ES2733954T3 - Composición que comprende torasemida y baclofeno para tratar trastornos neurológicos - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende al menos torasemida y baclofeno, o sus sales o formulaciones de liberación sostenida, para usar para promover la regeneración de nervios o neuronas en un sujeto que padece una lesión nerviosa seleccionada de neuropraxia, axonotmesis o neurotmesis, o una neuropatía causada por lesión nerviosa física directa, o de Charcot-Marie-Tooth.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición que comprende torasemida y baclofeno para tratar trastornos neurológicos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones para usar en el tratamiento de enfermedades y trastornos neurológicos. Más en particular, esta invención se refiere a nuevas terapias de combinación para dichas enfermedades, que incluyen neuropatías
Antecedentes de la invención
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una demencia cortical prototípica caracterizada por la deficiencia de memoria junto con disfasia (trastorno del lenguaje en el que hay un deterioro del habla y de la comprensión del habla), dispraxia (incapacidad de coordinar y realizar ciertos movimientos y gestos intencionados en ausencia de deterioros motores o sensoriales) y agnosia (capacidad para reconocer objetos, personas, sonidos, formas u olores) atribuible a la implicación de las áreas de asociación cortical (1-4).
La EA es actualmente la causa más común de demencia. Se caracteriza clínicamente por un deterioro global de la función cognitiva que progresa lentamente y deja a los pacientes en la etapa terminal en cama, con incontinencia y dependientes de cuidados asistenciales. La muerte ocurre, como media, 9 años después del diagnóstico (5).
La tasa de incidencia de la EA aumenta notablemente con la edad. Las proyecciones de población de las Naciones Unidas estiman que el número de personas mayores de 80 años se acercará a 370 millones en el año 2050. Actualmente, se calcula que 50% de las personas mayores de 85 años padecen la EA. Por lo tanto, más de 100 millones de personas en el mundo padecerán demencia en 50 años. El gran número de personas que requerirán cuidado constante y otros servicios afectará gravemente a los recursos médicos, monetarios y humanos (6). El deterioro de la memoria es la característica temprana de la enfermedad e implica a la memoria episódica (memoria de los sucesos del día a día). La memoria semántica (memoria para el significado verbal y visual) está implicada más tarde en la enfermedad. La característica patológica de la EA incluye placas amiloides que contienen betaamiloide (Abeta), ovillos neurofibrilares (NFT) que contienen Tau y disfunción y pérdida neuronal y sináptica (7-9). Durante la última década, se han propuesto dos hipótesis principales sobre la causa de la EA: la "hipótesis de la cascada amiloide", que establece que el proceso neurodegenerativo es una serie de sucesos desencadenados por el procesamiento anómalo de la proteína precursora de amiloide (APP) (10), y la "hipótesis de la degeneración del citoesqueleto neuronal" (11), que propone que los cambios del citoesqueleto son los sucesos desencadenantes. La teoría más ampliamente aceptada que explica el progreso de la EA sigue siendo la hipótesis de la cascada de amiloide (12-14) y los investigadores de la EA se han centrado principalmente en la determinación de los mecanismos que subyacen en la toxicidad asociada con las proteínas Abeta. La permeabilidad y remodelado microvascular, angiogénesis aberrante y rotura de la barrera hematoencefálica, se han identificado como sucesos clave que contribuyen a la toxicidad de la APP en la cascada amiloide (15). Por el contrario, la proteína Tau ha recibido mucha menos atención de la industria farmacéutica que el amiloide, debido tanto a problemas fundamentales como prácticos. Además, el cambio de densidad sináptica es la lesión patológica que se correlaciona mejor con el deterioro cognitivo que los otros dos.
Los estudios han puesto de manifiesto que la patología amiloide parece que progresa de una forma específica de neurotransmisores donde los terminales colinérgicos parecen los más vulnerables, seguido de los terminales glutaminérgicos y finalmente los terminales GABAérgicos (9). El glutamato es el neurotransmisor excitatorio más abundante en el sistema nervioso de mamíferos. En condiciones patológicas, su acumulación anómala en la hendidura sináptica conduce a la sobreactivación de los receptores de glutamato (16). La acumulación anómala de glutamato en la hendidura sináptica conduce a la sobreactivación de los receptores de glutamato que da como resultado procesos patológicos y finalmente la muerte de células neuronales. Este proceso, llamado excitotoxicidad, se observa normalmente en tejidos neuronales durante trastornos neurológicos agudos y crónicos.
Se está haciendo evidente que la excitotoxicidad está implicada en la patogénesis de múltiples trastornos de diferentes etiologías tales como: lesión de la médula espinal, accidente cerebrovascular, lesión cerebral por traumatismo, pérdida de oído, alcoholismo y abstinencia alcohólica, neuropatía alcohólica o dolor neuropático, así como enfermedades neurodegenerativas tales como la esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington (17-19). El desarrollo de tratamiento eficaz para estas enfermedades sigue siendo un problema de salud pública importante debido a su incidencia, así como a la falta de tratamientos curativos.
Se han ensayado los antagonistas de NMDAR que se dirigen a varios sitios de este receptor para contrarrestar la excitotoxicidad. Los antagonistas de NMDAR no competitivos se dirigen a los poros de canales iónicos reduciendo así la entrada de calcio en las neuronas postsinápticas. Algunos de ellos alcanzan el estado de aprobación. Como un ejemplo, la memantina está actualmente aprobada en la enfermedad de Alzheimer de moderada a grave. Se ensaya clínicamente en otras indicaciones que incluyen un componente de la excitotoxicidad tal como dependencia al alcohol (fase II), esclerosis lateral amiotrófica (fase III), demencia asociada con Parkinson (fase II), epilepsia, enfermedad de Huntington (fase IV), esclerosis múltiple (fase IV), enfermedad de Parkinson (fase IV) y lesión cerebral por traumatismo (fase IV). Sin embargo, esta molécula tiene un beneficio limitado para la mayoría de los pacientes de la enfermedad de Alzheimer, porque tiene efectos sintomáticos solo modestos. Otro planteamiento en la limitación de la excitotoxicidad consiste en inhibir la liberación presináptica de glutamato. El riluzol, aprobado actualmente en la esclerosis lateral amiotrófica, mostraba resultados prometedores en modelos de isquemia y de lesión cerebral por traumatismo (20-23). En este momento se prueba en ensayos en fase II en la esclerosis múltiple temprana, enfermedad de Parkinson (no muestra ningún resultado mejor que el placebo) así como en la lesión de médula espinal. El 1995, el fármaco alcanzó el estado de fármaco huérfano para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica y en 1996 para el tratamiento de la enfermedad de Huntington.
Los documentos WO2009/133128, WO2009/133141, WO2009/133142, WO2011/054759 y WO2012/117073, describen moléculas que se pueden usar en composiciones para el tratamiento de trastornos neurológicos.
A pesar de la investigación activa en este área, todavía hay necesidad de terapias eficaces alternativas o mejoradas para trastornos neurológicos, y, en particular, trastornos neurológicos que están relacionados con el glutamato y/o la toxicidad del amiloide beta. La presente invención proporciona nuevos tratamientos para dichas enfermedades neurológicas del sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (SNP).
Resumen de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar nuevos planteamientos terapéuticos para tratar trastornos neurológicos.
La invención surge, entre otros, del inesperado descubrimiento por los autores de la invención, de que composiciones que comprenden torasemida y baclofeno, representan terapias nuevas y eficaces para usar para promover la regeneración de nervios y neuronas en un sujeto.
La invención se refiere a una composición y una combinación para usar para promover la regeneración de nervios y neuronas en un sujeto, como se define en las reivindicaciones. La invención proporciona, en particular, composiciones que comprenden al menos torasemida y baclofeno, para usar para promover la regeneración de nervios y neuronas en un sujeto que padece una lesión nerviosa seleccionada de neuropraxia, axonotmesis o neurotmesis, o una neuropatía causada por lesión nerviosa física directa, o de Charcot-Marie-Tooth. También se describen en la presente memoria composiciones para tratar trastornos neurológicos, en particular la EA y trastornos relacionados, esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson (EP), neuropatías (por ejemplo, dolor neuropático o neuropatía alcohólica), alcoholismo o abstinencia alcohólica, daños al sistema nervioso periférico, enfermedad de Huntington (EH) y lesión de la médula espinal.
También se describe en la presente memoria una composición, para usar en el tratamiento de un trastorno neurológico, que comprende al menos torasemida, trimetazidina, mexiletina, ifenprodil, moxifloxacino o bromocriptina, o una de sus sales o formulaciones de liberación sostenida.
También se describe en la presente memoria una composición que comprende al menos un primer compuesto seleccionado del grupo que consiste en torasemida, trimetazidina, mexiletina, ifenprodil, moxifloxacino y bromocriptina, o una de sus sales, de cualquier pureza química, o formulaciones de liberación sostenida, en combinación con al menos un segundo compuesto distinto del dicho primer compuesto, seleccionado de sulfisoxazol, metimazol, prilocaína, difilina, quinacrina, carbenoxolona, acamprosato, ácido aminocaproico, baclofeno, cabergolina, dietilcarbamazina, cinacalcet, cinarizina, eplerenona, fenoldopam, leflunomida, levosimendán, sulodexida, terbinafina, zonisamida, etomidato, fenformina, trimetazidina, mexiletina, bromocriptina, ifenprodil, torasemida y moxifloxacino, sus sales de cualquier pureza química, o formulación de liberación sostenida, para la administración simultánea, separada o secuencial.
También se describe en la presente memoria una composición, para usar en el tratamiento de un trastorno neurológico, que comprende al menos un primer compuesto seleccionado del grupo que consiste en torasemida, trimetazidina, mexiletina, ifenprodil, moxifloxacino y bromocriptina, o una de sus sales, de cualquier pureza química, o formulaciones de liberación sostenida, en combinación con al menos un segundo compuesto distinto de dicho primer compuesto, seleccionado de sulfisoxazol, metimazol, prilocaína, difilina, quinacrina, carbenoxolona, acamprosato, ácido aminocaproico, baclofeno, cabergolina, dietilcarbamazina, cinacalcet, cinarizina, eplerenona, fenoldopam, leflunomida, levosimendán, sulodexida, terbinafina, zonisamida, etomidato, fenformina, trimetazidina, mexiletina, bromocriptina, ifenprodil, torasemida y moxifloxacino, sus sales de cualquier pureza química, o formulación de liberación sostenida, para la administración simultánea, separada o secuencial.
También se describe en la presente memoria una composición que comprende al menos un primer compuesto seleccionado del grupo que consiste en torasemida, trimetazidina, mexiletina, ifenprodil, moxifloxacino y bromocriptina, su(s) sal(es) de cualquier pureza química, o formulación(es) de liberación sostenida, en combinación con al menos un segundo compuesto distinto del dicho primer compuesto, seleccionado de sulfisoxazol, metimazol, prilocaína, difilina, quinacrina, carbenoxolona, acamprosato, ácido aminocaproico, baclofeno, cabergolina, dietilcarbamazina, cinacalcet, cinarizina, eplerenona, fenoldopam, leflunomida, levosimendán, sulodexida, terbinafina, zonisamida, etomidato, fenformina, trimetazidina, mexiletina, bromocriptina, ifenprodil, torasemida y moxifloxacino, su(s) sal(es) de cualquier pureza química, o formulación(es) de liberación sostenida, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para la administración simultánea, separada o secuencial.
La mayoría de las composiciones de fármacos preferidas comprenden 2, 3, 4 o 5, incluso más, fármacos distintos. Además, las composiciones de fármacos anteriores también se pueden usar en combinación además con uno o varios fármacos adicionales o tratamientos beneficiosos para sujetos con un trastorno neurológico.
También se describe en la presente memoria el uso de al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en torasemida, trimetazidina, mexiletina, ifenprodil, bromocriptina y moxifloxacino, o su(s) sal(es) de cualquier pureza química, o formulación(es) de liberación sostenida, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurológico.
También se describe en la presente memoria el uso de combinaciones de fármacos descritos antes, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurológico.
La invención se puede usar en cualquier sujeto mamífero, en particular sujeto humano, en cualquier fase de la enfermedad.
Breve descripción de las figuras
Para las figuras 1 a 27, *: p<0.05: significativamente diferentes del control (no intoxicación); "ns": efecto no significativo (ANOVA prueba a posteriori de Dunnett)
Figura 1: Efecto del pretratamiento con fármacos seleccionados contra lesiones por AP1-42 humano en HBMEC. A) Validación del modelo experimental usado para el cribado de fármacos: 1 h de pretratamiento con VEGF 10 nM protegía de forma significativa la red de capilares de esta lesión amiloide (+70% de red de capilares en comparación con la intoxicación por amiloide). La intoxicación se previene de forma significativa mediante torasemida (B) y bromocriptina (C) en dosis tan bajas como 400 nM y 3.2 nM respectivamente, mientras que para las dosis superiores e inferiores no se observa efecto o se observa un efecto más débil. *: p<0.05: significativamente diferente de la intoxicación por amiloide.
Figura 2: Efecto del pretratamiento con fármacos seleccionados en la liberación de LDH en ensayos de toxicidad de Ap1 -42 en células corticales primarias de rata. A) Validación del modelo experimental usado para el cribado de fármacos: 1 h de pretratamiento con estradiol (150 ng/ml) protegía de forma significativa las neuronas de esta lesión amiloide (-70 %), lo que se considera como un control positivo para la neuroprotección. Para todos los experimentos, AP1-42 produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. La intoxicación se previene significativamente mediante bromocriptina (40 nM, -29%) (B), trimetazidina (40 nM, -94%) (C), ifenprodil (600 nM, -94%) (D), mexiletina (3.2 nM, -73%) (e ), moxifloxacino (20 nM, -63%) (F). Hay que señalar que para otras concentraciones de fármaco no se observa efecto o se observa efecto más débil para dosis superiores e inferiores. *: p<0.05: significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 3: Efecto de la terapia de combinación de baclofeno y torasemida en la longitud total de la red de capilares en cultivos de HBMEC intoxicadas con beta-amiloide. El péptido amiloide humano agregado (AP1-42 2.5 |iM) produce una intoxicación significativa, por encima de 40%, en comparación con las células tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa por la combinación de baclofeno y torasemida (A), mientras que, en esas concentraciones, el baclofeno (B) y la torasemida (C) solos no tienen ningún efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05: significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 4: Efecto de la terapia de combinación de sulfisoxazol y torasemida en la longitud total de la red de capilares en cultivos de HBMEC intoxicadas con beta-amiloide. El péptido amiloide humano agregado (AP1-422.5 |iM) produce una intoxicación significativa, por encima de 40%, en comparación con las células tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de sulfisoxazol y torasemida (A), mientras que, en esas concentraciones, el sulfisoxazol (B) y la torasemida (C) solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05: significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 5: Efecto de la terapia de combinación de eplerenona y torasemida en la longitud total de la red de capilares en cultivos de HBMEC intoxicadas con beta-amiloide. El péptido amiloide humano agregado (AP1-422.5 pM) produce una intoxicación significativa, por encima de 40%, en comparación con las células tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de eplerenona y torasemida (A), mientras que, en esas concentraciones, la torasemida (B) y la eplerenona (C) solas no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 6: Efecto de la terapia de combinación de bromocriptina y sulfisoxazol en la longitud total de la red de capilares en cultivos de HBMEC intoxicadas con beta-amiloide. El péptido amiloide humano agregado (AP1-42 2.5 pM) produce una intoxicación significativa, por encima de 40%, en comparación con las células tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de bromocriptina y sulfisoxazol (A), mientras que, en esas concentraciones, la bromocriptina (B) y el sulfisoxazol (C) solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 7: Efecto de la terapia de combinación de acamprosato e ifenprodil en la liberación de LDH en la toxicidad de Api-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (Api-4 210 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de acamprosato e ifenprodil (A), mientras que, en esas concentraciones, el acamprosato (B) y el ifenprodil (C) solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por Api-42.
Figura 8: Efecto de la terapia de combinación de baclofeno y mexiletina en la liberación de LDH en la toxicidad del Api-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (Api-4 210 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de baclofeno y mexiletina (A), mientras que, en esas concentraciones, el baclofeno (B) y la mexiletina (C) solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p=0.051, diferente de la intoxicación por Api-42.
