JP2013528627A - イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩の使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図5
Description
野生型ヒト神経芽腫細胞(SH−SY5Y)をイーグル最小必須培地(EMEM)/Ham’s F12培地(1:1混合物)(FBS10%、ペニシリン10ユニット/ml、ストレプトマイシン10μg/mlを含む)中で培養した。野生型マウス神経芽腫Neuro−2a細胞を最小必須培地(MEM)(FBS10%、ペニシリン10ユニット/ml、ストレプトマイシン10μg/mlを含む)中で培養した。
実施例1の野生型ヒト神経芽腫SH−SY5Y細胞の培地を、既知組成培地(EMEM/F12培地(カタログ番号12500−062)、Hepes 5mM、グルコース0.6%、NaHCO3 3mM、グルタミン2.5mM、インシュリン25μg/ml、トランスフェリン100μg/ml、プロゲステロン20nM、プトレシン60μM、亜セレン酸ナトリウム30nM、ヘパリン2μg/ml)に切り替えた。各ウェルは1×105SH−SY5Y細胞を培地300μl中に有した。30分後、各ウェルを表1に与えられる試験試料A〜Dのそれぞれで、50μg/mlの濃度で24時間処理した。その後、各ウェルの培地中のAβ1−40のレベル(含量)を、ヒトAβ1−40イムノアッセイキット(カタログ番号KHB3482 インビトロジェン)によって分析した。
各ウェルは1×105のSH−SY5Y細胞を培地300μl中に有した。各ウェルのSH−SY5Y細胞を試験試料A〜Dで50μg/mlの濃度でそれぞれ処理した後、各ウェルの細胞から細胞ホモジネートをそれぞれ調製し、各ウェルの培地中のAβ1−40の量を、ヒトAβ1−40イムノアッセイキット(カタログ番号KHB3482 インビトロジェン)を用いて決定した。
各ウェルは1×105SH−SY5Y細胞を培地300μl中に有した。各ウェルのSH−SY5Y細胞を試験試料A〜Dで50μg/mlの濃度で24時間それぞれ処理した後、細胞を均質化用バッファ(50mM Hepes pH7.5、1mM EDTA、150mM NaCl、1% NP−40、1mM PMSF、5μg/ml アプロチニン、10μg/ml ロイペプチン)中で均質化した。細胞残屑を遠心分離によって除去した。タンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、次いでPVDF膜に移し、その後、イムノブロット(抗Aβ1−17、6E10または抗−APP C−末端抗体)によってホロAPPの量を評価した。
マウス神経芽腫Neuro−2a細胞は、既知組成培地中にAβ−分解酵素を放出するが、培地中に検出可能な量のAβを産生しない。Neuro2a細胞を培地中で24時間インキュベートし、次いで、細胞を除いて培地を引き出した。培地を個々に、50μg/mlの濃度の試験試料A〜Dおよび10ngの合成Aβ1−40で24時間処理し、次に、培地中の酵素の促進に対する各試験試料の効果を調べた。各ウェルに残ったAβ1−40の量をヒトAβ1−40イムノアッセイキット(カタログ番号KHB3482、インビトロジェン)で分析し、ビヒクル対照群と比較して百分率で示した。図4を参照すると、試験試料D(イソアクテオシド)はAβの分解を加速しない。
乾燥したヒトAβ1−42を冷蔵庫から取出し、室温に平衡にした。Aβ1−42を、1,1,1,3,3,3−ヘキサ−フルオロ−2−プロパノール(HFIP)に1mMの濃度で溶解させ、次いで室温で1時間静置した。Aβ1−42/HFIP溶液をハミルトンシリンジで分注し、次いで窒素ガス気流下で乾燥させ、その後−20℃で保存した。HFIPで処理したAβ1−42をPBSに溶解させ、各試験試料の処理を、50μg/mlの濃度で、4℃で24時間行い、振動−インキュベートしてAβ1−42オリゴマーを調製した。Aβ1−42のオリゴマー化のレベルをチオフラビンT蛍光(Ex=450nm、Em=482nm)によって分析した。
探索行動試験装置は、箱(40cm×40cm×40cm)と、直径3cmの穴を、端から7cmの距離に4cmの間隔で16個有するステンレスの底板と、から構成される。各ラットのエントリーカウントを10分間記録した。
受動回避装置は、明区画、暗区画およびこれらの2つの区画の間のギロチンドアから構成される。
