KR20130095246A

KR20130095246A - 아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도

Info

Publication number: KR20130095246A
Application number: KR1020137000895A
Authority: KR
Inventors: 항칭 린; 무환 수; 영밍 후앙; 징징 탕
Original assignee: 신파 티엔리 파머슈티컬 컴퍼니 리미티드 (항저우)
Priority date: 2010-06-16
Filing date: 2011-06-16
Publication date: 2013-08-27
Also published as: WO2011157059A1; KR101847501B1; US20120009131A1; CA2802441A1; EP2397144B1; TWI486162B; CA2802441C; CN106176778A; TW201200137A; CN103037868A; JP5968878B2; EP2397144A1; MY160878A; AU2011267724A1; AU2011267724B2; SG186717A1; JP2013528627A

Abstract

아밀로이드 β 펩타이드의 생산, 축적 또는 응집의 억제제로서 사용되는 아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 아밀로이드 β 펩타이드와 관련된 질환 또는 증상을 예방 또는 치료하는데 효과가 있다.

Description

아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도{Use of isoacteoside or pharmaceutically acceptable salt thereof}

본 발명은 일반적으로 아밀로이드 β 펩타이드(아밀로이드 β 펩타이드; Aβ) 관련 질환 또는 이상을 예방 또는 치료하는데 활성 성분의 용도 및 아밀로이드 베타 펩타이드의 형성, 축적 또는 응집을 억제하기 위한 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병은 39-43개 아미노산의 펩타이드의 축적과 관련이 있는 것으로 생각되며 이런 펩타이드는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 가수분해 생성물인 아밀로이드 β 펩타이드로 불린다. Aβ 중에서, Aβ1-40이 가장 풍부한 형태인 반면, Aβ1-42는 뉴런에 더욱 유독하며 매우 섬유소원성이며 알츠하이머병과 가장 관련있는 Aβ 형태로 생각된다. Aβ 모노머는 올리고머화를 통해 가용성 Aβ 올리고머를 형성할 수 있으며, 추가로 세포외적으로 불용성 원섬유 또는 노인성 반점을 형성할 수 있다.

Aβ-관련 질환 또는 이상은 다운증후군, 네덜란드형 아밀로이드 뇌혈관병증(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis(HCHWA) Dutch), 괌의 파킨슨 치매 복합증(Parkinson-dementia complex of Guam)(Clinical Neurology and Neurosurgery (1990) 92: 305-310); 대뇌 아밀로이드 맥관병증(Cerebral amyloid angiopathy)(J. Neuropath. Exp. Neuro. (2002) 61: 282-293); 봉입체 근염(inclusion body myositis)(Neurology (2006) 66: 65-68); 전두측두엽 치매(frontotemporal demetia)(Neuroreport (2002) 13-5: 719-723); 노인성 황반변성(age-related macular degeneration)(Experimental Eye Research (2004) 78: 243-256); 피크병(Pick's disease)(Neuroscience Letters (1994) 171: 63-66) 등을 포함한다고 일반적으로 생각된다.

기술된 대로 Aβ-관련 질환 또는 이상은 일반적으로 선천적 인자(예를 들어, 유전) 또는 후천적 인자(예를 들어, 노화 또는 환경 영향)에 의해 유발된 유기체들에 존재하는 Aβ 또는 Aβ 응집체의 비정상적인 양을 유도하는 Aβ의 형성, 축적 또는 응집과 관련이 있다.

Aβ의 형성, 축적 또는 응집의 억제는 알츠하이버병 또는 다른 Aβ-관련 질환 또는 이상을 효과적으로 예방 또는 치료하기 위한 접근법으로 사용될 수 있다고 일반적으로 생각된다.

Aβ 및 이의 응집체는 유기체에서 여러 질환 또는 이상을 일으킬 수 있기 때문에, 본 발명의 한 목적은 Aβ의 형성, 축적 또는 응집을 억제하기 위한 활성 성분을 제공하는 것이며 이런 활성 성분은 식품, 음료, 씹는 물질, 패치, 스킨 케어 제품 등에서 첨가제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 목적은 Aβ-관련 질환 또는 이상을 예방 또는 치료하기 위한 약물 및 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 성취하기 위해서, 본 발명은 Aβ의 형성, 축적 또는 응집의 억제 및 Aβ 관련 질환 또는 이상을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조에서 아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 개시한다.

바람직하게는, 상기 아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 학습 및 기억 능력을 유지, 개선 또는 회복하기 위해, 아밀로이드 β 펩타이드에 의해 유발된 뉴런 손상 또는 세포자멸사를 억제하기 위해 제공된다.

바람직하게는, 사람에 대한 상기 약물의 유효 복용량은 하루당 체중의 kg당 0.2mg 내지 4.0mg의 아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 동일하다.

