CN101365451A - 使用小分子化合物用于神经保护的方法 - Google Patents
使用小分子化合物用于神经保护的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101365451A CN101365451A CNA2006800419288A CN200680041928A CN101365451A CN 101365451 A CN101365451 A CN 101365451A CN A2006800419288 A CNA2006800419288 A CN A2006800419288A CN 200680041928 A CN200680041928 A CN 200680041928A CN 101365451 A CN101365451 A CN 101365451A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- relevant
- disease
- neurodegeneration
- dosage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
提供了预防神经退行性变和神经元损失的方法,其通过施用包含具有预防神经退行性变和神经元损失作用的小分子化合物的组合物。在本发明的一个方面,所述方法和组合物也可用于治疗神经退行性疾病。因为其稳定性、易于用于制造和配置、易于施用以及患者依从性,小分子化合物提供了重要的治疗选择。本发明的小分子化合物包括具有神经保护作用的拓扑异构酶II抑制剂、细菌转肽酶抑制剂、钙离子通道拮抗剂、环氧合酶抑制剂、叶酸合成抑制剂或钠通道阻断剂及其功能类似物。本发明的组合物既可以在早期临床症状出现前预防性施用,又可以用于CNS受损和神经退行性疾病已出现明显的临床症状之后施用。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年11月21日提交的美国临时专利申请序号No.60/738,761和2005年12月12日提交的美国临时专利申请序号No.60/749,910的权益,两者在此通过参考方式全文并入本文。
技术领域
本发明涉及包含小分子化合物的方法和组合物,用于保护神经元免受由由于枢神经系统受损或疾病引起而导致的死亡或者退化。
背景技术
中枢神经系统(central nervuous system,CNS)的疾病和受损可造成破坏性的衰弱性疾病,其每年改变了数百万个体的生活。一般来说,这些疾病的演化发生在导致疾病或紊乱的轻微至严重的临床表现的神经元细胞的死亡和退化之后。已知外伤的受损、局部缺血以及其他许多神经病理学起因所造成的损伤可直接或间接地通过多种机制(例如氧化应激、自由基损伤或细胞蛋白的机能紊乱)引起神经损坏和死亡。CNS受损或疾病的实例包括脑外伤(traumatic brain injury,TBI);外伤性癫痫(posttraumaticepilepsy,PTE);中风(stroke);脑缺血(erebral ischemia);神经退行性疾病(neurodegenerative diseases);辐射、暴露于电离或铁等离子体、神经性毒剂、氰化物或毒性浓度的氧气所诱导的癫痫继发性颅脑损伤;由于CNS疟疾或抗疟疾试剂治疗引起的神经毒性;及其他CNS外伤。CNS神经元损伤和神经退行性疾病往往会进一步导致源于细胞凋亡、氧化应激和线粒体功能障碍的神经元损失。
神经退行性疾病的特征是神经元逐渐丧失,并与(1)酶功能障碍、(2)活性氧分子(reactive oxygen species)的形成和/或(3)最终导致组织退化的蛋白质错折叠和聚集有关。神经退行性疾病包括帕金森症(Parkinson’sdisease)、阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease)、亨廷顿氏病(Huntington’sdisease)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、多聚谷氨酸疾病(polyglutamine diseases)、tau蛋白病(tauopathy)、肌张力异常(spinocerebellar ataxia)、脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia)、脊髓和延髓肌萎缩症(spinal and bulbar muscular atrophy)以及传染性海绵状脑病(sngiform encephalopathies)-包括朊病毒疾病(prion diseases)等等。
神经元受损和疾病可能由酶功能障碍引起。许多细胞酶类对于神经元的功能至关重要,并且蛋白功能的改变对细胞存活是破坏性的。正常代谢酶可以使蛋白质再生循环从而创造一个合成与降解的永久循环。负责维护正常细胞功能的细胞酶类包括受体、神经递质转运蛋白(neurotransmitter transporters)、合成与降解酶类、分子伴侣和转录因子。这些酶的突变会导致错折叠蛋白质的不正常的积累和降解。已知这些错折叠的蛋白质导致神经元损伤,如神经元包含体与斑块。因此,对该细胞机制的了解,以及鉴定可以减少、抑制和改善这种错折叠的蛋白质的分子工具是至关重要的。此外,了解蛋白质聚集对神经元存活的影响,从而可开发合理而有效的治疗这些疾病的方案。
神经毒性的活性氧分子的形成似乎即可以触发细胞的/神经元的退化的通路,又可以在调解坏死神经元死亡中发挥重要作用。可在体内使用特定毒素来筛选能够保护神经元免受活性氧分子损伤和神经退行性变的化合物。举例来说,包括1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)、百草枯、鱼藤酮和6-羟多巴胺(6-OHDA)在内的毒素可造成过多活性氧分子的形成并可在动物模型上诱导多巴胺能神经元的缺失和帕金森病表型(Simon et al.,Exp Brain Res,1974,20:375-384;Langston et al.,Science,1983,219:979-980;Tanner,Occup Med,1992,7:503-513;Liou et al.,Neurology,1997,48:1583-1588)。
ALS的发作通常是自发性的,并且微量金属及活性氧分子的作用与偶发性的ALS和其他神经系统疾病相关联,所述神经系统疾病如阿尔茨海默症、帕金森氏症、朊病毒疾病、多聚谷氨酸病、脊髓小脑性共济失调、脊髓及延髓肌萎缩症、传染性海绵状脑病、tau蛋白病、亨廷顿氏病病(Manfredi and Xu,Mitochondrion,2005 Apr,5(2):77-87;Zeevalk et al.,Antioxid Redox Signal,2005 Sep-Oct,7(9-10):1117-1139)。
扭转蛋白A(Torsin A)是属于ATP酶的功能多样的AAA+蛋白超家族的一种蛋白质,此蛋白超家族包括热休克蛋白(heat shock proteins,Hsp)、蛋白酶和动力蛋白(Neuwald et al.,Genome Res.,1999,9:27-43)。具有分子伴侣活性的扭转蛋白家族包括扭转蛋白A、扭转蛋白B、TOR-1、TOR-2和OOC-5。最近证明扭转蛋白A可以调控多巴胺转运蛋白(dopaminetransporter,DAT)及其它多发性的膜结合蛋白质的细胞水平(Tones et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2004,101:15650-15655)。认为扭转蛋白A对多巴胺能神经元暴露于DAT所调控的活性氧分子之后,具有神经保护活性(Cao et al.,J Neurosci,2005,25(1):3801-3812)。扭转蛋白活性的降低或丧失也会消除其调节蛋白质折叠的能力,并可能导致响应不利的环境条件的蛋白质聚集和神经退行性变。扭转蛋白A蛋白的突变,也被直接关联到早发性扭转张力障碍(early-onset torsion dystonia)—一种人体运动障碍(L.J.Ozelius,et al.,Nature Genetics,1997,17:40)。
分子伴侣蛋白,如扭转蛋白,属于正常的细胞蛋白,可预防蛋白错折叠和聚集。分子伴侣蛋白包括蛋白家族例如Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60和Hsp40(Muchowski and Wacker,Nature Reviews,2005,6:11-22)。人扭转蛋白A的突变会导致早发性扭转张力障碍,一种以不受控制的肌肉痉挛为特征的运动障碍。其症状可以由症状较轻的书写痉挛到严重的被固定于轮椅上。在北美超过30万人受肌张力障碍的困扰,比亨廷顿氏症和肌肉失养症更为普遍。因为对这种疾病缺乏了解,针对该疾病的治疗方法非常有限,包括外科手术或注射肉毒毒素来控制肌肉收缩。
大部分早发性扭转张力障碍的病人在扭转蛋白A基因上具有一个独特的密码子缺失(DYTF),其导致了在扭转蛋白A的羧基端缺少一个谷氨酸(GAG)从而产生功能失调的扭转蛋白(L.J.Ozelius,et al.,Genomics,1999,62:377;L.J.Ozelius,et al.,Nature Genetics,1997,17:40)。最近的一篇文献描述了羧基端的另一种18个碱基对或6个氨基酸的缺失,也能导致早发性扭转张力障碍(Leung,et al.,Neurogenetics,2001,3:133-143)。
在多聚谷氨酸扩张疾病以及α-共核蛋白错折叠相关的神经退行性疾病,如亨廷顿氏病和帕金森氏病中,扭转蛋白质与预防蛋白质错折叠和聚集相关联(Caldwell et al.,Hum MoI Genetics,2003,12:307-319;Cao etal.,J Neurosci,2005,25:3801-3812)(See also Cooper et al.,Science,2006,313:324-328)。神经退行性疾病,如帕金森氏症,亨廷顿氏病,和多聚谷氨酸扩张疾病由异常的蛋白质错折叠和聚集造成。已发现在这些疾病的体内实验模型中,扭转蛋白可以减少蛋白质错折叠和聚集。据信扭转蛋白也可以作用于其他与神经退行性疾病相关的蛋白质错折叠和聚集有关联的蛋白质。
困扰神经退行性疾病的一大障碍是,直到临床症状表现出之前,患者都不清楚促使神经元退化的神经元环境一直都在发展。到临床症状出现时,已经有实质性的神经元损失并且神经元环境已经明显不利于神经元存活。遗传筛选对个体是否倾向于发展为神经退行性疾病提供了信息。但是,缺少可靠的蛋白聚集或神经元损失的早期检测方法使得这些退行性疾病在无监测的状态下发展,直到由于神经元已经损失使得治疗可能无效或多余的地步。而且,即使有可靠的早期检测方法,现有的治疗对这些神经退行性疾病的长期治疗也是无效的,因此需要新药和新的治疗方法。
对异常蛋白聚集的分子机制和调节剂的更好的了解是开发改进方法所需要的,这些改进方法用于在出现显著神经元破坏前的早期阶段诊断这些失调并为药物设计和开发提供模式系统。使用模式系统,可以筛选并开发靶向与蛋白聚集相关的特异基因和基因产物的化合物。另外,有必要了解神经退行性变的机制并开发预防或缓解异常蛋白折叠和聚集以及随之的神经元损失的神经保护化合物。
CNS损伤和疾病的普遍性强调了需要深入了解神经退行性变的发生和发展的机制。而且需要新型和改良的神经保护性化合物,用于预防性地或在损伤和疾病的发生之后预防或减轻神经元损失。因此还需要新型的治疗方法以保护神经细胞免于因中枢神经系统损伤或疾病而引发的死亡和退化。
也需要用于治疗和预防神经元损伤造成的疾病的新型治疗方法,所述神经元损伤包括蛋白错折叠和蛋白聚集。理想情况下,这些治疗方法既可以具有预防性用途也具有症状发生后的用途。现有的治疗性的选择包括疫苗和蛋白疗法,这两种方案都很难制备和实施。尽管这些疗法可能提供也许并不存在的治疗候选方案,但是制备和实施的难度可能会导致很低的患者依从性。因此,所需的治疗方法应该易于制备和实施并能够有很高的患者依从性。
发明内容
发明概述
本发明提供了保护神经元免受由受损、局部缺血或者神经退行性变引起的损伤或者死亡的方法,这些方法是通过施用具有预防神经元死亡效果的小分子化合物。在本发明的一个方面中,这些方法可以用于治疗与细胞蛋白质功能紊乱相关的神经元损伤和神经退行性病变。在本发明的另一个方面中,这些方法也可以用于治疗与活性氧分子相关的神经元损伤和神经退行性病变。在本发明的又一个方面中,这些方法可用于通过施用小分子化合物来预防和减少体内或体外的蛋白错折叠和聚集。本发明的另一方面是提供了治疗与蛋白错折叠和聚集相关的神经元损伤和神经退行性疾病有关的方法。
本发明的小分子化合物包括具有神经保护作用的拓扑异构酶II抑制剂、细菌转肽酶抑制剂、钙离子通道拮抗剂、环氧合酶抑制剂、叶酸合成抑制剂或钠通道阻断剂及其具有神经保护作用的功能类似物。这种所述神经保护作用是调节细胞蛋白如神经递质转运蛋白或分子伴侣蛋白的结果。所述小分子化合物可以通过调控扭转蛋白的活性从而减轻不正常细胞蛋白导致的神经元损伤。所述小分子化合物也可以通过调控扭转蛋白的活性从而减轻由活性氧分子造成的神经元损伤,这种调控作用是通过调节神经元表面的神经递质转运蛋白实现的。所述小分子化合物还可以调控扭转蛋白的分子伴侣活性,扭转蛋白的分子伴侣活性可以通过帮助引导蛋白正确折叠从而减少由于蛋白错折叠或聚集造成的神经元损伤。小分子化合物的稳定性,易于制备和修饰,便于给药和良好的治疗依从性,因此小分子化合物提供了一种重要的治疗手段。所述化合物可以既可以在早期临床症状出现前的预防性施用,又可以用于CNS受损和神经退行性病变已出现明显的临床症状之后施用。
因此,本发明的一个目的是提供用于神经中枢受损或者发生神经退行性变之后保护神经元免于受损或死亡的方法和组合物。
本发明的另一个目的是鉴定用于治疗和预防与不正常细胞蛋白相关的神经退行性变(neurodegeneration)和神经元损失的方法和组合物中的小分子化合物。
本发明的还一个目的是鉴定用于治疗和预防与活性氧分子相关的神经退行性变和神经元缺失的方法和组合物中的小分子化合物。
本发明的另一个目的是鉴定用于治疗和预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的方法和组合物中的小分子化合物。
本发明的另一个目的是通过提供使用小分子化合物来预防神经退行性变和神经元损失的方法和组合物,所述小分子化合物包括具有神经保护作用的拓扑异构酶II抑制剂、细菌转肽酶抑制剂、钙离子通道拮抗剂、环氧合酶抑制剂、叶酸合成抑制剂或钠通道阻断剂和功能类似物。
本发明的另一个目的是鉴定用于方法和组合物中的小分子化合物,所述方法和组合物是通过调控扭转蛋白活性来治疗和预防神经退行性变和神经元缺失。
本发明的另一个目标是鉴定通过调控扭转蛋白活性来用于治疗或预防的方法,所述神经退行性变和神经元损失与蛋白错折叠和聚集相关。
