CN112839712A - 用于减少或治疗发炎的组合物和方法 - Google Patents

用于减少或治疗发炎的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112839712A
CN112839712A CN201980054580.3A CN201980054580A CN112839712A CN 112839712 A CN112839712 A CN 112839712A CN 201980054580 A CN201980054580 A CN 201980054580A CN 112839712 A CN112839712 A CN 112839712A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
composition
acid entity
entity
salt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980054580.3A
Other languages
English (en)
Inventor
迈克尔·哈米尔
瑞弗·亚非恩
李中伟
哈利·路易特哈特
西蒙·青山
斯维特拉娜·马鲁基安
纳丁·道尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Axcella Health Inc
Original Assignee
Axcella Health Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Axcella Health Inc filed Critical Axcella Health Inc
Publication of CN112839712A publication Critical patent/CN112839712A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/175—Amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本公开提供了用于减少或治疗例如在患有炎性病状或病症的对象中的发炎的组合物和方法。

Description

用于减少或治疗发炎的组合物和方法
相关申请
本申请要求2018年6月20日申请的美国序列号62/687,724的优先权，以及要求2018年11月9日申请的美国序列号62/758,249的优先权，以及要求2019年1月18日申请的美国序列号62/794,165的优先权，其内容通过引用整体结合到本文中。
背景技术
在对伤害性刺激(noxious stimuli)的反应中，发炎(inflammation)涉及一系列生理和免疫机制以启动修复过程。炎性疾病是人类发病率和死亡率的重要原因。目前可用的用于发炎的治疗有多种副作用，例如肾上腺抑制、骨弱化、肌肉耗损(muscle wasting)、消化性溃疡、低钾血症和免疫系统抑制。
鉴于可用治疗的广泛发生和副作用，仍然需要抗炎剂，例如，减少对象发炎的膳食组合物和治疗剂。
发明内容
本文提供了包含氨基酸实体的组合物(例如，活性部分)，其用于改善或减少对象，例如，患有炎性病状或病症(inflammatory condition or disorder)的对象的发炎。所述组合物可用于减少和/或治疗(例如，逆转、减少、改善或预防)有需要的对象(例如，人)中的发炎的方法中。所述方法可进一步包括在施用包含氨基酸实体的组合物之后监测对象的纤维化的一种或多种症状的改善。
在一方面，本发明的特征在于一种用于减少对象的发炎的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的组合物(例如，活性部分)，所述组合物包含：
a)亮氨酸氨基酸实体，
b)精氨酸氨基酸实体，
c)谷氨酰胺氨基酸实体；以及
d)N-乙酰基半胱氨酸(NAC)实体；
从而减少对象的发炎。
在一些实施例中，发炎不是肝发炎。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的对象的炎性病状或病症的方法，其包括向所述对象施用有效量的组合物(例如，活性部分)，所述组合物包含：
a)亮氨酸氨基酸实体，
b)精氨酸氨基酸实体，
c)谷氨酰胺-氨基酸实体；以及
d)NAC-实体；
从而治疗炎性病状或病症。
在一些实施例中，炎性病状或病症不是肝炎性病状或病症。
在另一方面，本发明的特征在于一种用于减少对象的发炎的组合物，其包含有效量的组合物，所述组合物包含：
a)亮氨酸氨基酸实体，
b)精氨酸氨基酸实体，
c)谷氨酰胺氨基酸实体；以及
d)N-乙酰基半胱氨酸(NAC)-实体；
条件是：
所述发炎不是肝发炎。
在另一个方面，本发明的特征在于一种用于治疗有需要的对象的炎性病状或病症的组合物，其包含有效量的组合物，所述组合物包含：
a)亮氨酸氨基酸实体，
b)精氨酸氨基酸实体，
c)谷氨酰胺氨基酸实体；以及
d)NAC实体；
条件是：
所述炎性病状或病症不是肝炎性病状或病症。
所述炎性病状或病症不是肝脏炎性病状或病症。在一些实施方案中，所述炎性病状或病症选自：胃肠道炎性病状或病症、肺部炎性病状或病症、皮肤炎性病状或病症、心血管系统炎性病状或病症、神经系统炎性病状或病症、肾脏炎性病状或病症、胰腺炎性病状或病症、关节炎性病状或病症、眼部炎性病状或病症、内分泌系统炎性病状或病症，或其组合。
在一些实施方案中，所述炎性病状或病症选自：传染病、自身免疫性疾病、血管疾病、组织或器官移植、缺血(ischemia)、败血症(sepsis)、伤口愈合、手术、淀粉样变性(amyloidosis)、结节病(sarcoidosis)或其组合。
在一些实施方案中，所述方法还包括确定以下中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多种(例如，全部)的水平：(a)C-反应蛋白；(b)IL-1β；(c)IL-2；(d)IL-10；(e)MCP-1；(f)MIP-1；(g)NF-kB；(h)TNFα；(i)丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase)(ALT)；或(j)天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase)(AST)。
另一方面，本发明的特征在于一种在对象中抑制M1表现型或促进M2表现型中的一种或两种的方法，包括施用予对象有效量的组合物(例如活性部分)，该组合物包含：
a)亮氨酸氨基酸实体，
b)精氨酸氨基酸实体，
c)谷氨酰胺氨基酸实体；以及
d)NAC实体；
从而在对象中抑制M1表现型或促进M2表现型。
在一些实施方案中，所述方法还包括确定对象中抗炎性趋化因子(例如CCL18)的水平。在一些实施方案中，组合物的施用增加对象中抗炎性趋化因子(例如CCL18)的水平或活性。
在一些实施方案中，组合物的施用导致粘膜修复、肠稳衡(homeostasis)、脑膜重塑、血管修复、中枢神经系统(CNS)髓鞘再生、CNS自身免疫调节或葡萄糖稳衡中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种(例如全部)的改善。
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)还包含(e)异亮氨酸-氨基酸实体或(f)缬氨酸氨基酸实体中的一种或两种。
在一些实施例中，(a)-(d)或(a)-(f)的总重量％(wt％)大于组合物(例如，呈干燥形式)其他氨基酸实体组分、非氨基酸实体蛋白质组分(例如乳清蛋白)或非蛋白质组分(或两者)中的一种、两种或三种的总重量％，例如，(a)-(d)或(a)-(f)至少为所述组合物中的氨基酸实体组分中的一者或两者或全部组分(例如，呈干燥形式)的总重量的50重量％、75重量％或90重量％。
在一些实施例中，所述组合物包含18个或更少、15个或更少、或10个或更少的氨基酸实体的组合，例如，所述组合包含所述组合物中的氨基酸实体组分或全部组分(例如，呈干燥形式)的总重量的至少42重量％、75重量％或90重量％。
在一些实施例中，组合物不包含长度超过20个氨基酸残基的肽(例如，乳清蛋白)，或者如果存在长度超过20个氨基酸残基的肽，则该肽以小于所述组合物(例如，呈干燥形式)的非氨基酸实体蛋白质组分或全部组分的总重量的10重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少存在。
在一些实施例中，组合物中不存在甲硫氨酸、色氨酸、缬氨酸或半胱氨酸中的至少一种、两种、三种或更多种(例如，全部)，或者如果存在，则以小于例如，所述组合物(例如，呈干燥形式)中的全部组分的总重量的10重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少存在。在一些实施例中，甲硫氨酸、色氨酸、缬氨酸或半胱氨酸中的一种、两种、三种或更多种(例如，全部)如果存在，则以游离形式存在。在一些实施例中，甲硫氨酸、色氨酸、缬氨酸或半胱氨酸中的一种、两种、三种或更多种(例如，全部)如果存在，则以盐形式存在。
在一些实施例中，甲硫氨酸、色氨酸、缬氨酸或半胱氨酸，如果存在，可以存在于寡肽、多肽或蛋白质中，条件是蛋白质不是乳清、酪蛋白、乳清蛋白或用作营养补充剂、医疗食品或类似产品的任何其它蛋白质，无论是作为完整蛋白质或蛋白质水解产物(hydrolysate)存在。
在一些实施例中，(a)-(f)中的至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个(例如，全部)选自表1。
在一些实施例中，亮氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体的重量比为1+/-20％：1.5+/-20％：2+/-20％：0.15±20％。在一些实施例中，亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体的重量比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：1.5+/-20％：2+/-20％：0.15±20％。
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包含：
a)亮氨酸氨基酸实体，其选自：i)L-亮氨酸或其盐，ii)包含L-亮氨酸的二肽或其盐，或三肽或其盐，或iii)β-羟基-β-甲基丁酸(HMB)或其盐；
b)精氨酸氨基酸实体，其选自：i)L-精氨酸或其盐，ii)包含L-精氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐，iii)肌酸或其盐，或iv)包含肌酸的二肽或其盐、或三肽或其盐；
c)所述谷氨酰胺氨基酸实体为L-谷氨酰胺或其盐，或包含L-谷氨酰胺的二肽或其盐、或三肽或其盐；以及
d)所述NAC实体是NAC或其盐，或包含NAC的二肽或其盐。
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)还包含以下中的一种或两种：e)L-异亮氨酸或其盐或包含L-异亮氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐；或f)L-缬氨酸或其盐或包含L-缬氨酸的二肽或其盐或三肽或其盐。
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包含：a)所述亮氨酸氨基酸实体是L-亮氨酸或其盐；b)所述精氨酸氨基酸实体是L-精氨酸或其盐；c)所述谷氨酰胺氨基酸实体为L-谷氨酰胺或其盐；和d)所述NAC实体是NAC或其盐。
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包含：a)所述亮氨酸氨基酸实体是L-亮氨酸或其盐；b)所述精氨酸氨基酸实体是L-精氨酸或其盐；c)所述谷氨酰胺氨基酸实体为L-谷氨酰胺或其盐；d)所述NAC实体为NAC或其盐；e)所述异亮氨酸氨基酸实体是L-异亮氨酸或其盐；和f)所述缬氨酸氨基酸实体是L-缬氨酸或其盐。
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)与药学上可接受的载剂一起调配。
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)被调配为膳食组合物。
附图说明
图1A-1B是显示用氨基酸组合物(氨基酸组合物A-1)处理对STAM小鼠模型(图1A)和FATZO小鼠模型(图1B)中的NAFLD活性评分、气球样膨大(ballooning)和发炎的影响的图。
图2是表示对STAM和FATZO小鼠施用氨基酸组合物的处理方案的示意图。
图3A-3E是一系列图和图像，显示用氨基酸组合物处理STAM和FATZO小鼠对NAFLD活性评分(NAS)、脂肪变性、发炎和肝发炎(如用组织学所确定的)的影响。
图4是在STAM小鼠中用氨基酸组合物处理后肝脏基因表达模式的基因图谱，显示了ACOX1的激活。
图5A-5D是在STAM小鼠中用氨基酸组合物处理后肝脏基因表达模式的基因图谱，显示了抗炎性IL-10的上游调节剂(upstream regulator)的激活(图5A)；促炎性NF-kB(图5B)、干扰素、IL-1B和IL-2的抑制(图5C)；和纤维发生TGF-b信号传导路径的抑制(图5D)。
图6是显示用氨基酸组合物处理后，作为C-C趋化因子受体2型(CCR2)和5型(CCR5)的配体的MCP-1和MIP-1蛋白水平的系列图。
图7是显示施用所示氨基酸组合物后FATZO小鼠肝脏组织学的一系列显微图像(H&E染色或用于胶原沉积的天狼星红染色(Sirius Red stain)。
图8是显示施用所示氨基酸组合物后来自FATZO小鼠的肝组织学的一系列显微图像。
图9是显示在施用所示氨基酸组合物后在来自FATZO小鼠的固定肝组织中观察到的NAFLD活性评分(左上图)、天狼星红染色(右上图)、脂肪变性水平(左下图)和气球样膨大(右下图)的一系列图。
图10A-10B是一系列图，显示用氨基酸组合物处理人类对象对除细胞角蛋白18(cytokeratin 18)(CK-18)M65(图10B)外的丙氨酸转氨酶(ALT)和C-反应蛋白(CRP)(图10A)水平的影响。
具体实施方式
本文部分描述了包含氨基酸实体的组合物(例如，活性部分)和通过施用有效量的组合物来减少发炎的方法。可施用所述组合物以治疗或预防有需要的对象的炎性病状或病症。已仔细选择氨基酸实体和组合物中的氨基酸实体的相对量，例如，以减少需要许多生物、细胞和分子过程的协调的对象(例如，患有炎性病状或病症的对象)的发炎。该组合物允许对组织生理学的多路径有益作用，以优化炎性反应中涉及的信号路径的调节、发炎中涉及的细胞因子(cytokine)的表达，以及炎性效应细胞(effector cells)的活化。特别地，所述组合物已经被特别地定制以减少促炎性并增加抗炎性细胞因子的产生，和减少炎性路径信号传导。
在以下详细描述的实施例中，本发明的组合物通过减少NFkB信号传导、减少炎性基因和蛋白质表达(例如IL-6、IL-1β、MCP-1、MIP-1和TNFalpha)、增加抗炎性基因和蛋白质表达(例如IL-10和IL-2)，以及减少发炎效应细胞(例如肝星状细胞)的活化来改善发炎。
在以下详细描述的另一个实施例中，本发明的组合物通过在M2巨噬细胞中暴露IL-4后增加抗炎性趋化因子CCL18分泌来改善发炎。
定义
除非另有说明，权利要求书和说明书中使用的术语如以下所定义。
必须注意，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一”，“一个”和“该(或所述)”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。
如本文所用，术语“氨基酸实体”是指呈游离形式或盐形式(或两者)的左旋(L)-氨基酸，肽中的L-氨基酸残基小于20个氨基酸残基(例如，寡肽，例如二肽或三肽)、氨基酸的衍生物、氨基酸的前驱体或氨基酸的代谢物(参见例如表1)。氨基酸实体包括能够影响游离L-氨基酸的生物学功能的氨基酸衍生物、氨基酸前驱体、氨基酸代谢物或氨基酸的盐形式。氨基酸实体不包括完整或修饰形式(例如水解形式)的大于20个氨基酸残基的天然多肽或蛋白质。
氨基酸盐包括任何可摄入的盐。对于药物组合物，组合物中存在的氨基酸的盐形式(例如，活性部分)应为药学上可接受的盐。在一个具体的例子中，盐形式是氨基酸的盐酸盐(HCl)盐形式。
在一些实施例中，氨基酸实体的衍生物包含氨基酸酯(例如，烷基酯，例如氨基酸实体的乙酯或甲酯)或酮酸。
表1.氨基酸实体包括本文所述组合物的氨基酸、前驱体、代谢物和衍生物。
Figure BDA0002944254760000091
给定测量的性质或精确度，“大约”和“近似”通常是指所测定数量的可接受的误差程度。示例性误差程度在给定值或值范围的15个百分点(％)以内，通常在10％以内，更通常在5％之内。
“氨基酸”是指具有氨基(-NH2)，羧酸基(-C(＝O)OH)和通过中心碳原子键合的侧链的有机化合物，包括必需的和非必需的氨基酸以及天然、非蛋白质和非天然氨基酸。
如本文所用，术语“活性部分”是指总体上具有如本文所述的生理作用，例如抗炎性作用的能力的四个或更多个氨基酸实体的组合。例如，活性部分可以在患有疾病或病症的对象中重新平衡代谢功能障碍。本发明的活性部分可以包含其他生物活性成分。在一些实例中，活性部分包括四个或更多个氨基酸实体的确定的组合，如下文详述。在其他实施例中，活性部分由氨基酸实体的确定的组合组成，如下文所详述。
各个氨基酸实体以各种量或比例存在于组合物(例如活性部分)中，其可以表示为重量(例如，以克计)、氨基酸实体彼此之间的重量比、摩尔量、组合物的重量百分比、组合物的摩尔百分比、热量含量、对组合物的热量贡献百分比等。通常，本发明将提供剂型形式的氨基酸实体的克数、氨基酸实体相对于组合物重量(即，组合物中存在的所有氨基酸实体和任何其他生物活性成分的重量)的重量百分比、或比例。在一些实施例中，组合物，例如活性部分作为药学上可接受的制剂(例如药物产品)提供。
如本文所用，术语“有效量”是指本发明的活性物质在本发明的组合物中，特别是本发明的药物组合物中的量，其足以减轻症状和/或改善待治疗的病状(例如，提供所需的临床反应)。用于组合物中的活性物质的有效量将根据所治疗的特定病状、病状的严重度、治疗持续时间、并用疗法(concurrent therapy)的性质、所采用的特定活性物质、特定的药学上可接受的赋形剂和/或使用的载剂，以及主治医师知的识和专长的类似因素而变化。
本文所述的“药物组合物”包含至少一种“活性部分”和药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施例中，药物组合物用作治疗剂。不需要满足药物标准的其他组合物(GMP；药物级组分)可以用作营养保健品，医疗食品或补充剂，它们被称为“消费者健康组合物”。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合与人和动物的组织接触使用的氨基酸、材料、赋形剂、组合物和/或剂型，没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，且具有合理的获益/风险比。在一个具体的实施例中，“药学上可接受的”是指不含可检测的内毒素或内毒素水平低于药物产品中可接受的水平。
在一个具体的实施例中，“药学上可接受的”是指由制药业或监管制药业的机构或实体(例如，政府或贸易机构或实体)使用的标准，以确保一个或多个产品质量参数在药物、药物组合物、治疗或其他治疗剂的可接受范围内。产品质量参数可以是制药业或机构或实体(例如政府或贸易机构或实体)规定的任何参数，包括但不限于组合物；组合物均匀性；剂量；剂量均匀性；污染物或杂质的存在、不存在和/或含量；以及无菌等级(例如，微生物的存在、不存在和/或含量)。政府监管机构的示例包括：联邦药品管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMA)、瑞士医药管理局、中国食品药品监督管理局(CFDA)或日本药品医疗器械管理局(PMDA)。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指药物配方中除活性剂以外的在生理上相容的成分。药学上可接受的赋形剂可包括但不限于缓冲剂、甜味剂、分散增强剂、调味剂、苦味遮蔽剂、天然色素、人工色素、稳定剂、溶剂或防腐剂。在一个具体的实施例中，药学上可接受的赋形剂包括柠檬酸或卵磷脂中的一种或两种。
如本文所用，术语“非氨基酸实体蛋白质组分”是指肽(例如，多肽或寡肽)，其片段或降解肽。示例性的非氨基酸实体蛋白质组分包括但不限于乳清蛋白、卵白蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、大麻蛋白、豌豆蛋白、糙米蛋白、或其片段或降解肽中的一种或多种。
如本文所用，术语“非蛋白质组分”是指除蛋白质组分以外的组合物的任何组分。示例性非蛋白质组分可包括但不限于糖类(例如单糖(例如右旋糖、葡萄糖或果糖)、二糖、寡糖或多糖)。脂质(例如，含硫脂质(例如，α-硫辛酸)，长链甘油三酸酯，ω3脂肪酸(例如EPA、DHA、STA、DPA或ALA)，ω6脂肪酸(GLA、DGLA或LA)，中链甘油三酸酯或中链脂肪酸)；维生素(例如维生素A、维生素E、维生素C、维生素D、维生素B6、维生素B12、生物素或泛酸)；矿物质(锌、硒、铁、铜、叶酸盐、磷、钾、锰、铬、钙或镁)；或固醇(例如胆固醇)。
如果组合物、配方或产品提供所需的临床效果，则为“治疗性(therapeutic)”。期望的临床效果可以通过减轻疾病的进展和/或缓解疾病的一种或多种症状来显示。
“单位剂量(unit dose或unit dosage)”包括进行市场销售以供使用的形式的一种或多种药物产品，它们具有活性和非活性组分(赋形剂)的特定混合物，具有特定的组态(例如胶囊壳)，并分配为特定剂量(例如多个棒状包)。
如本文所用，发炎(例如炎性病状或病症)的术语“治疗(treat,treating ortreatment)”是指改善发炎(例如减缓、阻止或减少发炎或其至少一种临床症状的发展)；缓解或改善至少一种物理参数，包括患者可能无法辨别的那些参数；和/或预防或延迟发炎的发生、发展或进展。
包含氨基酸实体(例如，活性部分)的组合物
本文所述的本发明组合物(例如活性部分)包含氨基酸实体，例如表1所示的氨基酸实体。
在一些实施例中，亮氨酸氨基酸实体选自L-亮氨酸、β-羟基-β-甲基丁酸(HMB)、氧代-亮氨酸(α-酮异己酸(KIC))、异戊酰基-CoA、N-乙酰基-亮氨酸或它们的组合。
在一些实施例中，精氨酸氨基酸实体选自L-精氨酸、肌酸、精氨基丁二酸(argininosuccinate)、天冬氨酸、谷氨酸、胍丁胺、N-乙酰基-精氨酸或其组合。
在一些实施例中，谷氨酰胺氨基酸实体选自L-谷氨酰胺、谷氨酸、氨甲酰基-P(carbamoyl-P)、谷氨酸、n-乙酰谷氨酰胺或其组合。在一些实施例中，谷氨酰胺氨基酸实体选自L-谷氨酰胺、谷氨酸、氨甲酰基-P、谷氨酸、n-乙酰谷氨酰胺、α-酮基戊二酸(α–ketoglutarate)或其组合。在某些实施方案中，谷氨酰胺氨基酸实体是α-酮基戊二酸。
在一些实施例中，NAC-氨基酸实体选自NAC、乙酰基丝氨酸(acetylserine)、胱硫醚、胱硫醚、高半胱氨酸(homocysterine)、谷胱甘肽或其组合。
在一些实施例中，异亮氨酸氨基酸实体选自L-异亮氨酸、2-氧代-3-甲基-戊酸(α-酮-β-甲基戊酸(KMV))、甲基丁酰基-CoA、N-乙酰基-异亮氨酸或它们的组合。
在一些实施例中，缬氨酸氨基酸实体选自L-缬氨酸、2-氧代-戊酸(α-酮异戊酸(KIV))、异丁酰基-CoA、N-乙酰基-缬氨酸或其组合。
在某些实施例中，丝氨酸氨基酸实体选自L-丝氨酸、磷酸丝氨酸、P-羟基丙酮酸、甘氨酸、乙酰基丝氨酸、胱硫醚、磷脂酰丝氨酸或其组合。在一些实施例中，丝氨酸氨基酸实体选自L-丝氨酸或L-甘氨酸。在一个实施例中，丝氨酸氨基酸实体是L-丝氨酸。在另一个实施例中，丝氨酸氨基酸实体是L-甘氨酸。在另一个实施例中，丝氨酸氨基酸实体是L-甘氨酸和L-丝氨酸(例如，重量比为1:1的L-甘氨酸和L-丝氨酸)。
本文所述的组合物还可包含L-丝氨酸、L-甘氨酸、肌酸或谷胱甘肽中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如全部)或更多种。
在一些实施例中，所述组合物包含亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体(例如，L-谷氨酰胺或其盐)、NAC实体和L-丝氨酸。
在一些实施例中，所述组合物包含亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体(例如，L-谷氨酰胺或其盐)、NAC实体和L-甘氨酸。
在一些实施例中，所述组合物包含亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体(例如，L-谷氨酰胺或其盐)、NAC实体、L-甘氨酸和L-丝氨酸。
在一些实施例中，组合物包含亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体(例如，L-谷氨酰胺或其盐)和NAC实体。在一些实施例中，(a)-(f)中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个(例如，全部)在组合物中呈游离氨基酸形式，例如至少：氨基酸实体组分或总组分的总重量的42重量％、75重量％、90重量％或更多是所述组合物中的游离氨基酸形式(例如，呈干燥形式)的(a)-(f)中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如，全部)。