본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징 및 이점을 잘 이해하기 위해서, 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 실시예들로부터 상세하게 아래 기술될 것이다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

도 1은 각 웰의 세포외 Aβ1-40의 백분율 수준을 도시하며, 결과는 본 발명의 검사 샘플 D(아이소액티오사이드)가 세포외 Aβ1-40 축적을 감소시키는데 현저한 활성을 가지는 것을 나타낸다.
도 2는 각 웰의 세포내 Aβ1-40의 백분율 수준을 도시한다.
도 3은 APP 발현에 대한 검사 샘플들의 효과를 도시한다.
도 4는 Aβ1-40 분해에 대한 검사 샘플들의 효과를 도시한다.
도 5는 Aβ1-40 올리고머화에 대한 검사 샘플들의 효과를 도시한다.
도 6은 Aβ의 형성, 제거 및 응집의 과정을 설명한다.
도 7은 동물 연구를 위한 실험 스케줄을 설명한다.
도 8은 쥐의 탐색 행동 수행에 대한 검사 샘플들의 효과를 도시한다.
도 9는 쥐의 수동적 회피 반응 수행에 대한 검사 샘플들의 효과를 도시한다.
도 10은 쥐의 수중 미로 공간 수행에 대한 검사 샘플들의 효과를 도시한다.
도 11은 쥐의 수중 미로 프로브 검사(water maze probe test performance) 수행에 대한 검사 샘플들의 효과를 도시한다.
도 12a-e는 쥐의 면역조직화학 염색 결과를 도시한다.
도 13a는 쥐의 뇌 피질 및 해파에서 아세틸콜린의 수준을 도시한다.
도 13b는 쥐의 뇌 피질 및 해파에서 콜린의 수준을 도시한다.
도 14a는 쥐의 뇌 피질에서 아세틸콜린분해효소(acetylcholinesterase)의 활성을 도시한다.
도 14b는 쥐의 뇌 해마에서 아세틸콜린분해효소의 활성을 도시한다.

Aβ에 의해 유발된 다양한 질환은 공통된 특징을 가진다: Aβ 응집체의 형성. 이런 Aβ 응집체는 원섬유 또는 반점과 같은 모양으로 존재하며 유기체의 시스템, 기관, 조직 또는 체액에 퇴적되어, 다양한 질환 또는 이상을 일으킨다. 따라서 Aβ 형성, 축적 또는 응집의 억제는 Aβ-관련 질환 또는 이상을 효과적으로 예방 또는 치료하기 위한 접근법으로 사용될 수 있다고 생각된다.

상기의 관점에서, 본 발명은 Aβ 형성, 축적 또는 응집, 특히 Aβ 세포외 형성, 축적 또는 응집의 억제(예를 들어, 감소 또는 예방)를 위한 활성 성분으로서 아래 도시된 구조를 가진 아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 사용하는 것을 개시한다.

미국특허 7,087,252 B2는 10-70중량%의 에키나코사이드 및 1-40 중량%의 액티오사이드를 포함하며, 관화육종용(Cistanche tubulosa(Shrenk) Wight)의 육질 줄기로부터 제조되며, 노인성 치매를 대비하기 위해 제공된 의약 제제를 개시한다. 아이소액티오사이드 및 다양한 다른 페닐에타노이드 글리코사이드는 의약 제제에 포함되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, 아이소액티오사이드의 수화물 또는 다른 용매화물, 프로드럭 또는 대사산물은 아이소액티오사이드의 기능성 등가물로 생각된다. 본 발명에 기술된 프로드럭은 가수분해, 산화 또는 다른 반응에 의해 생물학적 조건(인 비보 또는 인 비트로)하에서 아이소액티오사이드를 생산할 수 있는 전구체 화합물을 의미한다. 본 발명에 기술된 아이소액티오사이드의 대사산물은 세포 또는 유기체에서 아이소액티오사이드의 신진대사에 의해 생산될 수 있는 화합물을 의미한다.

아이소액티오사이드의 약학적으로 허용가능한 염이 개인에게 투여될 때, 약학적으로 허용가능한 염은 일반적으로 아이소액티오사이드와 동일한 또는 유사한 치료 효과를 제공하며 알레르기 등과 같은 나쁜 부작용을 일으키지 않고 생리학적으로 견딜 수 있다. 아이소액티오사이드의 약학적으로 허용가능한 염은 철, 칼슘 및 마그네슘 염 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용된 "예방하다"라는 용어는 유기체에서 질환 또는 이상의 발생을 피하거나 지연하는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용된 "치료하다"라는 용어는 질환 또는 이상의 진행을 늦추거나 멈추게 하고 또는 개인을 개선된 상태 또는 정상 상태로 되돌아가게 하는 것을 의미한다.

"아밀로이드 β 펩타이드(Aβ)-관련 질환 또는 이상"이란 용어는 일반적으로 Aβ의 형성, 축적 또는 응집과 관련하여 발생하는 질환 또는 이상을 의미하며, 특히 Aβ에 의해 유발되는 질환 또는 이상을 의미한다. 비정상적 형성, 축적 또는 응집이 특정 질환 또는 이상을 가진 개인들의 특정 부분에서 발견될 때, 질환 또는 이상은 Aβ와 관련이 있는 것으로 생각된다. 또한, Aβ가 특정 질환 또는 이상에서 영향을 받은 병리학적 특징들의 발생과 가까운 곳에서 응집할 때, 이 질환 또는 이상은 또한 Aβ와 관련이 있는 것으로 생각될 수 있다.