本发明的另一个目的是鉴定通过扭转蛋白-依赖机制发挥作用的小分子化合物,用于治疗和预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的方法和组合物。
本发明的另一个目的是鉴定可以调控神经递质转运蛋白活性的小分子化合物,用于治疗和预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的方法和组合物。
以下对所公开的具体实施方式和所附权利要求的详细描述使本发明的这些及其他目的、特点和优点变得更清晰。
发明详述
应当理解与本文描述相似或等价的方法和材料可用于本发明的实施或测试中。本文提到的所有文献、专利申请、专利和其他参考通过引用将其全部内容并入本文。如有冲突,以本说明书作包括定义为准。另外,所述材料、方法和实施例只用于举例说明而非限定性的。
“小分子化合物”、“候选化合物”和“药物化合物”是指本发明中以对活性氧分子形成、蛋白错折叠和聚集、神经元损伤以及神经退行性变的作用筛选得到的分子化合物。这些化合物可以包括Prestwick文库的化合物、相关药物类别或者其功能类似物。
“蛋白错折叠”是指一个蛋白的折叠不同于该蛋白折叠成二级或者三级结构的正常方式。蛋白折叠过程中的错误可能是由于突变产生的蛋白序列的改变或者是由于帮助蛋白折叠的分子伴侣蛋白的缺陷造成的。错折叠可能导致蛋白质生理功能的改变,从而增强、减弱或者阻断了正常的蛋白功能。
“蛋白聚集”在本发明的范围内是指多肽链不正常的相互关联形成了自联状态的聚集,这种聚集可以是可溶的抑或是不溶的,而且不一定是纤丝状的。该术语也包括至少两个多肽链互相接触导致的任一多肽链处于去溶剂化状态的现象。其可能也包括多肽天然功能活性的丢失。
“治疗”在本发明的范围内是指减轻、抑制、改善或者预防。优选,是活性氧分子导致的神经退行性变、活性氧分子导致的细胞功能紊乱、神经退行性疾病、蛋白错折叠和聚集、蛋白错折叠和聚集导致的细胞功能紊乱以及蛋白聚集相关的疾病可得以治疗。
“蛋白聚集相关的疾病”在本发明的范围内包括与蛋白聚集相关的疾病相关联的、由其引起的或者可导致该病的任何疾病、不适和/或痛苦,所述蛋白聚集相关的疾病包括神经退行性疾病。
"神经退行性疾病"包括神经元的损失引起的疾病,而可导致感觉、运动、认知行为逐渐退化的致病因素造成了所述神经元的损失。这些疾病包括ALS、阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒疾病、多聚谷氨酸扩张性疾病、脊髓小脑性共济失调、脊髓和延髓肌萎缩、传染性海绵状脑病、tau蛋白病、亨廷顿氏病、额颞痴呆、运动神经元疾病(motor neuron disease,MND)等。
“CNS损伤”包括外伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)、外伤性癫痫(posttaumatic epilepsy,PET)、中风、脑缺血、神经退行性疾病、颅脑损伤继发性癫痫,上述疾病的诱发包括辐射、暴露于电离或铁等离子、神经毒剂、氰化物或毒性浓度的氧气,由中枢神经性疟疾或治疗与预防疟疾药物造成的神经毒性等。
本文所使用的“类似物”或者“功能类似物”是指在结构上与母体化合物类似,但是在组成上稍微不同(例如一个原子或者功能基团的差异、添加或者删除)的化合物。类似物可以具有或者不具有不同于原初化合物的化学或者物理性质,可以具有或不具有改进的生物的和/或化学的活性。例如,所述类似物与母体化合物相比可以更疏水或者具有不同的反应活性。所述类似物可以模仿母体化合物的化学和/或生物学的活性(也就是类似物具有相似或者相同的活性),或者,在某些情况下,可以具有增强的或者减弱的活性。所述类似物可以是原初化合物天然存在的或者非天然存在的(例如重组的)变体。其他类型的类似物包括异构体(对映体、非对映异构体等等)和化合物的其他类型的手性变体,以及结构异构体。所述类似物可以是线性化合物的分支状的或环状的变体。例如,线性化合物可以具有分支型或者替换型的类似物,从而被赋予某种所需的特性(例如提高亲水性或者生物利用度)。
本文所使用的“衍生物”是指化合物的化学的或者生物修饰的形式,其在结构上与母体化合物类似,并且(在实际上或者理论上)来自母体化合物。“衍生物”不同于“类似物”或者“功能类似物”,因为母体化合物可以是产生“衍生物”的起始原料,但是母体化合物不是必须的用来制备“类似物”或者“功能类似物”的起始原料。衍生物可以具有或不具有不同于母体化合物的化学的或者物理的特性。例如,所述衍生物与母体化合物相比可以更疏水或者具有不同的反应活性。衍生作用(即修饰作用)可以涉及所述分子的一个或者多个部分的替换(例如功能基团的改变)。例如,氢可以替换成卤素,如氟或氯,或者羟基(—OH)可以替换成羧酸基团(—COOH)。术语“衍生物”还包括母体化合物的偶联物或者药物前体(即化学修饰的衍生物,其可以在生理条件下被转换成原初的化合物)。例如,所述药物前体是活性剂的非活化形式。在生理条件下,所述药物前体可转化为该化合物的活性形式。比如,通过将在氮原子上的一个或两个氢原子替换为酰基基团(酰基药物前体)或氨基甲酸酯基团(氨基甲酸酯药物前体)而形成药物前体。关于药物前体的更详细的信息可以参照参考文献,例如Fleisher et al.,Advanced Drag Delivery Reviews 19(1996)115;Design of Prodrugs,H.Bundgaard(ed.),Elsevier,1985;and H.Bundgaard,Drags of the Future 16(1991)443。术语“衍生物”也可以用于描述所有的溶剂合物,例如水合物或加合物(比如醇类加合物)、活性代谢产物和母体化合物的盐类。可根据所述化合物中该部分的天然特性来制备盐的类型。举例来说,酸性基团(如羧酸基团)可形成碱金属盐或碱土金属盐类(如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐以及生理耐受的季铵离子盐,还有含有氨的酸式加成盐和生理忍受的有机胺,有机胺例如三乙胺、乙醇胺或3—(2—羟乙基)胺)。碱性基团可形成酸式加成盐,例如与无机酸如盐酸(HCL)、硫酸或磷酸,或与有机羧酸和磺酸如乙酸、柠檬酸、苯甲酸、顺丁烯二酸、富马酸、酒石酸、甲磺酸或甲苯磺酸。同时含有碱性基团和酸性基团的化合物(如除了碱性的氮原子还有羧基)可作为两性离子。可以通过所属技术领域的常规方法获得盐,例如通过将化合物与无机或有机酸或碱混合在溶剂或稀释剂中混合,或利用阳离子交换或阴离子交换从其他盐得到。
所有蛋白聚集相关疾病具有显著的共同特征:不正常蛋白的聚集作用和沉积作用(表1),并且这些疾病都涉及到分子伴侣的作用(Muchowskiand Wacker,Nature Reviews,2005,6:11-22)。蛋白聚集相关疾病包括但是不限于,阿尔茨海默症、帕金森氏症、多聚谷氨酸疾病、tau蛋白病、亨廷顿氏病、肌张力障碍、脊髓小脑性共济失调、脊髓和延髓肌萎缩症、传染性海绵状脑病以及ALS。转基因动物模型中突变蛋白的表达着重概述了这些疾病的特征(A.Aguzzi and A.J.Raeber,Brain Pathol,8,695(1998))。神经元尤其易受突变和错折叠的蛋白的毒性作用的损伤。如本发明所描述,对蛋白聚集相关的神经退行性疾病的共同特性的理解,例如对正常的细胞机制处理不必要的或者可能有害的蛋白,并且促进蛋白正确折叠的理解,能够开发有效和成功的治疗方案和诊断方法。
表1:蛋白聚集相关的神经退行性疾病
疾病 | 蛋白质沉淀 | 毒性蛋白质 | 疾病基因 | 危险因素 |
阿尔茨海默症 | 细胞外斑块细胞内缠结 | 淀粉样蛋白13 | APP早老蛋白1 | ApoE4等位基因 |
tau | 早老蛋白2 | |||
帕金森症 | 路易体 | α-突触核蛋白 | α-突触核蛋白ParkinUCHL-1LRRK2 | Tau连锁 |
朊病毒症 | 朊病毒斑块 | PrPSc | PRNP | 在pnon密码子129处的纯和基因 |
多聚谷氨酸症 | 核和细胞质包涵体 | 含多聚谷氨酸的蛋白 | 具有CAG重复扩展到9个不同基因 | |
Tau蛋白症 | 细胞质体的 | tua | tua | Tua连锁 |
家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化 | Bunina小体缠结 | SOD1 | SOD1 |
正确折叠需要蛋白质从一群可能但不正确的构型中选择一个特定结构。多肽选择合适结构的失败是对细胞功能和存活力的主要威胁。因此,进化出精细的系统来保护细胞免受错折叠蛋白的有害作用。抵抗蛋白错折叠的第一道防线包括分子伴侣,分子伴侣可以在新生多肽从核糖体上出现时与之结合,促进多肽正确折叠并预防有害的相互作用(J.P.Taylor,et al.,Science,2002,296:1991)。蛋白的不正确折叠可能并不一定会造成蛋白聚集和神经退行性变,但是由于某些更微妙的细胞功能失调可能导致疾病或障碍的临床症状的显现。例如,在,在早发性扭转张力障碍中,缺陷的扭转蛋白A蛋白不能正确的调控细胞水平的多巴胺转运子,从而导致肌张力异常的症状但是没有明显的神经退行性变和蛋白聚集(Torreset al.,Proc Nati Acad ScI,2002,101:15650-15655;Cao et al.,JNeuwsci,2005,25(1):3801-3812)。
本发明人筛选化学多样性的小分子文库中以鉴定对预防蛋白错折叠和聚集有作用的小分子化合物(表2)。秀丽隐杆线虫(C.elegans)小分子文库来自Prestwick Chemical,Inc.(Washington,DC)(下文中称为Prestwick文库)。该文库是包含针对在秀丽隐杆线虫中的耐受性选择的240个小分子的化学多样性集合。文库内的全部化合物经过线虫生命周期的毒性测试并证实对秀丽隐杆线虫没有毒性。所述候选化合物不会使用于组织学实验的培养基着色或者变暗。文库内大于95%的化合物是不具有专利的商品化的药物,而且已经安全的施用于人体。这些药物中大约5%是生物碱。这个文库用来筛选药物可以保证命中化合物具有足够的效价。如果筛选到一个阳性结果但没有足够效价,可以通过计算机辅助药物设计来合成最佳的类似物并且易于用同样的方法来筛选。该文库内的所述化合物为下一步的药物开发提供了机会,因为前体就是非毒性的口服可吸收的,并具有可接受的半衰期而没有不良副作用。
为提高成功机率,可以由专业医药化学家用计算机程序(例如ChemX/ChemDi verse(Accelrys))并基于关键设备来筛选化合物。为了增加多样性和提高筛选过程的成功率,将已知在不同治疗领域内具有功效的化合物整合到这个库中。这些化合物可以包括神经精神病、抗糖尿病、抗病毒、降压、解热、抗炎、抗菌和抗感染的药物。
在秀丽隐杆线虫模型中筛选蛋白聚集的小分子库,已鉴定了具有预防蛋白错折叠和聚集作用的几类化合物(表2)。药物可以放置在转基因线虫生长的基质上或者通过其他方便的途径施用使线虫暴露于候选药物下。当药物被引入生长基质上时,所述小分子化合物可以通过表皮和吸收的渗透至动物体内。这种施用方式可以使动物持续暴露于药物下。当在初筛浓度条件下药物产生响应,则进行系列稀释来确定产生所观察到的效果的最高可能浓度。
转基因动物模型中突变蛋白的表达简要表征了神经退行性疾病的特征(A.Aguzzi and A.J.Raeber,Brain Pathol,1998,8:695)。神经元特别易受突变或错折叠蛋白的毒性作用的损坏。这些神经退行性疾病的共同特征基于对预防活性氧分子造成损伤的正常细胞机制的认识,提供了治疗的并行途径。
秀丽隐杆线虫是研究多巴胺能神经元退化的理想模型,因为此在解剖学上和遗传上明确定义的透明线虫具有精确的302个神经元和其中8个是多巴胺能的(dopaminergic,DA)。因此,使用该秀丽隐杆线虫模型可以便于快速评判动物年老过程中多巴胺能神经元退行性变。多巴胺能神经元对于氧化应激以及利于产生活性氧分子的其他细胞内因子特别敏感,这种氧化应激是多巴胺代谢的结果(Blum et al.,2001)。在与活性氧分子相关的神经退行性变的模型中,扭转蛋白可以保护秀丽隐杆线虫多巴胺能神经元免受细胞多巴胺功能失调相关的特定的应激反应。特别是,扭转蛋白可以预防暴露于6-OHDA诱导的活性氧分子相关的神经退行性变(Cao et al.,J Neurosci,2005,25(1):3801-3812)。
在秀丽隐杆线虫中评定神经退行性变的另一个模型是过表达cat-2的转基因秀丽隐杆线虫,cat-2即人酪氨酸羟化酶(TH)的线虫同源蛋白,是多巴胺合成途径中的酶。过量表达CAT-2可以导致DA神经元广泛损失(Caoet al.,J Neurosci,2005,25(1):3801-3812)。已经证明扭转蛋白对DA神经元具有神经保护活性。该模型可以用来筛选作用于含TH的神经元包括肾上腺能神经元,去甲肾上腺能神经元以及DA神经元。相似的实验可以用来研究不同神经元亚型的死亡和退化,例如含有羟色胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸、乙酰胆碱、组胺和多肽神经递质的神经元。
筛选化学多样性的小分子文库来确定具有阻止与活性氧分子相关的神经退行性变作用的小分子化合物。从Prestwick Chemical,Inc.(Washington,DC)获得秀丽隐杆线虫的小分子文库(后文称为PrestwickLibrary)。所述文库是化学多样性的240个小分子的集合,已在秀丽隐杆线虫中进行了耐受性选择。文库内的全部化合物经过线虫生命周期的毒性测试并证实对秀丽隐杆线虫没有毒性。所述候选化合物不会使用于组织学实验的培养基着色或者变暗。文库内大于95%的化合物是不具有专利的商品化的药物,而且已经安全的施用于人体。这些药物中大约5%是生物碱。这个文库用来筛选药物可以保证命中化合物具有足够的效价。如果筛选到一个阳性结果但没有足够效价,可以通过计算机辅助药物设计来合成最佳的类似物并且易于用同样的方法来筛选。该文库内的所述化合物为下一步的药物开发提供了机会,因为先导化合物是无毒、口服吸收具有可接受的半衰期,并且耐受性好。
为提高成功机率,可以由专业医药化学家用计算机程序(例如ChemX/ChemDi verse(Accelrys))并基于关键设备来筛选化合物。为了增加多样性和提高筛选过程的成功率,将已知在不同治疗领域内具有功效的化合物整合到这个库中。这些化合物可以包括治疗神经精神病、抗糖尿病、抗病毒、降压、解热、抗炎、抗菌和抗感染的药物。
利用秀丽隐杆线虫模型筛选小分子库中用于神经保护的分子,已鉴定了具有预防与活性氧分子相关的神经退行性变作用的几类化合物。药物可以放置在转基因线虫生长的基质上或者通过其他方便的途径施用使线虫暴露于候选药物。当引入生长基质上时,所述小分子化合物可以通过表皮扩散和吸收而渗透至动物体内。这种施用方式可以使动物持续暴露于药物中。当药物在初筛浓度条件下产生响应时,则进行系列稀释来确定产生所观察到的效果的最高可能浓度。
下面的列表并不是限制性的,而是提供具有本文所述的神经元保护活性的特异的小分子。
