TWI488630B - 預防或治療澱粉樣β肽相關疾病或狀況的醫藥組合物 - Google Patents

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Description

預防或治療澱粉樣β肽相關疾病或狀況的醫藥組合物
本發明係有關於一種用於預防或治療一種與澱粉樣β肽相關性疾病或狀況之醫藥組合物，其含有作為有效成分的類葉升麻苷與異類葉升麻苷，該有效成分能夠抑制澱粉樣β肽生成、累積或聚集。
美國專利7,087,252 B2揭示了一種從管花肉蓯蓉(Cistanche tubulosa (Schenk)Wight)的肉質莖所製備之含25-50 wt%松果菊苷(echinacoside)及5-15 wt%類葉升麻苷(acteoside)的製劑，其可用於抗老年癡呆症(senile dementia)。異類葉升麻苷及多種其它苯乙醇苷類(phenylethanoid glycosides)已知被包含於該製劑中。
申請人前於WO 2011/157059 A1揭示了異類葉升麻苷或其醫藥學上可接受鹽於抑制澱粉樣β肽生成、累積或聚集之用途，以及其於製備預防或治療澱粉樣β肽相關之疾病或狀況的藥物之用途。
美國專利7,087,252 B2及WO 2011/157059 A1的全部內容通過參考方式被併入本案。
於本申請案中發明人延續WO 2011/157059 A1的研究並獲得一相關的發明成就。
有鑒於澱粉樣β肽和其聚集體，容易於生物體內引發各種疾病或狀況，因此本發明之一目的為提供一種抑制澱粉樣β肽生成、累積或聚集的醫藥組合物，其可作為食品、飲品、咀嚼物、貼片、皮膚保養品或其他的一添加劑。本發明之另一目的則提供一種預防或治療澱粉樣β肽相關之疾病或狀況的醫藥組合物。
本發明的又一目的為提供一種醫藥組合物於製備預防或治療澱粉樣β肽相關之疾病或狀況的藥物之用途。
依本發明內容所完成的一種預防或治療與一澱粉樣β 肽相關之一疾病或狀況的醫藥組合物包含作為有效成分的類葉升麻苷與異類葉升麻苷，其中異類葉升麻苷對該類葉升麻苷的重量比為4：1至1：4。
較佳的，該醫藥組合物中的異類葉升麻苷對該類葉升麻苷的重量比為4：1至2：3。
較佳的，該醫藥組合物不含有松果菊苷。
較佳的，該醫藥組合物能夠抑制該澱粉樣β 肽的生成、累積或聚集。
較佳的，該醫藥組合物能夠抑制該澱粉樣β 肽細胞外的生成、累積或聚集。
較佳的，該醫藥組合物能夠抑制該澱粉樣β 肽導致神經元的損傷或凋亡，進而保留、改善或恢復學習與記憶能力。
較佳的，該與澱粉樣β 肽相關之疾病或狀況為阿滋海默氏症、輕度認知障礙、路易氏體失智症、唐氏症、荷蘭 型類澱粉變性症、關島帕金森氏症-失智症複合症、大腦澱粉樣血管病、包涵體肌炎、額顳葉型失智症、年齡相關性黃斑變性或皮克病。
較佳的，該醫藥組合物是用於治療阿滋海默氏症。
較佳的，該醫藥組合物是用於避免或延遲一生物體罹患阿滋海默氏症。
較佳的，該醫藥組合物對人體的有效劑量係相當於每日每公斤體重0.2毫克至4毫克之該有效成分。
較佳的，該醫藥組合物包含一種萃取自植物的苯乙醇苷製劑作為該有效成分的來源，其中該製劑包含類葉升麻苷與異類葉升麻苷為主要的苯乙醇成分，且異類葉升麻苷的含量大於該類葉升麻苷。
較佳的，該製劑包含12-32%類葉升麻苷及26-46%的異類葉升麻苷，以該製劑的重量為基準。
較佳的，該植物為一管花肉蓯蓉。
