KR100500584B1

KR100500584B1 - 신경성장인자와 유사 작용을 갖는 육종용 추출물 및 이를함유하는 조성물

Info

Publication number: KR100500584B1
Application number: KR10-2002-0047412A
Authority: KR
Inventors: 김선여; 허진영; 정선경
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2002-08-12
Filing date: 2002-08-12
Publication date: 2005-07-12
Also published as: JP2005538131A; CN1649608A; JP4304505B2; CN100348218C; US20040219233A1; KR20040014757A; AU2003251198A1; WO2004014410A1; US20070178174A1

Abstract

본 발명은 신경세포 성장을 증가시키고, 다양한 원인에 의해 신경세포가 사멸되는 것을 억제하고, 손상된 신경세포를 재생시킬 수 있는 신경성장인자(Nerve growth factor, NGF)와 유사작용을 가지는 육종용(Cistanche deserticola Y.C.MA)의 조추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용추출물을 함유하여 신경세포 보호와 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적이고 안전한 의약품 및 건강보조식품을 제공한다.

Description

신경성장인자와 유사 작용을 갖는 육종용 추출물 및 이를 함유하는 조성물{Composition comprising the extract of Cistanche deserticola Y.C.MA showing enhancing activity of the neurite outgrowth and neurotrophic effects}

본 발명은 퇴행성 뇌질환 치료 및 예방을 위한 신경성장인자 유사작용을 갖는 육종용 추출물에 관한 것이다.

20세기에 들어서며 생명 과학 및 의학의 급속한 발전으로 인간의 평균 수명이 늘어나며 장노년 인구의 비중이 커져서 새로운 사회적 문제들이 부각되고 있으며, 특히 노인성 신경계 질환들, 즉 뇌졸중(stroke), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨스씨병(Parkinson's disease, PD) 등은 치명적인 신경계의 기능장애로 나타나고 있다.

신경계에서 신경세포의 성장(growth), 분화(differentiation) 및 사멸 (cell death)은 각기 정상적인 발생과 조직의 고유한 기능 확립 및 항상성 유지에 중요한 조절과정이다. 신경세포의 사멸은 두가지 형태인 신경세포사멸(apoptosis)과 세포괴사(necrosis)가 있는데, 신경괴사는 세포내 이온들의 급격한 불균형을 유도하는 손상에 의하여 일어나며 세포질과 미토콘드리아의 팽창 그리고 세포질의 용해 후 핵막의 파괴에 의해 유도되는데, 국소 빈혈(ischemic), 체온저하(hypothermia), 뇌졸증, 물리적 또는 화학적 외상과 같은 갑작스러운 상해에 의해 세포가 죽는 급성사멸을 말하는 것으로서(Tomei et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, pp853-857, 1993), 단백질 합성억제제에 의하여 영향을 받지 않으며 신경계에 일어나는 대표적인 예는 신경세포가 이온성 글루탐산 수용체의 활성화에 의해 손상을 입을 때 나타난다. 세포사멸(apoptosis)은 예정화된 세포사멸이라고도 하는데 특징적 형태는 세포 크기의 축소(cell shrinkage), 세포막 팽창(membrane blebbing), 세포골격의 붕괴와 같은 막의 변화와 염색질응축 등과 같은 핵의 변화를 수반한다(Kerr J. F., J. Pathol., 107(3), pp217-219, 1972 : Arends M. J. & Morris R. G., Am. J. Pathol., 136(3), pp593-608, 1990). 미토콘드리아 기능의 상실과 함께 세포는 막으로 둘러싸인 소구조인 세포사멸체 (apoptotic body)을 형성하게 되는데, 형성된 세포사멸체는 동물모델에서 이웃하는 세포나 대식세포에 의해 식균(phagocytosis)되어 완전히 제거됨으로써 세포질 내용물의 유출로 인한 염증 반응없이 조직에서 제거된다.

다세포 생물에서 세포의 성장·분화 및 이동 등의 모든 행동은 세포 밖에 존재하는 조절요인에 의해 조절된다. 신경세포 또한 이러한 조절요인이 필요한데 이것이 신경조절인자이며, 표적세포에서 유리되어 중추신경(Central Nervous System, CNS)과 말초신경(Pheriperal Nervous System. PNS)에서 뉴론의 성장 분화 생존에 영향을 미치는 단백질을 모두 신경성장인자들이라 한다. 다섯 가지의 관련된 인자들이 있는데 신경성장인자(NGF; nerve growth factor), 뇌 유래 신경성장인자 BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), 신경인자 NT-3(Neurotrophin-3), NT-4, NT-5 등이 있으며, 이러한 신경인자들은 각각 합성되는 곳이나 분화, 발현되는 양상이 다르고 표적장소가 다르나 각각을 구성하는 아민산 배열은 종간에 매우 유사하다. 신경인자는 신경계에서는 신경세포사멸을 억제하는데 신경세포사멸은 신경인자의 결핍상태에 접할 때 일어나며, 대부분 새로운 단백질의 합성(cell death related genes)에 의존하는 세포사멸의 한 형태이다. 신경인자들이 신경계의 발생동안 일어나는 신경세포의 예정사를 억제한다는 것은 이미 잘 규명되어 있다.

이러한 기능을 하는 신경인자들 중 신경성장인자(NGF)는 레비몬탈치니(Levi- Montalcini)가 1950년 초기에 뱀독이나 마우스육종에서 분리하였는데, 이 추출액 속에서 병아리 교감신경절 뉴론의 조직배양을 하면 뉴론 축색의 성장이 수배나 촉진된다는 보고를 하였다(Levi-Montalcini R., Birth Defects Orig Artic Ser, 19(4), pp3-22, 1983). 과거에 신경성장인자는 뉴론의 분열을 촉진하는 것으로 생각되었는데 현재 알려진 바에 의하면, 그보다 뉴론의 퇴화 사멸을 억제함으로써 뉴론의 수적 감소를 방지하고 있다. 이 신경성장인자의 수용체는 후근 지각 신경절, 뇌, 교감신경지배장기에 존재하며, 생체내에서 심장과 같은 교감신경 지배장기에서는 신경성장인자를 생합성하고 이것이 신경종말에서 흡수되고 축색에서 역방향으로 수송되어 뉴론 세포에 도달하면 이곳에서 단백질 합성을 촉진한다고 보고되어진다(Mahalik T. J., Investig Dermatol Symp Proc., Aug;2(1), pp14-18, 1997).