I.辅助分子伴侣功能的分子。
下列类型的分子可以通过调控分子伴侣功能的方式来预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经元退行性变和神经元缺失。主要参与调节蛋白折叠的分子伴侣是40KDa的热休克蛋白(HSP40;DnaJ)、60KDa的热休克蛋白(HSP60;GroEL)、70KDa的热休克蛋白(HSP70;DnaK)和扭转蛋白(TOR-1;TOR-2;扭转蛋白A;扭转蛋白B;OOC-5)家族。在一个实施方案中,这些类型的分子可以通过调控扭转蛋白A蛋白的作用来促进蛋白正确的折叠。
a)拓扑异构酶II抑制剂
在一个实施方案中,拓扑异构酶II抑制剂可以用于预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经元退行性变和神经元损失。拓扑异构酶II抑制剂可以筛选自但是并不局限于:洛美沙星(lomefloxacin)、西诺沙星(cinoxacin)、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、噁喹酸(oxolinic acid)、萘啶酸(nalidixic acid)、苏拉明(suramin)、美巴龙(merbarone)、金雀异黄素(genistein)、盐酸表阿霉素(epirubicin HCl)、玫瑰树碱(ellipticine)、阿霉素(doxorubicin)、金黄三羧酸(aurintricarboxylicacid,ATA)、或其药物学可接受的盐。
特别重要的是萘啶酸(Sanofi-Aventis,Bridgewater,NJ;CAS No.389-08-2),这是一种喹诺酮类的抗生素通常用作治疗尿道感染。萘啶酸属于4—喹诺酮类家族,其是含有4—氧络的喹诺酮类(在氮的对位上有一个羰基)。它们抑制A-亚型的DNA促旋酶并可以用于抗菌剂。第二代4—喹诺酮还可以在7—位用1—哌嗪基替换并在6—位用氟替换。正如上文所所提到的,本发明所包括的小分子化合物已经批准在人体上使用。所述药物萘啶酸已经获准使用在治疗尿道感染的治疗中,其推荐剂量为每个6小时约750mg/kg至约1500mg/kg,更常见的是每6小时施用大约1g/kg。如果药物施用超过一周或两周,剂量可以减为每6小时约500mg/kg,尽管此剂量可以在必要时适当地滴定。在禁食的正常个体中,以为1g/kg的剂量施用1—2小时后,活性药物的血清浓度的高峰平均为大约20—40mg/ml(90%的蛋白结合),药物半衰期为90分钟。用于预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的萘啶酸剂量可以基于用于治疗其他疾病的有效的非毒性剂量,根据需要来适当滴定。
另一种特别重要的拓扑异构酶的抑制剂是噁喹酸(CAS No:14698-29-4),这是一种可以用于治疗尿路感染的抗生素。正如上文所述,本发明所包括的小分子化合物已经批准在人体上使用。噁喹酸药物已经获准使用在治疗尿道感染的治疗中,其推荐剂量是约10mg/kg—约40mg/kg,更常见剂量为约20mg/kg。用于预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的噁喹酸剂量可以基于用于治疗其他疾病的有效的非毒性剂量,根据需要来适当滴定。
b)细菌转肽酶抑制剂
在可选择的实施方案中,细菌转肽酶抑制剂可以用作预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经元退行性变和神经元损失。细菌转肽酶抑制剂可以选自但是并不局限于,氨苄青霉素(ampicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、哌拉西林(piperacillin)、阿莫西林(amoxicillin)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、双氯西林(dicloxyacillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、青霉素(penicillin)、美坦西林(metampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、头孢西丁(cefoxatin)、或其药物学可接受的钠盐。
特别重要的是青霉素衍生的美坦西林钠盐(CAS No.6489-97-0;Prestwick library compound 235)。美坦西林通常每8小时施用约250mg/kg至约500mg/kg。用于预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的美坦西林剂量可以基于用于治疗其他疾病的有效的非毒性剂量,根据需要来适当滴定。
在本发明的一个实施方案中,细菌转肽酶抑制剂可以用作预防与活性氧分子相关的神经元退行性变和神经元损失。细菌转肽酶抑制剂可以选自但是并不局限于氨苄西林、青霉素、氨西林、氨苄西林、美坦西林、阿莫西林以及头孢西丁。在一个实施方案中,过血脑障的化合物可以用于预防与活性氧分子相关的神经元退行性变和神经元损失。
特别重要的是青霉素衍生的美坦西林钠盐(CAS No.6489-97-0;Prestwick library compound 235)。如前所述,本发明所包括的小分子化合物已经批准在人体上使用。药物美坦西林已被批准使用在细菌感染的治疗,推荐剂量为每8小时施用约250mg/kg至约500mg/kg之间,尽管此剂量可以根据需要适当滴定。用于预防神经退行性变的美坦西林剂量可以基于用于治疗其他疾病的有效的非毒性剂量、根据需要来适当滴定。
II通过转功能缺陷分子伴侣的作用发挥其功效的分子。
下列类型的分子可以通过转功能缺陷分子伴侣的作用来预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经元退行性变和神经元损失。在这一类型中包括用缺陷型的蛋白分子伴侣活性转扭转蛋白突变体的化合物。
a)钙通道拮抗剂
在一个实施方案中,钙通道拮抗剂可以用作预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经元退行性变和神经元损失。钙通道拮抗剂可以选自但并不局限于尼莫地平(nimodipine)、二维林(diproteverine)、维拉帕(verapamil)、尼群地平(nitrendipine)、地尔硫(diltiazem)、氟嗪(mioflazine)、洛哌丁胺(loperamide)、氟嗪(flunarizine)、苄普地尔(bepridil)、利多氟嗪(lidoflazine)、CERM-196、R—58735、R—56865、
诺嗪(ranolazine)、尼索地平(nisoldipine)、尼地平(nicardipine)、PN200-110、非洛地平(felodipine)、氨氯地平(amlodipine)、R-(-)-202-791或R-(+)Bay K-8644、或其药物学上可接受的盐。
特别重要的是盐酸洛哌丁胺(,McNeil-PPC,Inc.,FortWashington,PA;Mylan,CAS No.53179-11-6)属于阿激动剂类型,并因其激活了特异的、μ和K阿受体(每种受体控制不同的脑功能)而在CNS和平肌具有广泛作用。如前所述,本发明所包括的小分子化合物已经批准在人体上使用。药物盐酸洛哌丁胺已被批准用于治疗腹泻,推荐剂量为初期施用约1mg/kg至约5mg/kg,后期施用约0.5mg/kg至约3mg/kg,通常初期施用约4mg/kg,后期施用约2mg/kg,不能超过约16mg/kg的每日剂量。用于预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经元退行性变和神经元损失的盐酸洛哌丁胺剂量可以基于用于治疗其他疾病的有效的非毒性剂量,根据需要来适当滴定。
b)环氧合酶抑制剂
在一个实施方案中,环氧合酶抑制剂可以用作预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经元退行性变和神经元损失。环氧合酶抑制剂可以选自但并不局限于萘普生(naproxen)、柳珊瑚酸(flufenamic acid)、邻甲氯酚那酸(tolfenamic acid)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)、非那西丁(phenacetin)、安乃近(dipyrone)、氟比洛芬(flurbiprofen)、meclofenamide、吡罗昔康(piroxicam)、吲哚美辛(indomethacine)或其药物学可接受的盐。除了具有抗炎症作用,环氧合酶抑制剂还具有止痛、退热和抑制血小板的作用。他们主要用于治疗慢性关节炎以及与疼痛和炎症相关的某些软组织疾病。环氧合酶抑制剂包括非甾体抗炎药(nonsteroidalanti-inflammatory drugs,NSAIDs),其通过抑制环氧合酶阻抑前列腺素合成,环氧合酶可以将花生四烯酸转化成作为前列腺素前体的内生环过氧化物。抑制前列腺素合成可以解释其止痛、退热和血小板抑制作用;其他的机制可以解释其抗炎症功效。某些NSAIDs也可以抑制脂氧合酶或磷脂酶C,或者调控T-细胞功能(AMA Drug Evaluations Annual,1994,1814-1815)。
特别重要的是甲氯芬那酸(meclofenamic acid)钠盐(Mylan,CAS No.644-62-2)。如前所述,本发明所包括的小分子化合物已经批准在人体上使用。药物甲氯芬那酸钠盐已被批准用于治疗疼痛,推荐剂量是约25mg/kg至约75mg/kg,通常剂量为约50mg/kg,每日施用4次,但可以增加剂量到约400mg/日。用于预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经元退行性变和神经元损失的甲氯芬那酸钠盐剂量可以基于用于治疗其他疾病的有效的非毒性剂量,根据需要来适当滴定。
在本发明的一个实施方案中,环氧合酶抑制剂可以用作预防与活性氧分子相关的神经元退行性变和神经元损失。环氧合酶抑制剂可以选自但并不局限于氟比洛芬、meclofenamide、吡罗昔康和吲哚美辛。除了具有抗炎症作用,其还具有止痛、退热和抑制血小板的作用。他们主要用于治疗慢性关节炎以及与疼痛和炎症相关的某些软组织疾病。NSAIDs通过抑制环氧合酶阻抑前列腺素合成而起作用,环氧合酶可以将花生四烯酸转化成作为前列腺素前体的内生环过氧化物。抑制前列腺素合成可以解释其止痛、退热和血小板抑制作用;其他的机制可以解释其抗炎症功效。某些NSAIDs也可以抑制脂氧合酶或磷脂酶C,或者调控T-细胞功能(AMA Drug Evaluations Annual,1994,1814-1815)。
特别重要的是甲氯芬那酸钠盐(Mylan,CAS No.644-62-2)。如前所述,本发明所包括的小分子化合物已经批准在人体上使用。药物甲氯芬那酸钠盐已被批准使用于疼痛的治疗,推荐剂量是约25mg/kg至约75mg/kg,通常剂量为约50mg/kg,每日施用4次,但可以增加剂量到约400mg/日。用于预防与活性氧分子相关的神经元退行性变和神经元损失的甲氯芬那酸钠盐剂量可以基于用于治疗其他疾病的有效的非毒性剂量,根据需要来适当滴定。
III.影响多聚谷氨酸延伸的分子
以下各类分子通过影响有聚集倾向的蛋白来预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经元退行性变和神经元损失。这些类型中所包括的分子可以影响具有多聚谷氨酸重复序列的蛋白。
a)叶酸合成抑制剂
在一个实施方案中,叶酸合成抑制剂可以用作预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经元退行性变和神经元损失。叶酸合成抑制剂可以选自但并不局限于磺胺药物,包括磺胺甲基异噁唑、磺胺嘧啶和磺胺多辛;氨苯砜;甲氧苄啶;二甲氧苄氨嘧啶;乙胺嘧啶;甲氨蝶呤;或其药物学可接受的盐。
特别重要的是磺胺米隆(CAS No.138-39-6;Prestwick文库化合物166),是具有SO2NH2结构的磺胺类药物的一个成员。这一类成员也称为"磺胺药”,是磺胺的衍生物,在微生物体内作为叶酸合成的抑制剂,具有细菌抑制活性。如前所述,本发明所包括的小分子化合物已经批准在人体上使用。药物磺胺米隆已批准用作抗菌药,推荐的剂量为第一次剂量约500mg/kg,之后每六小时约250mg/kg,根据需要施用7天。用于预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的磺胺米隆剂量可以基于用于治疗其他疾病的有效的非毒性剂量,根据需要来适当滴定。
b)局部麻醉剂(Na+通道阻断剂)
在一个实施方案中,钠通道阻断剂可以用作预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经元退行性变和神经元损失。钠通道阻断剂可以选自但并不限于利多卡因(lidocaine)、盐酸达克罗宁(dyclonine HCl)、美西律(mexilitine)、苯妥英(phenytoin)、氯氨酮(ketamine)、氟卡胺(flecainide)、金刚烷胺(amantadine)、或其药物学可接受的盐。
特别重要的是盐酸达克罗宁(AstraZeneca,DE,CAS No.586-60-7)。盐酸达克罗宁是局部麻醉剂,当以适当浓度施加于局部神经组织时可以阻抑神经传导。达克罗宁可作用于神经系统的任何位置和任何类型的神经纤维。当这些麻醉剂接触到神经干时,可以引起神经支配区的感受性和运动性麻痹。他们的作用是完全可逆的(参见Gilman AG,et.al.,Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics,8thed)。几乎所有的局部麻醉剂都是通过降低电压门控钠离子通道的活化电势而发挥作用。如前所述,本发明所包括的小分子化合物已经批准在人体上使用。药物盐酸达克罗宁被批准用作局部麻醉剂,推荐的剂量为每两小时约2-3mg/kg。用于预防与蛋白错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的盐酸达克罗宁剂量可以基于用于治疗其他疾病的有效的非毒性剂量,根据需要来适当滴定。
在本发明的另一个实施方案中,钠通道阻断剂可以用作预防与活性氧分子相关的神经元退行性变和神经元损失。钠通道阻断剂可以选自但并不局限于利多卡因、盐酸达克罗宁、美西律、苯妥英、氯氨酮、氟卡胺和金刚烷胺,他们通常用作局部麻醉剂。当这些麻醉剂接触到神经干时,可以引起神经支配区的感受性和运动性麻痹。他们的作用是完全可逆的(参见Gilman AG,et.al.,Goodman and Gilman′s The PharmacologicalBasis of Therapeutics,8th ed)。