Figura 9: Efecto de la terapia de combinación de baclofeno y trimetazidina en la liberación de LDH en la toxicidad del Api-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (Api-4 210 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de baclofeno y trimetazidina (A), mientras que, en esas concentraciones, el baclofeno (B) y la trimetazidina (C) solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por Api-42.
Figura i0: Efecto de la terapia de combinación de cinacalcet y mexiletina en la liberación de LDH en la toxicidad del Api-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (Api-4 210 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de cinacalcet y mexiletina (A), mientras que, en esas concentraciones, el cinacalcet (B) y la mexiletina (C) solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por Api-42.
Figura i i : Efecto de la terapia de combinación de cinarizina y trimetazidina en la liberación de LDH en la toxicidad del Api-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (Api-42 i0 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de cinarizina y trimetazidina (A), mientras que, en esas concentraciones, la cinarizina (B) y la trimetazidina (C) solas no tienen ningún efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por Api-42.
Figura i2: Efecto de la terapia de combinación de trimetazidina y zonisamida en la liberación de LDH en la toxicidad del Api-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (Api-42 i0 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de trimetazidina y zonisamida (A), mientras que, en esas concentraciones, la trimetazidina (B) y la zonisamida (C) solas no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por Api-42.
Figura i3: Efecto de la terapia de combinación de terbinafina y torasemida en la longitud total de la red de capilares en cultivos de HBMEC intoxicadas con beta-amiloide. El péptido amiloide humano agregado (Api-422.5 |iM) produce una intoxicación significativa, por encima de 40%, en comparación con las células tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de terbinafina y torasemida (A), mientras que, en esas concentraciones, la terbinafina (B) y la torasemida (C) solas no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por Api-42.
Figura i4: Efecto de la terapia de combinación de cinacalcet y mexiletina en la longitud total de la red de capilares en cultivos de HBMEC intoxicadas con beta-amiloide. El péptido amiloide humano agregado (Api-422.5 |iM) produce una intoxicación significativa, por encima del 40%, en comparación con las células tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de cinacalcet y mexiletina (A), mientras que, en esas concentraciones, el cinacalcet (B) y la mexiletina (C) solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por Api-42.
Figura i5: Efecto de la terapia de combinación de baclofeno y torasemida en la liberación de LDH en la toxicidad del Api-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (Api-4 210 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de baclofeno y torasemida, mientras que, en esas concentraciones, el baclofeno y la torasemida solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por Api-42.
Figura i6: Efecto de la terapia de combinación de torasemida y sulfisoxazol en la liberación de LDH en la toxicidad del Api-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (Api-42 i0 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de sulfisoxazol y torasemida (A), mientras que, en esas concentraciones, la torasemida (B) y el sulfisoxazol (C) solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 17: Efecto de la terapia de combinación de moxifloxacino y trimetazidina en la liberación de LDH en la toxicidad del AP1-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (AP1-42 10 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de moxifloxacino y trimetazidina (A). La adición de moxifloxacino permite un aumento del 100% del efecto observado para la trimetazidina (C) sola, mientras que, en la misma concentración, el moxifloxacino (B) solo no tiene efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 18: Efecto de la terapia de combinación de moxifloxacino y baclofeno en la liberación de LDH en la toxicidad del AP1-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (AP1-42 10 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de moxifloxacino y baclofeno (A), mientras que, en esas concentraciones, la moxifloxacino (B) y el baclofeno (C) solos no tienen ningún efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 19: Efecto de la terapia de combinación de moxifloxacino y cinacalcet en la liberación de LDH en la toxicidad del Ap1-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (AP1-42 10 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de moxifloxacino y cinacalcet (A), mientras que, en esas concentraciones, el moxifloxacino (B) y el cinacalcet (C) solos no tienen ningún efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 20: Efecto de la terapia de combinación de moxifloxacino y zonisamida en la liberación de LDH en la toxicidad del AP1-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (AP1-42 10 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de moxifloxacino y zonisamida (A). La adición de moxifloxacino permite un aumento de 81% del efecto observado para la zonisamida (C) sola, mientras que, en la misma concentración, el moxifloxacino (B) solo no tiene efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 21: Efecto de la terapia de combinación de moxifloxacino y sulfisoxazol en la liberación de LDH en la toxicidad del AP1-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (AP1-42 10 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de moxifloxacino y sulfisoxazol (A), mientras que, en esas concentraciones, el moxifloxacino (B) y el sulfisoxazol (C) solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 22: Efecto de la terapia de combinación de mexiletina (MEX) e ifenprodil (IFN) en la liberación de LDH en la toxicidad del AP1-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano agregado (AP1-42 10 |iM) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de mexiletina 25,6 pM e ifenprodil 24 nM, mientras que, en esas concentraciones, la mexiletina y el ifenprodil solos no tienen ningún efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.0572, significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 23: Efecto de la terapia de combinación de baclofeno (BCL) y torasemida (TOR) en la longitud total de la red de neuritas en neuronas corticales intoxicadas con beta-amiloide. El péptido amiloide humano (AP1-42 2.5 ^M) produce una intoxicación significativa, por encima de 15%, en comparación con las células tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene de forma significativa mediante la combinación de torasemida y baclofeno; además, esta combinación permite un aumento del crecimiento de las neuritas. *: p<0.05, significativamente diferente de la intoxicación por AP1-42.
Figura 24: Efecto de la terapia de combinación de cinacalcet y mexiletina frente a la toxicidad del glutamato en células corticales neuronales. La intoxicación por glutamato se previene de forma significativa mediante la combinación de cinacalcet (64 pM) y mexiletina (25,6 pM), mientras que, en esas concentraciones, el cinacalcet y la mexiletina solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. * p<0.001, significativamente diferente de la intoxicación por glutamato; (ensayo ANOVA prueba a posteriori de Dunnett).
Figura 25: Efecto de la terapia de combinación de sulfisoxazol y torasemida frente a la toxicidad del glutamato en células corticales neuronales. La intoxicación por glutamato se previene de forma significativa mediante la combinación de sulfisoxazol (6,8 nM) y torasemida (400 nM), mientras que, en esas concentraciones, el sulfisoxazol y la torasemida solos no tienen efecto significativo en la intoxicación. *: p<0.001, significativamente diferente de la intoxicación por glutamato; (ensayo ANOVA prueba a posteriori de Dunnett).
Figura 26: Efecto del pretratamiento con torasemida (TOR) en la liberación de LDH en ensayos de toxicidad de Api-42 humano en células corticales primarias de rata. El Api-42 produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. La intoxicación se previene de forma significativa mediante torasemida (200 nM, -90%) 0: p<0.0001: significativamente diferente de la intoxicación por Api-42.
Figura 27: Comparación de pretratamiento con acamprosato y su derivado homotaurina en la liberación de LDH en ensayos de toxicidad de Api-42 humano en células corticales primarias de rata. El Api-42 produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. La intoxicación se previene de forma igualmente significativa mediante homotaurina y acamprosato (99%, 8 nM). 0: p<0.000i: significativamente diferente de la intoxicación por Api-42.
Figura 28: Efecto de la combinación de baclofeno (BCL) y torasemida (TOR) en la longitud total de la red de neuritas de neuronas corticales cultivadas en ausencia de tóxico. Se observa un aumento de la longitud de la red de neuritas cuando se añade la combinación de baclofeno (400 nM) y la torasemida (80 nM) en el medio de cultivo; además esta combinación permite una mejora del crecimiento de neuritas mientras que, en esas concentraciones el baclofeno y la torasemida solos no tienen efecto significativo (ns) en la longitud de la red de neuritas. * p<0.005, significativamente diferente del control.
Figura 29: Efecto de la combinación de baclofeno (BCL) y torasemida (TOR) en promover la regeneración de nervios después de aplastamiento de nervios. A - Animales que experimentan lesión de nervios (aplastamiento de nervios) tratados con la combinación de baclofeno-torasemida muestran una latencia significativamente menor de CMAP tras estimulación del nervio ciático lesionado el día 7 y el día 30 desde el aplastamiento de nervios cuando se compara con los animales operados de forma simulada (barra blanca) o con los animales tratados con vehículo. B - Las amplitudes de la señal de potenciales evocados musculares tras estimulación del nervio ciático son significativamente menores en animales que experimentan lesión de nervios cuando se comparan con los animales operados de forma simulada tanto el día 7 o el día 30 después del aplastamiento de nervios. Se observa un aumento significativo de la amplitud de CMAP el día 30 desde el aplastamiento de nervios para los animales tratados con baclofeno (3 mg/kg)-torasemida (400 pg/kg) (dosis 3) dos veces al día. *p<0.05; **p<0.00i; ***p<0.000i, significativamente diferente de los animales tratados con vehículo (barra negra).
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona una composición que comprende al menos torasemida y baclofeno, o sus sales o formulaciones de liberación sostenida, para usar para promover la regeneración de nervios o neuronas en un sujeto que padece una lesión nerviosa seleccionada de neuropraxia, axonotmesis o neurotmesis, o una neuropatía causada por lesión nerviosa física directa, o de Charcot-Marie-Tooth. "Neuropatías" se refiere a afecciones donde los nervios del sistema nervioso periférico están dañados, esto incluye daños del sistema nervioso periférico producidos por factores genéticos, enfermedad inflamatoria, por sustancias químicas que incluyen fármacos (vincristina, oxaliplatino, alcohol etílico), o por un traumatismo físico directo al nervio. El tratamiento de las neuropatías también incluye el tratamiento del dolor neuropático.
Los daños del sistema nervioso periférico se pueden clasificar según la fase del traumatismo neuronal. La invención es adecuada para tratar lesiones de nervios clasificadas desde neuropraxia (afección donde solo está deteriorada la capacidad de señalización del nervio), axonotmesis (lesión que implica daños a los axones, sin deterioro de los tejidos conjuntivos de alrededor de los nervios), pero también de neurotmesis (lesión que daña tanto los axones como los tejidos de alrededor).
Las alteraciones en axones o tejidos de alrededor (tales como mielina) pueden ser de origen genético. Un ejemplo de neuropatías heredadas es la familia de enfermedades llamada de Charcot-Marie-Tooth. Las enfermedades de Charcot-Marie-Tooth son trastornos progresivos que afectan a nervios periféricos que se distinguen por el(los) gen(es) específicos que se altera(n). La(s) mutación(es) da(n) como resultado un deterioro de axones, que transmiten impulsos nerviosos, y/o afectan a la producción de la vaina de mielina por las células Shwann, lo que está implicado en la velocidad de transmisión del impulso nervioso. Hay varios tipos (clasificados en función de las características clínicas) y subitpos de CMT (que corresponden a una clasificación genética). Los tipos de CMT son CMTi, CMT2, CMT3, CMT4, C m T 5 , CMT6, C m T D I , CMTRI, CMTX. Neuropatías periféricas relacionadas son, por ejemplo, HNPP (neuropatía hereditaria con susceptibilidad a la parálisis por presión), neuropatías desmielinizantes graves DSS (síndrome de Dejerine-Sottas), CHN (neuropatía hipomielinizante congénita). CMTi (un tipo desmielinizante) y CMT2 (un tipo axonal) explican aproximadamente 70% de los pacientes de CMT.
Como se usa en la presente memoria, “tratamiento” incluye la terapia, prevención, profilaxis, retardo o reducción de síntomas provocados o de las causas de las enfermedades o trastornos anteriores. El término tratamiento incluye en particular el control de la evolución de la enfermedad y de los síntomas asociados. El término tratamiento incluye en particular i) una protección contra la toxicidad causada por el beta-amiloide, o una reducción o un retardo de dicha toxicidad, y/o ii) una protección contra la excitotoxicidad del glutamato, o una reducción o un retardo de dicha toxicidad, en los sujetos tratados. El término tratamiento designa también una mejora de los síntomas cognitivos o una protección de células neuronales. En relación con las neuropatías, el término tratamiento también incluye la regeneración de nervios, que abarca remielinización, generación de nuevas neuronas, glía, axones, mielina o sinapsis.
Dentro del contexto de esta invención, cuando se nombran compuestos específicos se pretende incluir no sólo las moléculas específicamente nombradas, sino también cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables.
El término “sal” se refiere a una sal de adición de ácido inorgánico u orgánico farmacéuticamente aceptable y relativamente no tóxica de un compuesto para usar según la presente invención. La formación de una sal farmacéutica consiste en emparejar una molécula de fármaco ácida, básica o ion híbrido con un contraión para crear una versión de sal del fármaco. En la reacción de neutralización se puede usar una amplia variedad de especies químicas. Por lo tanto, las sales farmacéuticamente aceptables para usar según la invención incluyen las obtenidas haciendo reaccionar el compuesto principal, funcionando como una base, con un ácido inorgánico u orgánico para formar una sal, por ejemplo sales de ácido acético, ácido nítrico, ácido tartárico, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido canforsulfónico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico o ácido cítrico. Las sales farmacéuticamente aceptables para usar según la invención incluyen también aquellas en las que el compuesto principal funciona como un ácido y se hace reaccionar con una base adecuada para formar, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio o colina. Aunque la mayoría de las sales de un determinado principio activo son bioequivalentes, algunas pueden tener, entre otras cosas, propiedades de solubilidad o biodisponibilidad mayores. La selección de la sal ahora es una operación estándar común en el proceso del desarrollo de fármacos, como exponen H. Stahl y C.G Wermuth en su manual (40).
El concepto “combinación” o “tratamiento/terapia de combinación” indica un tratamiento en donde se administran conjuntamente al menos dos o más fármacos a un sujeto para causar un efecto biológico. En una terapia de combinación según esta invención, los al menos dos fármacos se pueden administrar juntos o por separado, al mismo tiempo o secuencialmente. Además, los al menos dos fármacos se pueden administrar por diferentes vías y protocolos. Como resultado, aunque se pueden formular juntos, los fármacos de una combinación también se pueden formular por separado.
Como se describe en los ejemplos, la torasemida, trimetazidina, mexiletina, ifenprodil, bromocriptina y moxifloxacino tienen un fuerte efecto inesperado en procesos biológicos implicados en trastornos neurológicos. Además, estos compuestos también mostraron in vivo una capacidad muy eficaz para corregir síntomas de dichas enfermedades. Estas moléculas, solas o en terapias de combinación, representan por lo tanto novedosas estrategias para tratar trastornos neurológicos, tales como neuropatías (por ejemplo, dolor neuropático o neuropatía alcohólica). Las combinaciones de estos fármacos con otros compuestos seleccionados (véase la Tabla 2) son particularmente ventajosas, porque producen un efecto sinérgico sorprendente e inesperado en dosis en las que los fármacos solos esencialmente no tienen efecto. Además, debido a su eficacia, las combinaciones de fármacos descritas en la presente memoria se pueden usar en dosis bajas, lo que es una ventaja adicional muy importante.
En la tabla 1 siguiente se proporciona el número CAS específico de cada uno de estos compuestos. La tabla 1 menciona también, de forma no limitante, sales, racematos, profármacos, metabolitos o derivados frecuentes de estos compuestos usados en las composiciones de la invención.
Tabla 1
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Las moléculas anteriores se pueden usar solas o, preferiblemente, en terapias de combinación para proporcionar el beneficio clínico más eficaz. En relación con esto, se describe en la presente memoria una composición para el uso en el tratamiento de un trastorno neurológico, preferiblemente EA, trastornos relacionados con EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo, dolor neuropático o neuropatía alcohólica), alcoholismo o abstinencia alcohólica o lesión de la médula espinal, que comprende uno cualquiera de los compuestos anteriores en combinación con al menos un compuesto distinto seleccionado de sulfisoxazol, metimazol, prilocaína, difilina, quinacrina, carbenoxolona, acamprosato, ácido aminocaproico, baclofeno, cabergolina, dietilcarbamazina, cinacalcet, cinarizina, eplerenona, fenoldopam, leflunomida, levosimendán, sulodexida, terbinafina, zonisamida, etomidato, fenformina, trimetazidina, mexiletina, ifenprodil, moxifloxacino, bromocriptina o torasemida, o una de sus sales o formulaciones de liberación sostenida.