중추신경계에서 NGF는 신경세포의 손상에 대하여 보호기능을 한다고 하는 많은 보고 등이 있는데, 예를 들면 핌브리아-포닉스(Fimbria-fornix)의 절삭 (Cholinergic 축삭돌기 절삭, Choliergic axotomy)은 전뇌 기저의 콜린성 신경세포로부터 해마까지의 콜린성 첨가를 막는데, 이로 인하여 콜린성 신경세포는 서서히 퇴화하게 되며, 절삭후 신경성장인자를 넣어주면 콜린성 신경세포의 퇴화는 거의 완전히 억제되며 고농도의 뇌세포 유래 성장인자(BDNF)를 투여하면 콜린성 적삭에 대하여 신경성장인자와 비슷한 효과를 얻을 수 있다(Hefti F.J., Neurosci, Aug;6(8), pp2155-2162, 1986). 또한 신경성장인자와 말초신경과의 관계를 살펴보면, 성숙한 동물에서 신경성장인자의 역할은 아직 명확히 규명되지는 않았으나, 최근 보고에 의하면 신경성장인자의 항체를 주입하면 교감신경절의 파괴가 일어나고 노르에피네프린을 합성하는 효소인 타이로신 하이드록실라아제와 도파민 베타-하이드록실라아제의 활성도 역시 감소한다고 한다(Levi-Montalcinin et al.; Bull. Soc. Sci. Med Grand Duche Luxemb, 115(2), pp69-74, 1978). 한편, 외부로부터 신경성장인자를 주입해주면 NGF에 민감한 신경의 생존이 증가하고 해당조직에 대한 신경지배정도가 증가하는데 외부에서 주입한 신경성장인자가 말초신경손상 후 발생학적 변화를 약화시킨다는 보고(Zettler C, Head R.J., Rush R.A., Brain Res., 538(2), pp251-262, 1991)에 의하면, 신경성장인자는 신경손상 후 신경 재생과정에 중요한 역할을 할 것으로 여겨지고 있다. 이와 같은 결과들은 조직의 신경성장인자와 교감신경의 지배정도가 상호 밀접한 관계가 있음을 보여준 보고라 할 수 있다.

신경계의 정상적인 발생 과정상의 발생중인 뉴론의 약 50%는 세포사멸에 의해 제거되며(Barres BA, Schmid R, Sendnter M, Raff MC., Development, 118(1), pp283-95, 1993), 표적 세포에 의해 분비되는 신경인자들이 뉴론의 생존을 결정한다고 알려져 있다. 신경세포가 정상상태에서 생존·성장·분화하기 위해서는 신경성장인자와 같은 성장인자들이 필수적으로 요구된다고 할 수 있다. 그러나 이러한 신경성장인자는 분자량의 크기 때문에 뇌에서의 BBB(Blood brain barrier)를 통과하지 못한다. 그래서 퇴행성 뇌질환에 있어서 치료효과를 보기가 어렵게 되어 있다. 이에 내생하는 신경성장인자의 합성을 더욱 유도해야 하며 나아가서는 신경성장인자와 같은 역할을 하는 물질의 개발이 시급한 실정이다.

본 발명에서 사용된 열당과(列當科, Orobanchaceae) 식물의 육종용 (Cistanche deserticola Y.C.MA)은 다년생 기생초본(寄生草本)으로서 알칼리성의 토지, 건천(乾川), 사지(砂地)에서 자라며, 신을 보하고 정을 보익하며 조한 것을 촉촉하게 하고 양을 활하게 한다고 하여 예로부터 자양강장제의 의미로 상용되어온 한약재이다. 효소, 지방 및 성분 미량의 알칼로이드와 결정성의 중성물질을 함유하고 있고(정 보섭 및 신 민교; 향약대사전, 영림사, pp888~889, 1998), 일본에서 시스타노사이드(cistanoside), 시스타노사이드 F, 투불로사이드 A(tubuloside A), 투불로사이드 B, 2’-아세틸아세토사이드(acetylacetoside), 에치나코사이드 (echinacoside), 3’-α-람노피라노사이드(rhamnopyranoside), 이소아세테오사이드 (isoacteoside), 아세토사이드(acetoside), 시린갈리드 A(syringalide A) 성분이 분리되었다.

약리작용으로는 혈압강하작용, 통변작용, 강장(强壯)작용 및 타액분비 와 호흡마비를 촉진하는 작용이 있으며, 최근 논문에 의하면 항산화 작용과 노화방지 작용이 있다고 보고되고 있으나, 뇌질환에 대한 치료효과의 효능은 전혀 알려진 바 없다.

본 발명에서는 여러 생화학적인 실험을 통해 육종용의 신경세포의 성장 분화에 대한 영향을 알아보고, 또한 육종용 조추출물 및 비극성용매 가용추출물이 퇴행성 뇌질환의 가장 큰 원인인 세포사멸을 억제하는데 중요한 성장인자의 역할을 하는가 여부와 신경성장인자를 유도 유무를 알아보기 위하여 세포주 배양을 통한 미세 관찰과 더불어 분자생물학적인 실험을 통하여 실시하였다.

연구 결과, 본 발명에 따른 육종용 조추출물 및 비극성용매 가용추출물이 신경세포사멸을 저해하고 신경인자의 합성을 증가시킴으로서 신경세포보호 활성을 갖는다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신경세포를 보호하고 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적인 육종용 조추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용추출물을 함유한 약학조성물 및 건강보조식품을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적인 육종용(Cistanche deserticola Y.C.MA)의 조추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 육종용 조추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조추출물은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 극성용매에 가용한 추출물을 의미한다.

추가적으로, 본 발명은 육종용의 극성용매 또는 비극성용매 가용추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 추출물을 제공한다.

상기 극성용매 가용추출물은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 부탄올에 가용된 추출물이고, 비극성용매 가용추출물은 에틸아세테이트, 헥산과 같은 비극성 용매, 바람직하게는 에틸아세테이트로부터 선택되어진 용매에 가용된 추출물을 의미한다.

본 발명의 육종용으로부터 조추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용추출물을 분리하는 방법은 하기와 같다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 육종용의 추출물은 건조된 육종용 무게(㎏)의 약 5배 내지 20배, 바람직하게는 약 10배 내지 15배의 물, 저급 알콜 또는 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:5의 혼합비(㎏/ℓ)를 갖는 이들의 혼합용매로 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 30℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 1일 동안 초음파 추출 등의 추출방법에 의하여 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매에 따른 가용추출물인 조추출물을 추출, 감압농축 및 동결건조하여 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 추출공정에서 얻어지는 조추출물들을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 유효성분이 정제된 극성용매 및 비극성용매 가용추출물은 상기 조추출물을 물에 현탁한 후, 이를 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 비극성 용매를 가하여 수층과 비극성용매 가용층을 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 분획하여 수득할 수 있으며, 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. 3rd Ed. pp6-7, 1998).

