JP6469568B2

JP6469568B2 - グルタチオンを含有する免疫増強剤

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Publication number: JP6469568B2
Application number: JP2015516327A
Authority: JP
Inventors: 将之落合; 匡彦森田; 幸治森下; 恵理香加々美; リッチー，ジョン
Original assignee: KYOUWA HAKKO BIO CO.,LTD
Current assignee: KYOUWA HAKKO BIO CO.,LTD
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2019-02-13
Anticipated expiration: 2033-09-27
Also published as: EP2900252A4; ES2659199T3; AU2013320871A1; CA2886556A1; US20150209316A1; EP2900252B1; EP2900252A1; JP2015531341A; CA2886556C; WO2014051168A1; PH12015500708A1; CN104684567A; NZ706329A; PH12015500708B1

Description

本発明は、有効量のグルタチオン又はその塩をその必要がある患者に経口投与することを含む免疫機能増強方法に関する。本発明はまた、グルタチオン又はその塩を含む免疫機能増強用経口剤、及び免疫機能増強への使用のためのグルタチオン又はその塩に関する。

還元型グルタチオン（ＧＳＨ）は、動物組織中に存在する最も豊富なチオールであり（１−１５ｍＭ）（非特許文献１）、またその関連する生合成経路、レドックス経路、及び解毒経路と合わせて、細胞の酸化ストレス及びフリーラジカル損傷に対する重要な防御系を代表する（非特許文献２−５）。

ＧＳＨは、一次細胞内レドックスバッファとして、タンパク質中のＣｙｓのチオール型を維持すること、及び酸化ラジカルの恒常的な攻撃に対し細胞を保護する役割を果たす。それはまた、生体異物及び発癌物質などの様々な内在性及び外来性の化合物の解毒作用、タンパク質構造及び機能の保持、タンパク質合成及び分解の調節、並びに免疫機能の調整を含む、数多くの他の重要な機能も有する（非特許文献６−８）。それ故、最適な血中及び組織中のＧＳＨレベルを保持することは、健康を維持する上で極めて重要であり、またＧＳＨ合成ができないことは致死的である（非特許文献９）。

多くの研究が、たとえ部分的でもＧＳＨ喪失による、免疫機能の低下（非特許文献１０）、広範囲の生体異物に対する感受性の増加（非特許文献１１）、及び酸化的損傷（非特許文献１２）を含む、多種多様な弊害を証明してきた。組織及び血中レベル又は産生におけるＧＳＨの変化は、感染症（例えば、ＨＩＶ）、遺伝性疾患（例えば、糖尿病）、生体異物誘導性疾患（例えば、アルコール性肝疾患）、及び変性性疾患（例えば、パーキンソン病及びアルツハイマー病）を含む多くの病理の症状であり、また加齢と密接な関係がある（非特許文献１３−１５）。