En la Tabla 2 siguiente se proporciona el número CAS específico para cada uno de estos compuestos distintos adicionales, diferentes de los de la Tabla 1:
Tabla 2
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También se describe en la presente memoria una composición que comprende:
- al menos un primer compuesto seleccionado de la sal(es) de torasemida, trimetazidina, mexiletina, ifenprodil, bromocriptina y moxifloxacino de cualquier pureza química, o su(s) formulación(es) de liberación sostenida, en combinación con
- al menos un segundo compuesto, distinto de dicho primer compuesto, seleccionado de sulfisoxazol, metimazol, prilocaína, difilina, quinacrina, carbenoxolona, acamprosato, ácido aminocaproico, baclofeno, cabergolina, dietilcarbamazina, cinacalcet, cinarizina, eplerenona, fenoldopam, leflunomida, levosimendán, sulodexida, terbinafina, zonisamida, etomidato, fenformina, trimetazidina, mexiletina, bromocriptina, ifenprodil, torasemida y moxifloxacino, sal(es) de cualquier pureza química, o su(s) formulación(es) de liberación sostenida, para usar en el tratamiento de un trastorno neurológico en un sujeto que lo necesite.
Como se describe en los ejemplos, las terapias de composiciones que usan uno o más de los fármacos mencionados antes conducen a una corrección eficaz de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades neurológicas. Como se ilustra en la sección experimental, las composiciones que comprenden al menos torasemida, trimetazidina, mexiletina, ifenprodil, bromocriptina y moxifloxacino proporcionan un efecto terapéutico y biológico sustancial para prevenir los efectos tóxicos de la proteína o el péptido p-amiloide (Ap) en células humanas. Además, in vivo, estas composiciones conducen a una mejora de los síntomas cognitivos, así como a una inhibición de las rutas moleculares desencadenas por la intoxicación por Ap, entre las cuales está la excitotoxicidad del glutamato. Por lo tanto, representan novedosos y potentes métodos para tratar dicha enfermedad.
La sección experimental muestra además que las composiciones mencionadas antes también son eficaces i) en la protección de forma sinérgica de células neuronales in vitro frente a la toxicidad del glutamato, y ii) al conferir beneficio clínico en modelos in vivo para enfermedades relacionadas con la excitotoxicidad del glutamato.
También se describen en la presente memoria composiciones que comprenden 1, 2, 3, 4 o 5 fármacos distintos, incluso más preferiblemente 2, 3 o 4 fármacos distintos, para un tratamiento de combinación de la enfermedad de Alzheimer (EA), trastornos relacionados con la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo, dolor neuropático o neuropatía alcohólica), alcoholismo o abstinencia alcohólica, o lesión de la médula espinal en un sujeto que lo necesite. En una realización preferida, los fármacos de la invención se usan en combinación(es) para la administración combinada, separada o secuencial, con el fin de proporcionar el efecto más eficaz.
También se describe en la presente memoria la composición que comprende (i) torasemida y (ii) un compuesto seleccionado de bromocriptina, baclofeno, sulfisoxazol, eplerenona o terbinafina, o una sal o formulación de liberación sostenida de dichos compuestos (i) y (ii).
También se describe en la presente memoria la composición que comprende (i) trimetazidina y (ii) un compuesto seleccionado de baclofeno, cinarizina, zonisamida o moxifloxacino, o una sal o formulación de liberación sostenida de dichos compuestos (i) y (ii).
También se describe en la presente memoria la composición que comprende (i) moxifloxacino y (ii) un compuesto seleccionado de baclofeno, cinacalcet, zonisamida, sulfisoxazol o trimetazidina, o una sal o formulación de liberación sostenida de dichos compuestos (i) y (ii).
También se describe en la presente memoria la composición que comprende (i) mexiletina y (ii) un compuesto seleccionado de baclofeno, cinacalcet, ifenprodil o levosimendán, o una sal o formulación de liberación sostenida de dichos compuestos (i) y (ii).
También se describe en la presente memoria una composición que comprende (i) ifenprodil y (ii) un compuesto seleccionado de acamprosato, levosimendán o mexiletina, o una sal o formulación de liberación sostenida de dichos compuestos (i) y (ii).
También se describen en la presente memoria composiciones para usar en el tratamiento de un trastorno neurológico tal como la enfermedad de Alzheimer (EA), trastornos relacionados con la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo, dolor neuropático o neuropatía alcohólica), alcoholismo o abstinencia alcohólica o lesiones de la médula espinal, que comprende una de las siguientes combinaciones de fármacos, para una administración combinada, separada o secuencial:
- Baclofeno y Torasemida,
- Eplerenona y Torasemida,
- Acamprosato e Ifenprodil,
- Baclofeno y Mexiletina,
- Baclofeno y Trimetazidina,
- Bromocriptina y Sulfisoxazol,
- Cinacalcet y Mexiletina,
- Cinarizina y Trimetazidina,
- Sulfisoxazol y Torasemida,
- Trimetazidina y Zonisamida,
- Levosimendán y Mexiletina,
- Levosimendán e Ifenprodil,
- Levosimendán y Trimetazidina,
- Levosimendán y Moxifloxacino,
- Terbinafina y Torasemida,
- Moxifloxacino y Trimetazidina,
- Moxifloxacino y Baclofeno,
- Moxifloxacino y Cinacalcet,
- Moxifloxacino y Zonisamida,
- Moxifloxacino y Sulfisoxazol, o
Mexiletina e Ifenprodil.
Los ejemplos de composiciones preferidas para usar según la invención que comprenden una combinación de al menos tres compuestos, para la administración combinada, separada o secuencial, se proporcionan a continuación: - Baclofeno y Trimetazidina y Torasemida,
- Baclofeno y Cinacalcet y Torasemida, o
- Baclofeno y Acamprosato y Torasemida.
Los ejemplos de composiciones preferidas para usar según la invención que comprenden una combinación de al menos cuatro compuestos, para la administración combinada, separada o secuencial, se proporcionan a continuación:
- Baclofeno y Acamprosato y Torasemida y Dietilcarbamazina, o
- Baclofeno y Acamprosato y Torasemida e Ifenprodil.
Como se describe en la sección experimental, las terapias de combinación anteriores inducen un fuerte efecto neuroprotector contra la toxicidad del Ap y proporcionan resultados positivos en rendimientos conductuales y ensayos bioquímicos in vivo. Los resultados muestran que las composiciones como se describen en la presente memoria
i) corrigen eficazmente rutas moleculares desencadenadas, in vivo, por agregados de Ap y ii) conducen a una mejora de deficiencias neurofisiológicas observadas en animales enfermos como supervivencia de las neuronas o integridad sináptica.
Además, los resultados presentados muestran también que las terapias de combinación anteriores tienen un importante efecto sinérgico neuroprotector frente a la excitotoxicidad del glutamato (figuras 24 y 25, tabla 8), una ruta que está implicada en diversas enfermedades neurológicas como la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo, dolor neuropático o neuropatía alcohólica), alcoholismo o abstinencia alcohólica o lesión de la médula espinal. Estas terapias proporcionan resultados positivos en modelos in vivo e in vitro para estas enfermedades. Además, los resultados in vivo muestran también que dichas composiciones restablecen eficazmente la integridad de la barrera hematoencefálica, que se sabe que está deteriorada en diversas enfermedades neurológicas.
Como se ha indicado previamente, los compuestos en un tratamiento o composición de combinación para usar según la presente invención, se pueden formular juntos o separados, y administrar juntos, por separado o de forma secuencial y/o repetida.
Como se describe en los ejemplos, además de ser eficiente en la protección de neuronas frente a la toxicidad del glutamato, la terapia con baclofeno-torasemida también es particularmente eficaz en promover el crecimiento de células neuronales, incluso en ausencia de cualquier exposición a un agente o condiciones tóxicas. Además, in vivo, esta terapia de combinación conduce a una mejora de la pérdida de transducción de señal nerviosa posterior a la lesión nerviosa. Por lo tanto, la combinación de baclofeno-torasemida representa una novedosa y potente terapia para tratar neuropatías, lesiones nerviosas y lesión de la médula espinal, como se ha definido antes.
En relación con esto, se describe en la presente memoria un método para tratar neuropatías, p. ej., lesiones de nervios periféricos o lesiones de la médula espinal, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composición que comprende baclofeno y torasemida sales, profármacos, derivados o cualquier formulación de los mismos.
También se describe en la presente memoria un método para tratar neuropatías, p. ej., lesiones heredadas tales como enfermedades de c Mt , que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composición que comprende baclofeno y torasemida, o sales, profármacos, derivados o cualquier formulación de los mismos.
También se describe en la presente memoria un método para tratar la enfermedad CMT1 o CMT2, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composición que comprende baclofeno y torasemida, o sales, profármacos, derivados o cualquier formulación de los mismos.
También se describe en la presente memoria un método para tratar neuropatías, p. ej., lesiones de nervios periféricos o lesiones de la médula espinal, que comprende administrar de forma simultánea, separada o secuencial y/o repetida a un sujeto que necesite dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un baclofeno y torasemida, como se ha descrito antes.
Aunque muy eficaces in vitro e in vivo, dependiendo del sujeto o afección específica, las composiciones para usar según la invención se pueden usar además junto con fármacos o tratamientos adicionales beneficiosos para la afección neurológica tratada en los sujetos. En relación con esto, en una realización particular, el(los) fármaco(s) o composiciones para usar según la presente invención se pueden combinar con extractos de Ginkgo Biloba. Los extractos adecuados se incluyen, sin limitación, extractos de Ginkgo Biloba, extractos de Ginkgo Biloba mejorados (por ejemplo, enriquecidos en ingredientes activos o con un nivel reducido de contaminantes) o cualquier fármaco que contenga extractos de Ginkgo Biloba.
Los extractos de Ginkgo Biloba se pueden usar en una composición que comprende al menos torasemida, trimetazidina, mexiletina, bromocriptina, ifenprodil y moxifloxacino.
Como se describe en la presente memoria, los extractos de Ginkgo Biloba se usan en combinación con cualquiera de las siguientes combinaciones de fármacos:
- Acamprosato e Ifenprodil,
- Baclofeno y Mexiletina,
- Baclofeno y Torasemida,
- Baclofeno y Trimetazidina,
- Bromocriptina y Sulfisoxazol,
- Cinacalcet y Mexiletina,
- Cinarizina y Trimetazidina,
- Eplerenona y Torasemida,
- Sulfisoxazol y Torasemida,
- Trimetazidina y Zonisamida,
- Levosimendán y Mexiletina,
- Levosimendán e ifenprodil,
- Levosimendán y Trimetazidina,
- Levosimendán y Moxifloxacino,
- Terbinafina y Torasemida,
- Moxifloxacino y Baclofeno,
- Moxifloxacino y Cinacalcet,
- Moxifloxacino y Zonisamida,
- Moxifloxacino y Sulfisoxazol,
- Mexiletina e Ifenprodil,
- Baclofeno y Trimetazidina y Torasemida,
- Baclofeno y Cinacalcet y Torasemida,
- Baclofeno y Acamprosato y Torasemida,
- Sulfisoxazol y Trimetazidina y Torasemida y Zonisamida,
- Sulfisoxazol y Mexiletina y Torasemida y Cinacalcet,
- Baclofeno y Acamprosato y Torasemida y Dietilcarbamazina,
- Baclofeno y Acamprosato y Torasemida e Ifenprodil,
- Levosimendán y Baclofeno y Trimetazidina,
- Levosimendán y Ácido aminocaproico y Trimetazidina,
- Levosimendán y Terbinafina y Trimetazidina, o
- Levosimendán y Sulfisoxazol y Trimetazidina.
También se describen en la presente memoria terapias usadas conjuntamente con fármaco(s) o combinación(es) de fármacos para usar según la presente invención, que pueden comprender uno o más fármacos para mejorar síntomas de la enfermedad de Alzheimer, trastornos relacionados con la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo, dolor neuropático o neuropatía alcohólica), alcoholismo o abstinencia alcohólica, o lesión de la médula espinal, o fármaco(s) que se pueden usar para tratamiento paliativo de estos trastornos.
Por ejemplo, se pueden usar combinaciones para usar según la invención, conjuntamente con donepezil (CAS: 120014-06-4), gabapentina (CAS: 478296-72-9; 60142-96-3), galantamina (357-70-0), rivastigmina (123441-03-2) o memantina (CAS: 19982-08-2).
La duración de la terapia depende de la fase de la enfermedad o trastorno que se esté tratando, de la combinación usada, de la edad y el estado del paciente y de cómo responda el paciente al tratamiento. La dosis, frecuencia y modo de administración de cada componente de la combinación se pueden controlar independientemente. Por ejemplo, un fármaco se puede administrar por vía oral, mientras que el segundo fármaco se puede administrar por vía intramuscular. La terapia de combinación se puede administrar en ciclos intermitentes que incluyan periodos de descanso, de manera que el cuerpo del paciente tiene oportunidad de recuperarse de cualesquiera efectos secundarios aún imprevistos. Los fármacos también se pueden formular juntos, de tal manera que una administración suministre todos los fármacos.
La administración de cada fármaco de la combinación puede ser por cualquier medio adecuado que tenga como resultado una concentración del fármaco que, combinada con el otro componente, puede mejorar el estado del paciente o tratar eficazmente la enfermedad o trastorno.
Aunque se pueden administrar los ingredientes activos de la combinación como la sustancia química pura, es preferible presentarlos como una composición farmacéutica, también denominada en este contexto formulación farmacéutica. Las posibles composiciones incluyen las adecuadas para la administración por vía oral, rectal, tópica (incluyendo transdérmica, bucal y sublingual) o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica).
Más habitualmente, estas formulaciones farmacéuticas se prescriben al paciente en “paquetes para paciente” que contienen una serie de unidades de dosificación u otros medios para la administración de dosis unitarias medidas para el uso durante un periodo de tratamiento definido en un solo paquete, normalmente un envase blíster. Los paquetes para paciente tienen una ventaja frente a las prescripciones tradicionales, donde un farmacéutico divide el suministro de un paciente de un producto farmacéutico de un suministro a granel, en cuanto que el paciente tiene siempre acceso al prospecto contenido en el paquete para paciente, normalmente ausente en las prescripciones tradicionales. Se ha comprobado que la inclusión de un prospecto mejora la observancia del paciente con las instrucciones del médico. Por lo tanto, se describe además en la presente memoria una formulación farmacéutica en combinación con material de envasado adecuado para dichas formulaciones. En dicho paquete para paciente, el uso previsto de una formulación para el tratamiento de combinación se puede inferir por las instrucciones, servicios, suministros, adaptaciones y/u otros medios que ayuden a usar la formulación del modo más adecuado para el tratamiento. Dichas medidas hacen que un paquete para paciente sea específicamente adecuado y esté adaptado para el uso para el tratamiento con la combinación
El fármaco puede estar contenido, en una cantidad adecuada, en cualquier sustancia vehículo adecuada (p. ej., excipiente, vehículo, soporte), que puede representar 1-99% en peso del peso total de la composición. La composición se puede proporcionar en una forma farmacéutica que sea adecuada para la vía de administración oral, parenteral (p. ej., intravenosa, intramuscular), rectal, cutánea, nasal, vaginal, por inhalación, dérmica (parche) u ocular. Por lo tanto, la composición puede estar en forma de, p. ej., comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, granulados, suspensiones, emulsiones, soluciones, geles incluyendo hidrogeles, pastas, pomadas, cremas, escayolas, pociones, dispositivos de suministro osmótico, supositorios, enemas, inyectables, implantes, pulverizadores o aerosoles.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular según la práctica farmacéutica convencional (véase, p. ej., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 y Encycopledia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York).
Las composiciones farmacéuticas para usar según la invención se pueden formular para liberar el fármaco activo sustancialmente de manera inmediata tras la administración, o después de la administración en cualquier momento o periodo de tiempo predeterminado.
Las formulaciones de liberación controlada incluyen (i) formulaciones que crean una concentración sustancialmente constante del fármaco dentro del cuerpo durante un periodo de tiempo prolongado; (ii) formulaciones que, después de un periodo de retraso predeterminado, crean una concentración sustancialmente constante del fármaco dentro del cuerpo durante un periodo de tiempo prolongado; (iii) formulaciones que mantienen la acción del fármaco durante un periodo de tiempo predeterminado manteniendo un nivel relativamente eficaz y constante del fármaco en el cuerpo con una minimización concomitante de efectos secundarios no deseables asociados con fluctuaciones en el nivel plasmático de la sustancia del fármaco activo; (iv) formulaciones que localizan la acción del fármaco mediante, por ejemplo, colocación espacial de una composición de liberación controlada adyacente a o en el tejido u órgano enfermo; y (v) formulaciones que dirigen la acción del fármaco usando vehículos o derivados químicos para suministrar el fármaco a un tipo particular de célula diana.
