CN101411753B - 列当总苷在制备抗老年痴呆的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种列当提取物、列当总苷和列当多糖,是以水或甲醇或乙醇为提取溶剂,采用煎煮或回流或渗漉或浸渍或超声的方法制成,所述列当提取物及列当总苷做进一步的抗氧化、抗疲劳、抗老年痴呆、抗肝炎等药效学实验,阐述列当提取物、列当总苷或列当多糖在预防和治疗疾病方面的应用,为进一步对植物列当的利用提供了新的途径和用途。

Description

列当总苷在制备抗老年痴呆的药物中的应用
技术领域
本发明涉及植物提取物及其制备法方法和用途,特别涉及列当提取物及其制备方法以及进一步纯化所得的列当总苷及列当多糖,本发明还涉及列当提取物、列当总苷和列当多糖在预防和治疗疾病方面的用途。
背景技术
列当科有13属180种,主产于北温带欧亚大陆,以列当属为最大,包含140种;我国有肉苁蓉属、草苁蓉属、野菰属、丁座草属和列当属等10属,约35种,多种具有较好的药用价值,如:主产于我国西北部盐碱地和沙地的肉苁蓉属植物肉苁蓉、主产于我国东北长白山区的草苁蓉属植物草苁蓉以及广泛分布于我国北方各地的列当属植物列当。本发明所涉及的列当属Orobanche植物在我国有20余种,如紫花列当Orobanche coerulescens、黄花列当Orobanche pycnostachya、弯管列当Orobanche cernua、长齿列当Orobanche coelestis、淡黄列当Orobanche sordida、短齿列当Orobanche kelleri、短唇列当Orobanche major、多齿列当Orobanche uralensis、分枝列当Orobancheaegyptiaca、毛列当Orobanche caesia、美丽列当Orobanche amoena、丝毛列当Orobanche caryophyllacea和缢筒列当Orobanche kotschyi等。列当为拥有较多寄主的寄生草本植物,如:美丽列当寄生生于菊科蒿属和豆科的一些植物上;缢筒列当O.kotschyi寄生于蒿属和锈线菊属植物上;丝毛列当O.caryophyllacea寄生于拉拉藤属植物上;紫花列当O.coerulescens寄生于蒿属植物上;短唇列当O.major寄生于矢车菊属及蓝刺头属的一些植物上(张金兰,蒋青等,新疆寄生杂草菟丝子和列当的调查,植物检疫,1995,4:205-208)。
列当属部分植物在我国民间作为药用已有久远的历史,如列当和弯管列当,以全草入药,具有补肾壮阳、强筋壮骨之功效,用于腰膝冷痛、阳萎、遗精、肝炎等病症的治疗。列当(别名花苁蓉、独根草、兔子拐棒等,蒙药称之为:特莫根-素勒-乌布斯),来源于列当科列当属Orobanche植物紫花列当O.coerulescens或黄花列当O.pycnostachya一年生寄生草本植物,生长于沙丘、干草原、砾石沙地和戈壁,在我国北方各地均有分布。该药材,性温、味甘,具有补肾,强筋之功效,收载于《开宝本草》、《唐本草》、《东北药用植物志》、《陕西中药志》等历代医药文献中,民间用于肾虚、腰膝冷痛、阳痿遗精、神经官能症等疾病的治疗。文献报道该植物主要含多糖及苯乙醇苷类成分等(如:马凤霞,赵权等.列当多糖的提取与组成分析,特产研究,2003,8:243-44;Lin,L.C.,Chiou W.F.,et al.Phenylpropano idglycosides from Orobanche caerulescens.Planta Med,2004,70(1):50-52)。欧亚列当水提物具有抗衰老、抗疲劳、改善脑组织循环、增强免疫和雄激素样作用(刘东春等,欧亚列当提取物抗脂质过氧化作用的研究,沈阳药科大学报,2001,18(3):204-206;刘东春等,欧亚列当提取物的药效学研究,中药材,2000,23(6):341-343)。