ＧＳＨ投与の効力を証明する実験室的及び疫学的データの豊富さにもかかわらず、ヒト患者における経口的ＧＳＨ補給の有効性に関する直接的なデータはまだ殆どない。

Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ａ．，Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｉｔｓｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９８８．２６３（３３）：ｐ．１７２０５−８．Ｓｉｍｏｎｅ，Ｇ．，Ｍ．Ｔａｍｂａ，ａｎｄＭ．Ｑｕｉｎｔｉｌｉａｎｉ，Ｒｏｌｅｏｆｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｉｎａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｓｙｓｔｅｍｓ．ＲａｄｉａｔＥｎｖｉｒｏｎＢｉｏｐｈｙｓ，１９８３．２２（３）：ｐ．２１５−２３．Ｓａｅｚ，Ｇ．Ｔ．，Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ，Ｗ．Ｈ．，Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ，Ｊ．Ｖ．，Ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓａｎｄｔｈｉｏｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓ−ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅａｇａｉｎｓｔｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ：ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｊ．Ｖｉｎａ１９９０，ＢｏｃａＲａｔｏｎ：ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．２３７−２５４．Ｓｉｅｓ，Ｈ．，ＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓ１９８５，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ．Ｓｉｅｓ，Ｈ．，Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｃｅｌｌｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．ＦｒｅｅＲａｄｉｃＢｉｏｌＭｅｄ，１９９９．２７（９−１０）：ｐ．９１６−２１．Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ａ．ａｎｄＭ．Ｅ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ．ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ，１９８３．５２：ｐ．７１１−６０．ｖｉｎａ，Ｊ．，Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ：ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＦｕｎｃｔｉｏｎｓ．１９９０，ＢｏｃａＴａｔｏｎ：ＣＲＣＰｒｅｓｓ．Ｌｕ，Ｓ．Ｃ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｃｕｒｒｅｎｔｃｏｎｃｅｐｔｓａｎｄｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ．ＦａｓｅｂＪ，１９９９．１３（１０）：ｐ．１１６９−８３．Ｓｈｉ，Ｚ．Ｚ．，ｅｔａｌ．，Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｍｏｕｓｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｕｔｎｏｔｆｏｒｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｉｎｃｕｌｔｕｒｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０００．９７（１０）：ｐ．５１０１−６．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．，ｅｔａｌ．，ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎｉｎｒａｔｓｉｍｐａｉｒｓＴ−ｃｅｌｌａｎｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｉｍｍｕｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＡｒｃｈＳｕｒｇ，１９９３．１２８（１）：ｐ．２９−３４；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ３４−５．Ｊｏｌｌｏｗ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓｉｎｒｅａｃｔｉｖｅｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＡｒｃｈＴｏｘｉｃｏｌＳｕｐｐｌ，１９８０．３：ｐ．９５−１１０．Ｅｌｌｏｕｋ−Ａｃｈａｒｄ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｅｘｖｉｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌｓｉｎａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｓｔｕｄｉｅｓ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎ，ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓａｎｄｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅｓｉｎｃａｌｃｉｕｍｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓａｎｄｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ＡｒｃｈＴｏｘｉｃｏｌＳｕｐｐｌ，１９９５．１７：ｐ．２０９−１４．Ｒｅｉｄ，Ｍ．ａｎｄＦ．Ｊａｈｏｏｒ，Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｉｎｄｉｓｅａｓｅ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｌｉｎＮｕｔｒＭｅｔａｂＣａｒｅ，２００１．４（１）：ｐ．６５−７１．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｃ．Ｍ．，Ｊ．Ｄｏｗ，ａｎｄＭ．Ｒ．Ｍｏｏｒｅ，Ａｐｏｓｓｉｂｌｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｒｏｌｅｆｏｒｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎａｃｕｔｅａｌｃｏｈｏｌｉｃｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙ．ＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍａｃｏｌ，１９７７．２６（１６）：ｐ．１５２９−３１．Ｒｉｃｈｉｅ，Ｊ．Ｐ．，Ｊｒ．，Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｉｎａｇｉｎｇａｎｄｃａｎｃｅｒ．ＥｘｐＧｅｒｏｎｔｏｌ，１９９２．２７（５−６）：ｐ．６１５−２６．

