KR20170072350A - 아포에쿼린-함유 조성물 및 이의 뉴런 염증을 치료하기 위한 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대상체에서 뉴런 염증을 감소시키기 위해 뉴런을 전처리하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 대상체에 아포에쿼린을 투여하는 단계로서, 대상체의 뉴런이 전처리되어 대상체에서 후속 런 염증을 감소시키는 단계를 포함한다.

Description

아포에쿼린-함유 조성물 및 이의 뉴런 염증을 치료하기 위한 사용 방법 {APOAEQUORIN-CONTAINING COMPOSITIONS AND METHODS OF USING SAME TO TREAT NEURONAL INFLAMMATION}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2014년 11월 11일 출원된 미국 가출원 62/078,099의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 모든 목적상 본원에 참조로서 통합된다.

발명의 기술 분야

본 발명은 일반적으로 뉴런 염증의 치료에 유용한 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 아포에쿼린(apoaequorin)-함유 조성물 및 뉴런 염증을 치료하기 위해 이들 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

2009년에 뇌졸중은 미국에서 19명 사망마다 약 1건을 차지하여, 단지 심장 질환과 암의 사망 원인 중 세 번째의 주요 사망 원인이 되었다. 결과적으로, 뇌졸중 후 손상을 개선하는 방법을 반드시 찾아내야 한다. 허혈 후 칼슘의 독성 효과를 차단함으로써 허혈 및 가능한 신경보호에서 칼슘의 역할에 많은 관심이 집중되었다.

칼슘 (Ca^{2 +})은 신경전달물질 방출과 시냅스 가소성을 비롯한 다양한 뉴런 프로세스에서 중추적인 역할을 한다. 뉴런은 지속적인 활동의 결과로 세포 내 Ca^{2 +}에서 지속적으로 변동 처리되며, 그러나, 세포 내 Ca^{2 +}의 과도하거나 지속적인 증가는 뉴런에 독성을 나타낼 수 있다. 따라서, 뉴런의 세포내 Ca^{2 +}는 매우 엄격히 조절되며, 뉴런이 세포질 Ca^{2 +} 수준을 제한하거나 조절할 수 있는 여러 메커니즘이 존재한다. 특히, 칼슘 결합 단백질 (CaBP; 예컨대, 칼빈딘, 파르발부민, 및 칼레티닌)은 세포질 Ca²⁺의 결합 및 완충에 중요하다.

해마에 대한 연구는 CaBP의 존재가 일반적으로 세포 사멸을 초래하는 흥분 독성 손상에 대한 일부 보호를 부여함을 보여주었다. 흥미롭게도, 저하된 수준의 CaBP는 나이가 들면서, 그리고 알츠하이머병 및 파킨슨병을 비롯한 신경퇴행성 질환에서 관찰된다. 허혈성 손상 전에 CaBP를 투여함으로써 허혈 동안 Ca2+ 독성을 최소화시키기 위한 치료 또한 긍정적인 결과를 갖는다. 예를 들어, 예나리 (Yenari) 등은 허혈 유도 전에 동물을 칼빈딘으로 처리하고, 칼빈딘의 과다-발현이 신경보호성임을 발견하였다. 또한, 판 (Fan) 등은 허혈 전에 칼빈딘으로 쥐를 처리하고, 경색 부피가 적을수록 더욱 우수한 거동 회복, 및 칼빈딘-처리된 동물에서 감소된 아폽토시스를 입증하였다. 실제로, 많은 연구가 뇌졸중의 해로운 영향을 이해하는데 초점을 맞추었다. 흥미롭게도, 뇌졸중의 주요 위험 인자는 노화이며, 뇌 노화에 대한 하나의 중요 가설은 노화의 Ca^{2 +} 가설이다. 이러한 가설은 칼슘 및 칼슘-의존적 프로세스를 조절하는 능력에서 노화 관련 변화가 인지 기능 저하 및 신경변성 장애에 대한 감수성의 증가에 상당히 기여한다고 주장한다. Ca^{2 +}에서 이러한 노화 관련 변화, 및 허혈성 세포사에서 Ca^{2 +}의 중요한 역할을 고려하여, 많은 연구가 뉴런 및 아교세포 둘 모두에서 Ca²⁺ 조절이상에 초점을 두고 있다.

허혈 후 과도한 세포내 Ca^{2 +} 축적은 흥분독성을 통해 세포사를 강화시키는 것으로 알려져있다. 허혈성 손상 후, Ca^{2 +}는 전압-게이팅된 Ca^{2 +} 채널 (VGCC)을 통해, NMDA 수용체를 통해, 그리고 세포내 세포 기관으로부터의 방출을 통해 세포 내부에 축적된다. 수많은 연구에서 NMDA 수용체, VGCC 또는 이 둘 모두의 조합을 통한 Ca^{2 +} 유입 차단이 허혈에 대한 신경보호성일 수 있음을 보여주었다. 흥미롭게도, NMDA 수용체 차단제가 임상 실험에 투입되었을 때, 이들은 신경보호를 부여하는데 실패하였으며, 이들은 바람직하지 않은 부작용 예컨대, 환각 및 혼수를 유발하였다. NMDA 수용체 차단제가 임상 시험에서 왜 실패했는지는 불확실하지만, 허혈성 뇌졸중의 치명적인 영향을 개선하는데 초점을 둔 지속적인 연구가 요구됨이 있음이 분명하다.

진보에도 불구하고, 뉴런 염증을 치료하는 신규하고 대안적인 치료제가 여전히 요구되고 있다. 특히, 종래의 작용제에 비해 부작용이 감소된 약학적 조성물 또는 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 조성물이 요망되고, 발견시 이는 의료 및 영양 보건 집단에서의 오랜 기간의 요구를 충족시킬 것이다.

발명의 개요

본 발명은 부분적으로, 아포에쿼린에 대한 본 발명자들의 최근 조사, 칼슘 결합 단백질, 및 아포에쿼린이 신규한 신경보호 능력을 갖는다는 예상치 못한 발견을 기초로 한다. 특히, 아포에쿼린은 대상체에서 뉴런을 전처리(preconditioning)하는데 유용하여 후속 뉴런 염증을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 신경보호 적용에서 실질적인 이점을 부여하는 아포에쿼린-함유 조성물 및 사용 방법을 제공한다.