目前,国内外对列当科植物的化学成分及药理作用的研究报道主要集中于肉苁蓉属和草苁蓉属植物上,而对列当属植物研究报道较少;迄今为止未见有列当提取物及制备方法和用途的相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种列当提取物、列当多糖或列当总苷,是以水或甲醇或乙醇为提取溶剂,采用煎煮或回流或渗漉或浸渍或超声的方法制成,所述列当提取物、列当多糖或列当总苷作为制备在预防和治疗疾病方面的用途。为进一步对植物列当的利用提供了新的途径和用途。
本发明所述的一种列当提取物、列当多糖或列当总苷,是以水或甲醇或乙醇为提取溶剂,采用煎煮或回流或渗漉或浸渍或超声的方法制成,其中列当提取物为苯乙醇苷、多糖和酚酸及酚苷类化合物;列当总苷为类叶升麻苷、异类叶升麻苷、Crenatoside、Cistanoside F和1′-O-Sinapoylglucose。
所述的列当提取物、列当多糖或列当总苷的制备方法,按下列步骤进行:
a、选取干净的列当并粉碎成粗粉,过20目筛,或粉碎至2—5厘米的段作为加工原料,以4-20倍浓度0-100%的乙醇或甲醇为提取溶剂,采用煎煮或回流或渗漉或浸渍或超声的方法进行提取1-3次;
b、将步骤a中提取液过滤或离心除去不溶性杂质,浓缩,干燥后得列当提取物;
c、将步骤b得到的列当提取物,用水溶解后,通过大孔吸附树脂柱,先用5-15倍浓度为0—15%的乙醇或0—10%的甲醇洗脱除去部分杂质,再用5-20倍浓度为20-50%甲醇或乙醇或10-40%丙酮水溶液洗脱,收集洗脱液;
d、将步骤c洗脱液,浓缩、干燥后,得到列当总苷;
e、或将步骤a的加工原料,以水为提取溶剂,采用中煎煮或回流或超声的方法进行提取1-3次,浓缩至相对密度为1.05-1.2,加入3-5倍量的95%乙醇,放置,过滤,收集不溶物,得到列当多糖;
f、或将步骤a的加工原料,以80%—100%的乙醇或甲醇为提取溶剂,采用回流或渗漉或浸渍或超声的方法进行提取1-3次,将其残渣取出干燥至无醇味,用4-20倍水回流提取0.5-2小时,提取次数1-3次,再将水提取液合并浓缩至相对密度为1.05-1.2,加入3-5倍量的95%乙醇,放置,过滤,收集不溶物,得到列当多糖。
所述的列当植物为列当科列当属植物,包含紫花列当、黄花列当、弯管列当、长齿列当、淡黄列当、短齿列当、短唇列当、多齿列当、分枝列当、毛列当、美丽列当、向日葵列当或丝毛列当。
所述的列当总苷的制备方法,所用的大孔树脂为AB-8、D101、D201或HPD600型号聚苯乙烯型多孔性吸附树脂。
所述的列当提取物和列当总苷作为制备治疗在抗氧化的药物的用途。
所述的列当提取物和列当总苷作为制备治疗在抗疲劳的药物的用途。
所述的当提取物和列当总苷作为制备治疗在抗老年痴呆的药物的用途。
所述的列当提取物和列当总苷作为制备治疗在保肝的药物的用途。
所述的列当提取物和列当总多糖作为制备治疗在便秘中的药物的用途。
本发明所述的列当提取物、列当总苷和列当多糖及其制备方法和用途,根据文献所报道的列当在民间药用情况,将本发明所获得的列当提取物及列当总苷做进一步的抗氧化、抗疲劳、抗老年痴呆、抗肝炎等药效学实验,阐述列当提取物在预防和治疗疾病方面的应用。
以下将本发明的发明原理以及产品性能检测结果做一详细解释,来说明本发明比现有技术优异之处。
(1)、本发明方法采用大孔树脂富集有效部位具有提取效率高、工艺设备简单和生产成本低等优点。大孔吸附树脂为吸附性和分子筛原理相结合的分离材料,其本身是由苯乙烯、二苯乙烯或甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子网状孔穴结构,在水溶液中吸附能力较强且具有良好的选择性。该分离材料对天然有效成分不仅具有较好的选择性,而且还有较好的浓缩能力,在吸附列当有效部位列当总苷的同时除去杂质。
