CN101264094B - 藏波罗花苯丙素苷组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从传统藏药藏波罗花中提取的总苯丙素苷类组合物及其制备方法，并以该类组合物作为抗氧化药物/保健品上的用途，应用于临床治疗因相关自由基损伤导致的衰老、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤等的疾病；以及作为食品、饲料用抗氧化添加剂的用途，防止或减缓饲料酸败变质、营养价值下降、适口性变差。藏波罗花苯丙素苷化合物组成的组合物，含有藏波罗花苯丙素苷化合物A和藏波罗花苯丙素苷化合物B，其组合物两者重量比为60-90∶40-10，两者含量之和占总苯丙素苷总重量的70％-100％。以组合物为主要成分制备的制剂有片剂、胶囊、颗粒剂、针剂、滴丸、液体制剂、粉剂，提供了新的天然、高效、低毒的植物天然抗氧化剂。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物的化合物及其制备方法和用途。具体涉及从传统藏药藏波罗花中提取的总苯丙素苷类组合物及其制备方法，以该类组合物作为抗氧化药物/保健品上的用途，及作为食品、饲料用抗氧化添加剂的用途。
背景技术
由于环境因素、饮食因素、生活因素的影响，现代人体内自由基代谢常常容易失去平衡。自由基的生成和清除的平衡对于生命过程的正常进行非常重要，只有氧自由基的产生和清除处于平衡时，身体才能保持健康。自由基过多或清除能力不足，体内就有多余的自由基，引起组织损伤，脂质过氧化，酶失活，蛋白质变化，DNA突变，免疫功能低下，导致疾病的发生，最明显的是癌症、心脑血管疾病和衰老的发生。抑制脂质过氧化物生成的药物可以保护组织免受自由基损伤，有补虚，扶正固体的功能，对多种疾病有防治意义并有较广的保健作用，它不但可以延缓衰老，而且还可以减少心、脑血管疾病和癌症的发生，还具有美容作用。
随着国内外对食品质量和安全的广泛关注，如何防止食品变质，保障人体健康日显重要。为了提高食品的抗氧化性能，预防食物氧化，主要依靠在食品中加入抗氧化剂，以防止食品，特别是油脂的氧化。
在畜牧业养殖中，为保障动物机体抗氧化防御系统的防御能力，防止细胞和组织的损伤，饲料中必须包括各种抗氧化剂。随着家畜使用年限的延长，防止氧化对健康和免疫状态造成损害是极其重要的，宠物、奶牛和种禽对自由基很敏感，需要不断摄人含有抗氧化剂的日粮和氧化稳定性好的饲料。缺乏抗氧化剂则会引起很多不良反应，如奶牛乳房炎、乳房水肿和繁殖机能下降等与氧化应激有关。传统合成的抗氧化剂虽然抗氧化能力比较强，但长期食用有潜在的毒性，有的甚至会产生致畸、致癌作用，因此愈来愈受到人们的排斥。如，1977年，美国FDA宣布食品中禁止使用2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)，日本厚生省也曾在1982年宣布禁用丁基羟基回香醚(BHA)及叔丁基对苯酚(TBHQ)。
寻找天然、高效、低毒的植物天然抗氧化剂成为了一种必然趋势，又因其在自然界中的分布广泛、抗氧化活性强而倍受关注。
发明内容
本发明的目的正是为了克服现有技术中的不足而提供一种从藏波罗花中制备苯丙素苷组合物(化合物藏苷A和藏苷B)的制备方法；提供以苯丙素苷类化合物为有效活性成份的药物组合物制剂，及其在作为抗氧化药物及保健品，如，抗衰老上的用途；提供以苯丙素苷类化合物为有效活性成份用于供食品/饲料抗氧化剂用途的组合物。
本藏波罗花生于海拔3600-5400米的高山灌丛草地或高山草地，分布于西藏和青海，为青藏高原所特有的物种。据西藏民间医药传统记载，藏波罗花的根可入药，有补养气血、消炎止痛，祛风除湿等功效，是中国藏、蒙、彝、傈僳等多个民族常用草药。藏波罗花资源丰富，为传统安全的藏药。藏波罗花虽然为我国藏、蒙、彝、僳僳等多个民族常用草药，但国内外关于其药效学及相关研究未见报道。申请人前期还对藏波罗花进行抗氧化相关研究，利用离体测定方法与在体动物模型实验表明藏波罗花苯丙素苷化合物具有显著抗氧化、抗衰老作用。相关研究也未见报道。
本发明的目的由以下技术措施来实现：一种由藏波罗花苯丙素苷化合物组成的组合物，含由藏波罗花苯丙素苷化合物A和藏波罗花苯丙素苷化合物B，分别简称为：藏苷A和藏苷B，其组合物两者重量比为60-90∶40-10，两者含量之和占总苯丙素苷总重量的70％-100％，其中：
(1)藏苷A的结构为：
(2)藏苷B的结构为：
上述藏波罗花苯丙素苷组合物的制备方法有三种，分别是：