제 1 양태에서, 본 발명은 뉴런을 전처리하여 대상체에서 뉴런 염증을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 대상체에 아포에쿼린을 투여하는 단계로서, 대상체의 뉴런이 전처리되어 뉴론 염증을 감소시키는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 대상체로의 투여는 주사(injection)에 의한 것이다. 대안적인 구체예에서, 대상체로의 투여는 경구 전달 예를 들어, 정제 또는 캡슐로부터 선택된 단위 투약 형태로 제형화된 아포에쿼린에 의해 이루어진다. 특정 구체예에서, 아포에쿼린은 뉴트라슈티컬 조성물의 형태로 대상체에 투여된다.

인식할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 뉴론을 전처리하여 대상체에서 뉴런 염증을 감소시키기 위한 아포에쿼린 뿐만 아니라 대상체에서 뉴런 염증을 감소시키기 위해 뉴론을 전처리하기 위한 조성물의 제조에서 아포에쿼린의 용도를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 종양 괴사 인자 α (TNF α) 단백질 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 대상체에 아포에쿼린을 투여하는 단계로서, 대상체의 TNFα 단백질 수준이 감소되는 단계를 포함한다.

특정 구체예에서, 대상체로의 투여는 주사에 의한 것이다. 대안적인 구체예에서, 대상체로의 투여는 경구 전달 예를 들어, 정제 또는 캡슐로부터 선택된 단위 투약 형태로 제형화된 아포에쿼린에 의해 이루어진다. 특정 구체예에서, 아포에쿼린은 뉴트라슈티컬 조성물의 형태로 대상체에 투여된다.

인식할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 대상체에서 TNFα 단백질 수준을 감소시키기 위한 아포에쿼린 뿐만 아니라, 대상체에서 TNFα 단백질 수준을 감소시키기 위한 조성물의 제조에서 아포에쿼린의 용도를 포함한다.

본 발명은 대상체의 신경보호 기능을 통해 이의 정신적 및 신체적 건강의 전반적인 개선을 제공한다는 점에서 종래 조성물 및 방법에 비해 다양한 이점을 제공한다.

본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 명세서 및 청구항의 개관 후에 명백해질 것이다.

도 1A-C는 급성 해마 뇌 슬라이스(slice)에서 세포사에 대한 산소-글루코오스 결핍의 효과를 묘사한다. A) 실험 디자인의 다이어그램. 관상(coronal) 해마 슬라이스를 인공 뇌척수액 (aCSF)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 슬라이스의 반은 산소-글루코오스 결핍 (OGD)의 허혈 상태로 5분 동안 옮긴 반면, 나머지 반은 산소 정상 상태 (OGD 비처리)로 유지하였다. 그 후 모든 슬라이스를 aCSF로 옮겨 30분간 재관류 및 트리판 블루 염색을 시행하였다. 이어서 슬라이스를 10% 중성-완충된 포르말린에서 고정시켰다. B) 산소 정상 상태 (OGD 비처리)로 유지된 슬라이스 및 5분간 OGD로 처리된 슬라이스에서 해마의 영역 CA1에서 트리판 블루 염색의 대표적인 이미지. OGD 슬라이스와 비교한 산소 정상 상태 슬라이스에서 덜 염색됨이 주지된다. C) 산소 정상 상태로 유지된 슬라이스와 비교하여 5분 OGD 처리된 슬라이스로부터의 해마의 영역 CA1에서 트리판 블루-염색된 뉴런의 수는 현저하게 증가하였다 (^*, P<.01).
도 2A-C는 허혈성 세포 치사에 대한 아포에쿼린의 용량-의존적 효과를 묘사한다. A) 실험 설계의 다이어그램. 등쪽 해마에서 양쪽으로 캐뉼레이팅된 쥐에 한쪽 반구에는 0, 0.4, 1 또는 4% 아포에쿼린 (AQ) 및 다른 쪽 반구에는 비히클 (0% AQ)을 주입하였다. 주입 후 1일에, 관상 해마 슬라이스를 절단하고 인공 뇌척수액 (aCSF)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 슬라이스를 산소-글루코오스 결핍 (OGD)의 허혈 상태로 5분 동안 옮겼다. 그 후 슬라이스를 aCSF로 옮겨 30 분간 재관류 및 트리판 블루 염색을 시행하였다. 이어서 슬라이스를 10% 중성-완충된 포르말린에서 고정시켰다. B) 비히클-처리된 슬라이스 또는 4% AQ-처리된 슬라이스에서 허혈 후 해마의 영역 CA1에서 트리판 블루 염색의 대표 이미지. 비히클-처리된 슬라이스와 비교한 AQ-처리된 슬라이스에서 덜 염색됨이 주지된다. C) 그래프는 아포에쿼린의 용량에 따른 신경보호 (구조된 세포의 퍼센트)를 보여준다. 0% AQ와 비교하여 1 또는 4% AQ (0.4% AQ는 제외)로 처리된 쥐에서 현저한 신경보호가 존재하였다 (비히클; *, p<.01).
도 3A-C는 허혈성 세포사에 대한 아포에쿼린의 시간-의존적 효과를 묘사한다. A) 실험 설계의 다이어그램. 등쪽 해마에서 양쪽으로 캐뉼레이팅된 쥐에 한쪽 반구에는 4% 아포에쿼린 (AQ) 및 다른 쪽 반구에는 비히클 (0% AQ)을 주입하였다. 관상 해마 슬라이스를 주입 후 1시간, 1일, 2일, 3일 또는 5일에 절단하고, 슬라이스를 인공 뇌척수액 (aCSF)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 슬라이스를 산소-글루코오스 결핍 (OGD)의 허혈 상태로 5분 동안 옮겼다. 그 후 슬라이스를 aCSF로 옮겨 30분간 재관류 및 트리판 블루 염색을 시행하였다. 이어서 슬라이스를 10% 중성-완충된 포르말린에 고정시켰다. 두 번째 세트의 쥐에는 4% AQ를 양쪽 주입하였고, 웨스턴 블롯팅에 사용되도록 주입 후 1시간, 1일, 2일 또는 3일에 뇌를 제거하였다. B) 허혈전 1일 또는 2일에 4% AQ의 주입은 현저한 신경보호를 유발시켰으나, 신경보호 효과는 주입 후 3 또는 5일에 더 이상 나타나지 않았다. AQ는 단지 허혈 전 1시간에 주입되는 경우 신경보호성이지 않음이 주지된다 (p = .78). C) 22 kD의 AQ 단백질의 웨스턴 블롯 분석. AQ는 주입 후 1시간 및 1일째에 등쪽 해마 (AQ-dhcp)에 존재하지만 주입 후 3일에는 더 이상 존재하지 않는다. 주입 후 2일째에, 쥐의 단지 29%만이 밴드가 존재한다. 주입 시간에 상관없이 배쪽 해마 (AQ-vhpc)에는 밴드가 결코 존재하지 않음이 주지된다. β-액틴 (45 kD)의 분석은 등쪽 (액틴-dhpc) 또는 배쪽 (액틴-vhpc) 해마 중 어느 시점에서도 단백질 로딩의 효과를 나타내지 않았다. ^*, p <.01
도 4A-B는 인터류킨-10 mRNA 발현에 대한 아포에쿼린의 효과를 묘사한다. A) 인터류킨-10 (IL-10) mRNA 발현은 4% AQ가 등쪽 해마에 주입된 후 1 시간째에 현저하게 증가하였다. 이러한 통계적으로 유의한 증가는, IL-10 mRNA 발현이 1 내지 2일 내에 기준선 근처로 되돌아가기 때문에 일시적이었으며, 그러나 생물학적으로 관련된 2- 내지 3-배 증가는 여전히 관찰되었다. B) β-액틴 mRNA 발현은 4% AQ와 비히클-처리된 반구에서 유의한 차이가 없었다 (p = .52). 두 그래프 모두에 대해, 데이터는 비히클-처리된 대조군 반구로부터의 배수-변화로서 표현된다.
도 5는 실시예 2에서 이용된 실험적 방법론을 예시한다.
도 6A-B는 AQ의 해마내 주입이 신경보호성임을 보여주는 데이터를 묘사한다.
도 7A-D는 AQ 주입 후 사이토킨 발현을 묘사한다.
도 8A-C는 AQ의 경구 투여가 신경보호성임을 나타내는 데이터를 예시한다.
도 9A-C는 AQ 주입이 IL-10 및 TNF-α 단백질 발현을 변경시킴을 보여주는 데이터를 묘사한다.
도 10A-C는 노화 쥐에서 AQ 주입 및 추적 공포 조건화를 예시한다.
도 11A-C는 AQ의 경구 투여가 시간 및 용량 의존적임을 묘사한다.
도 12는 실시예 4에서 이용된 실험적 방법론을 묘사한다.
도 13A-C는 AQ의 경구 투여가 신경보호성임을 묘사한다.
도 14A-D는 AQ의 경구 투여가 사이토킨 단백질 발현을 변경시킴을 입증하는 데이터를 보여준다.
도 15A-B는 AQ의 해마내 주입이 사이토킨 단백질 발현을 변경시킴을 입증하는 데이터를 보여준다.
도 16은 IL-10 nAb가 AQ의 신경보호 효과를 역행하는 것을 보여주는 데이터를 예시한다.