(2)、本发明方法所使用的大孔吸附树脂为国产AB-8、D101、D201、HPD600等型号。
(3)、本发明方法所制备的列当提取物,其总苷含量为3-30%,多糖含量为0-20%。
(4)、本发明方法所制备的列当提取物进一步纯化所得的列当总苷,其中所含苯乙醇苷含量不小于30%。
具体实施方式
为了更好理解本发明,下面采用列表的方式结合实例来进一步说明,但本发明的内容并不局限于此。
实施例1—16制备列当提取物
实施例1选取干净的紫花列当药材1kg粉碎成粗粉,过20目筛,以4倍水为提取溶剂,煎煮提取1次,时间2小时,将提取液过滤除去不溶性杂质,浓缩,干燥后即得列当提取物,收率为26.1%,总苷含量6%。
实施例2或选取干净的紫花列当药材1kg切至小于5厘米的段,以12倍量的30%乙醇回流提取2次,每次60分钟,合并提取液,将提取液离心除去不溶性杂质,浓缩,干燥后即得列当提取物,收率为28.9%,总苷含量8.9%。
实施例17—81为制备列当总苷
实施例24
选取干净的分枝列当药材1kg并粉碎粒度小于5cm粗粉,以20倍水为提取溶剂,采用超声提取三次次,每次1小时;
将提取液过滤除去不溶性杂质,浓缩,真空干燥后得列当提取物;
将提取物,用水溶解后,上D101大孔吸附树脂柱,先用20倍去离子水洗脱除去部分杂质,再用5倍柱体积的浓度为50%乙醇洗脱,收集洗脱液;
将洗脱液,减压浓缩、喷雾干燥后,得到列当总苷77.8%。
实施例78
选取干净的弯管列当药材1kg,粉碎,过20目筛,以10倍量95%乙醇渗漉提取48小时,合并提取液,将提取液离心除去不溶性杂质,浓缩至浸膏,真空干燥后得列当提取物;
将提取物加水混悬,上HPD-600大孔吸附树脂,先用18倍量去离子水洗脱除杂,再用5倍柱体积的浓度为25%甲醇洗脱,洗脱液减压浓缩,真空干燥,得到列当总苷,其含量为68.0%。
Figure G2008100730210D00062
Figure G2008100730210D00071
Figure G2008100730210D00081
实施例82—94为列当多糖
实施例83
选取干净的黄花列当药材1kg切至5厘米的段,以10倍水回流2次,时间每次1小时,合并提取液,过滤除去不溶性杂质,浓缩,干燥后得列当提取物;
将提取物以水为提取溶剂,回流提取2次,浓缩至相对密度为1.05,加入5倍量的95%乙醇,放置24小时,过滤,收集不溶物,得到列当多糖含量59.1%。
实施例85
选取干净的弯管列当药材1kg粉碎过20目筛,以15倍量的水超声提取2次,每次30分钟,合并提取液,离心,将离心上清液浓缩至相对密度为1.1,加入3倍量的95%乙醇,放置36小时,过滤,收集不溶物,得列当多糖,含量43.7%。
 
序号 药材 提取溶剂 分离纯化醇沉倍数 列当多糖(%)
82 紫花列当 水(回流) 3 61.0
83 黄花列当 水(回流) 5 59.1
84 分枝列当 水(超声) 3 24.9
85 弯管列当 水(超声) 4 43.7
实施例86
选取干净的紫花列当药材1kg粉碎过20目筛,以10倍量的95%乙醇回流提取1次,时间1小时,过滤,将其残渣取出干燥至无醇味,再用15倍水回流提取1次,时间0.5小时;
将提取液浓缩至相对密度为1.12,加入3倍量的95%乙醇,放置,过滤,收集不溶物,得列当多糖,多糖含量为69.0%。
实施例87
选取干净的黄花列当药材1kg粉碎过20目筛,以15倍量的95%乙醇回流提取1小时,时间30分钟,过滤,将其残渣取出干燥至无醇味,再用10倍水超声提取2次,每次25分钟;
将水提取液合并后,浓缩至相对密度为1.2,加入4倍量的95%乙醇,放置,过滤,收集不溶物,得列当多糖,多糖含量为52.8%。