本発明の目的は、ＧＳＨ補給の効果を免疫機能のバイオマーカーに基づき検出することである。

本発明は以下の通りである。
（１）有効量のグルタチオン又はその塩をその必要がある患者に経口投与することを含む免疫機能増強方法。
（２）有効量のグルタチオン又はその塩をその必要がある患者に経口投与することを含むナチュラルキラー細胞の細胞毒性増大方法。
（３）有効量のグルタチオン又はその塩をその必要がある患者に経口投与することを含むリンパ球の増殖増大方法。
（４）前記患者がヒトであり、かつ前記投与が、グルタチオン又はその塩に換算して１日あたり５０ｍｇから５０００ｍｇである（１）に記載の免疫機能増強方法。
（５）前記患者がヒトであり、かつ前記投与が、グルタチオン又はその塩に換算して１日あたり２５０ｍｇから５０００ｍｇである（１）に記載の免疫機能増強方法。
（６）前記投与が１日から１年間にわたる（１）に記載の免疫機能増強方法。
（７）前記投与が１週間から６か月間にわたる（１）に記載の免疫機能増強方法。
（８）前記投与が３か月間にわたる（１）に記載の免疫機能増強方法。
（９）前記投与が１日以上にわたる（１）に記載の免疫機能増強方法。
（１０）前記投与が１週間以上にわたる（１）に記載の免疫機能増強方法。
（１１）前記投与が３か月間以上にわたる（１）に記載の免疫機能増強方法。
（１２）グルタチオン又はその塩を含んでなる、免疫機能増強用経口剤。
（１３）グルタチオン又はその塩を含んでなる、ナチュラルキラー細胞の細胞毒性増大用経口剤。
（１４）グルタチオン又はその塩を含んでなる、リンパ球の増殖増大用経口剤。
（１５）免疫機能増強への使用のための、グルタチオン又はその塩。
（１６）ナチュラルキラー細胞の細胞毒性増大への使用のための、グルタチオン又はその塩。
（１７）リンパ球の増殖増大への使用のための、グルタチオン又はその塩。
（１８）有効量のグルタチオン又はその塩をその必要がある患者に経口投与することを含む免疫機能増強方法。ただし、該方法は、ヒトに対する医療行為を含まない。
（１９）有効量のグルタチオン又はその塩をその必要がある患者に経口投与することを含むナチュラルキラー細胞の細胞毒性増大方法。ただし、該方法は、ヒトに対する医療行為を含まない。
（２０）有効量のグルタチオン又はその塩をその必要がある患者に経口投与することを含むリンパ球の増殖増大方法。ただし、該方法は、ヒトに対する医療行為を含まない。
（２１）免疫機能増強用経口剤を製造するためのグルタチオン又はその塩の使用。
（２２）ナチュラルキラー細胞の細胞毒性増大用経口剤を製造するためのグルタチオン又はその塩の使用。
（２３）リンパ球の増殖増大用経口剤を製造するためのグルタチオン又はその塩の使用。

本発明によれば、グルタチオン又はその塩により、免疫機能が増強され、かつナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の細胞毒性及びリンパ球増殖が増大される。

図１は、ＧＳＨ投与前（０か月）と、ＧＳＨを１，３，６または７か月間投与後に被験者から採取したリンパ球中のグルタチオン濃度の変化を示す。縦軸はリンパ球中のグルタチオン濃度（μｍｏｌ／１０^６ｃｅｌｌｓ）を表し、横軸は、Ｃ群はプラセボ群を表し、Ｂ群は１日あたりＧＳＨ２５０ｍｇ投与群を表し、Ａ群は１日あたりＧＳＨ１０００ｍｇ投与群を表す。横軸の同一群内のバーは、左から１，３，６および７か月間投与群を表す。値は、平均値±平均値の標準誤差を表し、＊はベースライン値（ＧＳＨ各濃度投与前）とＡ群のＧＳＨ投与後（１，３および６か月後）の測定値とを、カイ２乗検定を用いて検定した結果、有意差が認められた（ｐ＜０．０５）ことを意味し、†は、プラセボ群（Ｃ群）とＡ群のＧＳＨ投与後（１および６か月後）の測定値とを、カイ２乗検定を用いて検定した結果、有意差が認められた（ｐ＜０．０５）ことを示す。図２は、ＧＳＨ投与前（０か月）と、ＧＳＨを３か月間投与後に被験者から採取したリンパ球の増殖作用の変化を示す。縦軸は、細胞増殖にともなって３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅが細胞内に取り込まれたことによる放射活性（単位：ｃｏｕｎｔｓｐｅｒｍｉｎｕｔｅ＝ｃｐｍ）を示し、横軸は、Ｃ群はプラセボ群を表し、Ｂ群は１日あたりＧＳＨ２５０ｍｇ投与群を表し、Ａ群は１日あたりＧＳＨ１０００ｍｇ投与群を表す。値は、平均値±平均値の標準誤差を表す。図３は、ＧＳＨ投与前（０か月）と、ＧＳＨを３か月間投与後に被験者から採取したＮＫ細胞によるヒトＫ５６２細胞に対する細胞毒性作用の変化を表し、縦軸は、Ｋ５６２細胞による全放射活性に対する、ＮＫ細胞毒性により溶解したＫ５６２細胞からの放射活性の比を表す（単位：％溶解）。横軸は、Ｃ群はプラセボ群を表し、Ｂ群は１日あたりＧＳＨ２５０ｍｇ投与群を表し、Ａ群は１日あたりＧＳＨ１０００ｍｇ投与群を表す。値は、平均値±平均値の標準誤差を表し、＊はベースライン値（ＧＳＨ１０００ｍｇ投与前）と上記ＧＳＨ１０００ｍｇ投与群の測定値とを、カイ２乗検定を用いて検定した結果、有意差が認められた（ｐ＜０．０５）ことを示す。

