 따라 신장 지질 축적과 지방농도에 변화를 주는지 확인하기 위하여 Oil-red O 염색, 총콜레스테롤, 자유지방산 및 중성지방의 농도를 측정하는 실험을 수행하였다.
그 결과, db/m 마우스에서는 SAR131675 처리와 상관없이 신장 내 지방 침착, 신장 내 총콜레스테롤, 자유지방산 및 중성지방의 침착에는 어떠한 변화가 없었음을 확인하였다 (도 2). 그러나, db /db 마우스에서는 비당뇨 db/m 마우스에 비해 신장 내 지방 침착이 증가하였고, 신장 내 자유지방산 및 중성지방의 농도가 현저하게 증가하였다. 그런데, db /db 마우스에 SAR131675를 처리한 경우에는 아무것도 처리하지 않은 db/db 마우스에 비하여 신장 내 지방 침착이 감소되었고, 신장 내 자유지방산 및 중성지방의 농도가 정상대조군 수준으로 감소되었음을 확인하였다(도 2).
따라서, SAR131675는 당뇨 마우스에서 신장 내의 지방 침착을 감소시키고, 신장 내의 자유지방산 및 중성지방의 농도를 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5. SAR131675 처리가 신장 내 사구체 표현형, 콜라겐 IV, 세포사멸 및 염증세포 침윤에 미치는 영향
본 발명자들은 SAR131675의 처리에 따라 당뇨병성 신증의 특징인 사구체 내 경화, 섬유화, 콜라겐 IV의 침착 등에 대한 감소 효과가 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 그 결과, db/m 마우스에서는 SAR131675의 처리와 상관없이 사구체 내 섬유화인 사구체 혈관 사이 간질 영역과 섬유화 사이에 큰 차이는 없었으나, SAR131675를 처리하지 않은 db/db 마우스에서는 사구체 내 혈관간질 영역이 증가하였고, 콜라겐 IV의 침착이 증가하였고, SAR131675를 처리한 경우에는 사구체 내 혈관간질 영역이나 콜라겐 IV의 침착이 정상 수준으로 회복됨을 확인하였다(도 3a).
또한, TGF-β1(Transforming growth factor beta 1) 및 TUNEL-양성 세포의 이중 면역형광염색을 수행하였다. 그 결과, db/m 마우스에서는 SAR131675의 처리와 상관없이 TGF-β1 에 변화가 없었으나, SAR131675를 처리하지 않은 db/db 마우스에서는 TGF-β1 가 증가하였고, SAR131675를 처리한 경우에는 TGF-β1이 다시 정상 수준으로 감소되었음을 확인하였다(도 3b 왼쪽 패널). TUNEL-양성 세포의 경우에도 SAR131675를 처리하지 않은 db/db 마우스에서는 TUNEL-양성 세포가 증가하였으나, SAR131675를 처리한 경우 정상 수준으로 다시 감소되었음을 확인하였다(도 3b 오른쪽 패널).
또한, 세포사멸인자인 Bcl-2, Bax의 단백질 발현량에 대한 비율, 당뇨병에 의해 유발된 신장 내 염증세포의 침윤을 확인하기 위한 MCP-1(monocyte chemoattractant protein 1) 및 F4/80-양성 세포의 이중 면역형광염색을 수행하였다. 그 결과, db/m 마우스에서는 SAR131675의 처리와 상관없이 Bcl-2/Bax ratio에 있어 큰 차이가 없었으나, SAR131675를 처리하지 않은 db/db 마우스에서는 상기 ratio가 감소되었고, SAR131675를 처리한 경우에는 상기 ratio가 다시 정상수준으로 증가되었음을 확인하였다(도 3c 왼쪽 패널). MCP-1 및 F4/80-양성 세포에 대한 염색 실험 결과에서도 db/m 마우스에서는 SAR131675의 처리와 상관없이 MCP-1 및 F4/80-양성 세포의 변화에 큰 차이가 없었으나, SAR131675를 처리하지 않은 db/db 마우스에서는 상기 MCP-1 및 F4/80-양성 세포가 증가되어 신장 내 염증세포의 침윤이 증가되고, SAR131675를 처리한 경우에는 다시 정상 수준으로 염증세포의 침윤이 억제되었음을 확인하였다(도 3c 오른쪽 패널).
따라서, SAR131675는 당뇨병성 신증의 특징인 사구체 내 경화, 섬유화, 콜라겐 IV의 침착을 감소시키는 효과가 있고, 신장 내 세포사멸을 감소시키며, 신장 내 염증세포의 침윤을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 6. SAR131675 처리가 신장 내 림프혈관 생성 및 세뇨관 간질의 섬유화에 미치는 영향
본 발명자들은 SAR131675의 처리에 따라 당뇨병성 신증의 특징인 신장 내 림프혈관생성 및 세뇨관 간질의 섬유화를 감소시키는 효과가 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
우선, 세뇨관 간질 섬유화를 나타내는 Trichrome-양성 부분, 세뇨관간질 섬유화에 관여하는 TGF-β1의 양 및 콜라겐 IV의 양을 비교하는 실험을 수행하였다. 그 결과, db/m 마우스에서는 SAR131675의 처리와 상관없이 Trichrome-양성 부분, TGF-β1의 양 및 콜라겐 IV의 양에서 큰 차이가 없었으나, SAR131675를 처리하지 않은 db/db 마우스에서는 세뇨관 간질 섬유화영역이 증가하였고, TGF-β1의 양 및 콜라겐 IV의 양이 증가하였다. 그러나, SAR131675를 처리하는 경우 상기 세뇨관 간질 섬유화영역이 정상과 유사한 수준으로 감소되었고, TGF-β1의 양 및 콜라겐 IV의 양도 회복되었음을 확인하였다(도 4a).