이하 구체적으로 육종용 극성용매 및 비극성용매 가용추출물의 분리공정을 설명하면,

예를 들어 육종용을 분쇄하고 물, 메탄올 또는 부탄올과 같은 극성용매로 초음파추출한 후에 여과하고, 감압농축 및 동결건조하여 극성용매에 가용한 조추출물을 얻는 제 1단계;

상기의 조추출물을 물에 현탁하여 순차적으로 클로르포름, 에틸아세테이트와 같은 비극성용매로 녹여 현탁시킨 후, 분액깔대기로 분획 및 여과하여 에틸아세테이트 가용추출물을 얻는 제 2단계;

이어서 순차적으로 수층을 부탄올, 물 등과 같은 극성 용매를 사용하여 분획 및 여과하고, 부탄올 가용추출물 및 물 가용추출물을 얻는 제 3단계;

상기의 에틸아세테이트 가용추출물, 부탄올 가용추출물 및 물 가용추출물을 감압농축하여 건조하는 제 4단계로 구성된 분리공정을 포함한다.

본 발명은 상기 제법으로 얻어지고 퇴행성 뇌질환 치료에 효과적인 조추출물 및 비극성용매 가용추출물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 추출물을 유효성분으로 함유하고, 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료에 효과적인 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 조추출물 및 비극성용매 가용추출물을 0.1 ~ 20 중량%로 포함한다.

상기에 있어서, 퇴행성 뇌질환은 뇌졸증, 파킨슨, 노인성 치매 또는 알쯔하이머인 신경계 질환 치료용 조성물을 의미한다.

본 발명의 육종용 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 구척 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 5 내지 500mg/㎏의 양, 바람직하게는 100 내지 250 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방효과를 나타내는 육종용의 조추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품을 제공한다.

또한, 퇴행성 뇌질환의 예방효과를 나타내는 육종용의 극성용매 또는 비극성용매 가용추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품을 제공한다.

본 발명의 추출물들을 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 육종용의 조추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 육종용 조추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 추출물은 퇴행성 뇌질환의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 1. 육종용 조추출물의 제조방법

경희대학교 한의과대학 본초학교실의 검증을 받은 건조상태의 육종용(정도물산) 8㎏을 정선하여 세절한 후, 3000㎖ 비이커에 1㎏씩 넣고 85% 메탄올(물:메탄올 = 15:85) 1500㎖를 가하여 하루동안 냉침한 후, 1시간 동안 초음파 추출(Branson사, 미국)하고 상층액을 여과지(Whatman사)로 여과하여 육종용의 찌꺼기를 제거하였다. 초음파 추출을 1회 더 반복하여, 전체적으로 얻은 추출액을 여과지에 거른후 감압농축하였다. 2번 추출한 육종용은 85% 메탄올에 1일 더 냉침한 후 초음파 추출하여 감압 농축하였고, 나머지 7kg도 상기의 방법으로 수행하였으며 동결건조기(Speed Spec 3000, BioRad사, 미국)를 사용하여 하기 표 1과 같은 건조분말 3.7㎏을 얻어 시료로 사용하였다.

실험에 사용된 육종용

약물	생약명	학명	수율(%)
육종용	Cistanche herba	Cistanche deserticola	45.5%

실시예 2. 육종용의 극성용매 및 비극성용매 가용추출물의 제조방법

상기 실시예 1의 육종용 건조 추출물 500g을 300㎖의 물에 현탁한 후, 에틸아세테이트 3ℓ를 가하여, 분액깔대기에 넣고 에틸아세테이트 불용성층(하층)과 에틸아세테이트 가용성층(상층)으로 분획하여 에틸아세테이트 가용부를 수집하였다. 하층(물층)과 동일한 부피의 에틸아세테이트 용매를 상기한 방법과 동일한 방법으로 5회 반복하여 용액의 색이 옅어질 때까지 최대한 에틸아세테이트층에 용해가 가능한 물질을 얻어낸 후, 동결건조하여 건조상태의 육종용의 비극성용매 가용추출물을 수득하여 육종용의 에틸아세테이트 추출물 8.2g을 수득하였으며, 시료로 사용하였으며, 이때 얻어진 물 가용추출물층은 다시 순차적으로 부탄올과 물을 가하여 분획하여, 부탄올 추출물 11.83g, 물 추출물 26g을 얻었으며, 육종용의 극성용매 가용추출물 시료로 사용하였다.

참조예 1. 육종용의 시료제조

실시예 1 및 실시예 2의 육종용 조추출물과 에틸아세테이트 가용추출물을 각각 PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.2) 완충용액에 용해시켜 최종농도가 1.0 ㎎/㎖ 이 되도록 한 후, 1회용 주사기를 이용한 막여과지(0.2 ㎛, millipore)를 이용하여 무균상태로 제조하였다. 시료가 PBS 완충용액에 완전히 용해되지 않을 경우, 디메틸술폭시드(DMSO, dimethyl sulforoxide, Sigma사, 미국)에 녹여 DMSO의 최종농도가 0.1% 이하가 되도록 맞춘 후 무균조작으로 제조하였다.

참조예 2. 세포주 배양

직경이 100 mm되는 배양용기(TPP, Switserland)에 PC12 세포주를 3×10⁴이 되게 처리한 후, 2.0g/ℓ의 탄산수소나트륨(NaHCO_3,sodium bicarbonate), 5% 말혈청(HS), 10% 소태아혈청(FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신 항생제(10000 U/㎖) 1%가 포함된 RPMI 1640 배지(Gibco BRL, USA)를 사용하여 배양하였으며, 사용한 소태아혈청은 사용하기전 55℃에서 30분간 열비활성시켜 사용하였고, 70% 습도와 37℃ 온도를 유지하여 공기(95%)와 이산화탄소(5%)의 혼합기체를 계속 공급하면서 세포를 배양하였다. 배지는 10 ㎖씩 주 4회 교체해 주었고, 주 3~4회 계대 배양하였다.