方法1.取粉碎细度达40～200目的藏波罗花药材，用水、30％-90％的乙醇溶剂或乙酸乙酯分别提取，其中，藏波罗花粉碎物与溶剂的重量/容量比为1∶2～20，将按比例混合好的藏波罗花粉碎物与上述溶剂置于提取釜中，提取温度为30℃～80℃，提取液浓缩后得相应的水提取浓缩物、醇溶剂提取浓缩物或乙酸乙酯提取浓缩物，用交换柱进行层析，用低级醇水溶液梯度洗脱，收集其浓度＞60％的低级醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用低级醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低级醇∶乙酸乙酯或正丁醇＝1∶0.5～5洗脱，体积为生药体积的5-15倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。
方法2.取粉碎细度达40-200目的藏波罗花药材，用水、30％-90％的乙醇溶剂或乙酸乙酯分别提取，浓缩后得水提取浓缩物、醇溶剂提取浓缩物或乙酸乙酯提取浓缩物，按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶2～20，进行萃取，浓缩萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用低级醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低级醇∶乙酸乙酯或正丁醇＝1∶0.5～5洗脱，体积为生药体积的5～15倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。
方法3.取粉碎细度达40-200目的藏波罗花药材，用水、醇溶剂和/或乙酸乙酯提取，浓缩后得水提取浓缩物、醇溶剂提取浓缩物或乙酸乙酯提取浓缩物，按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶2～20，进行萃取，浓缩萃取液，用交换柱进行层析，用低级醇水溶液梯度洗脱，收集其浓度＞60％的低级醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用低级醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低级醇∶乙酸乙酯或正丁醇＝1∶0.5～5洗脱，体积为生药体积的5～15倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。
方法1、2或3所用的低级醇为甲醇、乙醇、丙醇即C1～C3醇类，其重量浓度为30％～90％。所用的交换柱采用聚酰胺，其目数为30-60目、60-100目或100-120目；大孔吸附树脂，其型号为HPD-100、HPD-100A、HPD-400或HPD-400A。硅胶柱的目数是：40-80目、60-100目或200-300目。
将藏波罗花苯丙素苷组合物，藏苷A和藏苷B制备成制剂，该制剂是粉剂、片剂、胶囊、颗粒剂、缓释片、缓释胶囊、滴丸或口服液制剂。制剂应用于临床治疗因相关自由基损伤导致的衰老、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤等的疾病。
将藏波罗花苯丙素苷组合物，藏苷A和藏苷B制备成食品/饲料抗氧化制剂，是将藏波罗花总苯丙素苷组合物粉碎成为粒径为20-150μm的粉状物，添加适量微晶纤维素、淀粉、梭甲基纤维素钠，按常规方法制成，制剂中藏波罗花总苯丙素苷的含量为4.0％-15％，其它成分为药物辅料，制作出的成品是粉剂。应用于制备食品、饲料、饮料的抗氧化制剂。
藏波罗花总苯丙素苷有效成分化合物的分离和鉴定：
取藏波罗花总苯丙素苷10g，加1～3倍量的硅胶搅拌，过硅胶柱，先用水冲洗至无色，再用二氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脱，收集洗脱液，干燥，得活性最佳组分V。
取上述组分100mg，用甲醇溶解，进行半制备液相色谱分离纯化，色谱条件：phenomenex C18反相半制备柱，以不同比例的甲醇一水作为流动相，紫外检测器检测，收集出峰流份，组分V-1的流动相为甲醇一水(25∶75)，得淡黄色粉末59mg，为化合物A；组分V-2的流动相为甲醇一水(45∶65)，得白色粉末13mg，为化合物B。
分别采用ESI-MS，1H-NMR，13C-NMR，DEPT，1H-1H COSY，HSQC，HMBC，NOESY，TOCSY，GC-MS对化合物A和B进行结构鉴定。
