CN105744932B - 用于治疗神经障碍的包含托拉塞米和巴氯芬的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗与谷氨酸兴奋毒性和淀粉样蛋白β毒性相关的神经障碍的组合物和方法。更具体而言，本发明涉及多发性硬化、阿尔茨海默病、阿尔茨海默病相关疾病、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、神经性疼痛、酒精性神经病、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的新的组合疗法。

Description

用于治疗神经障碍的包含托拉塞米和巴氯芬的组合物

发明领域

本发明涉及用于治疗神经疾病和障碍的组合物和方法。更具体而言，本发明涉及用于此类疾病包括阿尔茨海默病及相关疾病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森氏病、神经病、酒精中毒、酒精戒断、亨廷顿氏病和脊髓损伤的新的组合疗法。

发明背景

阿尔茨海默病（AD）是特征在于记忆缺失连同可归因于皮层联络区的参与的言语障碍症（其中存在语言和语言理解损伤的言语病症）、运动障碍（在不存在运动或感知损伤的情况下协调和进行某些目的性运动和手势的失能）和失认症（识别对象、人、声音、形状或气味的能力）的原型皮质性痴呆（prototypic cortical dementia）。

AD目前是痴呆的最主要原因。其临床特征在于缓慢发展且使得晚期患者离不开床、失禁且依赖监护的认知功能的总体减退。平均诊断后9年发生死亡（5）。

AD的发病率随年龄显著增加。联合国人口预测估计超过80岁的人的数目到2050年将达到3.7亿。目前，估计50％的超过85岁龄的人患有AD。因此，50年内世界上将有超过1亿人患有痴呆。需要持续护理和其他服务的大量人口将严重影响医疗、财政和人力资源（6）。记忆损伤是疾病的早期特征且涉及情景记忆（对于今天白天（day-today）事件的记忆）。疾病晚期涉及语义记忆（对于口语和视觉含义的记忆）。AD的病理学标志包括含有β淀粉样蛋白(Abeta)的淀粉样蛋白斑、含有Tau的神经原纤维缠结(NFT)和神经元和突触功能障碍和损失（7-9）。最近十年，已提出了关于AD原因的两个主要假说：“淀粉样蛋白级联假说”，其认为神经变性过程是由淀粉样蛋白前体蛋白（APP）的异常加工引发的一系列事件（10），和“神经元细胞骨架退化假说”（11），其提出了细胞骨架改变是引发事件。解释AD进展的最广为接受的理论保留了淀粉样蛋白级联假说（12-14）且AD研究人员已主要聚焦于确定与Abeta蛋白相关的毒性根本的机制。微血管通透性和重建、异常血管发生和血脑屏障瓦解已被鉴定为造成淀粉样蛋白级联中的APP毒性的关键事件（15）。相反，由于基础和实践担心两者，Tau蛋白相比于淀粉样蛋白已受到少得多的来自制药工业的关注。此外，突触密度改变是比其他两者与认知缺损最相关的病理损害。

研究已揭示淀粉样蛋白病理学似乎以神经递质特异性方式发展，其中胆碱能末端表现出最易受攻击，其次为谷氨酸能末端且最后为GABA能末端（9）。谷氨酸是哺乳动物神经系统中最丰富的兴奋性神经递质。在病理学状况下，其在突触间隙中的异常积累导致谷氨酸受体活动过度（16）。突触间隙中谷氨酸的异常积累导致谷氨酸受体的活动过度，其导致病理学过程并最终导致神经细胞死亡。该过程即兴奋毒性通常在急性和慢性神经障碍过程中在神经组织中观察到。

正变得明显的是，兴奋毒性参与不同病因学的多种病症的发病，诸如：脊髓损伤、中风、创伤性脑损伤、听力损失、酒精中毒和酒精戒断、酒精性神经病变、或神经性疼痛以及神经变性疾病如多发性硬化、阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、帕金森病和亨廷顿氏病(17-19)。这些疾病有效治疗的开发仍是主要公共健康问题，这是由于它们的发生以及缺少根治疗法。

靶向该受体的多个位点的NMDAR拮抗剂已测试为抵消兴奋毒性。非竞争性NMDAR拮抗剂靶向离子通道孔，因此降低钙进入突触后神经元。它们中的一些达到批准状态。作为实例，美金刚（Memantine）目前被批准用于减轻严重的阿尔茨海默病。其在包括兴奋毒性要素的其他适应症中进行临床测试，诸如酒精依赖（II期）、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（III期）、与帕金森相关的痴呆（II期）、癫痫、亨廷顿氏病（IV期）、多发性硬化（IV期）、帕金森病（IV期）和外伤性脑损伤（IV期）。然而，该分子对于大多数阿尔茨海默病患者具有有限的益处，因为其仅具有不大的症状效果。限制兴奋毒性的另一手段在于抑制谷氨酸突触前释放。目前批准用于肌萎缩性脊髓侧索硬化症的利鲁唑在缺血和外伤性脑损伤模型中显示令人鼓舞的结果（20-23）。其目前在早期多发性硬化、帕金森病（未显示比安慰剂更好的结果）以及脊髓损伤的II期试验中测试。该药物在1995年达到用于治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症的罕见病药物状态并在1996年达到用于治疗亨廷顿氏病的罕见病药物状态。

WO2009/133128、WO2009/133141、WO2009/133142和WO2011/054759公开了可用于治疗神经障碍的组合物中的分子。

尽管该领域中活跃的研究，但仍存在对于神经障碍且具体是涉及谷氨酸和/或淀粉样蛋白β毒性的神经障碍的可选的或改进的有效疗法的需求。本发明提供了用于中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）的此类神经疾病的新的治疗。

发明概述

本方面的目标是提供用于治疗神经障碍的新的治疗方法。

本发明尤其是起源于由本发明人出人意料的发现，即单独的或组合的托拉塞米、曲美他嗪、美西律、溴隐亭、艾芬地尔和莫西沙星代表了用于治疗神经障碍的新的且有效的疗法。

本发明因此提供用于治疗神经障碍，尤其是AD及相关疾病、多发性硬化（MS）、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）、帕金森病（PD）、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、周围神经系统损伤、亨廷顿氏病（HD）和脊髓损伤的新颖组合物和方法。

更具体而言，本发明涉及用于治疗神经障碍的组合物，其包含至少托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、莫西沙星或溴隐亭，或其盐、前药、衍生物、持续释放制剂。

本发明的另一目标涉及组合物，其包含选自以下的至少一种第一化合物：托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、莫西沙星和溴隐亭，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物、或持续释放制剂，并组合至少一种与所述第一化合物不同的第二化合物，选自：磺胺异噁唑、甲巯咪唑、丙胺卡因、二羟丙茶碱、米帕林、甘珀酸、阿坎酸、氨基己酸、巴氯芬、卡麦角林、乙胺嗪、西那卡塞、桂利嗪、依普利酮、非诺多泮、来氟米特、左西孟旦、舒洛地特、特比萘芬、唑尼沙胺、依托咪酯、苯乙双胍、曲美他嗪、美西律、溴隐亭、艾芬地尔、托拉塞米、和莫西沙星，其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或持续释放制剂，用于同时、分开或顺序施用。

本发明的另一目标涉及用于治疗神经障碍的组合物，其包含选自以下的至少一种第一化合物：托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、莫西沙星和溴隐亭，其任何化学纯度的盐、前药、衍生物、或持续释放制剂，并组合至少一种与所述第一化合物不同的第二化合物，选自：磺胺异噁唑、甲巯咪唑、丙胺卡因、二羟丙茶碱、米帕林、甘珀酸、阿坎酸、氨基己酸、巴氯芬、卡麦角林、乙胺嗪、西那卡塞、桂利嗪、依普利酮、非诺多泮、来氟米特、左西孟旦、舒洛地特、特比萘芬、唑尼沙胺、依托咪酯、苯乙双胍、曲美他嗪、美西律、溴隐亭、艾芬地尔、托拉塞米、和莫西沙星，其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或持续释放制剂，用于同时、分开或顺序施用。

本发明还涉及组合物，其包含选自以下的至少一种第一化合物：托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、莫西沙星和溴隐亭，其任何化学纯度的盐、前药、衍生物、或持续释放制剂，并组合至少一种与所述第一化合物不同的第二化合物，选自：磺胺异噁唑、甲巯咪唑、丙胺卡因、二羟丙茶碱、米帕林、甘珀酸、阿坎酸、氨基己酸、巴氯芬、卡麦角林、乙胺嗪、西那卡塞、桂利嗪、依普利酮、非诺多泮、来氟米特、左西孟旦、舒洛地特、特比萘芬、唑尼沙胺、依托咪酯、苯乙双胍、曲美他嗪、美西律、溴隐亭、艾芬地尔、托拉塞米、和莫西沙星，其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或持续释放制剂，以及药学上可接受的赋形剂，用于同时、分开或顺序施用。

最优选的药物组合物包含1、2、3、4或5种不同的药物，甚至更优选2、3或4种。此外，上述药物组合物还可以用于与一种或几种额外的有利于患有神经障碍的主体的药物或治疗进一步组合。

本发明还涉及治疗神经障碍的方法，所述方法包括向有需要的主体施用上文公开的药物或组合物。

本发明的进一步目标涉及治疗神经障碍的方法，所述方法包括向有需要的主体同时、分开或顺序施用上文公开的药物组合。

本发明的进一步的目标涉及选自托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、溴隐亭和莫西沙星，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或持续释放制剂的至少一种化合物用于制备用于治疗神经障碍的药物的用途。

本发明的进一步目标涉及上文公开的药物组合用于制备用于治疗神经障碍的药物的用途。

本发明可用于处于任何疾病阶段的任何哺乳动物主体，尤其是人主体。

附图简述

对于图1-27,*: p<0.05: 与对照（无中毒）显著不同；"ns": 无显著作用(ANOVA +Dunnett’s 事后检验)

图1：所选的药物预处理对HBMEC中人Aβ_1-42损伤的作用A）用于药物筛选的实验模型的验证以10nM的VEGF预处理1小时显著保护毛细血管网免于此淀粉样蛋白损伤（相比于淀粉样蛋白中毒，+70%的毛细血管网）。中毒被分别以低至400nM和3.2nM剂量的托拉塞米（B）和溴隐亭（C）显著阻止，而对于更高和更低剂量未观察到作用或观察到较差的作用。 : p<0.05: 与淀粉样蛋白中毒显著不同。

图2：所选药物预处理在人Aβ_1-42毒性测定中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。A）用于药物筛选的实验模型的验证：1小时的雌二醇(150ng/ml)预处理显著保护神经元免于该淀粉样蛋白损伤(-70%), 其被认为是对于神经保护的正对照。对于所有实验，Aβ_1-42产生相比于媒介物处理的神经元的显著中毒。中毒被溴隐亭(40nM, -29%) (B)、曲美他嗪(40nM, -94%) (C)、艾芬地尔(600nM, -94%) (D)、美西律(3.2nM, -73%) (E)、莫西沙星(20nM, -63%) (F)显著阻止。注意对于其他药物浓度，对于更高或更低剂量未观察到作用或观察到更差的作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图3：巴氯芬和托拉塞米组合疗法对于β淀粉样蛋白中毒的HBMEC培养物中毛细血管网的总长度的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 2.5µM)相比于媒介物处理的细胞产生显著的中毒，40％以上。该中毒被巴氯芬和托拉塞米（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的巴氯芬（B）和托拉塞米（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图4：磺胺异噁唑和托拉塞米组合疗法对于β淀粉样蛋白中毒的HBMEC培养物中毛细血管网的总长度的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 2.5µM)相比于媒介物处理的细胞产生显著的中毒，40％以上。该中毒被磺胺异噁唑和托拉塞米（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的磺胺异噁唑（B）和托拉塞米（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图5：依普利酮和托拉塞米组合疗法对于β淀粉样蛋白中毒的HBMEC培养物中毛细血管网的总长度的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 2.5µM)相比于媒介物处理的细胞产生显著的中毒，40％以上。该中毒被依普利酮和托拉塞米（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的托拉塞米（B）和依普利酮（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图6：溴隐亭和磺胺异噁唑组合疗法对于β淀粉样蛋白中毒的HBMEC培养物中毛细血管网的总长度的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 2.5µM)相比于媒介物处理的细胞产生显著的中毒，40％以上。该中毒被溴隐亭和磺胺异噁唑（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的溴隐亭（B）和磺胺异噁唑（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图7：阿坎酸和艾芬地尔组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被阿坎酸和艾芬地尔（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的阿坎酸（B）和艾芬地尔（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图8：巴氯芬和美西律组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被巴氯芬和美西律（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的巴氯芬（B）和美西律（C）对中毒不具有显著作用。:p=0.051: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图9：巴氯芬和曲美他嗪组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被巴氯芬和曲美他嗪（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的巴氯芬（B）和曲美他嗪（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图10：西那卡塞和美西律组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被西那卡塞和美西律（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的西那卡塞（B）和美西律（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图11：桂利嗪和曲美他嗪组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被桂利嗪和曲美他嗪（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的桂利嗪（B）和曲美他嗪（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图12：曲美他嗪和唑尼沙胺组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被曲美他嗪和唑尼沙胺（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的曲美他嗪（B）和唑尼沙胺（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图13：特比萘芬和托拉塞米组合疗法对于β淀粉样蛋白中毒的HBMEC培养物中毛细血管网的总长度的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 2.5µM)相比于媒介物处理的细胞产生显著的中毒，40％以上。该中毒被特比萘芬和托拉塞米（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的特比萘芬（B）和托拉塞米（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图14：西那卡塞和美西律组合疗法对于β淀粉样蛋白中毒的HBMEC培养物中毛细血管网的总长度的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 2.5µM)相比于媒介物处理的细胞产生显著的中毒，40％以上。该中毒被西那卡塞和美西律（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的西那卡塞（B）和美西律（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图15：巴氯芬和托拉塞米组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被巴氯芬和托拉塞米的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的巴氯芬和托拉塞米对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图16：托拉塞米和磺胺异噁唑组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被磺胺异噁唑和托拉塞米（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的托拉塞米（B）和磺胺异噁唑（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图17：莫西沙星和曲美他嗪组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被莫西沙星和曲美他嗪的组合（A）显著阻止。莫西沙星的添加允许对于单独的曲美他嗪（C）观察到的作用的100％增加，而在相同浓度，单独的莫西沙星（B）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图18：莫西沙星和巴氯芬组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被莫西沙星和巴氯芬（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的莫西沙星（B）和巴氯芬（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图19：莫西沙星和西那卡塞组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被莫西沙星和西那卡塞（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的莫西沙星（B）和西那卡塞（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图20：莫西沙星和唑尼沙胺组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被莫西沙星和唑尼沙胺的组合（A）显著阻止。莫西沙星的添加允许对于单独的唑尼沙胺（C）观察到的作用的81%增加，而在相同浓度，单独的莫西沙星（B）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图21：莫西沙星和磺胺异噁唑组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被莫西沙星和磺胺异噁唑（A）的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的莫西沙星（B）和磺胺异噁唑（C）对中毒不具有显著作用。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图22：美西律（MEX）和艾芬地尔(IFN)组合疗法在人Aβ_1-42毒性中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)相比于媒介物处理的神经元产生显著的中毒。该中毒被美西律25.6 pM和艾芬地尔24 nM的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的美西律和艾芬地尔对中毒不具有显著作用。: p<0.0572: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图23：巴氯芬(BCL)和托拉塞米(TOR)组合疗法对于β淀粉样蛋白中毒的皮层神经元中神经突网络的总长度的作用。人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 2.5µM)相比于媒介物处理的细胞产生显著的中毒，15 %以上。该中毒被托拉塞米和巴氯芬的组合显著阻止；此外该组合允许神经突生长的增强。: p<0.05: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图24：西那卡塞和美西律组合疗法针对对神经元皮层细胞的谷氨酸毒性的作用。谷氨酸中毒被西那卡塞(64pM)和美西律(25.6pM)的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的西那卡塞和美西律对中毒不具有显著作用。: p<0.001, 与谷氨酸中毒显著不同；(ANOVA+ Dunnett 事后检验)。