본 발명에 의해 제공된 Aβ 억제를 위한 활성 성분은 Aβ의 형성, 축적 또는 응집을 억제하는 사용을 수월하게 하도록, 식품, 음료 등에 첨가제로서 사용될 수 있다.

활성 성분으로서 아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 본 발명에 의해 제공된 Aβ-관련 질환 또는 이상을 치료하기 위한 약물 또는 약학적 조성물은 적절한 담체, 희석제 또는 부형제 등을 포함할 수 있고 분말, 과립, 정제, 트로키, 알약, 캡슐, 수성 또는 유성 용액, 현탁액, 크림, 연고, 겔, 에어로졸, 좌약, 패치 또는 임의의 다른 바람직한 형태로 존재할 수 있다. 상기한 약물 또는 약학적 조합은 경구, 국소, 비경구, 피부, 비강, 눈, 안내, 또는 다른 경로를 통해 투여될 수 있다.

내용에서, "또는"이란 용어는 달리 명시하지 않는 한 일반적으로 "및/또는"으로 정의된다.

인구의 노령화와 함께, 노령화와 관련이 있는 치매는 노인성 질환과 관련된 현재의 의학 연구에서 주요 관심사들의 하나가 되었다. 알츠하이머병은 가장 일반적인 형태의 치매이다.

알츠하이머병은 만성 진행성 신경퇴행성병이며, 환자가 점차적으로 인식 능력을 상실하며 비정상적 행동을 보이며, 언어 및 운동 능력의 일어날 수 있는 손실이 이어지는 것을 특징으로 하며, 따라서 알츠하이머병은 환자 및 남자 환자/여자 환자 가족의 삶의 질에 큰 영향을 쉽게 미칠 수 있다. 알츠하이머병을 앓고 있는 환자의 수가 점차적으로 증가하여, 환자 가족 및 사회에 심각한 부담을 유발시키는 경향을 고려하여, 본 발명은 실험을 실행하기 위해 알츠하이머병과 더욱 관련된 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)를 선택한다.

다음 실시예에서 표 1에 나열된 검사 샘플은 Aβ 실험을 실행하기 위해 사용되었고, Aβ 실험은 임의의 검사 샘플이 첨가되지 않은 부형제 대조군(Vehicle control group)과 비교되었다.

검사 샘플

기호	검사 샘플	순도(%)	원료
A	페닐에타노이드 글리코사이드를 함유하는 제제	-	Tianlife^®(US 7087252B2에 개시된 추출물로 불림)
B	에키나코사이드	99	Sinphar Lab.
C	액티오사이드	97	Sinphar Lab.
D	아이소액티오사이드	97	Sinphar Lab.

에키나코사이드, 액티오사이드 및 아이소액티오사이드의 화학적 구조는 아래에 도시된다:

에키나코사이드:

액티오사이드:

아이소액티오사이드:

실시예 1: 신경아세포종 세포 배양

야생형 인간 신경아세포종 세포(SH-SY5Y)를 (10% FBS, 10 units/ml 페니실린, 10㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는) 이글스 최소 필수 배지(EMEM) / 햄스 F12 배지(1:1 혼합물)에서 배양하였다. 야생형 생쥐 신경아세포종 뉴로-2a 세포를 (10% FBS, 10 units/ml 페니실린, 10㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는) 최소 필수 배지(MEM)에서 배양하였다.

실시예 2: 세포외 Aβ1-40 축적에 대한 각 검사 샘플의 효과

실시예 1에서 야생형 인간 신경아세포종 SH-SY5Y 세포의 배지를 화학적 규명 배지(chemical defined medium)(EMEM/F12 배지(Cat.No.12500-062)), 헤페스 5mM, 글루코오스 0.6%, NaHCO₃ 3mM, 글루타민 2.5mM, 인슐린 25㎍/ml, 트랜스페린 100㎍/ml, 프로게스트론 20nM, 퓨트레신 60μM, 소듐 셀레나이트 30nM, 헤파린 2㎍/ml)로 교체하였다. 각 웰은 300㎕의 배양 배지에 1x10⁵ SH-SY5Y 세포를 함유하였다. 30분 후, 각 웰을 24시간 동안 50㎍/ml의 농도로 각각 표 1에 제공된 검사 샘플 A-D로 처리하였다. 그 후, 각 웰의 배지에서 Aβ1-40의 수준을 인간 Aβ1-40 면역분석 키트(Catalog # KHB3482 Invitrogen)에 의해 분석하였다.

인간 신경세포아종 SH-SY5Y 세포는 Aβ의 세포외 축적을 유발한다. 도 1은 임의의 검사 샘플로 처리되지 않은 부형제 대조군에서 백분율 수준을 기초로 한, 각 SH-SY5Y 웰의 배지에서 Aβ1-40의 퍼센트 수준을 도시한다. 결과는 평균±표준 편차(SD) 형태로 도시되었다. 부형제 대조군과 검사 샘플-처리 그룹 사이의 현저한 차이는 *, P<0.05, * *, P<0.01 및 ***, P<0.001로 나타내었다.

