CN103524574B - 一种从列当科植物中制备类叶升麻苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从列当科植物中制备类叶升麻苷的方法，该方法是以含类叶升麻苷的植物为原料，经酸性溶剂提取、大孔树脂分离，替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料纯化，冷冻干燥得到高纯度的类叶升麻苷。本发明制备的类叶升麻苷纯度可达90%以上，收率高、分离工艺简便，处理量大；同时采用酸性溶剂，提高了产品的稳定性，以替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料为纯化材料，大大降低了生产成本，为扩大其应用提供了技术支撑。

Description

一种从列当科植物中制备类叶升麻苷的方法

技术领域

本发明涉及植物提取及分离纯化的方法，具体说是采用经济、简便的方法从列当植物中制备得到高纯度的类叶升麻苷的方法。

背景技术

类叶升麻苷是列当科植物的代表成分之一，具有抗老年痴呆，调节免疫、抗炎、抑制肿瘤生长、抗病毒和抗菌等广泛的药理学活性； 对其进行深入的研究及利用具有广泛的开发价值。

列当植物有13属180种，主产于亚欧大陆，其中列当属最大，包含140种，本发明所涉及的列当属Orobanche植物在我国有20多种，如紫花列当Orobanche coerulescens、黄花列当Orobanche pycnostachya、弯管列当Orobanche cernua、长齿列当Orobanche coelestis、淡黄列当Orobanche sordida、短齿列当Orobanche kelleri、短唇列当Orobanche major、多齿列当Orobanche uralensis、分枝列当Orobanche aegyptiaca、毛列当Orobanche caesia、美丽列当Orobanche amoena、丝毛列当Orobanche caryophyllacea和缢筒列当Orobanche kotschyi等。列当中含有大量的苯乙醇苷类化合物及多糖，主要功效有抗氧化、抗疲劳、抗老年痴呆、保肝及治疗便秘（列当总苷在制备抗老年痴呆的药物中的应用，ZL200810073021.0）；本发明在此基础上改进工艺，根据类叶升麻苷化学结构特点，含多个酚羟基，在弱酸性条件下较稳定，故在提取工艺中，适当调节了溶剂的pH值，确保类叶升麻苷在提取过程中不被破坏，从而提高提取效率，使其达到最大溶出。并采用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料作为纯化材料，该填料吸附量高，颗粒均匀，机械强度好，不易破碎，残留物少，预处理方便；可以替代ODS-C18键合硅球固定相、聚酰胺及葡聚糖凝胶等，用于反相色谱法分离，具有更高的化学稳定性，可以在强酸、强碱介质下使用，可以用多种有机溶剂作为洗脱剂，可以在较高的浓度下使用，寿命非常长；同时它与相同粒径的C18固定相的柱效相当，无论对极性或非极性样品，几乎无不可逆吸附；关键是该填料的价格是C18反相填料、葡聚糖凝胶的六分之一，大大节约了生产成本，适合工业化生产。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中从列当植物中制备天然类叶升麻苷成本高、收率的低的缺陷，提供一种经济、简便，收率高，适合大生产的一种从列当科植物中制备类叶升麻苷的方法，该方法是以含类叶升麻苷的植物为原料，经酸性溶剂提取、大孔树脂分离，替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料纯化，冷冻干燥得到高纯度的类叶升麻苷。本发明制备的类叶升麻苷纯度可达90%以上，收率高、分离工艺简便，处理量大；同时采用酸性溶剂，提高了产品的稳定性，以替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料为纯化材料，大大降低了生产成本，为扩大其应用提供了技术支撑。

本发明所述的一种从列当科植物中制备类叶升麻苷的方法，按下列步骤进行：

a、以列当科植物为原料，粉碎成粗粉，过20-40目药筛，采用提取溶剂为质量浓度10－95％乙醇水溶液或水溶液提取2-4次，每次提取1-4小时，提取温度40－100℃，合并提取液，在温度为40-60℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物；

b、再将步骤a得到的总粗提物用质量浓度为10-60%乙醇水溶液溶解，通过大孔树脂吸附，再用质量浓度为40-70%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含类叶升麻苷有效部位，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为50-89.9%；

c、将步骤b得到的含类叶升麻苷的有效部位，含体积分数为1%醋酸的水溶液或质量浓度为10—40%的含体积分数为1%醋酸的甲醇水溶液溶解，用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料吸附后，用质量浓度为20-70%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

d、将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为90-99.9%。

步骤a中提取溶剂的pH值为1.5-6.5，列当科植物原料与提取溶剂质量比为1:5-1:20。

步骤b中所用的大孔树脂为AB-8、D101、D201、HP-20、HPD100或HPD600型号聚苯乙烯型多孔性吸附树脂。

本发明所述的一种从列当科植物中制备类叶升麻苷的方法，该方法中所述的列当植物为列当科列当属植物，包括紫花列当、黄花列当、弯管列当、长齿列当、淡黄列当、短齿列当、短唇列当、多齿列当、分枝列当、毛列当、美丽列当、丝毛列当或缢筒列当。