图25：磺胺异噁唑和托拉塞米组合疗法针对对神经元皮层细胞的谷氨酸毒性的作用。谷氨酸中毒被磺胺异噁唑(6.8nM)和托拉塞米(400nM)的组合显著阻止，而在那些浓度，单独的磺胺异噁唑和托拉塞米对中毒不具有显著作用。: p<0.001, 与谷氨酸中毒显著不同；(ANOVA + Dunnett 事后检验)。

图26：托拉塞米(TOR)预处理在人Aβ_1-42毒性测定中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的作用。Aβ_1-42产生相比于媒介物处理的神经元的显著中毒。中毒被托拉塞米(200nM, -90%)显著阻止。: p<0.0001: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图27：阿坎酸及其衍生物高牛磺酸预处理在人Aβ_1-42毒性测定中对大鼠原代皮层细胞对LDH释放的比较。Aβ_1-42产生相比于媒介物处理的神经元的显著中毒。中毒被高牛磺酸和阿坎酸(99%, 8nM)同样显著的阻止。: p<0.0001: 与Aβ_1-42中毒显著不同。

图28：巴氯芬(BCL)和托拉塞米(TOR)组合疗法对于在毒性不存在的情况下培养的皮层神经元的神经突网络总长度的作用。当巴氯芬(400nM)和托拉塞米(80nM)组合添加在培养基中时，观察到神经突网络长度的增加；此外，该组合允许神经突生长的增强，而在那些浓度，单独的巴氯芬和托拉塞米对神经突网络长度不具有显著（ns）作用。* p<0.005，与对照显著不同。

图29：巴氯芬(BCL)和托拉塞米(TOR)组合在神经压伤后促进神经再生中的作用。A－当相比于假手术处理的动物（白色柱）或媒介物处理的动物，用巴氯芬-托拉塞米组合处理的经受神经损伤（神经压伤）的动物显示在神经压伤第7天和第30天刺激受伤的坐骨神经时显著更低的CMAP潜伏时间。B－当在神经压伤第7天或第30天相比于假手术处理的动物时，坐骨神经刺激时肌诱发电位信号的幅度在经历神经损伤的动物中显著更低。CMAP幅度的显著增加在神经损伤第30天对于用巴氯芬(3mg/kg)-托拉塞米(400µg/kg)（剂量3）每日两次（bid）处理的动物观察到。*p<0.05; **p<0.001; ***p<0.0001, 与媒介物处理的动物（黑色柱）显著不同。

发明详述

本发明提供用于治疗神经障碍的新的组合物。本发明公开了允许有效矫正此类疾病且可以用于患者治疗的药物或新颖的药物组合的用途。

本发明适合于治疗任何神经障碍，无论是中枢或周围的，尤其是其中涉及淀粉样蛋白或谷氨酸兴奋毒性的病症。此类病症的具体实例包括神经变性疾病诸如阿尔茨海默病及相关病症、多发性硬化（MS）、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）、帕金森病（PD）、亨廷顿氏病（HD）、或其他神经病症如神经病（例如酒精性神经病或神经性疼痛）、酒精中毒或酒精戒断和脊髓损伤。“神经病”指这样的病况，其中周围神经系统的神经损伤，这包括由遗传因素、炎性疾病、由化学物质包括药物（长春新碱、奥沙利铂、乙醇）或由对神经的直接物理创伤引起的周围神经系统的损伤。神经病的治疗还包括治疗神经性疼痛。

周围神经系统的损伤可以根据神经元创伤的阶段来分级。本发明适合于治疗分级从神经失用症（其中仅神经的信号传递能力受损的病况）、轴突断伤（损伤暗指对轴突的伤害，而不损伤神经周围的结缔组织）还有神经断伤（伤害轴突和周围组织两者的损伤）的神经损伤。

轴突中或周围组织中（作为髓磷脂）中的改变可以是遗传来源的。遗传性神经病的实例是所谓的Charcot-Marie-Tooth家族病。Charcot-Marie-Tooth病是进行性病症，其影响周围神经，所述周围神经由改变的一种或多种特定基因而得以区分。突变导致轴突（其传递神经冲动，和/或影响由Shwann细胞产生髓鞘）损伤，其涉及神经冲动传递速度。它们是CMT的若干类型（分类为临床特征的函数）和亚型（对应于遗传分类）。CMT类型为CMT1、CMT2、CMT3、CMT4、CMT5、CMT6、CMTDI、CMTRI、CMTX。相关的周围神经病例如为HNPP（易患压迫性麻痹的遗传性神经病）、严重脱髓鞘性神经病DSS（Dejerine–Sottas综合征）、CHN（先天性髓鞘形成不足神经病）。CMT1(脱髓鞘型)和CMT2（轴突型）占CMT患者的约70％。

本发明特别适合于治疗AD及相关病症。在本发明的上下文，术语“AD相关病症”包括AD型的老年性痴呆（SDAT）、Lewis体痴呆、血管性痴呆、轻度认知缺损（MCI）和年龄相关记忆障碍（AAMI）。

如本文所用，“治疗”包括由上述疾病或病症引起的或者是上述疾病或病症的原因的症状的治疗、防止、预防、延迟或降低。术语治疗具体包括疾病进展及相关症状的控制。在经治疗的主体中术语治疗具体包括i）针对由淀粉样蛋白β引起的毒性的保护，或所述毒性的降低或延迟，和/或ii）针对谷氨酸兴奋毒性的保护，或所述毒性的降低或延迟。术语治疗还指认知症状的改善或神经元细胞的保护。与神经病有关，术语治疗还包括神经再生，其涵盖髓鞘再生，新的神经元、神经胶质、轴突、髓鞘或突触的产生。

在本发明的上下文中，具体化合物命名意在包括不仅具体命名的分子，还包括任何纯度的其任何药学上可接受的盐、水合物、衍生物（例如酯、醚）、异构体、外消旋物、缀合物或前药。

如本文所用的术语“前药”指本发明的化合物的任何功能衍生物（或前体），其当施用于生物系统时，作为例如自发的化学反应、酶催化的化学反应、和/或代谢性化学反应的结果而产生所述化合物。前药通常是无活性的或者比所产生的药物活性更低，且可以例如用于改善药物的物理化学特性，以将药物靶向特定组织，以改善药物的药代动力学和药效动力学特性和/或以降低不期望的副作用。前药具体具有结构X-药物，其中X为惰性载体部分且药物为活性化合物，其中所述前药比药物活性更低且在体内药物从载体释放。一些可用于前药设计的常用官能团包括但不限于羧基、羟基、胺、磷酸酯/膦酸酯和羰基。经这些基团的修饰通常产生的前药包括但不限于酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺和磷酸酯。选择合适前药的具体技术指导是公知常识（24-28）。此外，前药的制备可以通过本领域技术人员已知的常规方法进行。可用于合成其他前药的方法描述于对该主题的大量综述(25; 29-35)中。例如，Arbaclofen Placarbil列于ChemID plus Advance数据库(http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/)且Arbaclofen Placarbil 是巴氯芬的熟知前药(36; 43)。

化合物的术语“衍生物”包括功能上和/或结构上与所述化合物相关的任何分子，诸如此类分子的酸、酰胺、酯、醚、乙酰化变体、羟基化变体、或烷基化（C1-C6）变体。术语衍生物还包括已失去如上列出的一个或多个取代基的结构上相关的化合物。例如，高牛磺酸是阿坎酸的脱乙酰的衍生物。化合物的优选的衍生物是如通过已知方法确定的具有与所述化合物实质上程度的相似性的分子。类似化合物连同其与母体分子的相似性指数可见于大量数据库诸如PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)或DrugBank(http://www.drugbank.ca/)。在更优选的实施方案中，衍生物应具有与母体药物大于0.4的Tanimoto相似性指数，优选大于0.5，更优选大于0.6，甚至更优选大于0.7。Tanimoto相似性指数广泛用于测量两个分子之间的结构相似性程度。Tanimoto相似性指数可通过软件诸如在线可得的Small Molecule Subgraph Detector (37-38)(http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/SMSD/)来计算。优选的衍生物应结构上和功能上与母体化合物相关，即，它们应还保留至少部分母体化合物活性，更优选它们应该具有针对Aβ或谷氨酸毒性的保护性活性。

术语衍生物还包括药物的代谢物，例如施用于生物后由所述药物的（生物化学）修饰或加工（通常经专门的酶系统）产生的分子，且所述分子展示或保留药物的生物活性。代谢物已公开为负责母体药物的大部分的治疗作用。在具体的实施方案中，如本文所用的“代谢物”指修饰的或加工的药物，其保留至少部分母体药物的活性，优选其具有针对Aβ或谷氨酸毒性的保护性活性。代谢物的实例包括从托拉塞米的肝代谢产生的所述药物的羟基化形式(药物库数据库(39)。

术语“盐”指本发明的化合物的药学上可接受的且相对无毒的、无机或有机酸加成盐。药用盐形成在于将酸性、碱性或两性离子的药物分子与抗衡离子配对以产生药物的盐形式。各种各样的化学形式可用于中和反应。本发明的药学上可接受的盐因此包括通过将作为碱行使功能的主要化合物与无机或有机酸反应以形成盐诸如乙酸、硝酸、酒石酸、盐酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、樟脑磺酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸的盐来获得那些。本发明的药学上可接受的盐还包括其中主要化合物作为酸行使功能并且与合适的碱反应形成例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐或胆碱盐的那些。尽管大部分给定有效成分的盐是生物等效的，但其中一些可以具有尤其是增加的溶解性或生物利用率特性。盐选择目前是药物开发过程中的常规标准操作，如H. Stahl和C.G Wermuth在其手册中所教导的（40）。

术语“组合”或“组合治疗/疗法”指这样的治疗，其中至少两种或多种药物共施用于主体以产生生物效应。在根据本发明的组合疗法中，至少两种药物可以同时或顺序地一起或分开施用。而且，至少两种药物可以经不同的途径和方案施用。结果是，尽管它们可以配制在一起，但组合的药物也可以分开配制。

如实施例中所公开的，托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、溴隐亭和莫西沙星对涉及神经障碍的生物过程具有强的出人意料的作用。此外，这些化合物还在体外显示出矫正这些疾病的症状的非常有效的能力。这些分子单独地或在组合疗法中因此代表用于治疗神经障碍诸如阿尔茨海默病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森病、亨廷顿氏病、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断和脊髓损伤的新颖的方法。这些药物与其他所选的化合物的组合（参见表2）是特别有利的，因为它们以其中单独的所述药物基本上无作用的剂量产生了令人惊奇且出人意料的协同效应。而且，由于其效力，本发明公开的药物组合可以以低剂量使用，其是进一步非常重要的优点。

在这方面，在具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗AD、AD相关疾病、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的组合物，其包含至少托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、溴隐亭或莫西沙星，或其盐、前药、衍生物或持续释放制剂。

这些化合物的每一种的具体CAS号提供于下文表1中。表1还以非限制性方式举出了用于本发明的组合物中的这些化合物的常见盐（common salts）、外消旋物、前药、代谢物或衍生物。

以上分子可以单独或优选在组合疗法中使用以提供最有效的临床益处。在这方面，在优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗神经障碍优选AD、AD相关疾病、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的组合物，其包含以上组合物中的任一种与至少一种选自以下的不同化合物的组合：磺胺异噁唑、甲巯咪唑、丙胺卡因、二羟丙茶碱、米帕林、甘珀酸、阿坎酸、氨基己酸、巴氯芬、卡麦角林、乙胺嗪、西那卡塞、桂利嗪、依普利酮、非诺多泮、来氟米特、左西孟旦、舒洛地特、特比萘芬、唑尼沙胺、依托咪酯、苯乙双胍、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、莫西沙星、溴隐亭或托拉塞米，或其盐、前药、衍生物，或持续释放制剂。