부형제 대조군과 비교하여, 도 1을 참조하면, 검사 샘플 A(페닐에타노이드 글리코사이드를 함유하는 제제) 및 C(액티오사이드)는 약 20%만큼 Aβ1-40의 수준을 감소시켰고 D(아이소액티오사이드)는 약 47.44±16.62%만큼 Aβ1-40의 수준을 감소시켰다. 도 1의 결과는 검사 샘플 D(아이소액티오사이드)가 세포외 Aβ1-40 축적을 감소시키는데 현저한 활성을 가진다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 세포내 Aβ1-40 축적에 대한 각 검사 샘플의 효과

각 웰은 300㎕의 배양 배지에 1x10⁵ SH-SY5Y 세포를 함유하였다. 각 웰의 SH-SY5Y 세포를 50㎍/ml의 농도에서 검사 샘플 A-D로 개별적으로 처리한 후, 세포 균질액을 각 웰의 세포로 제조하였고, 각 웰의 배지에서 Aβ1-40의 양을 인간 Aβ1-40 면역분석 키트(Catalog # KHB3482 Invitrogen)에 의해 분석하였다.

도 2는 임의의 검사 샘플로 처리하지 않은 부형제 대조군을 기초로 한, SH-SY5Y 웰의 세포내 Aβ1-40의 백분율 수준을 도시한다. 도 2를 참조하면, 검사 샘플 A-D는 Aβ의 세포내 축적을 현저하게 일으키지 않는다는 것을 알려준다.

실시예 4: APP 발현에 대한 각 검사 샘플의 효과

각 웰은 300㎕의 배양 배지에 1x10⁵ SH-SY5Y 세포를 함유하였다. 각 웰의 SH-SY5Y 세포를 24시간 동안 50㎍/ml의 농도에서 검사 샘플 A-D로 개별적으로 처리한 후, 세포를 균질화 버퍼(50mM 헤페스 pH 7.5, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1mM PMSF, 5㎍/ml 아프로티닌, 10㎍/ml 레우펩틴)에서 균질화하였다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하였다. 단백질은 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분리하였고 그런 후에 PVDF 막으로 전달하였고, 뒤이어 면역블롯에 의해 홀로APP(holo APP) 양을 평가한다(항Aβ1-17, 6E10 또는 항-APP C-말단 항체).

도 3은 임의의 검사 샘플로 처리되지 않은 부형제 대조군을 기초로 한, 백분율로 표현되는, 세포에서 APP 발현에 대한 검사 샘플 A-D의 효과를 도시한다. 도 3에 도시된 대로, 검사 샘플 A-D는 APP 발현을 하강제어하지 않는 것으로 보인다.

실시예 5: 세포외 Aβ1-40 분해에 대한 각 검사 샘플의 효과

생쥐 신경아세포종 뉴로-2a 세포는 화학적 규명 배지(chemical defined medium)에서 Aβ-분해 효소를 방출할 것이나, 배지에서 Aβ의 탐지가능한 양을 생산하지 않을 것이다. 뉴로 2a 세포를 24시간 동안 배지에서 배양하였고 그런 후에 배지를 세포 없이 제거하였다. 배지를 24시간 동안 50㎍/ml의 농도에서 검사 샘플 A-D 및 10ng 합성 Aβ1-40로 개별적으로 처리한 후, 배지에서 효소를 촉진하는데 각 검사 샘플의 효과를 검사하였다. 각 웰의 잔존하는 Aβ1-40 양을 인간 Aβ1-40 면역분석 키트(Catalog # KHB3482 Invitrogen)에 의해 분석하였고, 부형제 대조군과 비교함으로써, 백분율로 표현하였다. 도 4를 참조하면, 검사 샘플 D(아이소액티오사이드)는 Aβ 분해를 촉진하지 않는다.

실시예 6: Aβ1-42 올리고머화에 대한 각 검사 샘플의 효과

건조된 인간 Aβ1-42는 냉장고로부터 빼내었고 실온과 평형으로 만들었다. Aβ1-42를 1mM의 농도로 1,1,1,3,3,3-헥사-플루오로-2-프로판올(HFIP)에 용해시켰고 그런 후에 1시간 동안 실온에 놓았다. Aβ1-42/HFIP 용액을 해밀톤 주사기로 분취하였고, 질소 기체의 흐름하에서 건조하였고, 뒤이어 -20℃의 온도에서 저장하였다. HFIP로 처리된 Aβ1-42를 PBS에 용해하였고, Aβ1-42 올리고머를 제조하기 위해 24시간 동안 50㎍/ml의 농도 및 4℃에서 각 검사 샘플의 처리로 진동 배양하였다. Aβ1-42 올리고머화의 수준은 티오플라빈 T 형광(Ex=450nm, Em=482nm)에 의해 분석하였다.