발명의 상세한 설명

I. 총론

본 발명의 재료 및 방법을 기술하기 전에, 본 발명은 기재된 특정 방법 및 재료로 제한되는 것이 아니며, 이들이 다양할 수 있음이 이해된다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술하려는 목적이며, 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해해야 한다.

본원 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같은, 단수 형태는 문맥에서 명백히 달리 지시되지 않는 경우 복수의 언급을 포함하는 것임이 주지되어야 한다. 또한, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "포함하는", "함유하는" 및 "갖는"이 상호교환적으로 사용될 수 있음이 주지되어야 한다.

달리 정의되지 않는 경우, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

동물. 92마리의 수컷 F344 성체 쥐를 사용하였다. 쥐는 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있게 하면서 14/10시간 주/야 주기로 유지하였다. 현저한 체중 증가 및/또는 감소를 설명하기 위해, 각 동물의 체중을 주당 2회 기록하였다.

약물. 아포에쿼린 (AQ; Quincy Bioscience)을 7.4%의 농도로 이중 탈이온수에서 제조하였다. 용량 의존적 실험에서 실험군 (n = 18)은 이들의 일일 PB에 혼합된 0 (n = 4), 3.6 (n = 5), 48 (n = 4), 240 (n = 3), 또는 480 mg/kg의 AQ를 투여받았다. 나머지 연구에 있어서, 쥐 (n = 73)는 이들의 일일 PB에 혼합된 48 mg/kg의 AQ를 투여받았다. 동물들은 다섯개의 군 중 하나에 배정되었다; AQ 비처리 (n = 12), 1시간 AQ (n = 17), 1일 AQ (n = 15), 2일 AQ (n = 15), 및 7일 AQ (n = 14). 쥐는 매일 정해진 시간에 케이지에서 페트리 디쉬에 놓인 1/4 티스푼의 PB를 투여받았다. 페트리 디쉬는 모든 PB가 소비될 때까지 제거하지 않았다. 적절한 AQ 투여량을 유지하기 위해 동물의 무게를 주 2회 측정하였다.

주입 연구를 위한 AQ는 이전에 기술된 바와 같이 제조하였다 (Detert et al., 2013). IL-10 중화 항체 (nAb) 및 이의 IgG 대조군을 무균 PBS 중에 제조하였다. 0.5 μg을 1 ul/분의 속도로 1 ul 해밀턴 주사기를 통해 주입하였다.

산소-글루코오스 결핍. 투여 마지막 날에, 쥐에게 소화를 위해 PB 소비 후 1시간을 허용하고, 이소플루란으로 깊게 마취시키고, 등쪽 해마 (dhpc; Bregma ^-3.14 - ^-4.16; Paxinos & Watson, 1998)의 관상 슬라이스 (400 μm)를 표준 절차를 이용하여 준비하였다 (Moyer & Brown, 2007). aCSF에서 1시간 슬라이스 회복 후, 각 뇌의 하나의 반구 (카운터발란스)는, 슬라이스를 5분 동안 산소-글루코오스 결핍 챔버 (글루코오스는 프룩토오스로 대체되고 95% O₂-5% CO₂ 대신에 95% N₂-5% CO₂로 버블링됨)로 옮김으로써 시험관내 허혈 처리하고, 나머지 반구는 회복되게 유지시켰다. 이어서, 모든 슬라이스를 30분 재관류 기간 동안 0.2% 트리판 블루를 함유하는 산소화된 aCSF에 넣었다. 트리판 블루는 죽은 세포는 염색시키는 반면, 살아있는 세포는 염색시키지 않는다 (DeRenzis & Schechtman, 1973). 슬라이스를 산소화된 실온 aCSF에서 2회 헹구고, 이어서 냉장고에서 밤새 10% 중성 완충된 포르말린으로 고정시켰다. 그 후, 슬라이스를 30% 수크로스에서 한랭보호하고, 냉동미세절단기 (cryostat)에서 절개하고 (40 μm), 세포 계수를 위해 교체된 슬라이드 상에 탑재시켰다.