在一些实施例中，(a)-(f)中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如全部)在组合物中呈盐形式，例如至少：氨基酸实体组分或总组分的总重量的0.01重量％、0.1重量％、0.5重量％、1重量％、5重量％或10重量％或更多是所述组合物中呈盐形式的(a)-(f)中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如，全部)。
在一些实施例中，(a)-(f)中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如全部)作为二肽或三肽的一部分提供，例如以至少以下的量提供：所述组合物的氨基酸实体组分或总组分的0.01重量％、0.1重量％、0.5重量％、1重量％、5重量％或10重量％或更多。
在一些实施例中，所述组合物包含以下物质，基本上由以下物质组成，或由以下物质组成：
a)亮氨酸氨基酸实体，
b)精氨酸氨基酸实体，
c)谷氨酰胺氨基酸实体；以及
d)N-乙酰基半胱氨酸(NAC)实体。
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包含以下物质、基本上由以下物质组成或由以下物质组成：
a)亮氨酸氨基酸实体，其选自：i)L-亮氨酸或其盐，ii)包含L-亮氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐，或iii)β-羟基-β-甲基丁酸(HMB)或其盐；
b)精氨酸氨基酸实体，其选自：i)L-精氨酸或其盐，ii)包含L-精氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐，iii)肌酸或其盐，或iv)包含肌酸的二肽或其盐、或三肽或其盐；
c)所述谷氨酰胺氨基酸实体为L-谷氨酰胺或其盐、或包括L-谷氨酰胺的二肽或其盐、或三肽或其盐；以及
d)所述NAC实体是NAC或其盐或者包含NAC的二肽或其盐。
在一些实施例中，所述组合物(例如，活性部分)还包含以下一种或两种，基本上由以下一种或两种组成，或由以下一种或两种组成：e)L-异亮氨酸或其盐，或包含L-异亮氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐；或f)L-缬氨酸或其盐，或包含L-缬氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐。
在一些实施例中，所述组合物包含以下物质、基本上由以下物质组成或由以下物质组成：a)L-亮氨酸或其盐；b)L-精氨酸或其盐；c)L-谷氨酰胺或其盐；和d)NAC或其盐。
在某些实施方案中，所述组合物(例如活性部分)能够减少，或减少了发炎至少20％、35％或50％，如使用HepG2细胞所检测的，例如活性降低，例如在HepG2细胞中的报告基因(reporter)测定中TNFα-诱导的NF-kB活性降低，如实施例3所述，例如相对于参考组合物(例如载体对照；含L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸的氨基酸组合物；含L-精氨酸、L-谷氨酰胺和NAC的氨基酸组合物；含L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酰胺的氨基酸组合物；或NAC)。
在某些实施方案中，所述组合物(例如活性部分)能够降低，或降低了发炎至少5％、10％或20％，如使用MCP1/CCL2测定法(例如在原代肝细胞中)所检测的，例如使用基于抗体的检测测定，例如ELISA，例如如实施例3或6中所述，例如相对于参考组合物(例如，载体对照；包含L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸的氨基酸组合物；包含L-精氨酸、L-谷氨酰胺和NAC的氨基酸组合物；包含L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酰胺的氨基酸组合物；缬氨酸；谷氨酰胺；精氨酸；异亮氨酸；亮氨酸；或NAC)。。
在某些实施方案中，所述组合物(例如，活性部分)能够降低，或降低了发炎至少10％、25％或50％，如使用IL-6测定(例如在原代肝星状细胞中)所检测的，例如使用基于抗体的检测测定，例如ELISA，例如如实施例6中所述，例如相对于参考组合物(例如，载体对照；包含L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸的氨基酸组合物；包含L-精氨酸、L-谷氨酰胺和NAC的氨基酸组合物；包含L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酰胺的氨基酸组合物；缬氨酸；谷氨酰胺；精氨酸；异亮氨酸；亮氨酸；或NAC)。。
在某些实施方案中，所述组合物(例如活性部分)能够减少，或减少了发炎至少10％、20％或30％，如使用丙氨酸转氨酶(ALT)测定所检测的，例如基于抗体的检测测定，例如ELISA，例如如实施例1中所述，例如相对于参考组合物(例如载体对照)。
在某些实施方案中，所述组合物(例如活性部分)能够减少，或减少了发炎至少5％、20％或30％，如使用天冬氨酸转氨酶(AST)测定所检测的，例如基于抗体的检测测定，例如ELISA，例如如实施例1中所述，例如相对于参考组合物(例如载体对照)。
在某些实施方案中，所述组合物(例如，活性部分)能够增加，或增加了抗炎性趋化因子分泌至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多，如使用CCL18测定所检测的，例如，在原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中，例如，使用基于抗体的检测测定，例如，ELISA，例如，如实施例10中所述，例如，相对于参考组合物(例如，单一氨基酸实体(例如，缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸或NAC)；异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸；或异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、精氨酸和谷氨酰胺)。
在某些实施方案中，所述组合物(例如，活性部分)能够促进M1或抑制M2的一者或两者至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多，如使用CCL18测定所检测的，例如在原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中，例如使用基于抗体的检测测定，例如ELISA，例如如实施例10中所述，例如相对于参考组合物(例如，单一氨基酸实体(例如，缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸或NAC)；异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸；或异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、精氨酸和谷氨酰胺)。
在一些实施例中，所述组合物(例如活性部分)能够减少或降低一种或多种肝细胞类型(例如肝细胞、星状细胞(stellate cells)或巨噬细胞中的一种、两种或三种，例如在肝细胞、星状细胞和巨噬细胞的三培养物中)的发炎，例如，通过发炎标记物水平的变化(例如降低)所检测的，所述发炎标记物(例如IL-6、IP-10、MCP-1、0或GROα(CXCL1)、IL-8、或YKL40的一种、两种、三种、四种、五种、或更多种(例如，全部))的变化例如至少20％、30％、40％或50％，例如，如使用基于抗体的检测测定(例如ELISA)所评估的，例如，如实施例11中所述，例如，相对于参照组合物(例如较低浓度的组合物、载体对照、单氨基酸实体或氨基酸实体的组合)。在某些实施例中，所述组合物导致以下各项中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如全部)的减少：
(i)IL-6水平(例如，IL-6水平降低至少50％、60％、70％或80％)；
(ii)IP-10的水平(例如，IP-10水平降低至少35％、40％、45％、或者50％)；
(iii)MCP-1水平(例如MCP-1水平降低至少50％、60％、70％、80％或90％)；
(iv)GROalpha(CXCL1)的水平(例如，GROalpha(CXCL1)水平降低至少15％、20％、25％或30％)；
(v)IL-8水平(例如，IL-8水平降低至少5％、10％、15％或20％)；或
(vi)YKL40水平(例如，YKL40水平降低至少70％、80％、90％或95％)。
在一些实施例中，通过在实施例11中所述的条件下使培养物中的一种或多种肝细胞类型(例如，肝细胞、星状细胞或巨噬细胞中的一种、两种或三种)，例如由膜(例如，渗透膜，例如，Transwell)分离的肝细胞类型(例如，由膜与星状细胞或巨噬细胞中的一种或两种分离的肝细胞)与所述组合物接触来评估所述组合物(例如，所述活性部分)的活性。
在某些实施方案中，所述组合物(例如，活性部分)能够减少，或减少了发炎，如通过巨噬细胞中ATP产生所检测的，例如糖酵解ATP产生的水平，例如糖酵解ATP产生水平降低至少50％、60％、70％或80％，例如使用ATP速率产生测定来评估，例如耗氧量或细胞外酸化之一或两者的测定，例如如实施例12中所述，例如相对于参考组合物(例如，载体对照(PBS)、单个氨基酸实体或氨基酸实体的组合)。
i.量
组合物(例如，活性部分)可包括0.5g+/-20％至10g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体，1g+/-20％至15g+/-20％的精氨酸氨基酸实体，0.5g+/-20％至20g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体，和0.1g+/-20％至5g+/-20％的NAC实体。
示例性组合物可包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、1.5g或1.81g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g NAC实体(例如，如表2所示的g/封包(packet))。
表2.包括L-精氨酸(R)或L-精氨酸盐酸盐(R HCl)形式的示例性组合物
Figure BDA0002944254760000191
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包括1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-20％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-15％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-10％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-5％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、1.5g或1.81g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g NAC实体。
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包括1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-20％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-15％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-10％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-5％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、1.5g或1.81g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g NAC实体。
示例性组合物可包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g NAC实体(例如，如表3所示的g/封包)。
表3.包括L-精氨酸(R)或L-精氨酸盐酸盐(R HCl)形式的示例组合物
Figure BDA0002944254760000211
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包括1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-20％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-15％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-10％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-5％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g NAC实体。
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包括1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-20％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-15％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-10％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-5％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g NAC实体。
示例性组合物可包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.25g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、1g谷氨酰胺氨基酸实体和0.225g NAC实体(例如，如表4所示的g/封包)。
表4.包括L-精氨酸(R)或L-精氨酸盐酸盐(R HCl)形式的示例性组合物
Figure BDA0002944254760000231
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包括1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.225g+/-20％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.225g+/-15％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.225g+/-10％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.225g+/-5％的NAC实体。示例性组合物可包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.25g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、1g谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g NAC实体和1.5g丝氨酸氨基酸实体(例如，如表5所示的g/封包)。
表5.包括L-精氨酸(R)或L-精氨酸盐酸盐(R HCl)形式的示例性组物
Figure BDA0002944254760000241
Figure BDA0002944254760000251
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包含1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-20％的NAC-氨基酸实体和1.5g+/-20％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-15％的NAC-氨基酸实体和1.5g+/-15％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-10％的NAC-氨基酸实体和1.5g+/-10％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-5％的NAC-氨基酸实体和1.5g+/-5％的丝氨酸氨基酸实体。
示例性组合物可包含1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.25g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、1g谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g NAC实体和1.667g丝氨酸氨基酸实体(例如，如表6所示的g/封包)。
表6.包括L-精氨酸(R)或L-精氨酸盐酸盐(R HCl)形式的示例性组合物
Figure BDA0002944254760000261
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包含1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-20％的NAC-氨基酸实体和1.667g+/-20％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-15％的NAC-氨基酸实体和1.667g+/-15％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-10％的NAC-氨基酸实体和1.667g+/-10％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-5％的NAC-氨基酸实体和1.667g+/-5％的丝氨酸氨基酸实体。
ii.比例
示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：1.5+/-15％：2+/-15％：0.15+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：1.81+/-15％：2+/-15％：0.15±15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体：0.5+/-10％：0.5+/-10％：1.5+/-10％：2+/-10％：0.15+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：1.81+/-10％：2+/-10％：0.15±10％。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体：0.5+/-5％：0.5+/-5％：1.5+/-5％：2+/-5％：0.15+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：1.81+/-5％：2+/-5％：0.15±5％。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.5：1.5：2：0.15或1：0.5：0.5：1.81：2：0.15的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。
示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：1.5+/-20％：2+/-20％：0.3+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：1.81+/-20％：2+/-20％：0.3±20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：1.5+/-15％：2+/-15％：0.3+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：1.81+/-15％：2+/-15％：0.3±15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：1.5+/-10％：2+/-10％：0.3+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：1.81+/-10％：2+/-10％：0.3±10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：1.5+/-5％：2+/-5％：0.3+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：1.81+/-5％：2+/-5％：0.3±5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.5：1.5：2：0.3或1：0.5：0.5：1.81：2：0.3的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。
示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：0.75+/-20％：2+/-20％：0.15+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：0.905+/-20％：2+/-20％：0.15±20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：0.75+/-15％：2+/-15％：0.15+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：0.905+/-15％：2+/-15％：0.15±15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：0.75+/-10％：2+/-10％：0.15+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：0.905+/-10％：2+/-10％：0.15±10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：0.75+/-5％：2+/-5％：0.15+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：0.905+/-5％：2+/-5％：0.15±5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.5：0.75：2：0.15或1：0.5：0.5：0.905：2：0.15的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。
示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：0.75+/-20％：2+/-20％：0.3+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：0.905+/-20％：2+/-20％：0.3±20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：0.75+/-15％：2+/-15％：0.3+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：0.905+/-15％：2+/-15％：0.3±15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：0.75+/-10％：2+/-10％：0.3+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：0.905+/-10％：2+/-10％：0.3±10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：0.75+/-5％：2+/-5％：0.3+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：0.905+/-5％：2+/-5％：0.3±5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.5：0.75：2：0.3或1：0.5：0.5：0.905：2：0.3的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。