这些不同于表1中列出的那些的额外的不同化合物的每一种的具体CAS号提供于下文表2中：

表2

药物名称	CAS号
		阿坎酸	77337-76-9; 77337-73-6; 107-35-7; 3687-18-1
氨基己酸	60-32-2
		巴氯芬	1134-47-0; 66514-99-6; 69308-37-8; 70206-22-3; 63701-56-4; 63701-55-3; 847353-30-4
卡麦角林	81409-90-7
		甘珀酸	5697-56-3或7421-40-1
桂利嗪	298-57-7
		乙胺嗪	90-89-1或1642-54-2
二羟丙茶碱	479-18-5
		依普利酮	107724-20-9
依托咪酯	33125-97-2
		非诺多泮	67227-57-0或67227-56-9
来氟米特	75706-12-6
		左西孟旦	141505-33-1
甲巯咪唑	60-56-0
		莫西沙星	151096-09-2或186826-86-8或192927-63-2或354812-41-2
苯乙双胍	114-86-3或834-28-6
		丙胺卡因	721-50-6或14289-31-7或14289-32-8
米帕林	83-89-6或69-05-6或6151-30-0
		舒洛地希	57821-29-1
特比萘芬	91161-71-6
		曲美他嗪	5011-34-7或13171-25-0
唑尼沙胺	68291-97-4

巴氯芬的前药的具体实例在Hanafi 等人, 2011 (41)中给出，特别是巴氯芬酯和巴氯芬酯氨基甲酸酯，其由于CNS靶向而尤其引起关注。因此，此类前药特别适合于本发明的组合物。如前所述的Arbaclofen placarbil也是众所周知的前药且因此可在本发明的组合物中用于替代巴氯芬。巴氯芬的其他前药可见于以下专利申请中：WO2010102071,US2009197958, WO2009096985, WO2009061934, WO2008086492, US2009216037,WO2005066122, US2011021571, WO2003077902, WO2010120370。

用于阿坎酸的可用前药诸如泛解酸酯新戊基磺酰基酯、新戊基磺酰基酯前药或阿坎酸的掩蔽的羧酸酯新戊基磺酰基酯前药显著地列于WO2009033069, WO2009033061,WO2009033054 WO2009052191, WO2009033079, US 2009/0099253, US 2009/0069419, US2009/0082464, US 2009/0082440、和US 2009/0076147。

在优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗有需要的主体中的神经障碍的组合物，其包含：

－至少一种选自以下的第一化合物：托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、溴隐亭和莫西沙星，其任何纯度的盐、前药、衍生物或持续释放制剂，并组合有

－至少一种与所述第一化合物不同的第二化合物，其选自磺胺异噁唑、甲巯咪唑、丙胺卡因、二羟丙茶碱、米帕林、甘珀酸、阿坎酸、氨基己酸、巴氯芬、卡麦角林、乙胺嗪、西那卡塞、桂利嗪、依普利酮、非诺多泮、来氟米特、左西孟旦、舒洛地特、特比萘芬、唑尼沙胺、依托咪酯、苯乙双胍、曲美他嗪、美西律、溴隐亭、艾芬地尔、托拉塞米和莫西沙星，其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或持续释放制剂。

在具体的实施方案中，本发明涉及这些药物或组合物用于在有需要的主体中治疗AD或相关病症的用途。

在具体的实施方案中，本发明涉及这些药物或组合物用于治疗有需要的主体中的MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的用途。

如实施例中所公开的，使用一种或多种上文列出的药物的组合物疗法导致阿尔茨海默病及其他神经疾病的有效矫正。如实验部分中所示的，包含至少托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、溴隐亭和莫西沙星的组合物提供实质上的治疗和生物效应以阻止淀粉样蛋白β (Aβ)蛋白或肽对人细胞的毒性作用。此外，在体内，这些组合物导致认知症状的改善以及由Aβ中毒（其中谷氨酸兴奋毒性）引起的分子途径的抑制。因此，它们代表zhiilao此类疾病的新颖且有效的方法。

实验部分进一步显示上述组合物还在i）体外协同保护神经元细胞免于谷氨酸毒性和ii）在体内模型中赋予对涉及谷氨酸兴奋毒性的疾病的临床益处中是有效的。

更优选地，本发明的药物组合物可以包含1、2、3、4或5种不同的药物，甚至更优选2、3或4种不同的药物，其用于在有需要的主体中组合治疗阿尔茨海默病（AD）、AD相关病症、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤。在优选的实施方案中，本发明的药物用于用于组合、分开或顺序施用的组合中，以提供最有效的作用。

在具体的实施方案中，组合物包含（i）托拉塞米和（ii）选自溴隐亭、巴氯芬、磺胺异噁唑、依普利酮或特比萘芬的化合物，或所述化合物（i）和（ii）的盐、前药、衍生物或持续释放制剂。

在另一具体的实施方案中，组合物包含（i）曲美他嗪和（ii）选自巴氯芬、桂利嗪、唑尼沙胺、或莫西沙星的化合物，或所述化合物（i）和（ii）的盐、前药、衍生物或持续释放制剂。

根据进一步具体的实施方案，组合物包含（i）莫西沙星和（ii）选自巴氯芬、西那卡塞、唑尼沙胺、磺胺异噁唑、或曲美他嗪的化合物，或所述化合物（i）和（ii）的盐、前药、衍生物或持续释放制剂。

在另一进一步具体的实施方案中，组合物包含（i）美西律和（ii）选自巴氯芬、西那卡塞、艾芬地尔、或左西孟旦的化合物，或所述化合物（i）和（ii）的盐、前药、衍生物或持续释放制剂。

具体的实施方案涉及组合物，其包含（i）艾芬地尔和（ii）选自阿坎酸、左西孟旦或美西律的化合物，或所述化合物（i）和（ii）的盐、前药、衍生物或持续释放制剂。

用于治疗神经障碍诸如阿尔茨海默病（AD）、AD相关病症、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的本发明优选的组合物包含以下药物组合之一，用于组合、分开或顺序施用：

－ 巴氯芬和托拉塞米，

－ 托拉塞米和托拉塞米，

－ 阿坎酸和艾芬地尔，

－ 巴氯芬和美西律，

－ 巴氯芬和曲美他嗪，

－ 溴隐亭和磺胺异噁唑,

－ 西那卡塞和美西律,

－ 桂利嗪和曲美他嗪,

－ 磺胺异噁唑和托拉塞米,

－ 曲美他嗪和唑尼沙胺,

－ 左西孟旦和美西律,

－ 左西孟旦和艾芬地尔,

－ 左西孟旦和曲美他嗪,

－ 左西孟旦和莫西沙星,

－ 特比萘芬和托拉塞米,

－ 莫西沙星和曲美他嗪,

－ 莫西沙星和巴氯芬,

－ 莫西沙星和西那卡塞,

－ 莫西沙星和唑尼沙胺,

－ 莫西沙星和磺胺异噁唑，或

－ 美西律和艾芬地尔。

包含用于组合、分开或顺序施用的至少三种化合物的组合的根据本发明的优选的组合物的实例提供于下文：

－ 巴氯芬和曲美他嗪和托拉塞米,

－ 巴氯芬和西那卡塞和托拉塞米,

－ 巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米,

－ 左西孟旦和巴氯芬和曲美他嗪,

－ 左西孟旦和氨基己酸和曲美他嗪,

－ 左西孟旦和特比萘芬和曲美他嗪, 或

－ 左西孟旦和磺胺异噁唑和曲美他嗪。

包含用于组合、分开或顺序施用的至少四种化合物的组合的根据本发明的优选的组合物的实例提供于下文：

－ 磺胺异噁唑和曲美他嗪和托拉塞米和唑尼沙胺，

－ 磺胺异噁唑和美西律和托拉塞米和西那卡塞,

－ 巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和乙胺嗪，或

－ 巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和艾芬地尔。

如实验部分中所公开的，本发明的上述组合疗法诱导针对Aβ毒性的强的神经保护作用并在体内行为性能和生物化学测定中提供阳性结果。结果显示本发明的组合物i）有效矫正体内由Aβ聚集体引发的分子途径和ii）导致作为神经元存活或突触完整性的患病动物中观察到的神经生理学损伤的改善。

此外，呈现的结果还显示以上组合疗法针对谷氨酸兴奋毒性（图24和25，表8）（参与多种神经疾病如AD、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的途径）的重要的协同神经保护作用。这些疗法对这些疾病在体内或体外模型中均给出阳性结果。

此外，体内结果还显示本发明的组合物有效地恢复脑血屏障完整性，其已知在几种神经疾病中被损伤。

本发明的目标因此还在于如上定义的组合物，其用于治疗神经障碍诸如阿尔茨海默病（AD）、AD相关病症、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤。

本发明的进一步目标在于如上定义的组合物用于制备治疗神经障碍诸如阿尔茨海默病（AD）、AD相关病症、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的药物的用途。

本发明进一步提供用于治疗神经障碍诸如阿尔茨海默病（AD）、AD相关病症、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的方法，其包括向有需要的主体施用有效量的如上文公开的组合物。

如之前所示，本发明的组合治疗或组合物中的化合物可以一同或分开配制，且一同、分开或顺序地和/或重复地施用。

在这方面，本发明的具体目标是用于在主体中治疗AD、AD相关疾病、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的方法，其包括向需要此类治疗的主体同时、分开或顺序施用有效量的如上公开的组合物。

在优选的实施方案中，本发明涉及在有需要的主体中治疗阿尔茨海默病（AD）、AD相关病症、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的方法，其包括向所述主体施用有效量的托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、溴隐亭和莫西沙星，或其盐或前药或衍生物或持续释放制剂，优选在如上文公开的组合中。

在另一实施方案中，本发明涉及在有需要的主体中治疗阿尔茨海默病（AD）、AD相关病症、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的方法，其包括向所述主体同时、分开或顺序施用选自托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、溴隐亭和莫西沙星，其盐、前药、衍生物或任何制剂的至少一种第一化合物和与所述第一化合物不同的至少一种第二化合物的组合，所述第二化合物选自磺胺异噁唑、甲巯咪唑、丙胺卡因、二羟丙茶碱、米帕林、甘珀酸、阿坎酸、氨基己酸、巴氯芬、卡麦角林、乙胺嗪、西那卡塞、桂利嗪、依普利酮、非诺多泮、来氟米特、左西孟旦、舒洛地特、特比萘芬、唑尼沙胺、依托咪酯、苯乙双胍、曲美他嗪、美西律、溴隐亭、艾芬地尔、托拉塞米和莫西沙星，其盐、前药、衍生物，或任何制剂。

在进一步的实施方案中，本发明涉及治疗阿尔茨海默病（AD）、AD相关病症、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的方法，其包括向有需要的主体施用选自托拉塞米、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、溴隐亭和莫西沙星，其盐、前药、衍生物或任何制剂的至少一种第一化合物和与所述第一化合物不同的至少一种第二化合物的组合，所述第二化合物选自磺胺异噁唑、甲巯咪唑、丙胺卡因、二羟丙茶碱、米帕林、甘珀酸、阿坎酸、氨基己酸、巴氯芬、卡麦角林、乙胺嗪、西那卡塞、桂利嗪、依普利酮、非诺多泮、来氟米特、左西孟旦、舒洛地特、特比萘芬、唑尼沙胺、依托咪酯、苯乙双胍、曲美他嗪、美西律、溴隐亭、艾芬地尔、托拉塞米和莫西沙星，其盐、前药、衍生物，或任何制剂。

如实施例中所公开的，除了有效保护神经元免于谷氨酸毒性外，巴氯芬-托拉塞米疗法还在促进神经元细胞生长中甚至在不存在暴露于任何毒性剂或状况的情况下尤其有效。此外，在体内，该组合疗法导致神经损伤后神经信号转导丧失的改善。因此，巴氯芬-托拉塞米组合代表用于治疗如上文定义的神经病、神经损伤和脊髓损伤的新颖且有效的疗法。

在这方面，在具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗神经病例如外周神经损伤或脊髓损伤的方法，其包括向有需要的主体施用包含巴氯芬和托拉塞米，其盐、前药、衍生物或任何制剂的组合物。

在另一具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗神经病例如遗传性神经病如CMT疾病的方法，其包括向有需要的主体施用包含巴氯芬和托拉塞米，或其盐、前药、衍生物或任何制剂的组合物。

在更具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗CMT1或CMT2疾病的方法，其包括向有需要的主体施用包含巴氯芬和托拉塞米，或其盐、前药、衍生物或任何制剂的组合物。

本发明的具体目标还是治疗神经病例如外周神经损伤或脊髓损伤的方法，其包括向需要此类治疗的主体同时、分开或顺序和/或重复施用有效量的如上文公开的巴氯芬和托拉塞米。

尽管体外和体内均非常有效，但取决于主体和具体病况，本发明的方法和组合物可以还与对主体中所治疗的神经病况有利的额外药物或治疗组合使用。在这方面，在具体的实施方案中，根据本发明的药物或组合物还可以与银杏提取物组合。合适的提取物包括但不限于银杏提取物，改进的银杏提取物（例如富含活性组分或污染物较少）或任何含有银杏提取物的药物。