通过低分辨ESI-MS得出化合物A和B的分子量均为624，进一步通过高分辨HRESI-MS得出它们的分子式均为C29H36015。通过1D-NMR(1H NMR，13CNMR，DEPT)和2D-NMR(1H-1H COSY，HSQC，HMBC，NOESY和TOCSY)解析两个化合物的结构；并进行了化合物A和B水解单糖硅烷化衍生物的GC-MS鉴定，得出化合物A和B的甲基五碳糖均为L-鼠李糖，六碳糖均为D-葡萄糖。
鉴定确定的化合物A结构为：
β-D-Glucopyranoside，2-(3，4-dihydroxyphenyl)ethyl-3-0-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-，4-[(2E)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate](9CI)；
鉴定确定的化合物B结构为：
β-D-Glucopyranoside，2-(3，4-dihydroxyphenyl)ethyl-3-0-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-，6-[(2E)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate](9CI)。
化合物A和B均为苯丙素苷化合物，分别称为藏波罗花苯丙素苷A、藏波罗花苯丙素苷B(简称：藏苷A和藏苷B)，其结构式见前述。
藏波罗花总苯丙素苷样品中有效成分化合物A和B(藏苷A和藏苷B)的含量测定采用高效液相色谱法进行。
分析条件：流动相采用乙腈-水(25/75，v/v)；流速为1.0ml/min；定量分析的检测波长为330nm；柱温设置为25℃；进样量20μl。纯品化合物A和B用作外标，它们分别于乙腈-水(25/75，v/v)中配置成1.0mg/ml的母液。两种母液分别用乙腈-水(25/75，v/v)按1/2，1/3，1/4和1/5倍进行稀释得到0.50，0.33，0.25和0.20mg/mL浓度的几种用于分析的溶液。这四种标准液和母液通过分析型HPLC来制作标准曲线。藏波罗花总苯丙素苷样品用乙腈-水(25/75，v/v)配置成1.0mg/ml的样品溶液，样品溶液在进行分析前要用0.45μ膜进行过滤。每个样品重复测定三次。通过标准曲线来求得样品中藏苷A和藏苷B的含量。
经多次检测，藏波罗花总苯丙素苷中，藏苷A和藏苷B含量比例(重量)为60-90∶40-10，两者含量之和在60％(重量)以上。
本发明藏波罗花总苯丙素苷经离体测定方法与在体动物模型实验表明具有显著抗氧化、抗衰老作用。
藏波罗花总苯丙素苷(简写ZZBG)活性作用试验：
1.抗氧化活性的测定
超氧阴离子清除实验、羟自由基清除实验和过氧化脂质抑制实验是目前检测药物体外抗氧化的常用指标，本发明用这三个指标分别对藏波罗花总苯丙素苷(ZZBG)与有效成分藏苷A和藏苷B体外抗氧化活性进行了测定。结果见表 1。ZZBG、藏苷A或B清除超氧阴离子(O·2-)的能力：藏苷A或B＞ZZBG(36.0％)＞Vc(34.5％)。ZZBG、藏苷A或B对羟自由基HFR(·OH)的清除：藏苷A或B≈苯甲酸＞ZZBG(300min)＞Vc(120min)＞空白(15min)。ZZBG的效果略低于苯甲酸，但显著强于Vc。ZZBG、藏苷A或B对小鼠肝组织过氧化脂质(LPO)抑制活性：藏苷A或B≈ZZBG(-97.2％)＞BHT(-57.6％)＞Vc(206.3％)。ZZBG、藏苷A或B的效果显著强于BHT(0.5mg/ml的Vc无抑制LPO的作用，反而有强烈的促氧化作用)。
体外抗氧化活性测定结果表明，ZZBG、藏苷A或B具有极其显著的抗氧化活性。其综合抗氧化能力强于阳性对照(苯甲酸，Vc，BHT)。ZZBG、藏苷A或B可用于制备动物(包括人)用抗氧化药物；也可用于制备食品或饲料用抗氧化剂。
表1.藏波罗花总苯丙素苷(ZZBG)、藏苷A和藏苷B体外抗氧化活性(浓度0.5mg/ml)
2.抗衰老活性
果蝇是双翅目果蝇属昆虫，其许多代谢途径，生理功能及发育阶段同哺乳动物相似，具有与人类相似的生长发育，繁殖和衰老阶段，用它作材料进行寿命实验，其结果具有一定的参考价值。果蝇用作研究抗衰老药物的模型动物之一，还具有下列特点：高度纯种；生存期短，在正常情况下的平均寿命为60d左右；繁殖快，12d左右即完成一个世代，且每个受精的雌果蝇可产卵400～500个，因此在短时间内就可获得大量实验动物；判断药效的观察指标明确可靠。本发明利用果蝇进行ZDTW抗衰老活性实验材料，利用果蝇生存(寿命)与果蝇体内抗氧化的生化指标实验判断ZDTW抗衰老活性。
(1)果蝇生存(寿命)实验
果蝇寿命实验由表2可知：在雌性和雄性果蝇寿命实验中，藏波罗花总苯丙素苷(ZZBG)组与空白组比较，具有极显著性差异(p＜0.01)。
表2.果蝇寿命实验统计
a用SAS软件进行t检验：P＜0.05；