示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.75+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.905+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.75+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.905+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.75+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.905+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.75+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.905+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.25：0.75：1：0.225或1：0.5：0.25：0.905：1：0.225的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。
包含氨基酸实体的示例性组合物可以包括重量比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.75+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％：1.5+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.905+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％：1.5+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.75+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％：1.5+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.905+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％：1.5+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，所述组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.75+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％：1.5+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.905+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％：1.5+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.75+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％：1.5+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.905+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％：1.5+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.25：0.75：1：0.225：1.5或1：0.5：0.25：0.905：1：0.225：1.5的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。
示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.75+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％：1.667+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.905+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％：1.667+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.75+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％：1.667+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.905+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％：1.667+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，所述组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.75+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％：1.667+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.905+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％：1.667+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.75+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％：1.667+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.905+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％：1.667±5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.25：0.75：1：0.225：1.667或1：0.5：0.25：0.905：1：0.225：1.667的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。
在一些实施例中，所述组合物包含10重量％+/-15％至30重量％+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、5重量％+/-15％至15重量％+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、5重量％+/-15％至15重量％+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、15重量％+/-15％至40重量％+/-15％的精氨酸氨基酸实体、20重量％+/-15％至50重量％+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和1重量％+/-15％至8重量％+/-15％的NAC实体。
在一些实施例中，组合物包含10重量％+/-15％至30重量％+/-15％的亮氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括5重量％+/-15％至15重量％+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，所述组合物包含5重量％+/-15％至15重量％+/-15％的缬氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含15重量％+/-15％至40重量％+/-15％的精氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含20重量％+/-15％至50重量％+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1％重量+/-15％至8％重量+/-15％的NAC实体。
在一些实施例中，所述组合物包含16重量％+/-15％至18重量％+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、7重量％+/-15％至9重量％+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、7重量％+/-15％至9重量％+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、28重量％+/-15％至32重量％+/-15％的精氨酸氨基酸实体、31重量％+/-15％至34重量％+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和1重量％+/-15％至5重量％+/-15％的NAC实体。
在一些实施例中，组合物包含16重量％+/-15％至18重量％+/-15％的亮氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括7重量％+/-15％至9重量％+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，所述组合物包含7重量％+/-15％至9重量％+/-15％的缬氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含28重量％+/-15％至32重量％+/-15％的精氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含31重量％+/-15％至34重量％+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1重量％+/-15％至5重量％+/-15％的NAC实体。
在一些实施例中，组合物包括16.8重量％+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、8.4重量％+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、8.4重量％+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、30.4重量％+/-15％的精氨酸氨基酸实体、33.6重量％+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和2.5重量％+/-15％的NAC实体。
iii.氨基酸实体的关系
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)具有一种或多种以下性质：
a)所述组合物中的Q-氨基酸实体的重量％大于所述R-氨基酸实体的重量％；
b)所述组合物中的Q-氨基酸实体的重量％大于L-氨基酸实体的重量％；
c)所述组合物中的所述R-氨基酸实体的重量％大于所述L-氨基酸实体的重量％；或
d)(a)-(c)中的两种或三种的组合。
在一些实施例中，组合物中谷氨酰胺氨基酸实体的重量％大于精氨酸氨基酸实体的重量％，例如，组合物中谷氨酰胺氨基酸实体的重量％比精氨酸氨基酸实体的重量％大至少5％，例如，谷氨酰胺氨基酸实体的重量％比精氨酸氨基酸实体的重量％大至少10％或25％。
在一些实施例中，组合物中谷氨酰胺氨基酸实体的重量％大于亮氨酸氨基酸实体的重量％，例如，组合物中谷氨酰胺氨基酸实体的重量％比亮氨酸氨基酸实体的重量％大至少20％，例如，组合物中谷氨酰胺氨基酸实体的重量％比亮氨酸氨基酸实体的重量％大至少25％或50％。
在一些实施例中，组合物中精氨酸氨基酸实体的重量％大于亮氨酸氨基酸实体的重量％，例如，组合物中精氨酸氨基酸实体的重量％比亮氨酸氨基酸实体的重量％大至少10％，例如，组合物中精氨酸氨基酸实体的重量％比亮氨酸氨基酸实体的重量％大至少15％或30％。
在一些实施例中，组合物中亮氨酸氨基酸实体的重量％大于组合物中异亮氨酸氨基酸实体的重量％，例如，组合物中亮氨酸氨基酸实体的重量％比组合物中异亮氨酸氨基酸实体的重量％大至少25重量％。
在一些实施例中，组合物中亮氨酸氨基酸实体的重量％大于组合物中缬氨酸氨基酸实体的重量％，例如，组合物中亮氨酸氨基酸实体的重量％比组合物中缬氨酸氨基酸实体的重量％大至少25重量％。
在一些实施例中，精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC或其盐的重量％为所述组合物中氨基酸实体的至少50重量％或70重量％，但不超过所述组合物中氨基酸实体的90重量％。
在一些实施例中，NAC实体的重量％为所述组合物中的氨基酸实体组分或全部组分的至少1重量％或2重量％，但不超过所述组合物中的氨基酸实体组分或全部组分的10重量％或更多。
在一些实施例中，异亮氨酸氨基酸实体和缬氨酸氨基酸实体的组合为所述组合物中的所述氨基酸实体组分或全部组分的至少15重量％或20重量％，但不超过所述组合物中的所述氨基酸实体组分或全部组分的50重量％；
在一些实施例中，所述谷氨酰胺氨基酸实体和NAC实体为所述组合物中的所述氨基酸实体组分或全部组分的至少40重量％或50重量％，但不超过所述组合物中的所述氨基酸实体组分或全部组分的90重量％。
在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)还包含丝氨酸氨基酸实体，例如，丝氨酸氨基酸实体以比组合物中的任何其它氨基酸实体组分更高的量存在。在一些实施例中，丝氨酸氨基酸实体的重量％为组合物中氨基酸实体或全部组分的至少20重量％或更多。
iv.从组合物中排除或限制的氨基酸分子
在一些实施例中，所述组合物不包含长度超过20个氨基酸残基的肽(例如，蛋白质补充剂)，所述肽选自或衍生自卵白蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、大麻蛋白、豌豆蛋白或糙米蛋白中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如，全部)，或者如果所述肽存在，则所述肽以小于以下量存在：所述组合物中的非氨基酸实体组分或全部组分的总重量(例如，呈干燥形式)的10重量(wt)％、5重量％、1重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％。
在一些实施例中，组合物包含3至19、3至15或3至10种不同氨基酸实体的组合，例如，所述组合包含：所述组合物中的氨基酸实体组分或全部组分的总重量％(例如，呈干燥形式)的至少42重量％、75重量％、或90重量％。
在一些实施例中，二肽或其盐或三肽或其盐以小于以下存在：所述组合物中的氨基酸实体组分或全部组分的总重量(例如，呈干燥形式)的10重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。
在一些实施例中，组合物中氨基酸实体组分(例如，呈干燥形式)的总克数的至少50％、60％、70％或更多来自(a)-(f)中的一种、两种、三种、四种、五种、或更多种(例如，全部)。
在一些实施例中，来自组合物中氨基酸实体组分或全部组分(例如，呈干燥形式)的至少50％、60％、70％或更多的热量来自(a)-(f)中的一种、两种、三种、四种、五种、或更多种(例如，全部)。
在一些实施例中，组合物不包含长度超过20个氨基酸残基的肽(例如，蛋白质补充剂)，所述肽选自或衍生自卵白蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、大麻蛋白、豌豆蛋白或糙米蛋白(例如，完整的或可水解的形式)中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如，全部)。
在一些实施例中，组合物(例如，药物组合物)不包含长度超过20个氨基酸残基的肽(例如，蛋白质补充剂)，所述肽选自或衍生自卵白蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、大麻蛋白、豌豆蛋白或糙米蛋白(例如，完整的或可水解的形式)中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如，全部)。
在一些实施例中，组合物中不存在碳水化合物(例如，右旋糖、麦芽右旋糖、蔗糖、糊精、果糖、半乳糖、葡萄糖、糖原、高果糖玉米糖浆、蜂蜜、肌醇、转化糖、乳糖、左旋糖、麦芽糖、糖蜜、甘蔗或木糖中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种或18种)，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。
在一些实施例中，组合物中不存在维生素(例如，维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B12、维生素C或维生素D中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种)，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。
在一些实施例中，硝酸盐或亚硝酸盐中的一种或两种不存在于组合物中，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。
在一些实施例中，4-羟基异亮氨酸不存在于组合物中，或如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。
在一些实施例中，益生菌(例如，芽孢杆菌益生菌)不存在于组合物中，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。
在一些实施例中，组合物中不存在乙酸苯酯(phenylacetate)，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。
在一些实施例中，组合物中不存在明胶(例如明胶胶囊)，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。
在一些实施例中，S-烯丙基半胱氨酸、S-烯丙基巯基半胱氨酸或果糖基-精氨酸中的一种、两种或三种不存在于组合物中，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。
用途，例如治疗方法
可施用如本文所述的本发明的组合物(例如，活性部分)以减少或治疗对象的发炎。在一些实施方案中，可施用组合物以预防对象的发炎。可施用所述组合物以治疗或预防本文所述的炎性病状。
在一些实施方案中，对象患有发炎或已经被诊断患有炎性病状或病症。在一些实施方案中，具有发炎或炎性病状或病症的对象是人。在一些实施方案中，对象未接受过使用组合物的预先治疗(例如，初次治疗的对象(
Figure BDA0002944254760000381
subject))。
本公开内容的特征在于一种用于改善或减少发炎的方法，所述方法包括向有需要的对象施用有效量的本文公开的组合物(例如，活性部分)。所述组合物可以根据本文所述的剂量方案施用以治疗患有炎性病状或病症的对象。
在一些实施方案中，本文所述的组合物(例如，活性部分)用作治疗(例如，逆转、减少、改善或预防)对象(例如，具有炎性病状或病症的对象)的发炎的药物。在一些实施方案中，所述组合物(例如，活性部分)用于制造用于治疗(例如，逆转、减少、改善或预防)对象(例如，具有炎性病状或病症的对象)的发炎的药物。
在一些实施方案中，发炎是全身性的。在一些实施方案中，发炎是局部的。在一些实施方案中，发炎是急性的。在一些实施方案中，发炎是慢性的。
在一些实施方案中，发炎选自：肉芽肿性发炎(例如，结核病、麻风病、结节病或梅毒)、纤维蛋白性发炎(例如，涉及肠道发炎，例如，来自假膜性结肠炎感染)、化脓性发炎(例如，与葡萄球菌感染相关)、浆液性发炎(例如，皮肤水疱)或溃疡性发炎。
示例性炎性病状或病症包括但不限于全身性(例如，慢性全身性发炎、白塞氏病(
Figure BDA0002944254760000391
disease)、结节病、系统性红斑狼疮、青少年特发性关节炎、硬皮病、干燥综合征(
Figure BDA0002944254760000392
syndrome)或败血症)和器官特异性病状和病症(例如，肺、心脏、肠、肾、胰腺和其他器官的发炎)。
在一些实施方案中，炎性病状或病症与以下相关(例如，继发于以下)：毒素；损伤(例如，环境危害(例如，石棉、煤尘或多环芳烃中的一种、两种或更多种(例如，全部))或吸烟)；医学治疗(例如，手术)；或其组合。
可通过施用本文所述的组合物治疗或预防的示例性炎性病状包括但不限于胃肠道炎性病状、肺部炎性病状、皮肤炎性、心血管系统炎性病状、神经系统炎性病状、肾脏炎性病状、胰腺炎性病状、关节炎性病状、眼部炎性病状、内分泌炎性病状或其组合。在一些实施方案中，炎性病状或病症是自身免疫性病症。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是胃肠道炎性病状(例如，肠)。在某些实施方案中，胃肠道炎性病状选自以下中的一种或多种：结肠炎(例如溃疡性结肠炎、假膜性结肠炎、显微镜下结肠炎、未定型结肠炎(indeterminatal colitis)、缺血性结肠炎、放射性结肠炎或胶原性结肠炎)、克罗恩病(Crohn's disease)、肠漏综合征、小肠特发性发炎、贮袋炎、肠易激综合征(IBS)、巴雷特食管(Barrett’s esophagus)、肠发炎、慢性胃炎、远端直肠炎、肠炎、小肠结肠炎、胃炎、胃肠炎、胆管炎、回肠炎、便秘、腹泻；消化不良或非溃疡性消化不良、憩室病、息肉或其组合。在某些实施方案中，炎性病状或病症是前肠炎性病状，例如巴雷特食管或慢性胃炎。在某些实施方案中，炎性病状或病症是后肠炎性病状，例如炎性肠病(IBD)或溃疡性结肠炎。在某些实施方案中，炎性病状或病症是克罗恩病。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是肺部炎性病状或病症。在某些实施方案中，肺部炎性病状或病症选自以下的一种或多种：哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、支气管炎(例如慢性支气管炎)、细支气管炎、肺发炎、肺纤维化、囊性纤维化、肺炎肿(pneumonitis)(例如过敏性肺炎、寻常型间质性肺炎(usual interstitialpneumonitis)(UIP)、肺炎(pneumonia)(例如脱屑性间质性肺炎、淋巴样间质性肺炎、巨细胞间质性肺炎或细胞间质性肺炎)、外源性变应性肺泡炎、石棉肺、矽肺、支气管扩张、铍中毒、滑石中毒、肺尘病、肺结节病、胸膜炎或其组合。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是皮肤炎性病状或病症。在某些实施方案中，皮肤炎性病状或病症选自以下一种或多种：银屑病；湿疹；皮炎(例如湿疹性皮炎、局部或脂溢性皮炎、过敏性或刺激性接触性皮炎、裂纹性湿疹、光变应性皮炎、光毒性皮炎、植物光皮炎、放射性皮炎或郁积性皮炎)；溃疡；由皮肤或粘膜的创伤、烧伤或局部缺血引起的糜烂；鱼鳞病；大疱性表皮松解症；肥厚性瘢痕；瘢痕疙瘩；由于老化导致的皮肤变化；炎性皮肤病；光老化；皮肤萎缩(例如，由于局部使用皮质类固醇)；炎性皮肤病；迟发型超敏反应(例如毒藤皮炎)；蜂窝织炎；皮肌炎；天疱疮；运动诱发的皮肤发炎；或其组合。在某些实施方案中，皮肤炎性病症包括粘膜发炎，例如唇炎、唇裂、鼻刺激、粘膜炎和外阴阴道炎。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是心血管系统炎性病状或病症。在某些实施方案中，心血管系统炎性病症选自以下的一种或多种：动脉粥样硬化、冠状动脉梗塞损伤、外周血管疾病、心肌炎、血管炎、狭窄的血管再造、心肌炎、心包炎、与II型糖尿病相关的血管疾病、心内膜炎、胆固醇相关的代谢紊乱、氧自由基损伤、缺血或其组合。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是神经系统炎性病状或病症。在某些实施方案中，神经系统炎性病状或病症选自以下一种或多种：神经退化疾病(例如，阿兹海默症(Alzheimer’s disease)或痴呆)、多发性硬化、脑炎(例如，具有炎性水肿的脑炎)、抑郁、注意力缺陷障碍(ADD)、帕金森病、精神分裂症、神经病(例如，外周神经病)或其组合。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是肾脏炎性病状或病症。在某些实施方案中，所述肾脏炎性病状或病症选自以下一种或多种：肾炎；韦格纳氏病(Wegener’s disease)继发性肾炎；急性肾炎继发性急性肾衰竭；阻塞后综合征；管状局部缺血；肾盂肾炎肾小球硬化；膜性神经病；肾动脉硬化；或其组合。在某些实施方案中，肾炎选自以下的一种或多种：肾小球肾炎(例如，急性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、感染后肾小球肾炎(例如，链球菌后肾小球肾炎)或其组合)；间质性肾炎；狼疮肾炎；或其组合。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是胰腺炎性病状或病症。在某些实施方案中，胰腺炎性病状或病症是胰腺炎(例如，急性或慢性胰腺炎)。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是关节炎性病状或病症。在某些实施方案中，所述关节炎性病状或病症选自以下一种或多种：类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、银屑病关节炎、狼疮相关的关节炎、强直性脊柱炎、脊椎关节病、退行性关节炎、滑膜炎或其组合。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是眼部炎性病状或病症。在某些实施方案中，眼部炎性病状或病症选自以下的一种或多种：葡萄膜炎、虹膜炎、视神经炎、结膜炎、巩膜炎、虹膜炎、干燥性角膜结膜炎、睑炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、干眼综合征、视神经损伤、糖尿病性视网膜病、角膜发炎、视网膜发炎或其组合。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是内分泌系统炎性病状或病症。在某些实施方案中，内分泌系统炎性病状或病症选自以下的一种或多种：自身免疫性甲状腺炎(桥本氏病(Hashimoto's disease))、肾上腺皮质发炎(例如急性肾上腺皮质发炎或慢性肾上腺皮质发炎)、I型糖尿病，或其组合。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是自身免疫性病症。在某些实施方案中，所述自身免疫性病症选自以下的一种或多种：关节炎(例如，类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、狼疮相关的关节炎、强直性脊柱炎或其组合)；自身免疫性甲状腺炎；硬皮病；狼疮；系统性红斑狼疮(SLE)；HIV；干燥综合征；血管炎；多发性硬化；皮炎(例如特应性皮炎或湿疹性皮炎)、重症肌无力；炎性肠病(IBD)；克罗恩病；结肠炎；糖尿病(I型)；急性炎性病状(例如内毒素血症、败血症或中毒性休克综合征)；移植排斥；过敏或特应性疾病(例如哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、过敏性接触性皮炎或过敏性结膜炎)；虹膜睫状体炎/葡萄膜炎性视神经炎；全身性血管炎；韦格纳肉芽肿病；脉管炎(颞动脉炎或结节性多动脉炎)；风湿性多肌痛(PMR)；腱炎；粘液囊炎；速发型超敏反应(例如哮喘、花粉热、皮肤过敏或急性过敏反应)；急性播散性脑脊髓炎；干燥综合征；阿狄森氏病；心脏病；骨质疏松症；普秃；抗磷脂抗体综合征；自身免疫性溶血性贫血；恶性贫血；自身免疫性肝炎；大疱性类天疱疮；子宫内膜异位；古德帕斯丘综合征；化脓性汗腺炎；特发性血小板减少性紫癜；间质性膀胱炎；硬斑病；神经性肌强直；颞动脉炎(“巨细胞动脉炎”)；血管炎；白癜风；外阴痛；或其组合。