特别重要的是盐酸利多卡因(Alphacain HCl/anestacon/xylocaine,Astrazeneca,CAS No.137-58-6;Prestwick Library compound 50)。利多卡因是局部麻醉剂,当以适当浓度用在局部的神经组织时可以阻抑神经传导。利多卡因可作用于神经系统的任何位置和任何类型的神经纤维。如前所述,本发明所包括的小分子化合物已经批准在人体上使用。利多卡因被批准用作局部麻醉剂,推荐的剂量为约1mg/kg至约50mg/kg,更常见用量是约5mg/kg至约35mg/kg,最常见的用量是约10mg/kg至约20mg/kg。用于预防与活性氧分子相关的神经退行性变和神经元损失的盐酸利多卡因剂量可以基于用于治疗其他疾病的有效的非毒性剂量,根据需要来适当滴定。
表2:Prestwick文库初筛鉴定得到的,具有对与蛋白错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失有作用的化合物。
定量结构-活性相关(Quantiative Structure-Activity Relationship,QSAR)方法可用于量化化合物的化学结构和其生物学活性之间的关系。每一种化合物类型可通过一个或多个技术来定性或定级其广谱功效,这些技术包括结构-活性相关(structure acitivity,SAR)和/或定量结构-活性相关(QSAR)方法,其鉴定与某类型化合物相关的一个或多个结构所联系的一个或多个活性。这些化合物类型的每个都可以根据以下的因素如合成性、适应性、专一性、活性、毒性和/或新陈代谢来排定优先次序。在本案中,可以测定和分析每个特定化合物类型中所有或附加的化合物。由于一些类型的化合物十分庞大,可测定和分析这类化合物中的亚类并且如果该类继续表现出预计水平的额外功效,则将继续测定剩余的成员。本方法也可鉴定用于本发明的化合物的功能类似物和化合物类型。功能类似物的活性再通过使用秀丽隐杆线虫模型筛选蛋白聚集的作用来予以确认。
除了上述特别重要的化合物,其他相关的包括在Prestwick文库中的化合物已经在上述化学类别中进行了鉴定。表3列出了这些化合物。
表3.来自Prestwick文库的相关化合物
目标/靶化合物 | 来自Prestwick文库的相关化合物 |
拓扑异构酶II抑制剂 | 238:洛美沙星;C17H20ClF2N3O3780:西诺沙星;C12H10N2O5 |
细菌转肽酶抑制剂 | 114:氨苄青霉素钠盐;C16H18N3NaO4S186:氯唑西林钠盐;C19H17ClN3NaO5S755:哌拉西林钠盐;C23H26N5NaO7S357:阿莫西林;C16H19N3O5S434:头孢羟氨苄;C16H17N3O5S450:Dicloxyacillin钠盐;C19H16Cl2N3NaO5S703:羧苄青霉素钠盐;C17H16N2Na2O6S |
钙通道抑制剂 | 134:盐酸地尔硫卓;C22H27ClN2O4S |
环氧合酶抑制剂 | 45:萘普生;C14H14O3203:柳珊瑚酸;C14H10F3NO2205:托芬那酸;C14H12ClNO2218:芬布芬;C16H14O3219:酮洛芬;C16H14O3533:非那西丁;C10H13NO2713:安乃近;C13H16N3NaO4S |
叶酸合成酶抑制剂 | 14:乙酰磺胺钠;C8H11N2NaO4S23:磺胺嘧啶;C10N10N4O2S |
10:磺胺胍;C7H10N4O2S16:磺胺噻唑;C9H9N3O2S2177:磺胺甲噁唑;C10H11N3O3S711:磺胺苯酰;C13H12N2O3S | |
钠通道抑制剂 | 264:盐酸达克罗宁;C18H28ClNO249:盐酸Amyleine;C14H22ClNO276:二丁卡因;C20H29N3O2312:二盐酸氟桂嗪;C26H23C12F2N241:;普鲁卡因;C13H21ClN2O2199:盐酸丙胺卡因;C13H21ClN2O241:盐酸Mexiletine;C11H18ClNO266:达舒宁;C21H29N3O409:盐酸胺碘酮;C25H30ClI2NO358:奥西卡因;C28H41N3O3305:盐酸布比卡因;C18H29ClN2O57:盐酸苯噁洛芬;C17H29ClN2O |
将表3中所列的化合物在秀丽隐杆线虫中进行了初次筛选分析。发现一定数量的化合物尽管在初次筛选过程中不具有显著的作用,但阻止与蛋白质错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失。该数据显示在实施例1中。其他体外和体内筛选分析是本领域内已知的,其用于筛选这些药物以确证从初次和二次筛选中得到的结果。从初次筛选得到的阴性结果会在使用不同的分析中产生阳性作用。其他蛋白质错折叠和聚集的分析包括动态光散射分析(Li et al.,FASEB J.,2004,ePub;Kaylor etal.,J MoI Biol,2005,353:357-372)、沉降速度分析(MacRaild et al.,/BiolChem,2004,2779:21038-21045)和酵母聚集分析(Outeiro et al.,Science,2003,302:1772),尽管还有其他分析是本领域已知的并可以用于这些目的。
同样,可使用这些蛋白质错折叠/聚集分析中的任何分析来筛选确定的药物类型中的相关化合物和功能类似物或者使用QSAR鉴定的那些化合物,以确定阻止与蛋白质错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的活性。对于阻止与蛋白质错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的作用,可使用高通量筛选技术筛选在初次秀丽隐杆线虫筛选中鉴定的药物的变体。也可使用计算机辅助药物设计/计算机建模方法来鉴定化学变体,以对与蛋白质错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的作用来筛选所述化学变体。
计算机建模技术可使所选分子的三维原子结构可视化并合理设计与该分子相互作用的新化合物。这些方法提供了发现小分子化合物的功能类似物的途径,已知所述小分子化合物具有与蛋白质错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失作用。对化合物在结合到靶蛋白时代三维结构的分析可以鉴定相互作用位点,所述相互作用位点其后被用于鉴定那些可能具有相似结合特性的相似化合物和功能类似物。所述三维构建体一般依赖所选择分子的X射线晶体分析或NMR成像的数据。该分子动力学需要力场数据。计算机图像系统使得预测一个新化合物如何连接到靶分子上成为可能,并且允许所述化合物和靶分子的结构的实验性操作,以得到完美结合特异性。当在分子-化合物之一或两者上产生小的改变时,对其相互作用将如何进行预测,需要分子力学软件和计算集约型计算机,所述计算机通常与分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面偶联。
另外,将表3中所列的一些化合物在秀丽隐杆线虫中进行了初次筛选分析。发现一定数量的化合物尽管在初次筛选过程中不具有显著的作用,但阻止与活性氧分子相关的神经退行性变和神经元损失。该数据显示在实施例2中。其他体外和体内筛选分析是本领域内已知的,其用于筛选这些药物以证实从初次和二次筛选中得到的结果。从初次筛选得到的阴性结果会在使用不同的神经保护分析中产生阳性作用。
同样,可使用任何神经退行性变的分析来筛选确定药物类型中的相关化合物和功能类似物或者使用QSAR鉴定的那些化合物,以确定阻止与活性氧分子相关的神经退行性变和神经元损失的活性。此类分析对本领域熟练的技术人员而言是已知的,并且包括体内和体外分析,其包括神经退行性变的细胞培养分析和转基因动物模型分析。对神经退行性变的作用,可使用高通量筛选技术筛选在初次秀丽隐杆线虫筛选中鉴定的药物的变体。也可使用计算机辅助药物设计/计算机建模方法来鉴定化学变体,以对与蛋白质错折叠和聚集相关的神经退行性变和神经元损失的作用来筛选所述化学变体。
计算机建模技术可使所选分子的三维原子结构可视化并合理设计与该分子相互作用的新化合物。这些方法提供了发现小分子化合物的功能类似物的途径,已知所述小分子化合物具有与活性氧分子相关的神经退行性变和神经元损失作用。对化合物在结合到靶蛋白时代三维结构的分析可以鉴定相互作用位点,所述相互作用位点其后被用于鉴定那些可能具有相似结合特性的相似化合物和功能类似物。所述三维构建体一般依赖所选择分子的X射线晶体分析或NMR成像的数据。该分子动力学需要力场数据。计算机图像系统使得预测一个新化合物如何连接到靶分子上成为可能,并且允许所述化合物和靶分子的结构的实验性操作,以得到完美结合特异性。当在分子-化合物之一或两者上产生小的改变时,对其相互作用将如何进行预测,需要分子力学软件和计算集约型计算机,所述计算机通常与分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面偶联。
分子建模系统的例子有CHARMm和QUANTA程序,olygenCorporation,Waltham,Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA程序执行分子结构建构、图形建模和分析。QUANTA运行分子与其他各分子作用行为的互动式建构、修饰、可视化和分析。
许多文章综述了与特定蛋白相互作用的药物的计算机建模(Schneiderand Fechner,Nat Rev Drug Discov.2005 Aug;4(8):649-63;Guner,IDrugs.2005Jul;8(7):567-72;and Hanai,Curr Med Chem.2005;12(5):501-25.)。其他筛选和图示化学物的计算机程序可从下述公司获得,如BioDesign,Inc.,Pasadena,Calif.,and Hypercube,Inc.,Cambridge,Ontario。尽管这些软件原本设计是用来应用对特定蛋白有特异性的药物,但它们也适合设计对DNA或RNA区域有特异性的药物,只要此区域已被鉴定。尽管上文参考设计和制造可改变结合的化合物已做了描述,但可用来筛选已知化合物,包括天然产物或合成的化学药品、生物活性物质包括蛋白,以得到抑制剂或活化因子化合物。使用这种方法鉴定的化合物的活性可通过使用秀丽隐杆线虫模型筛选蛋白聚集和神经保护来予以确认。
本发明另一方面,小分子化合物通过扭转蛋白依赖机制作用而阻止与活性氧分子相关的神经退行性变和神经元损失。可使用在本文中描述的方法鉴定小分子化合物,所述小分子化合物具有调控扭转蛋白的作用以保护神经元避免与活性氧分子相关的损伤的作用。所述化合物可以通过直接或间接相互作用调控扭转蛋白的作用。间接作用包括调控具有对torsion蛋白的下游作用的其他酶类或化学中间产物。在一个实施方式中,调控扭转蛋白作用的化合物包括美坦西林或其他细菌转肽酶抑制剂。
在本发明的一些实施方案中,所述组合物还可括至少一种活性氧分子清除剂。合适的活性氧分子清除剂包括辅酶Q、维生素E、维生素C、丙酮酸盐、褪黑素、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、谷氨酰胺(“GSH”)和硝酮。在一些实施方案中,至少一种活性氧分子清除剂在与小分子化合物的预防性施用组合而预防性地施用。
可使用广泛多种的施用途径或模式将本方法中可用的化合物或其药学可接受的盐递送至患者。合适的施用途径包括,但不局限于吸入、透皮、口服、直肠、透粘膜、肠内和肠道外施用,其中包括肌肉内,皮下和静脉内注射。
术语“药学可接受的盐”表示保留了用于本方法的化合物的生物学效力和特性的盐类,并且不具有生物学或其他不良性质。可以从无机和有机碱制备这些盐。从无机碱得到盐包括,但不局限于钠、钾、锂、氨、钙和镁盐。从有机碱得到的盐包括,但不局限于下列的盐:伯、仲和叔胺,包括天然取代胺的取代胺以及包括环胺,其包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、tromethanine、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、N-烷基葡萄糖胺(N-alkylglucamines)、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶和N-乙基哌啶(N-ethylpiperidine)。也应该理解其他羧酸衍生物可用于本方法的实施中,例如羧酸酰胺,包括羧酰胺、低烷基羧酰胺、二(低烷基)羧酰胺等等。
所述化合物或其药学可接受盐可单独施用、与其他化合物组合施用和/或与其他治疗试剂组合为混合物施用。当然,能够与本方法所述的化合物共同施用的治疗试剂的选择部分地依赖于所治疗的病症。
所述活性化合物(或其药学可接受的盐)本身可单独施用或以药学组合物的形式施用,其中所述活性化合物与一种或多种药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂形成预混合物或混合物。可以使用一种或多种药学可接受的载体,以常规的方式制作用于本发明的药学组合物,所述载体包括促进所述将活性化合物加工成药用制剂的赋形剂和助剂。合适的剂型依赖于所选择的施用途径。
对于注射,可将所述化合物制成含水溶液,优选地在生理耐受缓冲液例如汉克氏溶液、林格式溶液或生理盐缓冲液中。对于透粘膜施用,在制剂中使用对待渗透的屏障适用的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
对于口服施用,通过将所述活性化合物与本领域已知的药学可接受载体混合,可方便地配制该化合物。这些载体使本方法的化合物被制成药片、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、混悬液等,用于待治疗患者的口腔吸收。用于口服应用的药学制剂可以固体赋形剂的形式获得,优选地在添加合适的助剂后研磨所得混合物,如需要则加工该颗粒混合物以得到药片或糖衣丸的核心。合适的赋形剂尤其是填充剂,例如糖,其中包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇;纤维素制剂,例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)。如需要,可添加崩解剂,例如交联PVP、琼脂、藻朊酸或其盐(例如藻朊酸钠)。
可用合适的包膜提供糖衣丸核心。对于此目的,可使用浓缩的糖溶液,其可任选地包含阿拉伯胶、滑石、PVP、卡波普胶、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可向药片或糖衣丸包膜中添加染料或颜料以鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