(2)果蝇体内抗氧化的生化指标测定ZZBG果蝇体内抗氧化的生化指标测定结果见表3。ZZBG对果蝇体内超氧化物歧化酶(SOD)清除氧自由基的能力的影响：Vc组、ZZBG与空白组比较，均具有差异极显著性(p＜0.01)；ZZBG对果蝇体内谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px活性的影响：与空白组比较，阳性组Vc无提高GSH-Px活性的作用。ZZBG对GSH-Px活性明显提高，为20.8％。ZZBG对果蝇体内CAT活性的影响：ZZBG与空白相比具有显著差异(p＜0.01)，Vc效果最好(5.6％)。ZZBG对果蝇体内MDA含量的作用：ZZBG具有明显的降低果蝇体内MDA含量的作用。
表3.果蝇体内SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA浓度水平
用SAS软件进行t检验：**P＜0.01；*P＜0.05。
动物个体实验证明ZZBG具有显著的抗衰老活性。
3.ZZBG抗食品、饲料氧化作用
(1)ZZBG对米糠的抗氧化作用
将ZZBG(B)与阳性对照抗氧化剂乙氧基喹啉(A)添加到米糠中，在室温、无光照条件下储存，7天和20天后取样，分别测定其酸价，酸价测定采用氢氧化钾滴定法。试验结果见表4。
表4.ZZBG对米糠的抗氧化作用
从表4可见，贮存20天后，相同水平的ZZBG对米糠的抗氧化效果与乙氧基喹啉 相当，说明ZZBG抗氧化效果较好。
(2)ZZBG对油脂的抗氧化作用
将0.03％ZZBG、乙氧喹(50％)、BHT添加到新鲜猪油中。在110％，通气速度为20L/h的条件下加速油脂氧化，用油脂氧化测定仪测定油脂的过氧化值。不同抗氧化剂对油脂的抗氧化试验结果见表5。
由表5可见，在猪油中添加ZZBG等抗氧化剂后，产生相同过氧化值的时间，添加ZZBG与常用的饲料抗氧化剂乙氧喹啉和BHT相比，产生相同过氧化值的时间分别延长了1.56和1.22倍。
表5.ZZBG对油脂的抗氧化作用
| 抗氧化剂 | 氧化诱导时间(h) |
| ZZBG | 4.52 |
| 乙氧喹(50％) | 2.9 |
| BHT | 3.72 |
| 对照 | 1.42 |
以下是本发明的说明书附图的图面说明：
图1是本发明的三种不同的制备工艺流程。
本发明与现有技术相比具有以下积极效果：
1.原料提取于天然传统补益药用植物：安全实用。
2.ZZBG抗氧化作用综合效果高于常用合成氧化剂。
3.由组合物制备的制剂可应用于临床治疗因相关自由基损伤导致的衰老、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤等的疾病，为治疗这类疾病增加了新的药物品种。
4.由组合物制备的抗氧化制剂可作为食品、饲料的抗氧化添加剂，防止或减缓食品、饲料酸败变质。
具体实施方式
具体实施方式 本发明以下将结合说明书附图和实施例作进一步的详细说明。
实施例1.1藏波罗花总苯丙素苷(简写ZZBG)的制备(使用第一种方法)
取粉碎细度达100目的藏波罗花药材，用水提取，其中，藏波罗花粉碎物与溶剂的重量/容量比为1∶20，将按比例混合好的藏波罗花粉碎物与上述溶剂置于提取釜中，提取温度为80℃，提取液浓缩(压力98Kpa、温度80℃)后得相应的水提取浓缩物，用60-100目聚酰胺柱进行层析，用乙醇水溶液梯度洗脱，收集其浓度＞60％的乙醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分 的组合物；通过40-80目硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用乙醇∶乙酸乙酯＝1∶2.5的混合液洗脱，体积为生药体积的5倍，收集＞60％洗脱液，浓缩(压力98Kpa、温度60℃)至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：0.85％。经分离检测，其中藏苷A为42.2g，藏苷B为18.3g。
实施例1.2藏波罗花总苯丙素苷的制备(使用第一种方法)
取粉碎细度达200目的藏波罗花药材，用30％的乙醇溶剂提取，其中，藏波罗花粉碎物与溶剂的重量/容量比为1∶20，将按比例混合好的藏波罗花粉碎物与上述溶剂置于提取釜中，提取温度为50℃，提取液浓缩后得相应的醇溶剂提取浓缩物，用HPD-100大孔吸附树脂柱进行层析，用甲醇水溶液梯度洗脱，收集其浓度＞60％的甲醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过60-100目硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用甲醇和正丁醇混合液，即甲醇∶正丁醇＝1∶0.5洗脱，体积为生药体积的8倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：0.97％。经分离检测，其中藏苷A为62.5g，藏苷B为15.8g。该制备过程中相关提取液及洗脱液的浓缩均为减压浓缩(压力98Kpa、温度60℃)。