도 5는 백분율로 Aβ1-40 올리고머화에 대한 검사 샘플 A-D의 효과를 도시한다. 도 5를 참조하면, 검사 샘플 A(페닐에타노이드 글리코사이드를 함유하는 제제), B(에키나코사이드), C(액티오사이드) 및 D(아이소액티오사이드)는 Aβ1-42 올리고머화를 억제하는데 활성을 갖는 것으로 발견되었고, 아이소액티오사이드(D)는 98.93±1.70%만큼 Aβ1-42 올리고머화를 현저하게 억제할 수 있었다. 즉, 아이소액티오사이드(D)는 Aβ1-42 올리고머화를 현저하게 억제할 수 있었고 Aβ가 원섬유 또는 노인성 반점을 형성하는 것을 추가로 억제할 수 있다.

도 6은 Aβ의 형성, 제거 및 응집의 과정을 도시한다(Pharmacology & Therapeutics (2005) 108: 131). 배지에서 세포외 Aβ 축적(1)은 세포내 Aβ 축적(2), APP 발현(3), Aβ 분해(4), Aβ 올리고머화(5) 및 Aβ 형성(6)에 의해 영향을 받게 될 것이 도시된다. 검사 샘플 A-C와 비교하여, 실시예 2 내지 6에서 세포 연구로부터의 결과에 따라, 아이소액티오사이드(D)는 배지에서 세포외 Aβ 축적(1)을 감소시키는데 효과적이며 Aβ 올리고머화(5)를 현저하게 억제할 수 있으며, 이는 미리 Aβ 응집을 억제할 것으로 예상된다. 게다가, 세포외 Aβ 축적(1)을 감소시키는데 아이소액티오사이드(D)의 효과는 세포내 Aβ 축적(2)을 향상시키고, 세포의 APP 발현(3)을 감소시키거나 세포외 Aβ 분해(4)를 향상시키는 아이소액티오사이드 때문이 아니다. 따라서 아이소액티오사이드(D)의 효과는 전적으로 Aβ 형성을 감소시키는 것이라는 것을 나타낸다.

요약하면, 아이소액티오사이드(D) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 Aβ의 형성, 축적 또는 응집을 억제하기 위한 활성 성분으로 사용될 수 있다. 따라서, 아이소액티오사이드(D)는 Aβ에 의해 유발된 뉴런 손상 또는 세포자멸사를 효과적으로 억제하기 위해 제공될 수 있고, 추가로 학습 또는 기억 능력을 유지, 개선 또는 회복하기 위해 제공될 수 있다. 또한, 상기 결과들에 따라, 아이소액티오사이드(D) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 Aβ-관련 질환 또는 이상을 예방 또는 치료하는 것뿐만 아니라 Aβ의 형성, 축적 또는 응집을 억제하기 위해 제공될 수 있다.

기술된 Aβ-관련 질환 또는 이상은 알츠하이머병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 루이체 치매(Lewy body dementia), 다운 증후군, 네덜란드형 아밀로이드 뇌혈관병증(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis(HCHWA) Dutch), 괌의 파킨슨 치매 복합증(Parkinson-dementia complex of Guam), 대뇌 아밀로이드 맥관병증(Cerebral amyloid angiopathy), 봉입체 근염(inclusion body myositis), 전두측두엽 치매(frontotemporal demetia), 노인성 황반변성(age-related macular degeneration), 피크병(Pick's disease) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 비록 기술된 Aβ는 대부분 Aβ1-40 또는 고 섬유화성 Aβ1-42로 예시되지만, Aβ는 다른 펩타이드 단편을 포함할 수 있다.

상기 검사 샘플 중에서, 아이소액티오사이드(D)가 Aβ의 형성, 축적 또는 응집을 감소시키는데 뛰어난 효과를 가진다. 아래 설명된 다음 실시예 7 내지 11에서, 체중 250-300mg의 수컷 스프래그-다우리 쥐들(Sprague-Dawley(SD) rats)을 BioLASCO Taiwan Co. Ltd로부터 얻었다. 신경 손상을 일으키기 위해 SD 쥐들에 Aβ1-42로 뇌실에 주입하여, 이들의 기억 및 학습 능력에 영향을 미치고 쥐의 뇌에 노인성 반점 유사 응집체를 형성하여, 알츠하이머병의 동물 모델로 사용한다. Aβ에 의해 유도된 알츠하이머병 동물 모델은, 예를 들어, 나베시마 등(Neuroscience Letters (1994) 170: 63-66)(British Journal of Pharmacology (1999) 126: 235-244)을 참조할 수 있다.