对于口服施用,可将所述化合物制成持续释放的制剂。在下述引用文献中描述了用于制成持续释放制剂的多种方法——美国专利号4,891,223;6,004,582;5,397,574;5,419,917;5,458,005;5,458,887;5,458,888;5,472,708;6,106,862;6,103,263;6,099,862;6,099,859;6,096,340;6,077,541;5,916,595;5,837,379;5,834,023;5,885,616;5,456,921;5,603,956;5,512,297;5,399,362;5,399,359;5,399,358;5,725,883;5,773,025;6,110,498;5,952,004;5,912,013;5,897,876;5,824,638;5,464,633;5,422,123和4,839,177;以及WO 98/47491。
可口服使用的药学试剂包括由明胶制成的推入式胶囊(push-fitcapsules),以及由明胶和可塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的软的、密封胶囊。推入式胶囊可包含活性成分与填充剂(例如乳糖)、结合剂(例如淀粉)和/或润湿剂(例如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂预混合。在软胶囊中,可将所述活性化合物溶解或悬浮于合适的液体中,例如脂肪油、液体石蜡或液体PEG中。另外,可添加稳定剂。用于口服施用的所有制剂应当以适用于此施用方式的剂量。
对于口腔施用(buccal administration),所述化合物可采用以常规方式制成的药片或药锭的形式。
对于吸入施用,所述活性化合物可以以气雾喷剂的形式从压力包装或喷雾器中方便地递送,并使用合适的推进剂,例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。对于压力气雾剂,可通过提供泵以递送可测量的量来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的化合物的胶囊和药筒(如明胶)可制成包含所述化合物和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可制成所述化合物用于通过注射的肠道外施用,例如通过大丸剂注射或连续输液。注射用剂型可以是单位剂量形式,例如在安培瓶中或多剂量容器内,并具有添加的防腐剂。所述组合物可采用油性或水性载体内混悬液、溶液或乳化液的形式,并可以包含制剂用试剂,例如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠道外施用的药学制剂包括水溶性形式的所述活性化合物的水溶液。另外,可将所述活性化合物的混悬液制成合适的油性注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油、或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。水性注射混悬液包括增强该混悬液粘度的物质,例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地,所述混悬液有合适的稳定剂或增强所述化合物溶解度的试剂,以制备高浓缩溶液。
可选地,所述活性化合物可以是粉末的形式,以便在使用前与合适的载体如灭菌的无热源水组成。
可将所述化合物制成直肠组合物,例如栓剂或保留灌肠剂(retentionenemas),例如包含常规栓剂基质(例如可可脂或其他甘油酯)的化合物。
除了之前描述的剂型,可将所述化合物制成储存制剂(depotpreparatin)。可通过植入或跨皮递送(例如皮下或肌肉内)、肌肉内注射或透皮贴施用这样的长时程作用剂型。因此,例如,可将所述化合物与合适的多聚物或疏水材料(例如,可接受油中的乳化剂)或离子交换树脂一起配置,或配置成微溶衍生物(例如微溶盐)。
本发明的另一个实施方案涉及纳米颗粒。本文所描述的化合物可并入纳米颗粒。在本发明范围内的所述纳米颗粒是指包括表现出微观特性的单分子水平的颗粒以及那些颗粒的聚集。使用和制作上述纳米颗粒的方法可在本领域内找到(美国专利序号6,395,253;6,387,329;6,383,500;6,361,944;6,350,515;6,333,051;6,323,989;6,316,029;6,312,731;6,306,610;6,288,040;6,272,262;6,268,222;6,265,546;6,262,129;6,262,032;6,248,724;6,217,912;6,217,901;6,217,864;6,214,560;6,187,559;6,180,415;6,159,445;6,149,868;6,121,005;6,086,881;6,007,845;6,002,817;5,985,353;5,981,467;5,962,566;5,925,564;5,904,936;5,856,435;5,792,751;5,789,375;5,770,580;5,756,264;5,705,585;5,702,727和5,686,113)。
所述药学组合物也包括合适的固体或凝胶状态的载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的实例包括但不局限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和多聚物例如PEG。
适用于本发明的药学组合物包括组合物,其中所述活性成分以治疗性或预防性的有效量被包括在内,即以有效达到之前讨论的治疗性或预防性益处的量。当然,对特定施用有效的实际量尤其依赖所治疗的病症和施用的途径。对有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内,尤其是在学习了本文公开的内容之后。
可根据动物模型确定用于人类的治疗有效量。例如,可制成用于人类的剂量以达到在动物中发现有效的血液循环浓度。疼痛的有用动物模型是本领域已知的。
本领域技术人员不需要过多的实验,就能得出剂量计划——剂量水平和剂量频率的组合——对于在每一个定量给药时间内的特定时间段,其将产生基本上将该小分子化合物的血浆水平连续维持在所需的浓度范围内,并且因而使神经保护最大化。可通过使用持续释放药物递送系统来实现连续暴露,其中包括植入或肠道外聚合物或者缓释或脉冲释放的口服制剂。本领域技术人员已知也能通过使药物/制剂组合与剂量水平和给药时间表配合维持血浆暴露水平高于阈值水平。这些方法是本领域已知的,并有多种名称,其中包括"给药增加(dosing up)"或"给药至稳定状态(dosing to steady state)"。例如,可将在血浆中产生短半衰期药物水平的口服制剂配制成更高水平或更频繁给药以维持血浆水平在需要的阈值之上——这样的剂量或给药时间表的选择是基于该剂型的药代动力学的数学建模,其使用本领域技术人员已知的已发表的公式或计算方法或可购买的软件程序。另一个实例,导致高水平扩展的暴露的剂型可以更低频率的时间表给药,这样的剂量或给药时间表的选择是基于该剂型的药代动力学的数学建模,其使用本领域技术人员已知的已发表的公式或计算方法或可购买的软件程序。另一个实例,导致低水平扩展到暴露的剂型可使用更高频率的给药时间表来“给药增加”直到血浆水平显示或预计在定义的范围内,这样的剂量或给药时间表的选择是基于该剂型的药代动力学的数学建模,其使用本领域技术人员已知的已发表的公式或计算方法或可购买的软件程序。
本发明的组合物可预防性地施用至具有CNS受损风险而发展成神经退行性疾病的个体。在另一个实施方式中,本发明的组合物可在神经退行性疾病的遗传筛选导致阳性测试后施用至个体,当时所述个体仍处于无症状时,或者当时神经退行性疾病开始出现时的该疾病的发作时。本发明的组合物可施用一段时间,其中所述个体处于CNS受损或正发展为神经退行性疾病。在本文描述的任意方法中,尤其可以以有效量施用所述的组合物以预防神经退行性变。
在另一个实施方案中,在遭受脑外伤受损或缺血性损伤例如中风后将本发明的组合物立即施用于个体,其中继发于所述受损或缺血性损伤的因素——例如活性氧分子的形成——可导致继发性神经元损伤。所述化合物可在受损或缺血性损伤后施用至少大约3、9、18或24小时,或在受损或缺血性损伤后施用至少大约3、5、7、12或15天。也可使用更长时间的施用(持续至少一个月),其依赖于受损的程度。
在本发明的任何方法中,本文所描述的组合物以有效量施用以治疗或预防神经退行性变和神经元损失。所述组合物也可以以有效量施用以治疗或预防源于CNS受损或缺血性损伤的继发性损伤而导致的神经退行性变和神经元损失。所述化合物可施用足以缓解或减轻CNS受损或神经退行性疾病的症状的时间段。本文所描述的小分子化合物可保护多种神经元亚类型。这样的神经元亚类型包括但不局限于肾上腺素能、去甲肾上腺素能、血清素能、多巴胺能、胆碱能、GABA能、甘氨酸能、谷氨酸能和组氨酸能神经元。
在另一个实施方案中,可施用本文描述的化合物以调控分子伴侣蛋白(例如在扭转蛋白家族中的那些蛋白)的活性。这些方法具有与那些其中分子伴侣活性被破坏或恶化的疾病特别相关。特别重要的是施用化合物以治疗早发扭转蛋白肌张力障碍,其中扭转蛋白A中的突变破坏分子伴侣的活性并部分是与肌张力障碍相关的神经元功能障碍的原因。
也可施用所述化合物以调控神经递质转运蛋白的活性。这样的转运蛋白包括但不局限于多巴胺转运蛋白(DAT)、血清素转运蛋白、GABA转运蛋白、去甲肾上腺素转运蛋白、囊泡乙酰胆碱转运蛋白等。可利用扭转蛋白和神经递质转运蛋白的调控来为具有受损或死亡风险的神经元提供神经保护。
另一方面,所述小分子化合物通过依赖扭转蛋白的机制发挥作用以治疗或预防与蛋白质错折叠或聚集相关的神经退行性变和神经元损失。可使用本文所描述的方法鉴定小分子化合物,其具有调控扭转蛋白功能的作用以治疗或预防与蛋白质错折叠或聚集相关的神经退行性变和神经元损失。所述化合物可通过直接或间接的相互作用调控扭转蛋白的作用。间接作用包括调控另一个酶或化学中间产物,其具有对扭转蛋白的下游作用。在一个实施方案中,调控扭转蛋白的化合物包括美坦西林或其他的细菌转肽酶抑制剂。在另一个实施方式中,调控扭转蛋白的化合物包括萘啶酸或噁喹酸或其他拓扑异构酶II抑制剂。在另一个实施方式,所述化合物调控突变扭转蛋白用来治疗或预防与蛋白质错折叠或聚集相关的神经退行性变和神经元损失。在此特定的实施方案中,所述化合物包括钙离子通道拮抗剂,例如盐酸洛哌丁胺或环氧合酶抑制剂,例如一水甲氯酚那酸钠盐。
以下实施例作将对本发明做进一步说明,但同时不构成对本发明的任何限制。阅读本说明书之后,应当清晰地认识到,可诉诸于多种实施方式、修改及其等效方式,这些对本领域技术人员来说是不脱离本发明的精神的。
附图说明
图1提供了显示初次筛选Prestwick文库鉴定得到的候选药物的效果概略图。图1A显示了7种候选药物可以减少在神经退行性疾病的秀丽隐杆线虫模型中的蛋白错折叠和聚集的发生率,所述神经退行性疾病模型是由多聚谷氨酸聚集引起的。图1B显示了7种候选药物中的两个是通过扭转蛋白非依赖性机制直接作用于聚集的蛋白上。图1C现实了三种化合物是通过扭转蛋白依赖性机制起作用的。图1D显示了两种药物是作用于功能紊乱的扭转蛋白A扭转蛋白。化合物用Prestwick文库中的编码表示。
图2提供了显示初次筛选Prestwick文库得到每组药物中的功能相关化合物的功效的概略图。化合物用Prestwick文库中的编码表示。
图3A提供了显示从孵化到L2阶段施用药物时5种通过扭转蛋白依赖性机制发挥作用的候选化合物的预防性分析的结果的概略图。阴影线柱形表示在L3幼虫阶段的蛋白聚集的标准化的降低,实心的柱形表示在年轻成年阶段的蛋白聚集的标准化的降低。化合物用Prestwick文库中的编码表示。图3B显示了预防性分析的形式,其中包括药物暴露和取消以及聚集减少分析的时间。
图4A提供了显示从L2向前的阶段药物暴露时5种通过扭转蛋白依赖性机制发挥作用的候选化合物的校正分析的结果。阴影线的柱形表示了L3阶段蛋白聚集的标准化的降低,实心的柱形表示了在年轻成年阶段的蛋白聚集的标准化的降低。化合物用Prestwick文库中的编码表示。图4B显示了校正分析的形式,其中包括药物暴露和取消以及聚集减少分析的时间。
图5a提供显示三种候选化合物预防6-OHDA攻击造成的多巴胺能神经元损伤的结果概略图。化合物用Prestwick文库中的编码表示(50—盐酸利多卡因;206—甲氯芬那酸钠盐一水合物;235—美坦西林钠盐)。图5b提供了显示图5a中同样的化合物在扭转蛋白非依赖性模型中的结果概略图,显示了三种化合物中的两种可以通过扭转蛋白非依赖性机制保护多巴胺能神经元免受损伤。图5c和5d提供了显示美坦西林钠盐(Prestwick化合物235)通过扭转蛋白依赖性机制预防多巴胺能神经退行性变的概略图。美坦西林可以在表达野生型(wt)扭转蛋白A的转基因线虫中提供神经元保护作用。在6-OHDA攻击后,表达突变型扭转蛋白A(ΔE)的转基因线虫不能被美坦西林保护。
图6提供了显示磺胺米隆(Prestwick化合物66)和甲氯芬那酸钠盐一水合物(Prestwick化合物206)预防过量产生多巴胺造成的神经退行性变发生的结果。
图7提供了显示一组美坦西林钠盐(Prestwick化合物235)相关化合物在受6-OHDA攻击的秀丽隐杆线虫神经退行性变模型中预防神经退行性变的结果的概略图。
图8提供的概略图显示了野生型(wt)扭转蛋白A可以预防α-突触核蛋白(α-Syn)在秀丽隐杆线虫的多巴胺能神经元中过量表达所引起的多巴胺神经元的退化,然而突变型扭转蛋白A的神经元保护活性降低。
图9提供的概略图显示了从Prestwick文库得到的5种扭转蛋白A依赖性的化合物的扭转蛋白A特异性,这5种扭转蛋白A依赖性的化合物可以降低神经元退行性病变的秀丽隐杆线虫模型中蛋白错折叠和聚集的发生率。图9显示了5种Prestwick化合物中的3种可以特异性通过扭转蛋白A依赖机制作用于野生型(wt)扭转蛋白A从而提高多巴胺能神经元的存活。图9还显示了5种Prestwick化合物中的2种可以通过扭转蛋白A依赖机制特异性地作用于突变型扭转蛋白A从而提高多巴胺能神经元的存活。
具体实施方式
实施例
实施例1使用蛋白质错折叠和聚集的秀丽隐杆线虫模型筛选小分子
如Brenner(Brenner,Genetics,191 A,11:71-94)所述,将秀丽隐杆线虫培养于20℃的NGM平板上。将几个秀丽隐杆线虫系用做Prestwick小分子文库的初级筛选。一个转基因虫系表达Punc-54::Q82-GFP;其中有野生型(wild type,wt)(Punc-54::扭转蛋白A)或突变型(Punc-54::扭转蛋白A(ΔE))。扭转蛋白-A表达导致在荧光显微镜下可见的蛋白质聚集的表型。转基因线虫涂布在药物平板上,就可溶性蛋白恢复研究后代。
根据标准程序(Rand and Johnson,Methods Cell Biol,1995,48:187-204),通过将可溶性药物和线虫在其上生长的琼脂培养基混合来将药物施用至秀丽隐杆线虫。此施用模型使线虫连续爆楼于该药物。