银杏提取物可以用于包含至少托拉塞米、曲美他嗪、美西律、溴隐亭、艾芬地尔和莫西沙星的组合物中。

在优选的实施方案中，银杏提取物与以下药物组合的任一种组合使用：

－ 阿坎酸和艾芬地尔，

－ 巴氯芬和美西律，

－ 巴氯芬和托拉塞米，

－ 巴氯芬和曲美他嗪，

－ 溴隐亭和磺胺异噁唑,

－ 西那卡塞和美西律,

－ 桂利嗪和曲美他嗪,

－ 托拉塞米和托拉塞米，

－ 磺胺异噁唑和托拉塞米,

－ 曲美他嗪和唑尼沙胺,

－ 左西孟旦和美西律,

－ 左西孟旦和艾芬地尔,

－ 左西孟旦和曲美他嗪,

－ 左西孟旦和莫西沙星,

－ 特比萘芬和托拉塞米,

－ 莫西沙星和巴氯芬,

－ 莫西沙星和西那卡塞,

－ 莫西沙星和唑尼沙胺,

－ 莫西沙星和磺胺异噁唑,

－ 美西律和艾芬地尔,

－ 巴氯芬和曲美他嗪和托拉塞米,

－ 巴氯芬和西那卡塞和托拉塞米,

－ 巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米,

－ 磺胺异噁唑和曲美他嗪和托拉塞米和唑尼沙胺，

－ 磺胺异噁唑和美西律和托拉塞米和西那卡塞,

－ 巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和乙胺嗪,

－ 巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和艾芬地尔,

－ 左西孟旦和巴氯芬和曲美他嗪,

－ 左西孟旦和氨基己酸和曲美他嗪,

－ 左西孟旦和特比萘芬和曲美他嗪, 或

－ 左西孟旦和磺胺异噁唑和曲美他嗪。

与根据本发明的药物或药物组合组合使用的其他疗法可以包括一种或多种改善阿尔茨海默病、AD相关病症、MS、PD、ALS、HD、神经病（例如神经性疼痛或酒精性神经病）、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的症状的药物，或者能够用于这些病症的姑息疗法的药物。

例如，本发明的组合可以与以下组合使用：多奈哌齐(CAS:120014-06-4)、加巴喷丁(CAS:478296-72-9; 60142-96-3)、加兰他敏(357-70-0)、利凡斯的明(123441-03-2)或美金刚(CAS:19982-08-2)。

本发明的进一步目标涉及如上文公开的化合物或化合物的组合用于制备通过组合、分开或顺序施用于有需要的主体用于治疗以上列出的病症的药物的用途。

本发明的进一步目标是制备药物组合物的方法，所述方法包括将以上化合物在合适的赋形剂或载体中混合。

疗法的持续时间取决于所治疗的疾病或病症的阶段，所用的组合，患者的年龄和病况，和患者如何响应治疗。组合的每一组分的剂量、频率和施用模式可以独立控制。例如，一种药物可以口服施用而第二药物可以肌内施用。组合疗法可以在开和关（on-and-off）循环中给予，所述循环包括休息期，使得患者身体拥有从任何仍无法预料的副作用恢复的机会。药物可以一起配制使得一次施用递送所有药物。

组合的每一药物的施用可以通过任何合适的方式，其导致药物浓度（与其他组分组合）能够改善患者病况或有效治疗疾病或病症。

尽管组合的活性组分可以作为纯化学品施用，但优选将它们作为药物组合物呈现，在本上下文中还优选的是作为药物制剂。可能的组合物包括适合于口服、直肠、局部（包括经皮、面颊和舌下）、或肠胃外（包括皮下、肌内、静脉内和皮内）施用。

更常见地，将这些药物制剂在含有许多剂量单位或其他用于施用在不同治疗期过程中使用的计量的单位剂量的工具的“患者包”（以单一包装，通常是泡罩包装）中开具给患者。患者包相对于传统处方（其中药剂师从大量供应中分出患者的药物供应）具有优点，所述优点在于患者始终可获得患者包中包含的包装说明书（其通常在传统处方是缺少的）。包括包装说明书已显示改进对医师指示的患者依从性。因此，本发明进一步包括如前文所述的药物制剂与适合于所述制剂的包装材料的组合。在此类患者包中，用于组合治疗的制剂的预期使用可以通过说明书、设备、规定、改写本（adaptation）和/或其他方式来推断以帮助对于治疗最合适地使用所述制剂。此类措施使得患者包特别适合且适应用于用本发明的组合来治疗。

药物可以以任何合适的量包含在任何合适的载体物质（例如赋形剂、媒介物、支持物）中，其可以占组合物的总重量的1-99重量％。可以以适合于口服、肠胃外（例如静脉内、肌内）、直肠、表皮、经鼻、阴道、吸入、皮肤（贴片（patch））、或眼施用途径的剂型提供组合物。因此，组合可以为以下的形式：例如，片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、凝胶包括水凝胶、糊剂、软膏剂、霜剂、硬膏剂、灌药剂（drenches）、渗透递送装置、栓剂、灌肠剂、可注射剂、植入剂、喷雾剂或气溶胶。

药物组合物可以根据常规药物实践来配制（例如参见Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams &Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds.J. Swarbrickand J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York）。

根据本发明的药物组合物可以配制以在施用时立即或在施用后任何预定的时间或时期大量释放活性药物。

控制释放制剂包括（i）在延长的时期在体内产生药物的基本恒定的浓度的制剂；（ii）预定延迟时间后在延长的时期在体内产生药物的基本恒定的浓度的制剂；（iii）在预期的时期过程中通过在体内维持相对恒定、有效的药物水平且伴有将与活性药品的血浆水平中的波动相关的不期望的副作用降至最低来保持药物作用的制剂；（iv）通过例如邻近于患病组织或器官或者在患病组织或器官中空间放置控制释放的组合物来定位药物作用的制剂；和（v）通过使用载体或化学衍生物以递送药物至特定靶细胞类型来靶向药物作用的制剂。

以控制释放制剂形式施用药物尤其在这样的情况中是优选的，在所述情况中药物单独或组合地具有（i）窄的治疗指数（即，导致有害副作用或有毒反应的血浆浓度与导致治疗作用的血浆浓度之间的差异小；通常，治疗指数TI定义为半数致死剂量（LD50）与半数有效剂量（ED50）的比率）；（ii）胃肠道中窄的吸收窗口；或（iii）非常短的生物半衰期，使得需要一天过程中频繁给药以保持处于治疗水平的血浆水平。

许多策略的任何均可以采用以获得其中释放率超过所讨论药物的代谢速率的控制释放。控制释放可以通过各种配制参数和成分包括例如各种类型的控制释放组合物和包衣的合适选择来获得。因此，将药物与合适赋形剂配制在药物组合物中，所述药物组合物施用时以受控的方式释放药物（单一或多单位片剂或胶囊剂组合物、油溶液、混悬剂、乳剂、微胶囊剂、微球、纳米颗粒、贴片和脂质体）。

口服使用的固体剂型

用于口服使用的制剂包括在具有无毒药学上可接受的赋形剂的混合物中含有活性组分的片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂（例如蔗糖、微晶纤维素、淀粉包括马铃薯淀粉、碳酸钙、氯化钠、磷酸钙、硫酸钙、或磷酸钠）；成粒剂和崩解剂（例如纤维素衍生物包括微晶纤维素、淀粉包括马铃薯淀粉、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐或藻酸）；粘合剂（例如阿拉伯胶、藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、或聚乙二醇）；和润滑剂、助流剂和抗结合剂（例如硬脂酸、硅石或滑石）。其他药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、调味剂、塑化剂、保湿剂、缓冲剂等。

片剂可以是无包衣的或者它们可以通过已知技术包衣，任选以延迟在胃肠道中的崩解和吸收并因此提供在更长时期上的持续作用。包衣可以适合于以预定模式释放活性药物（例如，以实现控制释放制剂）或其可以适合于直至通过胃部之后才释放活性药物（肠溶包衣）。包衣可以是糖包衣、薄膜包衣（例如基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮）、或肠溶包衣（例如基于甲基丙烯酸共聚物、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫胶和/或乙基纤维素）。延时材料诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯可以使用。

固体片剂组合物可以包括适合于保护组合物免于不想要的化学改变（例如，释放活性药物之前的化学降解）的包衣。包衣可以以如Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology中描述的相似方式应用于固体剂型。

几种药物可以以片剂混合在一起或者可以分隔开。例如，第一药物包含在片剂的内部，且第二药物在外部，使得第二药物的主要部分在释放第一药物前释放。

用于口服使用的制剂还可以作为可咀嚼片剂呈现，或作为硬明胶胶囊剂呈现，其中将活性组分与惰性固体稀释剂（例如马铃薯淀粉、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土）混合，或作为软明胶胶囊剂呈现，其中将活性组分与水或油介质例如液体石蜡或橄榄油混合。粉剂和颗粒剂可以以常规方式使用片剂和胶囊剂下的上述成分来制备。

用于口服使用的控制释放组合物可以例如这样构成，以通过控制活性药物的溶解和/或扩散来释放活性药物。

溶解和扩散控制释放可以通过合适地包衣药物的片剂、胶囊剂、丸剂、或颗粒制剂或通过将药物掺入合适的基质来实现。控制释放包衣可以包括上述的一种或多种包衣物质和/或例如虫胶、蜂蜡、glycowax、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕榈酰硬脂酸甘油酯、乙基纤维素、丙烯酸树脂、dl-聚乳酸、乙酸丁酸纤维素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羟基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝胶、1,3-丁二醇、乙二醇甲基丙烯酸酯、和/或聚乙二醇。在控制释放基质制剂中，基质材料可以还包括例如水合甲基纤维素、巴西棕榈蜡和硬脂醇、聚羧乙烯934、硅酮、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯和/或卤代的碳氟化合物。

含有要求保护的组合的一种或多种药物的控制释放组合物还可以以漂浮片剂或胶囊剂的形式（即，口服施用后在胃内容物顶部漂浮一定时期的片剂或胶囊剂）。药物的漂浮片剂制剂可以通过将药物与赋形剂和20-75% w/w的水胶体诸如羟乙基纤维素、羟苯基纤维素或羟苯基甲基纤维素的混合制粒来制备。获得的颗粒可以随后压制为片剂。在接触胃液时，片剂形成在其表面基本上水不可渗透的凝胶屏障。该凝胶屏障使得保持密度小于一，由此允许片剂在胃液中保持漂浮。

口服施用的液体

适合于通过添加水来制备含水混悬剂的粉剂、可分散粉剂或颗粒剂是用于口服施用的常规剂型。作为混悬剂的制剂提供在与分散剂或湿润剂、悬浮剂、和一种或多种防腐剂的混合物中的活性组分。合适的悬浮剂是例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、藻酸钠等。

肠胃外组合物

药物组合可以还通过以剂型、制剂来注射、输注或植入（静脉内、肌内、皮下等），或经含有常规、无毒的药学上可接受的载体和佐剂的合适递送设备或植入物来肠胃外施用。此类组合物的配制和制备是药学配制领域的技术人员所熟知的。

用于肠胃外使用的组合物可以以单位剂型（例如在单一剂量安瓿中）或在含有若干剂量的小瓶中且其中可以添加合适的防腐剂（见下文）来提供。组合物可以呈溶液剂、混悬剂、乳剂、输注设备或用于植入的递送设备的形式，或者其可作为干粉剂以在使用前与水或另一合适媒介物重构来呈现。除了活性药物，组合物还可以包括合适的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。活性药物可以掺入用于控制释放的微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中。组合物可以包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、和/或分散剂。

根据本发明的药物组合物可以呈适合于无菌注射的形式。为了制备此类组合物，合适的活性药物溶解或悬浮于肠胃外可接受的液体媒介物中。可使用的可接受媒介物和溶剂中的是水，通过添加合适量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲剂调节至合适的pH的水，1,3-丁二醇，林格溶液和等渗的氯化钠溶液。含水制剂还可以含有一种或多种防腐剂（例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯）。在其中药物之一仅少量或略微可溶于水的情况下，可以添加溶解增强剂或增溶剂，或者溶剂可以包含60% w/w聚乙二醇等。

控制释放肠胃外组合物可以呈含水悬浮液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油悬浮液或乳状液的形式。可选地，活性药物可以掺入生物相容载体、脂质体、纳米颗粒、植入物或输注设备。用于制备微球和/或微胶囊的材料例如为生物可降解/生物溶蚀性聚合物诸如polygalactin、聚（氰基丙烯酸异丁脂）、聚（2-羟乙基-L-谷氨酰胺）。当配制控制释放肠胃外制剂时可以使用的生物相容载体为碳水化合物（例如葡聚糖）、蛋白（例如白蛋白）、脂蛋白或抗体。用于植入物的材料可以是生物不可降解的（例如聚二甲基硅氧烷）或生物可降解的（例如聚（己内酯）、聚（羟乙酸）或聚（原酸酯））。

可选途径

尽管更不优选或更不方便，但其他施用途径和因此的其他制剂也可以考虑。在这方面，对于直肠应用，用于组合物的合适剂型包括栓剂（乳剂或混悬剂类型）和直肠明胶胶囊剂（溶液剂或混悬剂）。在典型的栓剂制剂中，将活性药物与合适的药学上可接受的栓剂基质诸如可可脂、酯化脂肪酸、甘油明胶和各种水可溶性或分散性基质如聚乙二醇组合。可以掺入各种添加剂、增强剂或表面活性剂。

药物组合物还可以以含有常规无毒的药学上可接受的载体和赋形剂的剂型或制剂（包括微球和脂质体）在皮肤上局部施用用于经皮吸收。制剂包括霜剂、软膏剂、洗剂、搽剂、凝胶、水凝胶、溶液剂、混悬剂、棒（sticks）、喷雾剂、糊剂、硬膏剂、及其他类型的经皮药物递送系统。药学上可接受的载体或赋形剂可以包括乳化剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、润湿剂、渗透促进剂、螯合剂、凝胶形成剂、软膏基质、香水和皮肤保护剂。

防腐剂、润湿剂、渗透促进剂可以是对羟苯甲酸酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲基丙酯，和苯扎氯铵、甘油、丙二醇、尿素等。

上述的用于皮肤上局部施用的药物组合物还可以结合对待治疗的身体部分上或在其附近的局部施用来使用。组合物可以适合于直接应用或通过特殊的药物递送设备诸如敷料或可选地硬膏剂、垫、海绵、创可贴、或其他形式的合适的柔性材料来应用。