較佳的，該製劑係經過一包含以下步驟的方法所製備：a)將該管花肉蓯蓉的肉質莖以一第一極性溶劑加予萃取；b)將步驟a)獲得的萃取物於濃縮後加到裝有疏水大孔隙聚合物的柱中，使得苯乙醇苷吸附在聚合物上；c)用第二極性溶劑作為流動相流洗液洗脫該柱以除去游離的化合物，而實質上大部份的苯乙醇苷仍然吸附在聚合物上；以及d)用第三極性溶劑將苯乙醇苷從聚合物上洗脫下來， 得到含有苯乙醇苷的洗脫液，其中第一極性溶劑為水、甲醇、乙醇、水與甲醇的混合溶劑、或水與乙醇的混合溶劑；第二極性溶劑為水；及第三極性溶劑為甲醇、乙醇、水與甲醇的混合溶劑、或水與乙醇的混合溶劑，且該第三極性溶劑與第二極性溶劑相比極性較低；e)將步驟d)獲得的含有苯乙醇苷的洗脫液濃縮再溶於水中，所得到的水溶液與一大孔樹脂接觸使得其中的苯乙醇苷吸附在大孔樹脂上；及f)依序以一第四極性溶劑和一第五極性溶劑分別對該大孔樹脂進行洗脫，其中該第五極性溶劑的極性較該第四極性溶劑為低，使得以該第四極性溶劑洗脫而得的洗脫液不含有類葉升麻苷與異類葉升麻苷，而以該第四極性溶劑洗脫而得的洗脫液僅包含類葉升麻苷與異類葉升麻苷，其中第四極性溶劑及第五極性溶劑為水與甲醇的混合溶劑、或水與乙醇的混合溶劑。
較佳的，該第四極性溶劑為25~35%乙醇水溶液，而該第五極性溶劑則為35~45%乙醇水溶液。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉出實施例，並配合所附圖式，作詳細說明。
許多由澱粉樣β肽引發的疾病均具有一種共通的特徵-澱粉樣β肽聚集體的形成。這些澱粉樣β肽聚集體可以例 如纖維或斑塊的形態出現，並且沉澱在生物體的系統、器官、組織或體液中，進而引發各種疾病或狀況。如能有效抑制澱粉樣β肽的生成、累積或聚集，應可避免澱粉樣β肽形成聚集體而引發的各種疾病或狀況，其應可作為有效預防或治療澱粉樣β肽相關疾病或狀況的方式之一。
所述“預防”意指避免或延遲疾病或狀況在生物體中出現，而所述“治療”則指減緩或阻止疾病或狀況的發展，又或者使生物體的狀況回復至較佳或正常的狀態。
所述“澱粉樣β肽相關性疾病或狀況”指此疾病或狀況的發生通常與澱粉樣β肽的生成、累積或聚集相關，且尤其指此疾病或狀況的發生為澱粉樣β肽所導致。而當在具有某種疾病或狀況之一定比例上的生物體上發現有澱粉樣β肽的不正常生成、累積或聚集現象時，亦可認為此疾病或狀況為澱粉樣β肽相關。另外，當澱粉樣β肽的聚集處與疾病或狀況所發生的病理特徵影響位置相近時，亦可認為此疾病或狀況為澱粉樣β肽相關。
在下列實施例中，利用表一所提供之測試樣品進行Aβ試驗，並且與未加入任何測試樣品處理的對照組(Vehicle)進行比較。
實施例一：神經瘤母細胞株之培養
將原生型(wild type)人類神經瘤母細胞SH-SY5Y培養於Eagle’s Minimum essential Medium(EMEM)/Ham’s F12 medium(1：1混合物)(含10% FBS,10 units/ml penicillin,10 μg/ml Streptomycin)中，而原生型小鼠神經瘤母細胞Neuro-2a則培養於minimum essential medium(MEM)培養基(含10% FBS,10 units/ml penicillin,10μg/ml Streptomycin)中。
實施例二：各樣品對Aβ1-40於細胞外的累積測試
將實施例一中的原生型人類神經瘤母細胞SH-SY5Y之 培養基置換成化學成份培養基(EMEM/F12 medium(Cat.No.12500-062),Hepes 5 mM，葡萄糖0.6%,NaHCO3 3 mM，麩醯胺2.5 mM，胰島素25 μg/ml,Transferin 100 μg/ml,Progestrone 20 nM,Putrescine 60 μM，亞硒酸鈉(Sodium selenite)30 nM,Heparin 2μg/ml)。每個井(well)具有1x105 個SH-SY5Y細胞，而培養基體積為300 μl。30分鐘後，將表一中所示之測試樣品分別以50 μg/ml的總濃度加入至不同井中處理24小時，接著以Human Aβ1-40 Immunoassay kits(Catalog # KHB3482 Invitrogen)分析各井之培養基中的Aβ1-40含量。
人類神經瘤母細胞SH-SY5Y會累積Aβ於細胞外的培養基中，而圖1顯示SH-SY5Y井分別經各測試樣品處理後，Aβ1-40於培養基中的含量百分比，其係以未加入任何測試樣品處理的對照組(C)為比較基準。結果顯示為平均值±標準誤差，而對照組和測試樣品組間之統計差異標示為：＊＊＊ 表示P<0.001。