この実施例では、水中迷路プールを4つの四半分に分割し、隠されたプラットフォームを第4の四半分に設置し、水面下1.0cmに沈めた。各ラットは4時間の間隔で1日当たり2回の試験を受け、各試験は隠されたプラットフォームを見つけるために2分間行った。1回目の試験は空間パフォーマンス(spatial performance)試験のために行った。各ラットを、隠されたプラットフォームを見つけるために最大120秒間泳がせた。成功すると、ラットにプラットフォーム上で30秒間の休息時間を与えた。決められた時間内に成功しなかった場合は、ラットのスコアを120秒とし、その後ラットをプラットフォーム上に乗せ、30秒間の休息時間を与えた。空間パフォーマンス試験は4日間連続して行った。5日目に、隠されたプラットフォームを水中迷路プールから取り去り、各ラットを第1の四半分に入れ、60秒間泳がせた。各ラットが隠されたプラットフォームが位置していた四半分で過ごした時間を、プローブテスト(probe test)の間に記録した。
水中迷路パフォーマンス試験の後、すべてのラットの頭部を切断しその脳を速やかに頭蓋骨から除去し、次いで、その脳の海馬部分のAβ1−42に対して免疫組織化学染色を行った。図12A〜Eは、免疫組織化学染色の結果を示す。図12Bにおいては、Aβ1−42を持続注入したラットの脳に多数のプラークが見られた。図12Cおよび図12Dにおいては、試験試料D(イソアクテオシド)2.5mg/kgで治療したラットの脳にはわずかなプラークしか見られず、試験試料D(イソアクテオシド)5mg/kgで治療したラットの脳にはプラークがほとんど見られなかった。図12Cを図12Eと比較すると、試験試料D(イソアクテオシド)で治療したラットの脳におけるプラークは、アリセプトで治療したラットの脳のものよりも少ないことが明らかである。この結果によれば、試験試料D(イソアクテオシド)はAβの生成の阻害またはプラークの凝集の除去に有効である。
水中迷路パフォーマンス試験の後、すべてのラットの頭部を切断しその脳を速やかに頭蓋骨から除去した。神経伝達物質の濃度および酵素のレベル(含量)を分析するために、GlowinskiおよびIversenの方法にしたがって脳の皮質および海馬を分離し、次いで皮質および海馬をそれぞれ計量し、50mMのNa−リン酸バッファー(pH7.8)を添加して均質化した。
Claims (12)
- イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩の、アミロイドβペプチドに関連する疾患または状態の予防または治療のための薬剤の調製における、使用。
- 前記疾患または状態が、前記アミロイドβペプチドの生成、蓄積または凝集に関連する、請求項1に記載の使用。
- 前記疾患または状態が、前記アミロイドβペプチドの細胞外の生成、蓄積または凝集に関連する、請求項2に記載の使用。
- 前記アミロイドβペプチドが、Aβ1−40またはAβ1−42である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- 前記疾患または状態が、アルツハイマー病、軽度認識障害、レビー小体認知症、ダウン症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(HCHWA)オランダ型、グアム−パーキンソン痴呆複合、脳アミロイド血管症、封入体筋炎、前頭側頭認知症、加齢性黄斑変性症、またはピック病である、請求項1に記載の使用。
- 前記薬剤がアルツハイマー病の予防または治療のためのものである、請求項5に記載の使用。
- 前記イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩は、学習および記憶能力を維持する、改善する、または回復するように、アミロイドβペプチドによって引き起こされる神経損傷またはアポトーシスを阻害するためのものである、請求項1に記載の使用。
- 前記薬剤のヒトに対する有効な投与量は、1日あたり、体重1kgあたり、イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩が0.2〜4.0mgに相当する、請求項1に記載の使用。
- アミロイドβペプチドの生成、蓄積または凝集の阻害における、イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩の使用。
- 前記イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩が、前記アミロイドβペプチドの細胞外の生成、蓄積または凝集の阻害のために用いられる、請求項9に記載の使用。
- 前記アミロイドβペプチドが、Aβ1−40またはAβ1−42である、請求項9または10に記載の使用。
- 前記イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩が、薬品、食品、飲料、チューイング品、パッチまたはスキンケア製品の調製に用いられる、請求項9に記載の使用。
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