治疗的剂量和持续时间

应理解组合的药物可以并行（在相同或不同的药物制剂中）施用或顺序施用。如果存在顺序施用，则施用第二（或额外）活性组分中的延迟不应使得失去活性组分的组合的有效作用的益处。根据本说明书的组合的最低需要是组合应旨在与活性组分的组合的有效作用的益处组合使用。组合的预期使用应由设备、规定、改写本（adaptation）和/或有助于使用根据本发明的组合的其他方式来推断。

尽管本发明的活性药物可以以分开的剂量例如每日两次或三次来施用，但优选组合中每种药物每日一次剂量，且在单一药物组合物（单位剂型）中所有药物的单一每日剂量是最优选的。

术语“单位剂型”指适合作为用于人主体的单一剂量的物理上可分开的单位（诸如胶囊剂、片剂、或装填的注射器筒），含有预定量的一种或多种活性材料的每一单位计算产生期望的治疗作用，连同所需的药物载体。

施用通常重复。其可以是每日一至几次持续几天至几年，且可以甚至持续患者一生。在大部分情况下表明长期或至少周期性重复的长期施用。

此外，关于具体患者的药物基因组（基因型对治疗剂的药代动力学、药效动力学或效力概况的作用）信息可以影响所用的剂量。

除了当响应于特别受损的情况外，当可能需要更高剂量时，组合中每一药物的优选剂量通常在于不高于通常对于长期维持治疗所开具的或证实在3期临床研究中是安全的那些的剂量范围之内。

本发明的一个显著的优点是每一化合物可以在组合疗法中以低剂量使用，同时组合产生对患者的实质上的临床益处。组合疗法的确可以在化合物单独不具有实质作用的剂量时是有效的。因此，本发明的具体优点在于能够使用亚最优剂量的每一化合物，即比通常开具的治疗剂量更低的剂量，优选1/2的治疗剂量，更优选1/3、1/4、1/5或甚至更优选1/10的治疗剂量。在具体实例中，使用低至1/20、1/30、1/50、1/100或甚至更低的治疗剂量的剂量。

在此类亚最优剂量时，单独的化合物将基本上无活性的，但根据本发明的组合是完全有效的。

优选的剂量对应于对于长期维持治疗通常开具的那些的1％高至50％的量。

最优选的剂量可对应于对于长期维持治疗通常开具的那些的1％高至10%的量。

用于本发明的药物剂量的具体实例下文提供：

－ 溴隐亭口服约0.01-10 mg/日，优选少于5 mg/日，更优选少于2.5 mg/日，甚至更优选少于1 mg/日，此类剂量对于口服施用是尤其适合的，

－ 艾芬地尔口服约0.4-6 mg/日，优选少于3 mg/日，更优选少于1.5 mg/日，甚至更优选少于0.75 mg/日，此类剂量对于口服施用是尤其适合的，

－ 美西律口服约6-120 mg/日，优选少于60 mg/日，更优选少于30 mg/日，甚至更优选少于15 mg/日，此类剂量对于口服施用是尤其适合的，

－ 莫西沙星口服约4-40 mg/日，优选少于20 mg/日，更优选少于10 mg/日，甚至更优选少于5 mg/日，此类剂量对于口服施用是尤其适合的，

－ 托拉塞米口服约0.05-4 mg/日，优选少于2 mg/日，更优选少于1 mg/日，甚至更优选少于0.5 mg/日，此类剂量对于口服施用是尤其适合的，

－ 曲美他嗪口服约0.4-6 mg/日，优选少于3 mg/日，更优选少于1.5 mg/日，甚至更优选少于0.75 mg/日，此类剂量对于口服施用是尤其适合的，

－ 阿坎酸口服约1-400 mg/日，

－ 氨基己酸口服约0.1 g-2.4 g/日，

－ 巴氯芬0.01-150 mg/日，优选少于100 mg/日，更优选少于50 mg/日，最优选5-40 mg/日，甚至更优选少于35 mg/日，通常15 mg/日，12 mg/日，24 mg/日，30 mg/日，此类剂量对于口服施用是尤其适合的，

－ 乙胺嗪口服约0.6-600 mg/日，

－ 西那卡塞口服约0.3-36 mg/日，

－ 桂利嗪口服约0.6-23 mg/日，

－ 依普利酮口服约0.25-10 mg/日，

－ 来氟米特口服约0.1-10 mg/日，

－ 左西孟旦口服约0.04-0.8 mg/日，

－ 磺胺异噁唑口服约20-800 mg/日，

－ 磺胺异噁唑口服约0.05-40 mg/日，

－ 特比萘芬口服约2.5-25 mg/日，

－ 唑尼沙胺口服约0.5-50 mg/日。

应理解实际施用的药物量将由医师在相关情况的指导下来确定，所述情况包括待治疗的一种或多种病况、待施用的确切组合物、个体患者的年龄、体重和响应、患者症状的严重性和所选的施用途径。因此，上述剂量范围旨在提供对于本文教导的一般性指导和支持，并不旨在限制本发明的范围。

以下实施例给出用于说明性而非限制性的目的。

实施例

根据Committee for Research and Ethical Issue of the I.A.S.P. (1983)的 指导进行动物的护理和饲养以及实验。

A）与Aβ毒性相关的疾病的治疗

在这一系列实验中，已测试候选化合物其阻止或降低人Aβ_1-42的毒性作用的能力。Aβ_1-42是构成来自患有AD的人患者的生物活检样品中发现的聚集体的全长肽。药物首先单独测试，随后通过其组合作用的测定来测试。对各种细胞类型测定作用，以进一步记录化合物在体外模型（其说明AD的不同生理特征）中的活性。体内研究在AD的小鼠模型中进行，通过评价化合物对i）动物的认知表现和ii）对AD的分子标志（细胞凋亡诱导、氧化应激诱导、炎症途径诱导）的作用来证实该保护性作用。

I. 化合物阻止人Aβ _1-42 的毒性

I.1.针对Aβ _1-42 在人脑微血管内皮细胞模型中毒性的保护

使用人脑微血管内皮细胞培养物来研究由候选化合物对Aβ _1-42 毒性提供的保护。

人脑微血管内皮脑细胞(HBMEC, ScienCell Ref:1000, 在第10代冷冻)在+37℃下水浴中迅速解冻。上清液立即放入9 ml含有10％胎牛血清(FCS; GIBCO ref 10270-106)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM; Pan Biotech ref: P04-03600)中。将细胞悬浮液+4℃以180 x g离心10 min，并将沉淀悬浮于具有1.6%无血清RocketFuel (Cell System,Ref: SF-4Z0-500-R, Batch 54102)、2%青霉素10.000 U/ml和链霉素10mg/ml (PS; PanBiotech ref: P06-07100 batch 133080808)的CSC无血清培养基 (CSC无血清, CellSystem, Ref: SF-4Z0-500-R, Batch 51407-4)中，并以20000细胞/孔的密度以100µl的终体积接种于96孔板(基质胶层生物包被血管发生系统, BD, Ref 354150, Batch A8662)。在基质胶支持物上，内皮脑细胞自发开始毛细血管网形态建成的过程（33）。

每种条件进行三个单独的培养，每种条件6个孔。

候选化合物和人淀粉样蛋白_-β_1-42处理

简言之，将Aβ_1-42肽(Bachem, ref: H1368 batch 1010533)在定义培养基中以20µM重构（母液），并在+37℃下黑暗中缓慢摇动3天用于聚集。以相同条件制备对照培养基。

3天后，该聚集的人淀粉样蛋白肽以在对照培养基中稀释的2.5µM用在HBMEC上（最优孵育时间）。在基质胶上HBMEC接种后2小时加入Aβ_1-42肽，持续18小时孵育。

在基质胶上HBMEC接种后1小时，将测试化合物和VEGF-165溶解在培养基(+ 0.1 %DMSO)中并随后用HBMEC预孵育1小时，随后应用Aβ_1-42 (以每培养孔100µl的终体积)。测试化合物或VEGF孵育后1小时（在基质胶上细胞接种后两小时），将100µl的Aβ_1-42肽加入至在对照培养基中稀释的2.5µM的终浓度（在测试化合物或VEGF (以200 µl总体积/孔)存在的情况下），以避免进一步药物稀释。

培养板的构成

将已知为VEGF-A的促血管生成同工型的VEGF-165用于该研究中的所有实验作为参考化合物。VEGF-165是涉及血管发生的最丰富的VEGF同工型之一。VEGF以10nM用作参考测试化合物。

评价以下条件：

· 负对照：单独的培养基+ 0.1% DMSO

· 中毒：淀粉样蛋白-β_1-42 (2.5µM)持续18小时

· 正对照：VEGF-165 (10nM) (一种参考化合物/培养物)1小时，随后添加Aβ_1-42(2.5 µM)持续18小时的孵育时间。

· 测试化合物：测试化合物1小时，随后添加Aβ_1-42 (2.5 µM)持续18小时的孵育时间。

毛细血管网定量

每孔，使用InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare)在光透过下用4x镜头照两个照片。所有图像在相同条件下取得。血管发生网的分析使用Developer软件(GEHealthcare)完成。评价毛细血管网的总长度。

数据处理

所有值表示为平均值± s.e. 3个培养物的平均值（n = 6/条件）。统计分析对不同条件进行ANOVA随后为Dunnett检验（当其允许时）（Statview软件5.0版）来完成。图中插入的值（作为％）显示淀粉样蛋白毒性进化。实际上，淀粉样蛋白毒性取作100％且测试化合物作用计算为该淀粉样蛋白毒性的％。

结果

结果显示于图1中。它们证明单独测试的药物诱导针对由Aβ肽1-42引起的毒性的实质上的保护作用。

- 托拉塞米以例如400 nM的低剂量诱导强保护作用；

- 溴隐亭以例如3.2 nM的低剂量诱导强保护作用。

结果还出人意料地显示，相比于上述药物浓度的更高或更低的浓度将使该模型中对Aβ _1-42毒性的作用变差或甚至具有更低的作用至无作用。

I.2 针对Aβ _{1-42对原代皮层} 神经元细胞的毒性的保护.

测试化合物和人淀粉样蛋白-β1-42处理

大鼠皮层神经元如由Singer等人描述进行培养(42)。简言之，将15天妊娠的妊娠雌性大鼠通过颈脱位法处死(大鼠Wistar)并从子宫移除胎。移除皮层并置于冰冷的含有2％青霉素10.000 U/ml和链霉素10mg/ml和1%牛血清白蛋白（BSA）的Leibovitz (L15)培养基中。皮层通过胰蛋白酶在37ºC下20分钟(0.05%)来离解。通过加入含有II级DNaseI和10％胎牛血清（FCS）的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)来停止反应。随后将细胞通过3次连续经过10 ml移液器来机械离解并以515 x g +4℃持续10 min来离心。丢弃上清液并将细胞沉淀在由添加有B27 (2%)、L-谷氨酰胺(0.2mM)、2% PS溶液和10ng/ml BDNF组成的定义的培养基中重悬。将活细胞使用锥虫蓝不相容试验在Neubauer细胞计数器中计数。将细胞以30 000细胞/孔接种在96孔板（孔预包被由聚-L-赖氨酸(10µg/ml)）并在加湿空气(95%)/CO2 (5%)气氛中在+37℃下培养。

简言之，将Aβ_1-42肽在定义培养基中以40µM重构（母液），并在+37℃下黑暗中缓慢摇动3天用于聚集。以相同条件制备对照培养基。

3天后，将溶液用于原代皮层神经元，如下：

神经元培养10天后，将药物溶解在培养基(+0.1 % DMSO)中并随后与神经元预孵育1小时，随后应用Aβ_1-42 (以每培养孔100µl的终体积)。药物孵育后1小时，将100µl Aβ_1-42肽加入至10µM的终浓度（在药物存在的情况下稀释），以避免进一步的药物稀释。将皮层神经元中毒24小时。每种条件进行三个单独的培养，每种条件6个孔。

将BDNF (50ng/ml)和雌二醇-β (150nM)分别用作正对照和参考化合物。

培养板的构成

将以150nM的雌二醇-β用作正对照。

将雌二醇-β溶解在培养基中并预孵育1小时，随后应用聚集的淀粉样蛋白-β_1-42。

评价以下条件：

- 对照蚀斑12孔/条件

· 负对照：单独的培养基+ 0.1% DMSO

· 中毒：淀粉样蛋白-β_1-42 (10 µM)持续24小时

· 参考化合物：雌二醇 (150nM) 1小时

- 药物板：6孔/条件

· 负对照：单独的培养基+ 0.1% DMSO

· 中毒：淀粉样蛋白-β_1-42 (10 µM)持续24小时

· 药物：药物－1小时随后为淀粉样蛋白-β_1-42 (10 µM) 24小时。

乳酸脱氢酶（LDH）活性测定

中毒后24小时，将上清液取出并用细胞毒性检测试剂盒(LDH, Roche AppliedScience, ref: 11644793001, batch: 11800300)分析。用于定量细胞毒性的该比色测定基于测量从死亡细胞的细胞溶胶释放进上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性。

数据处理

所有值表示为3个培养物的平均值的平均值± s.e. （n = 6/条件）。统计分析在不同条件（ANOVA随后为Dunnett检验（当其允许时），Statview软件5.0版）来完成。

结果

对于各个所选药物在毒性测定中对原代皮层神经元细胞获得的结果呈现在图2、26、和27中。它们证明单独测试的药物诱导针对由Aβ肽1-42引起的毒性的实质上的保护作用。