每种药物首先溶解在合适的溶剂中,其后根据已经考虑好的药物溶剂体积将该药物添加至预先高压灭菌的培养基中。所有的药物以0.5mg/ml的初始浓度进行测试,其中一些对线虫有毒性,随后再以0.1mg/ml或0.025 mg/ml的浓度进行测试。每个平板接种100μl浓缩的大肠杆菌OP50细菌。
用于鉴定化合物的筛选分析使用蛋白质聚集数据来确定分子作用的特异性。所述筛选利用在模式动物系统秀丽隐杆线虫使用多聚谷氨酸扩展(polyglutamine expansions)的细胞分析。另外,扭转蛋白A以3中不同的方式包括于一些分析中:存在野生型扭转蛋白A、存在突变扭转蛋白A或存在野生型和突变扭转蛋白A两者(所有情况中都有多聚谷氨酸扩展)。以在蛋白质聚集中的统计学显著降低来筛选线虫。得到阳性结果的化合物被再次筛选,并根据分析的结果分类。聚集分析的方法在Caldwell et al.(Hum MoI Genetics,2003,12(3):307-319)中被描述。简单来说,使用装备有Endow GFP HYQ和Texas Red HYQ滤光体(Chroma Inc.)的尼康Eclipse E800荧光显微镜检查线虫。图像用Spot RI CCD照相机(Diagnostic Instruments Inc.)捕捉。使用MetaMorph软件(UniversalImaging Inc.)进行图像的假彩色化、图形重叠和聚集体积的量化。对于每一种经分析的虫系,通过在1000x放大倍率下,捕获30个L3期动物(对于Q82::GFP聚集)后部区域的所有聚集或30个成熟动物的所有聚集/日的图像来确定平均聚集体积。在MetaMorph软件系统中将像素区域转化为μm并直接下载到Excel电子表格中用于进一步分析。通过ANOVA使用Statistica(SPPS软件)进行平均体积的统计学分析。
为看到候选化合物在抑制蛋白质错折叠和聚集上的作用,将5个怀孕的线虫置于每个药物平板上,并在20℃生长大约3天。计数30个F1代L3期的线虫和年轻成熟期线虫作为聚集数。
为看到候选化合物在抑制蛋白质错折叠和聚集上的预防作用,将5个怀孕的线虫置于每个药物平板上,并在20℃生长大约3天。拣出35-40个F1代L2期的线虫并转移到具有与药物平板相同浓度的对照溶液的平板上。8小时候,计数30个L3期的线虫作为聚集数。32小时后,分析30个年轻成熟线虫。
为基于蛋白质聚集的标准化降低来计算药物在线虫上的特殊区域的成比例的效力,使用以下公式:
(A-B)/(A-C)x100%;其中
A=在溶剂对照平板上生长的线虫的聚集数量
B=整个生命期间生长在特异药物平板上的线虫的聚集数量
C=接受pre-L2暴露并其后转移到溶剂对照平板上的线虫的聚集数量
如果处理方式没有作用,则该数值等于0%。相反地,如果处理方式有效地在药物上饲养线虫完整一生,则该数值等于100%。
为知道候选药物化合物对蛋白质错误止跌和聚集的纠正作用,将5个怀孕的线虫置于溶剂对照平板上,并在20℃培养大约3天。拣出35-40个处于L2期的F1线虫病转移到药物平板上。8小时后,计数30个L3期线虫的聚集数量。32小时后,分析30个年轻成虫。
为基于蛋白质聚集的标准化降低来计算药物在线虫上的特殊区域的成比例的效力,使用以下公式:
(A-B)/(A-C)x100%;其中
A=在溶剂对照平板上生长的线虫的聚集数量
B=整个生命期间生长在特异药物平板上的线虫的聚集数量
C=从L2期(至成年)接受接触的线虫的聚集数量
如果处理方式没有作用,则该数值等于0%。相反地,如果处理方式有效地在药物上饲养线虫完整一生,则该数值等于100%。
结果
对文库的初次筛选鉴定了7个分子,其可再生地在含有Punc54::Q82::GFP+Punc-54::.扭转蛋白+Punc-54::扭转蛋白(ΔE)的线虫中降低蛋白质聚集。
为阐明小分子化合物作用的机制,使用在初次筛选中鉴定的所有药物来处理含有Punc.54::Q82::GFP但无任何扭转蛋白A表达的转基因线虫。在初次筛选中鉴定的7种化合物中,2种药物(磺胺米隆和盐酸达克罗宁)降低了蛋白质聚集的出现。这说明这两种药物通过扭转蛋白非依赖机制阻止了蛋白质错折叠和聚集,而且似乎是直接作用于多聚谷氨酸蛋白。
在存在表达转基因Punc-54::Q82::GFP+Punc-54::扭转蛋白A和单独wttorsionA的线虫时,涂布不单独直接作用于多聚谷氨酸的剩余的5个初次候选药物。3种初次筛选中鉴定的药物(萘啶酸、噁喹酸和美坦西林钠盐通过野生型扭转蛋白A减少了蛋白聚集。
在存在表达转基因Punc-54::Q82::GFP+Punc-54::扭转蛋白(ΔE)和单独突变torsionA的线虫时,涂布相同的不单独直接作用于多聚谷氨酸剩余5个初次候选药物。2种药物(洛哌丁胺盐酸盐和加氯芬那酸钠盐)通过作用于突变扭转蛋白A降低了聚集。这些数据集中显示在图1中。
对与5个通过扭转蛋白依赖扭转蛋白机制作用的分子具有相似的结构和作用机制的分子再次分析其蛋白质聚集的抑制。这些分子没有通过潜在治疗的第一轮分析,并且记载于上述表2中。
所有的分子由Preswick文库数字编码。在秀丽隐杆线虫聚集模型中的相关药物筛选产生了对蛋白质聚集形成的多种作用。这些数目显示在(图2)中。尽管一些受测试的化合物在此模型中未表现出对蛋白质错折叠的显著作用,但可能其他蛋白质错折叠/聚集分析可以显示出对蛋白质聚集的形成的作用。多次重复显示药候选药物阳性反应的实验以确证对蛋白质错折叠和聚集的作用。
当线虫从孵化到L2期都暴露于药物化合物时,从显示所有5个扭转蛋白特异性药物(萘啶酸、噁喹酸、美坦西林钠盐、盐酸洛哌丁胺、甲氯酚那酸)的抑制分析得到结果似乎是有利的。值得注意的是,线虫年龄越大(无论是否缺少暴露),药物的功效越强(图中的实柱)。这些结果显示在图3中。
当药物化合物直到发育的晚期才提供时,校正分析中的结果显示3种扭转蛋白特异药物(噁喹酸、美坦西林钠盐和盐酸洛哌丁胺)似乎是有利的。这些结果显示在图4中。
这些结果说明可以在此秀丽隐杆线虫模型中就抑制或校正蛋白质错折叠和聚集的作用筛选候选药物化合物文库。可使用该模型筛选更广泛种类的此类药物来鉴定具有抑制或校正蛋白质错折叠和聚集的作用的药物化合物。
实施例2从Preswick小分子文库鉴定的化合物对秀丽隐杆线虫中的多巴胺能神经元的神经保护
之前的研究确立了秀丽隐杆线虫中的“CEP”和“ADE”机械感受神经元在用多巴胺选择性神经毒素6-OHDA处理后,很容易发生可辨别的神经退化(Nass et al,2002)。通过活性氧分子的形成介导6-OHDA的毒性,其中活性氧分子的形成是通过非酶促自氧化过程产生的过氧化氢和过氧化基团(Kumar et al.,1995;Foley and Riederer,2000)。在暴露于6-OHDA后,秀丽隐杆线虫的多巴胺神经元表现出凋亡式细胞死亡的特征性剂量依赖模式,这被超微结构分析所证实(Nass et al.,2002)。此种退化可通过与绿色荧光蛋白的共表达而在活体动物中得到监视,并且被归类为3个时间和形态上可区分的时期,其中包括神经元过程发泡(neuronal processblebbing)、随着过程损失的细胞体呈圆形以及细胞体损失。这些特征性变化在数小时内以此顺序反复出现,其着重叙述在MPTP处理的猴和6-OHDA处理的大鼠中的观察结果,其中对纹状末端的损伤导致退行性的变化并先于SNpc细胞体的这种变化(Berger et al.,1991;Herkenham etal.,1991)。最近显示了扭转蛋白在6-OHDA介导的神经退行性变中的作用(Cao et al.,J Neurosci,25(1):3801-3812)。用多种浓度的6-OHDA处理动物,随着时间的过去,线虫的发育和成长,多巴胺GFP标记在这些透明动物中的共表达伴随神经退行性变。
如Brenner(Brenner,Genetics,1974,77:71-94)所描述的,将秀丽隐杆线虫培养于25℃的NGM平板上。使用2个转基因秀丽隐杆线虫系用于Prestwick小分子文库的初级筛选。一个转基因线虫系表达Pdat-1::GFP具有野生型(Pdat-1::扭转蛋白A)和突变型(Pdat-1-txlorsinACΔE))两者。扭转蛋白-A表达的表型产生6-OHDA处理后可见的神经退行性变。将转基因线虫涂布于药物平板上,并研究后代的秀丽隐杆线虫中的8个多巴胺能神经元的形态学变化。
根据标准程序(Rand and Johnson,Methods Cell Biol,1995,48:187-204),通过将可溶性药物与培养秀丽隐杆线虫的琼脂培养基混合来对秀丽隐杆线虫施用药物。这种施用模式使线虫持续暴露于药物。
首先将每种药物溶解在合适的溶剂中,其后将药物溶液添加到预先高压灭菌的培养基中,其中药物溶液的体积已经考虑好。在0.5mg/ml的起始浓度测试所有的药物,其中一部分对现场有毒并在0.1mg/ml或0.025mg/ml的浓度再测试。每个平板接种100μl浓缩的大肠杆菌OP50细菌。
通过用2%的氯化钠和0.5M的NaOH处理怀孕的成虫以分离胚胎来获得年龄同步的线虫(Lewis Fleming,1995)。将这些胚胎在25℃培养30小时。在L3期,用10mM(50mM)6-OHDA和2mM(or 10mM)抗坏血酸孵育幼虫1小时,并且每10分钟轻轻振动(Nass et al.,2002)。其后洗涤线虫并散布在接种细菌(OP50)的NGM平板上,在接触6-OHDA后从第2至第72小时内的时间点记录。
6-OHDA处理后立即在荧光解剖显微镜下,根据GFP的出现选择包含转基因的线虫,并将其转移到接种了OP50的新鲜NGM平板上。对于每一个时间点,将30-40个线虫施加到2%的琼脂糖板上并用3mM左咪唑固定。在装备了Endow GFP绿光体(Chroma Technology,Rockingham,VT)的尼康Eclipse E800落射荧光显微镜下检查线虫。为了便于分析,只记录线虫头部的4个CEP DA神经元。当所有4个神经元都存在并且线虫神经元过程完好时,该线虫被记录为“野生型”;当至少4个神经元树突或胞体中的一个如描述中的缺陷时,该线虫被记录为“树突起泡”、“胞体圆化”或“胞体损失”。这些实验重复3次。使用MetaMorph软件(Universal Imaging)驱动的Cool Snap CCD照相机(Photometries,Tucson,AZ)捕捉图像。
结果
表达突变和野生扭转蛋白两者的线虫具有50%的缺陷多巴胺神经元。对所述文库的初次筛选鉴定了3个分子,其可在包含Pdat-1::GFP+Pdat-1::扭转蛋白+Pdat-1::扭转蛋白(ΔE)的线虫暴露于6-OHDA后,可再生地降低多巴胺能神经退行性变(图5a)。
为阐明小分子化合物作用的机制,将所有在初级筛选中鉴定的药物与包含转基因而无任何扭转蛋白A表达的转基因线虫一起涂布。3种在初次筛选中鉴定的化合物中,2种药物盐酸利多卡因(50)和一水加氯芬那酸钠盐(206)降低了6-OHDA介导的神经退行性变(图5b)。此结果说明盐酸利多卡因和甲氯芬那酸钠一水合物通过扭转蛋白非依赖机制阻止神经退行性变。
为探索美坦西林钠盐(235)的作用机制,在6-OHDA侵入前,用美坦西林钠盐处理表达Pdat-1-扭转蛋白(编码wt扭转蛋白A)或Pdat-1::GFP+Pdat-1::扭转蛋白(ΔE)(编码突变扭转蛋白A)的2个转基因线虫虫系。只在表达wt扭转蛋白A的Pdat-1-GFP+Pdat-1::扭转蛋白A线虫中提供美坦西林钠盐的神经保护(图5c和5d)。这些结果说明美坦西林钠盐通过扭转蛋白在包含DA神经元中发挥作用。
这些结果共同证明可以以与活性氧分子相关的阻止神经退行性变的作用在此秀丽隐杆线虫中筛选候选药物化合物的文库。也可使用此模型筛选更广泛类型的这些药物,以鉴定其他具有与活性氧分子相关的阻止神经退行性变和神经元损失的作用的药物化合物。
实施例3在使用转基因秀丽隐杆线虫表达酪氨酸羟化酶的神经退行性变的模型中的神经元保护。
与野生型相比,过表达cat-2(酪氨酸羟化酶的线虫同源物)导致75%的转基因线虫中神经元内多巴胺产生升高和特征性的多巴胺能神经元损失(Cao et al.,J Neurosci,25(1):3801-3812)。尽管神经元退化依然存在,但共表达线虫或人扭转蛋白将多巴胺能神经元的损失降低到轻微的程度。这些实验的目的是确定Prestwick文库中的小分子化合物在另一个不同的神经退行性变秀丽隐杆线虫模型中的作用。
使用上文描述的相同方法培养线虫。表达Pdat-1-CAT-2的转基因线虫系表达在整合系中的所有发育阶段都产生可见的神经退行性变的表型,其中只有大约55%的7日龄动物保持了所有4个CEP神经元。使用此种神经保护模型的筛选试验证明2种化合物特别对过表达cat-2的多巴胺能神经元具有神经保护作用。化合物166(磺胺米隆)和206(加氯芬那酸钠盐)都表现出在转基因线虫中多巴胺能神经退行性变的标准降低的减少(图6)。这些结果也证明在神经退行性变模型中表现出很少至没有神经保护的化合物仍可以在不同的神经退行性变模型中产生阳性结果,其中假定通过不同的作用机制。化合物166是这种化合物的一个例子。
实施例4在神经退行性变的秀丽隐杆线虫模型中筛选与化合物235相关的分子
以在多种神经退行性变模型中的神经保护作用,再分析与初次筛选所鉴定的化合物具有相似和作用机制的Prestwick文库中的分子。这些分子列于上述表3中。
所有的分子用Prestwick文库号码编号。其中特别重要的是与美坦西林钠盐(化合物235)相关的化合物。美坦西林通过部分地调控扭转蛋白A蛋白的作用而具有神经保护作用(图5a-5d)。尽管没有观察到与肌张力障碍相关的神经元丢失,但涉及扭转蛋白依赖机制并且因此调节扭转蛋白活性的化合物与肌张力障碍治疗相关,其中据信缺陷突变扭转蛋白A的表达是与该失调相关的神经元功能障碍的原因。在秀丽隐杆线虫神经保护模型中筛选与美坦西林相关的化合物产生多种神经保护作用。这些数据显示在图7中。尽管一些被测试的化合物在此模型中未表现出对神经保护的显著作用,但可能其他神经保护分析可以证明对抑制神经元死亡和退化的作用。特别是,头孢羟氨苄和羧苄青霉素二钠盐(化合物434和703)显示出与化合物235相同程度的神经保护作用。化合物邻氯青霉素钠盐和羟氨苄青霉素(化合物186和357)也在此模型中表现出神经保护作用,虽然程度较小。反复重复多次对候选药物显示出阳性反应的实验以证实其神经保护作用。在此模型中显示出阳性反应的化合物易于以之前描述的(Pdat-1::GFP+Pdat-1::扭转蛋白A)和(Pdat-1::GFP+Pdat-1::扭转蛋白(ΔE))模型再次筛选,以鉴定是否所述作用也通过扭转蛋白依赖机制。
这些结果证明可以在此秀丽隐杆线虫模型中筛选候选药物化合物文库的神经保护作用。可使用此模型筛选广泛类型的药物(例如在表3中列出的其他类型)以鉴定其他具有神经保护作用的药物化合物。
实施例5在α-突触核蛋白毒性分析中扭转蛋白A相关的再确认