La administración de fármacos en forma de una formulación de liberación controlada se prefiere especialmente en los casos en los que el fármaco, solo o en combinación, tiene (i) un índice terapéutico estrecho (es decir la diferencia entre la concentración plasmática que produce efectos secundarios dañinos o reacciones tóxicas y la concentración plasmática que produce un efecto terapéutico es pequeña; en general, el índice terapéutico, TI, se define como la relación de la dosis letal media (LD50) a la dosis eficaz media (ED50); (ii) una ventana de absorción estrecha en el tracto gastrointestinal; o (iii) una semivida biológica muy corta, de manera que se requiere una dosificación frecuente durante un día con el fin de mantener el nivel plasmático en un nivel terapéutico.
Se puede aplicar cualquiera de una serie de estrategias con el fin de obtener la liberación controlada en la que la velocidad de liberación sea mayor que la velocidad del metabolismo del fármaco en cuestión. La liberación controlada se puede obtener por la selección adecuada de diversos parámetros e ingredientes de formulación, que incluyen, p. ej., diversos tipos de revestimientos y composiciones de liberación controlada. Por lo tanto, el fármaco se formula con excipientes adecuados en una composición farmacéutica que, tras la administración, libera el fármaco de una manera controlada (composiciones de cápsula o comprimido unitario individual o múltiples, soluciones en aceite, suspensiones, emulsiones, microcápsulas, microesferas, nanopartículas, parches y liposomas).
Formas farmacéuticas sólidas para uso oral
Las formulaciones para uso oral incluyen comprimidos que contienen el o los ingredientes activos en una mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes o cargas (p. ej., sacarosa, celulosa microcristalina, almidones que incluyen almidón de patata, carbonato de calcio, cloruro de sodio, fosfato de calcio, sulfato de calcio o fosfato de sodio); agentes de granulación y disgregantes (p. ej., derivados de celulosa que incluyen celulosa microcristalina, almidones que incluyen almidón de patata, croscarmelosa sódica, alginatos o ácido algínico); agentes aglutinantes (p. ej., goma arábiga, ácido algínico, alginato de sodio, gelatina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, polivinilpirrolidona o polietilenglicol); y agentes lubricantes, deslizantes y antiadhesivos (p. ej., ácido esteárico, sílices o talco). Otros excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser colorantes, agentes aromatizantes, plastificantes, humectantes, agentes de tamponamiento y similares. Los comprimidos pueden no estar revestidos o pueden estar revestidos mediante técnicas conocidas, opcionalmente para retrasar la disgregación y la absorción en el tracto gastrointestinal y de este modo proporcionar una acción sostenida durante un periodo más prolongado. El revestimiento puede estar adaptado para liberar la sustancia del fármaco activo en un patrón predeterminado (p. ej., con el fin de lograr una formulación de liberación controlada) o puede estar adaptado para no liberar la sustancia del fármaco activo hasta después de haber pasado el estómago (revestimiento entérico). El revestimiento puede ser un revestimiento de azúcar, un revestimiento de película (p. ej., basado en hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, copolímeros de acrilato, polietilenglicoles y/o polivinilpirrolidona) o un revestimiento entérico (p. ej., basado en copolímero de ácido metacrílico, ftalato acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, succinato acetato de hidroxipropilmetilcelulosa, poli(ftalato acetato de vinilo), goma de laca y/o etilcelulosa). Se puede usar un material de retardo tal como, p. ej., monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las composiciones sólidas de comprimidos pueden incluir un revestimiento adaptado para proteger la composición de cambios químicos no deseados (p. ej., degradación química antes de la liberación de la sustancia del fármaco activo). El revestimiento se puede aplicar sobre la forma farmacéutica sólida de manera similar a como se describe en la Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.
En el comprimido pueden estar mezclados entre sí diversos fármacos, o éstos pueden estar distribuidos. Por ejemplo, el primer fármaco está contenido en el interior del comprimido, y el segundo fármaco está en el exterior, de modo que se libera una parte considerable del segundo fármaco antes de la liberación del primer fármaco.
Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como comprimidos masticables, o como cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo está mezclado con un diluyente sólido inerte (p. ej., almidón de patata, celulosa microcristalina, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín), o como cápsulas de gelatina blanda en donde el ingrediente activo está mezclado con agua o un medio de aceite, por ejemplo, parafina líquida o aceite de oliva. Se pueden preparar polvos y granulados usando los ingredientes mencionados antes en los comprimidos y cápsulas de una manera convencional.
Las composiciones de liberación controlada para uso oral se pueden preparar, p. ej., para liberar el fármaco activo controlando la disolución y/o la difusión de la sustancia del fármaco activo.
La liberación controlada por disolución o difusión se puede lograr mediante un revestimiento adecuado de una formulación de comprimido, cápsula, pelet o granulado de fármacos, o incorporando el fármaco en una matriz adecuada. Un revestimiento de liberación controlada puede incluir una o más de las sustancias de revestimiento mencionadas antes y/o, p. ej., goma de laca, cera de abejas, Glycowax, cera de ricino, cera de carnauba, alcohol estearílico, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerol, etilcelulosa, resinas acrílicas, poli(ácido dl-láctico), acetato butirato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poli(acetato de vinilo), vinilpirrolidona, polietileno, polimetacrilato, metacrilato de metilo, 2-hidroximetacrilato, hidrogeles de metacrilato, 1,3-butilenglicol, metacrilato de etilenglicol y/o polietilenglicoles. En una formulación de matriz de liberación controlada, el material de la matriz puede incluir también, p. ej., metilcelulosa hidratada, cera de carnauba y alcohol estearílico, carbopol 934, silicona, triestearato de glicerilo, acrilato de metilo-metacrilato de metilo, poli(cloruro de vinilo), polietileno y/o fluorocarburo halogenado.
Una composición de liberación controlada que contiene uno o más de los fármacos de las combinaciones reivindicadas también se puede presentar en forma de un comprimido o cápsula flotante (es decir un comprimido o una cápsula que, tras la administración oral, flota encima del contenido gástrico durante un cierto periodo de tiempo). Una formulación de comprimido flotante del o de los fármacos se puede preparar por granulación de una mezcla del o de los fármacos con excipientes y 20-75% en p/p de hidrocoloides, tales como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa. Los gránulos obtenidos después se pueden comprimir en comprimidos. Al ponerse en contacto con el jugo gástrico, el comprimido forma una barrera de gel sustancialmente impermeable al agua alrededor de su superficie. Esta barrera de gel participa a la hora de mantener una densidad de menos de uno, permitiendo así al comprimido permanecer flotando en el jugo gástrico.
Líquidos para administración oral
Los polvos, polvos dispersables o gránulos adecuados para la preparación de una suspensión acuosa por adición de agua son formas farmacéuticas convenientes para la administración oral. La formulación en forma de suspensión proporciona el ingrediente activo en una mezcla con un agente dispersante o humectante, agente de suspensión y uno o más conservantes. Como agentes de suspensión son adecuados, por ejemplo, la carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, alginato de sodio y similares.
Composiciones parenterales
La composición farmacéutica también se puede administrar por vía parenteral por inyección, infusión o implante (intravenoso, intramuscular, subcutáneo o similares) en formas farmacéuticas, formulaciones, o mediante dispositivos de suministro adecuados o implantes que contienen vehículos y coadyuvantes convencionales no tóxicos farmacéuticamente aceptables. La formulación y la preparación de dichas composiciones son bien conocidas por los expertos en la técnica de la formulación farmacéutica.
Las composiciones para uso parenteral se pueden proporcionar en formas farmacéuticas unitarias (p. ej., en ampollas monodosis), o en viales que contienen varias dosis y en los que se puede añadir un conservante adecuado (véase más adelante). La composición puede estar en forma de una solución, una suspensión, una emulsión, un dispositivo de infusión o un dispositivo de suministro para implantar o se puede presentar en forma de un polvo seco para reconstituir con agua u otro vehículo adecuado antes de usar. Aparte del o de los fármacos activos, la composición puede incluir vehículos y/o excipientes adecuados aceptables para la vía parenteral. El o los fármacos activos pueden estar incorporados en microesferas, microcápsulas, nanopartículas, liposomas o similares para la liberación controlada. La composición puede incluir agentes de suspensión, solubilización, estabilización, ajuste del pH y/o dispersantes.
Las composiciones farmacéuticas para usar según la invención pueden estar en la forma adecuada para inyección estéril. Para preparar dicha composición, el o los fármacos activos adecuados se disuelven o suspenden en un vehículo líquido aceptable para la vía parenteral. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden usar están el agua, agua ajustada a un pH adecuado por adición de una cantidad adecuada de ácido clorhídrico, hidróxido de sodio o un tampón adecuado, 1,3-butanodiol, solución Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. La formulación acuosa puede contener también uno o más conservantes (p. ej., p-hidroxibenzoato de metilo, etilo o n-propilo). En los casos donde uno de los fármacos es sólo moderadamente o ligeramente soluble en agua, se puede añadir un agente de aumento de la disolución o de solubilización, o el disolvente puede incluir 10-60% en p/p de propilenglicol o similares.
Las composiciones parenterales de liberación controlada pueden estar en forma de suspensiones acuosas, microesferas, microcápsulas, microesferas magnéticas, soluciones en aceite, suspensiones en aceite o emulsiones. Alternativamente, el o los fármacos activos se pueden incorporar en vehículos biocompatibles, liposomas, nanopartículas, implantes, o dispositivos de infusión. Los materiales para usar en la preparación de microesferas y/o microcápsulas son, p. ej., polímeros biodegradables/bioerosionables tales como poligalactina, poli-(cianoacrilato de isobutilo), poli(2-hidroxietil-L-glutamina). Los vehículos biocompatibles que se pueden usar cuando se formula una formulación parenteral de liberación controlada son hidratos de carbono (p. ej., dextranos), proteínas (p. ej., albúmina), lipoproteínas o anticuerpos. Los materiales para usar en implantes pueden ser no biodegradables (p. ej., polidimetilsiloxano) o biodegradables (p. ej., poli(caprolactona), poli(ácido glicólico) o poli(ortoésteres)).
Vías alternativas
Aunque son menos preferidas y menos convenientes, se pueden contemplar otras vías de administración y por lo tanto otras formulaciones. En relación con esto, para aplicación rectal, las formas farmacéuticas adecuadas para una composición incluyen supositorios (de tipo emulsión o suspensión) y cápsulas de gelatina rectales (soluciones o suspensiones). En una formulación típica de supositorio, el o los fármacos activos se combinan con una base de supositorio farmacéuticamente aceptable adecuada, tal como manteca de cacao, ácidos grasos esterificados, gelatina glicerinada y diversas bases solubles en agua o dispersables como los polietilenglicoles. Se pueden incorporar diversos aditivos, potenciadores o tensioactivos.
Las composiciones farmacéuticas también se pueden administrar por vía tópica sobre la piel para la absorción percutánea en formas farmacéuticas o formulaciones que contienen vehículos y excipientes convencionalmente no tóxicos farmacéuticamente aceptables, que incluyen microesferas y liposomas. Las formulaciones incluyen cremas, pomadas, lociones, linimentos, geles, hidrogeles, soluciones, suspensiones, barras, pulverizadores, pastas, escayolas y otros tipos de sistemas de suministro transdérmico de fármacos. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir agentes emulsionantes, antioxidantes, agentes de tamponamiento, conservantes, humectantes, potenciadores de la penetración, agentes quelantes, agentes formadores de gel, bases de pomadas, perfumes y agentes protectores de la piel.
Los conservantes, humectantes y potenciadores de la penetración pueden ser parabenos, tales como phidroxibenzoato de propilo o metilo, y cloruro de benzalconio, glicerina, propilenglicol, urea, etc.
Las composiciones farmacéuticas descritas antes para administración tópica sobre la piel también se pueden usar en conexión con una administración tópica sobre o cerca de la parte del cuerpo que se va a tratar. Las composiciones pueden estar adaptadas para aplicación directa o para aplicación por medio de dispositivos especiales de suministro de fármacos tales como vendajes o, alternativamente esparadrapos, almohadillas, esponjas, tiras u otras formas de material flexible adecuado.
Dosis y duración del tratamiento
Se apreciará que los fármacos de la combinación se pueden administrar de manera concomitante, en la misma o en diferente formulación farmacéutica o secuencialmente. Si hay una administración secuencial, el retraso en la administración del segundo (o adicional) ingrediente activo no debería ser tal que se pierda el beneficio del efecto eficaz de la combinación de los ingredientes activos. Un requisito mínimo para una combinación según esta descripción es que la combinación debería estar destinada a un uso combinado con el beneficio del efecto eficaz de la combinación de los ingredientes activos. El uso previsto de una combinación se puede inferir por los servicios, suministros, adaptaciones y/u otros medios que ayuden a usar la combinación según la invención.
Aunque los fármacos activos de la presente invención se pueden administrar en dosis divididas, por ejemplo, dos o tres veces al día, se prefiere una sola dosis diaria de cada fármaco de la combinación, siendo lo más preferido una sola dosis diaria de todos los fármacos en una sola composición farmacéutica (forma farmacéutica unitaria).
La expresión “forma farmacéutica unitaria” se refiere a unidades físicamente discretas (tales como cápsulas, comprimidos o cilindros de jeringa cargados) adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material o materiales activos calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo farmacéutico necesario.
La administración en general es repetida. Puede ser una o varias veces al día durante desde varios días a varios años y puede ser incluso durante toda la vida del paciente. En la mayoría de los casos está indicada una administración crónica o al menos repetida periódicamente a largo plazo.
Adicionalmente, la información farmacogenómica (el efecto del genotipo en la farmacocinética, la farmacodinámica o el perfil de eficacia de un producto terapéutico) sobre un paciente concreto puede influir en la dosis usada.
Excepto cuando responden a casos que se deterioran especialmente en los que se pueden requerir dosis mayores, la dosis preferida de cada fármaco en la combinación normalmente está dentro del intervalo de dosis no superiores a las normalmente prescritas para un tratamiento de mantenimiento a largo plazo o que hayan demostrado ser seguras en estudios clínicos de fase 3.
Una ventaja notable de la invención es que cada compuesto se puede usar en dosis bajas en una terapia de combinación, produciendo al mismo tiempo, en combinación, un beneficio clínico sustancial al paciente. La terapia de combinación puede de hecho ser eficaz en dosis en las que los compuestos individualmente no tienen un efecto sustancial. Por consiguiente, una ventaja particular de la invención está en la capacidad para usar dosis subóptimas de cada compuesto, es decir, dosis que son menores que las dosis terapéuticas normalmente prescritas, preferiblemente 1/2 de las dosis terapéuticas, más preferiblemente 1/3, 1/4, 1/5 o incluso más preferiblemente 1/10 de las dosis terapéuticas. En ejemplos particulares, se usan dosis tan bajas como 1/20, 1/30, 1/50, 1/100, o incluso menores, de las dosis terapéuticas.
En dichas dosis subóptimas, los compuestos solos serían sustancialmente inactivos, mientras que la o las combinaciones para usar según la invención son totalmente eficaces.
Una dosis preferida corresponde a cantidades desde 1% hasta 50% de las normalmente prescritas para el tratamiento de mantenimiento a largo plazo.
La dosis más preferida puede corresponder a cantidades desde 1% hasta 10% de las normalmente prescritas para el tratamiento de mantenimiento a largo plazo.