세포 계수. 슬라이스를 올림푸스 현미경 (디지탈 카메라 장착됨)으로 10X로 시험하고, 사진을 촬영하였다 (CellSens). CA1 (약 800 μm 섹션) 내부의 트리판 블루 염색된 뉴런은 실험 조건에 대해 맹검 상태로 실험자에 의해 계수되었다. 통계 분석은 SPSS (v 21.0.0; IBM Corporation; Armonk, NY)를 사용하여 수행되었다. ANOVA를 사용하여 약물 효과를 평가하고, 피셔의 LSD 포스트-hoc 평가를 이용하여 군 상호작용을 평가하였다. 별표 (^*)는 p <.05를 나타낸다.

웨스턴 블롯 . 동물들을 이소플루란으로 깊게 마취시키고, 뇌를 신속하게 제거하고, 냉동시키고 -80℃에서 보관하였다. 해부 시간에, 샘플을 dhpc로부터 해부하였다 (Bregma ^-3.14 - ^-4.16mm). 샘플을 균질화하고, 4000 RPM에서 20분간 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 단백질을 브래드포드(Bradford) 단백질 검정 키트 (Bio-Rad)를 사용하여 측정하였다. 단백질 샘플을 표준화하고 SDS-PAGE (12%)를 위해 로딩하였다. 단백질 (30μg)을 터보 트랜스퍼 시스템 (Turbo Transfer System) (Bio-Rad)을 사용하여 PVDF 막 상으로 옮겼다. 막을 차단 완충액 (2시간), 1차 항체 (4℃에서 밤새; 1:1000 마우스 항-에쿼린 [Chemicon] 또는 1:1000 토끼 항-β-액틴 [Cell Signaling Technology] 및 2차 항체 (90분; 1:20,000 염소 항-마우스 [Santa Cruz Biotechnology] 또는 1:40,000 염소 항-토끼 [Millipore])에서 인큐베이션하였다. 이어서 막을 세척하고, 화학발광 용액 (Thermo Scientific)에 넣고, 신진 지박스(Syngene GBox)로 영상화시켰다. 진시스(GeneSys) 소프트웨어 (v 1.2.4.0, Synoptics 카메라 4.2MP)로 이미지를 촬영하고, 각 밴드의 형광을 진툴스(GeneTools) 소프트웨어 (v 4.02, Cambridge, England)로 평가하였다. 값은 대조군 동물의 백분율로 나타냈다. 통계는 SPSS로 수행하였다 (v. 21).

비록, 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 이제 바람직한 방법 및 재료가 기술된다. 본 발명과 관련하여 이용될 수 있는 공개 문헌에 보고된 화학물질, 기구, 통계 분석 및 방법을 기재하고 개시하는 것을 포함하는, 본원에 특별히 언급된 모든 공개 문헌 및 특허는 모든 목적상 참조로서 본원에 포함된다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 당해 기술 분야의 기술 수준을 나타내는 것으로 간주되어야 한다. 여기서 어떠한 것도, 본 발명이 종래 발명에 의한 그러한 기재내용보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

II. 발명

허혈성 뇌졸중은 매년 미국에서 ~795,000명의 사람에게서 발병하며, 이는 737억 달러의 추정 연간 비용을 발생시킨다. 칼슘은 여러 가지 신경신호전달 캐스케이드에서 중추적인 역할을 하지만, 허혈 동안 과도한 칼슘 유입은 흥분독성 세포사를 촉발시킬 수 있다. 칼슘 결합 단백질은 뉴런이 허혈 동안 세포 내 칼슘 수준을 조절/완충시키는 것을 돕는다. 에쿼린은 해파리 에쿼레아 빅토리아 (Aequorea victoria)로부터 분리된 칼슘 결합 단백질이며, 칼슘 지표로서 수년간 사용되어 왔으나, 이의 신경보호 특성에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 본 연구는 아포에쿼린 (에쿼린의 칼슘 결합 요소)의 해마내 주입이 허혈성 세포사로부터 뉴런을 보호한다는 가설을 시험하기 위해 시험관내에서 쥐의 뇌 슬라이스 제조물을 사용하였다. 양쪽에 캐뉼러 삽입된 쥐는 한쪽 반구에는 아포에쿼린 주입 및 다른 쪽 반구에는 비히클 대조군을 투여받았다. 이어서, 해마 슬라이스를 준비하고, 산소-글루코오스 결핍 (OGD)으로 5분간 처리하고, 세포사를 트리판 블루 배제에 의해 검정하였다. OGD로부터 뉴런을 용량-의존적으로 보호하는 아포에쿼린 - 1% 및 4% (0.4%는 제외)의 투여량은 트리판 블루-라벨링된 뉴런의 수를 현저하게 감소시켰다. 이러한 효과는 또한 시간 의존적이며, 최대 48시간 지속되었다. 이러한 시간 의존적 효과는 사이토킨 및 케모카인 발현 변화와 병행하며, 이는 아포에쿼린이 신경면역조절 메카니즘을 통해 뉴런을 보호할 수 있음을 나타낸다. 이들 데이터는, 아포에쿼린으로의 전처리가 허혈성 세포사에 대하여 뉴런을 보호하고, 효과적인 신경치료제일 수 있다는 가설을 지지한다.