本発明で用いたグルタチオンは、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び酸化型グルタチオンを包含する。ＧＳＨは、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ構造をもつトリペプチドを指し、酸化型グルタチオンは、２分子のＧＳＨがＳＳ結合により結合したグルタチオンジペプチドを指す。

本発明で用いたＧＳＨ及び酸化型グルタチオンは、任意の製造プロセスにより取得され得る。ＧＳＨ製造のためのプロセスの例は、酵母などの微生物からの抽出法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９５７年、第３巻、ｐ．６０３）、化学的合成法（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０年、第５３巻、ｐ．２５２９）、酵素的合成法（特開昭６１−７４５９５号公報）があり、酸化型グルタチオン製造のためのプロセスの一例としては、ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．，１９７０年、第１７巻、ｐ．１７５の方法がある。ＧＳＨ及び酸化型グルタチオンはまた、シグマ−アルドリッチコーポレーションから購入することができる。

グルタチオンの塩の例としては、塩酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、α−ケトグルタル酸塩、及びアスパラギン酸塩をあげることができ、他の塩又は２つ以上の塩の適当な組合せを使用してもよい。

本願における、免疫機能とは、微生物の感染防御、他の固体の細胞の拒絶、変異細胞および老廃組織の除去にかかわる機能を意味し、例えば、ＮＫ細胞による細胞毒性およびリンパ球の増殖機能等が挙げられる。

本願における、ＮＫ細胞とは、非Ｔおよび非Ｂ細胞系の特殊なリンパ球でウイルス感染の防御や腫瘍細胞の排除を行う細胞を意味する。

本願における、免疫機能増強とは、例えば、Ｔ細胞の増殖を促進することによって、および／または腫瘍やウイルス感染細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性を高めることによって、微生物の感染防御や他の固体の細胞の拒絶、変異細胞および老廃組織の除去機能を高めることを意味する。

本願における、ＮＫ細胞の細胞毒性とは、ＮＫ細胞が腫瘍細胞やウイルス感染細胞などに対し直接細胞を攻撃し、傷害を与えることを意味する。

本願における、ＮＫ細胞の細胞毒性作用の増大とは、ＮＫ細胞が腫瘍細胞やウイルス感染細胞などに対し、直接攻撃し傷害を与える作用が促進されることを意味する。従って、ＮＫ細胞の毒性作用の増大は、腫瘍やウイルス性疾患の治療方法および／または予防方法として有用である［「ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗ２００２免疫」、中外医学社、ｐ．７６−ｐ．８０］。

本願における、リンパ球増殖とは、抗原刺激によるＴ細胞の細胞分裂による増殖を意味する。

本願における、リンパ球増殖増強とは、抗原刺激によるＴ細胞の細胞分裂による増殖が増加することを意味し、これにより細胞内感染性微生物および細胞外感染微生物に対する細胞障害活性が増大する［「ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗ２００２免疫」、中外医学社、ｐ．１０−ｐ．１１］。その結果、該細胞内感染性微生物または該細胞外感染微生物を原因とする感染症の治療方法および／または予防方法として有用である。細胞内感染性微生物としては、例えば、ウイルス、クラミジア、リケッチア、リステリア、リーシュマニア、好酸菌、チフス菌等が挙げられ、細胞外感染微生物としては、例えば、原虫、真菌、寄生虫、マイコプラズマ、腸炎球菌、大腸菌等が挙げられる。