实施例1.3藏波罗花总苯丙素苷的制备(使用第一种方法)
取粉碎细度达40目的藏波罗花药材，用90％的乙醇溶剂提取，其中，藏波罗花粉碎物与溶剂的重量/容量比为1∶2，将按比例混合好的藏波罗花粉碎物与上述溶剂置于提取釜中，提取温度为50℃，提取液浓缩后得相应的水提取浓缩物、用HPD-400大孔吸附树脂进行层析，用丙醇水溶液梯度洗脱，收集其浓度＞60％的丙醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过200-300目硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用丙醇和正丁醇混合液，即丙醇∶正丁醇＝1∶2.5洗脱，体积为生药体积的15倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：0.98％。经分离检测，其中藏苷A为51.7g，藏苷B为12.9g。该制备过程中相关提取液、萃取液及洗脱液的浓缩均为减压浓缩(压力98Kpa、温度80℃)。
实施例1.4藏波罗花总苯丙素苷的制备(使用第一种方法)
取粉碎细度达60目的藏波罗花药材，乙酸乙酯提取，其中，藏波罗花粉 碎物与溶剂的重量/容量比为1∶10，将按比例混合好的藏波罗花粉碎物与上述溶剂置于提取釜中，提取温度为30℃，提取液浓缩后得相应的乙酸乙酯提取浓缩物，用D001离子交换树脂进行层析，用乙醇水溶液梯度洗脱，收集其浓度＞60％的乙醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用乙醇和乙酸乙酯混合液，即乙醇∶乙酸乙酯＝1∶5洗脱，体积为生药体积的10倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：1.12％。经分离检测，其中藏苷A为67.1g，藏苷B为13.3g。该制备过程中相关提取液、萃取液及洗脱液的浓缩均为减压浓缩(压力98Kpa、温度60℃)。
实施例2.1藏波罗花总苯丙素苷的制备(使用第二种方法)
取粉碎细度达100目的藏波罗花药材，用水提取，浓缩后得水提取浓缩物、按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶20，进行萃取，浓缩萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过60-100目硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用甲醇和正丁醇混合液，即甲醇∶正丁醇＝1∶2.5洗脱，体积为生药体积的5倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：0.98％。经分离检测，其中藏苷A为61.1g，藏苷B为18.3g。该制备过程中相关提取液及洗脱液的浓缩均为减压浓缩(压力98Kpa、温度80℃)。
实施例2.2藏波罗花总苯丙素苷的制备(使用第二种方法)
取粉碎细度达200目的藏波罗花药材，用30％乙醇溶剂提取，浓缩后得醇溶剂提取浓缩物，按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶10，进行萃取，浓缩萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过200-300目硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用甲醇和乙酸乙酯混合液，即甲醇∶乙酸乙酯＝1∶0.5洗脱，体积为生药体积的10倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：1.09％。经分离检测，其中藏苷A为62.1g，藏苷B为17.5g。该制备过程中相关提取液及洗脱液的浓缩均为减压浓缩(压力98Kpa、温度80℃)。
实施例2.3藏波罗花总苯丙素苷的制备(使用第二种方法)