我们之前显示了扭转蛋白A能够抑制由于α-突触核蛋白在秀丽隐杆线虫的DA神经元中过表达导致的多巴胺(DA)神经元退化,而扭转蛋白(ΔE)的神经保护作用降低(Cao et al.,J Neurosci,2005,25(1):3801-3812)。特别地,只有26.1±5.3%表达Pdat-1::GFP+Pdat-1::α-突触核蛋白的线虫在第4天成虫时维持了所有的4个野生型CEP DA神经元,而表达Pdat-1::GFP+Pdat-1::α-突触核蛋白+Pdat-1::扭转蛋白A和Pdat-1::GFP+Pdat-1::α-突触核蛋白+Pdat-1-扭转蛋(ΔE)的线虫比例分别为57.3±1.6%和42.2±7.3%(Cao et al.,J Neurosci,2005,25(1):3801-3812)(图8)。
所有分子用Prestwick文库号码编号。从聚集分析中所鉴定的扭转蛋白A依赖化合物具有扭转蛋白A特异作用,并且因此可能在α-突触核蛋白毒性分析中以相同的方式发挥作用。将所有3个α-突触核蛋白转基因虫系暴露于5种trosinA依赖化合物,以确定它们的扭转蛋白A特异性(图9)。如所预料的,当扭转蛋白A表达缺失时,这些化合物中没有一个对扭转蛋白Pdat-1::GFP+Pdat-1::α-突触核蛋白有作用。相反地,美坦西林(化合物235)、萘啶酸(化合物187)和噁喹酸(化合物193)这3个野生型扭转蛋白A依赖化合物将野生型DA神经元在Pdat-1::GFP+Pdat-1::α-突触核蛋白+Pdat-1::扭转蛋白A中的存活分别增强了30.3±7%(p=0.013)、28.9±4.9%(p=0.005)和31.4±3.7%(p=0.002),而洛哌丁胺盐酸盐(144)和甲氯酚那酸(206)这两个扭转蛋白A(ΔE)依赖化合物未能显示出任何显著地神经保护。相反地,在Pdat-1::GFP+Pdat-1::α-突触核蛋白+Pdat-1::扭转蛋白(ΔE)线虫中,美坦西林、萘啶酸和噁喹酸未显示出显著地神经保护,而洛哌丁胺盐酸盐和甲氯酚那酸将DA神经元的存活增强了39.5±1.4%(p=0.001)和25±1.2%(p=0.002)。
这些结果证明使用秀丽隐杆线虫帕金森症模型的α-突触核蛋白毒性分析(参见Cao et al.,J Neurosci,2005,25(1):3801-3812)模拟了在帕金森症患者大脑中发现的α-突触核蛋白过表达的作用。在人类和线虫中,多巴胺神经元在年老期间响应α-突触核蛋白的倍增而随时间死亡。秀丽隐杆线虫帕金森证模型清楚地证明治疗能力直接与人类疾病状况相关并且对帕金森症研究中的几个不同模型系统交叉有效,而且进一步确立了简单的模型系统对研究甚至是复杂的神经退行性疾病是有用的(参见Cooper et al.,Science,2006,313:324-328)。
实施例6测试与每种扭转蛋白A依赖药物功能相似的化合物
功能相似分子的活性除了那些表3中所列的外,在包含Punc-54::Q82::GFP+Punc-54::扭转蛋白+Punc-54::扭转蛋白(ΔE)的神经保护秀丽隐杆线虫模型中进行了分析,以确定其中是否有与功能相似化合物相关的显著活性(表4)。
这些结果证明如表4中所示的其他功能相似化合物显示出显著的神经保护活性。可使用此模型筛选广泛类型的药物(例如在表3中列出的其他类型)以鉴定其他具有神经保护作用的药物化合物。
表4:功能相似的化合物的活性
化合物类型 | 功能相似化合物(药物名称) | P-值(显示显著性) |
喹诺酮类(拓扑异构酶II抑制剂) | ||
萘啶酸盐酸盐(Neggram) | p<0.001 | |
噁喹酸 | p<0.001 | |
氟哌酸(Noroxin) | p<0.001 | |
依诺沙星(Penetrex) | p<0.001 | |
β-内酰胺(细菌转肽酶) | ||
氨苄青霉素 | p<0.001 | |
巴氨西林(Spectrobid) | p=0.025 | |
美坦西林 | p<0.001 | |
环青霉素 | p=0.002 | |
邻氯青霉素 | p=0.002 | |
双氯青霉素钠盐 | p=0.055 |
羧苄青霉素 | p=0.003 | |
哌嗪青霉素钠盐 | p=0.004 | |
Ca2+拮抗剂 | ||
盐酸洛哌丁胺 | p<0.001 | |
硝苯吡啶 | p<0.001 | |
R-(+)BayK86443 | p=0.027 | |
盐酸地尔硫卓 | p=0.001 | |
抗炎症 | ||
甲氯芬那酸 | p<0.001 | |
萘普生 | p=0.019 | |
安乃近 | p=0.003 |
实施例7利多卡因和甲氯酚那酸通过不同的机制保护抵抗6-OHDA
为测试甲氯酚那酸或利多卡因是否能不依赖扭转蛋白A的功能而负调节DAT-1蛋白水平,我们使用了之前描述的转基因系Pdat-1::GFP::DAT-1(Cao et al.,J Neurosci,2005,25(1):3801-3812),其中在DA神经元特异启动子的控制下,dat-1的cDNA在读框内与gfp融合以产生GFP和DAT-1之间的融合蛋白。如通过检查转基因群落中的荧光密度和可视的GFP表达的普遍情况所示的,扭转蛋白A能够负调节GFP::DAT-I水平(Cao et al.,J Neurosci,2005,25(1):3801-3812)。
我们用甲氯酚那酸或利多卡因处理了Pdat-1::GFP::DAT-1,发现甲氯酚那酸将荧光强度从对照中的1970 A.U.减少到1740A.U.(p=0.029),而具有细胞体和神经元加工GFP两者的线虫比例从对照中的70%下降到44.7%(p=0.029)(表5)。利多卡因将Pdat-1::GFP::DAT-1中的荧光强度从对照中的1970A.U.减少到1612A.U.(p=0.002),而具有细胞体和神经元加工GFP两者的线虫比例从对照中的70%下降到30%(p=0.0007)(表5)。这些数据证明利多卡因和甲氯酚那酸两者能直接负调节DAT-1蛋白的水平。
为确定此结果不是由于非特异性的作用,我们以其对GFP::DAT-1水平的作用测试了来自Prestwick文库的、未显示出抗6-羟多巴胺(6-OHDA)神经保护的一种化合物(环匹罗司乙醇胺(ciclopiroxethanolamine))。与对照相比,环匹罗司乙醇胺没有显著的作用[荧光强度为1923A.U.(p=0.82)并且66.7%的线虫没有细胞体和神经元处理的GFP(p=0.71)](图5)。
为进一步检测甲氯酚那酸和利多卡因的神经保护作用,我们使用了我们之前描述(Cao et al.,J Neurosci,2005,25(1):3801-3812)的转基因系(Pdat-1-CAT-2)。过表达cat-2(酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因的秀丽隐杆线虫同源物)引起高水平的DA产生,并且作为结果观察到DA神经元退化(Cao et al.,J Neurosci,2005,25(1):3801-3812)。我们测试了Pdat-1::CAT-2中的利多卡因,其对CAT-2诱导的神经退行性变不具有显著的神经保护作用(-7.9%±5%,p=0.6),这说明所观察到的其针对6-OHDA的神经保护作用只是DAT-1水平负调节的结果。我们也测试了甲氯酚那酸是否能抑制CAT-2诱导的神经退行性变。显著地,其具有19±1.1%(p=0.002)的神经保护作用。因此,甲氯酚那酸可以保护神经元避免由多巴胺前体(酪氨酸羟化酶)过表达产生的退化。
这些结果证明利多卡因和甲氯酚那酸通过不同的机制针对神经毒素6-OHDA产生神经保护作用。
表5:在DA神经元内化合物对Pdat-1::GFP::DAT-1表达的作用
化合物 | 无(水对照) | 盐酸利多卡因a | 甲氯芬那酸钠盐a | 环匹罗司乙醇胺a |
细胞体的平均像素强度±SEM(A.U.) | 1970±80(n=69)b | 1612±78(n=57)b,c | 1740±64(n=48)b,c | 1923±85(n=64)b |
具有细胞体和树突/轴突GFP的神经元 | 70% | 30%d | 44.7%d | 66.7% |
只具有细胞体GFP的神经元 | 30% | 70%e | 51.1%e | 32.3% |
没有GFP的线虫 | 0% | 0% | 4.2% | 0% |
n代表从40-47个线虫/化合物暴露(参加脚注b)分析的细胞体的数量
a将利多卡因盐酸盐、甲氯酚那酸和环匹罗司乙醇胺分别以1.85mM、1.49mM和1.86mM溶解在水中。
b分析从每个株系中得来的40-47个线虫,其中以像素强度分析从每个线虫得来的1个或2个细胞体。
c表示从只接触溶剂或接触环匹罗司乙醇胺的Pdat-1::GFP::DAT-1线虫得来的细胞体的像素强度与接触多卡因盐酸盐(p=0.002)或甲氯酚那酸(p=0.029)的线虫显著不同。
d与只接触溶剂或环匹罗司乙醇胺的线虫相比,具有细胞体和树突/轴突GFP的神经元的平均百分比在接触多卡因盐酸盐(p=0.007)或甲氯酚那酸(p=0.029)的线虫中被显著降低了。
e与只接触溶剂或环匹罗司乙醇胺的线虫相比,只具有细胞体GFP的神经元的平均百分比在接触多卡因盐酸盐或甲氯酚那酸的线虫中被显著降低了。
在本说明书中提到的所有文件通过引用并入本文。
对本发明所描述的实施方式做多种修改和变化,对本领域技术人员是显而易见的,并且未脱离本发明的范围和精神。尽管根据特别优选的实施方式描述了本发明,但应当理解不应将所要求保护的本发明不适当地局限于这些特别实施方式中。实际上,对所描述的实施本发明的方式所做的多种修改,对本领域技术人员是显见的,并涵盖于本发明的范围内。
Claims (48)
1.预防与蛋白质错折叠或聚集相关的神经退行性变和神经元损失的方法,其通过对需要治疗的哺乳动物施用包括有效量的小分子化合物的组合物,用于预防与蛋白质错折叠或聚集相关的神经退行性变和神经元损失,其中所述小分子化合物具有预防与蛋白质错折叠或聚集相关的神经退行性变和神经元损失的作用,并且
其中所述小分子化合物包括拓扑异构酶II抑制剂、细菌转肽酶抑制剂、钙离子通道拮抗剂、环氧合酶抑制剂、叶酸合成抑制剂或钠通道阻断剂及其功能类似物。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述拓扑异构酶II抑制剂包括洛美沙星、西诺沙星、安吖啶、依托泊苷、替尼泊苷、噁喹酸、萘啶酸、苏拉明、美巴龙、金雀异黄素、盐酸表阿霉素、玫瑰树碱、阿霉素、金黄三羧酸、或其药物学可接受的盐。
3.如权利要求2所述的方法,其中所述拓扑异构酶II抑制剂包括噁喹酸或萘啶酸。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述噁喹酸以约10mg/kg至约40mg/kg的剂量施用。
5.如权利要求3所述的方法,其中所述萘啶酸以约1g/天至约5g/天的剂量施用。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述细菌转肽酶抑制剂包括氨苄青霉素、氯唑西林、哌拉西林、阿莫西林、头孢羟氨苄、双氯西林、羧苄青霉素、青霉素、美坦西林、阿莫西林、头孢西丁、或其药物学可接受的盐。
7.如权利要求6所述的方法,其中所述细菌转肽酶抑制剂包括美坦西林。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述美坦西林以每8小时约250mg/kg至约500mg/kg的剂量施用。
9.如权利要求1所述的方法,其中所述钙通道阻断剂包括尼莫地平、二丙维林、维拉帕米、尼群地平、地尔硫卓、米氟嗪、洛哌丁胺、氟桂嗪、苄普地尔、利多氟嗪、CERM-196、R-58735、R-56865、雷诺嗪、尼索地平、尼卡地平、PN200-1 10、非洛地平、氨氯地平、R-(-)-202-791或R-(+)Bay K-8644、或其药物学上可接受的盐。
10.如权利要求9所述的方法,其中所述钙通道阻断剂包括洛哌丁胺。
11.如权利要求10所述的方法,其中所述洛哌丁胺以约1mg/kg至约5mg/kg的剂量施用。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述环氧合酶抑制剂包括萘普生、柳珊瑚酸、邻甲氯酚那酸、芬布芬、酮洛芬、非那西丁、安乃近、氟比洛芬、meclofenamide、吡罗昔康、吲哚美辛或其药物学可接受的盐。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述环氧合酶抑制剂包括meclofenamide。
14.如权利要求13所述的方法,其中所述meclofenamide以约25mg/kg至约75mg/kg的剂量施用。
15.如权利要求1所述的方法,其中所述叶酸合成抑制剂包括磺胺药物、氨苯砜、甲氧苄啶、二甲氧苄氨嘧啶、乙胺嘧啶、甲氨蝶呤、或其药物学可接受的盐。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述叶酸合成抑制剂包括磺胺米隆。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述磺胺米隆以每6小时约250mg/kg至约750mg/kg的剂量施用。
18.如权利要求1所述的方法,其中所述钠通道阻断剂包括利多卡因、盐酸达克罗宁、美西律、苯妥英、氯氨酮、氟卡胺、金刚烷胺、或其药物学可接受的盐。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述钠通道阻断剂包括盐酸达克罗宁。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述盐酸达克罗宁以每2小时约2mg/kg至约3mg/kg的剂量施用。
21.如权利要求1所述的方法,其中所述的小分子化合物通过吸入、透皮、口服、直肠、透粘膜、肠内或胃肠外途径施用。
22.如权利要求1所述的方法,其中在与蛋白质错折叠或聚集相关的神经退行性变和神经元损失发作之后,将所述的小分子化合物施用于哺乳动物。
23.如权利要求1所述的方法,其中所述小分子化合物调控扭转蛋白的活性。
24.如权利要求23所述的方法,其中所述小分子化合物调控野生型扭转蛋白A的活性。
25.如权利要求23所述的方法,其中所述小分子化合物调控突变型扭转蛋白A的活性。
26.如权利要求1所述的方法,其中所述蛋白质错折叠或聚集与神经退行性疾病相关,所述神经退行性疾病包括肌萎缩侧束硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒疾病、多聚谷氨酸扩张性疾病、脊髓小脑性共济失调;脊髓和延髓肌萎缩、传染性海绵状脑病、tau蛋白病、亨廷顿氏病或肌张力障碍。
27.预防与活性氧分子相关的神经退行性变和神经元损失的方法,其通过对需要治疗的哺乳动物施用包括有效量的小分子化合物的组合物,用于预防与活性氧分子相关的神经退行性变和神经元损失,其中所述小分子化合物具有预防与活性氧分子相关的神经退行性变和神经元损失的作用,并且