왼쪽 뇌실 속에 주입 캐뉼라의 삽입을 위해 쥐들을 마취시켰다. 절개부를 꿰맨 후, 쥐들을 우리로 돌려보냈다. 도 7은 동물 연구를 위한 실험 계획을 설명한다. 탐색 행동 검사를 7일에 실행하였고, 수동적 회피 학습 검사를 8일 및 9일에 실행하였고, 수중 미로 검사를 10일 내지 13일에 실행하였고, Aβ1-42 주입의 시작 후, 프로브 검사를 14일에 실행하였다. 실험 그룹은 표 2에 도시된다. 샴(Sham) 그룹을 TFA 용액(64.9% 살균 ddH2O, 35% 아세토나이트릴, 0.1% 트라이플루오로아세트산)으로 처리하였고, 다른 실험 그룹을 하루당 300pmol/12㎕의 Aβ1-42(Tocris 1428; MW:4514.08)에 해당하는, 시간당 TFA 용액에 용해된 0.5㎕의 Aβ1-42로 처리하였다. 실험 기간 전체에서 검사(즉, 탐색 행동 검사, 수동적 회피 학습 검사 및 수중 미로 검사) 1시간 전에, 검사 샘플을 쥐들에게 경구로 투여하였다. 표 2는 각 실험 그룹에 대한 조건을 도시하며, D는 표 1에 도시된 아이소액티오사이드이며, 아리셉트(Aricept)는 알츠하이머병과 같은 치매를 치료하기 위한 판매용 약물이다. 모든 검사 샘플을 매일 탈이온화 증류수(ddH2O)로 새롭게 제조하였고 위 튜브에 의해 경구로 투여하였다.

실시예 7 내지 11에서, 결과는 평균±표준 편차(SD) 형태로 도시되었다. Aβ1-42 대조군 그룹과 다른 실험 그룹 사이의 현저한 차이는 *, P<0.05, * *, P<0.01 및 ***, P<0.001로 나타내었다.

모든 쥐를 희생시키고 이들의 뇌를 제거하여, 얇은 조각으로 절단하고 염색하였다. 또한 신경전달물질을 검사하였다.

동물 실험 설계

그룹	유도물질(뇌실 주입)	검사 샘플 (위 튜브에 의해 경구로 투입)	쥐
샴 그룹	TFA 용액	ddH2O	12
Aβ1-42 대조군 그룹	Aβ1-42	ddH2O	12
D 2.5mg/kg		D 2.5mg/kg	12
D 5mg/kg		D 5mg/kg	12
아리셉트		아리셉트 0.75mg/kg	12

실시예 7: 탐색 행동 검사 및 장치

탐색 행동 검사 장치는 박스(40cm x 40cm x 40cm) 및 3cm 지름의 16개 구멍을 가진 스테인리스 강 바닥 보드로 구성되며, 이런 구멍은 4cm 떨어져 있고 측면 모서리로부터 7cm의 거리에 있다. 각 쥐의 입장 횟수를 10분 동안 기록하였다.

도 8은 표 2에 따른 쥐들에 의해 실행된 탐색 행동 검사의 결과를 도시한다. 도 8을 참조하면, Aβ1-42의 뇌실 주입은 쥐들의 탐색 활동을 감소시키며 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 및 아리셉트는 쥐들의 탐색 활동을 개선하는데 효과적이며, 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 5mg/kg는 아리셉트 0.75mg/kg보다 더 좋은 효과를 나타낸다.

실시예 8: 수동적 회피 반응 검사

수동적 회피 장치는 밝은 구획, 어두운 구획 및 두 구획 사이의 단두대 문(guillotine door)으로 이루어진다.

각각의 쥐를 밝은 구획에 놓고 단두대 문을 열었다. 90초 내에 어두운 구획으로 들어온 쥐들을 이 실험에서 검사하도록 선택하였다.

연습 실험중, 선택된 쥐들의 각각을 밝은 구획에 개별적으로 놓고 단두대 문을 열었다. 어두운 구획에 들어갈 때, 단두대 문을 닫았고 5초 동안 바닥을 통해 어두운 구획에 있는 쥐에게 전기 충격을 가했다. 그 후, 쥐를 어두운 구획으로부터 제거하여 홈 우리로 되돌려 보냈다.

연습 실험 24시간 후, 쥐들을 밝은 구획에 개별적으로 놓고 단두대 문을 열였고, 각 쥐의 전기 충격을 받은 어두운 상자로 다시 들어가는데 걸리는 시간(step through latency)(STL)을 기록하였다.

도 9는 표 2에 따른 쥐들의 수동 회피 반응 결과를 도시한다. 도 9를 참조하면, Aβ1-42의 뇌실 주입은 쥐들에 대한 수동 회피 학습 반응의 현저한 손상을 일으키며 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 및 아리셉트는 Aβ1-42의 뇌실 주입에 의해 유발된 쥐들의 수동 회피 학습 손상을 뒤집는다. 도 9에 도시된 대로, 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 2.5mg/kg는 아리셉트 0.75mg/kg과 동일한 효과를 나타내며 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 5mg/kg는 아리셉트 0.75mg/kg보다 더 좋은 효과를 나타낸다.