取粉碎细度达40目的藏波罗花药材，用90％的乙醇提取，浓缩后得醇溶剂提取浓缩物，按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶2，进行萃取，浓缩 萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过40-80目硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用丙醇和乙酸乙酯混合液，即丙醇∶乙酸乙酯＝1∶2.5洗脱，体积为生药体积的5-15倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：0.93％。经分离检测，其中藏苷A为60.4g，藏苷B为18.0g。该制备过程中相关提取液及洗脱液的浓缩均为减压浓缩(压力98Kpa、温度80℃)。
实施例2.4藏波罗花总苯丙素苷的制备(使用第二种方法)
取粉碎细度达80目的藏波罗花药材，用乙酸乙酯提取，浓缩后得乙酸乙酯提取浓缩物，按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶10，进行萃取，浓缩萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过60-100目硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用甲醇和正丁醇混合液，即甲醇∶正丁醇＝1∶1.5洗脱，体积为生药体积的10倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：1.12％。经分离检测，其中藏苷A为61.9g，藏苷B为18.8g。该制备过程中相关提取液及洗脱液的浓缩均为减压浓缩(压力98Kpa、温度80℃)。
实施例3.1藏波罗花总苯丙素苷的制备(使用第三种方法)
取粉碎细度达200目的藏波罗花药材，用水提取，浓缩后得水提取浓缩物，按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶20，进行萃取，浓缩萃取液，用D001离子交换树脂进行层析，用甲醇水溶液梯度洗脱，收集其浓度＞60％的甲醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过40-80目硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用甲醇和乙酸乙酯混合液，即甲醇∶乙酸乙酯＝1∶0.5洗脱，体积为生药体积的5倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：0.95％。经分离检测，其中藏苷A为45.2g，藏苷B为20.3g。
实施例3.2藏波罗花总苯丙素苷的制备(使用第三种方法)
取粉碎细度达100目的藏波罗花药材，用30％乙醇溶剂提取，浓缩后得醇溶剂提取浓缩物，按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶10，进行萃取，浓缩萃取液，用HPD-100大孔吸附树脂柱进行层析，用丙醇水溶液梯度洗脱，收集其浓度＞60％的丙醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过200-300目硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用丙醇和乙酸乙酯混合液，即丙醇∶乙酸乙酯＝1∶0.5～5洗脱，体积为生药体积的10倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：0.97％。经分离检测，其中藏苷A为60.5g，藏苷B为16.9g。该制备过程中相关提取液及洗脱液的浓缩均为减压浓缩(压力98Kpa、温度60℃)。
实施例3.3藏波罗花总苯丙素苷的制备(使用第三种方法)
取粉碎细度达40目的藏波罗花药材，用90％乙醇溶剂提取，浓缩后得醇溶剂提取浓缩物，按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶2，进行萃取，浓缩萃取液，用HPD-400大孔吸附树脂柱进行层析，用丙醇水溶液梯度洗脱，收集其浓度＞60％的丙醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过40-80目硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用丙醇和正丁醇混合液，即丙醇∶正丁醇＝1∶0.5～5洗脱，体积为生药体积的5倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：1.09％。经分离检测，其中藏苷A为52.7g，藏苷B为13.5g。该制备过程中相关提取液、萃取液及洗脱液的浓缩均为减压浓缩(压力98Kpa、温度80℃)。
