CN113876785B - P-3Fax-Neu5Ac的新的药物用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了P‑3Fax‑Neu5Ac的新的药物用途。P‑3Fax‑Neu5Ac可以在细胞中显著降低不溶性tau聚集物，并在小鼠脑内有效阻止tau病理的产生和传播，能够用于制备治疗阿尔茨海默病药物。

Description

P-3Fax-Neu5Ac的新的药物用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及P-3Fax-Neu5Ac在制备阿尔茨海默病药物中的 应用，为阿尔茨海默病的治疗提供了新的药物选择。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，简称AD)，俗称老年痴呆，是老年人中常见的一 种神经退行性疾病，表现为学习记忆障碍，失语、失用、失认，人格行为改变等全面性痴呆。 现有药物仅能缓解部分症状，无法有效治疗或延缓病程。AD有两大神经病理学特征：细胞 外的由β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)形成的淀粉样斑块(amyloid plaques)和细胞内的主 要由异常过度磷酸化tau蛋白聚集而成的神经纤维缠结(neurofibrillarytangle,NFT)。遏制 Aβ和tau病理的发展是治疗AD的重要方案。Tau是目前AD药物开发的重要靶点。现有若 干针对tau病理的药物正在进行临床试验，其作用靶点包括：针对tau的主动免疫和被动免 疫、抑制tau磷酸化、抑制tau聚集和促进tau降解等(Iqbal,K.,F.Liu,etal.(2018)."Recent developments with tau-based drug discovery."Expert OpinDrug Discov 13(5):399-410.)。
神经纤维缠结NFT的主要成分是异常过度磷酸化的tau蛋白聚集而形成的双螺旋丝 (paired helical filaments，PHFs),该病理起始于蓝斑核、内嗅皮层移行区(Braak I，II级)， 进而发展至包括海马区在内边缘系统(Braak III，IV级)，最后侵袭大脑皮层(Braak V，VI 级)，显示出固定的进行模式。临床上根据tau病理的分布和扩散情况对AD进行病理诊断 和分级，即Braak分级(Braak,H.and E.Braak(1995)."Staging ofAlzheimer's disease-related neurofibrillary changes."Neurobiol Aging 16(3):271-278；discussion 278-284.)。越来越多的研 究提示，人脑中tau病理传播是导致AD病程进展的关键原因之一，抑制tau病理可能对延 缓或阻止AD病理传播起到积极作用。目前理论认为，AD病人脑内存在毒性寡聚体tau，能 够诱导正常tau蛋白发生构象改变和过度磷酸化，进而相互聚集形成不溶性的神经纤维缠结。 因此，抑制tau的磷酸化和聚集，被认为是治疗AD的潜在途径(Chu,D.and F.Liu(2018). "Pathological Changes of TauRelated to Alzheimer's Disease."ACS Chem Neurosci.)。
Neu5Ac(N-acetylneur aminic acid，N-乙酰神经氨酸)是分布最广、最具代表性的唾液酸， 构成神经节苷脂(ganglioside)中鞘糖脂(glycospinglipid)的主要成分。Neu5Ac参与细胞识别、 信号转导、肿瘤发生、受精等多个生理过程。以唾液酸为主体结构的一系列药物已被用于癌 症、炎症及流感的治疗。
P-3Fax-Neu5Ac(分子式C22H30FNO14)，是全乙酰化的3-氟唾液酸，中文化学名为：5-(乙酰氨基)-3,5-二脱氧-3-氟-D-赤型-α-L-甘露基-2-非酮吡喃甲酸甲酯2,4,7,8,9-五乙酸(5- (acetylamino)-3,5-dideoxy-3-fluoro-D-erythro-α-L-manno-2-nonulopyranosonic acid methyl ester 2,4,7,8,9-pentaacetate；)，结构式如下：
Figure BDA0003230717880000021
Rillahan首次对P-3Fax-Neu5Ac进行了报道，对P-3Fax-Neu5Ac进入细胞后，转变为神经 酰胺转移酶(也称唾液酸转移酶，sialyltransferases)的竞争性底物，抑制正常神经酰胺转移 酶的功能，降低细胞中蛋白质和脂类的唾液酸化水平(Rillahan,C.D.,A.Antonopoulos,et al. (2012)."Global metabolic inhibitors of sialyl-andfucosyltransferases remodel the glycome."Nat Chem Biol 8(7):661-668.)。进一步研究显示，使用黑色素瘤细胞表面过表达的蛋白质的抗体 包被P-3Fax-Neu5Ac纳米药物形成囊泡。对黑色素瘤小鼠给予药物后，肺部的肿瘤结节发生 率比没有接受药物的小鼠低75％。
目前尚未有P-3Fax-Neu5Ac新的药理活性的研究报道。
发明内容