참조예 3. 육종용 시료의 처리

1×10⁷ 세포/웰의 농도로 100 ㎜ 배양용기에 부착된 세포들을 0.25 % 트립신(Tripsin)-EDTA(Gibco BRL사, 미국) 용액 500 ㎕를 처리하여 세포들을 배양용기로부터 이탈시킨 후, 10 ㎖의 신선한 배지로 트립신-EDTA용액을 중화시키고 세포현탁액을 만들었다. 세포현탁액 20 ㎕에 PBS 완충용액에 녹인 0.4 % 트립판 블루(Trypan blue) 10 ㎕을 가하여 염색한 후, 세포수 측정기를 이용하여 살아있는 세포수를 계산하였다. 세포부착효소인 폴리-디-라이신(Poly-D-lysine, Sigma사)을 50 ㎍/㎖로 PBS 완충용액 희석한 다음, 6 웰 세포 배양 접시에 2 ㎖씩 첨가하여 37 ℃에서 1시간 이상 방치하였다. 1시간 후 PBS 완충용액(pH 7.2)로 세척한 다음 건조된 6 웰 세포배양 접시를 사용하였고, 1×10⁵ 세포/웰의 농도로 세포를 희석한 후, 배양용기에 접종하여 배양하였다. 접종한 지 24시간 후에, 실시예 1의 육종용 조추출물은 최종농도가 각각 10 ㎍/㎖로, 신경성장인자(NGF)는 50 ng/㎖으로 처리하였으며, 5% 이산화탄소와 95% 산소의 혼합 공기하에서 온도와 습도가 일정하게 유지되는 배양기에서 6일 동안 배양하면서 관찰하였고 2일에 한번씩 새로운 배지로 교체하였다.

실험예 1. 육종용 조추출물의 생리활성 검정

육종용 조추출물의 생리활성을 검정하기 위하여, 실시예 1의 육종용 조추출물 10㎍/㎖을 PC12 세포(세포주 은행, 서울대학교 암센터)에 처리한 결과, 2일 후에 신경세포돌기가 형성되기 시작하였고 6일이 지나면 대부분의 세포에서 신경축색돌기 성장(neurite outgrowth)이 일어나 신경원 유사세포로 분화되었다(도 1a, 도 1b, 도 3, 도 4a, 도 4b, 도 4c, 도 4d 참조). 신경성장인자(NGF)를 농도별로 처리하여 가장 효과가 높은 농도로 결정하고(도 2a 내지 2e 참조), 신경축색돌기 증강여부를 판단하는 대조군으로 사용하였다.

육종용의 조추출물 및 에틸아세테이트 가용추출물을 PC12 세포에 처리한 후, 신경축색돌기성장 효과를 검색한 결과, 육종용의 에틸아세테이트 가용추출물이 가장 높은 신경축색돌기성장을 나타냈다(도 3, 도 4a, 도 4b, 도4c, 도 4d 참조).

실험예 2. 육종용 분획물에 의한 신경축색돌기성장 측정

참조예 3에서 시료를 처리한 지 24시간 후에, 신경성장인자(NGF) 50 ng/㎖, 1 % 우태아혈청(FBS) 및 2 % 말혈청(HS)이 첨가된 신선한 배지로 교체하였다. 24시간이 지난후부터 매일 일정한 시간에 위상차 현미경(CK-25, 올림푸스사, 미국)을 이용하여 세포체로부터 뻗은 신경축색돌기를 관찰하였고 현미경 사진을 찍은 후에 사진상에서 그 길이를 측정하였다. 신경축색돌기가 보이지 않으면 0으로, 세포중심체와 길이가 같으면 1로, 세포중심체 지름의 2배 길이로 성장하면 2로 정하고, 그 이상의 길이가 되면 3으로 수치화하였다(도 4a, 4b, 4c, 4d 참조). 이때 대조군은 신경성장인자 50 ng/㎖을 처리한 군으로 대조하였고, 측정값은 평균±표준편차이며, 각 군에 대한 자료값은 대조군과 각 시료군을 비교하여 스튜던트 t-검정법으로 분석하였다(**p<0.01;도 3 및 표 2 참조). 각각의 추출물을 PC12 세포주에 10 ㎍/㎖이 되게 처리하고, 신경축색돌기의 측정은 대조군 대 비율로 나타내었으며, 대조군은 신경성장인자(NGF) 50 ng/㎖ 처리기준으로 하였다. -표시는 효과가 없음을 나타내고 육종용은 대조군과 비교하여 우수한 신경축색돌기성장효과를 보였다(*p<0.01).

육종용 추출물이 PC12 세포의 신경축색돌기성장에 미치는 영향

시료	신경축색돌기의 비율(% of 대조군)
대조군	100%
NGF	133±0.21
육종용 조추출물	132±0.27%

실험예 3. 육종용의 세포자연사멸 검정

육종용의 에틸아세테이트 가용추출물과 신경성장인자(NGF)가 각각 처리된 세포를 매일 일정한 시간에 현미경 관찰을 하였으며, 또한 우태아혈청고갈 배지하에서 신경성장인자(NGF)와 육종용 에틸아세테이트 가용추출물을 각각 처리한 후의 세포의 변화를 관찰하였다. 6일간 배양한 후에 새로운 배지로 교체하여 신경성장인자(NGF)와 각각 육종용 추출물을 제거하고 24시간이 지난 후에 세포의 형태학적 변화 및 수반되는 세포자연사멸의 특징을 관찰하였다. 그 결과 우태아혈청 고갈 배지에서 세포는 세포자연사멸의 지표인 데옥시뉴클레오타이드(DNA)의 단편화가 일어났음을 확인하였으며, 이것으로 세포자연사멸이 일어나고 있다는 것을 검증하였다.

실험예 4. 육종용의 LDH 검정

육종용의 세포자연사멸(apoptosis)정도를 알아보기위해 LDH(lactate dehydrogenase)효소 저해효과를 실험하였다.

신경성장인자가 없는 조건에서 세포를 배양하여 배양액으로 유리된 LDH를 측정하기 위하여 육종용 에틸아세테이트 가용추출물을 PC12 세포에 6일 동안 처리한 후, 배지 30 ㎕을 취하여 96 웰 배양접시에 옮겼다. 실험군으로는 육종용의 에틸아세테이트 가용추출물 시료를 처리하고 6일 동안 배양한 후에 새로운 배지로 교체하고 24시간 추가 배양한 상층배지를 30 ㎕를 취하여 96 웰 배양접시에 옮겼다. LDH 검정을 실시하기 위하여 96 웰 배양접시에 NADH 1.0 ㎎을 0.75 소듐 피루베이트(sodium pyruvate) 1 ㎖에 녹여 만든 용액 30 ㎕을 넣고, 37 ℃ 인큐베이터에서 30분간 반응시킨 후, 발색시약 30 ㎕을 첨가하고 37 ℃에서 20분간 추가 반응시켰다. 반응액에 0.4N 수산화나트륨을 100㎕를 가하여 반응을 멈춘 뒤, 5분 후에 405 ㎚ 파장에서 UV 흡광도를 측정하였다.