实施例3.4藏波罗花总苯丙素苷的制备(使用第三种方法)
取粉碎细度达80目的藏波罗花药材，乙酸乙酯提取，浓缩后得乙酸乙酯提取浓缩物，按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶10，进行萃取，浓缩萃取液，用60-100聚酰胺柱进行层析，用乙醇水溶液梯度洗脱，收集其浓度＞60％的乙醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过60-100目硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用乙醇和乙酸乙酯混合液，即低级醇∶乙酸乙酯＝1∶2.5洗脱，体积为生药体积的5倍，收集＞60％洗脱液，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。得率：1.12％。经分离检测，其中藏苷A为66.5g，藏苷B为14.1g。该制备过程中相关提取液、萃取液及洗脱液的浓缩均为减压浓缩(压力98Kpa、温度60℃)。
实施例4.1.1片剂的制备：取藏波罗花总苯丙素苷50g，加入50g可压淀粉和40g梭甲基淀粉钠，混合均匀，70％的乙醇作为润湿剂，制软材，18 目筛制粒，烘干，16目筛整粒，加入3g硬脂酸镁作为润滑剂，混合均匀，压片、包衣，制成1000片包衣片。
实施例4.1.2片剂的制备：取藏波罗花总苯丙素苷10g，加入50g可压淀粉和40g梭甲基淀粉钠，混合均匀，70％的乙醇作为润湿剂，制软材，18目筛制粒，烘干，16目筛整粒，加入3g硬脂酸镁作为润滑剂，混合均匀，压片、包衣，制成1000片包衣片。
实施例4.2.1胶囊的制备：取藏波罗花总苯丙素苷50g，加入80g可压淀粉和20g梭甲基纤维素钠，混合均匀，以70％的乙醇润湿，制软材，24目筛制粒，烘干，20目筛整粒，加入3g硬脂酸镁，混合均匀，装胶囊，制成1000粒胶囊。
实施例4.2.2软胶囊的制备：取蜂蜡6g，置200g大豆油中，加热置熔融，放冷到室温后，加入50g藏波罗花总苯丙素苷，用胶体磨研磨均匀，置软胶囊生产设备上，压制成型，干燥，包装，制成500粒胶囊。
实施例4.3.1颗粒剂的制备：取藏波罗花总苯丙素苷100g，加入450g蔗糖粉、100g梭甲基纤维素钠、100g微晶纤维素和50g柠檬酸，混合均匀，以3％PVP为润湿剂制软材，20目筛制粒，烘干，18目筛整粒，分装，制成粒径为830-880μm的1000袋颗粒剂。每袋重0.72-0.78g
实施例4.3.2颗粒剂的制备
取藏波罗花总苯丙素苷300g，加入350g蔗糖粉、80g梭甲基纤维素钠、80g微晶纤维素和50g柠檬酸，混合均匀，以3％PVP为润湿剂制软材，20目筛制粒，烘干，18目筛整粒，分装，制成粒径为830-880μm的1000袋颗粒剂。每袋重0.80-0.85g。
实施例4.4.1粉针剂的制备
取藏波罗花总苯丙素苷12g，羟丙基-p-环糊精135g，加注射用水3L，搅成糊状，再加70℃～85℃的注射用水3L，溶解时温度控制在70℃～85℃，加甘露醇450g溶解，再用1moL/L盐酸溶液调pH值至5.6，加入针用炭后室温搅拌，过滤脱炭，精滤.滤液按每只2ml进行分装，采用速冻法干燥，将制品取出，进行封口，即得到性状为白色疏松块状物或粉末。
实施例4.4.2粉针剂的制备
取藏波罗花总苯丙素苷30g，环糊精375g，加注射用水3L，搅成糊状，再 加70℃～85℃的注射用水3L，溶解时温度控制在70℃～85℃，加乳糖300g溶解，再用1moL/L盐酸溶液调pH值至4.8，加入针用炭后室温搅拌，过滤脱炭，精滤。滤液按每只2ml进行分装，采用速冻法干燥，将制品取出，进行封口，即得到性状为白色疏松块状物或粉末。
实施例4.5.1滴丸的制备
将150g聚乙二醇4000在水浴上加热得熔融液，趁热加入藏波罗花总苯丙素苷细粉50g，搅拌均匀，65℃保温1小时，用滴丸机滴制，滴速120滴/分钟，滴制温度65-75℃，在15℃左右的液体石蜡中冷却，制得丸重约60mg，干燥，包衣，即得。
实施例4.5.2滴丸的制备
将150g聚乙二醇4000在水浴上加热得熔融液，趁热加入藏波罗花总苯丙素苷细粉80g，搅拌均匀，65℃保温1小时，用滴丸机滴制，滴速120滴/分钟，滴制温度65-75℃，在15℃左右的液体石蜡中冷却，制得丸重约60mg，干燥，包衣，即得。
实施例4.6.1口服液的制备
取蒸馏水适量，加入20g藏波罗花总苯丙素苷、180g蔗糖粉、20g柠檬酸，搅拌溶解，过滤，滤液补充蒸馏水至10000ml，加入香精适量，搅拌均匀，分装，每支10ml，压盖，100℃消毒1小时，检查合格，即得。