에쿼린은 본래 발광성 해파리 및 다른 해양 유기체로부터 분리된 광-단백질이다. 에쿼린 복합체는 22,285 달톤의 아포에쿼린 단백질, 분자 산소 및 발광단 코엘렌테라진(coelenterazine)을 포함한다. 3개의 Ca^{2 +} 이온이 이러한 복합체에 결합하는 경우, 코엘렌테라진은 이산화탄소 및 청색 광의 동시 방출과 함께 코엘렌터미드(coelentermide)로 산화된다. 에쿼린은 세포에 의해 외수송되거나 분비되지 않고, 세포 내에 구획화되거나 격리되지 않는다. 따라서, 에쿼린 측정은 비교적 장기간에 걸쳐 일어나는 Ca^{2 +} 변화를 검출하는데 사용되어 왔다. 여러 실험 시스템에서, 에쿼린의 발광이 세포 로딩 수시간 내지 수일 후에 검출되었다. 에쿼린은 또한 세포 기능 또는 배아 발달을 붕괴시키지 않는 것으로도 공지되어 있다.

에쿼린의 Ca^{2 +}-의존성 발광으로 인해, 에쿼린 복합체는 세포내 Ca^{2 +} 지시자로 광범위하게 사용되어 왔다. 에쿼레아 빅토리아 에쿼린은 특히 (1) 니코틴성의 콜린성 효능제에 대한 단일 부신 크롬친화세포의 분비 반응을 분석하고; (2) 심근 손상에서 Ca^{2 +} 방출의 역할을 해명하고; (3) 수정 동안 Ca^{2 +}의 대량 방출을 입증하고; (4) 병아리 근육모세포 발달에서 근소포체(Sarcoplasmic reticulum) Ca^{2 +} 펌프 발현의 조절을 연구하고; (5) 3 피코리터만큼 적은 주입 부피를 이용하여 마이크로피펫을 교정하는데 사용되어 왔다.

아포에쿼린은 약 22 kDa의 분자량을 갖는다. 아포에쿼린은 아포에쿼린 내의 이황화결합을 환원시킴으로써 에쿼린을 재생시키는데 사용될 수 있다. 칼슘이 로딩된 아포에쿼린은 결합된 기질을 함유하는 반응되지 않은 광단백질과 동일한 치밀한 스캐폴드 및 전체적인 폴딩 패턴을 보유한다.

해파리 에쿼레아 빅토리아로부터의 에쿼린의 통상적인 정제는 고된 추출 과정을 필요로 하거나 때때로 실질적으로 이종성이거나 연구 중인 유기체에 독성인 제조물을 필요로 한다. 2톤의 해파리는 통상적으로 약 125mg의 정제된 광단백질을 생성시킨다. 대조적으로, 재조합 에쿼린은 바람직하게는 유전공학처리된 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)로부터 아포에쿼린을 정제시킨 후, 순수한 코엘렌테라진을 이용한 시험관내에서의 에쿼린 복합체의 재구성에 의해 생성된다. 본 발명에 유용한 아포에쿼린은 기재되어 있고, 당업자에게 공지된 정제 체계 및/또는 합성을 통해 시중에서 입수 가능하다 (S. Inouye, S. Zenno, Y. Sakaki, and F. Tsuji. High level expression and purification of apoaequorin . (1991) Protein Expression and Purification 2, 122-126).

에쿼린은 코엘렌테레이트 에쿼레아 빅토리아로부터 분리된 CaBP이다. 에쿼린은 CaBP의 EF-핸드 패밀리에 속하며, 포유동물에서 CaPB와 밀접하게 관련된 EF-핸드 루프를 갖는다. 또한, 에쿼린은 Ca^{2 +}의 지시자로서 수년 동안 사용되었으며, 세포에 안전하고 내약성이 우수한 것으로 나타났다. 그러나, 현재까지 그 치료학적 가능성에 대한 연구는 조사되지 않았다. 에쿼린은 2개의 구성요소로 구성되었다 - 칼슘 결합 구성요소 아포에쿼린 (AQ) 및 화학발광 분자 코엘렌테라진. 이 단백질의 AQ 부분이 칼슘 결합 도메인을 함유하기 때문에, AQ는 본 연구에 사용되었다.

본 실험을 위해, 본 발명자들은 급성 해마 뇌 슬라이스에서 전 허혈(global ischemia)의 시험관내 모델을 사용하였다. 급성 해마 슬라이스에서, OGD-유도된 손상은 시험관내에서 관찰된 것과 유사한 해마의 영역 CA1에서 가장 명백하다. 급성 해마 슬라이스는 세포 배양 및 생체내 모델의 사용에 비해, 조직 형태가 온전한 동물로부터 비교적 변화되지 않으며, 세포외 이온 농도 및 신경전달물질의 방출이 생체내에서 보고된 것과 유사하며, 생체내에서 제어될 수 없는 혈관 또는 다른 전신 반응이 존재하지 않는다는 점을 포함한 많은 이점을 제공한다. 급성 슬라이스에서 OGD 후 뉴런 손상은 처음 30분의 재관류 이내에 나타나지만, 슬라이스의 짧은 수명으로 인해, 허혈의 단지 초기 변화만이 분석될 수 있다. 해마 뉴런은 허혈 후 세포사에 취약하기 때문에, 본 발명자들은 해마 내로의 직접적인 AQ의 주입이 허혈성 손상 전에 투여될 경우 신경보호성일 것이라는 가설을 시험하였다.