參考圖1所示，測試樣品A(類葉升麻苷)減少培養基中的Aβ1-40含量約10%，測試樣品A：I 40：10(類葉升麻苷40 μg/ml+異類葉升麻苷10 μg/ml)則減少培養基中的Aβ1-40含量約22%，而其餘測試樣品則減少培養基中的Aβ1-40含量約80%。圖1結果顯示類葉升麻苷+異類葉升麻苷=30 μg/ml+20 μg/ml：20 μg/ml+30 μg/ml；及10 μg/ml+40 μg/ml異類葉升麻苷(D)的測試樣品，與異類葉升麻苷50 μg/ml的測試樣品具有顯著降低Aβ1-40於細胞 外累積的極佳活性。
實施例三：各測試樣品對Aβ1-42寡聚化的實驗
將乾燥的Human Aβ1-42自冰箱取出平衡至室溫，加入1,1,1,3,3,3-Hexa-fluro-2-propanol(HFIP)溶解Aβ1-42至濃度為1mM，而之後在室溫下靜置1小時。以Hamilton注射器將上述Aβ1-42/HFIP容易進行分裝，並且以氮氣將HFIP吹乾，接著存放於-20℃。將HFIP處理後的Aβ1-42以PBS溶解，並分別以濃度50μg/ml的測試樣品A-D且於4℃下振盪處理24小時，以製備Aβ1-42之寡聚物(oligomer)，並利用thioflavine T結合螢光(Ex=450 nm,Em=482 nm)以分析Aβ1-42的寡聚化程度。
圖2顯示表1中的測試樣品分別對Aβ1-42寡聚化(oligomerization)的影響，結果以百分比顯示，並以未加入任何測試樣品處理的對照組(C)為基準。圖2結果顯示表1中的各測試樣品均具有抑制Aβ1-42寡聚化的活性，其中以類葉升麻苷+異類葉升麻苷=30 μg/ml+20 μg/ml；20 μg/ml+30 μg/ml；及10 μg/ml+40 μg/ml異類葉升麻苷(D)的測試樣品，與異類葉升麻苷50 μg/ml的測試樣品對降低Aβ1-42的寡聚化具有較佳的活性，進而可抑制Aβ形成纖維絲或老年斑塊。
綜合上述結果，異類葉升麻苷及類葉升麻苷的醫藥組合物可作為抑制Aβ生成、累積或聚集之有效成份，預計此醫藥組合物可有效抑制Aβ導致神經元的損傷或凋亡，以進 而保留、改善或恢復學習與記憶能力。此外，根據上述結果，此醫藥組合物可用於預防或治療Aβ相關疾病或狀況。
所述Aβ相關疾病或狀況可包含但不限於阿滋海默氏症、輕度認知障礙、路易氏體失智症、唐氏症、荷蘭型類澱粉變性症、關島帕金森氏症-失智症複合症、大腦澱粉樣血管病、包涵體肌炎、額顳葉型失智症、年齡相關性黃斑變性、皮克病以及其他。另，所述Aβ雖以Aβ中最大量的Aβ1-40或具有高度纖維形成性的Aβ1-42為例，然亦可包含其他胺基酸片段。
圖1及2的結果顯示異類葉升麻苷具有較佳的活性，但在實際應用上，異類葉升麻苷為一種含糖分子，不易以化學合成方式製備。以植物來源獲得高純度異類葉升麻苷的成本亦極高。由於圖1及2的結果亦顯示類葉升麻苷和異類葉升麻苷的混合物作為澱粉樣β 肽抑制劑具有可比擬於純異類葉升麻苷的活性，因此假使一醫藥組合物可包含適當組成比的類葉升麻苷和異類葉升麻苷，則可在兼顧經濟效益和醫療功效等實際應用面考量上，將此醫藥組合物用於代替純化之異類葉升麻苷於預防或治療澱粉樣β 肽相關的疾病或狀況。
在本發明的下列實施例中，首先參考美國專利案US7,087,252所述製備含有苯乙醇苷的管花肉蓯蓉製劑之方法，其包括下列步驟：a)將管花肉蓯蓉的地下部分(肉質莖)以一第一極性溶劑加予萃取；b)將步驟a)獲得的萃取物加到裝有疏水大孔隙聚合物的柱中，使得苯乙醇苷被吸附 在聚合物上；c)用第二極性溶劑作為流動相流洗液洗脫該柱以除去游離的化合物，而實質上大部份的苯乙醇苷仍然吸附在聚合物上；以及d)用第三極性溶劑將苯乙醇苷從聚合物上洗脫下來，得到含有苯乙醇苷的洗脫液，該第三極性溶劑與第二極性溶劑相比極性較低。