在一些实施方案中，炎性病状或病症与伤口愈合相关。在某些实施方案中，伤口选自以下的一种或多种：急性伤口、慢性伤口、开放性伤口、闭合性伤口、感染伤口、外部伤口、内部伤口或其组合。在一些实施方案中，炎性病状或病症与出血相关，例如来自创伤。
在一些实施方案中，炎性病状或病症与器官损伤；组织移植；器官移植；器官功能降低或丧失；多器官衰竭；器官排斥；组织排斥；器官再生；移植物抗宿主病；或其组合相关。在一些实施方案中，炎性病状或病症与器官移植或组织同种异体移植后遗症的发炎相关，例如包括器官或组织移植后急性期的同种异体移植排斥或慢性宿主抗移植物排斥。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是缺血，例如心脏缺血、肠缺血、脑缺血(例如中风)、肢体缺血、肠系膜缺血(例如伴随肠灌注不足发生)或皮肤缺血。在某些实施方案中，炎性病状包括缺血再灌注损伤后的组织损伤。在某些实施方案中，炎性病状或病症是灌注后综合征。在某些实施方案中，炎性病状或病症与任何器官的暂时性缺血(例如胃肠道、膀胱或心脏的暂时性缺血)相关。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是结节病(例如肺、淋巴结、皮肤、眼、心脏、脑或其组合的结节病)。在一些实施方案中，炎性病状或病症是淀粉样变性(例如，轻链(AL)淀粉样变性、发炎(AA)淀粉样变性、透析(Aβ2M)淀粉样变性或遗传性和老年(ATTR)淀粉样变性)。
在一些实施方案中，炎性病状与物理原因相关，例如烧伤；冻伤；物理损伤、异物(例如，碎片、污垢和碎屑)或创伤。
在一些实施方案中，炎性病状或病症与物质滥用或药物成瘾相关。
在一些实施方案中，炎性病状或病症与血管疾病(例如中风、外周动脉疾病(PAD)、腹主动脉瘤(AAA)、颈动脉疾病(CAD)、动静脉畸形(AVM)、严重肢体缺血(CLI)、肺栓塞(血凝块)、深静脉血栓形成(DVT)、慢性静脉功能不全(CVI)、静脉曲张或其组合)相关。
可以用本文所述的组合物治疗的示例性炎性病状或病症包括但不限于牙周病、牙龈炎、阑尾炎、慢性发炎中的组织坏死、内毒素休克、中性粒细胞减少性发热、细胞因子释放综合征(例如家族性吞噬血淋巴组织细胞增多症)、子宫颈炎、多发性肌炎(polymyositis)、天疱疮、天疱疮、类天疱疮、重症肌无力、格雷夫斯病、混合结缔组织病、硬化性胆管炎、风湿热、脱发、膀胱炎(例如间质性膀胱炎)、胆囊炎(例如急性或慢性胆囊炎)、寻常痤疮、憩室炎、化脓性汗腺炎、超敏反应、扁平苔癣、肥大细胞活化综合征、肥大细胞增多症、绒毛膜羊膜炎、泪腺炎、子宫内膜炎(endometritis)、上髁炎、附睾炎、筋膜炎、喉炎、脊髓炎、脐炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、腮腺炎、咽炎、静脉炎、直肠炎、前列腺炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口腔炎、扁桃体炎、阴道炎、血管炎、外阴炎、外阴阴道炎、血管炎、骨髓炎或横贯性脊髓炎。
可用本文所述的组合物治疗的示例性炎性病状或病症包括与感染性疾病相关的发炎。例如，发炎可以与感染原相关，感染原包括但不限于病毒、细菌、真菌或寄生虫。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是败血症，例如由肺炎、腹部感染、肾脏感染、血流感染或其组合引起的败血症。在某些实施方案中，败血症选自以下一种或多种：败血症综合征、革兰氏阳性败血症、革兰氏阴性败血症、培养物阴性败血症、真菌性败血症、尿源性败血症、或其组合。
可以用本文所述的组合物治疗的示例性传染病包括疟疾；肺炎；非洲锥虫病；结核病；HIV；人巨细胞病毒(HCMV)；疱疹病毒感染；流感病毒(例如，流感病毒A、流感病毒B或流感病毒C)；EB病毒(Epstein-Barr Virus)感染；查加斯病；细菌、旋毛虫病或真菌心肌炎；脑膜炎；军团菌；肝炎(例如，慢性活动性肝炎)；肺炎；艰难梭菌感染；小肠细菌过度生长(SIBO)；登革出血热；莱姆病；脑膜炎球菌血症；坏死筋膜炎；坏死性小肠结肠炎；麻风病；链球菌肌炎；传染性结肠炎；真菌病(例如白色念珠菌感染)；万古霉素抗性肠球菌(VRE)感染；会厌肺炎；腹膜炎；溶血性尿毒症综合征；中毒性休克综合征；卡氏肺囊虫；空肠弯曲杆菌感染；幽门螺杆菌感染；病毒性脑炎；化脓性关节炎；气体坏疽；盆腔炎；鸟分枝杆菌-胞内分枝杆菌感染；睾丸炎；病毒相关性噬血细胞综合征(VAHS)；或其组合。
在一些实施方案中，所述传染病是细菌感染，例如VRE、艰难梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、霍乱弧菌、产气荚膜梭菌、蜡状芽孢杆菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、幽门螺杆菌、炭疽杆菌、肉毒杆菌、无乳链球菌(B组链球菌)、单核细胞增生性李斯特氏菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮链球菌、化脓性链球菌、肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、肉毒杆菌、沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia)、空肠弯曲杆菌、法氏柠檬酸杆菌、艰难梭菌、破伤风梭菌、产气柯林斯菌、霍氏肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、变形梭杆菌、核粒梭状杆菌、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、口炎消化链球菌、不解糖卟啉单胞菌、铜绿假单胞菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、邦戈尔沙门氏菌(Salmonella bongori)、金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、博伊氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、索尼氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、婴儿链球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌或其组合的感染。
在一些实施方案中，所述感染性疾病是病毒感染，例如轮状病毒、诺如病毒、HIV、寨卡病毒、胡宁病毒、BK病毒、马秋波病毒、萨比亚病毒、科罗拉多蜱传热病毒(CTFV)、甲病毒属、水痘带状疱疹病毒(VZV)、鼻病毒和冠状病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、登革病毒、细小病毒B19、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹1或2病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、人副流感病毒(HPIV)、EB病毒(EBV)、拉沙病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、猴痘病毒、腮腺炎病毒、传染性软疣病毒(MCV)、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病病毒、鼻病毒、冠状病毒、风疹病毒、SARS冠状病毒或其组合的感染。
在一些实施方案中，所述传染病是真菌感染，例如念珠菌(例如白色念珠菌)、曲霉属、毛霉属、隐球菌属、组织胞浆菌属、球孢子菌属、糠秕马拉色菌属、小孢子菌属、发癣菌属、表皮癣菌属或其组合的感染。
在一些实施方案中，所述感染性疾病是原虫感染，例如溶组织内阿米巴、蓝氏贾第虫、小隐孢子虫或其组合感染。
在一些实施方案中，发炎与选自以下属的细菌病原体的感染相关：嗜胆菌属、弯曲杆菌属、假丝酵母菌属、柠檬酸杆菌属、梭菌属、柯林斯氏菌属、脱硫弧菌属、肠杆菌属、肠球菌属、埃希氏杆菌属(Escherichia)、梭杆菌属、嗜血杆菌属、克雷伯菌属、毛螺旋菌科、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、珀替菌属(Portiera)、普罗威登斯菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属、弧菌属、耶尔森氏菌属或其组合。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是肝脏炎性病状或病症。在某些实施方案中，所述肝脏炎性病状或病症选自：非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪肝病(AFLD)或酒精性脂肪性肝炎(ASH)。在某些实施方案中，所述肝脏炎性病状或病症选自以下的一种或多种：肝硬化(例如原发性胆汁性肝硬化或原发性硬化性胆管炎)、肝炎(例如由病毒感染、自身免疫反应、药物治疗、毒素、环境因素或作为原发性病症的继发性结果所致的肝炎)、胆道闭锁或其组合。
在一些实施方案中，炎性病状或病症是M2巨噬细胞相关的炎性病状或病症。在一些实施方案中，炎性病状或病症(例如M2巨噬细胞相关的炎性病状或病症)选自以下一种或多种：代谢综合征、肝脏炎性病状或病症(例如，脂肪肝病)、肥胖症、葡萄糖耐受不良、肾损伤、慢性肾病、心脏发炎(例如，心肌炎)、病毒感染(例如，柯萨奇病毒B3感染)、寄生虫感染(例如，克氏锥虫感染)、炎性肠病(IBD)、结肠炎、自身免疫性病症(例如，银屑病或特应性皮炎)、脊髓损伤、神经性疼痛、多发性硬化、动脉粥样硬化或创伤性脑损伤(例如，脑震荡)。
在一些实施方案中，炎性病状或病症不是肝脏炎性病状或病症。在一些实施方案中，炎性病状或病症不是肌肉炎性病状或病症。
在一些实施方案中，炎性病状或病症不是代谢综合征。在一些实施方案中，炎性病状或病症不是肥胖症。在一些实施方案中，炎性病状或病症不是葡萄糖耐受不良。
剂量方案
组合物(例如，活性部分)可以根据本文所述的剂量方案施用以减少或治疗发炎。例如，可以以每天2g+/-20％至每天90g+/-20％(例如，每天72g+/-20％总氨基酸实体)的剂量将组合物施用至对象持续例如两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、九周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周或更长的治疗期。
在一些实施例中，可以以单剂量或多剂量方案向具有炎性病状或病症的对象提供组合物。在一些实施例中，剂量每天施用两次、每天施用三次、每天施用四次、每天施用五次、每天施用六次、每天施用七次或更多次。在一些实施例中，每天施用组合物一次、两次或三次。在一些实施例中，组合物施用至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周。在一些实施例中，所述组合物长期施用(例如，超过30天，例如，31天、40天、50天、60天、3个月、6个月、9个月、一年、两年或三年)。
在一些实施例中，组合物在进餐之前施用。在其它实施例中，组合物与膳食同时施用。在其它实施例中，组合物在进餐后施用。
可以每2小时、每3小时、每4小时、每5小时、每6小时、每7小时、每8小时、每9小时或每10小时施用组合物，以改善或降低对象(例如，具有炎性病状或病症的对象)中的发炎。
在一些实施例中，组合物包含四个棒状包，例如，每个棒状包包含本文所述的组合物中包含的每种氨基酸实体的量的25％+/-15％。在一些实施例中，每天三次施用四个棒状包。在一些实施例中，组合物包含三个棒状包，例如，每个棒状包包含本文所述的组合物中包含的每种氨基酸实体的量的33.3％+/-15％。在一些实施例中，每天三次施用三个棒状包。
在一些实施例中，组合物以约2g+/-20％至50g+/-20％总氨基酸实体的剂量施用，例如每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次或每天六次(例如每天三次)。在一些实施例中，以2g+/-20％至10g+/-20％总氨基酸实体的剂量每天三次施用组合物，例如8g+/-20％或10g+/-20％总氨基酸实体每天施用三次。在一些实施例中，组合物以10g+/-20％至20g+/-20％总氨基酸实体的剂量每天施用三次，例如11g+/-20％、12g+/-20％、15g+/-20％、16g+/-20％或20g+/-20％总氨基酸实体每天施用三次。在一些实施例中，组合物以20g+/-20％至30g+/-20％总氨基酸实体的剂量每天施用三次，例如21g+/-20％、22g+/-20％、23g+/-20％或24g+/-20％总氨基酸实体每天施用三次。
活性部分的制备和药物组合物
本公开内容的特征在于制造或制备前述发明的组合物(例如，活性部分)的方法。用于制备组合物的氨基酸实体可以是聚结的和/或速溶的，以有助于分散和/或溶解。
所述组合物可以使用来自以下来源的氨基酸实体制备，或者可以使用其他来源：例如FUSI-BCAA速溶掺合物(重量比为2:1:1的L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸)、速溶L-亮氨酸和其它酸可以从Ajinomoto Co.,Inc.获得。医药级氨基酸实体原料可用于制备药用氨基酸实体产品。食品(或补充剂)级氨基酸实体原料可用于生产膳食氨基酸实体产品。
为了制备本公开的组合物，可以使用以下一般步骤：可以在掺合单元中掺合起始物料(单独的氨基酸实体和赋形剂)，然后验证掺合物的均匀性和氨基酸实体含量，并将掺合的粉末填充到棒状包或其它单位剂型中。棒状包或其它单位剂型的内容物可在用于口服施用时分散在水中。
本发明的食品补充剂和医学营养组合物将是适于口服施用的形式。
当将原料，例如药物级氨基酸实体和/或赋形剂组合到组合物中时，污染物可能存在于组合物中。当组合物基本上不包含(例如，包含小于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.1、0.01或0.001％(w/w))污染物时，组合物满足污染水平的标准。在一些实施例中，本文方法中描述的组合物不包含污染物。污染物包括并非有意存在于组合物中的任何物质(例如，药物级氨基酸实体和赋形剂，例如，口服施用组分，可以有意存在)或对组合物的产品质量参数具有负面影响的任何物质(例如，对象中的副作用、降低的效力、降低的稳定性/保质期、变色、气味、不良味道、不良质地/口感或组合物的组分的增加的分离)。在一些实施例中，污染物包括微生物、内毒素、金属或其组合。在一些实施例中，例如由金属、卵磷脂、胆碱、内毒素、微生物或组合物的每个部分的其他污染物(例如，来自原料的污染物)引起的污染水平低于食物中允许的水平。
赋形剂
本文披露的氨基酸组合物可以与一种或多种赋形剂复合或调配。合适的赋形剂的非限制性实例包括促味剂、矫味剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、黏合剂、致密剂、润滑剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂和着色剂。
在一些实施例中，赋形剂包含缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例包括柠檬酸、柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。
在一些实施例中，赋形剂包含防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂，例如α-生育酚和抗坏血酸盐，和抗微生物剂，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。
在一些实施例中，组合物包含黏合剂作为赋形剂。合适的黏合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯恶唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖类、寡糖及其组合。
在一些实施例中，组合物包含润滑剂作为赋形剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、Sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁和轻质矿物油。
在一些实施例中，组合物包含分散增强剂作为赋形剂。合适的分散剂的非限制性实例包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、黄原胶、膨润土、纯化的木质纤维素、羟基乙酸淀粉钠、同晶型硅酸盐和微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。
在一些实施例中，所述组合物包含崩解剂作为赋形剂。在一些实施例中，崩解剂是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例包括淀粉，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、预胶化淀粉和改性淀粉，甜味剂，粘土，例如膨润土，微晶纤维素，海藻酸盐，羟基乙酸淀粉钠，树胶，例如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐树胶、果胶和黄蓍胶。在一些实施例中，崩解剂是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合，以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。
在一些实施例中，赋形剂包括调味剂。调味剂可以选自合成的调味油和调味芳香剂；天然油；来自植物、叶、花和果实的提取物；以及它们的组合。在一些实施例中，调味剂选自肉桂油；冬青油；薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉树；香草；柑橘油如柠檬油、橙油、葡萄和葡萄柚油；和水果香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和杏。
在一些实施例中，赋形剂包括甜味剂。合适的甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载剂时)；糖精及其各种盐，例如钠盐；二肽甜味剂，例如阿斯巴甜糖；二氢查耳酮(dihydrochalcone)化合物，甘草素；甜菊(甜菊苷)；蔗糖的氯代衍生物，例如蔗糖素(sucralose)；和糖醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等。还考虑氢化淀粉水解物和合成甜味剂3,6-二氢-6-甲基-1,2,3-氧噻嗪-4-酮-2,2-二氧化物，特别是其钾盐(乙酰磺胺酸钾(acesulfame-K))和钠盐和钙盐。
在一些实施例中，组合物包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例包括食品、药物和化妆品色料(FD&C)、药物和化妆品色料(D&C)和外用药物和化妆品色料(Ext.D&C)。着色剂可以用作染料或它们相应的色淀。
特定的赋形剂可以包括以下一种或多种：柠檬酸、卵磷脂(例如Alcolec F100)、甜味剂(例如蔗糖素、蔗糖素微粉化NF、乙酰磺胺酸钾(例如Ace-K))、分散增强剂(例如黄原胶(例如Ticaxan Rapid-3))、调味剂(例如香草奶冻#4306、Nat Orange WONF#1326、酸橙865.0032U和柠檬862.2169U)、苦味遮蔽剂(例如936.2160U)和天然或人工色素(例如FD&CYellow6)。每个棒状包的示例性成分内容物示于表7中。
表7.每个棒状包中的成分内容物
Figure BDA0002944254760000511
Figure BDA0002944254760000521
在另一个实施例中，赋形剂限于柠檬酸、甜味剂(例如蔗糖素)、黄原胶、香味剂(例如香草奶冻#4036)、调味剂(例如Nat Orange WONF#1362)和着色剂(例如FD&C Yellow6)。赋形剂特别不包括卵磷脂(表8)。
表8.每个棒状包中的示例性内容物
成分 级别 功能
氨基酸 USP 活性药物成分(API)
柠檬酸 USP pH，风味
蔗糖素 NF 甜味(缓效)
黄原胶 FCC 稳定剂/增稠剂
香草奶冻(Art) GRAS 香味
橙(Nat+WONF) GRAS 1o风味
FD&C黄色6号 USP 色彩
膳食组合物
包括氨基酸实体的组合物(例如，活性部分)可以被调配并用作膳食组合物，例如，选自医疗食品、功能性食品或补充剂。在这样的实施例中，原料和最终产品应符合食品的标准。
本文公开的任何方面和实施例的组合物可以用作膳食组合物，例如选自医疗食品、功能性食品或补充剂。在一些实施例中，膳食组合物用于包括将组合物施用给对象的方法中。该组合物可用于以改善或降低发炎为目的的膳食组合物中。
在一些实施例中，膳食组合物选自医疗食品、功能性食品或补充剂。在一些实施例中，所述组合物为包含本文所述组合物的营养补充剂、膳食调配物、功能性食品、医疗食品、食品或饮料的形式。在一些实施例中，包含本文所述的组合物的营养补充剂、膳食调配物、功能性食品、医疗食品、食品或饮料用于管理发炎(例如，在具有炎性病状或病症的对象中)。
本公开内容的特征在于改善发炎的方法，所述方法包括向对象施用有效量的本文所述的膳食组合物。
本公开内容的特征在于向患有发炎的对象(例如，患有炎性病状或病症的对象)提供营养支持或补充的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的组合物。
本公开内容的特征在于提供有助于管理发炎(例如，炎性病状或病症)的营养支持或补充的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的本文所述的组合物。
在一些实施方案中，对象患有或已经被诊断患有炎性病状或病症。在其它实施方案中，所述对象未患有炎性病状或病症。
另外，所述组合物可用于对象(例如，没有发炎的对象)的膳食管理方法中。
在一些实施方案中，所述对象患有胃肠道炎性病状或病症。在一些实施方案中，对象患有肺部炎性病状或病症。在一些实施方案中，所述对象具有皮肤炎性病状或病症。在一些实施方案中，所述对象患有心血管系统炎性病状或病症。在一些实施方案中，对象患有神经系统炎性病状或病症。在一些实施方案中，所述对象患有肾脏炎性病状或病症。在一些实施方案中，对象患有胰腺炎性病状或病症。在一些实施方案中，对象患有关节炎性病状或病症。在一些实施方案中，所述对象患有眼部炎性病状或病症。在一些实施方案中，所述对象患有内分泌系统炎性病状或病症。
生物标记物
本文公开的任何方法可以包括评估或监测向患有发炎的对象(例如，患有炎性病状或病症的对象)施用如本文所述的本发明的组合物的有效性。该方法包括获得组合物的有效性的值，使得该值指示疗法的有效性。
在一些实施方案中，所述对象表现出升高的C-反应蛋白水平，例如相对于没有发炎的健康对象。在一些实施方案中，所述对象表现出升高的IL-1β水平，例如，相对于没有发炎的健康对象。在一些实施方案中，所述对象表现出升高的IL-2水平，例如，相对于没有发炎的健康对象。在一些实施方案中，所述对象表现出升高的MCP-1水平，例如相对于没有发炎的健康对象。在一些实施方案中，对象表现出升高的MIP-1水平，例如，相对于没有发炎的健康对象。在一些实施方案中，对象表现出升高的NF-kB水平，例如相对于没有发炎的健康对象。在一些实施方案中，对象表现出升高的TNFα水平，例如相对于没有发炎的健康对象。在一些实施方案中，所述对象表现出升高的ALT水平，例如相对于没有发炎的健康对象。在一些实施方案中，对象表现出升高的AST水平，例如相对于没有发炎的健康对象。