본 발명은 일반적으로, 대상체에서 칼슘 균형을 바로잡거나 유지하기 위한 그러한 대상체로의 아포에쿼린-함유 조성물의 투여에 관한 것이다. 혈장 및 체액에서 이온 칼슘 농도의 유지는 뉴런 흥분성, 근육 수축, 막 투과성, 세포 분열, 호르몬 분비, 뼈 무기질침착, 또는 허혈 후의 세포사의 예방을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 광범위한 신체 기능에 중요한 것으로 이해된다. 칼슘 항상성의 붕괴, 즉, 칼슘 불균형은 많은 질병, 증후군 및 질환을 초래하고/하거나 이와 관련이 있는 것으로 이해된다. 예시적인 질병, 증후군 및 질환은 수면의 질, 활력의 질, 기분의 질, 기억의 질 및 동통 지각과 관련된 것을 포함한다. CaBP의 연구는 적절한 이온 칼슘 수준의 유지에서 작용하는 보호 인자로서 인지로 이어졌다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 신경보호를 제공하고, 뉴런 염증의 진행을 지연시키고, 뉴런 염증의 발생을 방지하고, 뉴런 염증의 재발을 예방하고/하거나 치료하기 위해 단독 활성 성분으로서 아포에쿼린을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 공지된 치료학적 또는 뉴트라슈티컬 가치를 갖는 하나 이상의 추가 작용제와 조합된 아포에쿼린을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용되는 용어 "치료하는"은 예방 뿐만 아니라 장애 이장성(remittent) 치료를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "감소시키는", "완화시키는", "억제하는" 및 "저해하는"은 이의 완화 또는 감소의 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본원에서 사용되는 용어 "진행"은 범위 또는 중증도가 증가하거나, 진전되거나, 성장하거나, 악화되는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "재발"은 경감 후의 질병의 복귀를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "투여하는"은 환자, 조직, 기관 또는 세포가 아포에쿼린과 접촉하게 되는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 투여는 시험관내, 즉 시험 튜브 내, 또는 생체내, 즉 살아있는 유기체, 예를 들어, 인간의 세포 또는 조직에서 달성될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에서 유용한 조성물을 환자 또는 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 본원에서 동등하게 사용되는 "환자" 또는 "대상체"는 (1) 아포에쿼린의 투여에 의해 구제되거나 치료되는 뉴런 염증을 갖거나, (2) 아포에쿼린을 투여함으로써 예방되는 뉴런 염증에 민감한 포유동물, 바람직하게는 인간을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량"은 과도한 부작용 효과, 예를 들어, 독성, 자극 또는 알레르기 반응 없이 요망되는 치료학적 반응을 발생시키기에 충분한 활성제의 양을 의미한다. 특정 "유효량"은 치료되는 특정 질환, 환자의 신체 조건, 치료되는 동물의 유형, 치료 기간, 동시 치료(존재시)의 특성, 및 사용되는 특정 제형 및 화합물 또는 이의 유도체의 구조와 같은 요인에 따라 명백하게 다양할 것이다. 이러한 경우, (1) 뉴런 염증의 예방, 및 (2) 뉴런 염증의 역전 또는 안정화 중 하나 이상을 발생시키는 경우의 양이 치료적으로 유효한 것으로 간주될 것이다. 최적의 유효량은 통상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

대상체에 경구 투여하기 위한 특정한 바람직한 조성물에서, 아포에쿼린은 바람직하게는 캡슐 형태의 용량인 약 10 mg/용량의 투여량으로 적어도 하나의 허용가능한 담체와 함께 제형화되고, 대상체에 대해 권고되는 투여량은 약 10 mg/일(즉, 하루당 1개의 캡슐)이다.

본 발명에 따른 조성물은 액체, 또는 동결건조되거나 달리 건조된 제형을 포함하고, 다양한 완충제 함량(예를 들어, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석제, 표면으로의 흡착을 방지하기 위한 알부민 또는 젤라틴과 같은 첨가제, 세정제(예를 들어, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, 담즙산염), 가용화제(예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 메타비설파이트), 보존제(예를 들어, 티메로살, 벤질 알코올, 파라벤), 벌킹(bulking) 물질 또는 긴장성 개질제(예를 들어, 락토오스, 만니톨), 단백질로의 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체의 공유 부착, 금속 이온과의 복합체형성, 또는 중합체 화합물, 예를 들어, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 하이드로겔의 미립자 제조물 내로 또는 상으로, 또는 리포솜, 마이크로에멀젼(microemulsion), 마이셀(micelle), 라멜라(lamellar) 또는 멀티라멜라 소포, 적혈구 허깨비(erythrocyte ghost) 또는 스페로플라스트(spheroplast)로의 물질 상으로의 혼입을 포함한다. 이러한 조성물은 신체 상태, 가용성, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 청소 속도에 영향을 미칠 것이다. 조절 또는 지속 방출 조성물은 친지질성 데포(depot)(예를 들어, 지방산, 왁스, 오일) 중의 제형을 포함한다.

중합체(예를 들어, 폴록사머 또는 폴록사민)로 코팅된 미립자 조성물을 투여하는 방법이 본원에 또한 포함된다. 조성물의 다른 구체예는 비경구, 폐, 비 및 경구를 포함하는 다양한 투여 경로를 위한 미립자 형태의 보호 코팅, 프로테아제 억제제 또는 투과 향상제를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 비경구, 파라캔서(paracancerally), 경점막, 근내, 정맥내, 피내, 피하, 복막내, 뇌실내, 두개내 또는 종양내 투여된다.

추가로, 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이는 0.01-0.1M, 바람직하게는 0.05M 포스페이트 완충액 또는 0.9% 염수를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 및 에멀젼일 수 있다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브유 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 물, 알코올성 용액/수용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어, 염수 및 완충 매질을 포함한다.

비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거액 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거액 및 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충물, 전해질 보충물, 예를 들어, 링거액 덱스트로오스에 기반한 것 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 콜레이팅(collating) 작용제, 비활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다.

본 발명의 아포에쿼린-함유 조성물은 주사가능한 담체 시스템과의 조합된 아포에쿼린을 포함하는, 주사가능한 약제학적 투약 형태로 제형화될 경우 특히 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, 주사용 및 주입용 투약 형태 (즉, 비경구 투약 형태)는 활성 약물 물질을 캡슐화하는 인지질을 갖는 지질 이중층 소포 또는 리포좀의 주사가능한 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 주사는 비경구용으로 사용하기 위한 멸균 제조물을 포함한다.