本发明首次发现P-3Fax-Neu5Ac可以在细胞中显著降低不溶性tau聚集物，并在小鼠脑 内有效阻止tau病理的产生和传播，是抑制AD tau病理的有效药物。提供了P-3Fax-Neu5Ac 新的药物用途。
本发明具体技术方案如下：
P-3Fax-Neu5Ac在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用，所述P-3Fax-Neu5Ac结构式为：
Figure BDA0003230717880000022
所述P-3Fax-Neu5Ac能够抑制AD O-tau诱导的tau聚集，抑制并减缓tau病理在脑中的扩散 传播。
本发明所述的应用，P-3Fax-Neu5Ac作为唯一药物活性成分或者与治疗阿尔茨海默病的药物 进行组合用于阿尔茨海默病的治疗。
进一步的，所述药物还包括药学上可接受的载体。
进一步的，所述药物为注射剂。
本发明优点：
本发明首次发现P-3Fax-Neu5Ac可以在细胞中显著降低不溶性tau聚集物，并在小鼠脑 内有效阻止tau病理的产生和传播，是抑制AD tau病理的有效药物。提供了P-3Fax-Neu5Ac 新的药物用途。
附图说明
图1为P-3Fax-Neu5Ac在细胞中抑制AD O-tau诱导的tau聚集。(A)293T细胞处理相应浓 度P-3Fax-Neu5Ac 48小时，提取蛋白质，以SNA进行凝集素印迹实验，检测蛋白质α-2,6唾 液酸修饰的变化。GAPDH作为上样对照物。(B)对A图中的条带灰度进行计算、统计和比较。数据显示为平均值±标准误。统计使用单因素方差分析。**，p<0.01；***，p<0.001。 (C)293T细胞转染HA-tau151-391，转染后6小时，加入AD O-tau诱导HA-tau151-391聚集。 非诱导组加入Saline。同时，以25μM P-3Fax-Neu5Ac处理细胞。转染后48小时，裂解细胞 分离不溶性tau聚集物，以HA抗体进行western blot检测，分析不可溶性tau聚集物的含量。 GAPDH作为上样对照物。(D)对C图中的条带灰度进行计算、统计和比较。数据显示为平 均值±标准误。统计使用双因素方差分析。*，p<0.05。
图2为P-3Fax-Neu5Ac显著减少tau病理传播。(A)鼠脑免疫荧光染色。Saline+DMSO组小 鼠脑海马区注射生理盐水，尾静脉注射含16％DMSO的生理盐水(作为P-3Fax-Neu5Ac的空溶剂对照)。O-tau+DMSO组小鼠脑海马区注射AD O-tau，尾静脉注射含16％DMSO的 生理盐水。O-tau+P-3Fax-Neu5Ac组小鼠脑海马区注射AD O-tau，尾静脉注射P-3Fax-Neu5Ac。 16月龄时，灌注取脑，以AT8抗体进行常规免疫荧光染色标记磷酸化tau，以Hoechst标记 细胞核。左列:海马区和部分大脑皮层区域示意图。中列：为左列白色虚线框的放大，箭头 指示AT8阳性细胞。右列：在中列图的基础上叠加Hoechst细胞核标记。(B)统计每组小 鼠脑中AT8阳性细胞数量，进行统计学分析比较。数据显示为平均值±标准误。统计使用单 因素方差分析。*，p<0.05。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例的限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含 义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了 举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详尽描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
本发明实施例中所使用的P-3Fax-Neu5Ac，购自于Millipore(货号566224-10MG)。
实施例1
分别使用25μM、50μM、100μM P-3Fax-Neu5Ac处理293T细胞，48小时后提取蛋白质，进行接骨木凝集素(Sambucus Nigra Lectin，SNA)印迹实验，检测蛋白质α-2,6唾液酸修饰的变化。具体操作如下：细胞培养在含10％fetal bovine serum(FBS)的Dulbecco’smodified Eagle’s medium(DMEM)培养基中，分别加入相应浓度的P-3Fax-Neu5Ac，置于37℃5％CO2细胞培养箱中。48小时后，以含有10％蛋白酶抑制剂的上样缓冲液裂解细胞[125mMTris- HCl,pH 6.8,10％甘油,10％β-巯基乙醇,2％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.004％溴酚蓝]。沸水煮 5min,测定蛋白质浓度，上样相同量的蛋白质，以10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将 蛋白质电转到polyvinylidene fluoride(PVDF)膜上。作为上样对照的GAPDH，转膜后按常规 Western blot操作进行封闭，一抗、二抗孵育，显影。用于凝集素印迹的膜，用无蛋白封闭 液封闭1小时，转入含1:10000生物素标记的接骨木凝集素(Biotinylated-SNA)的磷酸盐缓 冲盐溶液(PBS)孵育30分钟。PBS洗三遍后，以含有1:10000辣根过氧化酶的二抗孵育 30分钟，PBS洗三遍后，与化学发光液共孵育，曝光、显影。
结果如图1A、1B所示。