マウス由来脾リンパ球を用いたＩｎｖｉｔｒｏでの、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）誘導リンパ球増殖活性およびＮＫ細胞毒性活性のＧＳＨ濃度依存的な増加が報告されている［ＹａｋｕｇａｋｕＺａｓｓｈｉ，１２６（１０），ｐｐ．８４９−８５７，２００６］。また、生体内でＧＳＨ産生作用がある２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール）投与によるリンパ球増殖作用が知られている［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６（６），ｐｐ．１９２１−１９２７，１９９１］。さらに、グルタチオンの前駆体であるＮ−アセチルシステイン（Ｎ−Ａｃ）のヒト経口投与による免疫細胞中でのグルタチオン濃度の増加、ＰＨＡ刺激リンパ球増殖活性、ＮＫ細胞毒性活性の増大が報告されている。

本願において、グルタチオンはそれ自体として投与され得るが、通常各種の製剤として投与するのが好ましい。

製剤は、有効成分としてグルタチオンまたはその塩を含有し、更に任意の有効成分を含有していてもよい。また、それら製剤は、有効成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。

製剤の投与形態は、免疫機能増強に際し最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、または静脈内、腹腔内もしくは皮下投与等の非経口投与を挙げることができるが、経口投与が好ましい。

投与する製剤の剤形としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤／煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤等の経口剤、注射剤、点滴剤、クリーム剤、坐剤等の非経口剤のいずれでもよいが、経口剤として好適に用いられる。

経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、パラオキシ安息香酸メチル等のパラオキシ安息香酸誘導体、安息香酸ナトリウム等の保存剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加して製剤化することができる。

また、経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤および顆粒剤等は、乳糖、白糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末等の賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルレセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤などを添加して製剤化することができる。

また、経口投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。

経口投与に適当な製剤は、そのまま、または例えば粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等の形態として、免疫機能増強用の健康食品、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品等の飲食品として用いてもよい。

経口用の、上記の防腐剤、保存剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種以上の補助剤もまた、これらの非経口用製剤において使用され得る。

本発明の免疫機能増強のためのグルタチオン又はその塩の濃度は、製剤の種類、製剤の投与により予想される効果などにより、適宜決定される。グルタチオン又はその塩は、通常０．１から１００重量％、好ましくは１から１００重量％、特に好ましくは２５から１００重量％の量で含有される。

グルタチオン又はその塩が本発明に従って投与される場合、用量及び投与スケジュールは、投与経路、患者の年齢、及び体重等に応じて変化する。患者がヒトである場合、グルタチオンは、グルタチオン又はその塩に換算して１日あたり５０ｍｇから５０００ｍｇ、好ましくは２５０ｍｇから１０００ｍｇ投与され得る。

投与期間については特別な制限はないが、投与は１日から１年間、好ましくは１週間から６か月間、最も好ましくは３か月間にわたり得る。別の実施形態では、投与は１日以上、好ましくは１週間以上、さらに好ましくは３か月間以上にわたり得る。

本発明の剤は、ヒトだけでなく、ヒト以外の動物（以降、非ヒト動物と略記）にも使用され得る。

非ヒト動物は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、及び魚類といった、ヒト以外の動物を包含する。

非ヒト動物への投与の場合、用量は、動物の年齢及び種類、並びに症状の性質及び重症度に応じて異なる。通常、薬剤は、オルニチン又はその塩、及びグルタチオン又はその塩に換算して、体重１ｋｇ当たり１ｍｇから６００ｍｇ、好ましくは２ｍｇから２００ｍｇ、さらに好ましくは４ｍｇから６０ｍｇの一日用量となる量で、１日１回から数回投与される。

投与期間については特別な制限はないが、通常は１日から１年間、好ましくは１週間から３か月間である。または、該投与は１日間以上でもよく、好ましくは１週間以上でもよく、さらに好ましくは３か月以上である。

また、本発明には、ヒトを投与対象にして１日あたり５０ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは２５０ｍｇ〜１０００ｍｇのグルタチオンまたはその塩を１日以上、好ましくは１週間以上、より好ましくは３か月以上投与する様に調整された免疫機能増強用、ＮＫ細胞の細胞毒性増強用、リンパ球増殖増強用の経口剤も含まれる。