在一些实施方式中，所述对象表现出降低的IL-10水平，例如，相对于没有发炎的健康对象。
在一些实施方案中，向对象施用本文所述的组合物(例如，活性部分)降低促炎性细胞因子(例如，TNFα、IL-1、IL-6或IFNγ中的一种、两种、三种或更多种(例如，全部))的水平或活性。在一些实施方案中，向对象施用本文所述的组合物降低促炎性介体(例如NF-kB)的水平或活性。在一些实施方案中，向对象施用本文所述的组合物增加抗炎性细胞因子(例如，IL-10、IL-4、IL-13和IL-5中的一种、两种、三种或更多种(例如，全部))的水平或活性。
在一些实施方案中，以本文所述的剂量方案向对象施用组合物减少以下一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种、11种、12种、13种或更多种(例如，全部)的水平或活性：(a)C-反应蛋白；(b)IL-1β；(c)IL-2；(d)IL-10；(e)MCP-1；(f)MIP-1；(g)NF-kB；(h)TNFα；(i)IL-6；(j)IP-10；(k)MCP-1；
(l)GROα(CXCL1)；(m)IL-8；或(n)YKL40。
在一些实施方案中，以本文所述的剂量方案向对象施用组合物减少以下中的一者或两者的水平或活性：(a)丙氨酸转氨酶(ALT)；(b)天冬氨酸转氨酶(AST)。
在一些实施方式中，向对象施用本文所述的组合物增加抗炎性趋化因子(例如CCL18)的水平或活性。
评估(例如筛选)的方法
在另一个方面，本文公开了用于评估如本文所述的组合物的方法或测定。该方法包括：(a)在实施例11中所述的条件下，使一种或多种肝细胞类型(例如，肝细胞、星状细胞或巨噬细胞中的一种、两种或三种，例如，在肝细胞、星状细胞和巨噬细胞的三培养物中)，例如，通过膜(例如，渗透膜，例如，transwell)分离的肝细胞类型(例如，通过膜将星状细胞和巨噬细胞中的一种或两种与肝细胞分离的肝细胞类型)与所述组合物接触；和(b)检测发炎标记物的水平，所述发炎标记物例如IL-6、IP-10、MCP-1、GROalpha(CXCL1)、IL-8或YKL40中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如全部)。在一些实施方案中，发炎标记物(例如，IL-6、IP-10、MCP-1、GROalpha(CXCL1)、IL-8或YKL40中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如，全部))的水平的变化(例如，降低)指示组合物适合于减少或治疗发炎。在一些实施方案中，所述组合物导致发炎标记物(例如，IL-6、IP-10、MCP-1、GROalpha(CXCL1)、IL-8或YKL40中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如全部))的水平降低，例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％或更多，例如，所述降低指示所述组合物适于减少或治疗发炎。在某些实施方案中，组合物导致以下各项中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如全部)的降低：
(i)IL-6水平(例如，IL-6水平降低至少50％、60％、70％或80％)；
(ii)IP-10的水平(例如，IP-10水平降低至少35％，40％，45％，或者50％)；
(iii)MCP-1水平(例如MCP-1水平降低至少50％、60％、70％、80％或90％)；
(iv)GROalpha(CXCL1)的水平(例如，GROalpha(CXCL1)水平降低至少15％、20％、25％或30％)；
(v)IL-8水平(例如，IL-8水平降低至少5％、10％、15％或20％)；或
(vi)YKL40水平(例如，YKL40水平降低至少70％、80％、90％或95％)。
在一些实施例中，一种或多种肝细胞类型(例如，肝细胞、星状细胞和巨噬细胞)存在于共培养物中，例如，由膜(例如，渗透膜，例如，Transwell)分离的肝细胞类型(例如，由膜与星状细胞或巨噬细胞中的一者或两者分离的肝细胞)存在于培养物中，例如，肝细胞与巨噬细胞与星状细胞的比率为约10：2：1(例如，由膜(例如，渗透膜，例如，Transwell)分离的肝细胞与星状细胞与巨噬细胞的比率为约10:2:1)。
在一些实施例中，检测步骤包括获得样品，例如培养物样品，例如来自实施例11中所述的Transwell板的培养物样品，并测量发炎标记物(例如IL-6、IP-10、MCP-1、GROα(CXCL1)、IL-8或YKL40中的一种、两种、三种、四种、五种、或更多种(例如全部))的水平。
实施例
以下实施例用于帮助理解本发明，但不是用来，也不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例1.治疗性氨基酸组合物A-1治疗改善化学诱导的纤维化动物模型中的肝发炎
在化学诱导的肝发炎模型中测试氨基酸组合物A-1影响肝发炎的能力。在小鼠中使用四氯化碳(CCl4)化学诱导实验性肝发炎的常用模型(Gideon Smith,Animal Modelsof Cutaneous and Hepatic Fibrosis；Progress in Molecular Biology andTranslational Science,Vol.105,pp.371-408)。CCl4在治疗4周后引起发炎、肝细胞损伤、坏死和发炎，在8周后引起肝硬化。通过四氯化碳(CCl4)在小鼠中诱导的肝发炎类似于人类肝发炎的重要特性，包括发炎、再生和纤维形成。
本研究使用7-8周龄的雄性BALB/c小鼠。每笼饲养四只动物，保持标准12小时光照周期，并自由获取水和标准小鼠饲料。食物和水可随意获得。
给动物腹膜内(IP)给药5％CCl4或载体，通常每周3天，持续4周。CCl4每周调配一次。通过口服管饲法(oral gavage)每天两次以23mg/ml、76mg/ml或153mg/ml给药10ml/kg的氨基酸组合物A-1。每周称重动物两次，每周一次经眼眶后窦收集血液用于血清。四周后，收集血液用于血清分离，并通过颈椎脱位术处死小鼠。除去肝的两个叶-将左叶置于含有10％福尔马林的管中用于组织病理学，同时称重右叶并置于含有2.3mm氧化锆珠和2倍体积的1:100蛋白酶抑制剂(Sigma Aldrich，#P8340)的珠磨器管中。在珠磨器中将组织样品均质化2分钟，并立即在4℃下以3,000rpm离心15分钟。在第2周和第4周分析血清的ALT/AST水平。进一步评估均质化肝脏样品的羟脯氨酸(Hyp)含量以鉴定肝发炎的形成。
羟脯氨酸(第4周)
羟脯氨酸(4-羟脯氨酸，Hyp)是常见的非蛋白原性氨基酸，并且用作存在的胶原蛋白的量的间接测量，指示发炎。CCl4处理的动物中肝脏Hyp含量水平显著高于载体处理的动物。数据是平均值±标准差(STDEV)；"组合物A-1"：氨基酸组合物A-1；与载体对照进行比较，*p<0.05。原始数据示于表9中。
表9.肝羟脯氨酸含量水平结果
Figure BDA0002944254760000581
AST水平和ALT水平
天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)是肝脏健康的常用测定的临床生物标记物。在整个研究期间，施用CCl4的动物中AST和ALT两者的水平都显著升高，表明发生了肝损伤。数据是平均值±标准差(STDEV)；"组合物A-1"：氨基酸组合物A-1；p值为与载体/CCl4对照进行比较；通过单尾T检验；n.s.不显著。原始数据示于表10和11中。
表10.ALT水平结果
Figure BDA0002944254760000591
表11.AST水平结果
Figure BDA0002944254760000592
简述
用氨基酸组合物A-1处理导致化学诱导的发炎减少，如通过减少的羟脯氨酸(胶原蛋白产生的标记物)水平所指示的，并且导致肝损伤的临床生物标记物的改善，如通过减少的肝酶ALT和AST的水平所指示的(表12-14)。
表12.肝羟脯氨酸含量水平结果：原始数据
Figure BDA0002944254760000601
表13.ALT水平结果：原始数据
Figure BDA0002944254760000602
Figure BDA0002944254760000611
表14.AST水平结果：原始数据
Figure BDA0002944254760000612
Figure BDA0002944254760000621
实施例2.在临床前动物模型中用氨基酸组合物A-1治疗性处理(therapeutictreatment)NAFLD、NASH和HCC。
在STAMTM模型(Stelic Institute&Co.,Tokyo,Japan；Saito K.等，2015Sci Rep5:12466)中测试了氨基酸组合物A-1和奥贝胆酸(6α-乙基-鹅脱氧胆酸；"OCA")治疗NASH的能力。包括另两组喂食标准饲料的正常C57BL/6小鼠和载体处理的STAMTM小鼠作为对照。所有接受处理或载体的动物均从6周龄开始处理，直至9周龄。化合物通过口服管饲法施用，剂量体积为10ml/kg。氨基酸组合物A-1以1500mg/kg的剂量每天施用两次，OCA以30mg/kg的剂量每天施用一次。
STAMTM是一种非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝细胞癌(HCC)的模型，由SMC实验室公司开发，并使用C57BL/6小鼠通过化学和膳食干预的组合产生(Saito K等，2015 SciRep5:12466)。小鼠在出生时用低剂量的链脲霉素(streptozotocin)处理，并在4周开始喂食高脂肪饮食。脂肪肝的证据在5周前出现，随后NASH在7周前出现，纤维化在9周前出现。
在53只雄性小鼠中，通过在出生后2天单次皮下注射200μg链脲霉素(STZ，Sigma-Aldrich，USA)溶液并在4周龄后饲喂高脂肪饮食(HFD，57kcal％脂肪，Cat#HFD32，CLEAJapan，日本)来诱导NASH。
氨基酸组合物A-1、OCA和载体(如下所述)通过口服途径以10mL/kg的体积施用。将氨基酸组合物A-1溶解在去离子水中至150mg/ml(10X)。将OCA(Advanced ChemBlocksInc.)重新悬浮于0.5％甲基纤维素水溶液中至3mg/ml(10X)。氨基酸组合物A-1以1500mg/kg的剂量每天两次施用(9am和7pm)。OCA以30mg/kg的剂量每天施用一次(9am)。
2组(载体)、3组(氨基酸组合物A-1)和4组(OCA)的小鼠的肝样品用于下列测定。对于HE染色，从预先固定在Bouin's溶液中的肝组织石蜡块上切片，并用Lillie-Mayer's苏木素(Muto Pure Chemicals Co.,Ltd.，日本)和伊红溶液(Wako Pure ChemicalIndustries)染色。根据Kleiner标准(Kleiner D.E.等，Hepatology，2005；41:1313)计算NAFLD活性评分(NAS)。
研究组
1组：STZ：十只初生儿STZ-引发的小鼠随意进食正常饮食而不进行任何治疗，直到9周龄。
2组：载体：从6到9周龄，十只NASH小鼠以10mL/kg的体积每日两次(9am和7pm)口服施用载体(10％磷酸盐缓冲盐水，pH7.2)。
3组：氨基酸组合物A-1：从6到9周龄，十只NASH小鼠每天两次(9am和7pm)以1500mg/kg的剂量口服施用补充有氨基酸组合物A-1的灌注水。
4组：OCA：从6到9周龄，十只NASH小鼠每天一次(9am)以30mg/kg的剂量口服施用补充有OCA的0.5％甲基纤维素。
5组：正常：十只正常小鼠随意进食正常饮食而不进行任何处理，直到9周龄。
6组：HFD：十只正常小鼠随意进食高脂肪膳食而不进行任何处理，直到9周龄。
组织学结果：HE染色、NAFLD活性评分和α-平滑肌肌动蛋白染色
通过组织学分析和来自每只动物的H&E染色的肝切片的分级评价非酒精性脂肪肝病(NAFLD)活性评分。该评分是对脂肪变性(0-3)、发炎(0-2)和肝细胞气球样膨大(0-2)的程度进行分级的三个单独评分的总和。所有组织都使用Kleiner等人的评分标准(Kleiner等人，Hepatology，2005；41(6)：1313-21)进行分级。结果如表37所示。数据是平均值±标准差(Stdev)。正常的C57BL/6小鼠喂食标准饲料后的平均评分为0+/-0。载体处理的STAMTM小鼠的平平均评分为4.7+/-0.67。氨基酸组合物A-1处理的小鼠的平均评分为3.1+/-0.74。OCA处理的小鼠的平均评分为2.9+/-0.74。当使用Dunnett氏多重比较检验进行比较时，氨基酸组合物A-1和OCA两者在NAFLD活性评分方面与载体在统计学上不同(氨基酸组合物A-1p＝0.0001，OCA p＝0.0001)。
类似地，氨基酸组合物A-1处理的小鼠显示平均气球样膨大评分0.4+/-0.52，相比之下，载体处理的STAMTM小鼠的平均气球样膨大评分1.6+/-0.52，OCA处理的小鼠的平均气球样膨大评分0.3+/-0.48。当使用Dunnett氏多重比较检验进行比较时，氨基酸组合物A-1和OCA两者在气球样膨大评分方面与载体在统计学上不同(氨基酸组合物A-1p＝0.0001，OCA p＝0.0001)。原始数据示于表15-18中。
表15.NAFLD活性评分
Figure BDA0002944254760000641
表16.NAFLD活性：脂肪变性评分
Figure BDA0002944254760000642
Figure BDA0002944254760000651
表17.NAFLD活性：发炎评分
Figure BDA0002944254760000652
表18.NAFLD活性：气球样膨大评分
Figure BDA0002944254760000653
纤维化：天狼星红(Sirius Red)染色结果
通过分析每只动物的染色肝脏切片的天狼星红阳性染色细胞区域来评价纤维化。使用阳性染色面积的百分比定量图像，作为纤维化的量度。该分析的结果示于表41中。数据是平均值±标准差(Stdev)。正常的C57BL/6小鼠喂食标准饲料后的平均阳性面积为0.286+/-0.09。载体处理的STAM小鼠的平均阳性面积为1.1+/-0.26。氨基酸组合物A-1处理的小鼠的平均阳性面积为0.828+/-0.33。OCA处理的小鼠的平均评分为0.776+/-0.25。当使用Dunnett氏多重比较检验进行比较时，氨基酸组合物A-1和OCA在统计学上不同于载体(氨基酸组合物A-1p＝0.00494，OCA p＜0.016)。原始数据示于表19中。
表19.纤维化(平均阳性染色面积，天狼星红)
Figure BDA0002944254760000661
与用氨基酸组合物A-1处理后STAM小鼠模型中NAFLD活性评分、气球样膨大和纤维化的统计学显著改善相似(图1A)，用氨基酸组合物A-1处理后在高脂肪、高果糖和胆固醇饮食(HFFC)小鼠模型中确定了NAFLD活性评分、气球样膨大和纤维化的统计学显著改善(图1B)。
α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色结果
将所有小鼠的肝脏切片染色标记物α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)以鉴定活化的肝星状细胞。使用阳性染色面积的百分比定量图像，作为星状细胞活化的量度。结果示于表20中。数据是平均值±标准差(STDEV)；p值为与载体处理的STAM小鼠对照进行比较；通过单尾T检验。正常C57BL/6小鼠喂食标准饲料后的平均阳性面积为0.682+/-0.26。载体处理的STAMTM小鼠的平均阳性面积为2.128+/-0.50。氨基酸组合物A-1处理的小鼠的平均阳性面积为1.657+/-0.84。OCA处理的小鼠的平均评分为1.562+/-0.31。
表20.活化的肝星状细胞(平均阳性染色区，α-平滑肌肌动蛋白)
Figure BDA0002944254760000671
简述
用氨基酸组合物A-1处理使NASH的严重程度显著降低到与通过OCA抑制法尼醇X受体(FXR)(目前正在由Intercept Pharmaceuticals,Inc.进行临床研究，用于治疗NASH)相当的水平，如NAFLD活性评分(NAS)的显著降低所示(与OCA处理的小鼠的平均评分2.9+/-0.74相比，氨基酸组合物A-1的平均NAS：3.1+/-0.74，相对于载体处理的STAM小鼠的平均评分4.7+/-0.67，)，以及降低纤维化的发展，如肝星状细胞活化的下调所示(与OCA处理的小鼠的平均面积1.562+/-0.31相比，氨基酸组合物A-1的平均α阳性SMA染色面积：1.657+/-0.84，相对于载体处理的STAMTM小鼠的平均面积2.128+/-0.50。。
表21.NAFLD活性评分：原始数据
Figure BDA0002944254760000672
Figure BDA0002944254760000681
表22.NAFLD活性：脂肪变性评分：原始数据
Figure BDA0002944254760000682
表23.NAFLD活性：发炎评分：原始数据
Figure BDA0002944254760000683
Figure BDA0002944254760000691
表24.NAFLD活性：气球样膨大评分：原始数据
Figure BDA0002944254760000692
表25.纤维化(平均阳性染色面积，天狼星红)：原始数据
Figure BDA0002944254760000701
表26.活化的肝星状细胞(平均阳性染色区域，α-平滑肌肌动蛋白)：原始数据
Figure BDA0002944254760000702
Figure BDA0002944254760000711
实施例3：用氨基酸组合物处理后肝细胞发炎的减少
使用稳定表达NF-κB荧光素酶报告基因系统(Signosis,Inc.)的HepG2肝细胞癌细胞评估氨基酸影响肝细胞发炎的能力。在第0天，以4.5e4将HepG2细胞接种在96孔微孔板(ThermoFisher)中，在补充有0.1％热灭活胎牛血清(HI-FBS，HyClone)和0.2％Primocin(InVivoGen)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM，Corning)中，并在37℃，5％CO2下培养过夜。在第1天，用DPBS(Gibco)洗涤细胞一次，并用不含氨基酸的DMEM(USBiologicals)替换，所述DMEM含有基于血液中的平均生理浓度的确定的定制氨基酸浓度、含25mM葡萄糖、1mM丙酮酸钠和确定的50X氨基酸组合物(即，载体、LIVRQ+N-乙酰基半胱氨酸、LIVRQ、RQ+N-乙酰基半胱氨酸、单独的N-乙酰基半胱氨酸、LIV或单独的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸)的剂量曲线(表27)，所述平均生理浓度基于人类代谢组数据库(Wishat DS，Tzur D，Knox C等，HMDB:the Human MetabolomeDatabase.Nucleic Acids Res.2007Jan；35(Database issue):D521-6.17202168)中公布的值。细胞在确定培养基(defined medium)中在37℃、5％CO2下预处理12小时。预处理后，将TNFα(R&D Systems)或载体掺入各孔中，使最终浓度为100pM，细胞在该刺激下于37℃、5％CO2再培养6小时。在12小时培养后，将细胞在冷PBS中洗涤1次，并使用被动裂解缓冲液裂解，并根据制造商的方案(Signosis)进行荧光素酶(luciferase)测定。使用Bio-TekSynergyH4平板读数器和亮度计(luminometer)评价萤火虫荧光素酶活性(Sitcheran R*,Comb WC,Cogswell PC,Baldwin AS*.Essential role for epidermal growth factorreceptor in glutamate receptor signaling to NF-kappaB.Mol Cell Biol.(2008)Aug；28(16):5061-70.Epub 2008Jun 9)。
相对于1×血浆氨基酸基线培养基，TNFα刺激的NF-kB活性不受50×亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸和谷氨酰胺处理细胞的影响。用50x半胱氨酸预处理细胞确实导致TNFα诱导的NF-κB活性的显著钝化。用单个氨基酸的组合处理确实对NF-kB报告基因活性具有不同的影响，但重要的是，所有6种氨基酸的组合(LIVRQNAC)导致肝脏细胞中TNFα诱导的NF-kB活性的最显著抑制(表27)。
表27.
Figure BDA0002944254760000721
Figure BDA0002944254760000731
实施例4.氨基酸组合物处理通过影响脂质代谢、发炎和纤维化改善两种啮齿动物模型中NASH的进展
调配氨基酸组合物以同时靶向多种疾病病理学机制，从而安全且有效地处理NASH(表28)。如本文所述，在两个已建立的NASH小鼠模型中研究氨基酸组合物的效力，以确定氨基酸组合物对与NASH和相关病症有关的体征和症状的作用。
表28.氨基酸组合物的示例性氨基酸组分。
Figure BDA0002944254760000732
STAMTM小鼠是SMC实验室公司(SMC Laboratories,Inc)开发的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝细胞癌(HCC)的模型。脂肪肝的证据在5周龄时存在，随后NASH在7周龄时存在，纤维化在9周龄时存在。雄性STAM小鼠在C57BL/6小鼠中产生，其在出生后2天接受低剂量链脲霉素，并在4周龄开始饲喂高脂肪饮食(57％kcal脂肪，HFD32，CLEA Japan,Inc.)(Saito K等，2015Sci Rep5:12466；在此通过引用将其全部内容并入本文)。从6周龄开始，以1.6m/kg的剂量每天两次将氨基酸组合物施用STAM小鼠，共3周。包括一组载体处理的STAM小鼠作为对照。未禁食的小鼠在9周龄时安乐死。收集血浆和肝脏样品用于进一步分析(图2)。
FATZOTM小鼠是近交的肥胖症、代谢综合征和NASH的多基因模型，由CrownBioscience,Inc开发(Peterson RG.Et，2017PLoS一；在此通过引用将其全部并入)。从6周龄开始，给雄性FATZO小鼠喂食高脂肪、果糖和胆固醇(HFFC)饮食(40％kcal脂肪，D12079B，Research Diets,Inc.，和5％果糖饮用水溶液)，以诱导NAFLD和NASH。诱导后4周出现脂肪肝的证据，随后诱导后16周出现NASH，诱导后20周出现纤维化。从诱导后16周开始，以3.0g/kg的剂量每天两次施用设计的氨基酸组合物，持续4周(图2)。一组载体处理的FATZO小鼠作为对照。未禁食的小鼠在诱导后20周安乐死。收集血浆和肝脏样品用于进一步分析。
Aperio ScanScope CS全载玻片数字成像系统(Vista，CA)用于在H&E，PicricSirius Red，SMA，F4/80中成像。从整个载玻片捕获图像。
肝脏由对样品ID不知情的兽医病理学家使用NASH临床研究网络(CRN)肝脏组织学评分系统(Kleiner DE等，2015，在此全文引入作为参考)进行评估。NASH CRN评分系统评估脂肪变性、小叶发炎、肝细胞气球样膨大、变性和纤维化的进展。用NASH评分系统分析每种情况的肝脏的一个横截面。以0-3的等级评估脂肪变性、小叶发炎和纤维化进展。以0-2等级评估气球样膨大退化。
Aperio Automatic Image Quantitation的Positive Pixel Count算法用于定量扫描的载玻片图像中存在的特定染色的百分比。掩蔽并评估颜色范围(色调和饱和度范围)和三个强度范围(弱、阳性和强)。该算法对每个强度范围中的数量和强度和进行计数，以及三个附加量：平均强度、强/总数的比率、以及弱阳性像素的平均强度。
使用特定的阳性像素算法对天狼星红和油红O(Oil Red O)肝脏切片进行成像。修改阳性像素算法以区分橙色和蓝色。对于天狼星红的评估，进行从正常"色调值"(0.1-0.96)和"色饱和度"(0.04-0.29)的改变。将脉管系统和人为假象从分析中排除。
通过Folch's方法(Folch J等，J.Biol.Chem.1957；226:497；在此全文引入作为参考)获得肝脏总脂质提取物。将肝样品在氯仿-甲醇(2:1，v/v)中匀浆并在室温下培养过夜。用氯仿-甲醇-水(8:4:3，v/v/v)洗涤后，将提取物蒸发至干，并溶于异丙醇。分别通过甘油三酸酯E试验和胆固醇E试验测量肝脏甘油三酸酯和胆固醇含量。
使用Illumina TruSeq Stranded mRNA样品制备试剂盒(Illumina#RS-122-2103)将肝RNA样品转化为cDNA文库。在Q2溶液(Morrisville，NC)下分析转录组。将RNA seq数据标准化，并使用Ingenuity Pathway Analysis(QIAGEN Bioinformatics)进行分析。专注于路径水平的小鼠肝基因的表达，因为它可转化为人NAFLD(Teufel A等，Gastroenterology，2016，在此通过引用将其全部内容并入)。
在Human Metabolome Technologies(Yamagata，日本)进行基于毛细管电泳飞行时间质谱(CE-TOFMS)和LC-TOFMS平台的代谢图谱分析。通过将迁移时间和m/z比与真实标准比较来鉴定样品中的代谢物，并通过将它们的峰面积与真实标准的峰面积比较来定量。