USP에 의해 규정된 바와 같이 5개의 다른 부류의 주사가 존재한다: 에멀젼, 지질, 분말, 용액 및 현탁액. 에멀젼 주사는 비경구 투여되도록 의도된 멸균의 피로겐-비함유 제조물을 포함하는 에멀젼을 포함한다. 용액 주사용의 지질 복합물 및 분말은 비경구용 용액을 형성시키기 위해 재구성되도록 의도된 멸균 제조물이다. 현탁액 주사용의 분말은 비경구 사용을 위한 현탁액을 형성시키기 위해 재구성되도록 의도된 멸균 제조물이다. 리포좀의 현탁액 주사용의 동결건조된 분말은 비경구 사용을 위해 재구성되도록 의도된 멸균의 동결건조된 제조물이며, 이는 수성 공간중에 또는 지질 이중층내에 활성 약물 물질을 캡슐화하는데 사용된 인지질을 갖는 지질 이중층 소포와 같은 리포좀의 혼입을 허용하는 방식으로 제형화되며, 이렇게 하여 제형이 재구성시 형성될 수 있다. 용액 주사용의 동결건조된 분말은 동결건조 (lyophilization) ("동결건조 (freeze drying)")에 의해 제조된, 용액용으로 의도된 투약 형태이며, 이렇게 하여, 공정은 극히 낮은 압력에서 냉동 상태의 생성물로부터 물을 제거하는 것을 포함하며, 이에 의해, 액체의 후속 첨가는 주사에 대한 모든 요구 사항을 따르는 용액을 생성시킨다. 현탁액 주사용의 동결건조된 분말은 적합한 유체 매질중에 현탁된 고형물을 함유하는 비경구용으로 의도된 액체 제조물이며, 이는 멸균 현탁액에 대한 모든 요구 사항을 따르며, 이렇게 하여 현탁액용으로 의도된 약제는 동결건조에 의해 제조된다. 용액 주사는 주사에 적합한, 적합한 용매 또는 상호 혼화성인 용매들의 혼합물에 용해된 하나 이상의 약물 물질을 함유하는 액체 제조물을 포함한다. 용액 농축물 주사는 비경구 사용을 위한 멸균 제조물을 포함하며, 이는 적합한 용매의 첨가시, 주사에 필요한 모든 요건을 따르는 용액을 생성시킨다. 현탁액 주사는 액체 상 전반에 걸쳐 분산된 고체 입자를 함유하는 액체 제조물 (주사에 적합함)을 포함하며, 이때 입자는 불용성이며, 이에 의해, 오일상은 수성상 전반에 걸쳐 분산되거나, 그 반대로 분산될 수 있다. 현탁액 리포좀 주사는 리포좀 (수성 공간중에 또는 지질 이중층내에 활성 약물 물질을 캡슐화하는데 사용된 인지질을 일반적으로 함유하는 지질 이중층 소포)이 형성되는 그러한 방식으로 수성상 전반에 걸쳐 분산된 오일상을 갖는 액체 제조물 (주사에 적합함)이다. 초음파 처리된 현탁액 주사는 액체상 전반에 걸쳐 분산된 고체 입자를 함유하는 액체 제조물 (주사에 적합함)이며, 이때, 입자는 불용성이다. 또한, 기체가 현탁액을 통해 버블링되어 고체 입자에 의한 미소구체의 형성을 유도할 때 생성물은 초음파 처리될 수 있다.

비경구 담체 시스템은 하나 이상의 약학적으로 적합한 부형제 예컨대, 용매 및 공-용매, 가용화제, 습윤제, 현탁제, 증점제, 에멀젼화제, 킬레이트화제, 완충제, pH 조절제, 항산화제, 환원제, 항균성 보존제, 벌크제, 보호제, 긴장성 조정제, 및 특별한 첨가제를 포함한다.

본 발명에 따라 투여가능한 조절 또는 지속 방출 조성물은 친지질성 데포(예를 들어, 지방산, 왁스, 오일) 중의 제형을 포함한다. 중합체(예를 들어, 폴록사머 또는 폴록사민)로 코팅된 미립자 조성물, 및 조직 특이적 수용체, 리간드 또는 항원에 대해 유도된 항체에 커플링되거나 조직 특이적인 수용체의 리간드에 커플링된 화합물이 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명에 따라 투여되는 조성물의 다른 구체예는 비경구, 폐, 비, 안구 및 경구를 포함하는 다양한 투여 경로를 위한 미립자 형태, 보호 코팅, 프로테아제 억제제 또는 투과 향상제를 포함한다.

폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린과 같은 수용성 중합체의 공유 결합에 의해 변형된 화학적 존재물이 상응하는 변형되지 않은 화합물 보다 정맥내 주사 후에 혈액에서 실질적으로 더 긴 반감기를 나타내는 것으로 공지되어 있다. 이러한 변형은 또한 수용액 중에서의 화학적 존재물의 가용성을 증가시키고, 응집을 배제시키고, 화합물의 물리적 및 화학적 안정성을 향상시키고, 화합물의 면역원성 및 반응성을 크게 감소시킬 수 있다. 그 결과, 변형되지 않은 존재물보다 덜 빈번하거나 낮은 용량으로 상기 중합체-존재물 앱덕트(abduct)를 투여함으로써 요망되는 생체내 생물학적 활성이 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 또 다른 방법에서, 조성물은 조절 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 작용제는 정맥내 주입, 이식가능한 삼투 펌프, 경피 패치, 리포솜, 또는 다른 투여 방식을 이용하여 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 펌프가 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 중합 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 조절 방출 시스템이 치료 표적, 즉, 뇌에 근접하여 배치되어, 전신 용량의 단지 분획만이 요구될 수 있다.

조성물은 아포에쿼린 단독을 포함하거나, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있고, 고체 또는 액체 형태, 예를 들어, 정제, 분말, 캡슐, 펠렛, 용액, 현탁액, 엘릭서(elixir), 시럽, 음료, 에멀젼, 젤, 크림, 안구 제형, 또는 좌약, 예를 들어, 직장 및 요도 좌약일 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 또한 검, 전분, 당, 셀룰로오스 물질, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 아포에쿼린을 함유하는 조성물은, 예를 들어, 펠렛의 피하 이식에 의해 환자에 투여될 수 있다. 한 추가 구체예에서, 펠렛은 일정 기간에 걸친 아포에쿼린의 조절 방출을 제공한다. 조성물은 또한 액체의 정맥내, 동맥내, 근내 주사, 액체 또는 고체의 경구 투여, 또는 국소 적용에 의해 투여될 수 있다. 투여는 또한 직장 좌약 또는 요도 좌약의 사용에 의해 달성될 수 있다.

본 발명에 의해 투여가능한 조성물은 공지된 용해, 혼합, 과립화 또는 정제 형성 방법에 의해 제조될 수 있다. 경구 투여를 위해, 아포에쿼린 및 이의 생리학적으로 용인되는 유도체, 예를 들어, 염, 에스테르, N-옥시드 등이 상기 목적을 위해 통상적인 첨가제, 예를 들어, 비히클, 안정화제 또는 비활성 희석제와 혼합되고, 통상적인 방법에 의해 투여에 적합한 형태, 예를 들어, 정제, 코팅된 정제, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 수성, 알코올성 또는 오일성 용액으로 전환된다.