Se proporcionan a continuación ejemplos específicos de dosis de fármacos para usar en la invención:
- Bromocriptina por vía oral de aproximadamente 0.01 a 10 mg al día, preferiblemente menos de 5 mg al día, más preferiblemente menos de 2.5 mg al día, incluso más preferiblemente menos de 1 mg al día, siendo dichas dosis particularmente adecuadas para la administración oral,
- Ifenprodil por vía oral de aproximadamente 0.4 a 6 mg al día, preferiblemente menos de 3 mg al día, más preferiblemente menos de 1.5 mg al día, incluso más preferiblemente menos de 0.75 mg al día, siendo dichas dosis particularmente adecuadas para la administración oral,
- Mexiletina por vía oral de aproximadamente 6 a 120 mg al día, preferiblemente menos de 60 mg al día, más preferiblemente menos de 30 mg al día, incluso más preferiblemente menos de 15 mg al día, siendo dichas dosis particularmente adecuadas para la administración oral,
- Moxifloxacino por vía oral de aproximadamente 4 a 40 mg al día, preferiblemente menos de 20 mg al día, más preferiblemente menos de 10 mg al día, incluso más preferiblemente menos de 5 mg al día, siendo dichas dosis particularmente adecuadas para la administración oral,
- Torasemida por vía oral de aproximadamente 0.05 a 4 mg al día, preferiblemente menos de 2 mg al día, más preferiblemente menos de 1 mg al día, incluso más preferiblemente menos de 0.5 mg al día, siendo dichas dosis particularmente adecuadas para la administración oral,
- Trimetazidina por vía oral de aproximadamente 0.4 a 6 mg al día, preferiblemente menos de 3 mg al día, más preferiblemente menos de 1.5 mg al día, todavía más preferiblemente menos de 0.75 mg al día, siendo dichas dosis particularmente adecuadas para la administración oral,
- Acamprosato por vía oral de aproximadamente 1 a 400 mg al día,
- Ácido aminocaproico por vía oral de aproximadamente 0,1 g a 2.4 g al día,
- Baclofeno entre 0.01 a 150 mg al día, preferiblemente menos de 100 mg al día, más preferiblemente menos de 50 mg al día, lo más preferiblemente entre 5 y 40 mg al día, incluso más preferiblemente menos de 35 mg al día, típicamente 15 mg al día, 12 mg al día, 24 mg al día, 30 mg al día, siendo dichas dosis particularmente adecuadas para la administración oral,
- Dietilcarbamazina por vía oral de aproximadamente 0.6 a 600 mg al día,
- Cinacalcet por vía oral de aproximadamente 0.3 a 36 mg al día,
- Cinarizina por vía oral de aproximadamente 0.6 a 23 mg al día,
- Eplerenona por vía oral de aproximadamente 0.25 a 10 mg al día,
- Leflunomida por vía oral de aproximadamente 0.1 a 10 mg al día,
- Levosimendán por vía oral de aproximadamente 0.04 a 0.8 mg al día,
- Sulfisoxazol por vía oral de aproximadamente 20 a 800 mg al día,
- Sulodexida por vía oral de aproximadamente 0.05 a 40 mg al día,
- Terbinafina por vía oral de aproximadamente 2.5 a 25 mg al día,
- Zonisamida por vía oral de aproximadamente 0.5 a 50 mg al día.
Se entenderá que la cantidad del fármaco realmente administrada será determinada por un médico, a la luz de las circunstancias relevantes que incluyen la afección o afecciones que se van a tratar, la composición exacta que se va a administrar, la edad, peso y respuesta del paciente individual, la gravedad de los síntomas del paciente y la vía de administración elegida. Por lo tanto, los intervalos de dosificación anteriores están dirigidos a proporcionar una orientación y ayuda general para las enseñanzas de la presente memoria, pero no se pretende que limiten el alcance de la invención.
Los siguientes ejemplos se dan con fines de ilustración y no a modo de limitación.
Ejemplos
El cuidado y la cría de animales, así como las experimentaciones, se llevan a cabo según la directrices del Committee for Research and Ethical Issue del I.A.S.P. (1983).
A) Tratamiento de enfermedades relacionadas con la toxicidad del Ap
En esta serie de experimentos se han ensayado compuestos candidatos en cuanto a su capacidad para prevenir o reducir los efectos tóxicos del AP1-42 humano. El AP1-42 es el péptido de longitud completa que constituye agregados encontrados en biopsias de pacientes humanos que padecen la EA. Los fármacos se ensayan primero individualmente, a lo que siguen ensayos de su acción combinada. El efecto se determina en diversos tipos de células, para documentar más la actividad de los compuestos en modelos in vitro que ilustran diferentes características fisiológicas de la EA. También se llevan a cabo estudios in vivo en un modelo de ratón para la EA, confirmando este efecto protector por la evaluación del efecto de los compuestos en i) el rendimiento cognitivo de los animales y ii) en características moleculares distintivas (inducción de apoptosis, inducción de estrés oxidativo, inducción de ruta de inflamación) de la EA.
I. Los compuestos previenen la toxicidad del AP1-42 humano
I.1. Protección contra la toxicidad del AP1-42 en un modelo de células endoteliales microvasculares de cerebro humano
Se usaron cultivos de células endoteliales microvasculares de cerebro humano para estudiar la protección proporcionada por el o los compuestos candidatos contra la toxicidad del AP1-42.
Se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37°C células cerebrales endoteliales microvasculares de cerebro humano (HBMEC, ScienCell Ref: 1000, congeladas en el pase 10). El líquido sobrenadante se puso inmediatamente en 9 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Pan Biotech ref: P04-03600) que contenía 10% de suero bovino fetal (FCS; GIBCO ref 10270-106). La suspensión celular se centrifugó a 180 x g durante 10 minutos a 4°C y los sedimentos se suspendieron en medio exento de suero CSC (CSC serum free, Cell System, Ref: SF-4Z0-500-R, lote 51407-4) con 1,6% de RocketFuel exento de suero (Cell System, Ref: SF-4Z0-500-R, lote 54102), 2% de penicilina 10 000 U/ml y estreptomicina 10 mg/ml (PS; Pan Biotech ref: P06-07100 lote 133080808) y se sembraron en una densidad de 20 000 células por pocillo en placas de 96 pocillos (Sistema de angiogénesis Matrigel layer Biocoat, BD, Ref 354150, lote A8662) en un volumen final de 100 |il. En un soporte de matrigel, las células cerebrales endoteliales comenzaron espontáneamente el proceso de morfogénesis de red de capilares (33).
Se llevaron a cabo tres cultivos separados por condiciones, 6 pocillos por condición.
Compuestos candidatos y tratamiento de amiloide P1-42 humano
Brevemente, se reconstituyó el péptido AP1-42 (Bachem, ref: H1368 lote 1010533) en un medio de cultivo definido 20 |iM (solución madre) y se agitó lentamente a 37°C durante 3 días a oscuras para la agregación. El medio de control se preparó en las mismas condiciones.
Después de 3 días, este péptido amiloide humano agregado se usó en HBMEC en 2.5 |iM diluido en medio de control (tiempo de incubación óptimo). El péptido AP1-42 se añadió 2 horas después de la siembra de HBMEC en Matrigel durante 18 horas de incubación.
Una hora después de la siembra de HBMEC en Matrigel, se disolvieron los compuestos de ensayo y VEGF-165 en medio de cultivo (+0,1% de DMSO) y después se preincubaron con HBMEC durante 1 hora antes de la aplicación del AP1-42 (en un volumen final por pocillo de cultivo de 100 |il). Una hora después de la incubación de los compuestos de ensayo o VEGF (dos horas después de la siembra de células en Matrigel), se añadieron 100 |il de péptido AP1-42 hasta una concentración final de 2.5 |iM diluido en medio de control en presencia de compuestos de ensayo o VEGF (en un volumen total/pocillo de 200 |il), con el fin de evitar diluciones adicionales del fármaco.
Organización de placas de cultivo
Para todos los experimentos de este estudio se usó como compuesto de referencia VEGF-165, que se sabe que es una isoforma proangiogénica de VEGF-A. VEGF-165 es una de las isoformas del VEGF más abundantes implicadas en la angiogénesis. El VEGF se usó como compuesto de ensayo de referencia en 10 nM.
Se evaluaron las siguientes condiciones:
• Control negativo: medio solo 0,1% de DMSO
• Intoxicación: amiloide-p1-42 (2.5 |iM) durante 18 h
• Control positivo: VEGF-165 (10 nM) (1 compuesto de referencia/cultivo) 1 h antes de la adición de AP1-42 (2.5 |iM) durante un tiempo de incubación de 18 h
• Compuestos de ensayo: compuesto de ensayo 1 h antes de la adición de AP1-42 (2.5 |iM) durante un tiempo de incubación de 18 h
Cuantificación de la red de capilares
Se tomaron 2 fotografías por pocillo con una lente 4x usando InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) en transmisión de luz. Todas las imágenes se tomaron en las mismas condiciones. El análisis de las redes de angiogénesis se hizo usando el software Developer (GE Healthcare). Se evaluó la longitud total de la red de capilares.
Procesamiento de datos
Todos los valores se expresan como media ± e.e. de la media de los 3 cultivos (n = 6 por condición). Se hicieron los análisis estadísticos en las diferentes condiciones llevando a cabo un ANOVA seguido de la prueba de Dunnett cuando estaba permitido (software Statview versión 5.0). Los valores (como %) insertados en las gráficas muestran la evolución de la toxicidad del amiloide. De hecho, la toxicidad del amiloide se consideró como 100% y el efecto del compuesto de ensayo se calculó como % de esta toxicidad del amiloide.
Resultados
Los resultados se muestran en la figura 1. Demuestran que los fármacos ensayados solos inducen un efecto protector sustancial contra la toxicidad causada por el péptido Api-42:
- Torasemida, en una dosis baja de, p. ej., 400 nM, induce un fuerte efecto protector;
- Bromocriptina, en una dosis baja de, p. ej., 3.2 nM, induce un fuerte efecto protector.
Los resultados muestran también que, inesperadamente, las concentraciones de fármaco superiores o inferiores en comparación con las concentraciones de fármaco mencionadas antes, pueden empeorar o más bien tener menos o no tener efecto en la toxicidad de Api-42 en este modelo.
I.2 Protección contra la toxicidad de Api-42 en células neuronales corticales primarias
Compuesto de ensayo y tratamiento del amiloide-pi-42 humano
Se cultivaron neuronas corticales de rata como describen Singer et al. (42). Brevemente, ratas hembra preñadas de 15 días de gestación se sacrificaron por luxación cervical (Rats Wistar) y se extrajeron los fetos del útero. Se extrajo la corteza cerebral y se puso en medio helado de Leibovitz (L15) que contenía 2% de penicilina 10 000 U/ml y estreptomicina 10 mg/ml y 1% de albúmina de suero bovino (BSA). Las cortezas cerebrales se disociaron mediante tripsina durante 20 min a 37°C (0.05%). La reacción se detuvo por adición de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía DNasa1 grado II y 10% de suero de ternero fetal (FCS). Después, las células se disociaron mecánicamente mediante 3 pases seriados a través de una pipeta de 10 ml y se centrifugaron a 515 x g durante 10 min a 4°C. Se descartó el líquido sobrenadante y el sedimento de células se resuspendió en un medio de cultivo definido que consistía en Neurobasal complementado con B27 (2%), L-glutamina (0.2 mM), 2% de solución PS y 10 ng/ml de BDNF. Se contaron las células viables en un citómetro Neubauer usando la prueba de exclusión con azul de tripán. Las células se sembraron en una densidad de 30000 células/pocillo en placas de 96 pocillos (los pocillos estaban recubiertos previamente con poli-L-lisina (10 |ig/ml)) y se cultivaron a 37°C en una atmósfera de aire humidificado (95%)/CO2 (5%).
Brevemente, se reconstituyó el péptido Ap1-42 en un medio de cultivo definido a 40 |iM (solución madre) y se sacudió lentamente a 37°C durante 3 días en la oscuridad para la agregación. El medio de control se preparó en las mismas condiciones.
Después de 3 días, la solución se usó en neuronas corticales primarias como sigue:
Después de 10 días de cultivo de neuronas, se disolvió fármaco en medio de cultivo (+0,1% de DMSO) y después se preincubó con neuronas durante 1 hora antes de la aplicación del AP1-42 (en un volumen final por pocillo de cultivo de 100 |il). Una hora después de la incubación del o de los fármacos, se añadieron 100 |il de péptido AP1-42 hasta una concentración final 10 |iM diluido en presencia del o de los fármacos, con el fin de evitar diluciones adicionales del o de los fármacos. Se intoxicaron las neuronas corticales durante 24 horas. Se llevaron a cabo tres cultivos separados por condición, 6 pocillos por condición.
Se usaron BDNF (50 ng/ml) y estradiol-p (150 nM) como control positivo y compuestos de referencia, respectivamente.
Organización de placas de cultivo
Se usó estradiol-p 150 nM como control positivo.
El estradiol-p se disolvió en medio de cultivo y se preincubó durante 1 h antes de la aplicación del amiloide-p1-42 agregado.
Se evaluaron las siguientes condiciones:
- Placa de control: 12 pocillos/condición
• Control negativo: medio solo 0,1% de DMSO
• Intoxicación: amiloide-p1-42 (10 |iM) durante 24 h
• Compuesto de referencia: estradiol (150 nM) 1 h
- Placa de fármaco: 6 pocillos/condición
• Control negativo: medio solo 0,1% de DMSO
• Intoxicación: amiloide-p1-42 (10 |iM) durante 24 h
• Fármaco: fármaco -1 h seguido de amiloide-p1-42 (10 |iM) durante 24 h
Ensayo de actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH)
24 horas después de la intoxicación, se retiró el líquido sobrenadante y se analizó con el kit de detección de citotoxicidad (LDH, Roche Applied Science, ref: 11644793001, lote: 11800300). Este ensayo colorimétrico para la cuantificación de la toxicidad celular se basa en la medición de la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada del citosol de células que mueren en el líquido sobrenadante.
Procesamiento de datos
Todos los valores se expresan como media ± e.e. de la media de los 3 cultivos (n = 6 por condición). Se hicieron los análisis estadísticos en las diferentes condiciones (ANOVA seguido de la prueba de Dunnett cuando estaba permitido, software Statview versión 5.0).
Resultados
Los resultados obtenidos para fármacos individuales seleccionados en los ensayos de toxicidad en células neuronales corticales primarias se presentan en las figuras 2, 26 y 27. Demuestran que los fármacos ensayados solos inducen un efecto protector sustancial contra la toxicidad causada por el péptido AP1-42:
- Trimetazidina, en una dosis baja de p. ej., 40 nM, induce un fuerte efecto protector;
- Mexiletina, en una dosis tan baja como 3.2 nM, induce un fuerte efecto protector;
- Bromocriptina, en una dosis tan baja como 40 nM, induce un fuerte efecto protector;
- Ifenprodil, en una dosis tan baja como 600 nM, induce un fuerte efecto protector;
- Moxifloxacino, en una dosis tan baja como 20 nM, induce un fuerte efecto protector;
- Torasemida, en una dosis de 200 nM, induce un fuerte efecto protector,
- Homotaurina, en una dosis de 8 nM, induce un fuerte efecto protector.
Los resultados obtenidos muestran también que, inesperadamente, las concentraciones de fármaco superiores o inferiores a las indicadas antes, pueden empeorar o más bien tener menos o no tener efecto protector en la toxicidad por AP1-42 para células neuronales.
II. Las terapias combinadas previenen la toxicidad de AP1.42 humano
II.1 Efecto de terapias combinadas en la toxicidad del péptido AP1-42 humano en células HBMEC humanas
Se evalúa en células humanas la eficacia de combinaciones de fármacos como se describen en la presente memoria. El protocolo que se usa en estos ensayos es el mismo que el descrito en la sección I.1 anterior.
Resultados
Todas las combinaciones de fármacos ensayadas proporcionan efecto protector contra la toxicidad del péptido AP1-42 humano en el modelo de HBMEC, como se muestra a continuación en la tabla 3 y se ilustra en las figuras 3 a 6 y las figuras 13 y 14. Los resultados muestran claramente que la intoxicación por péptido amiloide humano agregado (AP1-42 2.5 |iM) se previene de forma significativa mediante combinaciones como se describen en la presente invención, mientras que, en esas concentraciones, los fármacos solos no tienen efecto significativo en la intoxicación en las condiciones experimentales descritas antes.
Tabla 3:
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Figure imgf000022_0001
Como se ilustra en las figuras 3 a 6, 13 y 14, las siguientes combinaciones de fármacos dan efectos protectores particularmente interesantes contra la toxicidad del péptido AP1-42 humano en células HBMEC intoxicadas:
- Baclofeno y torasemida,
- Sulfisoxazol y torasemida,
- Torasemida y eplerenona,
- Sulfisoxazol y bromocriptina,
- Terbinafina y torasemida, o
- Cinacalcet y mexiletina.