실험 결과, 육종용 에틸아세테이트 가용추출물을 제거한 군에서 세포자연사멸로 인해서 LDH 량이 감소함을 알 수 있었다(도 5 참조).

실험예 5. 육종용의 MTT 검정

상기 실험예 3과 마찬가지로 육종용의 세포자연사멸 정도를 알아보기 위해 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 티아졸일 블루) 시험법으로 측정하였다.

신경성장인자(NGF)가 없는 조건 하에서 세포 생존율을 측정하기 위하여 96 웰 배양접시에 PC12 세포를 2×10⁴ 세포/웰의 농도로 접종하였으며, 24시간 배양 후, 육종용 에틸아세테이트 가용추출물을 처리하고 2일후에 배지를 제거하고 최종 농도가 0.05 ㎎/㎖이 되게 MTT(Sigma사)를 배지에 녹여서 150 ㎕을 처리하고 37 ℃ 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 4시간 후에 MTT를 제거하고 각 웰에 DMSO 150 ㎕씩을 첨가하여 결정을 용해시켰다. 마이크로 플레이트 리더 즉 ELISA 리더(Molecular devices사, 미국)를 이용하여 570 ㎚의 파장에서 UV 흡광도를 측정함으로써 세포 생존율을 측정하였다.

실험 결과, 육종용 에틸아세테이트 가용추출물을 처리한 후 제거한 군에서 생존률이 감소함을 확인할 수 있었으며, 결국 육종용의 에틸아세테이트 가용추출물을 제거한 세포에서 세포자연사멸이 뚜렷하게 증강됨을 확인하였다(도 5 참조).

실험예 6. 육종용의 세포자연사멸 검정

육종용의 에틸아세테이트 가용추출물을 제거하였을 때, 세포자연사멸이 일어나는지 알아보기 위하여 데옥시뉴클레오타이드 단편화(DNA fragmentation)을 실시하였다.

세포자연사멸이 일어나면 DNA의 단편화가 발생하게 되므로, 세포자연사멸 유발을 분자생물학적으로 확인하기 위해서 윌리 및 모리스 방법을 이용하여 DNA의 단편화를 확인하였다. 세포의 농도가 2.5∼5×10⁶ 세포/웰의 농도로 희석하여 100 ㎜ 세포배양용기에 접종하고 24시간 배양하였으며, 배지를 제거하고 PBS 완충용액으로 세척한 후, 배지를 각각 10 ㎖씩 가하고, 일정 농도의 시료가 처리된 배양용기를 흔들어 준 후 37 ℃가 유지되는 5 % 이산화탄소와 95 % 산소가 혼합된 배양기에서 6일 동안 배양하며, 2일에 한번씩 시료가 처리된 신선한 배지로 교체하였다. 0.25%의 트립신-EDTA를 1㎖씩 가해서 세포를 이탈시켜 수집된 세포액과 혼합하여 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세포 침전물에 500 ㎕의 용해완충용액(lysis buffer) (5 mmol/ℓ Tris-HCl (pH 7.4), 5 mmol/ℓ EDTA, 0.5 % Triton X-100)를 첨가하고 다시 부유시킨 후, 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 15분간 방치하고 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후, RNA 분해효소(RNase)를 1.0 ㎕를 상층액에 넣어주고, 37 ℃에서 1시간 배양하였다. 이어 단백질 분해효소(proteinase)를 1㎕ 가하고 SDS(bio-rad)를 최종농도가 1%가 되도록 가한 후 50 ℃에서 2시간 배양하고, 동량의 페놀-클로로포름을 넣고 15초 이상 혼합한 후 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 1/10 부피의 3M 소듐아세테이트를 넣어주고 2배 부피의 에탄올을 첨가하고 상온에서 30분 동안 정치한 후, 12,000 rpm, 4 ℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고 완전히 건조시킨 후, 20㎕ TAE 완충용액을 가하여 침전물을 녹였다. 분리된 DNA의 단편을 확인하기 위해서 1×TAE 완충용액을 사용하여 아가로오즈 젤(Gibco BRL, USA)을 만들어 전기영동을 실시하였다. 분리된 DNA 10㎕를 염색약과 혼합하여 분주한 후, 100 볼트에서 40분 동안 전기영동을 수행하고, 전기영동된 젤 Gel-DOC(gel doc 2000, Bio-Rad사, 미국)을 이용하여 단편화정도를 측정하였다.

실험 결과, 도 6a의 1은 신경성장인자(NGF) 50 ng/㎖를 처리한 것, 2는 육종용 조추출물 10㎍/㎖을 처리한 것, 3은 육종용 에틸아세테이트 가용추출물 10㎍/㎖을 처리한 것, 4는 우태아혈청을 제거한 것으로서, 육종용의 조추출물 및 에틸아세테이트 가용추출물을 처리한 후 제거한 세포의 경우에는 DNA의 단편화가 일어나서 세포자연사멸을 알 수가 있었고(도 6a 참조), 세포자연사멸이 일어난다고 보고되는 우태아혈청 제거 후, 도 6b의 1은 신경성장인자(NGF) 50 ng/㎖를 처리한 것, 2는 육종용 조추출물 10㎍/㎖을 처리한 것, 3은 육종용 에틸아세테이트 가용추출물 10㎍/㎖을 처리한 것, 4는 우태아혈청을 첨가한 것으로서, 육종용 조추출물 및 에틸아세테이트 가용추출물을 처리하였을 경우, DNA 단편화가 일어나지 않았다(도 6b 참조).

결국 육종용 조추출물 및 에틸아세테이트 가용추출물을 제거한 군에서는 단편화 현상이 일어남을 관찰할 수 있었고, 우태아혈청 제거후 육종용 조추출물 및 에틸아세테이트 가용추출물을 처리한 경우에는 DNA의 단편화가 일어나지 않은 것을 확인할 수 있었으므로, 이는 육종용의 조추출물 및 에틸아세테이트 가용추출물이 세포자연사멸을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7. 육종용의 형광활성세포분석

육종용이 세포자연사멸에 미치는 영향을 정량화하기 위하여 형광활성세포수집기(FACS)를 이용하여 분석하였다.

PC12 세포를 완전배지에서 배양한지 24시간이 지난 후, 말혈청 2 %, 우태아혈청 1%가 함유된 혈청고갈배지로 교체하고, 배지를 교체하면서 신경성장인자(NGF)와 육종용 에틸아세테이트 가용추출물을 각각 처리하였다. 24시간 배양한 후 부유액이 포함된 세포현탁액을 200g에서 5분동안 원심분리하고, 상층액이 제거된 세포에 100 ㎕의 형광을 내는 염료로서 아넥신(Annexin) V-FITC(바이오라드, USA)을 사용하였으며, 이것을 완충용액인 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼륨, 1 mM 염화마그네슘, 1.8 mM 염화칼슘에 가하여 녹인 후, 호일에 싸서 상온에서 5분 동안 배양하였고, 이때 100㎕의 HEPES 완충용액을 FACS용 소튜브에 넣어둔 후, 20㎕의 프로피디움 요오드(PI, Propidium Iodide)(100 ㎍/㎖ in HEPES buffer)를 첨가하고 분석을 실시하였다.

PI는 일종의 DNA 결합 염료로서, 각각의 세포에 대한 DNA 결합이나 양을 측정할 수 있게 하며, 세포자연사멸이 일어나면, PI는 DNA와 결합하게 된다.

결과적으로 세포자연사멸의 유도정도를 정량화하기 위하여 FACS 분석을 실시하였는데, 세포자연사멸이 일어나면 그래프상 왼쪽 하위부분으로 세포가 이동하게 된다. 즉, 육종용 에틸아세테이트 가용추출물을 배양액에서 제거하면 세포자멸이 일어남을 알 수 있으며, 세포의 수가 시간이 지날수록 하위 오른쪽으로 이동하는 것을 나타낸다. 하위 왼쪽은 살아있는 생존 세포를 나타내며, 하위 오른쪽은 세포자연사멸을 나타내고, 상위오른쪽은 세포사(necrosis)를 나타낸다. 이것으로 육종용의 에틸아세테이트 분획물과 신경성장인자(NGF)를 제거한 지 4시간 후부터 세포자연사멸이 일어나기 시작했으며, 12시간 이후에는 가장 많이 일어났고, 12시간이 지난 후에는 세포사가 유도됨을 확인할 수 있었다(도 7a, 7b, 7c, 7d 참조).

실험예 8. 육종용의 세포자연사멸(apoptosis) 방어 검색

육종용의 세포자연사멸의 방어를 검색하기 위하여, PC12 세포를 완전배지에서 배양한 후 혈청과 신경성장인자가 첨가되지 않은 배지로 교체하고, 세포를 24시간 추가 배양함으로써 세포자연사멸을 유도하였다. 육종용 에틸아세테이트 분획물이 혈청고갈로 유도된 PC12 세포의 사멸을 방어하는지를 알아보기 위해서 무혈청배지 하에 12시간 배양한 후 육종용 에틸아세테이트 가용추출물을 처리하여, 시간에 따른 세포의 형태적 변화를 관찰하고, DNA를 분리하여 단편을 확인하였고, FACS 분석으로 세포사멸 억제도를 확인하였다.(도 7a, 7b, 7c, 7d 참조)

실험예 9. 신경성장인자(NGF)의 유전자 발현(Gene Expression) 확인

역전사효소중합연쇄반응(RT-PCR)을 이용한 유전자 발현 확인

전체 세포의 리보뉴클레오타이드(RNA)는 트리졸 B(Trizol B)용액(Gibco BRL)을 이용하여 분리하였다. 1 ㎖의 트리졸 B 용액을 처리하여 세포를 용해시킨 후, 세포수집기를 이용하여 얻은 세포 용해물 1.5 ㎖을 소튜브에 옮긴 후 21G 주사기로 균질화시켰다. 세포 용해물을 4 ℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리를 행하여 얻은 상층액에 동량의 클로로포름을 첨가한 다음 15분 동안 상온에 방치한 후, 4 ℃, 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액, 즉 RNA층만 취하여 새로운 소튜브에 옮겨 동량의 100 % 이소프로판올을 혼합하고 15분 동안 상온에 방치한 후, 4℃, 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 얻은 리보뉴클레오티드 침전물에 75 % 에탄올 1.0 ㎖를 가해 세척하고, 4℃에서 12,000 rpm으로 5분 동안 원심분리 하였다. 10분간 상온에서 완전히 건조시킨 후, 100 ㎕의 DEPC(diethylpyrocabonate) 처리 증류수에 침전물을 녹인 후, 흡광도측정기 (Bio-Rad사, 미국)를 사용하여 UV 260 ㎚와 240 ㎚에서 측정하였다.

상보적인 데옥시뉴클레오타이드(cDNA) 합성은 역전사효소를 이용하고 중합연쇄반응은 Taq 중합효소(TaKaRa사, 일본)를 사용하였다. 1 ㎍의 상기 추출된 RNA를 65 ℃에서 15분 동안 처리하여 분리시킨 후, 반응용액 (4 ㎕ 5×완충용액, 1 ㎕ 10 mM dNTP (데옥시 뉴트레오티드) 혼합물, 1 ㎕ 20 μM 올리고(dT)₁₅ 프라이머, 0.2 ㎕ 200 U/㎕ M-㎖V 역전사 효소(Reverse transcriptase), 2 ㎕ 0.1 M 디티오쓰레이톨(dithiothreitol), DEPC 처리 증류수로 최종부피 20 ㎕로 제조)과 혼합한 후, 37 ℃ 60분, 72 ℃ 15분 동안 반응시켜 상보적인 데옥시뉴클레오타이드(cDNA)를 합성하였다. 중합연쇄반응 위에서 합성한 1 ㎕ cDNA를 반응액(10×완충용액 2.5 ㎕, 2.5 mM dNTP mixture 2 ㎕, 5 U/㎕ Taq 중합효소 0.2 ㎕, 10 μM 센스 프라이머 1 ㎕, 10 μM 안티센스 프라이머 1 ㎕, DEPC 처리 증류수로 최종부피 25 ㎕로 제조)과 혼합하여 하기의 표 3의 조건으로 중합연쇄반응기계(Perkin Elmer사, 미국)에서 반응시켰다. 신경성장인자(NGF) PCT 산물은 860 bp이고, 서열번호 1에 센스 프라이머, 서열번호 2에 안티센스 프라이머가 기재되어있으며, GAPDH PCR 산물은 307 bp이고, 서열번호 3에 센스 프라이머, 서열번호 4에 안티센스 프라이머가 기재되어있다.