使用多重ELISA测定(Meso Scale Discovery，Rockville，Maryland)定量肝脏中IL-1b、MCP-1、和MIP-1蛋白的水平。
该氨基酸组合物改善STAM和FATZO小鼠两者的气球样膨大和纤维化
用氨基酸组合物处理显著降低STAM和FATZO小鼠两者中的NAFLD活性评分(NAS)(图3A)。用氨基酸组合物处理也显著降低STAM小鼠中肝细胞的气球样膨大(图3B)。根据组织学测定，通过用氨基酸组合物处理STAM小鼠，脂肪变性和发炎的评分没有改变。用氨基酸组合物处理STAM小鼠后，天狼星红-阳性的纤维化面积显著降低，而用氨基酸组合物处理STAM小鼠后，油红O面积没有改变(图3C)。肝脏甘油三酸酯和胆固醇水平没有改变。
用氨基酸组合物处理也显著降低了FATZO小鼠中肝细胞的气球样膨大(图3D)。脂肪变性和发炎以及肝脏甘油三酸酯和胆固醇水平的评分在用氨基酸组合物处理的FATZO小鼠中没有改变。用氨基酸组合物处理FATZO小鼠，天狼星红-阳性的纤维化面积显著降低，而用氨基酸组合物处理FATZO小鼠，油红O面积没有改变(图3E)。
在由Ingenuity Pathway Analysis开发的上游调节系统生物学知识库框架的背景下解释了通过用氨基酸组合物处理影响的肝中的差异基因表达模式。计算的z-评分表明，基因表达模式与作为上游调节剂的编码过氧化物酶体脂肪酸氧化的ACOX1的激活一致(图4和表29)。
表29.与对照相比，用氨基酸组合物(处理组)处理STAM小鼠后与ACOX1路径相关的基因表达的P值和倍数变化。
Figure BDA0002944254760000761
Figure BDA0002944254760000771
Figure BDA0002944254760000781
氨基酸组合物缓和发炎路径
发炎是NASH的“第二次打击”。用氨基酸组合物处理导致的肝脏中的差异基因表达模式在IPA分析中产生z-评分，该评分与抗炎性IL-10的上游调节剂激活(图5A)和促炎性NF-kB(图5B和表30)、干扰素、IL-1b和IL-2(图5C和表30)的抑制有关。在蛋白质水平上，用氨基酸组合物处理显著下调肝MCP-1和MIP-1，它们分别是C-C趋化因子受体2型(CCR2)和5型(CCR5)的配体(图6)。因此，用氨基酸组合物治疗使免疫系统趋向抗炎性状态，这可以抑制NASH的进展。
表30.与对照相比，用氨基酸组合物(处理组)处理STAM小鼠后与ACOX1路径相关的基因表达的P值和倍数变化。
Figure BDA0002944254760000782
Figure BDA0002944254760000791
Figure BDA0002944254760000801
Figure BDA0002944254760000811
Figure BDA0002944254760000821
Figure BDA0002944254760000831
该氨基酸组合物预防纤维生成路径
纤维化是几种生物过程的联系，例如代谢失调、发炎和细胞死亡。肝细胞中的脂质积累和慢性发炎诱导肝星状细胞的纤维化活化(Wober H等，Cell Res.2009，其通过引用整体并入本文)。用氨基酸组合物处理所产生的肝脏基因表达模式与纤维发生TGF-b信号传导路径的抑制一致(图5D)。
越来越多的证据表明CCR2/CCR5及其配体(包括MCP-1/MIP-1)促进巨噬细胞募集和肝星状细胞活化，导致肝组织损伤后的纤维化(Lefebvre E等，PLoS One2016，在此将其全部引入作为参考)。氨基酸组合物在NASH的STAM模型中通过减少肝TGF-b信号传导和MCP-1和MIP-1蛋白而显示出有效的抗纤维化活性(图6)。
在NASH的STAM和FATZO小鼠模型中，氨基酸组合物显示了一致的疾病改变活性，包括NAS的改善和气球样膨大和纤维化的改善。氨基酸组合物的活性似乎至少部分地通过增加脂肪酸氧化、降低与肝发炎和纤维化相关的关键细胞因子转录路径的水平来驱动。
实施例5：脂肪变性和发炎的肝细胞模型
肝细胞的脂毒性似乎是通过氧化应激(oxidative stress)和内质网(ER)应激的肝细胞损伤的主要驱动因素。使用人类原代肝细胞(Lonza，TRL)评估氨基酸影响肝细胞中脂肪变性(脂质积累)和发炎的能力。
在第0天，将来自两个健康人供体的原代肝细胞批号以6e04细胞的密度接种在96孔光学微孔板(Thermofiser)中的肝细胞平板培养基(William’s E medium(Gibco))，其中补充有10％热灭活FBS(Atlanta Bio)、2mM Glutamax(Gibco)和0.2％Primocin(InVivoGen)，并在37℃、5％CO2下培养6小时。6小时后，将细胞洗涤两次，并在37℃、5％CO2下与补充有2mM Glutamax(Gibco)和1x青霉素/链霉素的肝细胞确定培养基(Corning)培养过夜。在第1天，将细胞洗涤两次，并在上述相同条件下在肝细胞培养基中培养24小时。
在第2天，用DPBS1X(Gibco)洗涤细胞两次，并维持在不含氨基酸的WEM(USBiologicals)中，WEM含有基于血液中平均生理浓度的确定的定制氨基酸浓度。这些值公布在人类代谢组数据库中(Wishrt DS，Tzur D，Knox C等，HMDB:the Human MetabolomeDatabase.Nucleic Acids Res.2007Jan；35(Database issue):D521-6.17202168；其全部内容通过引用结合到本文中)。该定制培养基补充有11mM葡萄糖、0.272mM丙酮酸钠，以及各种浓度范围的确定的氨基酸组合物(即，载体、LIVRQ+N-乙酰基半胱氨酸、LIVRQ、RQ+N-乙酰基半胱氨酸、单独的N-乙酰基半胱氨酸、LIV，或单独的L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺和L-半胱氨酸)的剂量曲线。细胞在这种确定培养基中在37℃、5％CO2下维持24小时。
预处理后，将细胞暴露于250μM的游离脂肪酸(FFA)或载体中，其中游离脂肪酸(FFA)的比例为2:1(油酸盐：棕榈酸盐)，并补充有1ng/ml的TNF-α(Thermofiser)。细胞与FFAs混合物和不同的氨基酸组合在37℃、5％CO2下培养24小时。在24小时培养后，除去培养基用于细胞因子分析，并用含有相同刺激条件和氨基酸浓度的新鲜培养基替换。细胞再培养48小时，共72小时的FFA和TNFα刺激。
通过ELISA(人CCK2/MCP-1DuoSet ELISA，R&D Systems)以1/5或1/10稀释在1X试剂稀释液(试剂辅助试剂盒2，R&D Systems)中测量人CCL2(MCP-1)。将数据标准化为在如下所述的荧光显微镜中通过由Hoechst3342(Life Technologies)染色的细胞核计数测定的特定每孔细胞密度。
MCP1/CCL2分泌
表31-34显示了来自两个健康供体(供体1用于表31和32，供体2用于表33和34)的原代人肝细胞中的基线扣除的MCP1/CCL2分泌。LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LIVRQNAC+S、LIVRQ和RQNAC显著降低了两个供体中MCP1/CCL2的分泌。然而，LIV组合仅在供体之一中显著增加MCP1/CCL2分泌。与单独的LIV相比，向LIV的组合中添加精氨酸(R)和谷氨酰胺(Q)降低了两个供体中MCP1/CCL2的分泌。单独地，N-乙酰基半胱氨酸和谷氨酰胺显示显著降低MCP1/CCL2分泌，而精氨酸增加MCP1分泌。异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸对MCP1/CCL2分泌没有影响。
表31.施用氨基酸组合物后供体1的MCP1表达的变化
Figure BDA0002944254760000851
Figure BDA0002944254760000861
Figure BDA0002944254760000871
表32.施用单一氨基酸组合物后供体1的MCP1表达的变化
Figure BDA0002944254760000872
Figure BDA0002944254760000881
表33.施用氨基酸组合物后供体2的MCP1表达的变化
Figure BDA0002944254760000882
Figure BDA0002944254760000891
表34.施用单一氨基酸组合物后供体2MCP 1表达的变化
Figure BDA0002944254760000901
Figure BDA0002944254760000911
实施例6:肝星状细胞-TNFα发炎反应
从Samsara Sciences获得原代人肝星状细胞，并在T75或T150培养瓶中以低于10代在完全HSC培养基(Complete HSC Medium)中生长至～80％汇合，接种到96孔板中，并在37℃、5％CO2的加湿培养箱中培养6小时。6小时后，从培养箱中取出板，用DPBS洗涤，并预处理(±单个氨基酸缺失(，±补充氨基酸剂量；有关培养基组成，参见实验)过夜，～14-15小时。在过夜预处理后，从细胞中除去培养基，并应用现在补充了3ng/mL TNFα的相同的预处理培养基。板在37℃，5％CO2下培养12小时。用TNFα刺激12小时后，取出上清液，并以两个分开的等份在-80℃冷冻。洗涤板，并用CCK-8活力试剂(Dojindo)培养1小时。在Synergy平板读数器上测量存活率。立即除去培养基，并将板固定，以用于免疫荧光染色。
通过ELISA(人CCK2/MCP-1DuoSet ELISA，R&D Systems；人IL-6DuoSet ELISA，R&DSystems)以1/5和1/20稀释于1X试剂稀释剂(试剂辅助试剂盒2(Reagent Ancillary Kit2)，R&D Systems)测定人CCL2/MCP1和人IL-6。将数据标准化为通过Hoechst染色的细胞核计数确定的每孔特定细胞密度。
促炎性MCP-1趋化因子分泌
表35-38显示了来自两个供体的原代人肝星状细胞中每细胞标准化MCP-1趋化因子分泌，作为血浆氨基酸背景的倍数变化。在每个处理组中，通过单向ANOVA和Dunnett多重比较检验计算统计学显著性。LIVRQNAC+G和RQNAC在两个供体中均显著地降低MCP-1的分泌。LIVRQNAC、LIVRQNAC+S减少MCP1分泌，并且在两个供体之一中具有统计学显著性。单独地，缬氨酸、精氨酸和亮氨酸中的每一种对MCP-1分泌没有显著影响。谷氨酰胺在两个供体中都降低MCP1分泌，但仅在两个供体之一中具有统计学显著性。N-乙酰基半胱氨酸显着降低了两个供体中MCP-1的分泌。
表35.施用氨基酸组合物后供体3的MCP1分泌的变化
Figure BDA0002944254760000921
Figure BDA0002944254760000931
表36.施用单一氨基酸组合物后供体3的MCP1分泌的变化
Figure BDA0002944254760000932
Figure BDA0002944254760000941
Figure BDA0002944254760000951
表37.施用氨基酸组合物后供体4的MCP1分泌的变化
Figure BDA0002944254760000952
Figure BDA0002944254760000961
表38.施用单一氨基酸组合物后供体4的MCP1分泌的变化
Figure BDA0002944254760000962
Figure BDA0002944254760000971
IL-6细胞因子分泌
表39-42显示了来自两个供体的原代人肝星状细胞中每细胞标准化的IL-6细胞因子分泌，作为血浆氨基酸背景的倍数变化。在每个处理组中，通过单向ANOVA与Dunnett多重比较检验计算统计学显著性。LIVRQNAC、LIVRQNAC+S和RQNAC在两个供体之一中显著降低IL-6分泌。LIVRQNAC+G、LIVRQNAC+S和RQNAC在两个供体中都降低IL-6分泌。LIV和LIVRQ对任一供体中的IL-6分泌没有显著影响。单独地，缬氨酸、精氨酸、异亮氨酸和亮氨酸对IL-6分泌没有显著影响。N-乙酰基半胱氨酸在两个供体中都减少IL-6分泌，但仅在两个供体之一中有统计学显著性。谷氨酰胺显著降低了两个供体中IL-6的分泌。
表39.施用氨基酸组合物后供体1的IL-6细胞因子分泌的变化
Figure BDA0002944254760000981
Figure BDA0002944254760000991
Figure BDA0002944254760001001
表40.施用单一氨基酸组合物后供体1的IL-6细胞因子分泌的变化
Figure BDA0002944254760001002
Figure BDA0002944254760001011
表41.施用氨基酸组合物后供体2的IL-6细胞因子分泌的变化
Figure BDA0002944254760001012
Figure BDA0002944254760001021
表42.施用单一氨基酸组合物后供体2的IL-6细胞因子分泌的变化
Figure BDA0002944254760001031
Figure BDA0002944254760001041
实施例7：原代人巨噬细胞中的细胞因子分泌
外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell)(PBMC)的分离
将未纯化的血沉棕黄层(buffy coats)(Research Blood Components)小心地倒入50mL离心管中，并用室温的含钙和镁的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(dPBS)(Gibco)稀释。将稀释的血沉棕黄层进一步分成总共四个50mL离心管，每个管20mL。将淋巴细胞分离培养基(Corning)小心地用移液管移至每个离心管的底部。混合物在20℃下以850×g离心32分钟，减速度和加速度为0。
离心后将PBMC层与其它组分分离，并加入到含有25mL dPBS的新的50mL离心管中。用dPBS将总体积调至50mL，并在20℃下以600×g离心10分钟，加速度为9，减速度为5。小心地从细胞沉淀(cell pellet)中除去上清液。用10mL dPBS重悬细胞沉淀。然后用dPBS将总体积调至50mL，并在20℃下以450×g离心5分钟，加速度为9，减速度为9。再次重复上清液去除和细胞沉淀物重悬。
然后小心地从细胞沉淀中除去上清液。将细胞沉淀重悬于10mL无钙或镁的dPBS中，并通过70μM细胞过滤器过滤。用Cellometer K2自动细胞计数器确定总PBMC数目。总共保存5E6细胞，用于流式细胞术分析。将剩余的细胞在20℃以490×g离心5分钟，加速度为9，减速度为9。
CD14+细胞选择
使用EasySepTM人CD14阳性选择试剂盒II(Human CD14 Positive Selection KitII)(STEMCELL Technologies)选择CD14+细胞。将细胞以1×108细胞/mL重悬于冷EasySepTM缓冲液(STEMCELL Technologies)中。将总共100μL/mL EasySepTM人CD14阳性选择混合物II(Human CD14 Positive Selection Cocktail II)加入到细胞悬浮液中，混合，并在室温下培养10分钟。将总共100μL/mL RapidSpheres加入到混合物中，并在混合后于室温培养3分钟，然后加入RoboSep缓冲液以使总体积达到10mL。将15mL试管中的混合物置于磁体中，并在室温下培养3分钟。弃去上清液，将10mL新鲜EasySepTM缓冲液加入15mL试管中。再重复两次加入RoboSep缓冲液、混合和弃去上清液。
将阴性和阳性级分在20℃以490×g离心5分钟，加速度为9，减速度为9，并且重悬于DMEM(Gibco)和10％热灭活胎牛血清(Atlanta Bio)和青霉素/链霉素中。计数细胞，并在20℃下以490×g再次离心5分钟，加速度为9，减速度为9。离心后，将细胞重悬于DMEM(Gibco)和10％热灭活胎牛血清(Atlanta Bio)和含有500U/mL GM-的青霉素/链霉素中，并以1-2×106个细胞/mL铺板于10cm组织培养板上。在补料/收获之间，将细胞保持在37℃、5％CO2中。
CD14+细胞供给
每3-4天通过除去培养基和未附着的细胞，在20℃以490×g离心5分钟，加速度为9，减速度为9，并重悬于新鲜DMEM(Gibco)和10％热灭活胎牛血清(Atlanta Bio)和含有GM-CSF的青霉素/链霉素中，对细胞进行补料。将重悬的细胞接种回10cm组织培养板上，并在37℃、5％CO2下培养。分化的巨噬细胞用于随后的实验。
筛选
在第0天，将原代人PMBC衍生的巨噬细胞以3.0E4细胞/孔接种在96-孔微孔板(ThermoFisher)中，所述微孔板在补充有青霉素-链霉素(Hyclone)和10％热灭活胎牛血清(HI-FBS)(Atlanta Bio)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(Gibco)中，并在37℃、5％CO2下培养过夜。在第1天，用每孔150μL DPBS(Gibco)洗涤细胞一次，并用75μL的以下处理：
a.含有根据人类代谢组数据库(HMDB)中公布的值的基于血液中平均生理浓度确定的定制氨基酸浓度的不含氨基酸的DMEM(US Biologicals)，其含有6mM葡萄糖、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES、0.2％普莫菌素(InVivoGen)；或
b.与上述相同的培养基，其具有不同浓度的一种氨基酸，包括完全缺失。
在第2天，用75μL的与上述相同的培养基处理细胞，其补充有0.30ng/mL脂多糖(LPS)(Sigma)，使最终浓度为0.15ng/mL LPS。对照孔用1uM BX-795(Tocis)、1uM TAK242(Sigma)、0.15ng/mL LPS或磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理。
在第3天，收集上清液并立即在-80℃冷冻器中冷冻。用150μL DPBS洗涤细胞一次，并使用WST-8细胞增殖细胞毒性测定(Dojindo)评价存活力。测定后，用150μL PBS洗涤细胞两次，用4％多聚甲醛固定5分钟，然后用150μL PBS再洗涤两次。根据制造商提供的方案，使用市售的试剂盒(R&D Systems)通过ELISA分析上清液样品中的IL-6和TNFa的蛋白水平。结果示于下表43-48中。
表43.IL-6测量：供体1
Figure BDA0002944254760001071
Figure BDA0002944254760001081
Figure BDA0002944254760001082
Figure BDA0002944254760001091
用LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LIVRQNAC+S、RQNAC和NAC处理显著减少原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中LPS诱导的IL-6分泌。用LIVRQ处理显著增加IL-6分泌，而LIV没有作用。单独施用精氨酸和谷氨酰胺增加了IL-6分泌，而单独施用其它氨基酸不影响IL-6分泌。进行双向ANOVA Dunnett多重比较，以用于统计学分析。平均值表示为基线扣除值。
表44.IL-6测量：供体2
Figure BDA0002944254760001092
Figure BDA0002944254760001101
Figure BDA0002944254760001111
Figure BDA0002944254760001112
Figure BDA0002944254760001121
用LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LIVRQNAC+S、RQNAC和NAC处理显著减少原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中LPS诱导的IL-6分泌。用LIVRQ和LIV处理显著增加IL-6分泌。单独施用谷氨酰胺和亮氨酸增加IL-6的分泌，而单独施用其他氨基酸则没有作用。进行双向ANOVADunnett多重比较，以用于统计学分析。平均值表示为基线扣除值。
表45.IL-6测量：供体3
Figure BDA0002944254760001122
Figure BDA0002944254760001131
Figure BDA0002944254760001141
Figure BDA0002944254760001142
用LIVRQNAC+G、LIVRQNAC+S、RQNAC和NAC处理显著减少原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中LPS诱导的IL-6分泌。用LIVRQ处理增加了IL-6分泌，而LIV和LIVRQNAC对IL-6分泌没有统计学显著的作用。单独施用谷氨酰胺显著增加IL-6分泌，而单独施用其它氨基酸则没有作用。进行双向ANOVA Dunnett多重比较,以用于统计学分析。平均值表示为基线扣除值。
表46.TNFalpha测量：供体1
Figure BDA0002944254760001151
Figure BDA0002944254760001161
Figure BDA0002944254760001171
用LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LIVRQNAC+S、RQNAC和NAC处理显著减少原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中LPS诱导的TNFa分泌。用LIV处理增加了TNFα的分泌，而LIVRQ对TNFα的分泌没有显著的作用。单独施用的氨基酸中没有一个对TNFα分泌有作用。进行双向ANOVADunnett多重比较，以用于统计学分析。平均值表示为基线扣除值。
表47.TNFalpha测量：供体2
Figure BDA0002944254760001181
Figure BDA0002944254760001191
Figure BDA0002944254760001192
Figure BDA0002944254760001201
用LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LIVRQNAC+S、RQNAC和NAC处理显著减少原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中LPS诱导的TNFα分泌。用LIV和LIVRQ处理增加了TNFα分泌。单独施用亮氨酸、异亮氨酸和谷氨酰胺增加TNFα分泌，而其它氨基酸没有作用。进行双向ANOVA Dunnett多重比较，以用于统计学分析。平均值表示为基线扣除值。
表48.TNFalpha测量：供体3
Figure BDA0002944254760001202
Figure BDA0002944254760001211
Figure BDA0002944254760001221
Figure BDA0002944254760001222
Figure BDA0002944254760001231
#由于技术错误，未在Exp3中测量亮氨酸
用LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LIVRQNAC+S、RQNAC和NAC处理显著减少原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中LPS诱导的TNFα分泌。用LIV和LIVRQ处理增加了TNFα分泌。单独施用的氨基酸对TNFα分泌没有显著的作用，除了谷氨酰胺增加TNFα分泌。进行双向ANOVA Dunnett多重比较，以用于统计学分析。平均值表示为基线扣除值。
实施例8.用氨基酸组合物治疗小鼠模型中的NASH
在一个实施例中，检测LIVRQNAC和相关氨基酸组合物在FATZO小鼠模型中的肥胖症、代谢驱动的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中的作用。
在16周的诱导期，通过在饮用水(WDF)中添加5％果糖的西方饮食(研究饮食#D12079B；脂肪40％kcal、蛋白质17％kcal、碳水化合物43％kcal)在60只雄性FATZO小鼠中诱导NASH。饮食和水可随意获得。建立了以对照饮食(n＝6，Purina#5008；脂肪17％kcal、蛋白质27％kcal、碳水化合物56％kcal)和无菌水喂养的同胎仔畜对照雄性FATZO小鼠，以作为对照。将小鼠收容在具有微隔离器的塑料笼中。每周更换一次无菌垫褥。小鼠每笼收容三只，并在整个研究期间维持十二小时光周期。每天监测室温，并保持在22-25℃，在诱导期每周记录体重。
在16周饮食诱导后，6只小鼠保持对照饮食(组1，对照)，而60只诱导的小鼠依体重和血浆葡萄糖(进食)随机分配用于以下处理。从西方饮食NASH诱导后16周开始，对FATZO小鼠施用测试物品4周。通过口服管饲法施用测试物品。在西方饮食NASH诱导后20周使动物安乐死，并收获组织用于分析。
Figure BDA0002944254760001241
LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LRQNAC和OCA(Advanced ChemBlocks,Inc.)、赋形剂和灌注水由Axcella Health,Inc提供。0.5％的甲基纤维素由CrownBio,Inc提供。给药溶液按附录1制备。TA化合物(氨基酸组合物)是每天在灌注水和赋形剂0.125％的黄原胶、1.5mM月桂基硫酸钠和0.28％卵磷脂中新鲜调配的氨基酸摻合物(Baxter#27F7114)。将奥贝胆酸(OCA)悬浮在灌注水中的0.5％甲基纤维素中。所有测试物品均冷藏保存。赞助者以冷冻粉末形式提供TA化合物。给药持续4周。