本発明は、実施例により以下に記載される。しかしながら、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

１．研究デザイン及び方法
デザインは、３つの群（ＧＳＨ１０００ｍｇ／日、ＧＳＨ２５０ｍｇ／日、及びプラセボ）に無作為に割当てられた健康な被験者（年齢２８−７９歳、平均＝４６．６歳）の招集を含む。被験者４８人、群当たり１６人の目標集積は、検出力計算と、セレニウムを用いた先の臨床試験の結果（Ｅｌ−Ｂａｙｏｕｍｙ，Ｋ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＥｐｉｄｅｍｉｏｌＢｉｏｍａｒｋｅｒｓＰｒｅｖ，２００２年、第１１巻、第１１号、ｐ．１４５９−６５）とを基準とした。血液試料を、ベースラインにおいて全ての被験者から採取した。被験者は以下のスケジュールに従って補給を開始した。グルタミンカプセルはスポンサーである協和発酵ＵＳＡから提供された。下記のようにカプセルを調剤し、被験者は以下のスケジュールに従って補給を開始した。
・Ａ群、ＧＳＨ：５００ｍｇ／カプセル、及びセルロース：１５ｍｇ／カプセル（毎日２錠）；
・Ｂ群、ＧＳＨ：１２５ｍｇ／カプセル、及びセルロース：３６０ｍｇ／カプセル（毎日２錠）；
・Ｃ群（プラセボ）、セルロース：４７０ｍｇ／カプセル（毎日２錠）。

適格な参加者を無作為に、プラセボ（Ｃ群），高用量（Ａ群）又は低用量（Ｂ群）グルタチオン群のいずれかに割当てた。補給は６か月間継続し、生体試料をベースラインから１、３、及び６か月後に採取した。６か月で補給を中止した。最後の生体試料の採取は、１か月のウォッシュアウト期間の後に行った。

血液試料は、前肘静脈から、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを含有する３つのチューブ内へ採取し、直ちに氷上に置いた。血液試料は、午前９時と午後１時との間に採取し、被験者は採取前に絶食しなかった。チューブを穏やかな振盪により混合し、全血２．５ｍｌ分を、好中球食作用及び呼吸バースト（下記参照）の分析用に取り分けた。２つの全血０．５ｍｌ分を、将来の分析用に取り分け−８０℃で保存した。残りの血液を、１３００ｘｇで１０分間遠心分離して、血漿、軟膜、及び赤血球分画を得た。複数の血漿０．５ｍｌ分を、１．５ｍｌのクライオバイアルに入れ、直ちに−８０℃で凍結した。濃縮赤血球を生理食塩水で３回洗浄し、複数のクラオバイアルに分注し（各０．５ｍｌ）、−８０℃で凍結した。軟膜分画を合わせ、リンパ球をフィコール-ハイパック密度勾配遠心法により単離した。手短に言えば、フィコールを３ｍｌ添加後、軟膜を、１９℃において４００ｇで３０分間遠心した。リンパ球層を取り除き、ＰＢＳで２回洗浄し、続いて２５０ｇで１０分間遠心した。最終洗浄後、リンパ球をＰＢＳ５ｍｌ中に再懸濁した。細胞数は、細胞懸濁液１０μｌに対しトリパンブルー４０μｌを添加した後に、血球計算板を用いて算定した。細胞を、９５％ＦＢＳ、５％ＤＭＳＯ中に、２．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、リンパ球増殖及びＮＫ細胞毒性の分析（下記参照）用に液体窒素中で保存した。細胞は、以下に記載の通り、酸抽出まで氷上に保持した。

＜グルタチオン＞
グルタチオンは、４つの時点（１、３、６、及び７か月）の各々からのリンパ球のメタリン酸（ＭＰＡ）抽出物として測定した。リンパ球用には、５ｘ１０^６細胞を含有する濃縮リンパ球のアリコートに、５％ＭＰＡを４００μｌ添加した。激しい混合及び室温で１５分間のインキュベーションの後、試料を１４，０００ｇで２分間遠心した。上清及びペレットを別々に、フリー及びＧＳＨの各々の分析まで−８０℃で保存した。ＧＳＨを１日あたり２５０ｍｇまたは１０００ｍｇ投与して投与開始から１、３、６および７か月後に被験者から採取したリンパ球中のグルタチオン濃度を測定したものを図１に示す。