실시예 9: 수중 미로 검사

이 실시예에서, 수중 미로 풀을 4개의 사분원으로 나눴고 숨겨진 플랫폼을 네 번째 사분원에 위치시키고 물의 표면 1.0cm 아래에 잠기게 하였다. 숨겨진 플랫폼을 찾기 위해 각 실험당 2분, 하루당 4시간 간격으로 각 쥐에게 2회 실험을 하였다. 첫 번째 실험은 공간 수행 검사를 위해 실행하였다. 숨겨진 플랫폼을 찾기 위해 각각의 쥐를 최대 120초 수영하게 하였다. 성공했을 때, 쥐에게 플랫폼 상에서 30초 휴식 기간을 허용하였다. 상기 기간 내에서 실패하면, 쥐에게 120초의 점수를 준 후 플랫폼에 올려놓고, 30초의 휴식 기간을 허용하였다. 공간 수행 검사를 4일 연속 동안 실행하였다. 5일째에, 숨겨진 플랫폼을 수중 미로 풀로부터 제거하였고, 각 쥐를 제 1 사분면에 놓고 60초의 수영 기간을 제공하였다. 숨겨진 플랫폼이 위치된 사분면에서 각 쥐가 보낸 시간을 프로브 검사(probe test) 동안 기록하였다.

도 10은 표 2에서 동물에 의해 실행된 공간 수행 검사의 결과를 도시하며 도 11은 표 2에서 동물에 의해 실행된 프로브 검사의 결과를 도시한다. 도 10과 도 11을 참조하면, Aβ1-42에 의해 유발된 수중 미로 공간 수행 및 프로브 검사의 결핍은 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 및 아리셉트에 의해 개선될 수 있고 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 5mg/kg는 아리셉트 0.75mg/kg보다 더 좋은 효과를 나타낸다는 것이 도시된다.

실시예 10: 쥐 뇌의 면역조직화학 염색

수중 미로 수행 검사 후, 모든 쥐를 참수하고 두개골로부터 이들의 뇌를 빠르게 제거한 후 뇌의 해마 부분에서 Aβ1-42에 대해 면역조직화학 염색을 하였다. 도 12a-e는 면역조직화학 염색 결과를 도시한다. 도 12b에서, 여러 반점이 Aβ1-42로 연속적으로 주입한 쥐의 뇌에서 발견되었다. 도 12c 및 12d에서, 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 2.5mg/kg로 처리한 쥐의 뇌에서 소수의 반점이 발견되었고 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 5mg/kg으로 처리한 쥐의 뇌에서 거의 반점이 발견되지 않았다. 도 12c를 12e와 비교하면, 검사 샘플 D(아이소액티오사이드)로 처리한 쥐의 뇌에서 반점들은 아리셉트로 처리한 쥐의 뇌에서 반점보다 적었다는 것이 분명하다. 결과에 따라, 검사 샘플 D(아이소액티오사이드)는 Aβ가 응집에 의해 반점을 형성하는 것을 억제하거나 반점을 제거하는데 효과적이다.

실시예 11: 쥐의 피질과 해마에서 신경전달물질 수준

수중 미로 수행 검사 후, 모든 쥐를 참수하고 두개골로부터 이들의 뇌를 빠르게 제거하였다. 글로윈스키 및 이베르센(Glowinski and Iversen)에 따라, 뇌 피질 및 해마를 분리하였고, 각각의 피질과 해마를 계량하고 신경전달물질의 농도 및 효소의 수준을 분석하기 위해 50mM Na-인산염 버퍼(pH 7.8)의 첨가에 의해 균질화하였다.

표 3과 표 4는 표 2에 따른 쥐의 뇌 피질과 해마에서 각각 신경전달물질 도파민(DA) 및 이의 대사 산물(DOPAC 및 HVA)의 농도를 각각 도시한다. 표 3과 표 4를 참조하면, Aβ1-42가 쥐의 피질과 해마에서 DA 수준을 감소시키며, 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 및 아리셉트는 Aβ1-42에 의해 유발된 쥐의 피질과 해마에서 DA 수준 감소를 뒤집는다.

표 2에 도시된 실험에 따른 쥐의 뇌 피질에서 DA 수준 및 이의 대사 산물 DOPAC 및 HVA 수준

DOPAC HVA DA
샴 16.75±1.70^* 3.71±0.58 3.92±0.44^**
부형제 대조군 11.66±1.13 2.76±0.43 2.33±0.28
D 2.5mg/kg 12.53±3.33 2.92±0.58 2.67±0.43
D 5mg/kg 13.80±3.03 2.74±0.69 3.84±0.47^*
아리셉트 10.49±2.38 2.42±0.78 3.10±0.46

표 2에 도시된 실험에 따른 쥐의 뇌 해마에서 DA 수준 및 이의 대사 산물 DOPAC 및 HVA 수준

DOPAC HVA DA
샴 5.87±0.92 3.68±0.41 5.36±0.75^***
부형제 대조군 5.13±0.80 3.39±0.36 1.00±0.21
D 2.5mg/kg 4.98±1.15 3.68±0.46 5.41±1.30^***
D 5mg/kg 4.13±0.45 3.29±0.25 4.07±0.59^***
아리셉트 3.19±1.00 2.45±0.33 1.33±0.37

도 13a는 표 2에 따른 쥐의 뇌 피질과 해마에서 신경전달물질 아세틸콜린의 수준을 도시하며, 도 13b는 표 2에 따른 쥐의 뇌 피질과 해마에서 콜린의 수준을 도시한다. 도 13a와 도 13b를 참조하면, Aβ1-42는 쥐의 뇌 피질과 해마에서 아세틸콜린 수준을 감소시키며, 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 및 아리셉트는 Aβ1-42에 의해 유발된 쥐의 뇌 피질과 해마에서 아세틸콜린 수준 감소를 뒤집으며, 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 5mg/kg이 특히 효과가 있다.