实施例4.6.2口服液的制备
取蒸馏水适量，加入100g藏波罗花总苯丙素苷、100g蔗糖粉、20g柠檬酸，搅拌溶解，过滤，滤液补充蒸馏水至10000ml，加入香精适量，搅拌均匀，分装，每支10ml，压盖，100℃消毒1小时，检查合格，即得。
实施例4.7.1粉剂的制备
取藏波罗花总苯丙素苷30g，粉碎成粒径为20μm粉状物，加入500g蔗糖粉、100g梭甲基纤维素钠、100g微晶纤维素混合均匀，分装，制成1000袋粉剂。每袋重0.68-0.73g。添加量为食品或饲料的0.01-1％。
实施例4.7.2粉剂的制备
取藏波罗花总苯丙素苷100g，粉碎成粒径为150μm粉状物，加入450g蔗糖粉、100g梭甲基纤维素钠、100g微晶纤维素混合均匀，分装，制成1000袋粉剂。每袋重0.70-0.75g。添加量为食品或饲料的0.01-1％。
Claims (1)
1.一种藏波罗花苯丙素苷组合物的制备方法，含有藏波罗花苯丙素苷化合物A和藏波罗花苯丙素苷化合物B，分别简称为：藏苷A和藏苷B，其组合物两者重量比为60-90∶40-10，两者含量之和占总苯丙素苷总重量的70％-100％，其中：
(1)藏苷A的结构为：
(2)藏苷B的结构为：
上述藏波罗花苯丙素苷组合物的制备方法，其特征在于：分别用三种方法可以制得，
(1)取粉碎细度达40～200目的藏波罗花药材，用水、30％-90％的乙醇溶剂或乙酸乙酯分别提取，其中，藏波罗花粉碎物与溶剂的重量/容量比为1∶2～20，将按比例混合好的藏波罗花粉碎物与上述溶剂置于提取釜中，提取温度为30℃～80℃，提取液浓缩后得相应的水提取浓缩物、醇溶剂提取浓缩物或乙酸乙酯提取浓缩物，分别用聚酰胺或大孔吸附树脂交换柱进行层析，用低级醇水溶液梯度洗脱，收集洗脱液浓度＞60％的低级醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用低级醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低级醇∶乙酸乙酯或正丁醇＝1∶0.5～5洗脱，体积为生药体积的5-15倍，收集洗脱液浓度＞60％的醇洗脱部位，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得；
(2)取粉碎细度达40-200目的藏波罗花药材，用水、30％-90％的乙醇溶剂或乙酸乙酯分别提取，浓缩后得水提取浓缩物、醇溶剂提取浓缩物或乙酸乙酯提取浓缩物，按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶2～20，进行萃取，浓缩萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用低级醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低级醇∶乙酸乙酯或正丁醇＝1∶0.5～5洗脱，体积为生药体积的5-15倍，收集洗脱液浓度＞60％的醇洗脱部位，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得；
(3)取粉碎细度达40-200目的藏波罗花药材，用水、醇溶剂和/或乙酸乙酯提取，浓缩后得水提取浓缩物、醇溶剂提取浓缩物或乙酸乙酯提取浓缩物，按浓缩物与乙酸乙酯的重量/容量比为1∶2～20，进行萃取，浓缩萃取液，分别用聚酰胺或大孔吸附树脂交换柱进行层析，用低级醇水溶液梯度洗脱，收集洗脱液浓度＞60％的低级醇水溶液洗脱部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的组合物；通过硅胶柱吸附进一步精制，用20％乙醇淋洗除杂，再用低级醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低级醇∶乙酸乙酯或正丁醇＝1∶0.5～5洗脱，体积为生药体积的5-15倍，收集洗脱液浓度＞60％的醇洗脱部位，浓缩至无有机溶剂味，干燥后粉碎、喷雾干燥或冷冻干燥，即得。
在方法(1)、(2)和(3)中所述低级醇为甲醇、乙醇、丙醇，即C1～C3醇类，其重量浓度为30％～90％；
在方法(1)和(3)中所述的交换柱采用聚酰胺，其目数为30-60目、60-100目或100-120目；大孔吸附树脂，其型号为HPD-100、HPD-100A、HPD-400或HPD-400A；
在方法(1)、(2)和(3)中所述的硅胶柱，目数是：40-80目、60-100目或200-300目。
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