实施例95
为了表征本发明列当提取物及列当总苷的抗氧化作用,采用DPPH自由基清除试验对列当提取物和列当总苷进行抗氧化能力的测定。
按文献报道,采用分光光度测定法:向2.5mL 6.5×10-5mol/LDPPH自由基溶液中加人0.5mL试样(空白对照用等量超纯水代替),总体积3ml,混匀,室温下放置15min后于光径1cm比色皿中测定DPPH自由基混合溶液在517nm处吸光值。每一吸光度平行测3次,取其平均值,清除率按下式计算:清除率%=[1—(Ai—Aj)/Ao]×100%。其中,Ao为2.5mL6.5×10-5mol/L DPPH自由基乙醇溶液与0.5mL超纯水混合液在517nm处吸光值;Ai为2.5mL6.5×10-5mol/L DPPH自由基乙醇溶液与0.5mL试样混合液在517nm处吸光值,Aj为2.5ml乙醇与0.5mL试样混合液在517nm处吸光值。抗氧化剂清除DPPH自由基能力采用清除的IC50值表示。将待测样品配制成系列溶液,测定待测样品浓度与DPPH自由基清除率,并绘制DPPH自由基清除率对样品浓度曲线,由曲线读取或用方程计算出DPPH自由基清除率为50%时所需样品浓度(C50),计算出样品溶液中溶质质量,按式(2)计算IC50″值。重复测定2次,平均值即为测定结果。因此,IC50值的物理意义为:当达到50%清除率时,单位质量抗氧化剂所清除DPPH自由基的质量。IC50值越高,抗氧化剂的自由基清除能力越强。(IC50″值=50%×加入DPPH·质量/加入样品溶液中溶质质量)
表1  列当提取物清除DPPH·自由基的能力
Figure G2008100730210D00111
表2  列当总苷清除DPPH·自由基的能力
Figure G2008100730210D00112
抗氧化试验结果显示,列当总苷浓度在50μg/ml,其清除率可达到91.2%,IC50值为25.7μg/ml,具在有一定的抗氧化能力,而列当提取物抗氧化活性较弱。
实施例96
为了表征本发明列当总苷的抗疲劳作用,将本发明制备的列当总苷进行对小鼠地抗疲劳试验。
将小鼠分为4组:对照组(蒸馏水)、列当总苷(低剂量组50mg/kg.bw、中剂量组150mg/kg.bw、高剂量组300mg/kg),分别给药;样品于灌胃前临用配置,小鼠每日灌胃量为0.4mg/20mg,连续灌胃21天。
1 实验方法及观察指标:
1.1 小鼠负重游泳试验小鼠末次灌胃30分钟后,按“程序”规定在水深30cm,水温25±0.5℃的游泳箱进行负重5%的游泳试验,记录小鼠自入水至力竭死亡的游泳时间。
1.2 血尿素氮含量小鼠末次灌胃30分钟后,按“程序”规定在水温为30±0.5℃的水中游泳90分钟,采血,测定血尿素氮含量。
1.3 肝糖原含量小鼠末次灌胃30分钟后,按“程序”规定在水温为30±0.5℃的水中游泳90分钟,立即处死,取肝,测定肝糖原含量。
1.4 统计学分析:使用SPSS12.0软件包采用ANOVA,LSR进行统计分析,结果以x±s表示。
2 实验结果
2.1 对小鼠游泳耐力的影响结果显示,与对照组比较,低、中、三个剂量组的小鼠游泳时间明显延长,并有显著差异(P<0.05),该结果表明高剂量的列当总苷对小鼠游泳耐力有明显增强作用。
2.2 对小鼠血尿素氮的影响与对照组相比,高剂量组小鼠运动后血尿素氮显著降低,并有统计学上的显著性差异,说明高剂量组小鼠对剧烈负荷的适应能力增强。
2.2列当总苷对小鼠肝糖元储备的影响与对照组相比,三个剂量组小鼠运动后肝糖元储备水平明显高于对照组,统计学上有显著性差异(P<0.05),表明三个剂量组小鼠运动后糖原储备丰富,列当提取物有改善代谢的作用。
表3  列当总苷对小鼠负重游泳时间、血清尿素和肝糖原的影响(x±s,n=10)