上述步驟a)的第一極性溶劑可例如為水、或水與乙醇的混合溶劑。步驟c)的第二極性溶劑為水。步驟d)的第三極性溶劑則可例如包含甲醇、乙醇、水與甲醇的混合溶劑、或水與乙醇的混合溶劑，而第三極性溶劑較佳為水與乙醇的混合溶劑。
本發明提供了一種進一步純化方法，其係直接將上述含苯乙醇苷的管花肉蓯蓉製劑經進一步純化，以得到僅含有類葉升麻苷與異類葉升麻苷之苯乙醇苷的醫藥組合物。此進一步純化方法包括步驟：e)將含有多種苯乙醇苷的管花肉蓯蓉製劑以大孔樹脂進行純化；f)依序以第四極性溶劑與第五極性溶劑分別對大孔樹脂進行洗脫，其中第四極性溶劑的極性較第五極性溶劑為低，使經由第五極性溶劑洗脫而出的苯乙醇苷大抵僅包含類葉升麻苷與異類葉升麻苷。在一較佳實施例中，第四極性溶劑可例如為25~35%乙醇水溶液，而第五極性溶劑則可例如為35~45%乙醇水溶液。
較佳的，該疏水大孔隙聚合物及大孔樹脂為交聯聚芳族物質，更佳的為交聯的聚苯乙烯，或交聯的苯乙烯和二乙烯苯共聚物，例如D-101型或AB-8型的材料。
將上述經第五極性溶劑洗脫後的洗脫液進行濃縮或乾燥，即可直接得到實質上僅含異類葉升麻苷與類葉升麻苷之苯乙醇苷的醫藥組合物。
實施例四：僅含有異類葉升麻苷與類葉升麻苷之苯乙醇苷的醫藥組合物
將管花肉蓯蓉藥材10 kg，切成飲片，加8倍量水浸泡1小時後煎煮提取2小時，過濾，濾液備用。藥渣再加6倍量水煎煮提取2次，每次1小時，過濾。合併三次濾液，減壓濃縮至比重1.10(50℃)，加乙醇至含醇量達60%，冷藏12小時，傾出上淸液，將殘留的懸濁液過濾，合併上淸液和濾液，減壓濃縮並回收乙醇至比重1.10(50℃)，得提取浸膏。
將提取浸膏6 kg加1倍量水加熱溶解，徐徐注入已處理好的大孔吸附樹脂柱內，先用水洗脫，收集藥材4倍量水洗脫液備用；再用40%乙醇洗脫，收集藥材5倍量40%乙醇洗脫液備用。將水洗脫液再注入大孔吸附樹脂柱中，先用藥材3倍量水洗脫，棄去水洗脫液；再用40%乙醇洗脫，收集藥材4倍量40%乙醇洗脫液備用。合併2次40%乙醇洗脫液，濃縮，乾燥，即得含有苯乙醇苷的製劑1107 g。
以高效液相色譜法測定，溶劑A：含0.1%甲酸的乙腈(acetonitrile,CAN)，溶劑B：含0.1%甲酸的MQ-H2 O，柱：Agilent Zorbax SB-C18柱，2.1 x 150 mm,5μm；流速：0.3 ml/min；UV波長：333 nm。上述苯乙醇苷製劑中的松果菊 苷、類葉升麻苷以及異類葉升麻苷之含量，經計算後所得之結果分別為33.6 wt%、3.65 wt%以及6.05 wt%。
將200公克上述含苯乙醇苷的製劑溶於800克水中，以一溶液形式流經大孔樹脂以便進行純化。接著依序先後分別以30%乙醇和40%乙醇進行洗脫。，在薄層析片(聚醯胺(Polyamide))以UV 365nm檢測個別的洗脫液，其中30%乙醇的洗脫液中未包含類葉升麻苷與異類葉升麻苷，而40%乙醇的洗脫液中則僅包含類葉升麻苷與異類葉升麻苷之苯乙醇苷23.6 g。在此實施例中，所測得洗脫液中的類葉升麻苷為22.5 wt%，而異類葉升麻苷為36.4 wt%。
雖然本發明已以數個較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在未脫離本發明所揭示之精神下所完成之等效改變或修飾，均應包含在下述之申請專利範圍內。
圖1顯示藥物A(類葉升麻苷)、I(異類葉升麻苷)、C(控制組，不含藥物)及不同比例之A與I的醫藥組合物對Aβ1-40在細胞外累積的影響。
圖2顯示顯示藥物A(類葉升麻苷)、I(異類葉升麻苷)、C(控制組，不含藥物)及不同比例之A與I的醫藥組合物對Aβ1-42寡聚化的影響。

Claims (13)