II.2 Efecto de terapias combinadas en la toxicidad del péptido Api.42 humano en células neuronales corticales primarias
Se evalúa en células neuronales corticales primarias la eficacia de combinaciones de fármacos como se describen en la presente memoria. El protocolo que se usa en estos ensayos es el mismo que el descrito en la sección I.2 anterior.
Resultados
Todas las combinaciones de fármacos ensayadas proporcionan efecto protector contra la toxicidad del péptido AP1.42 humano en células neuronales corticales primarias, como se muestra a continuación en la tabla 4 y se ilustra en las figuras 7 a 12 y 16 a 22. Los resultados muestran claramente que la intoxicación por péptido amiloide humano agregado (AP1-4 210 |iM) se previene significativamente mediante combinaciones como se describen en la presente memoria, mientras que, en esas concentraciones, los fármacos solos no tienen efecto significativo en la intoxicación en las condiciones experimentales descritas antes.
Tabla 4:
Figure imgf000022_0002
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Como se ilustra en las figuras 7 a 12, y 15 y 22, las siguientes combinaciones de fármacos dan efectos protectores particularmente interesantes contra la toxicidad del péptido Api-42 humano en células neuronales corticales primarias intoxicadas:
- Acamprosato e ifenprodil,
- Baclofeno y mexiletina,
- Baclofeno y torasemida,
- Baclofeno y trimetazidina,
- Cinacalcet y mexiletina,
- Cinarizina y trimetazidina,
- Trimetazidina y zonisamida.
- Mexiletina e ifenprodil,
- Moxifloxacino y baclofeno,
- Moxifloxacino y cinacalcet,
- Moxifloxacino y trimetazidina,
- Moxifloxacino y sulfisoxazol,
- Moxifloxacino y zonisamida, o
- Torasemida y sulfisoxazol.
II. 4. Protección del crecimiento de neuritas contra la toxicidad de AP1-42
Compuestos de ensayo y tratamiento de Api.42
Se cultivan neuronas corticales primarias de rata como se ha descrito previamente.
Después de 10 días de cultivo, las células se incuban con fármacos. Después de 1 hora, las células se intoxican con beta-amiloide 2.5 |iM (1-42; Bachem) en medio definido sin BDNF, pero junto con fármacos. Las neuronas corticales se intoxican durante 24 horas. Como control positivo (neuroprotector) se usa BDNF (10 ng/ml). Se llevaron a cabo tres cultivos independientes por condición, 6 pocillos por condición.
Longitud de neuritas
Después de 24 horas de intoxicación, se retira el líquido sobrenadante y las neuronas corticales se fijan mediante una solución fría de etanol (95%) y ácido acético (5%) durante 5 min. Después de permeabilización con 0,1% de saponina, las células se bloquean durante 2 h con PBS que contiene un 1% de suero bovino fetal. Después, las células se incuban con anticuerpo monoclonal antiproteínas asociadas a microtúbulos 2 (MAP-2; Sigma). Este anticuerpo se revela con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Alexa Fluor 488 (sonda molecular). Los núcleos de las neuronas se marcaron mediante un marcador fluorescente (solución Hoechst, SIGMA).
Se tomaron 10 fotografías por pocillo usando InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) con 20 aumentos. Todas las fotografías se toman en las mismas condiciones. El análisis de la red de neuritas se hace usando software Developer (GE Healthcare) con el fin de evaluar la longitud total de la red de neuritas.
Resultados
La combinación de baclofeno y torasemida induce un efecto protector significativo contra la toxicidad del péptido AP1-42 humano (mejora de un 531% de la red de neuritas) en células neuronales corticales primarias, como se muestra en la figura 23. Los resultados muestran claramente que la intoxicación por péptido amiloide humano (AP1.42 2.5 |iM) se previene significativamente por la combinación y que, además, la combinación aumenta la red de neuritas en comparación con el control.
Por lo tanto, esta combinación permite una protección eficaz de las células neuronales corticales y de redes neuronales celulares contra la toxicidad del péptido AP1-42 humano. Además, dicho aumento de la red de neuritas confirma la eficacia de dichos fármacos en trastornos neurológicos como lesión de médula espinal.
III. Los compuestos previenen la toxicidad del AP25-35 humano in vivo
Animales
Se usan ratones Swiss macho a lo largo de todo el estudio. Los animales se albergan en jaulas de plástico, con acceso libre a comida de laboratorio y agua, excepto durante los experimentos conductuales, y se mantienen en un entorno regulado, con un ciclo de 12 h de luz/oscuridad (luz a las 8:00 a.m.). Los experimentos conductuales se llevan a cabo en una sala experimental insonorizada y con regulación de aire, a la que los ratones habían sido habituados al menos 30 min antes de cada experimento.
Preparación e inyección de péptido amiloide
Se disolvieron el péptido AP25-35 y péptido AP25-35 desordenado en agua bidestilada estéril y se almacenaron a -20°C hasta su uso. Una observación por microscopio óptico indicaba que la incubación del péptido AP25-35, pero no la del péptido AP25-35 desordenado, conducía a la presencia de dos tipos de precipitados insolubles, estructuras similares a fibrillas birrefringentes y agregados globulares amorfos. Después se administran los péptidos P-amiloides por vía intracerebroventricular (i.c.v.). Brevemente, se anestesia cada ratón ligeramente con éter y se inserta una aguja de acero inoxidable de calibre unilateralmente 1 mm a la derecha del punto de la línea media equidistante de cada ojo, a una distancia igual entre los ojos y las orejas y perpendicular al plano del cráneo. Se suministran péptidos o vehículo gradualmente en un plazo de aproximadamente 3 s. Los ratones presentaron un comportamiento normal en el plazo de 1 min después de la inyección. El sitio de administración se controla inyectando tinta china en experimentos preliminares. Ni la inserción de la aguja ni la inyección del vehículo tuvieron una influencia significativa en la supervivencia, respuestas conductuales o funciones cognitivas.
Tratamiento con fármaco(s)
El día -1, es decir 24 h antes de la inyección de péptido AP25-35, se administran fármacos, combinación de fármacos o la solución de vehículo vía oral mediante sonda dos veces al día (a las 8:00 am y a las 6:00 pm).
El día 0 (a las 10:00 am) se inyecta a los ratones por vía i.c.v. péptido Ap25-35 o péptido Ap25-35 desordenado (control) en un volumen final de 3 |il (3 mM).
Entre el día 0 y el día 7 se administran fármacos, combinación de fármacos o la solución de vehículo vía oral mediante sonda una o dos veces al día (a las 8:00 am y a las 6:00 pm). Un grupo de animales recibe donepezilo (compuesto de referencia -1 mg/kg/día) vía oral por sonda en una sola inyección (a las 8:00 am). Los fármacos se solubilizan en agua y se preparan al momento justo antes de cada administración por sonda.
El día 7 se ensaya en todos los animales el rendimiento de alternancia espontánea en la prueba del laberinto en Y, un índice de la memoria funcional espacial.
Los días 7 y 8 se evalúa la memoria contextual a largo plazo de los animales usando el procedimiento de evitación pasiva de tipo descenso.
El día 8 los animales son sacrificados. Se diseca su cerebro y se mantiene a -80 °C para un posterior análisis.
Se observan resultados positivos en rendimientos conductuales y en ensayos bioquímicos realizados 7 días después de la inyección icv de péptido AP25-35, en particular para las combinaciones citadas en la tabla 5.
Tabla 5:
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IV. Los compuestos mejoraban los rendimientos conductuales y cognitivos de animales intoxicados
Los animales se intoxican como en la sección anterior.
Rendimientos de alternancia espontánea - prueba del laberinto en Y
El día 7 se ensayó en todos los animales el rendimiento de alternancia espontánea en el laberinto en Y, un índice de la memoria funcional espacial. El laberinto en Y está hecho de poli(cloruro de vinilo) gris. Cada brazo tiene 40 cm de longitud, 13 cm de altura, 3 cm de anchura en la parte inferior, 10 cm de anchura en la parte superior, y converge, en un ángulo igual. Se coloca cada ratón en el extremo de un brazo y se permite que se mueva libremente por el laberinto durante una sesión de 8 min. Se comprueba visualmente la serie de entradas en los brazos, incluyendo posibles retornos al mismo brazo. Una alternancia se define como entradas en los tres brazos en ocasiones consecutivas. Por lo tanto, el número de alternancias máximas es el número total de entradas en un brazo menos dos y el porcentaje de alternancia se calcula como (alternancias reales/alternancias máximas) x 100. Los parámetros incluyen el porcentaje de alternancia (índice de memoria) y el número total de entradas en los brazos (índice de exploración). Los animales que muestran un comportamiento extremo (porcentaje de alternancia < 25% o > 85% o número de entradas en un brazo < 10) se descartan. Normalmente, éstos representan 0-5% de los animales. Este ensayo sirve incidentalmente para analizar en el nivel conductual el impacto y el efecto amnésico inducido en ratones por la inyección de Ap25-35.
Ensayo de evitación pasiva
El aparato es una caja de dos compartimentos (15 x 20 x 15 cm de altura) con uno iluminado, con paredes de poli(cloruro de vinilo) blancas, y el otro oscuro, con paredes de poli(cloruro de vinilo) negras y un suelo de rejilla. Una puerta de guillotina separa cada compartimento. Una lámpara de 60 W colocada 40 cm por encima del aparato ilumina el compartimento blanco durante el experimento. Se podían suministrar al suelo de rejilla descargas eléctricas plantares aleatorizadas (0,3 mA durante 3 s) usando un generador de descargas eléctricas con aleatorizador (Lafayette Instruments, Lafayette, EE.UU.). La puerta de guillotina está inicialmente cerrada durante la sesión de adiestramiento. Se coloca cada ratón en el compartimento blanco. Después de 5 s se levanta la puerta. Cuando el ratón entra en el compartimento oscuro y pone todas sus patas sobre el suelo de rejilla, la puerta se cierra y se suministra la descarga eléctrica plantar durante 3 s. Se registran la latencia de paso, es decir el tiempo de espera hasta entrar en el compartimento oscuro, y el número de vocalizaciones. El ensayo de retención se lleva a cabo 24 h después del adiestramiento. Se coloca de nuevo cada ratón en el compartimento blanco. Después de 5 s se levanta la puerta; se registran la latencia de paso y la latencia de escape, es decir el tiempo consumido para volver al compartimento blanco, hasta los 300 s.
Se observan resultados positivos para cada una de las combinaciones ensayadas dadas en la Tabla 6.
Tabla 6
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V. Los compuestos mejoran los problemas neurofisiológicos de enfermedades neurológicas
Se ensayan terapias de combinación en el modelo in vivo de intoxicación por Ap. Se evalúan sus efectos en diversos parámetros que están afectados en enfermedades neurológicas:
- Nivel de expresión de caspasas 3 y 9, considerado como un indicador de apoptosis,
- Peroxidación de lípidos, considerado como un marcador para el nivel de estrés oxidativo,
- Ensayo de expresión de GFAP, considerado como un marcador del nivel de inflamación cerebral,
- Integridad de la barrera hematoencefálica,
- Integridad sináptica total (sinaptofisina ELISA).
Integridad de la barrera hematoencefálica
El diseño experimental respecto a la intoxicación de animales por Ap es el mismo que en la parte III.
El potencial efecto protector de las terapias de combinación en la integridad de la barrera hematoencefálica (BHE) se analiza en ratones a los que se les ha inyectado por vía intracerebroventricular (i.c.v.) el péptido amiloide-p25-35 oligomérico (Ap25-35) o péptido de control Ap25-35 desordenado (Sc.Ap), 7 días después de la inyección.
El día 7 después de la inyección de Ap25-35, los animales se someten a ensayo para determinar la integridad de la BHE usando el método AE (azul de Evans). Se sabe que el colorante AE se une a la albúmina sérica después de una inyección periférica, y se ha usado como trazador para la albúmina sérica.
Se inyecta por vía intraperitoneal (i.p.) colorante AE (2% en solución salina, 4 ml/kg) 3 h antes de la perfusión transcardiaca. Después, los ratones se anestesian con 200 |il i.p. de premezcla de ketamina 80 mg/kg, xilazina 10 mg/kg, se abre el tórax. Se realiza a los ratones una perfusión transcardiaca con 250 ml de solución salina durante aproximadamente 15 min, hasta que el fluido procedente de la aurícula derecha se vuelve incoloro. Después de decapitación, se extrae el cerebro y se diseca en tres regiones: corteza cerebral (izquierda derecha), hipocampo (izquierdo derecho), diencéfalo. Después, se pesa cada región cerebral para una medición cuantitativa de extravasación de AE-albúmina.
Las muestras se homogeneizan en solución salina tamponada con fosfato y se mezclan con vórtice después de añadir ácido tricloroacético al 60% para precipitar la proteína. Las muestras se enfrían a 4°C y después se centrifugan durante 30 min a 10 000 g, 4°C. Se mide el líquido sobrenadante a 610 nm para determinar la absorbancia del AE usando un espectrofotómetro.
El AE se cuantifica tanto como
- |ig/mg de tejido cerebral usando una curva de referencia, obtenida mediante la concentración conocida de AE-albúmina,
- como en |ig/mg de proteína.
Como se menciona en la tabla 7, las terapias de combinación como se describen en la presente memoria son eficaces en el mantenimiento de la integridad de la BHE, en comparación con animales intoxicados no tratados. Integridad sináptica total (sinaptofisina ELISA)
Se ha elegido como marcador de la integridad sináptica la sinaptofisina, y se ensaya usando un kit de ELISA comercial (USCN, Ref. E90425Mu). Se preparan muestras de tejidos de hipocampo y se homogeneizan en un tampón de extracción específico según la descripción del fabricante y la bibliografía de referencia.
Se lavan los tejidos en PBS helada (0.02 moles/l, pH 7.0-7.2) para eliminar el exceso de sangre minuciosamente y se pesan antes de congelarlos en nitrógeno y almacenarlos a -80 °C. Se cortan los tejidos en trozos pequeños y se homogeneizan en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada con un homogeneizador de vidrio. La suspensión resultante se somete a ultrasonidos con un disruptor de células ultrasónico o se somete a dos ciclos de congelación-descongelación para romper más las membranas celulares. Después, los homogeneizados se centrifugan durante 5 min a 5000 g y el líquido sobrenadante se somete inmediatamente a ensayo.
Todas las muestras se ensayan por triplicado.
La cuantificación de las proteínas se lleva a cabo con el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (ácido bicinconínico) (Pierce, n° ref. 23227) para evaluar el rendimiento de extracción y permitir la normalización.
Después, se calculan las concentraciones de proteínas totales a partir de diluciones de la curva de referencia, que sirven para normalizar los resultados de ELISA.
Los resultados (Tabla 7) muestran que las terapias de combinación son eficaces en el mantenimiento de un nivel de sinaptofisina general en el cerebro de los animales tratados, en comparación con los animales intoxicados no tratados.
Ensayo de estrés oxidativo
Los ratones se sacrifican por decapitación y se extraen rápidamente ambos hipocampos, se pesan y se mantienen en nitrógeno líquido hasta el ensayo. Después de descongelación, los hipocampos se homogeneizan en metanol frío (1/10 p/v), se centrifugan a 1000 g durante 5 min y el líquido sobrenadante se pone en un tubo Eppendorf. El volumen de reacción de cada homogeneizado se añade a FeSO4 1 mM, H2SO40,25 M, naranja de xilenol 1 mM y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de leer la absorbancia a 580 nm (A580 1), se añaden a la muestra 10 |il de hidroperóxido de cumeno 1 mM (CHP) y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente, para determinar el nivel de oxidación máximo. La absorbancia se mide a 580 nm (A580 2). El nivel de peroxidación de lípidos se determina como equivalentes de CHP (CHPE) de acuerdo con: CHPE = A580 1/A5802 x [CHP] y se expresa como equivalentes de CHP por peso de tejido y como porcentaje de datos del grupo de control. Los resultados (Tabla 7) muestran que las terapias de combinación son eficaces en la reducción del estrés oxidativo en general inducido por el Ap en el cerebro de animales tratados, en comparación con los animales intoxicados no tratados.