Figure G2008100730210D00121
注:与对照组相比较,*P<0.05,**P<0.01。
本实例的实验结果表明,与对照组相比,高剂量组的列当总苷对增强小鼠游泳耐力有显著作用,对血尿素氮水平有显著降低作用,三个剂量组的列当总苷对作为能量的糖原储备有显著提高作用。
实施例97
根为了表征本发明制备的列当总苷的抗老年痴呆作用,测定了本发明方法所得到的列当总苷对东莨菪碱所致小鼠记忆获得性障碍模型的影响
1 实验材料
昆明种雄性小鼠72只,体重18-22g,动物在恒温(21-23),恒湿(45-65%),人工昼夜,普通饲料喂养,自由饮水。随机分为6组,即对照组,模型组,列当总苷(低剂量组50mg/kg.bw、中剂量组150mg/kg.bw、高剂量组300mg/kg.bw),对照组与模型组给予等量的生理盐水,10分钟后进行记忆测验,采用跳台法和水迷宫法测试小鼠学习记忆情况。
2 实验方法及观察指标。
2.1 跳台法:将各组小鼠分别放入小鼠跳台仪上,先适应电压环境3分钟,然后以36V连续电刺激5分钟,小鼠受到电击后的正常逃避反应为跳上橡皮台,记录5min内动物跳下橡皮台的次数作为训练期错误次数。训练时平行操作。24小时后重新记录,记录小鼠第一次跳下时间(潜伏期),记录5分钟内跳下次数(即错误次数),并作为记忆指标。
2.2 水迷宫法:将小鼠Y型水迷路箱中水温维持为25-27℃,水深约1厘米。将各组小鼠分别分组放入水迷路中进行训练,训练时将小鼠从长臂端尾对Y型叉口轻轻放入水面以其在15秒内抵达平台为正确反应,小鼠抵达平台后休息15秒再重复训练,连接训练6次。记录小鼠从入水到抵达平台游出时间及正确反应次数。24小时后测试其记忆保持情况,48小时后测试记忆巩固情况。
3 结果
3.1 跳台法试验结果模型对照组小鼠跳台潜伏期显著缩短,错误次数显著增加;而列当总苷给药组均能使小鼠跳台潜伏期显著延长,明显减少小鼠跳台错误次数。
表4  各组小鼠跳台法试验测定结果(x±s,n=10)
注:与对照组相比较,*P<0.05。
3.2 水迷宫法试验结果连续三天的水迷宫试验发现:列当总苷各剂量组造模小鼠游迷宫所需时间明显少于模型组(P<0.05或P<0.01),模型组与正常老龄对照组比较,前者小鼠游迷宫所需时间明显高于后者(P<0.01)。
表5  各组小鼠水迷宫法测定结果(x±s,n=10)
Figure G2008100730210D00142
注:与对照组相比较,*P<0.05,**P<0.01。
结论:列当总苷给药组的潜伏期明显延长,错误次数减少,有助于提高正确反应次数,表现出对记忆功能的保护作用。
实施例98(保肝作用)
为了表征本发明制备的列当总苷在保肝护肝方面的应用,本发明进行了如下的药效学实验。
采用卡介苗(BCG)整体致敏,脂多糖(LPS)离体攻击法建立了大鼠原代肝细胞免疫损伤模型,研究列当总苷在体外对大鼠免疫性肝损伤的治疗作用。经尾静脉注射BCG 8mg/ml致敏大鼠12天后,采用两步灌流法取肝细胞,接种肝细胞与24孔板16小时后,加入10mg/l的LPS攻击,同时给予列当总苷进行干预,分别于3、6、12和24小时取细胞上清液,测定其丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬门氨酸氨基转移酶(AST)的活性,结果见表1、2。
表1  列当总苷对BCG+LPS引起的大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清ALT活力的影响(x±s,n=6)
Figure G2008100730210D00151
注:与Control比较,a)P<0.01;与BCG+LPS比较,b)P<0.01,c)P<0.05;
与同组低剂量比较,d)P<0.01,e)P<0.05;与同组中剂量比较,f)P<0.05。