  1. 一種組合物的用途，其中該用途係用於製備治療與一澱粉樣β肽相關之一疾病或狀況的藥物，該組合物包含作為有效成分的類葉升麻苷與異類葉升麻苷，其中異類葉升麻苷對該類葉升麻苷的重量比為約4：1至約2：3。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中異類葉升麻苷對該類葉升麻苷的重量比為約4：1至約1：1。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其不含有松果菊苷。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物能夠抑制該澱粉樣β肽的累積或聚集。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物能夠抑制該澱粉樣β肽細胞外的累積或聚集。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物能夠抑制該澱粉樣β肽導致神經元的損傷或凋亡，進而保留、改善或恢復學習與記憶能力。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該與澱粉樣β肽相關之疾病或狀況為阿滋海默氏症、輕度認知障 礙、路易氏體失智症、唐氏症、荷蘭型類澱粉變性症、關島帕金森氏症-失智症複合症、大腦澱粉樣血管病、包涵體肌炎、額顳葉型失智症、年齡相關性黃斑變性或皮克病。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該藥物是用於治療阿滋海默氏症。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該藥物是用於避免或延遲一生物體罹患阿滋海默氏症。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該藥物對人體的有效劑量係相當於每日每公斤體重0.2毫克至4毫克之該有效成分。
  11. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其包含一種萃取自植物的苯乙醇苷製劑作為該有效成分的來源，其中該製劑包含類葉升麻苷與異類葉升麻苷為主要的苯乙醇成分，且異類葉升麻苷的含量大於該類葉升麻苷，其中該製劑係經過一包含以下步驟的方法所製備：a)將該管花肉蓯蓉的肉質莖以一第一極性溶劑加予萃取；b)將步驟a)獲得的萃取物於濃縮後加到裝有疏水大孔隙聚合物的柱中，使得苯乙醇苷吸附在聚合物上； c)用第二極性溶劑作為流動相流洗液洗脫該柱以除去游離的化合物，而實質上大部份的苯乙醇苷仍然吸附在聚合物上；以及d)用第三極性溶劑將苯乙醇苷從聚合物上洗脫下來，得到含有苯乙醇苷的洗脫液，其中第一極性溶劑為水、甲醇、乙醇、水與甲醇的混合溶劑、或水與乙醇的混合溶劑；第二極性溶劑為水；及第三極性溶劑為甲醇、乙醇、水與甲醇的混合溶劑、或水與乙醇的混合溶劑，且該第三極性溶劑與第二極性溶劑相比極性較低；e)將步驟d)獲得的含有苯乙醇苷的洗脫液濃縮再溶於水中，所得到的水溶液與一大孔樹脂接觸使得其中的苯乙醇苷吸附在大孔樹脂上；及f)依序以一第四極性溶劑和一第五極性溶劑分別對該大孔樹脂進行洗脫，其中該第五極性溶劑的極性較該第四極性溶劑為低，使得以該第四極性溶劑洗脫而得的洗脫液不含有類葉升麻苷與異類葉升麻苷，而以該第五極性溶劑洗脫而得的洗脫液僅包含類葉升麻苷與異類葉升麻苷，其中第四極性溶劑及第五極性溶劑為水與甲醇的混合溶劑、或水與乙醇的混合溶劑。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該製劑包含12-32%類葉升麻苷及26-46%的異類葉升麻苷，以該製劑的重量為基準。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該第四極性溶劑為25~35%乙醇水溶液，而該第五極性溶劑則為35~45%乙醇水溶液。
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