附图说明

图1为本发明类叶升麻苷样品及对照品TLC图，其中1、13为类叶升麻苷对照品；2为空白对照；3—12分别为样品a—j；

图2为本发明类叶升麻苷样品及对照品HPLC色谱图，其中1为类叶升麻苷对照品；2为空白对照；3—12分别为样品a—j。

具体实施例

实施例1

以紫花列当植物为原料，粉碎成粗粉，过20目药筛，用提取溶剂质量浓度95%乙醇水溶液提取3次，每次提取1小时，提取溶剂的pH值为3，原料与提取溶剂质量比为1:5，提取温度50℃，合并提取液，在温度为60℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物；

再将总粗提物用10%质量浓度的乙醇溶解，通过AB-8型大孔树脂吸附，用70%质量浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含类叶升麻苷的有效部位，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为50%，收率为92.4%；

将得到的含类叶升麻苷的有效部位，用含体积分数为1%的醋酸的30%质量浓度为甲醇水溶液溶解，用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料吸附后，用质量浓度20%甲醇水溶液洗脱；

收集洗脱液；将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为92.4%，收率80.2%（样品编号为a）。

实施例2

以黄花列当植物为原料，粉碎成粗粉，过40目药筛，用提取溶剂为质量浓度60%乙醇水溶液提取2次，每次提取4小时，提取溶剂的pH值为5，原料与提取溶剂质量比为1:15，提取温度80℃，合并提取液，在温度为60℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物；

再将总粗提物用质量浓度60%乙醇溶解，通过D101型大孔树脂吸附，用质量浓度50%乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含类叶升麻苷的有效部位，以干品重量计算类叶升麻苷含量为62.3%，收率为87.1%；

将得到的含类叶升麻苷的有效部位，用含体积分数为1%的醋酸的10%质量浓度甲醇水溶液溶解，再用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料吸附后，用质量浓度60%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为94.1%，收率83.2%（样品编号为b）。

实施例3

以短齿列当植物为原料，粉碎成粗粉，过30目药筛，用提取溶剂为水溶液提取4次，每次提取2小时，提取溶剂的pH值为4，原料与提取溶剂质量比为1:10，提取温度100℃，合并提取液，在温度为50℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物；

再将总粗提物用质量浓度20%乙醇溶解，通过D201型大孔树脂吸附，用质量浓度40%乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含类叶升麻苷的有效部位，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为70.6%，收率88.2%；

将得到的含类叶升麻苷的有效部位，用含体积分数为1%醋酸的水溶液溶解，用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料吸附后，用质量浓度70%甲醇洗脱，收集洗脱液；

将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为96.2%，收率69.3%（样品编号为c）。

实施例4

以美丽列当植物为原料，粉碎成粗粉，过20目药筛，用提取溶剂为质量浓度30%乙醇水溶液提取2次，每次提取3小时，提取溶剂的pH值为6.5，原料与提取溶剂质量比为1:15，提取温度60℃，合并提取液，在温度为40℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物；

再将总粗提物用质量浓度40%乙醇水溶液溶解，通HP-20型过大孔树脂吸附，用质量浓度60%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含类叶升麻苷的有效部位，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为89.9%，收率82.9%；

将得到的含类叶升麻苷的有效部位， 用含体积分数为1%的醋酸的40%质量浓度的甲醇水溶液溶解，用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料吸附后，用质量浓度70%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为99.9%，收率63.7%（样品编号为d）。

实施例5

以分枝列当植物为原料，粉碎成粗粉，过40目药筛，用提取溶剂为质量浓度70%乙醇水溶液提取3次，每次提取1小时，提取溶剂的pH值为1.5，原料与提取溶剂质量比为1:20，提取温度40℃，合并提取液，在温度为55℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物；

再将总粗提物用质量浓度50%乙醇水溶液溶解，通过HPD100型大孔树脂吸附，用质量浓度65%乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含类叶升麻苷的有效部位，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为78.5%，收率82.4%；

将得到的含类叶升麻苷的有效部位，用含体积分数为1%的醋酸的35%质量浓度的甲醇水溶液溶解，再用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料吸附后，用质量浓度50%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为94.5%，收率81.9%（样品编号为e）。