LIVRQNAC+G和LRQNAC的亮氨酸剂量与LIVRQNAC的剂量相匹配。
Figure BDA0002944254760001242
Figure BDA0002944254760001251
Figure BDA0002944254760001252
在整个研究中，通过口服管饲法以10mL/kg的体积施用LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LRQNAC、OCA和载体。剂量通过每日体重计算。LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LRQNAC和载体每天施用两次(BID)，而OCA在早晨每天施用一次(QD)。小鼠每天接受一次OCA(QD)，和一种载体QD。剂量在0700和1800通过口服管饲法施用4周。
每天监测活力、临床体征和行为。在给药期间每天记录体重。每周通过尾夹在AM(0700)中收集血液样本用于葡萄糖测量(StatStrip血糖仪)。
动物用CO2吸入麻醉并通过心脏穿刺放血以安乐死。在麻醉动物结束时通过心脏穿刺获得终末血液样本(K2EDTA)。样品以冷冻形式提供给Axcella Health。记录器官重量(总肝脏，性腺脂肪垫)。将胰腺、小肠和性腺脂肪垫固定在10％缓冲福尔马林中，并按照方案中的指导制备。也将小肠、性腺脂肪垫和肝的切片在液氮中速冻并运输至赞助者。
将肝组织在Bouin溶液中于4℃固定24小时，然后浸入标准浓度的酒精然后二甲苯中，以制备用于石蜡包埋的组织。在石蜡包埋和冷却后，切下五微米切片并染色用于常规H&E和苦味酸(Picric)天狼星红。将肝脏的右和左叶的切片冷冻在OCT中，用于用油红染色分析脂质含量。Aperio全玻片数字成像系统(Scan Scope CS，Vista，CA)用于成像。所有载玻片在20x成像。扫描时间范围从1.5分钟到最大时间2.25分钟。将整个图像容纳并储存在其Spectrum软件系统中，从整个载玻片拍摄图像。
使用NASH肝脏评分标准来评估肝脏。在这个小鼠研究中，用NASH评分系统分析了每个病例的一个肝脏横切面。根据已公开的NASH CRN评分系统，该评分系统包括NAFLD活性评分(NAS)、纤维化阶段和通过模式识别鉴定NASH。NAS可在0至8的范围内，并通过来自H&E染色切片的脂肪变性(0-3)、小叶发炎(0-3)和肝细胞气球样膨大(0-2)的评分的总和来计算。从苦味酸天狼星红染色的载玻片对纤维化评分(0-4)。NASH系统用于人类肝脏18号活组织检查。系统地评估了脂肪变性、小叶发炎、肝细胞气球样膨大变性、纤维化、NAS和通过模式识别的NASH的存在。在本研究中，我们评估了本研究中每只小鼠的肝脏的一个总横截面。这是18号人类肝脏活组织检查的大小的约15倍。病理评分确定为0、+1、+2或+3。对损伤(lesion)的位置(门静脉周(periportal)、小叶中心(centrilobular)和中间带(midzonal))和脂肪积累(局灶性(focal)、门静脉周和/或小叶中心)进行评分。评分的另一部分是损伤的局灶性、多灶性和/或扩散性的分布。此外，轻度、中度和严重的损伤。这些参数构成总NASH评分。
所有免疫组织化学染色步骤使用Dako FLEX系统在自动化免疫染色仪上进行；在室温下进行培养，并且Tris缓冲盐水加0.05％Tween20，pH7.4(TBS-Dako公司)用于所有洗涤和稀释剂。在每次培养后进行彻底洗涤。一级抗体包括抗小鼠SMA、F4/80、Mac-2和苦味酸天狼星红。对照切片用同种型对照使用与第一抗体相同的浓度处理以验证染色特异性。
从H&E染色的切片分析白色脂肪组织(WAT)脂肪细胞大小。使用Aperio ImageScope Application，通过测量每个组织样品的10个最大脂肪细胞的面积来评价该区域的3个局部区域(组织边缘、不在血管周围的组织、血管周围的组织)。在每个组织内，每个区域的10个热点被量化(μm2)并被平均。
通过免疫组织化学染色鉴定胰腺β-胰岛细胞。
采用Aperio自动图像定量(Automatic Image Quantitation)来定量免疫组织化学染色、油红O和天狼星红染色的阳性像素。使用阳性像素计数算法来量化扫描的载玻片图像中存在的特定染色的百分比。掩蔽并评估颜色范围(色调和饱和度范围)和三个强度范围(弱、阳性和强)。该算法对每个强度范围中的数量和强度和进行计数，以及三个附加量：平均强度、强/总数的比率、以及弱阳性像素的平均强度。修改阳性像素算法以区分橙色和蓝色。对于天狼星红评估，进行从正常"色调值"(0.1-0.96)和"色饱和度"(0.04-0.29)的改变。将脉管系统和人为假象从分析中排除。
使用定量PCR测量MCP-1和MIP-1a的肝基因表达。
使用多重ELISA测定(Meso Scale Discovery，Rockville，Maryland)定量肝脏IL-1b、MCP-1和MIP-1的蛋白水平。
使用Bonferroni多重比较试验在GraphPad Prism 6(GraphPad软件公司，USA)上进行肝组织学评分的统计学分析。P值＜0.05被认为是统计学显著的。结果表示为平均值±SEM。在第2组(载体)和以下组之间进行比较：第3组(LIVRQNAC1,500mg/kg)，第4组(LIVRQNAC 3,000mg/kg)，第5组(LIVRQNAC+G 3,885mg/kg)，和(LRQNAC 2,469mg/kg)。
体重和肝重
与对照喂养的动物相比，喂养补充了果糖的西方饮食(WDF)16周引起对体重的显著影响。在施用测试药剂之前，与喂养对照饮食的动物相比，喂养WDF的动物明显更重(47.6±0.45相对于43.9±1.03g；p＜0.01)。
与所有处理组中的基线值相比，体重降低；与载体相比，体重减轻没有显著差异(对于对照、载体、LIVRQNAC(1500mg/kg)、LIVRQNAC(3000mg/kg)、LIVRQNAC+G、LRQNAC和OCA分别为-7.6±0.9、-6.9±1.3、-6.8±1.4、-5.7±1.2、-6.4±1.0、-4.7±1.6和-3.9±1.5％；p＜0.4992)。
与对照饮食相比，喂养WDF的载体处理动物的肝重(体重％)显著更高(7.22±0.3相对5.05±0.24％；p＜0.0001)；然而，在喂养WDF的动物中，在任何处理组中均未发现与载体相比的显著作用(对于载体、LIVRQNAC(1500mg/kg)、LIVRQNAC(3000mg/kg)、LIVRQNAC+G、LILRQNAC和OCA，分别为7.22±03、7.14±0.3、7.19±0.26、6.69±0.18、7.02±0.5和6.81±0.2；p＜0.7450)。
肝脏组织学
用对照饮食喂养的FATZO小鼠发生轻度脂肪变性并且没有发炎、气球样膨大或纤维化(图7)。用WDF喂养并用载体处理的FATZO小鼠发生了显著的脂肪变性、轻度发炎、气球样膨大和纤维化。与载体组中主要的大泡型脂肪变性相反，在LIVRQNAC、LIVRQNAC+G和LRQNAC组中观察到主要是小泡型和减少的大泡型脂肪变性的混合物，如图8所示。
NAFLD活性评分由固定肝组织中脂肪变性(0-3)、发炎(0-3)和气球样膨大(0-2)的组织学评分计算。在WDF喂养的动物中，与载体处理组相比，所有的氨基酸组合物处理都使NAS显著减少(图9)。与载体相比，LIVRQNAC和氨基酸组合物处理减少了肝脂肪变性，尽管只有LIVRQNAC+G和LRQNAC达到统计学显著性(p＜0.05)，而LIVRQNAC没有达到(LIVRQNAC3.0G/kg，p＝0.12)。所有氨基酸组合物的处理均显著减轻了肝细胞气球样膨大、脂毒性和细胞死亡的生物标记物。氨基酸组合物的处理没有明显改变肝发炎。总之，氨基酸组合物相关的肝病理的改善主要归因于肝细胞气球样膨大的减弱。与载体相比，OCA对NAS评分和NAS组分没有显著影响。
Figure BDA0002944254760001291
肝基因表达
MCP-1(CCL2)和MIP-1a(CCL3)是促炎性趋化因子，可通过巨噬细胞和中性粒细胞募集介导肝脏发炎。MCP-1和MIP-1a分别是CCR2和CCR5的配体，可作为治疗NASH肝发炎的有希望的治疗靶标。如表49和50所示，与对照饮食喂养的小鼠相比，在WDF喂养的小鼠中肝脏中的MCP-1和MIP-1a RNA表达水平显著上调。
表49.施用氨基酸组合物后MCP-1mRNA水平的倍数变化
Figure BDA0002944254760001301
表50.施用氨基酸组合物后MIP-1a mRNA水平的倍数变化
Figure BDA0002944254760001302
与载体组相比，LIVRQNAC和LRQNAC处理没有显著改变肝MCP-1和MIP-1a RNA表达。与载体组(p＝0.054)和LIVRQNAC组(p＜0.05)相比，LIVRQNAC+G处理导致肝脏MCP-1RNA表达稍微降低。类似地，与载体组和LIVRQNAC组(p<0.05)相比，LIVRQNAC+G处理导致肝脏MCP-1RNA表达稍微降低，尽管与载体组相比差异不显著(p＝0.19)。
肝脏趋化因子和细胞因子
与RNA数据一致，如表51和52所示，与对照饮食喂养的小鼠相比，WDF喂养的小鼠中肝MCP-1和MIP-1a蛋白水平升高。
表51.施用氨基酸组合物后平均肝脏MCP-1蛋白水平
Figure BDA0002944254760001311
表52.施用氨基酸组合物后平均肝脏MIP-1a蛋白水平
Figure BDA0002944254760001312
肝MCP-1和MIP-1a蛋白水平也与RNA表达水平正相关，如表53和54所示。
表53.施用氨基酸组合物后MCP-1蛋白与RNA水平之间的相关性
Figure BDA0002944254760001313
表54.施用氨基酸组合物后MIP-1a蛋白与RNA水平之间的相关性
Figure BDA0002944254760001321
与载体组相比，LIVRQNAC和LRQNAC处理没有显著改变肝MCP-1和MIP-1a蛋白水平。与LIVRQNAC组相比，LIVRQNAC+G处理稍微降低了肝MCP-1(p＝0.095)和MIP-1a(p＜0.05)蛋白质水平。另外，如表55所示，肝MCP-1和MIP-1a蛋白水平正相关。
表55.施用氨基酸组合物后MCP-1和MIP-1a蛋白水平之间的相关性
Figure BDA0002944254760001322
如表56-59所示，与对照饮食喂养的小鼠相比，WDF喂养的小鼠中肝脏中促炎性细胞因子IL-1b、IL-6、TNFa和CXCL1蛋白水平升高。
表56.施用氨基酸组合物后平均肝脏IL-1b蛋白水平
Figure BDA0002944254760001323
Figure BDA0002944254760001331
表57.施用氨基酸组合物后的平均肝脏IL-6蛋白水平
Figure BDA0002944254760001332
表58.施用氨基酸成分后平均肝脏CXCL1蛋白水平
Figure BDA0002944254760001333
表59.施用氨基酸组合物后平均肝脏TNFα蛋白水平
Figure BDA0002944254760001334
与载体相比，LIVRQNAC、LIVRQNAC+G和LRQNAC处理没有显著改变IL-1b、IL-6、TNFa和CXCL1蛋白水平。与LIVRQNAC相比，LIVRQNAC+G治疗降低了肝TNFa水平。
简述
基于临床观察，WDF喂养的FATZO小鼠比那些用对照饮食喂养的小鼠增加更多的体重。尽管体重变化存在差异，但在WDF喂养的小鼠和对照饮食喂养的小鼠之间，进食后血糖水平相当。所有处理在FATZO小鼠中都有良好的耐受性。WDF喂养的小鼠和对照饮食喂养的小鼠两者在处理期间体重减轻，这可能是由于与每天两次通过口服管饲法施用测试物品或载体相关的应激。
与载体相比，NAS在所有氨基酸组合物处理组中显著减弱，主要归因于气球样膨大评分。在所有氨基酸组合物处理组中肝细胞气球样膨大显著减少。在LIVRQNAC+G和LRQNAC处理组中，脂肪变性显著减少。LIVRQNAC也降低了脂肪变性，尽管差异不显著。发炎不受氨基酸组合物处理的影响。尽管LIVRQNAC+G和LRQNAC处理组的脂肪变性评分在组织学上有所改善，但通过氨基酸组合物处理，肝甘油三酸酯，胆固醇和油红O染色保持不变。与组织学和生物化学数据一致，氨基酸组合物处理不影响脂肪从头合成(de novo lipogenesis)酶FASN和ACACA的RNA水平。
尽管氨基酸组合物处理不影响肝甘油三酸酯水平，肝细胞脂肪变性的特征因氨基酸组合物处理而不同。WDF-喂养的小鼠(载体组)的肝脏主要显示大泡型脂肪变性。相反，在所有氨基酸组合物处理组中，大泡型脂肪变性减少，并且是小泡型和大泡型脂肪变性的混合。氨基酸组合物对大泡型到小泡型脂肪变性表现型的生物学意义和机制值得进一步研究。
低剂量LIVRQNAC处理而不是高剂量LIVRQNAC处理使NAFLD的FATZO模型中的肝纤维化评分显著减弱。LIVRQNAC+G和LRQNAC对纤维化没有影响。尽管如此，天狼星红胶原蛋白染色证明LIVRQNAC、LIVRQNAC+G和LRQNAC显著减少了肝脏中的胶原蛋白沉积。
与肝脏发炎评分一致，氨基酸组合物处理对促炎性趋化因子MCP-1和MIP-1a以及细胞因子IL-1b、IL-6、TNFa和CXCL1的肝脏RNA和蛋白水平没有显著影响。值得注意的是，与LIVRQNAC相比，LIVRQNAC+G(相当于LIVRQNAC加甘氨酸)处理具有较低的肝MCP-1、MIP-1a和TNFa。
在NAFLD和NASH期间观察到与发炎相关的肝脏氧化应激的增加。谷胱甘肽(GSH)是关键的内源性抗氧化剂，其可以抵消活性氧类(reactive oxygen species)。甘氨酸及其直接代谢前驱体丝氨酸是GSH生物合成的底物。因此，丝氨酸和/或甘氨酸的补充有助于补充GSH并改善NAFLD和NASH。LIVRQNACG治疗在肝脏中具有较低的发炎趋化因子和细胞因子，这支持了甘氨酸或丝氨酸的补充在NAFLD和NASH中是有益的。
总之，在FATZO小鼠中测试的所有三种氨基酸组合物(LIVRQNAC、LIVRQNAC+G和LRQNAC)减弱NAFLD活性评分、肝细胞气球样膨大和纤维化。这些氨基酸组合物可用于处理NASH。含甘氨酸的氨基酸组合物可进一步减少肝发炎，导致肝纤维化减少。
实施例9.用氨基酸组合物治疗对象。
本文所述研究的特征在于向患有2型糖尿病(T2DM)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的对象施用包含氨基酸的组合物。该PRE-IND和IRB批准的研究的目的是通过观察在施用6周和12周后纤维化、发炎、胰岛素敏感性、葡萄糖和脂质代谢、和细胞凋亡的各种标记物，确定氨基酸组合物的安全性和耐受性以及其对人生理学的结构和功能的影响。该组合物包括每个棒状包约1g L-亮氨酸、约0.5g L-异亮氨酸、约0.5g L-缬氨酸、约1.5g L-精氨酸(或1.81g L-精氨酸HCl)、约2.0g L-谷氨酰胺和约0.15g N-乙酰基半胱氨酸，用于以四个棒状包每天三次(例如，总共约72g每天，或约24g每天三次)施用。
在该研究中，对象每天接受氨基酸组合物三次，持续12周。氨基酸以粉末形式提供以溶解在12盎司水中。在12周的研究期间提供参与者氨基酸组合物。
本研究的主要疗效指标(outcome measure)是安全性和耐受性。次要疗效指标是通过与代谢、发炎和纤维化有关的生物标记物来检查对人类生理学的影响。在基线(第1天)、在研究的第6周和第12周进行评估。
选择对象的关键标准包括以下：年龄为18至70岁的男性或女性，包括端值；愿意并能够提供书面知情同意书；筛选时T2DM或血红蛋白A1c(HbA1c)的病史≥6.5％且＜10％；通过以下标准之一记录脂肪肝疾病：a.通过以下方法中的至少一种在筛选3个月内确认脂肪变性的先前病史：MRI测定的肝脂肪，PDFF≥8％；Fibroscan的控制衰减参数(ControlAttenuation Parameter)≥300dB/m；肝活组织检查表明非NASH NAFLD脂肪变性＞I级。如果患者在筛选的3个月内没有这种记录的先前的脂肪变性病史(如4a中所记录的)，则在筛选时必须使用下式记录到≥10％的肝脂肪评分：
预测的肝脂肪百分比＝10^(-0.805+(0.282*代谢综合征[是＝1/否＝0])+(0.078*2型糖尿病[是＝2/否＝0])+(0.525*log10(胰岛素mU/L))+(0.521*log10(AST U/L))–(0.454*log10(AST/ALT))34
注意：胰岛素、ALT和AST应当在空腹血清样品中测量。对象必须在筛选前3个月内进行稳定的运动、饮食和生活方式常规，没有大的体重波动，即在筛选时，对象在过去的3个月内应在其体重的±3％内。筛选时的身体质量指数(Body mass index)(BMI)≥32kg/m2。对于MRI设备不能容纳BMI≥45kg/m2的患者的地点，可以应用40-45kg/m2的上限。患者必须在筛选之前接受稳定剂量的葡萄糖降低药物(其可以包括二甲双胍、磺酰脲类、二肽基肽酶-4[DPP-4]抑制剂、钠-葡萄糖共转运蛋白2(sodium-glucose co-transporter 2)[SGLT2]抑制剂或长效基础胰岛素)至少3个月，并且计划在研究期间保持相同的药物，而没有预期其药物剂量调整。参见以下第8部分的排除的糖尿病相关药物的完整列表。如果对象同时接受抗高血压药物(例如，β阻断剂、氢氯噻嗪、ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂)、用于血脂异常的药物(例如，他汀类药物、贝特类药物)和用于甲状腺功能低下的药物(例如，左旋甲状腺素)的治疗，只要他们在筛选前服用稳定剂量和疗程的这些药物至少3个月，并且计划在研究期间保持相同的药物而没有预期其药物剂量调整，他们就可以包括在研究中。对象可以服用维生素补充剂(例如多种维生素；维生素E＜400IU/天)。然而，他们必须在筛选前服用稳定剂量和疗程的这些维生素补充剂至少3个月，而没有预期的剂量调整。具有生育可能性(childbearing potential)的女性对象在筛选时必须具有阴性血清妊娠试验，并且必须同意在整个研究期间以及在研究治疗最后一次剂量后30天在异性性交期间使用高效的避孕方法。生育可能性是指那些没有进行子宫切除术、双侧卵巢切除术或医学记录的卵巢衰竭的女性对象，或年龄<50岁、有任何持续时间闭经的女性。
LIVRQNAC抑制发炎和细胞凋亡。在基线(第1天)和第2、6和12周(W2、W6和W12)确定丙氨酸转氨酶(ALT)的血清水平。在指定数量的对象中，从基线到第6和12周的血清ALT+/-SEM的平均变化示于图10A(IU/ml)。此外，测量C-反应蛋白(CRP)，并显示第1天、第6周和第12周的平均值+/-SEM(图10A)。测量细胞角蛋白18(CK-18)M65的血浆水平，平均水平+/-SEM示于图10B。用氨基酸组合物处理降低CK-18M65的平均水平(图10B，U/L，平均值+/-SEM)。
ALT、CRP和CK-18M65在LIVRQNAC处理后都显示减少，支持了氨基酸组合物对发炎和细胞凋亡的抑制作用。
该研究的发现表明，氨基酸组合物具有良好的安全性和耐受性特征，并影响与发炎相关的人体结构和功能的生物标记物。
实施例10.原代人巨噬细胞中的抗炎性趋化因子分泌
外周血单个核细胞(PBMC)的分离
使用淋巴细胞分离培养基(Corning)从未纯化的血沉棕黄层(Research BloodComponents)中纯化淋巴细胞。离心后，提取PBMC层，并使用杜氏(Dulbecco’s)磷酸盐缓冲盐水(DPBS；Gibco)冲洗几次。通过70uM细胞过滤器过滤PBMC后，将细胞重悬并使用Cellometer K2自动细胞计数器计数。
CD14+细胞选择
根据制造商提供的实验方案，使用EasySepTM人CD14阳性选择试剂盒II(STEMCELLTechnologies)选择CD14+细胞。分离后，将CD14+细胞接种到10cm组织培养板中，并使用M-CSF(Peprotech)分化为巨噬细胞。
筛选
在第0天，将原代人PBMC衍生的巨噬细胞接种在96-孔微孔板(ThermoFisher)中，所述微孔板在补充有青霉素-链霉素(Hyclone)和10％热灭活胎牛血清(HI-FBS)(AtlantaBio)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(Gibco)并在37℃、5％CO2下培养过夜。在第1天，将细胞用DPBS洗涤一次，然后用以下处理：
a.不含氨基酸的DMEM(US Biologicals)，其中包含基于人体平均代谢组数据库(HMDB)中发布的值的，基于血液中平均生理浓度的确定的定制氨基酸浓度，含6mM葡萄糖，1mM丙酮酸钠，10mM HEPES，青霉素-链霉素；或
b.与上述相同的培养基，其具有不同浓度的一种氨基酸或氨基酸组合。
在第2天，用上述补充有重组人白介素-4(IL-4；Peprotech)的相同培养基处理细胞。对照孔分别用托法替尼(tofacitinib)(Tocris)和IL-4、含IL-4的PBS、或单独的磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理。
在第3天，收集上清液并立即在-80℃冰箱中冷冻。用DPBS洗涤细胞一次，并根据制造商提供的实验方案使用WST-8细胞增殖细胞毒性测定法(Dojindo)评估存活力。测定后，将细胞用PBS洗涤两次并用4％多聚甲醛固定。根据制造商提供的实验方案使用市售试剂盒(R&D Systems)通过ELISA分析CCL18上清液样品中的蛋白质水平。
在供体1(表60)中，用谷氨酰胺、LIVRQNAC、LIVRQ、RQNAC和NAC处理显著增加原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中IL-4诱导的CCL18分泌。对所有统计学分析均进行了双向ANOVADunnett多重比较。平均值以相对于载体对照的倍数变化表示。
表60.CCL18测量值：供体1
Figure BDA0002944254760001391
Figure BDA0002944254760001401
Figure BDA0002944254760001411
在供体2(表61)中，用谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、LIV、LIVRQNAC、LIVRQ、RQNAC和NAC处理可显著增加原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中IL-4诱导的CCL18分泌。对所有统计学分析均进行了双向ANOVADunnett多重比较。平均值以相对于载体对照的倍数变化表示。
表61.CCL18测量值：供体2
Figure BDA0002944254760001421
Figure BDA0002944254760001431
Figure BDA0002944254760001441
在供体3(表62)中，用谷氨酰胺、亮氨酸、LIVRQNAC、LIVRQ和RQNAC处理可显著增加原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中IL-4诱导的CCL18分泌。对所有统计学分析均进行了双向ANOVADunnett多重比较。平均值以相对于载体对照的倍数变化表示。
表62.CCL18测量值：供体3
Figure BDA0002944254760001442
Figure BDA0002944254760001451
Figure BDA0002944254760001461
Figure BDA0002944254760001471
实施例11.重现肝微环境以询问发炎的三培养模型
细胞接种和维持
建立了包括三种主要肝细胞类型(肝细胞、肝巨噬细胞和星状细胞)的三培养模型，以评估氨基酸组合L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺的作用和N-乙酰基半胱氨酸(LIVRQNAC)对发炎的反应。
使用96孔或12孔Transwell(Corning)共培养从健康供体中分离的肝细胞、巨噬细胞和星状细胞。
从Samsara Sciences获得并在完全HSC培养基中生长至T150培养瓶中约80％汇合的原代人肝星状细胞，接种在预先包被有胶原蛋白(Corning)的Transwell的膜的下表面。
接种星状细胞后，还将原代人PBMC衍生的巨噬细胞添加到膜的下表面。在Transwell中，将两种细胞均铺板在补充了10％热灭活的FBS(Atlanta Bio)，2mM Glutamax(Gibco)和0.2％Primocin(InVivoGen)的肝细胞平板培养基(威廉姆斯E培养基(William’sE medium)(Gibco))中，并在37℃、5％CO2的条件下培养6小时。
培养6小时后，将来自健康人供体的原代肝细胞接种在Transwell顶表面的胶原蛋白凝胶上。将三培养物在上述肝细胞平板培养基中于37℃、5％CO2下培养。6小时后，将细胞洗涤一次，并在37℃、5％CO2在肝细胞平板培养基中培养过夜。在第1天，将细胞洗涤一次，并在补充2mM Glutamax(Gibco)和1x青霉素/链霉素(P/S)的肝细胞确定培养基(Corning)中在37℃、5％CO2下培养过夜。
氨基酸预处理
第2天，将细胞用DPBS 1X(Gibco)洗涤两次，并保持在：
a.无氨基酸的WEM(US Biologicals)其补充有11mM葡萄糖(Sigma)、0.272mM丙酮酸钠(Sigma)、1x P/S(Gibco)，并包含基于血液中平均生理浓度的确定的定制氨基酸浓度；或
b.与上述相同的培养基，其具有30X或40X的一种浓度的确定氨基酸组合物LIVRQNAC。
将细胞在37℃、5％CO2的确定培养基(a和b)中保持24小时。
用游离脂肪酸和不同氨基酸组合的共处理