其中所述小分子化合物包括拓扑异构酶II抑制剂、细菌转肽酶抑制剂、钙离子通道拮抗剂、环氧合酶抑制剂、叶酸合成抑制剂或钠通道阻断剂及其功能类似物。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述叶酸合成抑制剂包括盐酸磺胺米隆、乙酰磺胺钠水合物、磺胺嘧啶、磺胺胍、磺胺噻唑、磺胺甲噁唑、磺胺苯酰、或其药物学可接受的盐。
29.如权利要求28所述的方法,其中所述叶酸合成抑制剂包括磺胺米隆。
30.如权利要求29所述的方法,其中所述磺胺米隆以约250mg/kg至约500mg/kg的剂量施用。
31.如权利要求27所述的方法,其中所述钠通道阻断剂包括利多卡因、盐酸达克罗宁、美西律、苯妥英、氯氨酮、氟卡胺、金刚烷胺、或其药物学可接受的盐。
32.如权利要求31所述的方法,其中所述钠通道阻断剂包括利多卡因。
33.如权利要求32所述的方法,其中所述利多卡因以1mg/kg至约50mg/kg的剂量施用。
34.如权利要求27所述的方法,其中所述环氧合酶抑制剂包括氟比洛芬、meclofenamide、吡罗昔康、吲哚美辛或其药物学可接受的盐。
35.如权利要求34的方法,其中所述环氧合酶抑制剂包括meclofenamide。
36.如权利要求35所述的方法,其中所述meclofenamide以约25mg/kg至约75mg/kg的剂量施用。
37.如权利要求27所述的方法,其中所述细菌转肽酶抑制剂包括氨苄青霉素、青霉素、头孢羟氨苄、阿莫西林、哌拉西林、邻氯青霉素、羧苄青霉素、美坦西林、双氯西林、头孢西丁、或其药物学可接受的盐。
38.如权利要求37所述的方法,其中所述细菌转肽酶抑制剂包括美坦西林。
39.如权利要求38所述的方法,其中所述美坦西林以每8小时约250mg/kg至约500mg/kg的剂量施用。
40.如权利要求27所述的方法,其中所述的小分子化合物通过吸入、透皮、口服、直肠、透粘膜、肠内或胃肠外途径施用。
41.如权利要求27所述的方法,其中所述活性氧分子与神经退行性疾病相关,所述神经退行性疾病包括肌萎缩侧束硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒疾病、多聚谷氨酸扩张性疾病、脊髓小脑性共济失调、脊髓和延髓肌萎缩、传染性海绵状脑病、tau蛋白病、亨廷顿氏病或肌张力障碍。
42.如权利要求27所述的方法,其中所述小分子化合物还包括活性氧分子清除剂或至少一种神经营养因子。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述活性氧分子的清除剂包括辅酶Q、维生素E、维生素C、丙酮酸盐、褪黑素、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、谷氨酰胺和硝酮。
44.如权利要求27所述的方法,其中在与活性氧分子相关的神经退行性变和神经元损失发作之后,将所述的小分子化合物施用于哺乳动物。
45.如权利要求27所述的方法,其中所述小分子化合物调控扭转蛋白的神经保护活性。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述小分子化合物间接调控扭转蛋白的神经保护活性。
47.如权利要求27所述的方法,其中所述神经元表达酪氨酸羟化酶。
48.如权利要求47所述的方法,其中所述神经元是多巴胺能的。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US73876105P | 2005-11-21 | 2005-11-21 | |
US60/738,761 | 2005-11-21 | ||
US60/749,910 | 2005-12-12 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101365451A true CN101365451A (zh) | 2009-02-11 |
Family
ID=40391396
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2006800419288A Pending CN101365451A (zh) | 2005-11-21 | 2006-11-21 | 使用小分子化合物用于神经保护的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101365451A (zh) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012117073A3 (en) * | 2011-03-01 | 2013-01-10 | Pharnext | New compositions for treating neurological disorders |
CN103249878A (zh) * | 2010-08-23 | 2013-08-14 | Irm有限责任公司,特拉华有限责任公司 | 机械激活的阳离子通道 |
CN105796540A (zh) * | 2016-03-18 | 2016-07-27 | 沈阳药科大学 | 托芬那酸在制备治疗亨廷顿氏症药物中的应用 |
CN108057033A (zh) * | 2011-03-01 | 2018-05-22 | 法耐斯特公司 | 用于治疗肌萎缩性侧索硬化症的新组合物 |
US10342768B2 (en) | 2014-08-29 | 2019-07-09 | Pharnext | Therapeutic approaches for treating Parkinson's disease |
US10434109B2 (en) | 2011-03-01 | 2019-10-08 | Pharnext | Compositions for treating neurological disorders |
US10682342B2 (en) | 2011-03-01 | 2020-06-16 | Pharnext | Compositions for treating amyotrophic lateral sclerosis |
CN114794029A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-07-29 | 上海大学 | 一种计数秀丽隐杆线虫子宫内发育胚胎数目的方法 |
WO2023092464A1 (zh) * | 2021-11-26 | 2023-06-01 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 玫瑰树碱及其可药用盐在抑制Mcl-1中的应用 |
-
2006
- 2006-11-21 CN CNA2006800419288A patent/CN101365451A/zh active Pending
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103249878A (zh) * | 2010-08-23 | 2013-08-14 | Irm有限责任公司,特拉华有限责任公司 | 机械激活的阳离子通道 |
WO2012117073A3 (en) * | 2011-03-01 | 2013-01-10 | Pharnext | New compositions for treating neurological disorders |
CN108057033A (zh) * | 2011-03-01 | 2018-05-22 | 法耐斯特公司 | 用于治疗肌萎缩性侧索硬化症的新组合物 |
EA032881B1 (ru) * | 2011-03-01 | 2019-07-31 | Фарнекст | Применение торасемида для лечения болезни альцгеймера или родственного болезни альцгеймера расстройства или травмы спинного мозга |
US10434109B2 (en) | 2011-03-01 | 2019-10-08 | Pharnext | Compositions for treating neurological disorders |
US10682342B2 (en) | 2011-03-01 | 2020-06-16 | Pharnext | Compositions for treating amyotrophic lateral sclerosis |
US10342768B2 (en) | 2014-08-29 | 2019-07-09 | Pharnext | Therapeutic approaches for treating Parkinson's disease |
CN105796540A (zh) * | 2016-03-18 | 2016-07-27 | 沈阳药科大学 | 托芬那酸在制备治疗亨廷顿氏症药物中的应用 |
WO2023092464A1 (zh) * | 2021-11-26 | 2023-06-01 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 玫瑰树碱及其可药用盐在抑制Mcl-1中的应用 |
CN114794029A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-07-29 | 上海大学 | 一种计数秀丽隐杆线虫子宫内发育胚胎数目的方法 |
CN114794029B (zh) * | 2022-06-09 | 2023-02-28 | 上海大学 | 一种计数秀丽隐杆线虫子宫内发育胚胎数目的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101365451A (zh) | 使用小分子化合物用于神经保护的方法 | |
US20070203079A1 (en) | Methods of using small molecule compounds for neuroprotection | |
Maia et al. | BACE-1 and γ-secretase as therapeutic targets for Alzheimer’s disease | |
CN100546977C (zh) | 抑制旋转异构酶的新化合物及其应用 | |
Convertino et al. | Pharmacological chaperones: design and development of new therapeutic strategies for the treatment of conformational diseases | |
Su et al. | Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models | |
Chen et al. | Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases | |
US8097645B2 (en) | Compounds for activating TGF-β signaling | |
Eissa et al. | Diphenylurea derivatives for combating methicillin-and vancomycin-resistant Staphylococcus aureus | |
JP2020059733A (ja) | ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性化剤及びその使用 | |
US20110081428A1 (en) | Use of thioflavin-like compounds to increase life span and/or health span | |
CN102036665A (zh) | 4-苯基丁酸钠(4pba)及其药学上可接受的盐的新颖用途 | |
CN105338812A (zh) | 苯并咪唑衍生物及其用途 | |
CN1300210A (zh) | 作为抗菌剂的异羟肟酸衍生物 | |
Lin et al. | Design, synthesis, and evaluation of amphiphilic sofalcone derivatives as potent Gram-positive antibacterial agents | |
JP2017535569A (ja) | イブジラスト及びリルゾールの併用及びその使用法 | |
Ahamad et al. | The emerging landscape of small-molecule therapeutics for the treatment of Huntington’s disease | |
US20200289482A1 (en) | Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators for treating autosomal dominant polycystic kidney disease | |
Varma et al. | High throughput screening for neurodegeneration and complex disease phenotypes | |
WO2007002497A1 (en) | Method of treating neurological disorders using clotrimazole and derivatives thereof | |
WO2022047212A1 (en) | Compositions and methods for treating neurodegenerative disorders | |
JP2019501972A (ja) | Tdp−43タンパク質症の治療のためのタクロリムス | |
Neri | Value of invertebrate genetics and biology to develop neuroprotective and preventive medicine in Huntington’s disease | |
EP2829536A1 (en) | 4-Nitro-5-dichloromethylpyrazol derivatives for the treatment of infectious diseases | |
US20190070174A1 (en) | Methods of treating neurodegenerative diseases |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090211 |