＜リンパ球増殖＞
５つの時点（０、１、３、６、及び７か月）の各々からのリンパ球試料を解凍し、３回洗浄し、細胞生存率を計数した。細胞を、Ｔ細胞分裂促進因子フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）の存在及び非存在下に、１ｘ１０^５及び５ｘ１０^４細胞／細胞の双方で、３枚に播種した。細胞増殖は、３Ｈ−チミジンの取込みによりモニターした。細胞内放射能は、液体シンチレーションカウンティングにより測定し、結果をｃｐｍで表した。３か月目のリンパ球増殖作用の評価結果（プラセボ，２５０ｍｇ／日投与群および１０００ｍｇ／日投与群）を図２に示す。

＜ＮＫ細胞の細胞毒性＞
ＮＫ細胞の細胞毒性は、標的細胞として^５１クロム酸ナトリウムで標識したヒトＫ５６２細胞を用いて算定した。Ｋ５６２細胞を標識した後、それらを９６ウェルプレートに入れた（１ｘ１０^４細胞／ウェル）。５つの時点の各々からのリンパ球試料を解凍し、３回洗浄し、計数して細胞生存率を測定し、エフェクター：標的細胞比１０：１で、３つのウェルに添加した。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞を採取し、上清をガンマ測定により放射能分析した。結果は、（ｃｐｍ実験的放出−ｃｐｍ自然発生的放出）／（ｃｐｍ最大−自然発生）として計算された、標的細胞溶解（％溶解）のパーセントとして表される。３か月目のＮＫ細胞の細胞毒性作用の評価結果（プラセボ，２５０ｍｇ／日投与群および１０００ｍｇ／日投与群）を図３に示す。

この試験は、ＧＳＨの効力の証拠を提供するべくデザインされ、かつ短期間（１か月）及び長期間（６か月）の効果の評価を包含する。先の実験動物試験及び臨床データに基づき、経口的ＧＳＨ補給の効果は漸進的かつ蓄積性であろうと予測された。血中ＧＳＨレベルに対するセレニウムの、同様の６か月までの漸進的な効果が、健康な成人男性において既に観察された（Ｅｌ−Ｂａｙｏｕｍｙ，Ｋ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＥｐｉｄｅｍｉｏｌＢｉｏｍａｒｋｅｒｓＰｒｅｖ，２００２年、第１１巻、第１１号、ｐ．１４５９−６５）。加えて、研究デザインはまた、結果変数に対する補給中止の影響の評価も可能にした。用量は、先の臨床試験結果に基づき、生物学的に関連した応答が試験期間内に観察され得る見込みを最適化するべく選択された。

２．研究の統計的分析
重要なバイオマーカー（ＮＫ細胞の細胞毒性、及びリンパ球増殖）に対するグルタチオンの効果の一次評価は、反復測定ＡＮＯＶＡ（分散分析）を用いて、ベースラインから処理の最後までの変化を各群で比較することを包含するものである。別法として、スチューデントｔ検定及び反復測定ＡＮＯＶＡを用いて、バイオマーカーレベルの平均継時変化を各年齢群で比較することもできる。

３．血中の免疫機能マーカーに対する経口的グルタチオンの効果
リンパ球増殖、及びＮＫ細胞の細胞毒性を包含する、免疫機能のいくつかの異なる血液ベースのパラメータについて、ＧＳＨ投与のインパクトを調べた。リンパ球及びＮＫ細胞アッセイは、凍結した精製リンパ球分画について実施した。これら後半のアッセイは、凍結された細胞標本から得られる、生きていてかつ増殖性の細胞の収率に依存する。それ故、全ての試料を慎重かつ迅速に処理して、純粋なリンパ球分画を得、これらを次に、最適の細胞生存を維持するべくデザインされたプロトコールを用いて凍結した。これらのアッセイでは、アッセイ対アッセイのバラつきを避けるため、所与の固体由来の各時点の全試料を、同じ日に全て一緒に分析することが重要であることから、生存率が最小限少なくとも７か月間は凍結された試料において維持されることが必要であった。生存率の最低レベルに達しなかった細胞試料は、さらなる分析に使用できなかった。この理由から、残念ながら数多くのリンパ球試料が分析に使用できなかった。このことは、恐らくは研究中に起きた−８０℃のフリーザーの機能不全から生じたものと考えられる。試料は解凍されなかったが、一定期間−１５℃までの温かい温度を体験した。これらの消失試料の結果として、使用可能なプレ−サンプル及びポスト−サンプルであった被験者のｎ値は、リンパ球増殖には群当たり８−９、またＮＫ細胞の細胞毒性アッセイには群当たり５−６に過ぎなかった。したがって、統計的検出力、とりわけサブグループ分析については、ネガティブな影響を受けた。