- 曲美他嗪以例如40 nM的低剂量诱导强保护作用；

- 美西律以低至3.2 nM的剂量诱导强保护作用；

- 溴隐亭以低至40 nM的剂量诱导强保护作用；

- 艾芬地尔以低至600 nM的剂量诱导强保护作用；

- 莫西沙星以低至20 nM的剂量诱导强保护作用。

- 托拉塞米以200 nM的剂量诱导强保护作用。

- 高牛磺酸以8 nM的剂量诱导强保护作用。

获得的结果还显示出人意料地，比上述的那些更高或更低的浓度将使对Aβ _1-42对神经元细胞的毒性的保护作用变差或甚至具有更低的保护作用至无保护作用。

II.组合疗法阻止人Aβ _1-42 的毒性

II.1 组合疗法对人Aβ _1-42 肽对人HBMEC细胞的毒性的作用。

本发明的药物组合的效力在人细胞上评价。这些测定中使用的方案与上文部分I.1中所述相同。

结果

所有测试的药物组合提供在HBMEC模型中针对人Aβ_1-42肽的毒性的保护作用，如下表3中所示和图3-6和图13和14中图示的。结果明确地显示由聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-422.5µM)的中毒被本发明的组合显著地阻止，而在那些浓度下，单独的药物对上述实验条件中的中毒无显著作用。

表3：

药物组合
		巴氯芬和托拉塞米	+
依普利酮和托拉塞米	+
		溴隐亭和磺胺异噁唑	+
磺胺异噁唑和托拉塞米	+
		特比萘芬和托拉塞米	+
美西律和艾芬地尔	+
		巴氯芬和曲美他嗪和托拉塞米	+
巴氯芬和西那卡塞和托拉塞米	+
		巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米	+
磺胺异噁唑和曲美他嗪和托拉塞米和唑尼沙胺	+
		磺胺异噁唑和美西律和托拉塞米和西那卡塞	+
巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和乙胺嗪	+
		巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和艾芬地尔	+
左西孟旦和巴氯芬和曲美他嗪	+
		左西孟旦和氨基己酸和曲美他嗪	+
左西孟旦和特比萘芬和曲美他嗪	+
		左西孟旦和磺胺异噁唑和曲美他嗪	+

如图3-6、13和14中所示例的，以下药物组合提供在中毒的HBMEC细胞中针对人Aβ_1-42肽毒性的尤其有意思的保护作用：

- 巴氯芬和托拉塞米，

- 磺胺异噁唑和托拉塞米,

- 托拉塞米和依普利酮，

- 磺胺异噁唑和溴隐亭,

- 特比萘芬和托拉塞米,或

- 西那卡塞和美西律。

II.2 组合疗法对人Aβ _1-42 肽对原代皮层神经元细胞的毒性的作用。

本发明的药物组合的效力对原代皮层神经元细胞进行评价。这些测定中使用的方案与上文部分I.2中所述相同。

结果

所有测试的药物组合提供在原代皮层神经元细胞中针对人Aβ_1-42肽的毒性的保护作用，如下表4中所示和图7-12和图16-22中图示的。结果明确地显示由聚集的人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10µM)的中毒被本发明的组合显著地阻止，而在那些浓度下，单独的药物对上述实验条件中的中毒无显著作用。

表4：

药物组合
		阿坎酸和艾芬地尔	+
巴氯芬和美西律	+
		巴氯芬和曲美他嗪	+
巴氯芬和托拉塞米	+
		西那卡塞和美西律	+
桂利嗪和曲美他嗪	+
		曲美他嗪和唑尼沙胺	+
左西孟旦和美西律	+
		左西孟旦和艾芬地尔	+
左西孟旦和曲美他嗪	+
		左西孟旦和莫西沙星	+
美西律和艾芬地尔	+
		莫西沙星和巴氯芬	+
莫西沙星和西那卡塞	+
		莫西沙星和曲美他嗪	+
莫西沙星和磺胺异噁唑	+
		莫西沙星和唑尼沙胺	+
托拉塞米和磺胺异噁唑	+
		巴氯芬和曲美他嗪和托拉塞米	+
巴氯芬和西那卡塞和托拉塞米	+
		巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米	+
磺胺异噁唑和曲美他嗪和托拉塞米和唑尼沙胺	+
		磺胺异噁唑和美西律和托拉塞米和西那卡塞	+
巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和乙胺嗪	+
		巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和艾芬地尔	+
左西孟旦和巴氯芬和曲美他嗪	+
		左西孟旦和氨基己酸和曲美他嗪	+
左西孟旦和特比萘芬和曲美他嗪	+
		左西孟旦和磺胺异噁唑和曲美他嗪	+

如图7-12和15-22中所示例的，以下药物组合提供在中毒的原代皮层神经元细胞中针对人Aβ_1-42肽毒性的尤其有意思的保护作用：

- 阿坎酸和艾芬地尔，

- 巴氯芬和美西律，

- 巴氯芬和托拉塞米，

- 巴氯芬和曲美他嗪，

- 西那卡塞和美西律,

- 桂利嗪和曲美他嗪,

- 曲美他嗪和唑尼沙胺,

- 美西律和艾芬地尔,

- 莫西沙星和巴氯芬,

- 莫西沙星和西那卡塞,

- 莫西沙星和曲美他嗪,

- 莫西沙星和磺胺异噁唑,

- 莫西沙星和唑尼沙胺，或

- 托拉塞米和磺胺异噁唑。

II.4.针对Aβ _1-42 毒性的神经突生长的保护

测试化合物和Aβ1-42处理

原代大鼠皮层神经元如之前所述培养。

培养10天后，将细胞与药物孵育。1小时后，在无BDNF但连同药物的定义培养基中通过2.5 μM β-淀粉样蛋白(1-42; Bachem)使细胞中毒。将皮层神经元中毒24小时。将BDNF(10ng/ml)用作正（神经保护性）对照。每种条件进行三个独立培养，每种条件6个孔。

神经突长度

中毒24小时后，将上清液取出并将皮层神经元通过乙醇（95％）和乙酸（5％）的冰冷溶液固定5分钟。用0.1％皂苷透化后，将细胞用含有1％胎牛血清的PBS封闭2小时。随后，将细胞与抗微管结合蛋白2(MAP-2; Sigma)的单克隆抗体孵育。用 Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG (分子探针)显示该抗体。神经元的细胞核用荧光标记物(Hoechst solution,SIGMA)进行标记。

每孔，使用InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare)用20x放大获取10张图片。所有图片在相同条件下取得。神经突网络的分析使用Developer软件(GE Healthcare)完成以评价神经突网络的总长度。

结果

巴氯芬和托拉塞米的组合在原代皮层神经元细胞中诱导针对人Aβ_1-42肽毒性的显著保护作用（531％的神经突网络的改善），如图23所示。结果清楚地显示通过人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 2.5 µM)的中毒被组合显著阻止并且此外，组合相比对照增强了神经突网络。

因此，该组合允许对皮层神经元细胞和细胞神经元网络针对人Aβ_1-42肽毒性的有效保护。此外，此类神经突网络的增强证实此类药物在神经障碍如脊髓损伤中的效力。

III.化合物阻止体内人Aβ _25-35 的毒性

动物

整个研究中使用雄性Swiss小鼠。动物饲养在塑料笼中，除在行为实验过程中外随意获取实验室食物和水，并保持在受调节的环境中，12小时光照/黑暗循环（上午8点开灯）。行为实验在隔音且空气调节的环境室中进行，每一实验前小鼠已对该室熟悉至少30分钟。

淀粉样蛋白肽制备和注射

将Aβ_25–35肽和打乱的（scrambled）Aβ_25–35肽已溶解在无菌的双蒸水中并储存在-20℃直至使用。光学显微镜观察结果指示孵育Aβ_25–35肽而非打乱的Aβ_25–35肽，导致存在两种类型的不溶性沉淀，双折射的纤丝样结构和无定形的球形聚集体。随后脑室内（i.c.v.）施用β-淀粉样蛋白肽。简言之，将每一小鼠用乙醚轻微麻醉，并将量规不锈钢针单侧插入与每眼等距的中线点的右边1 mm，在眼和耳之间相等距离处且垂直于头骨平面。将肽和媒介物在大约3秒内逐渐递送。注射后1分钟内小鼠展示出正常行为。施用部位通过在预实验中注射墨汁来检查。既不插入针也不注射媒介物已对存活、行为响应或认知功能具有显著影响。

药物处理

在第-1天，即Aβ_25–35肽注射前24小时，将药物、药物组合或媒介物经口通过管饲法一日两次（早8点和晚6点）施用。

在第0天（上午10点），将小鼠i.c.v.用Aβ25–35肽或打乱的Aβ25–35肽（对照）以3 μ1 (3 mM)的终体积注射。

在第0天至第7天之间，将药物组合或媒介物经口通过管饲法一日一次或两次（早8点和晚6点）施用。一个动物组经口通过管饲法以单次注射（早8点）接受多奈哌齐（参考化合物- 1 mg/kg/天）。药物溶解于水中并仅在每次管饲法施用前新鲜制备。

在第7天，所有动物均在Y迷宫测试（空间工作记忆指数）中测试自发的交替表现（alternation performance）。

在第7和8天，使用降低（step-down）型被动回避程序评估动物的前后关系（contextual）长期记忆。

在第8天，处死动物。切开它们的脑并保存在-80℃用于进一步分析。

在Aβ_25–35肽icv注射后7天进行的行为表现和生物化学测定中观察到阳性结果，显著的是列于表5中的组合。

表5：

药物组合	生物化学和/或行为测定中的结果
		巴氯芬和托拉塞米	+
美西律和艾芬地尔	+
		磺胺异噁唑和托拉塞米	+
巴氯芬和曲美他嗪和托拉塞米	+
		巴氯芬和西那卡塞和托拉塞米	+
巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米	+
		磺胺异噁唑和曲美他嗪和托拉塞米和唑尼沙胺	+
磺胺异噁唑和美西律和托拉塞米和西那卡塞	+
		巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和乙胺嗪	+
巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和艾芬地尔	+
		左西孟旦和巴氯芬和曲美他嗪	+
左西孟旦和氨基己酸和曲美他嗪	+
		左西孟旦和特比萘芬和曲美他嗪	+
左西孟旦和磺胺异噁唑和曲美他嗪	+

IV.化合物增强中毒动物的行为和认知表现

将动物如上文部分中毒。

自发交替表现－Y迷宫测试

在第7天，所有动物均在Y迷宫（空间工作记忆指数）中测试自发的交替表现（alternation performance）。Y迷宫由灰色聚氯乙烯制成。每一臂40 cm长、13 cm高、底部3cm宽、顶部10 cm宽，且以等角会聚。将每一小鼠置于一个臂的末端，且允许在8分钟的时期经迷宫自由移动。目视检查臂一系列的臂进入，包括可能回到相同的臂。交替定义为在连续的时机进入所有三个臂。最大交替数因此是臂进入的总数减二且交替的百分比计算为（实际交替/最大交替）x 100。参数包括交替的百分比（记忆指数）和臂进入的总数（探索指数）。显示极端行为（交替百分比< 25%或> 85%或臂进入数< 10）的动物丢弃。通常，其占动物的0-5％。该测试顺便用于分析在行为水平上由Aβ25–35注射在小鼠中诱导的影响和失忆作用。

被动回避试验

仪器为两个区室（15 x 20x 15 cm高）的盒，且一个用白色聚氯乙烯壁照亮且另一个用黑色聚氯乙烯壁和网格底板变黑暗。截断门（guillotine door）将各区室分开。位于仪器上方40 cm处的60 W灯在实验过程中照亮白色区室。乱序的足底电击(0.3 mA持续3秒)可使用电击发生器置乱器(Lafayette Instruments, Lafayette, USA)递送至网格地板。截断门在训练期过程中最初是关闭的。每一小鼠置于白色区室内。5秒后，门升起。当小鼠进入黑暗区室且其所有爪放在网格地板上时，门关闭且足底电击递送3秒。记录避暗潜伏期（step-through latency）（即，进入黑暗区室所花费的潜伏期）和发生数。保留测试在训练后24小时进行。每一小鼠再次置于白色区室内。5秒后，门升起，记录避暗潜伏期和逃逸潜伏期（即，返回白色区室所花费的时间）直至300秒。

对表6中列出的测试组合的每一种观察到阳性结果。

表6

。

V. 本发明的组合改善神经疾病的神经生理学担忧

在Aβ中毒的体内模型中测试组合疗法。评估了其对影响神经疾病的若干参数的作用：

- 胱天蛋白酶3和9表达水平，考虑作为细胞凋亡的指示剂，

- 脂质过氧化，考虑作为氧化应激水平的标志物，

- GFAP表达测定，考虑作为脑炎症水平的标志物，

- 脑血屏障完整性，

- 总体突触完整性（突触素ELISA）。

脑血屏障完整性

关于由Aβ的动物中毒的实验设计与部分III中的相同。

组合疗法对血脑屏障（BBB）完整性的潜在保护性作用在脑室内(i.c.v.)注射有低聚淀粉样蛋白-β25-35肽(Aβ25-35)或打乱的Aβ25-35对照肽(Sc.Aβ)的小鼠中在注射后7天进行分析。

在Aβ_25-35注射后第7天，测试动物以通过EB（伊文思蓝）方法测定BBB完整性。已知EB染料外周注射后结合血清白蛋白且已用作血清白蛋白的示踪剂。

将EB染料（2％于盐水中，4ml/kg）在经心脏(transcardiac)输注前3小时腹膜内(i.p.)注射。将小鼠随后用i.p. 200 µl预混氯胺酮80 mg/kg、赛拉嗪10 mg/kg麻醉，打开胸腔。将小鼠用250 ml盐水大约15分钟经心脏输注直至来自右心房的流体变成无色。断头后，将脑移除且切开为三个区域：大脑皮层（左＋右）、海马（左＋右）、间脑。随后，每一脑区域称重用于定量测量EB-白蛋白外渗。

将样品在磷酸缓冲盐溶液中均化并通过添加60％三氯乙酸后涡旋来混合以沉淀蛋白。将样品冷却至4℃，并随后在10,000 g, 4℃下离心30分钟。将上清液使用分光光度仪在610 nm测量EB的吸光度。