结果显示25μM、50μM、100μM P-3Fax-Neu5Ac可显著降低蛋白质α-2,6唾液酸修饰。后 续采取25μM P-3Fax-Neu5Ac处理细胞，检测其对tau聚集的影响。
实施例2
将带有血凝素(hemagglutinin，HA)标签蛋白的人tau151-391截断体(HA-tau151-391)，转 染至293T细胞。转染后6小时，加入AD患者脑中提取的毒性寡聚体tau(AD O-tau)诱导HA-tau151-391聚集。转染后48小时，RIPA缓冲液裂解细胞。53000×g，4度离心45分钟，取 得沉淀即为不溶性tau聚集物。沉淀加入200μl RIPA缓冲液，53000×g，4度离心15分钟洗 去杂质。沉淀加入western blot上样缓冲液，超声至溶解(超声条件：10％最大功率，0.5s开，3s关，超声总时长2分钟)，以HA标签抗体进行western blot检测，即可鉴定细胞中不可溶性tau聚集物的含量(Gu,J.,W.Xu,et al.(2020)."Truncation of tau selectivelyfacilitates its pathological activities."J Biol Chem.)。利用该tau病理的细胞模型，鉴定P-3Fax-Neu5Ac对 tau聚集的抑制作用。
结果如图1C和1D所示，293T细胞转染HA-tau151-391后，不加AD O-tau诱导(Saline组)，不溶性沉淀中也可检测到少量HA-tau151-391，这是由于HA-tau151-391存在自聚集现象。Saline+P-3Fax-Neu5Ac组与Saline+Con组相比显示，25μM P-3Fax-Neu5Ac不影响HA-tau151-391自聚集。AD O-tau+Con组显示AD O-tau的加入，明显诱导了HA-tau151-391的聚集，显示 为不溶性tau的量显著增加。而25μM P-3Fax-Neu5Ac显著抑制了AD O-tau引起的HA-tau151-391聚集(AD O-tau+P-3Fax-Neu5Ac组)。该结果表明，P-3Fax-Neu5Ac可在细胞模型中抑制 ADO-tau诱导的tau聚集。
实施例3
参照文献(Hu,W.,X.Zhang,et al.(2016)."Hyperphosphorylation determinesboth the spread and the morphology of tau pathology."Alzheimers Dement 12(10):1066-1077.)在小鼠脑海马区 注射AD患者脑中提取的AD O-tau，模拟AD患者脑中tau病理随着病程的发展而逐渐从海 马区扩散至皮层区域的过程，构建tau病理传播模型。
具体实验过程如下：C57BL/6J小鼠4月龄时海马区注射AD O-tau 2μl，对照组注射等体 积生理盐水(Saline)。注射后3天，尾静脉注射P-3Fax-Neu5Ac 20mg/kg体重，每天一次， 连续5天。小鼠7月龄、10月龄时，重复上述剂量尾静脉注射P-3Fax-Neu5Ac。对照组尾静脉注射等体积16％二甲亚砜(DMSO)溶液，作为空溶剂对照。16月龄小鼠以4％多聚甲醛(PFA)灌注后取脑，冰冻状态下制备40μm厚的组织切片。经过PBS清洗，以含有 0.3％TritonX-100的PBS透膜处理后，山羊血清封闭液(5％NGS,0.1％Triton,0.05％Tween-20in PBS)封闭1小时，1:500加入小鼠AT8抗体(标记磷酸化tau)4℃孵育过夜。PBS洗 三次，使用Cy5-goat anti mouse荧光二抗室温孵育2小时。1:10000加入Hochest孵育15分 钟以标记细胞核。PBS清洗过后，将组织切片贴在载玻片上，封片。
结果如图2所示，结果显示，Saline+DMSO组小鼠脑海马区仅注射生理盐水，未注射AD O-tau；尾静脉仅注射空溶剂，该组小鼠脑中tau病理信号较少。O-tau+DMSO组小鼠脑海马 区注射AD O-tau诱导tau病理传播，尾静脉仅注射空溶剂，在大脑皮层检测出大量tau病理 信号(图2A，第二行白色箭头，图2B)，说明tau病理从海马区传播至皮层区域，模型构建成功。O-tau+P-3Fax-Neu5Ac组小鼠脑海马区注射AD O-tau诱导tau病理传播，同时尾静脉注射P-3Fax-Neu5Ac，大脑皮层中的tau病理信号显著减少(图2A，第三行白色箭头，图 2B)，说明P-3Fax-Neu5Ac可有效抑制并减缓tau病理传播。

Claims (4)

1. P-3Fax-Neu5Ac在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用，所述P-3Fax-Neu5Ac结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，所述P-3Fax-Neu5Ac能够抑制ADO-tau诱导的tau聚集，抑制并减缓tau病理在脑中的扩散传播。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于P-3Fax-Neu5Ac作为唯一药物活性成分或者与治疗阿尔茨海默病的药物进行组合。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物还包括药学上可接受的载体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为注射剂。
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