＜リンパ球総グルタチオン＞
リンパ球レベルについての経口的ＧＳＨ投与の効果は、図１に要約される。値は、百万細胞ベース当たりで表され、０．７から６．７μｍｏｌ／１０^６細胞まで変動した。約３０％の最大増加が、高ＧＳＨ群で６か月後に観察された。高用量群では、増加は時間依存性であるように見え、レベルは投与１か月から３か月へ、６か月へと漸次に増加した。以上のように、高投与量（１．０ｇ／日）時には投与期間依存的にＧＳＨ濃度がリンパ球中に蓄積し、かつ投与前（０か月）と比べても有意差を示したことから、ＧＳＨに基づく薬効の発現（例えば、免疫増強機能等）が期待される。

＜リンパ球増殖＞
リンパ球増殖に対するＧＳＨ投与の効果は、図２に要約される。平均増殖能における増加は、３か月後に、双方のＧＳＨ群において用量依存様式で観察された。このことは、ＧＳＨ投与からの結果として生じる、リンパ球増殖の増大に向かう傾向を示唆している。

従って、ＧＳＨまたはその塩は、免疫機能増強剤として有用であり、好ましくは、Ｔ細胞の増殖を促進し、および／または腫瘍やウイルス感染細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性を高めることで、微生物の感染防御や他の固体の細胞の拒絶、変異細胞および老廃組織の除去機能を高める剤として有用である。さらに、好ましくは、細胞内感染性微生物（例えば、ウイルス、クラミジア、リケッチア、リステリア、リーシュマニア、好酸菌、チフス菌等）および細胞外感染微生物（例えば、原虫、真菌、寄生虫、マイコプラズマ、腸炎球菌、大腸菌等）に対する細胞障害活性を増大し、該細胞内感染性微生物または該細胞外感染微生物を原因とする感染症の治療剤および／または予防剤として有用である。

＜ＮＫ細胞の細胞毒性＞
ＮＫ細胞の細胞毒性に対するＧＳＨ投与の効果は、図３に要約される。平均％溶解値における増加は、３か月後に、双方のＧＳＨ群において用量依存的様式で観察されたが、高ＧＳＨ用量の施行群でのみ有意であった（Ｐ値＝０．０１）。

従って、ＧＳＨまたはその塩は、免疫機能増強剤として有用であり、好ましくは、Ｔ細胞の増殖を促進し、および／または腫瘍やウイルス感染細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性を高めることで、微生物の感染防御や他の固体の細胞の拒絶、変異細胞および老廃組織の除去機能を高める剤として有用である。好ましくは、腫瘍細胞やウイルス感染細胞などに対し、直接攻撃し傷害を与える作用を促進する剤として有用である。さらに好ましくは腫瘍やウイルス性疾患の治療剤および／または予防剤として有用である。

全体的には、これは長期間のＧＳＨ補給の有効性を初めて証明した、非常に成功した試験であった。

本出願は、２０１２年９月２８日出願の米国仮出願第６１／７０７，２８６号に基づくものであり、同特許出願の内容は参考として本明細書に援用される。

Claims

グルタチオン又はその塩のみを有効成分として含んでなり、投与期間が３か月間以上であり、グルタチオンの投与量が１日あたり１０００ｍｇ／日以上である、免疫機能増強用経口剤。
グルタチオン又はその塩のみを有効成分として含んでなり、投与期間が３か月間以上である、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性増大用経口剤。
グルタチオン又はその塩のみを有効成分として含んでなり、投与期間が３か月間以上であり、グルタチオンの投与量が１日あたり１０００ｍｇ／日以上である、リンパ球の増殖増大用経口剤。