实施例6

以弯管列当植物为原料，粉碎成粗粉，过30目药筛，用提取溶剂质量浓度50%乙醇水溶液提取4次，每次提取1小时，提取溶剂的pH值为2.0，原料与提取溶剂质量比为1:5，提取温度70℃，合并提取液，在温度为45℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物；

再将总粗提物用质量浓度30%乙醇溶解，通过HPD600型大孔树脂吸附，用质量浓度50%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含类叶升麻苷的有效部位，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为57.8%，收率为91.7%；

将得到的含类叶升麻苷的有效部位，用含体积分数为1%的醋酸的质量浓度25%甲醇水溶液溶解，再用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料吸附后，用质量浓度4 0%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为95.8%，收率79.4%（样品编号为f）。

实施例7

    以毛列当植物为原料，粉碎成粗粉，过20目药筛，用提取溶剂质量浓度70%乙醇水溶液提取2次，每次提取1.5小时，提取溶剂的pH值为4.0，原料与提取溶剂质量比为1:10，提取温度90℃，合并提取液，在温度为45℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物，进行含量测定，类叶升麻苷含量为4.5%，干浸膏得率22.3%；

将得到的总粗提物用质量浓度20%乙醇水溶液溶解，通过AB-8大孔树脂吸附，用质量浓度的60%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含类叶升麻苷的有效部位，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为55.6%，收率89%；

将得到的含类叶升麻苷的有效部位，用含体积分数为1%的醋酸水溶液液溶解，再用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料吸附后，用质量浓度60%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为93.5%，得率81.2%(样品编号为g）。

实施例8

以毛列当植物为原料，粉碎成粗粉，过20目药筛，用提取溶剂为质量浓度70%乙醇水溶液提取2次，每次提取1.5小时，不改变溶液pH值（溶剂pH值为6.8），原料与提取溶剂质量比为1:10，提取温度90℃，合并提取液，在温度为45℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物；进行含量测定，类叶升麻苷含量为3.2%，干浸膏得率21.5%；

将得到的含类叶升麻苷的有效部位，用含1%醋酸水溶液液溶解，用葡聚糖凝胶填料吸附后，用质量浓度60%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为92.9%，得率80.8%(样品编号为h）；

将实施例7与实施例8进行比较，结果提取溶剂在酸性条件下，类叶升麻苷的提取量远大于不改变pH值的提取溶剂，且类叶升麻苷在酸性条件下的稳定性较高；此外分别采用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料和葡聚糖凝胶填料进行纯化，最终制备得到的类叶升麻苷含量及收率的水平基本一致，表明本发明中所采用的替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料完全能够代替葡聚糖凝胶填料，在保证收率的前提下，大大节约了生产成本。

实施例9

以长齿列当植物为原料，粉碎成粗粉，过30目药筛，用提取溶剂质量浓度70%乙醇水溶液提取3次，每次提取1小时，提取溶剂的pH值为5.0，原料与提取溶剂质量比为1:8，提取温度80℃，合并提取液，在温度为40℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物；

再将总粗提物用质量浓度45%乙醇水溶液溶解，通过HP-20大孔树脂吸附，用质量浓度的55%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含类叶升麻苷的有效部位，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为52.9%，收率92.6%；

将得到的含类叶升麻苷的有效部位，用含体积分数为1%的醋酸质量浓度为40%甲醇水溶液溶解，再用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料吸附后，用质量浓度70%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为91.9%，得率88.7%(样品编号为i）。

实施例10

以长齿列当植物为原料，粉碎成粗粉，过30目药筛，用提取溶剂质量浓度70%乙醇水溶液提取3次，每次提取1小时，提取溶剂的pH值为5.0，原料与提取溶剂质量比为1:8，提取温度80℃，合并提取液，在温度为40℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物；

再将总粗提物用质量浓度45%乙醇水溶液溶解，通过HP-20大孔树脂吸附，用质量浓度的55%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含类叶升麻苷的有效部位，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为52.9%，收率92.6%；

将得到的含类叶升麻苷的有效部位，用含体积分数为1%的醋酸质量浓度为40%甲醇水溶液溶解，再用C18反相填料吸附后，用质量浓度70%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为90.4%，得率85.8%(样品编号为j）；

将实施例9与实施例10比较：结果替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料制备得到的类叶升麻苷含量及收率均稍大于C18反相填料，能够提高产量，节约成本。

实施例11

实施例1至实施例10中所制备样品a—j，在制备过程中分别采用薄层色谱和液相色谱进行初步的定性和定量研究；进一步将制备得到的类叶升麻苷单体化合物通过核磁、质谱进行结构确认；