预处理24小时后，将细胞维持在上述相同的培养基中，并且暴露于250uM的游离脂肪酸(FFA)中，其中游离脂肪酸的比例为2：1(油酸盐：棕榈酸盐)并补充有1ng/ml的TNF-α(Thermofisher)±LIVRQNAC。在37℃、5％CO2下培养24小时后，分别从Transwell的每一侧移出培养基，并将细胞在上述相同条件下再培养48小时。
通过ELISA分析24小时后的细胞因子/趋化因子和原胶原(Procollagen)Iα1
使用来自96孔Transwell两侧的上清液分析多种分析物：IL6、IL8、MCP1、IP10、Groalpha、原胶原Iα1(fireplex试剂盒，Abcam)。通过ELISA(人几丁质酶3样蛋白1(YKL40)Quantikine ELISA，R&D systems)从12孔Transwell收集的上清液中测量YKL40。
原胶原Iα1分泌
表63显示了由用(FFAs TNFα)+30x的LIVRQNAC处理的星状细胞分泌的原胶原Iα1的倍数变化，相对于FFAs+TNFα基线标准化。通过T检验计算的统计学显著性表明LIVRQNAC显著降低了原胶原Iα1的分泌。测量了来自肝细胞侧的原胶原Iα1水平，显示两种处理之间没有差异(表64)
表63.与1x LIVRQNAC相比，施用30x LIVRQNAC后，三培养物中星状细胞分泌的原胶原Iα1的倍数变化
Figure BDA0002944254760001491
表64.与1x LIVRQNAC相比，施用30x LIVRQNAC后，三培养物中从肝细胞侧测得的原胶原Iα1水平的倍数变化
Figure BDA0002944254760001492
表65和66显示了分别用FFA+TNFα+30x的LIVRQNAC处理的巨噬细胞和星状细胞或肝细胞侧分泌的细胞因子和趋化因子的倍数变化，相对于FFA+TNFα基线(1x的LIVRQNAC)标准化。测量了已确立趋化性并显示出在NASH患者中被上调的几种促炎性细胞因子(IL-6、IL-8、IP-10、GROalpha(CXCL1))和趋化因子(MCP1)。通过T检验计算出的统计学显著性表明，与对照的1x的LIVRQNAC相比，以30x的LIVRQNAC处理可显著降低IL-6、IP-10、GROalpha(CXCL1)和MCP1水平。当用LIVRQNAC 30x治疗时，IL-8水平也降低了，但是与LIVRQNAC 1x相比没有显著性。
表65.与1x LIVRQNAC相比，施用30x LIVRQNAC后，巨噬细胞和星状细胞分泌的细胞因子和趋化因子的倍数变化
Figure BDA0002944254760001501
Figure BDA0002944254760001511
表66.与1x LIVRQNAC相比，施用30x LIVRQNAC后，肝细胞分泌的细胞因子和趋化因子的倍数变化
Figure BDA0002944254760001512
Figure BDA0002944254760001521
表67和68显示了用FFA TNFα+40x的LIVRQNAC处理的巨噬细胞和星状细胞或肝细胞分泌的YKL-40的倍数变化，相对于LIVRQNAC 1x标准化。
在包括NASH在内的几种炎性疾病中，YKL40(也称为几丁质酶3样蛋白1[CHI3L1])的血浆水平升高。已经显示出随着纤维化的进展，NAFLD患者中YKL40血浆水平增加。通过T检验计算出的统计学显著性表明，40x的LIVRQNAC显著降低肝细胞YKL40的水平。用LIVRQNAC40x处理后，从巨噬细胞和星状细胞一侧测得的YKL-40水平也降低了，但与LIVRQNAC 1x处理相比没有显著性。
表67.与1x LIVRQNAC相比，施用40x LIVRQNAC后，星状细胞和巨噬细胞分泌YKL40的倍数变化
Figure BDA0002944254760001522
表68.与1x LIVRQNAC相比，施用40x LIVRQNAC后，肝细胞分泌的YKL40的倍数变化
Figure BDA0002944254760001523
Figure BDA0002944254760001531
实施例12.原代人M1巨噬细胞中ATP产生速率
巨噬细胞的活化诱导从氧化磷酸化到糖酵解的代谢转换。这种活化导致糖酵解、乳酸产生和糖酵解ATP水平增加，以及线粒体ATP的减少(伴随TCA循环底物琥珀酸和柠檬酸的增加)和炎性细胞因子和活性氧类的增加。巨噬细胞中的这种代谢变化可促进NAFLD进展。氨基酸组合L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺和N-乙酰基半胱氨酸(LIVRQNAC)对M1巨噬细胞代谢的影响使用实时ATP率测定来评估。
在第0天，将原代人PMBC衍生的巨噬细胞以2.0E4细胞/孔在补充青霉素-链霉素(Gibco)和10％热灭活胎牛血清(HI-FBS)(Atlanta Bio)的Dulbecco’s Modified EagleMedium(DMEM)(Gibco)中接种于Seahorse X96细胞培养微板V3-PS TC处理的用0.1mg/mL聚-D-赖氨酸(Trevigen)包被的板(Agilent)中，并在37℃、5％CO2下培养过夜。在第1天，用每孔150μL DPBS(Gibco)洗涤细胞一次，并用100μL的以下处理：
a.含有根据人类代谢组数据库(HMDB)中公布的值基于血液中平均生理浓度确定的定制氨基酸浓度的不含氨基酸的DMEM(USBiologicals)，其含有6mM葡萄糖、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES(Sigma)和青霉素-链霉素(Gibco)；或
b.与上述相同的培养基，其具有15X或30X HMDB的LIVRQNAC。
在第2天，用100μL上述补充了0.15ng/mL脂多糖(LPS)(Sigma)的相同培养基处理细胞。对照孔用0.15ng/mL LPS或磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理。
在第3天，收集上清液并立即在-80℃冷冻器中冷冻。使用市售试剂盒(AgilentSeahorse XF实时ATP速率测定试剂盒(Seahorse XF Real-Time ATP Rate Assay Kit))，根据厂商提供的方案，在Seahorse XF仪器上分析细胞的总ATP产生速率、糖酵解ATP产生速率和线粒体ATP产生速率。使用定制的测定培养基(不含氨基酸、不含酚红或碳酸氢钠的DMEM/F12(US Biologicals)，其含有根据基于人类代谢组数据库(HMDB)中公布的值的血液中平均生理浓度确定的定制氨基酸浓度，使用10mM XF葡萄糖(Agilent)、1mM XF丙酮酸(Agilent)和5mM HEPES(Sigma)。根据制造商提供的方案确定用于常定制的培养基的缓冲因子。在测定后，用PBS洗涤细胞两次并用4％多聚甲醛固定，将数据标准化为通过使用Hoechst 3342(Life Technologies)同时测定的细胞核计数确定的特定每孔细胞密度。结果显示在下表69-71中。
表69.总ATP产生速率结果
Figure BDA0002944254760001541
表70.糖酵解ATP测量
Figure BDA0002944254760001542
Figure BDA0002944254760001551
表71.线粒体ATP测量
Figure BDA0002944254760001552
表69-71显示了使用和不使用30X和15X LIVRQNAC处理时每分钟皮摩尔的标准化的ATP产生速率。如表69所示，30X和15X的LIVRQNAC对总ATP产生速率没有显著影响。然而，在两种测试浓度下，用LIVRQNAC处理后，糖酵解ATP的产生速率(表70)都显著降低。线粒体ATP产生速率(表71)增加，然而没有达到统计学显著性。通过t检验计算P值。
尽管已经参照优选实施例和各种替代实施例具体示出和描述了本发明，但是相关领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上对其进行各种改变。
在本说明书的主体内引用的所有参考文献、授权专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。

Claims (22)

1.一种用于减少对象的发炎的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物包含：
a)亮氨酸氨基酸实体，
b)精氨酸氨基酸实体，
c)谷氨酰胺氨基酸实体；以及
d)N-乙酰基半胱氨酸(NAC)-实体；
条件是：
所述发炎不是肝发炎，
从而减少对象的发炎。
2.一种治疗有需要的对象的炎性病状或病症的方法，其包括向所述对象施用有效量的组合物，所述组合物包含：
a)亮氨酸-氨基酸实体，
b)精氨酸-氨基酸实体，
c)谷氨酰胺-氨基酸实体；以及
d)NAC-实体；
条件是：
所述炎性病状或病症不是肝炎性病状或病症，
从而治疗炎性病状或病症。
3.一种用于减少对象的发炎的组合物，其包含有效量的组合物，所述组合物包含：
a)亮氨酸氨基酸实体，
b)精氨酸氨基酸实体，
c)谷氨酰胺氨基酸实体；以及
d)N-乙酰基半胱氨酸(NAC)-实体；
条件是：
所述发炎不是肝发炎。
4.一种用于治疗有需要的对象的炎性病状或病症的组合物，其包含有效量组合物，所述组合物包含：
a)亮氨酸-氨基酸实体，
b)精氨酸-氨基酸实体，
c)谷氨酰胺-氨基酸实体；以及
d)NAC-实体；
条件是：
所述炎性病状或病症不是肝炎性病状或病症。
5.如权利要求1或2所述的方法，或如权利要求3或4所述的用于用途的组合物，其中所述炎性病状或病症选自：胃肠道炎性病状或病症、肺部炎性病状或病症、皮肤炎性病状或病症、心血管系统炎性病状或病症、神经系统炎性病状或病症、肾脏炎性病状或病症、胰腺炎性病状或病症、关节炎性病状或病症、眼部炎性病状或病症、内分泌系统炎性病状或病症，或其组合。
6.如权利要求1、2或5中任一项所述的方法，或如权利要求3-5中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述炎性病状或病症选自：传染病、自身免疫性疾病、血管疾病、组织或器官移植、缺血、败血症、伤口愈合、淀粉样变性、结节病或其组合。
7.如权利要求1、2、5或6中任一项所述的方法，或如权利要求3-6中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述方法进一步包括确定以下各项中的一项、两项、三项、四项、五项、六项、七项、八项、九项或更多项(例如，全部)的水平：(a)C-反应蛋白；(b)IL-1β；(c)IL-2；(d)IL-10；(e)MCP-1；(f)MIP-1；(g)NF-kB；(h)TNFα；(i)丙氨酸转氨酶(ALT)；或(j)天冬氨酸转氨酶(AST)。
8.如权利要求1、2或5-7中任一项所述的方法，或如权利要求3-7中任一项所述的用于用途的组合物，其中(a)-(d)的总重量％大于所述组合物(例如，呈干燥形式)中的其他氨基酸实体组分、非氨基酸实体蛋白质组分(例如，乳清蛋白)或非蛋白质组分中的一种、两种或三种的总重量％。
9.如权利要求1、2或5-8中任一项所述的方法，或如权利要求3-8中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物包含18种或更少的氨基酸实体的组合。
10.如权利要求1、2或5-9中任一项所述的方法，或如权利要求3-9中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物不包含长度超过20个氨基酸残基的肽(例如乳清蛋白)，或如果存在长度超过20个氨基酸残基的肽，则所述肽以小于所述组合物(例如，呈干燥形式)的非氨基酸实体组分或全部组分的总重量的10重量(wt)％存在。
11.如权利要求1、2或5-10中任一项所述的方法，或如权利要求3-10中任一项所述的用于用途的组合物，其中甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)中的至少一种、两种、三种或四种(例如，全部)不存在，或如果存在，则以小于所述组合物(例如，呈干燥形式)的10重量％存在。
12.如权利要求1、2或5-11中任一项所述的方法，或如权利要求3-11中任一项所述的用于用途的组合物，其中(a)-(d)中的至少一种、两种、三种或更多种(例如，全部)选自表1。
13.如权利要求1、2或5-12中任一项所述的方法，或如权利要求3-12中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物还包含(e)异亮氨酸氨基酸实体或(f)缬氨酸氨基酸实体中的一种或两种。
14.如权利要求1、2或5-13中任一项所述的方法，或如权利要求3-13中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述亮氨酸氨基酸实体、所述精氨酸氨基酸实体、所述谷氨酰胺氨基酸实体和所述NAC-氨基酸实体的重量比为1+/-20％：1.5+/-20％：2+/-20％：0.15±20％。
15.如权利要求13或14所述的方法，或如权利要求13或14所述的用于用途的组合物，其中所述亮氨酸实体、所述异亮氨酸氨基酸实体、所述缬氨酸氨基酸实体、所述精氨酸氨基酸实体、所述谷氨酰胺氨基酸实体和所述NAC-氨基酸实体的重量比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：1.5+/-20％：2+/-20％：0.15±20％。
16.如权利要求1、2或5-15中任一项所述的方法，或如权利要求3-15中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物包含：
a)亮氨酸氨基酸实体，其选自：
i)L-亮氨酸或其盐，
ii)包含L-亮氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐，或
iii)β-羟基-β-甲基丁酸(HMB)或其盐；
b)精氨酸氨基酸实体，其选自：
i)L-精氨酸或其盐，
ii)包含L-精氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐，
iii)肌酸或其盐，或
iv)包含肌酸的二肽或其盐、或三肽或其盐；
c)所述谷氨酰胺氨基酸实体为L-谷氨酰胺或其盐，或包含L-谷氨酰胺的二肽或其盐、或三肽或其盐；以及
d)所述NAC实体是NAC或其盐，或包含NAC的二肽或其盐。
17.如权利要求1、2或5-16中任一项所述的方法，或如权利要求3-16中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物还包含以下中的一种或两种：
e)L-异亮氨酸或其盐，或包含L-异亮氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐；或
f)L-缬氨酸或其盐，或包含L-缬氨酸的二肽或其盐或三肽或其盐。
18.如权利要求1、2或5-17中任一项所述的方法，或如权利要求3-17中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物包含：
a)所述亮氨酸氨基酸实体是L-亮氨酸或其盐；
b)所述精氨酸氨基酸实体是L-精氨酸或其盐；
c)所述谷氨酰胺氨基酸实体是L-谷氨酰胺或其盐；以及
d)所述NAC实体是NAC或其盐。
19.如权利要求1、2或5-18中任一项所述的方法，或如权利要求3-18中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物包含：
a)所述亮氨酸氨基酸实体是L-亮氨酸或其盐；
b)所述精氨酸氨基酸实体是L-精氨酸或其盐；
c)所述谷氨酰胺氨基酸实体是L-谷氨酰胺或其盐；
d)所述NAC实体是NAC或其盐；
e)所述异亮氨酸氨基酸实体是L-异亮氨酸或其盐；以及
f)所述缬氨酸氨基酸实体是L-缬氨酸或其盐。
20.如权利要求1、2或5-19中任一项所述的方法，或如权利要求3-19中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物与药学上可接受的载剂一起调配。
21.如权利要求1、2或5-20中任一项所述的方法，或如权利要求3-20中任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物被调配为膳食组合物。
22.如权利要求21所述的方法，或如权利要求21所述的用于用途的组合物，其中所述膳食组合物选自医疗食品、功能性食品或补充剂。
CN201980054580.3A 2018-06-20 2019-06-19 用于减少或治疗发炎的组合物和方法 Pending CN112839712A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862687724P 2018-06-20 2018-06-20
US62/687,724 2018-06-20
US201862758249P 2018-11-09 2018-11-09
US62/758,249 2018-11-09
US201962794165P 2019-01-18 2019-01-18
US62/794,165 2019-01-18
PCT/US2019/038055 WO2019246310A1 (en) 2018-06-20 2019-06-19 Compositions and methods for the reduction or treatment of inflammation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112839712A true CN112839712A (zh) 2021-05-25

Family

ID=67253998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980054580.3A Pending CN112839712A (zh) 2018-06-20 2019-06-19 用于减少或治疗发炎的组合物和方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210260010A1 (zh)
EP (1) EP3810276A1 (zh)
JP (1) JP2021529736A (zh)
CN (1) CN112839712A (zh)
MA (1) MA52961A (zh)
WO (1) WO2019246310A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20190146A1 (ar) 2016-12-19 2019-06-18 Axcella Health Inc تركيبات حمض أميني وطرق لمعالجة أمراض الكبد
KR20210023846A (ko) 2018-06-20 2021-03-04 악셀라 헬스 인크. 아미노산 조성물을 제조하는 방법
US11737999B2 (en) * 2021-07-26 2023-08-29 Axcella Health Inc. Amino acid compositions and methods for the treatment of post-acute sequelae of COVID-19
US11622949B1 (en) 2022-08-04 2023-04-11 Gad M. Gilad Agmatine compositions for treatment of osteoarthritis

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101049500A (zh) * 2007-02-15 2007-10-10 北京苏里曼医药科技有限公司 一种氨基酸组合物
US20080108684A1 (en) * 2005-07-01 2008-05-08 Ajinomoto Co., Inc. Therapeutic agent for inflammatory bowel disease and tnf-alfa production inhibitor
US20110081329A1 (en) * 2006-06-07 2011-04-07 Daniel S. Smith Amino acid compositions
KR20170051079A (ko) * 2015-11-02 2017-05-11 (주)모아캠 아미노산 및 해양 심층수 추출 미네랄을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140121475A (ko) * 2012-02-06 2014-10-15 아지노모토 가부시키가이샤 특발성 염증성 근질환의 예방 또는 치료제

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080108684A1 (en) * 2005-07-01 2008-05-08 Ajinomoto Co., Inc. Therapeutic agent for inflammatory bowel disease and tnf-alfa production inhibitor
US20110081329A1 (en) * 2006-06-07 2011-04-07 Daniel S. Smith Amino acid compositions
CN101049500A (zh) * 2007-02-15 2007-10-10 北京苏里曼医药科技有限公司 一种氨基酸组合物
KR20170051079A (ko) * 2015-11-02 2017-05-11 (주)모아캠 아미노산 및 해양 심층수 추출 미네랄을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KEVIN J MULHALL等: "Comparison of different anti-inflammatory agents in suppressiong the monocyte response to orthopedic paticles", 《ORTHOPEDICS》, vol. 26, no. 12, pages 1219 - 1223 *

Also Published As

Publication number Publication date
MA52961A (fr) 2021-04-28
EP3810276A1 (en) 2021-04-28
WO2019246310A1 (en) 2019-12-26
US20210260010A1 (en) 2021-08-26
JP2021529736A (ja) 2021-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110087647B (zh) 氨基酸组合物及肝疾病的治疗方法
CN112839712A (zh) 用于减少或治疗发炎的组合物和方法
TWI775921B (zh) 用於治療和高血氨症或肌肉耗損中之一者或兩者相關之肝疾病及失調之組合物及方法
US20210275479A1 (en) Compositions and methods for the reduction or treatment of insulin resistance and metabolic conditions
CN112654263A (zh) 治疗血色素异常及地中海型贫血的组合物及方法
US10946047B2 (en) Extracellular vesicles with enhanced potency
Fukuda et al. Adenine inhibits TNF-α signaling in intestinal epithelial cells and reduces mucosal inflammation in a dextran sodium sulfate-induced colitis mouse model
JP2018517782A (ja) 相乗的飲料組成物
US20210275480A1 (en) Compositions and methods for the reduction or treatment of fibrosis
WO2017058828A1 (en) Methods for treating diseases mediated by erbb4-positive pro-inflammatory macrophages
US20230000808A1 (en) Compositions and methods excluding or with reduced glutamine for the treatment of hemoglobinopathies and thalassemias
JP6469568B2 (ja) グルタチオンを含有する免疫増強剤
Herencia et al. Cardiotrophin-1 decreases liver apoptosis through calpastatin induction
US20140309306A1 (en) Composition for amelioration of hypoalbuminemia
WO2022109465A1 (en) Antiviral therapeutic compounds and compositions for use in treatment of coronavirus and influenza virus
KR20180038225A (ko) 디아민 유도체를 포함하는 뇌졸중, 신경 세포 손상, 파킨슨병 또는 루게릭병의 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20210525

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication