KR20130107947A - 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물 - Google Patents
디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 패(Ishige okamurae)로부터 추출한 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 디플로르에토하이드록시카르마롤 및 이를 포함하는 패과(Ishigeaceae) 식물 추출물은 신경세포 세포배양 모델에서 글루타메이트 신경독성으로 유발되는 신경세포 손상 및 사멸을 억제하고 또한, 뇌염증세포인 미세신경교세포의 활성화에서 오는 신경독성을 억제하는 효과를 나타낸바, 이를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 신경세포 보호용 조성물은 글루타메이트 신경독성으로 유발되는 뇌질환들의 치료 또는 예방에 유용한 약학적 용도로 사용할 수 있으며, 나아가 이를 개선할 수 있는 기능성 식품의 용도로도 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 패(Ishige okamurae)로부터 추출한 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol, DPHC) 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것이다.
최근 고령화 문제가 사회적인 이슈로 대두됨에 따라 고령인구의 특성이나 주거, 보건, 문화, 여가 등 노인복지 등에 대한 국민의 관심이 높아지고, 이에 대한 통계 수요도 늘어나고 있다. 이러한 변화의 핵심은 노령화 인구의 증가로 인해서 지난 50여 년간 사망의 주된 원인이 되었으며 최근에는 급성전염성질병보다는 만성퇴행성 질병이 더욱더 큰 문제로 대두되고 있는 실정이다. 특히 만성퇴행성 질병 중에서 뇌혈관질환에 의한 사망은 단일 질환에 의한 사망률 중에서 2위를 기록하고 있는 매우 중요한 질환이다. 뇌혈관질환은 크게 2가지 형태로 분류될 수 있다. 하나는 뇌출혈 등에서 볼 수 있는 출혈성 뇌질환이고, 다른 하나는 뇌혈관의 폐쇄 등에 의해 나타나는 허혈성 뇌질환이다. 출혈성 뇌질환은 교통사고 등에서 의해서 주로 나타나며, 허혈성 뇌질환은 주로 노령의 사람들에게 자주 나타나는 질병이다.
대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서는 ATP감소, 부종이 발생되며, 결국 뇌의 광범위한 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 상당한 시간 경과 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사라고 한다. 지연성 신경세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면, 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippcampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다(Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol., 62, pp201-208, 1984; Kirino T. Brain Res., 239, pp57-69, 1982).
지금까지 가장 많은 사람들이 받아들이는 뇌허혈에 의한 신경세포사 기전으로는 2가지가 있다. 하나는 뇌허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포내로 유입되어 결국 과도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 흥분성 신경세포사 기전(Kang TC, et al., J Neurocytol., 30, pp945-955, 2001)과 허혈-재관류시에 갑작스러운 산소 공급으로 인해 생체내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경세포사, 2가지 기전에 있다 (Won MH, et al., Brain Res., 836, pp70-78, 1999; Sun AY, Chen YM. J. Biomed. Sci., 5, pp401-414, 1998; Flowers F, Zimmerman JJ. New Horiz. 6, pp169-180, 1998).
이러한 기전적인 연구를 바탕으로 해서 뇌허혈시에 나타나는 신경세포사를 효과적으로 억제하는 물질을 탐색하거나, 물질에 대한 기전을 밝히려는 연구가 많이 수행되고 있으나 아직까지 효과적으로 뇌허혈에 의한 신경세포사를 억제하는 물질은 거의 없는 실정이다.
지금까지 유일하게 뇌허혈 치료제로 FDA 공인 시판 중인 조직플라즈미겐활성자(tissue plasminogen activator)는 혈전 용해제로 뇌허혈을 유발시키는 혈전을 녹여 빠른 산소 및 포도당의 공급을 유도하는 물질이다. 따라서 직접적으로 신경세포를 보호하는 것이 아니기 때문에 빠른 사용이 필요하며, 혈전용해제라는 특징 때문에 과량의 사용이나, 자주 사용시에는 혈관벽이 얇아져 결국 출혈성 뇌혈관질환을 유발하게 된다.
한편 국내의 경우, 다수의 천연물질이 뇌졸중 예방에 효과가 있는 건강식품으로 시판되고 있으나 이들 대부분은 과학적인 검증을 거치지 않은 것이 많으며 오히려 건강식품 남용의 원인이 되기도 하여 사회적인 문제가 되고 있다.
따라서 식품으로 식이 가능한 천연자원들을 객관적으로 검증하여 뇌질환 치료 및 예방효과를 갖는 천연물질을 개발하고자 하는 노력이 시급하며, 관련 선행문헌으로서 한국등록특허 제0898758호에 패과 식물 추출물인 디플로르에토하이드록시카르마롤에 항당뇨 활성이 있다는 것이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0981184호에 패 추출물으로 라디칼 소거활성 등의 우수한 항산화 활성을 가지고 있다는 내용 등이 개시되어 있으나 패 추출물 및 DPHC 화합물이 신경세포를 보호하여 뇌질환의 예방 및 치료에 사용한다는 내용은 개시되어 있지 않다.
이에 본 발명자들은 신경세포사를 억제하는 물질을 연구하였으며, 그 결과 패과 식물 추출물과 이로부터 추출한 생리활성 물질인 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물이 글루타메이트 신경독성을 억제하는데 효과가 탁월함을 확인하였다.
따라서 본 발명의 목적은 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 디플로르에토하이드록시카르마롤화합물을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트 신경독성으로 인해 유발되는 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물 또는 이를 포함하는 패과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 기능성 식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기의 화학식으로 표시되는 디플로르에토하이드록시카르마롤(DPHC:Diphlorethohydroxycarmalol) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물을 제공한다.
<화학식>
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 디플로르에토하이드록시카르마롤은 패과(Ishigeaceae) 식물로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물은 글루타메이트 신경독성의 억제효과 및 미세신경교세포 활성의 억제효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물은 글루타메이트 신경독성으로 인해 유발되는 뇌질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 뇌질환은 뇌졸중(stroke), 뇌손상(brain trauma), 간질경련(seizure), 일시적 뇌허혈손상(ischemic reperfusion injury), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis,MS)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 패과(Ishigeaceae) 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 패과 식물은 패(Ishige okamurae) 일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 패과 식물에 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 디에틸에테르, n-헥산, 염산, 초산, 포름산, 구연산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 용매를 첨가하여 가용 추출한 용매 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 디플로르에토하이드록시카르마롤(DPHC) 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 뇌졸중, 뇌손상, 간질경련의 급성질환과 일시적 뇌허혈 손상, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭경화증, 다발성 경화증 등의 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 패과 식물 추출물은 글루타메이트 신경독성의 억제 및 미세신경교세포 활성의 억제 효과를 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트 신경독성으로 인해 유발되는 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물 또는 이를 포함하는 패과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 기능성 식품을 제공한다.
나아가, 본 발명은 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물 또는 이를 포함하는 패과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트 신경독성으로 인해 유발되는 뇌질환 예방 또는 치료용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명에 따른 디플로르에토하이드록시카르마롤(DPHC) 및 이를 포함하는 패과(Ishigeaceae) 식물 추출물은 흰쥐 대뇌피질에서 분리하여 배양한 일차 신경세포와 일차 미세신경교세포 및 그 세포주의 세포배양 모델에서 글루타메이트 신경독성 억제 및 미세신경교세포 활성을 억제하는 효과를 나타낸바, 이를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 신경세포 보호용 조성물은 이런 글루타메이트 신경독성이 원인이 되는 뇌질환들의 치료 또는 예방에 유용한 약학적 용도로 사용할 수 있으며, 나아가 이를 개선할 수 있는 기능성 식품의 용도로도 사용할 수 있다.
도 1은 DPHC 용량에 따른 독성 여부를 LDH 독성분석방법으로 측정한 그래프이다.
도 2-A는 HT-22 신경세포주에서 DPHC를 농도별로 처리하여 글루타메이트 신경독성에 대한 신경세포의 생존능을 측정한 그래프이다.
도 2-B는 일차 신경세포(primary cortical neuron)에 DPHC를 농도별로 처리하여 글루타메이트 신경독성에 대한 신경세포의 생존능을 측정한 그래프이다.
도 3은 글루타메이트 신경독성에 대한 HT-22 신경세포주에 DPHC 처리했을 때와 하지 않았을 때의 핵 형태 변화를 관찰한 결과이다.
도 4는 대뇌피질에서 분리한 일차 미세신경교세포에 DPHC 처리했을 때와 하지 않았을 때의 형태학적 염증성 변화를 관찰한 결과이다.
도 5-A는 LPS에 의해 생성된 미세신경교세포의 활성산소량을 DPHC를 농도별로 처리했을 때의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5-B는 글루타메이트에 의해 생성된 미세신경교세포의 활성산소량을 DPHC를 농도별로 처리했을 때의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 미세신경교세포에서 DPHC 처리 유무에 따른 phase Ⅱ 항산화효소인 hemeoxygenase (HO-1) 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 LPS에 의해 활성화된 미세신경교세포에서의 DPHC 처리에 따른 p38과 JNK, ERK의 인산화 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 LPS에 의해 활성화된 미세신경교세포에서의 DPHC 처리에 따른 NK-kB 및 IkB 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9-A는 글루타메이트에 의해 활성화된 미세신경교세포의 기사용 조정배지(conditioned media)를 사용하여 미세신경교세포의 신경독성(microglia-mediated neurotoxicity) 억제를 통한 DPHC의 신경세포 보호효과 분석을 나타낸 그래프이다.
도 9-B는 신경세포-미세신경교세포 공동배양(neuron-microglia co-culture)에서의 글루타메이트 신경독성에 대한 DPHC의 신경세포 보호효과 분석을 나타낸 사진이다.
도 2-A는 HT-22 신경세포주에서 DPHC를 농도별로 처리하여 글루타메이트 신경독성에 대한 신경세포의 생존능을 측정한 그래프이다.
도 2-B는 일차 신경세포(primary cortical neuron)에 DPHC를 농도별로 처리하여 글루타메이트 신경독성에 대한 신경세포의 생존능을 측정한 그래프이다.
도 3은 글루타메이트 신경독성에 대한 HT-22 신경세포주에 DPHC 처리했을 때와 하지 않았을 때의 핵 형태 변화를 관찰한 결과이다.
도 4는 대뇌피질에서 분리한 일차 미세신경교세포에 DPHC 처리했을 때와 하지 않았을 때의 형태학적 염증성 변화를 관찰한 결과이다.
도 5-A는 LPS에 의해 생성된 미세신경교세포의 활성산소량을 DPHC를 농도별로 처리했을 때의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5-B는 글루타메이트에 의해 생성된 미세신경교세포의 활성산소량을 DPHC를 농도별로 처리했을 때의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 미세신경교세포에서 DPHC 처리 유무에 따른 phase Ⅱ 항산화효소인 hemeoxygenase (HO-1) 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 LPS에 의해 활성화된 미세신경교세포에서의 DPHC 처리에 따른 p38과 JNK, ERK의 인산화 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 LPS에 의해 활성화된 미세신경교세포에서의 DPHC 처리에 따른 NK-kB 및 IkB 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9-A는 글루타메이트에 의해 활성화된 미세신경교세포의 기사용 조정배지(conditioned media)를 사용하여 미세신경교세포의 신경독성(microglia-mediated neurotoxicity) 억제를 통한 DPHC의 신경세포 보호효과 분석을 나타낸 그래프이다.
도 9-B는 신경세포-미세신경교세포 공동배양(neuron-microglia co-culture)에서의 글루타메이트 신경독성에 대한 DPHC의 신경세포 보호효과 분석을 나타낸 사진이다.
본 발명은 신경세포 보호활성이 있는 패(Ishige okamurae)로부터 추출한 디플로르에토하이드록시카르마(DPHC)를 포함하는 뇌질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 흰쥐 대뇌피질에서 분리하여 배양한 일차 신경세포와 일차 미세신경교세포 및 그 세포주의 세포배양 모델에서 신경세포 손상 및 사멸을 유발시키는 신경독성의 대표적인 기전인 글루타메이트 신경독성을 억제하거나 경감시키는 기능을 가지는 디플로르에토하이드록시카르마 및 이의 신경세포 보호용 용도 및 뇌질환 치료 용도에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 하기 화학식으로 표시되는 디플로르에토하이드록시카르마롤(DPHC, Diphlorethohydroxycarmalol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
<화학식>
본 발명에 따른 상기 디플로르에토하이드록시카르마롤(DPHC) 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산,프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에 따른 디플로르에토하이드록시카르마롤(DPHC)은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 천연 식물로부터 분리 및 정제할 수 있다. 즉, 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 식물 또는 식물의 일부로부터 수득 될 수 있다. 천연 식물의 줄기, 뿌리 또는 잎은 목적하는 추출물을 획득하기 위하여 적절히 건조하여 침연(macerated)하거나 단지 건조시켜 적절한 유기용매로 추출하고, 목적하는 추출물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는 본 발명의 디플로르에토하이드록시카르마롤(DPHC) 화합물은 패과(Ishigeaceae)에 속하는 식물로부터 분리 및 정제할 수 있다.
한편, 패과(Ishigeaceae) 식물은 갈조식물문(phacophyta), 민가지말목(Chordariales)에 속하는 갈조 식물로서, 대표적인 종으로는 패(Ishige okamurae Yendo)와 넓패(Ishige sinicola(Setchell et Gardner) Chihara)가 있다. 넓패(Ishige sinicola(Setchell et Gardner))는 남부 해안 각지, 제주도(각 지역), 일본, 중국에 분포하며, 형태학적 특징으로는 엽상이고, 흑갈색이며, 기포처럼 팽배한 부분은 황갈색이고 건조하면 흑색으로 되고, 파도가 조용한 곳의 조간대 중부바위 위에 군락을 이루면서 서식하며, 식용으로 이용되고 있다.
또한, 패과 식물 중 패(Ishige okamurae)는 남부 해안 각지, 제주도(각 지역 연안), 일본에까지 분포하며, 형태학적 특징으로는 딱딱한 나뭇가지처럼 좁은 잎과 두꺼운 외피층, 뾰족한 정점 및 거친 표면 배열을 가지며, 색은 암갈색이고 건조되면 흑색이 된다. 구성 성분으로는 스테아르산, 메틸 미리스테이트 및 팔미트산, (2S)-O-팔미토일-2-O-미리스토일-3-O-(6-술포-알파-D-퀴노보피라노실) 글리세롤 및 그의 유도체를 포함한다고 보고된 바 있다(Zhongguo et al.,2002).
이러한 패과 식물에 대하여 지금까지 알려진 효능으로는 방오 활성, 미백효과, 방사선 방호 효과가 알려져 있을 뿐, 그 외 다른 효능에 대한 연구에 대해서는 보고된 바가 없다. 이에 본 발명자들은 패과 식물로부터 생리활성 성분을 분리 및 정제하였으며, 정제한 성분이 신경세포를 보호하는 효과가 매우 우수하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 패과 식물(Ishigeaceae) 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylenechloride), n-헥산(hexane), 염산, 초산, 포름산, 구연산 및 시클로헥산(cyclohexane), 디에틸 에테르 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 패과 식물(Ishigeaceae) 추출물은 통상의 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 구체적으로는 냉침추출법, 온침추출법 또는 열수 추출법 등일 수 있고, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다.
구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다. 또한, 상기 수득한 패과 식물 추출물은 사용 시까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관할 수 있고, 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킬 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 패과 식물 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.
또한, 상기 방법으로부터 수득한 추출물은 이후 당업계에 공지된 분리 및 정제 방법을 사용하여 상기 추출물로부터 활성 성분을 수득할 수 있는데, 본 발명의 일실시예로서 상기 수득한 패과 식물의 추출물을 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina) 등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography), 고속액체크로마토그라피high preformance liquid chromatography, HPLC) 또는 중압액체크로마토그라피(MPLC, Midium Pressure Liquid Chromatography) 등을 단독으로 혹은 병행하여 수행함으로써 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물을 분리 및 정제할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 DPHC 화합물을 분리 및 정제하는 방법은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 화합물의 분리 및 정제 방법 이라면 모두 사용할 수 있으며, 반드시 상기 방법에 한정되는 것은 아니다.
따라서 본 발명의 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물은 순수하게 분리 및 정제된 화합물의 형태로 사용될 수 있으며, 또한 이를 함유하는 추출물의 형태로도 사용될 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이 상기 추출물은 패과 식물로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있으며, 패과 식물을 물 또는 유기용매로 추출하여 수득한 가용추출물일 수 있다.
구체적으로, 본 발명자들이 패(Ishige okamurae) 추출물 및 DPHC의 분리 정제한 과정을 살펴보면, 우선 음건한 패(500g)를 세절 한 뒤 70% 에탄올을 이용하여 실온에서 이틀간 교반 추출 하여 감압 여과 후 여액을 얻었다. 얻어진 여액은 감압 농축 후 패 에탄올 추출물(76.9g)을 얻었다. 얻어진 패 에탄올 추출물은 1L 증류수에 현탁 시킨 후 분별 깔대기를 이용해 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 용매분획을 실시하였고, 얻어진 에틸아세테이트 분획물(15.3g)은 셀라이트를 이용하여 메틸렌클로라이드, 에틸에테르, 에틸아세테이트 순으로 분획을 하였다. 그 중 에틸 에테르 분획물을 역상 실리카겔이 충진된 컬럼을 통해 메탄올과 물을 이용한 용매 기울기법으로 크로마토 그래피를 실시하였고, 10개의 분획물을 얻었다. 그 중 첫번째(EA-C-1) 분획층에서 디플로르에토하이드록시카르마롤(DPHC)(275.8mg)을 분리하였다. 얻어진 DPHC 화합물은 NMR을 이용해 얻은 데이터를 공지된 문헌(Ahn, M. J.; Yoon, K. D.; Kim, C. Y.; Kim, J. H. Shin, C. G.; Kim, J. Phytother. Res. 2006, 20, 71113)에 보고된 구조와 대조하여 확인하였다.
이와 같이 본 발명은 상기 추출 및 분획과정 중에 얻어진 패과 식물 추출물 및 상기 과정을 통해 정제된 DPHC 화합물, 정제하여 상업적으로 판매하는 DPHC 화합물 모두를 사용할 수 있으며, 본 발명에서 개시하고 있는 글루타메이트 신경 독성으로부터 신경세포를 보호하는 활성은 DPHC 화합물 뿐만 아니라 상기 패과 식물 추출물에서도 동일하게 확인하였다.
즉, 본 발명자들은 본 발명에 따른 디플로르에토하이드록시카르마롤(DPHC) 화합물 또는 패과 식물 추출물에 대한 신규한 효능을 조사한 결과, 상기 추출물 및 이로부터 분리된 DPHC 화합물이 신경세포를 보호하는 효과를 갖는다는 사실을 처음으로 규명하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 DPHC 처리가 글루타메이트 신경독성으로부터의 신경세포 사멸을 억제하며, 글루타메이트 신경독성 조건에서 신경세포의 핵 변화를 억제함을 규명하였다. 또한, DPHC 화합물이 LPS로 유도되는 미세신경교세포의 염증 반응에 의한 염증성 형태학적 변화도 경감시키고, 신경세포 사멸을 유발시키는 신경 독성 정도를 감소시킴을 확인할 수 있었다..
본 발명의 일실시예에 따르면, DCF-DA방법을 수행한 결과 글루타메이트 및 LPS에 의해 생성된 미세신경교세포의 활성산소량이 DPHC에 의해 농도의존적으로 감소했음을 확인할 수 있었으며, 항산화효소인 HO-1의 발현정도를 확인한 결과 DPHC를 처리한 군에서 HO-1의 발현이 유의하게 증가하였음을 알 수 있었다.
또한 본 발명의 일실시예에 따르면, DPHC가 세포내 신호 전달시스템에 속하는 단백질 변화에 미치는 영향을 살펴본 결과, LPS에 의한 p38과 JNK의 인산화를 현저하게 억제하고, LPS에 의해 현저히 증가한 NFkB는 DPHC에 의해 억제되고 LPS에 의하여 감소되었던 세포질의 IkB의 발현양은 DPHC에 의해 복구되었음을 확인할 수 있었다.
미세신경교세포에서 생성되는 활성산소는 미세신경교세포의 활성화시 NADPH oxidase 2(NOX2)에 의해 미세신경교세포의 세포막에서 생성되어 미세신경교세포의 활성화 초기 신호로서 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 상기의 실험 결과를 통해 본 발명자들은 DPHC 화합물이 미세신경교세포 활성화 유발물질인 글로타메이트와 LPS에 의해 발생한 활성산소를 억제함으로써 미세신경교세포의 활성화 신호전달체계를 억제한다는 사실을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 미세신경교세포의 기사용 조정배지와 신경세포-미세신경교세포 공동배양을 이용하여 미세신경교세포의 신경독성 억제 분석 실험을 통해 DPHC의 신경세포 보호효과를 확인하였다.
기사용 조정배지와 신경세포-미세신경교세포의 공동배양법을 이용하는 상기 실험은 천연물의 미세신경교세포 독성 억제활성를 조사하기 위해, 최근 여러 문헌들에서 잘 확립되어 있고 (Wang et al., Neuroscience, 185, pp150-160, 2011; Park et al., Nitric oxide, 22(1), pp18-29, 2010; Ock et al., Biol. Pharm. Bull., 33, pp461-467, 2010), 실제적으로 뇌에서는 신경세포와 미세신경교세포가 공존하며 상호 밀접한 영향을 끼친다는 점에서 상기 실험은 동물실험 전 단계에서 매우 효용성있는 실험방법으로 평가받고 있는 실정이다.
상기 실험결과, 글루타메이트에 의해 활성화된 미세신경교세포는 신경세포의 사멸을 유발시키는 물질을 배지에 분비함을 알 수 있었으며, 본 발명에 따른 DPHC 화합물이 이를 완화시켜 신경세포의 생존(cell survivability)을 증가시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.
신경세포 손상 및 사멸을 유발시키는 신경독성의 대표적인 기전은 병적으로 증가한 흥분성 신경전달물질에 의한 글루타메이트 신경독성(glutamate toxicity) 혹은 신경흥분 독성(excitotoxicity)을 들 수 있다. 병적인 상황에서의 발생한 고농도의 글루타메이트는 신경세포 손상 및 사멸의 원인이 되며, 산화적 스트레스는 글루타메이트 신경독성의 주요한 기전으로 평가되고 있다.
이러한 글루타메이트 신경독성이 발병 및 병의 진행의 원인이 되는 뇌질환을 살펴보면, 급성질환으로는 뇌졸중(stroke), 뇌손상(brain trauma), 간질경련(seizure), 만성질환으로는 ischemic reperfusion injury (일시적 뇌허혈손상), Alzheimer's disease(알츠하이머병), Parkinson's disease(파킨슨병), ALS(amyotrophic lateral sclerosis, 근위축성 측삭경화증), MS(multiple sclerosis 다발성 경화증) 등의 퇴행성 뇌질환(neurodegenerative diseases) 등을 들 수 있다.
뇌졸중 및 퇴행성 뇌질환에서의 신경세포 주변의 고농도의 글루타메이트는 시냅스 기전 (synaptic mechanism)을 통해 NMDA 수용체를 통하여 시냅스후 신경세포 내로 고농도의 칼슘이 들어오게해 미토콘드리아 칼슘 증가를 유발시키며 이어서 미토콘드리아 기능 손상 및 ATP 결핍, 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)의 생성 증가 및 세포고사(apoptosis)를 유발시킨다.
또한 시냅스 외 기전(extrasynaptic mechanism)에서는 고농도의 글루타메이트는 시스틴-글루타메이트 운반체(cystine-glutamate antiporter) 기능을 차단하여 신경세포 내 항산화 물질인 글루타디온(glutathione)의 성분인 시스테인(cystein) 유입을 감소 시켜 산화적 손상을 유발시킨다.
따라서 글루타메이트 신경독성을 억제하거나 경감시킬 수 있는 효능을 가진 후보물질은 이러한 뇌졸중 및 퇴행성 뇌질환의 예방, 기능개선, 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품의 우수한 소재가 될 수 있을 것이다. 실제로 치매 초기의 인지기능 개선제로는 콜린에스테라아제(choline esterase) 저해제 (Donepezil, Rivastigmine 등)가 시판 중이지만 어느 정도 진행이 된 중증 알츠하이머 치매의 인지기능 치료제 중 유일하게 시판 중인 memantine(Ebixa, Namenda 등)은 글루타메이트 수용체의 길항제(NMDA receptor antagonist)이다.
따라서, 글루타메이트로 유발한 신경세포 사멸을 효과적으로 억제하는 기능을 지닌 본 발명에 따른 패 추출물 및 이로부터 유래한 생리활성 물질인 DPHC 화합물은 탁월한 신경세포 보호용 조성물 또는 신경세포 사멸 억제용 조성물로 활용될 수 있으며, 글루타메이트 신경독성으로 유발되는 질환으로 널리 알려진, 뇌졸중, 뇌손상, 간질경련, 일시적 뇌허혈손상, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭경화증, 다발성 경화증 등의 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있다.
한편, 중추신경계의 염증세포인 미세신경교세포(microglia)의 활성화는 과도한 신경염증을 유발시켜, 주변 신경세포의 손상 및 사멸이 일어나게 하며 이는 뇌졸중 및 여러 퇴행성뇌질환에서 중요한 공통적 병인기전으로 작용한다. 그리하여 미세신경교세포의 활성을 억제한다면 퇴행성뇌질환의 진행을 완화시킬 수 있다고 보고되고 있다.
이에 본 발명에 따른 패 추출물 및 이로부터 유래한 생리활성 물질인 DPHC 화합물은 상기에서 언급한 바와 같이, 미세신경교세포의 염증 반응을 억제하면서도 동시에 여러 신경세포에서의 활성산소 생성을 탁월하게 감소시킴으로서, 퇴행성 뇌질환의 병인기전을 전방위적으로 억제할 수 있는 탁월한 치료 효능을 지닌 약학 조성물로 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명은 패과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물은 패과 식물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 신경세포보호용 조성물을 제공할 수 있다. 더불어, 패과 식물 추출물은 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 신경세포보호용조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 패과 식물 추출물 및 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트 신경독성으로 인해 유발되는 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있으며, 바람직하게 상기 뇌질환은 뇌졸중(stroke), 뇌손상(brain trauma), 간질경련(seizure), 일시적 뇌허혈손상(ischemic reperfusion injury), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 또는 다발성 경화증(multiple sclerosis,MS) 등 일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 천연 패과 식물에서 추출한 것인바 뇌질환에 대해 사용하던 기존의 화학적 제제보다 안전성이 높아, 글루타메이트 신경독성 혹은 신경흥분독성으로 유발되는 뇌질환을 억제할 수 있는 제제로서 광범위하게 활용될 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 조성물은 글루타메이트 신경독성 혹은 신경흥분독성으로 인해 발생되는 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물을 0.1 내지 50 % 중량으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 신경세포 보호용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 글루타메이트 신경독성 혹은 신경흥분독성으로 인해 발생되는 질환을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명에 따른 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물의 약학적으로 유효한 양은 0.5~100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5~5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환의 증상 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 신경세포 보호용 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 신경세포보호용 조성물은 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과 또는 신경세포 보호 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물 또는 패과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 글루타메이트 신경독성 혹은 신경흥분독성으로 인해 발생되는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 조성물은 상기 우수한 신경세포의 독성 억제, 글루타메이트 신경독성으로부터의 신경세포 사멸 억제 효과를 통해 글루타메이트 신경독성 혹은 신경흥분독성으로 발생하는 뇌 질환을 완하시키는 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 대한 별다른 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
따라서 본 발명의 조성물은 글루타메이트 신경독성에 의해 발생하는 뇌질환의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 글루타메이트 신경독성으로 인해 발생하는 질환 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로 사용할 수 있으며, 신경세포 보호를 위한 기능성 식품용 조성물로 사용할 수 있다.
또한 글루타메이트 신경독성으로 인해 발생하는 질환 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본 발명에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본 발명에 따른 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물 공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기 “음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명에 따른 상기 글루타메이트 신경독성으로 발생되는 뇌 질환치료 및 신경세포보호용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물 또는 패과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 또는 관련 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있으며, 상기 식품의 형태는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<참고예>
DPHC 화합물 준비
패과식물에서 추출한 화합물인 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol, DPHC)를 제주테크노파크(JTP) 바이오융합센터의 추출물은행에서 공급받았으며, DMSO로 녹여서 실험에 사용하였다.
실험동물준비 및 세포배양
오리엔트 바이오사(대한민국, 경기도)로부터 임신된 암컷 Sprague Dawley계 쥐를 구입하였다. 상기 쥐들을 플라스틱 우리에서 사육하였으며, 23±2℃ 및 12시간 간격의 명암주기를 유지하였다. 먹이는 미국의 PMI nutrition에서 생산된 5L79를 사용하였으며, 먹이와 물은 임의로 주었다. 모든 실험들은 국립제주대학교의 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 이루어졌다.
일차 대뇌피질 신경세포(primary cortial neuron) 배양을 위해서는 임신 16일째의 쥐의 뇌에서 대뇌 피질 조직(해마 제외)을 적출하여 10 ml 파이펫을 활용하여 단일세포로 분리한 다음 poly-L-lysine으로 코팅된 배양접시 위에서 Neural Basal Medium (MEM, NY, USA)으로 배양하였다.
해마 HT-22 신경세포주 배양을 위해서는 10%(v/v) 소 태아 혈청(Gibco, NY, USA)과 1% 페니실린스트렙토마이신이 함유된 Dulecco’s modified Eagle medium (DMEM, NY, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂항온기에서 배양하였다.
일차 미세신경교세포(primary microglia) 배양을 위해서는 생후 1일째 되는 Sprague Dawley 흰쥐의 대뇌 피질 조직 (해마 제외)을 적출하여 10 ml 파이펫을 활용하여 단일세포로 분리한 다음 75T 플라스크에 DMEM/F12로 배양하였고 2주 후에 미세신경교세포를 떼어내서 12-웰 배양접시에 분주하여 실험을 진행하였다.
BV2 미세신경교세포(microglia)는 10%(v/v) 소 태아 혈청(Gibco, NY, USA)과 1% 페니실린스트렙토마이신이 함유된 Dulecco’s modified Eagle medium (DMEM, NY, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂항온기에서 배양하였다.
웨스턴 블롯
세포배양 접시에서 배지를 제거한 다음 NE-PER® Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(PIERCE)를 이용하여 각각의 핵과 세포질을 분리, 단백질을 얻었다. 25 g 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 size 별로 분리하였다. 전기영동이 끝난 후 젤 상의 단백질을 nitrocellulose막에 이동시켰다. 여기에 5% skim milk로 2h 처리하여 비 특이적인 반응을 줄인 다음 IB (Santa Cruz, 1:500), NF-B (Santa Cruz, 1: 500), -actin (cell signaling, 1:5000) 항체를 결합시키고 다시 그 항체에 특이적인 HRP-conjugated anti-rabbit 2차 항체를 결합시켰다. MAPKs 단백질의 인산화와 HO-1 단백질을 확인하기 위하여 lysis buffer로 전체 단백질을 분리하였다. ERK (Santa Cruz, 1:1000), phospho-ERK (Santa Cruz, 1:1000), p38 (Cell signaling, 1:1000), phospho-p38 (Cell signaling, 1:1000), JNK (Cell signaling, 1:1000), phospho-JNK (Cell signaling, 1:1000), HO-1 (Millipore, 1:1000) 항체를 결합시키고 그 항체에 특이적인 HRP-conjugated anti-mouse 혹은 HRP-conjugated anti-rabbit 2차 항체를 결합시켰다. 이후 ECL로 발색 반응이 나타나는 형광반응을 X-ray film으로 이미지화 하였다.
통계처리
실험결과의 통계처리는 Origin5.0 프로그램으로 수행하였고 측정치는 평균±표준오차(standard error)로 나타내었다. 두 집단 사이의 평균을 비교할 때는 Student’s-test를 실시하여 p값을 비교하였으며 P<0.05인 경우를 통계적으로 유의하다고 평가하였다.
<실시예 1>
패 추출물 DPHC의 용량에 따른 독성여부 조사
HT-22 신경세포 및 BV2 미세신경교세포를 96-well 플레이트에 분주하여 배양한 후 DPHC를 농도별(10, 50, 100 μg/ml)로 12 시간동안 처리하였다. 이후 배지에 방출된 LDH(Lactate dehydrogenase) 양을 LDH 독성 분석방법(LDH assay)으로 측정하였다. LDH 독성 분석방법은 정상세포에서 LDH가 세포 내에 존재하다가 세포가 손상을 받으면 배양액으로 LDH가 분비되는 과정을 이용한 것으로, LDH를 기질과 반응하게하여 492 nm에서 흡광도 측정을 통해 독성 정도를 평가하는 기법이다.
실험 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 DPHC를 10 μg/ml, 50 μg/ml 처리한 군에서는 유의적인 차이가 없었고, DPHC를 100 μg/ml 처리한 군에서만 LDH가 유의적으로 많이 방출되는 것으로 나타나 10 μg/ml, 50 μg/ml 양의 DPHC는 세포 독성이 없음을 알 수 있었다(도 1 참조)(*** p<0.001).
<실시예 2>
신경세포에서의 글루타메이트 신경독성으로부터의 생존능에 대한 DPHC의 신경보호 활성 측정
본 발명에 따른 DPHC 화합물이 글루타메이트 신경독성으로부터의 신경세포 보호 활성, 즉 생존능(cell viability)이 존재하는지 측정하기 위하여 MTT 분석법 (MTT assay)으로 이를 조사하였다.
HT-22 세포와 일차 대뇌피질 신경세포(primary cortical neuron)을 96-well 배양접시에 분주하여 12시간 안정화 시켰다. DPHC를 여러 농도별(1, 10, 20, 30, 40 μg/ml)로 2시간 전처리한 후, 글루타메이트를 일차 대뇌피질 신경세포에는 100μM 처리하여 24시간 동안 반응시켰고, HT-22 신경세포주에는 5 mM 농도로 처리하여 12시간 동안 반응시켰다.
글루타메이트 약물처리 후에는 배양액과 동일한 양의 MTT(dimethylthiaxol diphenyltetrazolium bromide) 용액을 첨가한 후 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이후디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 포마잔 프로덕트(fomazan product)를 완전히 용해시킨 후에 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다 (Model 550, Bio-Rad, USA).
그 결과 DPHC 화합물은 글루타메이트에 의한 신경세포의 사멸을 HT-22 신경세포주 및 일차 대뇌피질 신경세포에서 탁월하게 억제하였다(도 2-A 및 도2-B 참조)(### P<0.001, * P<0.05, *** P<0.001 (###: compared to controls, *, ***:compared to glutamate-treated group).
<
실시예
3>
신경세포에서의
글루타메이트
신경독성
조건에서의 핵 변화 관찰을 통한
DPHC
의 신경세포 보호 활성 분석
세포고사(apoptosis)의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위하여 핵내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색제인 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색한 후, 글루타메이트로 유발되는 신경독성 유발시 DPHC 처리 유무에 따른 신경세포 내 핵 변화를 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다.
글루타메이트 신경독성 조건에서 DPHC의 처리가 핵의 형태변화를 유도하는 지 알아보기 위하여 HT22 세포를 24-웰 배양접시에 분주한 다음 16시간 안정화시켰다. 30 μg/ml DPHC를 2시간 전처리한 후 5 mM 글루타메이트를 처리하고 12시간 동안 반응시켰다. 12시간 후에 핵내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색제인 Hoechst 33342를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시키고 염색된 세포의 핵을 형광현미경에서 관찰하였다.
그 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군의 세포의 핵은 타원형의 온전한 핵 모양을 나타낸 반면, 글루타메이트를 처리한 세포의 핵은 응축과 분절화로 인해 사멸체(apoptotic body)를 관찰할 수 있었다. 그러나, 본 발명에 따른 DPHC와 글루타메이트를 함께 처리한 군에서는 글루타메이트로만 처리된 군에서 보다 사멸체가 매우 줄어들었으며 정상 대조군과 비슷하게 온전한 핵 모양을 유지한다는 사실을 관찰할 수 있었다(도 3 참조).
따라서 DPHC는 글루타메이트 신경독성 조건에서 세포 사멸에 따른 신경세포의 핵 변화를 억제하는 효능, 즉 신경 세포사멸을 억제하는 효능이 있음을 알 수 있다.
<
실시예
4>
미세신경교세포의 염증성 형태학적 변화의 현미경 관찰을 통한
DPHC
의 미세신경교세포활성화에 대한 억제 효과 분석
대뇌피질에서 분리한 일차 미세신경교세포에 50μg/ml DPHC를 1시간 전처리 한 후 DPHC와 함께 100 ng/ml LPS를 24시간 처리하고, 현미경으로 세포의 형태 변화를 관찰하였다. 일반적으로 일차 대뇌피질 미세신경교세포가 활성화되어 신경세포에 염증이 계속되면서, 만성 염증성 신경질환이 유발된다고 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 LPS로 유발된 미세신경교세포의 염증반응을 본 발명에 따른 DPHC 화합물이 효과적으로 억제시킬 수 있는지 확인해 보고자 한 것이다.
그 결과, 도 4에서와 같이, 원형 모양의 정상적인 미세신경교세포 세포체들은 LPS에 의해 자극을 받게 되면 방추형으로 확대되어 배양판에 납작에게 붙는 전형적인 활성화 형태로 변하게 된다. 그러나 DPHC의 전처치가 있게 되면 이러한 전형적인 염증성 형태학적인 변화가 탁월하게 경감되는 것을 현미경 상에서 확인할 수 있었서, DPHC는 LPS에 의한 염증 반응을 탁월하게 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 4 참조).
<
실시예
5>
미세신경교세포에서의
DPHC
의 활성산소 생성 억제 효과 분석
글루타메이트 및 LPS에 의해 생성된 미세신경교세포의 활성산소량이 DPHC에 의해 유효적으로 감소하는 지 여부를 확인하기 위해 DCF-DA 측정법을 사용하였다. 미세신경교세포에서의 활성산소종(reactive Oxygen Species; ROS)은 신경염증 신호전달계의 2차 전령(second messenger)으로서 작용하기 때문에 이의 억제는 미세신경교세포의 활성화 억제에 매우 중요하다 (Jung et al., J. Neurochem, 115, pp1668-1680, 2010). DCF-DA 측정법은 DCF-DA(2’,7’-dichlorofluorescein)가 아세틸레이트 폼(acetylated form)으로 세포 내에서는 세포내 에스테라아제(esterase)에 의해 아세테이트 그룹이 제거되어 세포막 투과가 가능하며 평상시 형광을 띠지 않지만, 세포에 발생한 활성산소종에 의해 산화되면 구조가 바뀌어 형광을 띠는 특징을 이용한 측정법이다. 이에 본 실시예에서는 BV2 미세신경교세포에서 LPS 혹은 글루타메이트를 처리하여 활성산소를 유발 시킨 다음 10μM의 DCF-DA를 첨가하여 30분 반응시켜서 FITC 계열의 excitation/emission 파장 (485nm/535nm)에서 흡광도를 측정하였다.
먼저 LPS로 인한 활성산소종 증가에 의한 산화적 스트레스에 대한 DPHC의 작용을 알아보았다. BV2 미세신경교세포를 96-웰 플레이트에 분주 배양하였고 16시간 동안 안정화 시킨 후 DPHC를 농도별 (1, 10, 30, 50 μg/ml)로 1시간 전처리 하였다. 그리고 100 ng/ml의 LPS 를 1시간 처리한 후에 10 μM의 DCF-DA (2`,7`-dichlorofluorescein)를 첨가 하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, DPHC는 1μg/ml 농도를 처리했을 때 보다 10, 30, 50μg/ml 농도로 처리했을 때 농도 의존적으로 LPS에 의해 생성된 활성산소의 양을 억제하였고, 50μg/ml 농도에서 34.48±2.07%로 라디칼 소거 효과가 가장 높게 나타났다(도 5-A 참조).
다음으로, 글루타메이트(glutamate)로 인한 활성산소종 증가에 의한 산화적 스트레스에 대한 DPHC의 작용을 알아보았다. BV2 미세신경교세포에 DPHC를 농도별 (1, 10, 30, 50μg/ml)로 1시간 전처리 후에 5 mM 글루타메이트를 12시간 처리한 후 세포내 활성산소의 생성을 DCF-DA 방법으로 측정하였다.
그 결과, 앞에 LPS에 대한 결과와 유사하게 DPHC는 농도의존적으로 글루타메이트에 인한 활성산소종 생성을 억제하였고 50μg/ml 농도에서 22.05±0.66%로 라디칼 소거작용이 가장 높게 나타났다(도 5b 참조)(# P<0.01, ### P<0.001, * P<0.05, *** P<0.001 (#, ###: compared to controls; *, **: compared to cells treated only with glutamate).
<
실시예
6>
미세신경교세포에서의
HO
-1 변화 측정
BV2 미세신경교세포에 50 μg/ml DPHC를 12시간 처리 후에, 웨스턴블롯팅 방법으로 HO-1 단백질의 발현을 조사하였다. 그 결과, DPHC를 처리하지 않은 군에 비해 DPHC를 처리한 군에서 항산화효소인 HO-1의 발현이 유의하게 증가하였음을 확인하였다(도 6 참조). HO-1은 가장 연구가 많이 되고 있는 phase Ⅱ 항산화효소로서 heme 대사를 통하여 최종적으로 생기는 carbon monoxide, ferrous iron(Fe2 +), bilirubin은 세포내 활성산소 독성를 중화시켜 항산화 효과를 나타낸다 (Innamorato et al., Curr. Opin. Neurol., 22, pp308-314, 2009; Ryter et al. Physiol. Rev., 86, pp583-650, 2006; Syapin P. J., Br. J. Pharmacol, 155, pp623-640, 2008). 따라서 DPHC는 글루타메이트나 LPS에 의해 발생하는 미세신경교세포의 활성산소에 의한 염증성 변화를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
<
실시예
7>
활성화된 미세신경교세포에서의
p38
과
JNK
의 인산화 및
NF
-
kB
와
IkB
발현에 미치는
DPHC
의 영향 분석
우선 BV2 미세신경교세포에 50μg/ml의 DPHC를 2시간 전처리 한 다음 100 ng/ml LPS를 30분간 처리하였다. 상기 <참고예>의 웨스턴 블롯 방법에 따라 우선 인산화된 인산화된 p38, JNK, ERK의 단백질 변화량을 관찰하였다.
그 결과, PHC는 LPS에 의한 p38과 JNK의 인산화가 27.5±3.7%와 53.7±2.3%로 현저하게 억제함을 알 수 있었다(도 7 참조)(# P<0.05, ### P<0.001, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 (#, ###: compared to controls; *, **, ***: compared to cells treated only with LPS).
또한, 활성화된 미세신경교세포에서의 NF-kB와 IkB의 발현에 대한 DPHC의 억제 작용을 분석하기 위하여, BV2 미세신경교세포에 50 μg/ml DPHC를 2시간 전처리 후 100ng/ml LPS를 30분 처리하였다. 세포핵과 세포질의 단백질을 분리하고 웨스턴 블롯 방법으로 세포핵에서의 NF-κB의 발현과 세포질에서의 IκB의 발현 변화를 조사하였다.
그 결과, LPS에 의해 세포핵에서의 NF-κB의 발현이 현저하게 증가하였으나 이는 DPHC 처리에 의해 26.7±10.4%로 유의성 있게 억제되었다. 또한, LPS에 의하여 감소 되었던 세포질에서의 IκB의 발현양도 DPHC에 의하여 23.9±6.4% 복구되었다(도 8 참조)(# P<0.05 or * P<0.05 (#: compared to controls; *: compared to cells treated only with LPS).
<
실시예
8>
기사용배지(conditioned media)와
신경세포-미세신경교세포 공동배양(
neuron
-
microglia
co
-culture)을 이용한 미세신경교세포의
신경독성
(
microglia
-
mediated
neurotoxicity
)억제를 통한 DPHC의 신경세포 보호효과 분석
글루타메이트에 의해 활성화된 미세신경교세포가 배지에 분비한 물질이 신경세포의 생존(cell survivability)에 영향을 미치는 것을 확인하고 DPHC가 미세신경교세포에 의한 신경독성을 완화시키는지를 확인하고자 하는 본 실험을 진행하였다.
천연물의 미세신경교세포 독성 억제활성를 조사하기 위해, 본 실시예에서의 기사용배지를 사용하는 방법과 신경세포-미세신경교세포 공동배양법을 사용하는 방법은 최근 여러 문헌들에서 잘 확립되어 있고 (Wang et al., Neuroscience, 185, pp150-160, 2011; Park et al., Nitric oxide, 22(1), pp18-29, 2010; Ock et al., Biol. Pharm. Bull., 33, pp461-467, 2010), 뇌에 실제로 신경세포와 미세신경교세포가 공존하며 서로 영향을 끼친다는 점에서 동물실험 전 단계에서 매우 효용성 있는 실험방법으로 평가되고 있다.
<8-1> 활성화된 미세신경교세포의 기사용
조정배지에서의
DPHC
의 신경세포 보호효과 분석
우선 BV2 미세신경교세포를 12-well 배양접시에 분주하여 12시간 동안 안정화 시킨 후, DPHC(50 μg/ml)를 2시간 전처리 하고 배지를 세척하고 글루타메이트(5mM)를 12시간 동안 처리하였다. 그리고 글루타메이트로 활성화된 미세신경교세포의 배지(기사용 조정배지, conditioned medium)를 회수하여 원심분리를 통하여 잔여물을 제거한 다음, HT-22 세포가 깔려있는 96-well 배양접시에 옮겨 처리한 후 12시간 동안 배양하였다. 그리고 MTT 분석법으로 신경세포 사멸에 대한 DPHC 화합물의 보호 활성을 조사하였다. 본 실험은 BV-2 미세신경교세포주 및 HT-22 신경세포주 모두 배양액 조성이 같기 때문에 상기 기사용 조정배지 실험이 기술적으로 가능한 것이다.
상기에서 DPHC를 처리한 후 배지를 세척하고 글루타메이트만 처리하는 이유는 해당 conditioned media에 DPHC가 있으면 신경세포에서의 글루타메이트 독성에 대한 DPHC 작용과 혼합되어 DPHC의 미세신경세포 독성 자체에 대한 정확한 평가가 어렵기 때문이다.
실험 결과, DPHC를 전처리한 미세신경교세포의 기사용배지(Glu/DPHC-CM)에서의 신경세포 사멸을 유발시키는 신경독성 정도는 글루타메이트만 처리한 미세신경교세포의 기사용배지(Glu-CM)에 비하여 유의적으로 감소하였다(도 9 참조).
본 실험을 통하여 본 발명자들은 글루타메이트에 의해 활성화된 미세신경교세포가 신경세포의 사멸을 유발시키는 물질을 분비함을 확인하였으며, 본 발명에 따른 DPHC를 처리하면 이러한 미세신경교세포의 신경독성을 상당히 완화함를 확인하였다.
<8-2> 공동배양(
neuron
-
microglia
co
-
culture
)에서의
DPHC
의 신경세포 보호효과 분석
또한, 본 발명자들은 신경세포-미세신경교세포의 공동배양법(neuron-microglia co-cultrue) 실험에서 DPHC 화합물의 미세신경교세포 활성화 억제를 통한 신경세포 보호효능을 분석하였다. 우선, BV2 미세신경교세포를 6×104농도로 24-well 배양접시에 분주하여 4시간 동안 배양시켜 안정화 시킨 후, DPHC(50 μg/ml)을 2시간 전처리한 후에 글루타메이트(10 mM)와 함께 2시간 더 처리하고 세척한 후, 형광유전자 GFP가 발현되는 B-35 EGFP 신경세포주를 1.5×105농도로 첨가하여 24시간 BV2 미세신경교세포와 B-35 EGFP 신경세포를 공동배양 하였다. 상기에서와 같이 중간에 DPHC와 글루타메이트를 세척한 이유는 글루타메이트의 신경세포에 대한 직접적인 독성작용과 DPHC의 신경세포에 대한 직접적인 신경보호 작용(도 2를 통해 제시했음)을 배제하고, 미세신경교세포에 대한 DPHC의 억제작용 자체가 신경세포 보호에 작용하는 점을 제시하기 위해 고안되었다.
한편, 또 다른 대표적인 미세신경교세포의 활성화 물질인 LPS로 미세신경교세포를 활성화시키기 위해, DPHC(50 μg/ml)을 2시간 전처리한 후에 배지를 세척하고, LPS(10 ng/ml)와 형광유전자 GFP가 발현되는 B-35 EGFP 신경세포주를 1.5×105농도로 첨가하여 24시간 BV2 미세신경교세포와 B-35 EGFP 신경세포를 공동배양 하였다.
형광현미경으로 임의로 5개 구역을 취하여 형광을 발현하는 B-35 EGFP 세포수를 카운팅하여 글루타메이트로 활성화된 미세신경교세포와 동일한 배양접시에서 배양된 신경세포의 생존능을 분석하여 미세신경교의 신경독성에 대한 DPHC의 신경세포 보호 효능을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (11)
- 하기 화학식으로 표시되는 디플로르에토하이드록시카르마롤(DHPC:Diphlorethohydroxycarmalol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물:
<화학식>
.
- 제1항에 있어서,
상기 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물은 패과(Ishigeaceae) 식물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 신경세포 보호용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물은 글루타메이트(glutamate)로 유발되는 신경독성의 억제효과 및 미세신경교세포 활성 억제효과 갖는 것을 특징으로 하는 신경세포 보호용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물은 글루타메이트 신경독성으로 인해 유발되는 뇌질환의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 신경세포 보호용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 뇌질환은 뇌졸중(stroke), 뇌손상(brain trauma), 간질경련(seizure), 일시적 뇌허혈손상(ischemic reperfusion injury), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis,MS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 신경세포 보호용 조성물. - 패과(Ishigeaceae) 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 패과(Ishigeaceae) 식물은 패(Ishige okamurae)인 것을 특징으로 하는 신경세포 보호용 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 패과 식물 추출물은 패과 식물에 물 또는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, n-헥산, 염산, 초산, 포름산, 구연산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 용매를 첨가하여 가용 추출한 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 신경세포 보호용 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 추출물은 디플로르에토하이드록시카르마롤(DHPC:Diphlorethohydroxycarmalol) 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 신경세포 보호용 조성물. - 하기 화학식으로 표시되는 디플로르에토하이드록시카르마롤(DHPC:Diphlorethohydroxycarmalol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 글루타메이트 신경독성으로 인해 유발되는 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물:
<화학식>
.
- 하기 화학식으로 표시되는 디플로르에토하이드록시카르마롤(DHPC:Diphlorethohydroxycarmalol) 화합물 또는 패과 식물 추출물을 유효성분으로포함하는 신경세포 보호용 기능성 식품:
<화학식>
.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120030154A KR20130107947A (ko) | 2012-03-23 | 2012-03-23 | 디플로르에토하이드록시카르마롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| EP3065784A1 (en) * | 2013-11-05 | 2016-09-14 | The Research Institute at Nationwide Children's Hospital | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING NF- kB AND SOD-1 TO TREAT AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS |
| KR20170086166A (ko) * | 2016-01-15 | 2017-07-26 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | 뇌졸중 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물 |
| KR20190081753A (ko) * | 2017-12-29 | 2019-07-09 | 인천대학교 산학협력단 | 패 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 조성물 |
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-
2012
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