如下两种方式定量EB：

■ 通过使用由已知浓度的EB-白蛋白获得的标准曲线的µg/mg脑组织。

■ µg/mg蛋白

如表7中所示，本发明的组合疗法当与未处理的中毒动物相比时，有效维持BBB完整性。

总体突触完整性（突触素ELISA）

突触素已选作突触完整性的标志物并使用

可商购ELISA试剂盒(USCN , Ref. E90425Mu)来测定。样品从海马组织制备并在如制造商和参考文献所述特定的提取缓冲液中均化。

将组织用冰冷的PBS (0.02 mol/l, pH 7.0-7.2)润洗以彻底去除多余血液并称重，随后氮冷冻并-80℃储存。将组织切为小块并在1 ml冰冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS）溶液中用玻璃匀浆器进行均化。所得的悬浮液用超声细胞破碎仪超声破碎或进行两轮冻融循环以进一步破碎细胞膜。随后，将匀浆以5,000 g离心5分钟并立即测定上清液。

所有样品一式三份测定。

蛋白定量用Pierce BCA (二喹啉甲酸)蛋白测定试剂盒(Pierce, Ref. #23227)进行以评价提取性能并允许归一化。

总蛋白浓度随后从标准曲线稀释液进行计算并用于将ELISA结果归一化。

结果（表7）显示当与未处理的中毒动物相比时，组合疗法在维持处理动物的脑中的总体突触素水平中是有效的。

氧化应激测定

将小鼠通过断头处死并迅速去除海马，称重并保持在液氮直至测定。解冻后，将海马在冰冷的甲醇（1/10 w/v）中均化，以1,000 g离心5分钟，并将上清液置于eppendorf管中。将每一匀浆的反应体积添加至FeSO4 1 mM、H2SO4 0.25 M、二甲酚橙1 mM，并在室温孵育30分钟。在580 nm(A580 1)读取吸光度后，将10 µl过氧化氢异丙苯1 mM (CHP)加入至样品并在室温孵育30分钟，以测定最大氧化水平。在 580 nm (A580 2)测量吸光度。脂质过氧化水平测定为CHP当量（CHPE），根据：CHPE = A580 1/A580 2 x [CHP]，且表示为CHP当量/组织重量且作为对照组数据的百分比。

结果（表7）显示当与未处理的中毒动物相比时，组合疗法在降低处理动物的脑中Aβ诱导的总体氧化应激中是有效的。

胱天蛋白酶途径诱导测定和GFAP表达测定

小鼠通过断头处死且将两个海马迅速移除，在冰冷的PBS (0.02 mol/l, pH 7.0-7.2)中润洗以彻底去除多余血液，称重并保持在液氮直至测定。将组织切为小块并在1 ml冰冷的PBS中用玻璃匀浆器进行均化。所得的悬浮液用超声细胞破碎仪超声破碎或进行两轮冻融循环以进一步破碎细胞膜。随后，将匀浆以5,000 g离心5分钟并立即测定上清液。

实验用商购测定进行：胱天蛋白酶-3 (USCN – E90626Mu), 胱天蛋白酶-9 (USCN– E90627Mu), GFAP (USCN – E90068)。

蛋白定量用Pierce BCA (二喹啉甲酸)蛋白测定试剂盒(Pierce, Ref. #23227)进行以评价提取性能并允许归一化。

结果（表7）显示当与未处理的中毒动物相比时，组合疗法对处理动物的脑中的细胞凋亡和炎症的标志物具有正面作用。

表7

药物组合	胱天蛋白酶途径	氧化应激	GFAP表达	BBB完整性	总体突触完整性
						巴氯芬-托拉塞米	+	+	+	+	+
巴氯芬-阿坎酸-托拉塞米	+	+	+	+	+
						美西律和艾芬地尔	+	+	+	+	+
磺胺异噁唑和托拉塞米	+	+	+	+	+

B）对神经元细胞的谷氨酸毒性的阻止

在这进一步的一组实验中，已测试候选化合物其阻止或降低对神经元细胞的谷氨酸毒性作用的能力。谷氨酸毒性涉及神经疾病或病症诸如多发性硬化、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、神经病、酒精中毒或酒精戒断、或脊髓损伤的发病。首先单独测试药物，随后测定其组合作用。

方法

本发明的药物组合的效力对原代皮层神经元细胞进行评价。这些测定中使用的方案与上文部分A.I.2中所述相同。

谷氨酸毒性测定

化合物的神经保护作用通过定量神经突网络（神经丝免疫染色（NF））来评估，其具体揭示谷氨酸能神经元。

神经元培养12天后，将候选组合的药物溶解在培养基(+0.1% DMSO)中。候选组合随后与神经元预孵育1小时，随后谷氨酸损伤。孵育后1小时，在候选组合存在的情况下添加谷氨酸20分钟至40μM的浓度，以避免进一步的药物稀释。孵育结束时，将培养基用具有候选组合但无谷氨酸的培养基更换。谷氨酸损伤后24小时固定培养物。MK801 (地佐环平氢马来酸盐（Dizocilpinehydrogen maleate）, 77086-22-7 - 20μM)用作正对照。

用皂苷（Sigma）透化后，将细胞用含有10％山羊血清的PBS封闭2小时，随后将细胞与针对神经丝抗体的小鼠单克隆一级抗体(NF, Sigma)一起孵育。用 Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG显示该抗体。

细胞的细胞核通过荧光标记物(Hoechst solution, SIGMA)进行标记，并定量神经突网络。将六个孔/条件用于评估3个不同的培养物中的神经元存活。

结果

所有测试的药物组合对于皮层神经元细胞提供了针对谷氨酸毒性的保护作用。结果显示于下表8中。

如图24和25中所示，本发明的组合强烈保护神经元免于在上述实验条件下的谷氨酸毒性。值得注意的是使用这样的药物浓度观察到有效保护，在所述药物浓度下单独使用的药物不具有显著的保护作用或具有较低的保护作用。

表8

药物组合	针对谷氨酸毒性的神经保护作用
		巴氯芬-托拉塞米	+
巴氯芬-阿坎酸-托拉塞米	+
		美西律和艾芬地尔	+
磺胺异噁唑和托拉塞米	+

C）使用本发明的组合改善与谷氨酸毒性相关的其他病症

本发明的药物和药物组合针对谷氨酸毒性的上述体外保护作用并组合在几种AD模型中本文示例的保护作用，促使发明人在其他疾病的一些模型中在谷氨酸毒性也涉及的发病机制如MS、ALS和神经学疼痛中测试这些药物和组合。

I) 组合在多发性硬化的体内模型中的保护作用.

使用其中髓鞘-少突胶质细胞糖蛋白-免疫的（MOG免疫的）小鼠发生慢性进展性EAE的模型来证实本发明的组合物在多发性硬化治疗中的有益效果。

动物和化学品

C57L/6J小鼠（8周龄）购自Janvier (France)；驯化两周后，用MOG（髓鞘-少突胶质细胞糖蛋白）肽免疫后使雌性小鼠（10周龄）发生慢性麻痹。实验性脑脊髓炎用Hooke KitMOG_35-55/CFA Emulsion PTX (百日咳毒素)诱导用于EAE诱导(EK-0110, EK-0115; Hookelaboratories)。对照试剂盒为CK-0115 (Hooke laboratories)。

实验程序

实验性脑脊髓炎通过以下程序诱导：

第0天，进行两次各自0.1 ml的皮下注射；一次在小鼠的上背部且一次在下背部。每次注射含有100µg MOG_35-55肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)、200µg灭活的结核分枝杆菌H37Ra且在完全弗氏佐剂中乳化(CFA) (Hooke laboratories)。乳剂提供扩增和区分MOG特异性自身免疫T细胞所需的抗原。

在MOG注射后2小时（第0天）和24小时（第1天）进行在PBS中的500 ng百日咳毒素的两次腹膜内注射（Hooke试剂盒）。通过提供额外佐剂百日咳毒素增强EAE发生。

免疫后8天小鼠发生EAE且在实验持续时间中保持长期麻痹。免疫后，以保密程序（blind procedure）每日观察小鼠的临床症状。将动物置于常规无病原体设施中且所有实验均根据由常设的生物伦理地方委员会规定的指导方针进行且由其批准。

实验组和药物处理：

如公开的雌性小鼠的组免疫前根据重量混匀。

- 对照组：在相同条件的EAE小时中媒介物注射（从第-1天至第28天，每日给予安慰剂）

- EAE组：MOG注射（第0天）＋百日咳毒素注射（第0和1天）－从第-1天至第28天，每日口服给予安慰剂

- EAE+正对照：MOG注射（第0天）＋百日咳毒素注射（第0和1天）－从第-1天至第28天，每日口服给予右苯丙胺

- EAE＋处理组：MOG注射（第0天）＋百日咳毒素注射（第0和1天）。处理在免疫前一天开始且持续直至第28天。

临床评分在第0-5-8-9-12-14-16-19-21-23-26-28天测量。

统计软件(Statsoft Inc.)用于整个统计分析。使用ANOVA分析和Student检验来分析临床疾病评分。P < 0.05认为是显著的。

疾病延迟、临床评分和死亡延迟已在各组与参考“immu”组之间通过Kaplan-Meier曲线和Cox模型(R包装‘存活’)来比较。所得的p值是单侧的且测试假说比参考‘immu’组更优。

总临床评分由尾评分、后肢评分、前肢评分和膀胱评分构成，如下所述：

尾评分：

评分=0	正常小鼠移动时保持其尾部直立。
		评分=1	如果尾部远端松弛，趋于落下。
评分=2	如果尾部完全松弛且拖在桌上。

后肢评分：

前肢评分：

评分=0	正常小鼠活跃地使用其前爪来抓取和行走且保持其头部直立。
		评分=1	由于一个或两个爪虚弱，可以行走但困难，例如，当小鼠抓住铁丝顶笼的下侧具有困难时，认为前爪虚弱。虚弱的另一征兆是头部下垂。
评分=2	当一个前肢麻痹（无法抓握且小鼠回转麻痹的肢）。此时头部也失去其大部分的肌肉紧张度。
		评分=3	小鼠无法移动，且无法获取食物和水。

膀胱评分：

评分=0	正常小鼠可以完全控制其膀胱。
		评分=1	当其下体被尿浸湿认为小鼠失禁。

听过添加所有上述分类来确定每一小鼠的总体评分。活动物的最大评分为10。

结果－组合疗法在MS小鼠中是有效的

在“EAE+处理组”小鼠中观察到总体临床评分的显著改善，显著的是表9中列出的组合。

表9

药物组合	EAE动物中总体临床评分的改善
		巴氯芬-托拉塞米	+
巴氯芬-阿坎酸-托拉塞米	+
		美西律和艾芬地尔	+
磺胺异噁唑和托拉塞米	+

II.ALS组合模型的保护作用

根据本发明的组合疗法体外在共培养模型中和体内在ALS的小鼠模型中进行测试。方案和结果呈现于该部分。

II.1 神经-肌肉共培养的原代培养物中针对谷氨酸毒性的保护作用

神经和肌肉细胞的原代共培养

根据之前所述方法从健康患者的活检样品部分中制备人肌肉（44）。肌肉细胞从解离的细胞建立（10000细胞/孔），置于明胶包被0.1％的48孔板中且在由MEM培养基和M199培养基的混合物组成的增殖培养基中生长。

卫星细胞融合后立即将13天龄Wistar大鼠胚胎脊髓的完整横切片（附有背根神经节 （DRG））置于肌肉单层1外植块/孔（在中央区域）。需要DRG以实现良好比例的神经支配。神经支配的培养物保持在混合培养基中。在通常的共培养物中24小时后，观察到神经突（neuritis）从脊髓外植块生长出。它们与肌管接触并在8天后诱导首次收缩。其后很快，位于邻近脊髓外植块的神经支配的肌纤维实际上持续收缩。神经支配的纤维形态上和空间上不同于无神经支配的纤维且能够容易地将其分辨。

一次共培养完成（6孔/条件）。

谷氨酸损伤

在第27天，将共培养物与候选化合物或利鲁唑在谷氨酸中毒 (60 µM) 前一小时孵育20分钟。随后，将共培养物洗涤且加入候选化合物或利鲁唑另外的48小时。该孵育时间后，将未固定的培养物与以浓度500 nmol/L的偶联有Alexa 488的α-银环蛇毒素在室温下孵育15分钟。随后，将共培养物在室温由PFA固定20分钟。用0.1％皂苷透化后，将共培养物与抗神经丝抗体（NF）孵育。

用 Alexa Fluor 568山羊抗小鼠IgG (分子探针)检测这些抗体。神经元的细胞核用荧光标记物(Hoechst solution)进行标记。

终点为（1）总神经突长度，（2）运动单位的数目，（3）总运动单位区域，其指示运动神经元存活和功能性。

对于每个条件，使用InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare)用20x放大获取每孔2x10张图片。所有图像在相同条件下取得。

结果

本发明的药物在共培养模型中有效保护运动神经元和运动单位。此外，当药物以表10中列出的药物组合来组合使用时，注意到保护的改善。

表10

药物组合	针对肌肉/神经共培养物中谷氨酸中毒的阳性作用
		巴氯芬-托拉塞米	+
巴氯芬-阿坎酸-托拉塞米	+
		美西律和艾芬地尔	+
磺胺异噁唑和托拉塞米	+

II.2 –组合疗法在ALS小鼠模型中是有效的

对雄性小鼠进行实验。在该组实验中选择转基因雄性小鼠B6SJL-Tg(SOD1)2Gur/J小鼠及其对照(分别为来自Jackson Laboratories的SN2726和SN2297, Ben Harbor, USA且由Charles River于France分配)以模拟ALS。

患病小鼠表达SOD1-G93A转基因，其设计为由其内源人SOD1启动子驱动的突变体人SOD1基因（在密码子93处甘氨酸至丙氨酸的单一氨基酸取代）。对照小鼠表达对照人SOD1基因。