表2  列当总苷对BCG+LPS引起的大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清AST活力的影响(x±s,n=6)
Figure G2008100730210D00152
注:与Control比较,a)P<0.01;与BCG+LPS比较,b)P<0.01;
与同组低剂量比较,c)P<0.01,d)P<0.05;与同组中剂量比较,e)P<0.05。
结果显示列当总苷具有较为显著的保肝作用:正常大鼠肝细胞上清AST和ALT活力随时间的延长变化不大;与正常对照组比较,BCG+LPS损伤后模型组大鼠肝细胞上清AST和ALT活力随时间的延长逐步升高,在12h明显升高,24h虽有所下降,但仍显著高于正常对照组,说明肝损伤细胞模型建立成功;溶剂对照组与模型组比较无显著性差异。除3h低、中剂量组AST未显著降低外,阳性对照药物DDB在各时间点均可显著降低AST和ALT水平,且在6和12h存在显著的剂量反应关系。而列当总苷各剂量组在6、12和24h均可不同程度地使升高的AST和ALT下降,其作用与阳性对照药物DDB相似;列当总苷高剂量组在3h可显著降低AST,并与低剂量组间存在显著差异,列当总苷各剂量组在3h均可显著降低ALT。
实施例99(列当多糖治疗便秘作用)
为了表征本发明列当多糖的治疗便秘作用,将本发明制备的列当多糖进行对燥结便秘模型小鼠的通便作用试验。
取小鼠60只,体重(20±3)g,其中12只作为正常对照组,常规饲养。其余48只造模,禁水仅用大米喂养3d,小鼠出现小便赤黄,大便干结呈圆珠或串珠状,体重减轻,说明造模成功。实验前各组小鼠均禁食禁水12h,将造模成功的48只小鼠随机分成4组:便秘模型组和列当多糖高、中、低(4.0、2.0、1g·kg)剂量组。按试验方案每天给药1次,连续给予7d。,末次给药时,空白对照组和模型对照组灌胃等量蒸馏水,所给药液及水中均含有2%墨汁。给药后连续观察5h,记录小鼠第一次排黑便时间、粪便粒数及称干粪重量,比较各组动物上述指标的差异。
表  对燥结便秘模型小鼠排便的影响
Figure G2008100730210D00161
结果如表所示:模型组小鼠第一次排除黑便时间较正常动物明显增加P<0.05),排便重量较正常组动物明显减少(P<0.05),说明模型复制成功。列当多糖组使燥结模型小鼠的第一次排便时间明显缩短,粪便重量明显增加,且高、中、低剂量组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05),提示该药对燥结型便秘小鼠具有良好的促进排便作用。

Claims (1)

1.一种列当总苷在制备抗老年痴呆的药物中的应用,其特征在于列当总苷为列当科列当属植物,包含紫花列当、黄花列当、弯管列当、长齿列当、淡黄列当、短齿列当、短唇列当、多齿列当、分枝列当、毛列当、美丽列当、向日葵列当、缢筒列当或丝毛列当,具体操作按下列步骤进行:
a、选取干净的列当并粉碎成粗粉,过20目筛,或粉碎至2-5厘米的段作为加工原料,以4-20倍浓度0-100%的乙醇或甲醇为提取溶剂,采用煎煮或回流或渗漉或浸渍或超声的方法进行提取1-3次;
b、将步骤a中提取液过滤或离心除去不溶性杂质,浓缩,干燥后得列当提取物;
c、将步骤b得到的列当提取物,用水溶解后,通过大孔吸附树脂柱为AB-8、D101、D201或HPD600型聚苯乙烯型多孔性吸附树脂,先用5-15倍浓度为0-15%的乙醇或0-10%的甲醇洗脱除去部分杂质,再用5-20倍浓度为20-50%甲醇或乙醇或10-40%丙酮水溶液洗脱,收集洗脱液;
d、将步骤c洗脱液,浓缩、干燥后,得到列当总苷。
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