중합연쇄반응 조건표

	95℃	3분	1 회
변성	95℃	30초	30 회
결합	62℃	30초
신장	72℃	1분
	72℃	7분	1 회

1.5 % 아가로오스젤(Gibco BRL, USA)에 10 ㎕의 역전사중합연쇄산물(RT-PCR product)을 전기영동으로 분석하였다. 전기영동은 100 볼트의 전압에서 30분 동안 수행하였고, 1×TAE 완충용액을 사용하였으며, 아가로오스젤은 브롬화 에티듐(ethidium bromide) 용액으로 20분간 염색을 한 후, 다시 3차 증류수에 10분간 탈염색하였고, 자외선을 조사하여 전기영동 결과를 관찰한 후, Gel-DOC을 사용하여 사진으로 제작하였으며(도 8a 참조), 이것을 수치화하여 그래프로 나타내었다(도 8b 참조).

비교유전자로는 250 염기쌍 크기를 갖는 GAPDH를 사용하였고, 이것을 기준으로 배양액만 처리한 것, 신경성장인자 50ng/㎖ 처리한 것, 육종용 조추출물 10㎍/㎖ 처리한 것, 육종용 에틸아세테이트 가용추출물 10㎍/㎖ 처리한 것을 비교하여 신경성장인자 유전자 발현량을 비교할 수가 있었고, 실제로 육종용 조추출물 및 에틸아세테이트 가용추출물이 신경성장인자(NGF) 수용체 발현량을 증가시킴을 확인할 수 있었다.

면역세포화학법(Immunocytochemistry)을 이용한 유전자발현 확인

육종용 조추출물 및 비극성용매 가용추출물이 신경성장인자(NGF) 수용체인 p75 수용체 발현량에 미치는 영향을 면역세포 화학법으로 검정하였다.

PC12 세포를 완전배지상태로 유리 커버슬립 (22 ㎜×22 ㎜)에서 배양하였고, 24시간이 지난 후, 육종용 에틸아세테이트 가용추출물 10 ㎕/㎖과 신경성장인자(NGF) 50 ng/㎖을 각각 처리하였다. 48시간이 지난 후 세포를 2% 고정액 파라포름알데히드(Phosphate buffer pH 7.4)로 실온에서 30분간 고정하고 PBS 완충용액으로 세척한 다음, 2% BSA (Bovine serum albumin)와 0.1% 트리톤 X-100 용액에 30분간 얼음위에서 반응시켜 비특이적 반응이 일어난 것을 제거하고 세포막의 투과성을 높여주었다. PBS 완충용액과 1% BSA 의 혼합용액으로 10분간 3회 세척하고 1차 항체 항-p75(1:2000 희석, 엘알에스랩)를 PBS 완충용액에 1시간 동안 반응시켰다. 다시 PBS 완충용액과 1 % BSA 혼합액으로 3회 세척한 후 텍사스-레드로 결합된 2차 항체 항-마우스 면역글로블린 G (Anti-mouse IgG, 위드랩(주) (1:5000 희석)로 1시간 동안 반응시킨 후 세척하여 형광현미경으로 수용체의 발현량을 관찰하였다.

실험 결과, NGF 첨가군과 육종용의 에틸아세테이트 가용추출물 처리군은 대조군보다 p75 수용체의 발현량이 증가됨을 확인할 수 있었다. 즉, 육종용의 에틸아세테이트 가용추출물 10㎍/㎖를 처리한 세포에서 신경성장인자(NGF) 수용체인 p75의 단백질 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다(도 9a, 도 9b 및 도 9c 참조).

이는 육종용 에틸아세테이트 가용추출물이 신경성장인자(NGF)의 합성을 증가시킴으로서 수용체의 발현량이 증가되어 이것이 PC12 세포의 성장 및 분화를 유도하는 것으로 추정할 수 있다. 또한 육종용 에틸아세테이트 가용추출물이 직접 수용체와 상호작용함으로서 신경성장인자(NGF)의 발현을 촉진시켰다고 볼 수 있다.

결과적으로 육종용 에틸아세테이트 가용추출물을 처리한 군에서 NGF 유전자의 발현량이 증가됨을 알 수 있었고(도 9a, 도 9b, 도 9c 참조), 이는 육종용 에틸아세테이트 가용추출물이 세포내의 NGF의 합성을 증가시킴을 알 수 있는 것이다.

실험예 10. 육종용의 독성실험

실시예 1과 실시예 2의 육종용 조추출물 및 에틸아세테이트 가용추출물의 독성을 확인하기 위하여 동물실험을 실시하였다.

경구투여

ICR계 마우스(중앙실험동물)와 5주령의 스프라우그 도울리(Sprague Dawley: SD)계 250내지 300g 정도의 수컷을 각각 10 마리씩 4군으로 나눈 다음 본 발명의 육종용 추출물(육종용 메탄올 추출물, 육종용 부탄올 추출물, 육종용 에틸아세테이트 가용추출물, 육종용 물 추출물)을 각각 500, 725, 1000 및 5000 mg/kg의 용량으로 경구투여하였다. 경구 투여 후, 2주간 독성 여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없음을 확인하였다.

복강투여

ICR계 마우스(중앙실험동물)와 5주령의 스프라우그 도울리((Sprague Dawley: SD)계 250내지 300g 정도의 수컷을 각각 10 마리씩 4군으로 나눈 다음 본 발명의 육종용 추출물(육종용 메탄올 추출물, 육종용 부탄올 추출물, 육종용 에틸아세테이트 추출물, 육종용 물 추출물)을 각각 25, 250, 500 및 725 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 복강 투여후 24시간 동안 독성 여부를 관찰한 결과, 4군 모두에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없음을 확인하였다.

수동적 학습능력 측정(Passive avoidance test)

육종용 에틸아세테이트 추출물을 치매를 유발시키기 1시간 전에 투여하여 수동적 학습능력에 미치는 효과를 측정하였다.

하단에 두께 3mm의 격자가 0.5 cm간격으로 설치되어 있으며 2개의 방으로 나누어진 박스(avoidance shuttle box, 40 X 20 X 20 cm, Gemini 사, 미국)에 ICR계 생쥐 (25-30g, 수컷)를 넣고 한 방을 밝게 하였다.

어두운 곳을 선호하는 생쥐가 밝은 방으로부터 나머지 어두운 방으로 들어가면 하단에 설치된 그리드(grid)를 통하여 전기자극(0.1mA/10g 체중)을 받게 되는 훈련을 1회 시행하였으며, 기억장애를 유발하는 스코폴라민 (scopolamine)을 생쥐에 훈련 시행 30분전에 투여하여 뇌병변을 유발시켰다. 24시간 후, 동일한 실험을 시행하여 생쥐가 밝은 방에 머무르는 시간을 측정하고, 이를 전일의 전기자극을 통한 훈련을 기억하는 지표로 하였다.