Ensayo de inducción de la ruta de caspasa y ensayo de expresión de GFAP
Los ratones se sacrifican por decapitación y se extraen rápidamente ambos hipocampos, se lavan en PBS helada (0.02 moles/l, pH 7.0-7.2) para eliminar el exceso de sangre minuciosamente, se pesan y se mantienen en nitrógeno líquido hasta el ensayo. Se cortan los tejidos en trozos pequeños y se homogeneizan en 1 ml de PBS helada con un homogeneizador de vidrio. La suspensión resultante se trata con ultrasonidos con un disruptor de células ultrasónico o se somete a dos ciclos de congelación-descongelación para romper más las membranas celulares. Después, los homogeneizados se centrifugan a 5 000 g durante 5 min y el líquido sobrenadante se somete inmediatamente a ensayo.
Los experimentos se realizan con ensayo comercial: caspasa-3 (USCN - E90626Mu), caspasa-9 (USCN -E90627Mu), GFAP (USCN - E90068).
La cuantificación de las proteínas se lleva a cabo con el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (ácido bicinconínico) (Pierce, n° ref. 23227) para evaluar el rendimiento de extracción y permitir una normalización.
Los resultados (Tabla 7) muestran que las terapias de combinación tienen un efecto positivo en marcadores de apoptosis e inflamación en el cerebro de los animales tratados, en comparación con los animales intoxicados no tratados.
Tabla 7
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B) Prevención de la toxicidad del glutamato en células neuronales
En este conjunto adicional de experimentos se ensayaron compuestos candidatos en relación a su capacidad para prevenir o reducir los efectos tóxicos de la toxicidad del glutamato en células neuronales. La toxicidad del glutamato está implicada en la patogénesis de enfermedades o trastornos neurológicos tales como la esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, neuropatías, alcoholismo o abstinencia alcohólica o lesión de la médula espinal. Los fármacos se ensayan primero individualmente, seguido de ensayos de su acción combinada.
Métodos
Se ensaya en células neuronales corticales primarias la eficacia de combinaciones de fármacos como se describen en la presente memoria. El protocolo que se usa en estos ensayos es el mismo que el descrito antes en la sección A.I.2.
Ensayos de toxicidad del glutamato
Se evalúa el efecto neuroprotector de compuestos por cuantificación de la red de neuritas (inmunotinción de neurofilamentos (NF)) que revela específicamente las neuronas glutamatérgicas.
Después de 12 días de cultivo de las neuronas, se disuelven fármacos de las combinaciones candidatas en medio de cultivo (+0,1% de DMSO). Después, las combinaciones candidatas se preincuban con neuronas durante 1 hora antes de la lesión por glutamato. Una hora después de la incubación se añade glutamato durante 20 min, hasta una concentración final 40 |iM, en presencia de combinaciones candidatas, con el fin de evitar posteriores diluciones de fármaco. Al final de la incubación se cambia el medio por medio con combinación candidata, pero sin glutamato. El cultivo se fija 24 horas después de la lesión por glutamato. Como control positivo se usa MK801 (hidrogenomaleato de dizocilpina, 77086-22-7 - 20 |iM).
Después de permeabilización con saponina (Sigma), las células se bloquean durante 2 h con PBS que contiene suero de cabra al 10%, después las células se incuban con anticuerpo primario monoclonal de ratón contra anticuerpo para neurofilamentos (NF, Sigma). Este anticuerpo se revela con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Alexa Fluor 488.
Los núcleos de las células se marcan mediante un marcador fluorescente (solución Hoechst, SIGMA) y se cuantifica la red de neuritas. Se usan seis pocillos por condición para evaluar la supervivencia neuronal en 3 cultivos diferentes.
Resultados
Todas las combinaciones de fármacos ensayadas proporcionan un efecto protector contra la toxicidad del glutamato para las células neuronales corticales. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 8.
Como se ilustra en las figuras 24 y 25, las combinaciones como se describen en la presente memoria, protegen fuertemente las neuronas frente a la toxicidad del glutamato en las condiciones experimentales descritas antes. Cabe destacar que se observa una protección eficaz usando concentraciones de fármacos en las que los fármacos usados solos no tienen efecto protector significativo o tienen un menor efecto protector.
Tabla 8
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C) Mejora de otros trastornos relacionados con la excitotoxicidad del glutamato usando combinaciones
El efecto protector in vitro mencionado antes contra la toxicidad del glutamato de los fármacos y las combinaciones de fármacos como se describen en la presente memoria, combinado con los efectos protectores ilustrados en la presente memoria en diversos modelos de EA, llevó a los autores de la invención a ensayar estos fármacos y combinaciones en algunos modelos de otras enfermedades en cuya patogénesis también está implicada la toxicidad del glutamato, como la EM, ELA y el dolor neuropático.
I) Efecto protector de combinaciones en un modelo in vivo de esclerosis múltiple
Se usa un modelo en el que ratones inmunizados con glucoproteína de mielina de oligodendrocitos (inmunizados con MOG) desarrollan EAE progresiva para demostrar el efecto beneficioso de composiciones como se describen en la presente memoria en el tratamiento de la esclerosis múltiple.
Animales y productos químicos
Se compran ratones hembra C57L/6J (8 semanas de edad) de Janvier (Francia); después de dos semanas de habituación, los ratones hembra (10 semanas de edad) desarrollan parálisis crónica después de inmunización con péptido MOG (glucoproteína de mielina de oligodendrocitos). La encefalomielitis experimental se induce con el kit de Hooke MOG35-55/CFA Emulsion PTX (toxina pertussis) para inducción de EAE (EK-0110, EK-0115; laboratorios Hooke). El kit de control es CK-0115 (laboratorios Hooke).
Procedimiento experimental
La encefalomielitis experimental se induce por el siguiente procedimiento:
El día 0 se llevan a cabo dos inyecciones subcutáneas de 0.1 ml cada una; una en la parte superior del lomo del ratón y otra en la parte inferior del lomo. Cada inyección contiene 100 |ig de péptido MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK), 200 |ig de Mycobacterium tuberculosis H37Ra inactivada y se emulsiona en coadyuvante completo de Freund (CFA) (Hooke laboratories). La emulsión proporciona el antígeno necesario para expandir y diferenciar las células T autoinmunes específicas de MOG.
Se llevan a cabo dos inyecciones intraperitoneales de 500 ng de toxina pertussis en PBS (kit de Hooke) 2 horas (día 0) y 24 horas (día 1) después de la inyección de MOG. La toxina pertussis aumenta el desarrollo de la EAE proporcionando coadyuvante adicional.
Los ratones desarrollan EAE 8 días después de la inmunización y permanecen paralizados crónicamente durante la duración del experimento. Después de la inmunización se observa diariamente en los ratones los síntomas clínicos en un procedimiento con ocultación. Los animales se mantienen en una instalación libre de patógenos convencional y todos los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con las directrices prescritas por, y son aprobadas por, el comité local permanente de bioética.
Grupos experimentales y tratamiento con fármacos:
Antes de la inmunización se homogeneizan por peso grupos de ratones hembra como se ha descrito:
- Grupo de control: inyección de vehículo en las mismas condiciones que los ratones de EAE (desde el día -1 al día 28, se administra diariamente placebo)
- Grupo de EAE: inyección de MOG (día 0) inyecciones de toxina pertussis (día 0 y 1) - desde el día - 1 al día 28, se administra diariamente placebo por vía oral
- EAE control positivo: inyección de MOG (día 0) inyecciones de toxina pertussis (día 0 y 1) - desde el día -1 al día 28, se administra diariamente dexametazona por vía oral.
- Grupo de EAE tratamiento: inyección de MOG (día 0) inyecciones de toxina pertussis (día 0 y 1). Los tratamientos comienzan un día antes de la inmunización y duran hasta el día 28.
Las puntuaciones clínicas se miden los días 0-5-8-9-12-14-16-19-21-23-26-28.
Se usa el software Statistica (Statsoft Inc.) durante todo el proceso para el análisis estadístico. Se usan el análisis ANOVA y pruebas t de Student para analizar la puntuación de la enfermedad clínica. P < 0.05 se considera significativo.
Se compararon los retrasos en la aparición de la enfermedad, la puntuación clínica y el retraso de la muerte entre cada grupo con el grupo “inmu” de referencia con curvas de Kaplan-Meier y un modelo de Cox (paquete de R “supervivencia”). Los valores p resultantes son unilaterales y ensayan la hipótesis de que sea mejor que el grupo “inmu” de referencia.
La puntuación clínica total se compone de la puntuación de cola, la puntuación de extremidades posteriores, la puntuación de extremidades anteriores y la puntuación de vejiga como se describe a continuación:
Puntuación de cola:
Figure imgf000030_0001
Puntuación de extremidades posteriores:
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Puntuación de extremidades anteriores:
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Puntuación de vejiga:
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La puntuación global para cada animal se determina mediante la suma de todas las categorías antes mencionadas. La puntuación máxima para animales vivos es 10.
Resultados - Las terapias de combinación son eficaces en un modelo de EM
Se observa una mejora significativa de la puntuación clínica global en los ratones del “grupo EAE tratamiento”, en particular para las combinaciones citadas en la Tabla 9.
Tabla 9
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II. Efecto protector de combinaciones en modelos de ELA
Se ensayan terapias de combinación como se describe en la presente memoria in vitro, en un modelo de cocultivo, e in vivo, en un modelo de ratón de ELA. En esta sección se presentan los protocolos y resultados.
II.1 Efecto protector contra la toxicidad del glutamato en cultivos primarios de cocultivo de nervio-músculo Cocultivos primarios de células nerviosas y musculares
Se prepara músculo humano según un método previamente descrito a partir de partes de biopsia de un paciente sano (44). Las células musculares se establecen a partir de células disociadas (10000 células por pocillo), se ponen en placas de 48 pocillos revestidos con gelatina al 0,1% y se cultivan en un medio de proliferación que consiste en una mezcla de medio MEM y medio M199.
Inmediatamente después de la fusión de células satélite, cortes transversales enteros de médulas espinales de embriones de ratas Wistar de 13 días de edad con ganglios de la raíz dorsal (DRG) unidos se ponen sobre la monocapa de músculo, 1 explante por pocillo (en la zona central). Los DRG son necesarios para lograr una buena proporción de inervaciones. Los cultivos inervados se mantienen en medio mixto. Después de 24 h en el cocultivo habitual, se observan neuritis surgiendo de los explantes de médula espinal. Se ponen en contacto con miotubos e inducen las primeras contracciones después de 8 días. Después, rápidamente, las fibras musculares inervadas situadas cerca de los explantes de médula espinal se contraen prácticamente de manera continua. Las fibras inervadas son morfológicamente y espacialmente distintas de las no inervadas y podían distinguirse fácilmente de las mismas.
Se realiza un cocultivo (6 pocillos por condición).
Lesión por glutamato
El día 27, los cocultivos se incuban con compuestos candidatos o riluzol una hora antes de la intoxicación con glutamato (60 |iM) durante 20 min. Después, se lavan los cocultivos y se añaden compuestos candidatos o riluzol durante 48 h adicionales. Después de este tiempo de incubación se incuban los cocultivos sin fijar con abungarotoxina acoplada con Alexa 488 en una concentración de 500 nmoles/l durante 15 min a temperatura ambiente. Después, se fijan los cocultivos mediante PFA durante 20 min a temperatura ambiente. Después de permeabilización con 0,1% de saponina, los cocultivos se incuban con anticuerpo antineurofilamentos (NF).
Estos anticuerpos se detectan con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Alexa Fluor 568 (sonda molecular). Los núcleos de las neuronas se marcan con un marcador fluorescente (solución Hoechst).
Los criterios de valoración son (1) longitud total de neuritas, (2) número de unidades motoras, (3) área total de unidades motoras, que son indicativos de la supervivencia y funcionalidad de las motoneuronas.
Para cada condición se toman 2 x 10 fotografías por pocillo usando InCell AnalyzerTM 1000 (GE, Healthcare) con 20 aumentos. Todas las imágenes se toman en las mismas condiciones.
Resultados
Los fármacos como se describen en la presente memoria protegen eficazmente las motoneuronas y las unidades motoras en el modelo de cocultivo. Además, se observa una mejora de la protección cuando los fármacos se usan en combinación para las combinaciones de fármacos citadas en la tabla 10.
Tabla 10
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II.2 - Las terapias de combinación son eficaces en el modelo de ratón con ELA
Se llevan a cabo experimentos en ratones macho. En este conjunto de experimentos para imitar la ELA se eligen ratones macho transgénicos B6SJL-Tg(SOD1)2Gur/J y su control (respectivamente SN2726 y SN2297 de Jackson Laboratories, Ben Harbor, EE.UU. y distribuidos por Charles River en Francia).
Los ratones enfermos expresan el transgén SOD1-G93A, diseñado con un gen SOD1 humano mutante (una sola sustitución de aminoácido de glicina por alanina en el codón 93) conducido por su promotor de SOD1 humano endógeno. Los ratones de control expresan el gen SOD1 humano de control.
Administración de fármacos
Se administran a los ratones tratamiento de fármacos candidatos diluidos en vehículo desde el día 60 después del nacimiento hasta la muerte. Las soluciones diluidas de fármacos candidatos se preparan con agua a temperatura ambiente justo antes de comenzar la administración.
• En agua potable:
Se añade riluzol a agua potable en una concentración final de 6 mg/ml (ajustada al peso corporal medio de cada grupo) en ciclodextrina al 5%. Dado que un ratón bebe aproximadamente 5 ml/día, la dosis administrada estimada es de 30 mg/kg/día, que es una dosis que se ha demostrado que aumenta la supervivencia de los ratones.
- Se usa ciclodextrina como vehículo en la concentración final de 5%, diluida en agua a temperatura ambiente a partir de una solución madre (ciclodextrina al 20%).
• Administración oral (vía oral):
- Las combinaciones de fármacos se administran por vía oral, diariamente.
- Se usa ciclodextrina como vehículo en la concentración final de 5%, diluida en agua a temperatura ambiente a partir de una solución madre (ciclodextrina al 20%).
Observación clínica
La observación clínica de cada ratón se lleva a cabo diariamente, desde el primer día de tratamiento (60 días de edad) hasta la muerte (o el sacrificio). La observación clínica consiste en estudiar ensayos conductuales: inicio de parálisis, “pérdida de extensión”, “pérdida de reflejo de enderezamiento” y observación de la marcha general:
- Inicio de parálisis: La observación consiste en la observación de la parálisis de cada extremidad. El inicio de la parálisis corresponde al día de los primeros signos de parálisis.
- El ensayo de pérdida de extensión consiste en notificación de temblores o sacudidas y la posición de las extremidades posteriores (colgando o extendidas hacia fuera) cuando el ratón está suspendido de la cola.
- El ensayo de pérdida de reflejo de enderezamiento evalúa la capacidad del ratón para enderezarse él mismo en un plazo de 30 segundos después de ser girado hacia cualquier lado. El reflejo de enderezamiento se ha perdido cuando el ratón es incapaz de enderezarse. La pérdida de reflejo de enderezamiento determina el estadio final de la enfermedad: si el ratón es incapaz de enderezarse se sacrifica.
Resultados - Las terapias de combinación son eficaces en un modelo in vivo de ELA
Se observa una mejoría de la enfermedad en los animales enfermos tratados con los fármacos y las combinaciones de fármacos como se describen en la presente memoria. En particular, las combinaciones de fármacos citadas en la Tabla 11 mejoran eficazmente la puntuación clínica de estos animales durante los diferentes estadios de la enfermedad.
Tabla 11:
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III) Efecto protector de combinaciones en neuropatía inducida por oxaliplatino como un modelo in vivo del dolor neuropático
Se ensayan in vivo terapias de combinación como se describen en la presente memoria, en modelos adecuados de neuropatía periférica, es decir, modelo agudo de neuropatía inducida por oxaliplatino y modelo crónico de neuropatía inducida por oxaliplatino. Los animales, protocolos y resultados se presentan en esta sección.