도 14a 및 도 14b는 표 2에 따른 쥐의 뇌 피질과 해마에서 아세틸콜린분해효소의 활성을 각각 도시한다. 도 14a 및 14b를 참조하면, Aβ1-42는 쥐의 뇌 피질과 해마에서 아세틸콜린분해효소 활성을 증가시키며, 검사 샘플 D(아이소액티오사이드) 및 아리셉트는 Aβ1-42에 의해 유발된 쥐의 뇌 피질과 해마에서 아세틸콜린분해효소 활성 증가를 뒤집는다.

Aβ 응집체가 세포 손상을 일으키기 때문에, 다양한 질환 또는 이상을 추가로 유도한다. 실시예 2 내지 6에서 세포 연구로부터의 결과에 따라, 아이소액티오사이드(D)가 Aβ의 형성, 축적 또는 응집을 억제하는데 효과적이며, 추가로 Aβ가 응집체를 형성하는 것을 억제하며, 따라서 아이소액티오사이드는 알츠하이머병 또는 다른 Aβ-관련 질환 또는 이상을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

실시예 7 내지 9에서 동물 연구로부터의 결과는 아이소액티오사이드가 Aβ에 의해 유발된 기억 또는 학습 결핍을 개선하는데 현저한 효과를 가지는 것을 도시한다. 실시예 10에 따라, 아이소액티오사이드는 Aβ가 응집에 의해 반점을 형성하는 것을 억제하거나 반점을 제거하는데 효과적이다. 게다가, 실시예 11에 따라, 아이소액티오사이드는 Aβ1-42에 의해 유발된 신경전달물질 수준 감소를 뒤집을 수 있으며, 따라서, 기억 또는 학습 능력의 결핍을 개선하는데 효과적이다. 상기 세포 및 동물 연구 결과는 아이소액티오사이드 또는 이의 동일한 약학적으로 허용가능한 염이 약 0.2mg/kg 내지 4mg/kg의 일일 치료 유효량(즉, 약 12mg - 240mg인 체중 60kg의 성인의 권장 복용량)으로 사람에게 투여될 수 있으며 알츠하이머병 또는 다른 Aβ-관련 질환 또는 이상을 예방 또는 치료하기 위한 접근법으로 사용될 수 있다는 것을 알려준다.

비록 본 발명은 상기한 여러 바람직한 실시태양에 의해 개시되었지만, 이들은 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 당업자에 의해 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 이루어진 여러 동일한 치환 및 변형은 여전히 첨부된 청구항의 범위 내에 있다.

Claims

개인의 아밀로이드 β 펩타이드와 관련된 질환 또는 이상을 예방 또는 치료하기 위한 의약의 제조에서 아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
제 1 항에 있어서,
질환 또는 이상은 아밀로이드 β 펩타이드의 형성, 축적 또는 응집과 관련이 있는 용도.
제 2 항에 있어서,
질환 또는 이상은 아밀로이드 β 펩타이드의 세포외 형성, 축적 또는 응집과 관련이 있는 용도.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
아밀로이드 β 펩타이드는 Aβ1-40 또는 Aβ1-42인 용도.
제 1 항에 있어서,
질환 또는 이상은 알츠하이머병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 루이체 치매(Lewy body dementia), 다운 증후군, 네덜란드형 아밀로이드 뇌혈관병증(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis(HCHWA) Dutch), 괌의 파킨슨 치매 복합증(Parkinson-dementia complex of Guam), 대뇌 아밀로이드 맥관병증(Cerebral amyloid angiopathy), 봉입체 근염(inclusion body myositis), 전두측두엽 치매(frontotemporal demetia), 노인성 황반변성(age-related macular degeneration) 또는 피크병(Pick's disease)인 용도.
제 5 항에 있어서,
상기 의약은 알츠하이머병을 예방 또는 치료하는 용도.
제 1 항 있어서,
아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 상기 개체의 학습 및 기억 능력을 유지, 개선 또는 회복하기 위해서, 아밀로이드 β 펩타이드에 의해 유발된 신경 손상 또는 세포자멸사를 억제하는 용도.
제 1 항에 있어서,
상기 의약의 인간에 대한 유효 복용량은 하루당 체중의 kg당 0.2mg - 4.0mg의 아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 동일한 용도.
아밀로이드 β 펩타이드의 형성, 축적 또는 응집을 억제하는데 아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
제 9 항에 있어서,
아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 아밀로이드 β 펩타이드의 세포외 형성, 축적 또는 응집을 억제하는데 사용되는 용도.
제 9 항에 있어서,
아밀로이드 β 펩타이드는 Aβ1-40 또는 Aβ1-42인 용도.
제 9 항에 있어서,
아이소액티오사이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 식품, 음료, 씹는 물질, 패치 또는 스킨 케어 제품의 제조에 사용되는 용도.