药物施用

小鼠从出生后第60天直至死亡用在媒介物中稀释的候选药物处理进行给药。药物候选物的稀释溶液临近在施用开始前室温下用水制备。

· 在饮用水中：

将利鲁唑以在5％环糊精中6mg/ml的终浓度（对每组平均体重进行调整）添加在饮用水中。由于小鼠饮用约5 ml/日，估计的施用剂量为30mg/kg/日，其为显示增加小鼠存活的剂量。

－ 环糊精以5％的终浓度用作媒介物，在室温下从储备溶液（环糊精20％）在水中稀释。

· 口服施用（经口）：

－ 每日经口施用药物组合。

－ 环糊精以5％的终浓度用作媒介物，在室温下从储备溶液（环糊精20％）在水中稀释。

临床观察

每只小鼠的临床观察每日进行，从处理的第一天（60天龄）直至死亡（或处死）。临床观察在于研究行为测试：麻痹的开始、“伸展（splay）丧失”、“翻正反射丧失”和一般步态观察：

－ 麻痹的开始：观察由每肢的麻痹观察组成。麻痹的开始对应于首次麻痹征兆当天。

－ 伸展丧失测试由当小鼠通过尾部悬吊时震颤或摇动通知（shakingnotification）和后肢的位置（悬挂或伸展开）组成。

－ 翻正反射丧失测试评价小鼠被翻至任一侧后在30秒内自己翻正的能力。当小鼠无法自己翻正时翻正反射丧失。翻正反射丧失确定疾病的末期：无法自己翻正的小鼠被安乐死。

结果－组合疗法在ALS体内模型中是有效的

疾病的改善对于用本发明的药物和药物组合处理的患病动物观察到。显著地，表11中列出的药物组合在疾病的不同阶段有效地改善这些动物的临床评分。

表11：

药物组合	对患病动物中临床评分的作用
		巴氯芬-托拉塞米	+
巴氯芬-阿坎酸-托拉塞米	+
		美西律和艾芬地尔	+
磺胺异噁唑和托拉塞米	+

III) 本发明的组合在作为神经学疼痛的体内模型的奥沙利铂诱导的神经病中的 保护作用。

在合适的外周神经病的模型（即奥沙利铂诱导的神经病和奥沙利铂诱导的神经病的慢性模型）中体内测试本发明的组合疗法。动物、方案和结果呈现于该部分。

动物养殖

在奥沙利铂处理实验开始时(D₀)使用称重为150 - 175 g的Sprague-Dawley 大鼠(CERJ, France)。动物饲养在具有12小时光/暗周期的温度(19.5℃ - 24.5℃)和相对湿度(45 % - 65 %)受控房间内的受限接近动物设施中，整个研究过程中随意接近标准压片的实验室食物和水。动物每笼饲养4或5只且在任何测试前观察一周驯化周期。

实验设计

在所有实验中使用以下四组大鼠：

对照组：

组1：奥沙利铂的媒介物（蒸馏水），i.p./候选组合的媒介物（蒸馏水），每日p.o.

组2：奥沙利铂（蒸馏水），i.p./候选组合的媒介物（蒸馏水），每日p.o.

组3：奥沙利铂3 mg/kg i.p./单一药物于蒸馏水中，p.o. 每日 x 9

测试的组合物组：

组4：奥沙利铂3 mg/kg i.p./候选组合于蒸馏水中，p.o. 每日 x 9

组5：奥沙利铂3 mg/kg i.p./ 加巴喷丁(100 mg/kg)于蒸馏水中, p.o. 在测试日(即D₁ & D₈);

媒介物和测试项从D-1至D7（最后测试日前一天）每日递送，而加巴喷丁在测试日施用（测试前120分钟）。

可能时，所有处理均以编码且随机次序施用。剂量以游离活性物质表示。

神经病诱导

通过单次腹膜内注射奥沙利铂(3 mg/kg)诱导急性神经病。

通过在第0、2、4和7天重复腹膜内注射奥沙利铂(3 mg/kg)(CD= 12 mg/kg, i.p.)诱导慢性外周神经病。人中的慢性神经病也是累积性的且最常见于已接受奥沙利铂> 或 =540 mg/m²总剂量的患者中，其对应于大鼠中~15 mg/kg作为累积剂量(Cersosimo R.J.2005)。

大鼠中奥沙利铂诱导的疼痛性神经病在奥沙利铂治疗的患者中再现疼痛症状：

- 热痛觉过敏是最早的症状。其可用丙酮测试或用尾部浸渍测试来测量；

- 机械痛觉过敏出现较晚。其可用Von Frey测试或用爪压力测试来定量。

动物给药和测试

所有药物组合从首次腹膜内注射奥沙利铂3 mg/kg前一天(D-1)施用且每日经口持续直至D7。在测试日（即D1和D7）过程中，测试后施用药物组合。来自参考处理组（加巴喷丁）的动物仅在测试日过程中给药。

丙酮测试

使用丙酮测试通过在D1（首次注射奥沙利铂3 mg/kg后约24小时（奥沙利铂急性作用））和D8（奥沙利铂慢性作用）测量对热非伤害性疼痛刺激的响应来评估冷异常性疼痛。

在丙酮测试中，在施加一滴丙酮至两个后爪跖面后测量后爪缩回的潜伏期（反应时间）并评分响应的强度（冷评分）。丙酮施加后20秒（截止）内测量对丙酮的冷却作用的反应时间。对丙酮的响应还分级为以下4点量表：0（无响应）；1（快速缩回，爪轻弹）；2（长时间的缩回或爪显著轻弹）；3（爪重复轻弹伴有舔或咬）。

对于每一实验组，结果表示为：

－反应时间定义为以秒表示的引起爪反应所需的时间（每只大鼠一共6次测量的平均值 ± SEM）。

－累积冷评分定义为每只大鼠一共6次评分的总和 ± SEM。最低分为0（对于6次试验任一次均无响应）且最大的可能分为18（六次试验每一次的重复轻弹且舔或咬）。

统计分析

进行Student检验、单侧、3型。显著水平设置为p< 0.05; 将所有组与患病＋媒介物组（奥沙利铂处理组）比较。平均值和标准差平均值显示在图上。

结果

奥沙利铂在时间过程中诱导丙酮施加（患病组＋媒介物）后爪缩回的反应时间的显著降低。相比于媒介物组，这一降低从第1天（奥沙利铂诱导的神经病的急性模型）至第8天（慢性模型）是进展的且显著的。

· 奥沙利铂诱导的神经病急性模型中的抗异常疼痛作用

用丙酮测试评估奥沙利铂诱导的神经病急性模型中测试的药物组合。表12呈现与奥沙利铂-媒介物处理组（组2）相比诱导累积冷评分中的显著降低和反应时间的显著增加的药物组合（组4）。结论是，这些药物组合保护动物免于由奥沙利铂诱导的急性神经病。

表12

+ = 在急性奥沙利铂诱导的模型中，在丙酮测试中累积冷评分分析和反应时间分析后，大鼠的组4中获得的抗异常疼痛作用。

· 奥沙利铂诱导的神经病慢性模型中的抗异常疼痛作用

用丙酮测试评估奥沙利铂诱导的神经病慢性模型中使用的药物组合。

表13呈现药物组合，对于所述药物组合，在神经病的慢性模型中，在处理后在组4（用药物组合和奥沙利铂处理的动物）中测量的丙酮测试中反应时间和冷评分相比于奥沙利铂-媒介物处理组（组2）分别显著增加和降低。结论是，这些药物组合保护动物免于由奥沙利铂诱导的慢性神经病。

表13

+ = 在慢性奥沙利铂诱导的模型中，在丙酮测试中累积冷评分分析和反应时间分析后，大鼠的组4中获得的抗异常疼痛作用。

IV)基于巴氯芬-托拉塞米的组合物在未中毒细胞中促进神经再生

巴氯芬-托拉塞米组合体外的神经营养性作用

神经突长度测定

使用MAP-2抗体如部分A）II.4中所述进行在大鼠皮层细胞的10天龄培养物中的神经突生长评价，例外是细胞未暴露于任何毒物。10天龄细胞培养物在测定前与药物孵育1天。

结果

如图28中所示，巴氯芬-托拉塞米组合展示显著的神经营养性作用（＋11％）而各个药物当单独施用时不具有任何实质的神经营养性作用。的确，暴露于巴氯芬-托拉塞米组合（分别400 nM和80 nM）时观察到神经元网络中总神经突长度的显著增加（MAP2-2标记）。值得注意的是，组合或单独的药物对于神经元数目均无作用，由此强调神经突网络中的这种增加与现存的神经突的延伸和促进重新神经元细胞延伸有关。

这些结果证实巴氯芬-托拉塞米组合在支持轴突延伸中是有效的且因此在治疗脊髓损伤和其他神经损伤中是有效的。还证实该组合在治疗包含轴突、脱髓鞘、或轴突和脱髓鞘组分两者的遗传性神经病中是有效的。实际上，应认为脱髓鞘引起轴突的去稳定化，其导致甚至在认为主要为脱髓鞘形式的神经病中观察到的轴突变性。

基于巴氯芬-托拉塞米的组合在促进体内神经再生中是有效的

坐骨神经压伤被广泛接受为外周神经损伤的可靠模型且用于评价神经再生。在该模型中，神经损伤导致神经功能的快速瓦解，如通过测量经刺激损伤的坐骨神经产生的诱发的肌肉动作电位（CMAP）所证实的。

神经损伤特征在于信号的更低的神经传导，其由CMAP产生中增加的潜伏期和导致降低的幅度和持续时间的动作电位强度受损所导致。

通常，神经功能恢复的第一征兆在2周内出现，并且，至损伤后第4周，通过组织学在坐骨神经中观察到再生轴突的显著的髓鞘再生（45）。

神经压伤

使用异氟烷（空气中2.5-3%）将小鼠麻醉。将右大腿去毛且在中部大腿水平面处暴露坐骨神经且在邻近坐骨神经分叉的5 mm处压伤。用显微镊(Holtex, 参考P35311)将神经压伤10秒，两次，每次压伤之间具有90°旋转。对于假手术动物，暴露坐骨神经但不压伤。最后，用缝合夹固定皮肤切口。压伤当日记为第0天。

剂量日程表

压伤当日，压伤后30分钟进行化合物的首次施用。

随后化合物每日施用两次，从压伤后一天和42天过程中。在一天内，药物施用间隔至少6小时。

在测试日（第7和30天），测试前1小时30分向小鼠施用。

施用体积为10ml/kg, 于0.25% DMSO/无菌水中。

肌电描记术测量

肌电描记术记录使用Keypoint肌电图描记器(EMG) (Medtronic, France)在第7天和第30天进行。通过空气中2.5-3%异氟烷将小鼠麻醉。将皮下单级针电极用于刺激和记录。将0.2 ms持续时间的超大(12.8 mA)方波用于刺激坐骨神经。用施加于坐骨切迹的单脉冲刺激右侧坐骨神经（同侧的）。通过置于腓肠肌的针电极记录CMAP。以毫秒表示的CMAP信号的开始（潜伏期）用于估计神经传导速度。潜伏期因此反映轴突髓鞘化的程度。动作(µV)电位的幅度也测定，其反映肌肉的去神经和再神经支配的水平。CMAP幅度目前与再生运动轴突数目成比例给出。还测定诱发的肌肉电位的持续时间。诱发的肌肉电位的幅度和持续时间与肌肉的再神经支配更相关。潜伏期和幅度更通常认为是当处理神经再生时最重要的终点。用单侧、3型、Student t检验分析数据；显著水平设定为p<0.05。

结果

当相比于媒介物处理的动物时，巴氯芬-托拉塞米组合在所有测试的剂量在显著改善信号的时间潜伏期方面均是有效的，且这快至神经损伤的第七天（图29，A）。在神经压伤第30天仍观察到显著差异，这时通常观察到自发恢复的开始。

信号幅度中的统计学上显著改善也在神经压伤第30天对于剂量3观察到（图29，B）。此类改善对于剂量1和2也观察到，但程度更低。类似结果当测量信号的持续时间时也观察到。

总而言之，这些体内结果显示巴氯芬-托拉塞米组合在促进经再髓鞘形成和肌肉再神经支配的神经再生中的效力。因此，体内实验数据证实体外观察到的巴氯芬-托拉塞米的神经营养性作用及其在矫正其中周围神经系统的神经受损的神经病（即本说明书中定义的神经病）以及脊髓损伤中的有用性。

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Claims (9)

1.组合物用于制造药物的用途，所述组合物至少包含托拉塞米和巴氯芬、或其盐或持续释放制剂，所述药物用于促进患有选自神经失用症、轴突断伤或神经断伤的神经损伤、或患有由对神经的直接物理创伤引起的周围神经系统的损伤或患有Charcot-Marie-Tooth的主体中的神经或神经元再生。

2.根据权利要求1的用途，其中所述组合物进一步包含选自以下的至少一种化合物：磺胺异噁唑、甲巯咪唑、丙胺卡因、二羟丙茶碱、米帕林、甘珀酸、阿坎酸、氨基己酸、卡麦角林、乙胺嗪、西那卡塞、桂利嗪、依普利酮、非诺多泮、来氟米特、左西孟旦、舒洛地特、特比萘芬、唑尼沙胺、依托咪酯、苯乙双胍、曲美他嗪、美西律、艾芬地尔、莫西沙星、或溴隐亭、或其盐或持续释放制剂。

3.根据权利要求2的用途，其中所述组合物包含至少一种以下化合物组合：

－ 巴氯芬和曲美他嗪和托拉塞米,

－ 巴氯芬和西那卡塞和托拉塞米,

－ 巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米,

－ 巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和乙胺嗪，或

－ 巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米和艾芬地尔。

4.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。

5.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中将所述组合物中的所述化合物配制为一同、分开或顺序施用。

6.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中将所述化合物重复施用于所述主体。

7.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中托拉塞米的剂量是少于4 mg/日。

8.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中巴氯芬的剂量是少于150 mg/日。

9.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中巴氯芬的剂量是少于50 mg/日。