Cría de animales
Se usan ratas Sprague-Dawley (CERJ, Francia) con un peso de 150 - 175 g al principio del experimento del tratamiento con oxaliplatino (D0). Los animales están alojados en una instalación para animales de acceso limitado en una sala controlada en temperatura (19.5°C - 24.5°C) y humedad relativa (45% - 65%), con un ciclo de 12 h de luz/oscuridad, con acceso a voluntad a comida de laboratorio granulada estándar y agua durante todo el estudio. Los animales están alojados en un número de 4 o 5 por jaula, y antes de cualquier ensayo se observa un periodo de aclimatación de una semana.
Diseño experimental
En todos los experimentos se usan los cuatro grupos siguientes de ratas:
Grupos de control:
Grupo 1: vehículo de oxaliplatino (agua destilada), i.p. / vehículo de combinación(es) candidata(s) (agua destilada), v.o. diariamente.
Grupo 2: oxaliplatino (agua destilada), i.p. / vehículo de combinación(es) candidata(s) (agua destilada), v.o. diariamente.
Grupo 3: oxaliplatino 3 mg/kg i.p. / un solo fármaco en agua destilada, v.o. diariamente x 9.
Grupos de composición ensayados:
Grupo 4: oxaliplatino 3 mg/kg i.p. / combinación(es) candidata(s) en agua destilada, v.o. diariamente x 9.
Grupo 5: oxaliplatino 3 mg/kg i.p. / gabapentina (100 mg/kg) en agua destilada, v.o. los días de ensayo (es decir D1 y D8).
El vehículo y los elementos ensayados se suministran diariamente desde el D-1 hasta el D7 (el día antes del último día de ensayo), mientras que la gabapentina se administra los días de ensayo (120 minutos antes del ensayo). Todos los tratamientos se administran en un orden codificado y aleatorio cuando es posible. Las dosis se expresan en términos de sustancia activa libre.
Inducción de neuropatía
La neuropatía aguda se induce mediante una sola inyección intraperitoneal de oxaliplatino (3 mg/kg).
La neuropatía periférica crónica se induce mediante inyecciones intraperitoneales repetidas de oxaliplatino (3 mg/kg, i.p.) los días 0, 2, 4 y 7 (CD = 12 mg/kg, i.p.). La neuropatía crónica en seres humanos es acumulativa también y se observa más frecuentemente en pacientes que han recibido dosis totales de oxaliplatino > o = 540 mg/m2, lo que corresponde a ~15 mg/kg como dosis acumulada en ratas (Cersosimo R.J. 2005).
La neuropatía dolorosa inducida por oxaliplatino en ratas reproduce los síntomas de dolor en pacientes tratados con oxaliplatino:
- La hiperalgesia térmica es el primer síntoma. Se puede medir con la prueba de la acetona o con la prueba de inmersión de la cola.
- La hiperalgesia mecánica aparece más tarde. Puede cuantificarse con la prueba de Von Frey o la prueba de presión en la pata.
Administración a animales y ensayos
Todas las combinaciones de fármacos se administran desde el día antes de la primera inyección intraperitoneal de oxaliplatino 3 mg/kg (D-1) y continúan diariamente por vía oral hasta el D7. Durante los días de ensayo (es decir D1 y D7), las combinaciones de fármacos se administran después del ensayo. A los animales del grupo tratado con referencia (gabapentina) se les administra dosis sólo durante los días de ensayo.
Prueba de la acetona
Se evalúa la alodinia al frío usando la prueba de la acetona midiendo las respuestas a una estimulación térmica no nociceptiva el D1 (aproximadamente 24 h después de la primera inyección de oxaliplatino 3 mg/kg (efecto agudo de oxaliplatino)) y el D8 (efecto crónico de oxaliplatino).
En la prueba de la acetona se mide la latencia de retirada de la pata trasera después de la aplicación de una gota de acetona en la superficie plantar de ambas patas traseras (tiempo de reacción) y se puntúa la intensidad de la respuesta (puntuación para frío). El tiempo de reacción al efecto de enfriamiento de la acetona se mide en el plazo de 20 segundos (corte de exclusión) después de la aplicación de acetona. Las respuestas a la acetona se clasifican también con respecto a la siguiente escala de 4 puntos: 0 (sin respuesta); 1 (retirada rápida, golpecitos de la pata); 2 (retirada prolongada o golpecitos marcados de la pata); 3 (golpecitos repetidos de la pata con lamedura o mordedura).
Para cada grupo experimental, los resultados se expresan como:
- El tiempo de reacción definido como el tiempo expresado en segundos necesario para provocar una reacción de la pata (media de 6 mediciones para cada rata juntas ± EEM).
- La puntuación para frío acumulada se define como la suma de las 6 puntuaciones de cada rata juntas ± EEM. La puntuación mínima es 0 (sin respuesta a ninguno de los 6 experimentos) y la puntuación máxima posible es 18 (golpecitos repetidos y lamedura o mordedura de patas en cada uno de los seis experimentos).
Análisis estadísticos
Se lleva a cabo una prueba de Student, unilateral, tipo 3. El nivel de significación se ajusta como p<0.05; todos los grupos se comparan con el grupo enfermo vehículo (grupo tratado con oxaliplatino). En las figuras se muestran las medias y el error estándar de la media.
Resultados
El oxaliplatino inducía una disminución significativa en el tiempo de reacción de retirada de la pata después de la aplicación de acetona (grupo enfermo vehículo) en el transcurso del tiempo. Esta disminución es progresiva y significativa desde el día 1 (modelo agudo de neuropatía inducida por oxaliplatino) hasta el día 8 (modelo crónico), en comparación con el grupo de vehículo.
- Efecto antialodínico en el modelo agudo de neuropatía inducida por oxaliplatino
Las combinaciones de fármacos ensayadas en el modelo agudo de neuropatía inducida por oxaliplatino se evalúan con la prueba de la acetona. La Tabla 12 presenta combinaciones de fármacos (Grupo 4) que inducen una disminución significativa en la puntuación para frío acumulada y un aumento significativo del tiempo de reacción, en comparación con el grupo tratado con oxaliplatino-vehículo (Grupo 2). En conclusión, estas combinaciones de fármacos protegen a los animales frente a la neuropatía aguda inducida por oxaliplatino.
Tabla 12
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= efecto antialodínico obtenido en el Grupo 4 de ratas, después de análisis de las puntuaciones para el frío acumuladas y análisis del tiempo de reacción en los ensayos de acetona, en el modelo inducido de oxaliplatino. - Efecto antialodínico en el modelo crónico de neuropatía inducida por oxaliplatino
Las combinaciones de fármacos usadas en el modelo crónico de neuropatía inducida por oxaliplatino se evalúan con la prueba de la acetona.
La Tabla 13 presenta combinaciones de fármacos para las cuales el tiempo de reacción y la puntuación para frío en la prueba de la acetona medidos en el Grupo 4 (animales tratados con combinaciones de fármacos y oxaliplatino) son respectivamente significativamente mayores o menores de después del tratamiento en el modelo crónico de neuropatía, en comparación con el grupo tratado con oxaliplatino-vehículo (Grupo 2). En conclusión, estas combinaciones de fármacos protegen a los animales frente a la neuropatía crónica inducida por oxaliplatino.
Tabla 13
Figure imgf000035_0002
= efecto antialodínico obtenido en el Grupo 4 de ratas, después de análisis de las puntuaciones para el frío acumuladas y análisis del tiempo de reacción en los ensayos de acetona, en el modelo inducido de oxaliplatino. IV) Las composiciones basadas en baclofeno-torasemida promueven la regeneración de nervios en células no intoxicadas
- Efectos neurotróficos de la combinación de baclofeno-torasemida in vitro
Ensayo de longitud de neuritas
La evaluación del crecimiento de neuritas en cultivos de 10 días de células corticales de ratas se llevó a cabo usando anticuerpos para MAP-2 como se ha mencionado en la sección A) II.4, con la excepción de que las células no se han expuesto a ningún producto tóxico. Los cultivos de células de 10 días se incubaron con los fármacos durante 1 día antes del ensayo.
Resultados
Como se muestra en la figura 28, la combinación de baclofeno-torasemida presenta un efecto neurotrófico significativo (+11%) mientras que los fármacos individuales, cuando se usan solos, no tienen ningún efecto neurotrófico sustancial. De hecho, se observa un aumento significativo en la longitud total de neuritas dentro de la red neuronal (marcada MAP2-2) tras exposición a la combinación de baclofeno-torasemida (400 nM y 80 nM respectivamente). Hay que mencionar, que ni la combinación ni los fármacos solos tienen efecto en el número de neuronas, resaltando así que este aumento en la red de neuritas está relacionado con una extensión de las neuritas existentes y con la promoción de extensión de células neuronales nuevas.
Estos resultados confirman que la combinación de baclofeno-torasemida es eficaz para soportar la extensión de axones y por lo tanto es eficaz en el tratamiento de lesión de la médula espinal y otras lesiones de nervios. Confirma también que la combinación es eficaz en el tratamiento de neuropatías heredadas que comprenden un componente axonal, desmielinizante, o tanto axonal como desmielinizante. De hecho, debe considerarse que la desmielinización causa una desestabilización del axón que da como resultado la degeneración axonal observada incluso en las neuropatías consideradas que son principalmente de la forma desmielinizante.
- Las composiciones basadas en baclofeno-torasemida son eficaces para promover la regeneración de nervios in vivo
El aplastamiento del nervio ciático se acepta ampliamente como un modelo válido para la lesión de nervios periféricos y para la evaluación de la regeneración de nervios. En este modelo, el daño de nervios da como resultado una interrupción rápida de la función nerviosa, puesta de manifiesto por la medición del potencial de acción evocado muscular (CMAP) generado por la estimulación del nervio ciático lesionado.
La lesión de nervios se caracteriza por una conducción nerviosa menor de la señal que resulta por una mayor latencia en la generación del CMAP y por una resistencia deteriorada del potencial de acción que da como resultado una menor amplitud y duración.
Normalmente, los primeros signos de recuperación de la función nerviosa ocurren en el plazo de 2 semanas, y la semana 4 después de la lesión, se observa una remielinización significativa de los axones regenerados en el nervio ciático por histología (45).
Aplastamiento de nervios
Los ratones se anestesiaron usando isoflurano (de 2.5 a 3% en aire). El muslo derecho se afeitó y se expuso el nervio ciático a nivel medio del muslo y se aplastó 5 mm proximal a la bifurcación del nervio ciático. Los nervios se aplastaron durante 10 s dos veces con microfórceps (Holtex, referencia P35311) con una rotación de 90° entre cada aplastamiento. Para los animales operados de forma simularda, los nervios ciáticos se expusieron, pero no se aplastaron. Finalmente, la incisión de la piel se aseguró con dos clips para heridas. El día del aplastamiento se considera el día 0.
Pauta posológica
El día del aplastamiento, la primera administración de compuestos se llevó a cabo 30 min después del aplastamiento.
Después los compuestos se administran dos veces al día, desde el día después del aplastamiento y durante 42 días. En el plazo de un solo día, las administraciones de fármacos se espaciaron durante al menos 6 horas.
Los días de ensayo (días 7 y 30) se administró la dosis a los ratones 1 h 30 antes del ensayo.
El volumen de administración era 10 ml/kg, en DMSO al 0,25%/agua estéril.
Dosis 1 (2 veces al día) Dosis 2 (2 veces al día) Dosis 3 (2 veces al día) Baclofeno (+/-) 3 mg/kg 3 mg/kg 3 mg/kg Torasemida 25 |jg/kg 100 jg/kg 400 jg/kg
Mediciones electromiográficas
Se llevaron a cabo los registros electrofisiológicos usando un electromiógrafo Keypoint (EMG) (Medtronic, Francia) el día 7 y el día 30. Los ratones se anestesiaron con isoflurano en aire al 2.5-3%. Se usaron electrodos de aguja monopolares subcutáneos tanto para la estimulación como el registro. Se usaron pulsos de ondas cuadradas supramáximos (12.8 mA) de 0.2 ms de duración para estimular el nervio ciático. El nervio ciático derecho (ipsilateral) se estimuló con un solo pulso aplicado en la muesca ciática. El CMAP se registró mediante electrodos de aguja puestos en el músculo gastrocnemio. El inicio (latencia) de la señal de CMAP expresada en milisegundos se usa para calcular la velocidad de conducción nerviosa. Por lo tanto, la latencia refleja el grado de mielinización de los axones. También se determinó la amplitud del potencial de acción (|iV), que refleja el nivel de denervación y de reinervación de músculos. La amplitud del CMAP actualmente se da como proporcional al número de axones motores regenerados. También se determinó la duración del potencial muscular evocado. La amplitud y duración del potencial muscular evocado están más relacionados con la reinervación muscular. La latencia y la amplitud se reconocen de forma más general como los criterios de valoración más importantes cuando se trata con la regeneración de nervios. Los datos se analizaron con una prueba t de Student, tipo 3, bilateral; el nivel de significación se fija en p<0.05.
Resultados
Las combinaciones de baclofeno-torasemida son eficaces, en todas las dosis ensayadas, en la mejora significativa del tiempo de latencia de la señal cuando se compara con animales tratados con vehículo, y esto tan pronto como el séptimo día desde la lesión del nervio (figura 29, A). Se observa todavía una diferencia significativa el día 30 desde el aplastamiento de nervios, cuando normalmente se observa el comienzo de una recuperación espontánea.
También se observa una mejora estadísticamente significativa en la amplitud de la señal para la dosis 3 el día 30 desde el aplastamiento de nervios (figura 29, B). Dicha mejora también se observa, pero en una extensión menor, para las dosis 1 y 2. Se observan resultados similares cuando se mide la duración de la señal.
Todos juntos, estos resultados in vivo muestran la eficacia de la combinación de baclofeno-torasemida en promover la regeneración de nervios a través de la remielinización y reinervación muscular. Por lo tanto, los datos experimentales in vivo confirman los efectos neurotróficos de baclofeno-torasemida observados in vitro y su utilidad en corregir neuropatías donde los nervios del sistema nervioso periférico se dañan (es decir, neuropatías como se define en la memoria descriptiva), y también lesión de la médula espinal.
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Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende al menos torasemida y baclofeno, o sus sales o formulaciones de liberación sostenida, para usar para promover la regeneración de nervios o neuronas en un sujeto que padece una lesión nerviosa seleccionada de neuropraxia, axonotmesis o neurotmesis, o una neuropatía causada por lesión nerviosa física directa, o de Charcot-Marie-Tooth.
2. La composición para usar de la reivindicación 1, que además comprende al menos un compuesto seleccionado de sulfisoxazol, metimazol, prilocaína, difilina, quinacrina, carbenoxolona, acamprosato, ácido aminocaproico, cabergolina, dietilcarbamazina, cinacalcet, cinarizina, eplerenona, fenoldopam, leflunomida, levosimendán, sulodexida, terbinafina, zonisamida, etomidato, fenformins, trimetazidins, mexiletina, ifenprodil, moxifloxacino o bromocriptina, o sus sales o formulaciones de liberación sostenida.
3. La composición para usar de la reivindicación 2, que comprende al menos una de las siguientes combinaciones de compuestos:
- baclofeno y trimetazidina y torasemida,
- baclofeno y cinacalcet y torasemida,
- baclofeno y acamprosato y torasemida,
- baclofeno y acamprosato y torasemida y dietilcarbamazina, o
- baclofeno y acamprosato y torasemida e ifenprodil,
o sus sales o formulaciones de liberación sostenida.
4. La composición para usar según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
5. La composición para usar según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los compuestos en dicha composición se formulan para ser administrados juntos, separados o de forma secuencial.
6. La composición para usar según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende menos de 4 mg de torasemida.
7. La composición para usar según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende menos de 150 mg de baclofeno, preferiblemente menos de 50 mg.
8. Torasemida, o una de sus sales o formulaciones de liberación sostenida, en combinación con baclofeno, o una de sus sales o formulaciones de liberación sostenida, para usar en promover la regeneración de nervios o neuronas en un sujeto que padece una lesión nerviosa seleccionada de neuropraxia, axonotmesis o neurotmesis, o de una neuropatía causada por lesión nerviosa física directa, o de Charcot-Marie-Tooth.
9. Torasemida, o una de sus sales o formulaciones de liberación sostenida, en combinación con baclofeno, o una de sus sales o formulaciones de liberación sostenida, para usar de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dichos compuestos se formulan para una administración simultánea, separada o secuencial.
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