실험 결과, 스코폴라민을 처리하여 기억장애를 유도한 경우, 생쥐가 밝은 방에 머무르는 시간이 가장 짧았고, 대조군으로 식염수를 투여한 생쥐는 일상적인 반응을 나타내었으며, 그 반면에 기억장애를 유도한 후 육종용 에틸아세테이트 추출물을 처리한 생쥐는 밝은 방에 머무르는 시간이 증가하였다. 즉, 생쥐의 인지기능이 개선되었음을 알 수 있었고, 동물 내에서의 신경성장인자의 발현량을 증가시킴으로써 탁월한 수동적 인지기능 증가효과를 확인할 수 있었다(도 11 참조).

본 발명의 육종용의 추출물은 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

제제예 1. 주사제제의 제조

실시예 1의 육종용 조추출물 100 ㎎

소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎

메틸파라벤 0.8 ㎎

프로필파라벤 0.1 ㎎

주사용 멸균증류수 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한 후, 2㎖용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 2의 육조용 에틸아세테이트 추출물 200 ㎎

유당 100 ㎎

전분 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

실시예 1의 육종용 조추출물 100 ㎎

유당 50 ㎎

전분 50 ㎎

탈크 2 ㎎

스테아린산마그네슘 적량

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

실시예 2의 육종용 부탄올 추출물 1000 ㎎

설탕 20 g

이성화당 20 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제조예 5. 혼합 액제의 제조

실시예 1의 육종용 조추출물 1000 ㎎

속단 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100 ㎖

통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다. 상기 속단 추출물 및 구척 추출물은 본 발명의 구척 추출물과 동일한 방법으로 제조할 수 있다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

실시예 1의 육종용 조추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁ 0.13 ㎎

비타민 B₂ 0.15 ㎎

비타민 B₆ 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

실시예 1의 육종용 조추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

본 발명의 육종용 추출물은 신경세포의 성장 및 분화를 유도하고, 생존을 유지시키는 효과를 나타내어, 퇴행성 뇌질환에 중요한 역할을 하는 신경세포 축색돌기 성장 촉진 및 신경세포성장인자의 역할을 대체할 수 있을 뿐만 아니라 독성이 없는 천연약제로 구성된 의약 및 건강보조식품으로 사용할 수 있다.

도 1a 는 대조군으로 배양액만을 처리했을 때, PC12 세포주의 신경축색돌기 성장한 것을 나타낸 도이고, 도 1b는 육종용 조추출물 10㎍/㎖을 처리했을 때의 PC12 세포주의 신경축색돌기 성장을 나타낸 도이며,

도 2a 는 대조군으로 배양액만 처리한 PC12 세포주 사진이고, 도 2b는 신경성자인자(NGF) 2ng/㎖, 도 2c는 NGF 10ng/㎖, 도 2d 는 NGF 30ng/㎖, 도 2e는 NGF 50ng/㎖을 PC12 세포에 처리하여 6일동안 배양한 후, 세포의 신경축색돌기의 형태학적 변화를 현미경으로 관찰한 사진이고, 도 2f는 신경축색돌기의 길이를 수치화로 나타낸 도이며,

도 3 은 육종용 조추출물 10㎍/㎖, 육종용 에틸아세테이트 가용추출물 10㎍/㎖ 또는 신경성장인자 50ng/㎖을 PC12 세포에 처리하여 6일동안 배양한 후, 세포의 신경축색돌기 성장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이며,

도 4a 는 배양액만 처리하여 PC12 세포주의 신경축색돌기 성장에 미치는 영향을 관찰한 사진이고, 도 4b는 육종용 에틸아세테이트 가용추출물 10㎍/㎖, 도 4c는 신경성장인자(NGF) 50ng/㎖을 세포배양액에 첨가하여 배양 후, 세포의 형태학적 변화를 현미경 200배율로 촬영한 사진이며,

도 5 는 LDH, MTT실험을 통해서 육종용의 에틸아세테이트 가용추출물을 배양액에서 제거하였을 때 세포자연사멸(apoptosis)을 측정한 것으로, 이는 배양액만 처리한 것의 효과를 100으로 나타내어 환산한 도이며,

도 6 은 육종용의 에틸아세테이트 가용추출물을 세포배양액에서 제거하고 세포를 포집하여 DNA의 단편화가 일어남을 확인한 전기영동 사진이고,

도 7a 는 신경성장인자(NGF) 50ng/㎖을 처리하여 배양한 세포를 나타낸 도이며, 도 7b는 신경성장인자 50ng/㎖을 처리한 후 제거하여 배양한 세포를 나타낸 도이고, 도 7c는 육종용 에틸아세테이트 가용추출물 10㎍/㎖을 처리한 후 제거하였을 때, 각각 세포사멸을 형광활성세포분석을 통해서 나타낸 도이며, 도 7d는 신경성장인자 제거 후, 즉, 세포사멸을 유도한 후 육종용의 에틸아세테이트 가용추출물 10㎍/㎖을 처리한 후 배양하고 분석한 도이며,

도 8a 는 NGF의 유전자 발현량을 나타낸 전기영동사진이고, 도 8b는 정량화하여 수치화한 도이고,

도 9a 는 배양액만 처리하여 NGF 수용체의 발현량에 미치는 영향을 면역세포화학염색법을 이용하여 나타낸 도이고, 도 9b는 신경성장인자(NGF) 50ng/㎖, 도 9c는 육종용 에틸아세테이트 가용추출물 10㎍/㎖ 을 처리하고 NGF 수용체의 발현량을 나타낸 도이며,

도 10 은 시료인 육종용 추출물의 박층 크로마토그래피(TLC) 사진이며,

도 11 은 스코폴라민(scopolamine)을 처리하여 기억장애를 유도한 마우스에 식염수 및 육종용 에틸아세테이트 추출물을 사용하여 수동적 인지기능 증가를 확인한 도이다.

<110> KIM, Sun-Yeou <120> Pharmaceutical composition comprising the extract of Cistanche deserticola Y.C.MA having enhancement of the neurite outgrowth and neurotrophic effects <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGF sense primer <400> 1 tggccagtgg tcgtgcagtc 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGF anti-sense primer <400> 2 aagtcagcct cttgcagc 18 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 3 cggagtcaac ggatttggtc gtat 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH anti-sense primer <400> 4 agccttctcc atggtggtga agac 24

Claims

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육종용의 에틸아세테이트 가용추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방을 위한 약학 조성물.
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제 9항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 뇌졸증, 파킨슨, 노인성 치매 또는 알쯔하이머인 신경계 질환 치료용 조성물.
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