（1）薄层色谱法定性研究：

参考2010年版中国药典一部中126页肉苁蓉鉴别项下，分别取样品a—j，加甲醇溶解，制成每1ml含1mg的溶液，作为供试品溶液。另取类叶升麻苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录VIB）试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以甲醇-醋酸-水（2:1:7）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。选择该展开系统，层析斑点清晰，易重现，供试品色谱中，在与类叶升麻苷对照品色谱相应位置上，显相同的斑点，阴性对照无干扰，结果见图1；（2）HPLC法定性定量检测：

实施例中类叶升麻苷含量测定均采用高效液相色谱法（RT-HPLC法），色谱条件参照2010年版中国药典一部中126页肉苁蓉含量测定项下，选择330nm；以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.2%甲酸溶液为流动相B，按A：B为35：65进行等度洗脱，峰形较好，主峰理论塔板数、对称性等色谱参数符合要求，最终确定色谱条件如下：

色谱条件 色谱柱：BDS Hypersil C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱；检测波长：330nm；流动相：甲醇：0.2%甲酸水溶液（35:65）；流速：1.00ml/min；柱温：温度30℃，样品a—j色谱图见图2；

（3）结构鉴定：样品a-j经核磁鉴定，结果如下：

     样品a-j，均为淡黄色无定形粉末，1%三氯化铁水溶液反应呈蓝黑色；¹H NMR(CD₃OD，500MHz）δ:ester moiety(E):7.53(1H,d,J=16.0 Hz,E-H-7), 6.99(1H,d,J=2.0Hz, E-H-2),6.90(1H,dd,J=2.0,8.0Hz,E-H-6),6.72(1H,d,J=8.0Hz,E-H-5),6.21(1H,d,J=16.0Hz,E-H- 8);aglycone(A):6.63(1H,dd,J=2.0Hz,A-H-2),6.61(1H,dd,J=8.0Hz,A-H-5),6.50(1H,dd,J=2.0, 8.0Hz,A-H-6),2.73(2H,m,A-H-7);sugarmoiety;5.13(1H,brs, Rha-H-1),4.31(1H,d,J=7.5Hz, Glu- H-1),1.03(3H,d,J=6.0Hz,Rha-H-6);¹³C NMR(CD₃OD，125MHz）δ:131.47(C-A-1),116.51 (C-A-2),144.67(C-A-3),146.13(C-A-4),117.11(C-A-5),121.26(C-A-6),36.57(C-A-7),72.27(C-A- 8),127.7(C-E-1),114.7(C-E-2),146.8(C-E-3),149.8(C-E-4),116.3(C-E-5),123.2(C-E-6),148.0(C-E-7),115.2(C-E-8),168.3(CO),104.2(Glu-1),76.0(Glu-2),81.6(Glu-3),70.4(Glu4),76.2(Glu5),62.4(Glu-6),103.0(Rha-1),72.3(Rha-2),72.1(Rha-3),73.8(Rha-4),70.6(Rha-5),18.5(Rha-6)。以上波谱数据及理化特征与文献（Li YB,Li J,Li P,et al.Isolation and characterization of phenylethanoid glycosides from Clerodendron bunfei.Acta Pharm Sin,2005,40:722-727.）报道一致，故推断该化合物为类叶升麻苷（acteoside）。

Claims (1)

1.一种从列当科植物中制备类叶升麻苷的方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、以列当科植物为原料，粉碎成粗粉，过20-40目药筛，采用提取溶剂为质量浓度10－95％乙醇水溶液或水溶液提取2-4次，每次提取1-4小时，提取温度40－100℃，合并提取液，在温度为40-60℃条件下，真空浓缩至干品，得到总粗提物，其中提取溶剂的pH值为1.5-6.5，列当科植物原料与提取溶剂质量比为1:5-1:20；

b、再将步骤a得到的总粗提物用质量浓度为10-60%乙醇水溶液溶解，通过大孔树脂为AB-8、D101、D201、HP-20、HPD100或HPD600型号聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附，再用质量浓度为40-70%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含类叶升麻苷有效部位，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为50-89.9%；

c、将步骤b得到的含类叶升麻苷的有效部位，用含体积分数为1%醋酸的水溶液或质量浓度为10-40%的含体积分数为1%醋酸的甲醇水溶液溶解，用替代C18反相硅胶的SBC MCI GEL反相色谱填料吸附后，用质量浓度为20-70%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

d、将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得类叶升麻苷单体，以干品重量计算类叶升麻苷的含量为90-99.9%。