또한, 세뇨관 상피가 섬유아세포로의 전환을 나타내는 표식자인 α-SMA(alpha smooth muscle actin)의 이중 면역형광염색, 림프혈관 생성의 표식자인 LYVE-1 및 podoplanin의 이중 면역형광염색 실험을 수행하였다. 그 결과, db/db 마우스에서는 SAR131675의 처리와 상관없이 α-SMA, LYVE-1 및 podoplanin의 발현에 큰 차이가 없었으나, SAR131675를 처리하지 않은 db/db 마우스에서는 상기 α-SMA, LYVE-1 및 podoplanin의 발현이 증가되었고, SAR131675를 처리하는 경우 다시 정상 수준으로 상기 α-SMA, LYVE-1 및 podoplanin의 발현이 감소됨을 확인하였다(도 4b).
또한, 신장의 피질 및 수질에서의 피브로넥틴(fibronectin), α-SMA, LYVE-1 및 Podoplanin의 발현량을 조직면역화학염색법 및 웨스턴블럿으로 측정하였다. 그 결과, SAR131675를 처리하지 않은 db/db 마우스에서는 피브로넥틴(fibronectin), α-SMA, LYVE-1 및 Podoplanin의 발현량이 증가되었고, SAR131675를 처리한 경우에는 정상 마우스와 동일한 수준으로 피브로넥틴(fibronectin), α-SMA, LYVE-1 및 Podoplanin의 발현량이 감소됨을 확인하였다(도 4c 및 도 4d).
따라서, SAR131675는 당뇨병성 신증의 특징인 신장 내 림프혈관생성 및 세뇨관 간질의 섬유화를 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 7. SAR131675 처리가 신장 내 염증반응와 산화스트레스에 미치는 영향
염증세포의 침윤은 신장 내 산화스트레스를 가져와 조직의 염증반응의 악순환과 세포사멸을 가져오는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 본 발명자들은 SAR131675의 처리가 신장 내 염증반응 및 산화스트레스를 억제하는 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 신장 내 염증반응을 확인하기 위해서는 염증세포 침윤에 관여하는 MCP-1 및 염증표식자인 TNF-α의 신장 조직 내의 발현을 비교하는 실험을 수행하였고, 신장 내 산화스트레스는 표식자인 소변 내의 8-OH-dG 및 Isoprostane의 양으로 측정하였다.
그 결과, db/m 마우스에서는 SAR131675의 처리와 상관없이 MCP-1 및 TNF-α의 신장 조직 내 발현량에서 변화가 없었으나, SAR131675를 처리하지 않은 db/db 마우스에서는 신장 내 MCP-1 및 TNF-α의 발현량이 현저히 증가하여 염증세포의 침윤이 증가되었음을 확인하였다. 그런데, SAR131675를 처리하는 경우에는 정상 수준으로 신장 내 MCP-1 및 TNF-α의 발현량이 감소됨을 확인하였다(도 5).
또한, SAR131675를 처리하지 않은 db/db 마우스에서는 db/m 마우스에 비해 소변 내 8-OH-dG 및 Isoprostane의 양이 현저하게 증가되었고, SAR131675를 처리하는 경우 상기 소변 내 8-OH-dG 및 Isoprostane의 양이 감소됨을 확인하였다(도 6).
따라서, SAR131675는 신장 내의 염증세포 침윤을 억제하여 산화스트레스를 감소시킴으로써 당뇨병성 신증에 대한 치료 효과가 있음을 확인하였다.
결론적으로 SAR131675는 당뇨병성 신증에 의해 유도되는 염증반응 및 신장 내 지방독성의 감소시킴으로써 림프혈관 생성을 억제하고, 산화스트레스 및 세포사멸을 유도하는 염증반응 및 섬유화를 억제하여 신장의 기능을 향상시켜 당뇨병성 신증에 대한 치료 효과가 있음을 확인하였다(도 7).

Claims (4)

  1. VEGFR3(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3) 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 억제제는 SAR131675, Axitinib, Telatinib, MGCD-265, Lenvatinib, Nintedanib 및 Pazopanib 으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 당뇨병성 미세혈관 합병증은 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy) 또는 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 신장 내 지방독성을 감소시키고, 신장 내 섬유화 및 염증세포의 침윤을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020170054470A 2017-04-27 2017-04-27 Vegfr3 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 KR20180120476A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20210114661A (ko) * 2020-03-11 2021-09-24 연세대학교 산학협력단 VEGFR-3 발현 조절을 통한 mTOR 관련 질환의 예방 또는 치료 방법

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