적합한 비활성 비히클의 예는 아카시아, 옥수수전분, 젤라틴과 같은 결합제, 또는 옥수수전분, 감자 전분, 알긴산과 같은 붕해제, 또는 스테아르산 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제와 조합된 락토오스, 수크로오스 또는 옥수수전분과 같은 통상적인 정제 베이스(base)이다.

적합한 오일성 비히클 또는 용매의 예는 식물성 또는 동물성 오일, 예를 들어, 해바라기유 또는 생선-간 오일이다. 조성물은 건조 및 습윤 과립 둘 모두로 달성될 수 있다. 비경구 투여(피하, 정맥내, 동맥내 또는 근내 주사)를 위해, 화학적 존재물 또는 이의 생리학적으로 용인되는 유도체, 예를 들어, 염, 에스테르, N-옥시드 등이, 요망시 상기 목적에 적합하고 통상적인 물질, 예를 들어, 가용화제 또는 다른 보조제와 함께 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 전환된다.

예로는 계면활성제 및 다른 약학적으로 허용되는 애쥬번트가 첨가되거나 첨가되지 않은 멸균 액체, 예를 들어, 물 및 오일이다. 예시적인 오일은 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유 또는 광유이다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로오스 및 관련 당 용액, 및 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 특히 주사용 용액을 위한 바람직한 액체 담체이다.

활성 성분을 함유하는 조성물의 제조는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 비강인두로 전달되는 에어로졸 또는 주사물질로 제조될 수 있으나, 주사 중의 용액, 또는 주사 중의 현탁액, 주사 전의 액체에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 조성물은 또한 에멀젼화될 수 있다. 활성 치료 성분은 약학적으로 허용되고 활성 성분과 양립되는 부형제와 종종 혼합된다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등 또는 이들의 조합물을 포함한다. 또한, 조성물은 활성 성분의 효과를 향상시키는 소량의 보조 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충제를 함유할 수 있다.

활성 성분은 중화된 약학적으로 허용되는 염 형태로서 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 무기산, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어, 아세트산, 타르타르산, 만델산 등과 함께 형성되는 산부가염을 포함한다. 자유 카르복실기로부터 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제이철, 및 유기 염기, 예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다.

예를 들어, 크림, 젤, 점적 등을 이용한 신체 표면으로의 국소 투여를 위해, 아포에쿼린 또는 이의 생리학적으로 용인되는 유도체가 약학적 담체를 갖거나 갖지 않는 생리학적으로 허용되는 희석제 중의 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 제조되고 적용된다.

본 발명에 따른 또 다른 방법에서, 활성 성분은 비히클, 특히 리포솜 중에서 전달될 수 있다(문헌: [Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., pp.353-365 (1989)] 참조).

아포에쿼린의 염은 바람직하게는 약학적으로 허용되는 염이다. 그러나, 다른 염이 본 발명에 따른 조성물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 제조에 유용할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 아포에쿼린의 용액을 약학적으로 허용되는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 메탄설폰산, 푸마르산, 말레산, 석신산, 아세트산, 벤조산, 옥살산, 시트르산, 타르타르산, 탄산 또는 인산의 용액과 혼합시킴으로써 형성될 수 있는 산부가염을 포함한다.

또한, 본원에 기재된 아포에쿼린 함유 조성물은 뉴런 염증의 다양한 유해한 효과의 발생을 예방하거나 이러한 효과를 감소시키거나, 안정화시키는 뉴트라슈티컬 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서의 목적상 용어 "뉴트라슈티컬" 또는 "뉴트라슈티컬 조성물"은 질병의 예방 및/또는 치료를 포함하는 의료 보건 이점을 제공하는 식품 또는 식품의 일부를 의미한다. 본 발명에 따른 뉴트라슈티컬 조성물은 활성 성분으로서 아포에쿼린만 함유할 수 있거나, 대안적으로 물질의 전체 섭취를 증가시킴으로써 식이를 보충하는 비타민, 조효소, 광물, 초본(herb), 아미노산 등을 포함하는 식이성 보충물과 혼합되어 이들을 추가로 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명은 환자에게 아포에쿼린을 함유하는 뉴트라슈티컬 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 환자에게 뉴트라슈티컬의 이점을 제공하는 방법을 제공한다. 이러한 조성물은 일반적으로 본원에서 언급되는 바와 같이 경구 경로에 적합한 상기 언급된 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 경구 전달에 적합한 임의의 담체인 "뉴트라슈티컬 허용가능 담체"를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 뉴트라슈티컬 조성물은 기능을 기초로 하여 규정된 면역증강제, 항염증제, 항산화제, 항바이러스제 또는 이의 혼합물을 포함하는 식이성 보충물을 포함한다.

면역증강제 및/또는 항바이러스제가 상처 치유를 가속화시키고 개선된 면역 기능에 유용하고; 이들은 콘플라워(coneflower), 또는 에키나세아(Echinacea) 속의 초본으로부터의 추출물, 삼부카(Sambuca) 속의 초본으로부터의 추출물, 및 골든실(Goldenseal) 추출물을 포함한다. 아스트라갈루스(Astragalus) 속의 초본이 또한 이의 천연 형태 또는 가공된 형태에서 효과적인 면역증강제이다. 아스트라갈루스는 골수 및 림프 조직 활성 면역세포에서 줄기 세포의 발달을 자극한다. 아연 및 이의 생물활성 염, 예를 들어, 아연 글루코네이트 및 아연 아세테이트가 또한 통상적인 감기의 치료에서 면역증강제로 작용한다.

항산화제는 혈액에서 항산화 효소의 수준을 증가시키는 작용을 하는, 천연의 황 함유 아미노산인 알리신을 포함한다. 알리신을 함유하는 초본 또는 초본 추출물, 예를 들어, 마늘이 또한 효과적인 항산화제이다. 카테킨, 및 카테킨을 함유하는 녹차와 같은 초본의 추출물이 또한 효과적인 항산화제이다. 아스트라갈루스 속의 추출물은 또한 항산화 활성을 나타낸다. 케르세틴(quercetin), 헤스페리딘(hesperidin), 루틴(rutin) 및 이들의 혼합물과 같은 바이오플라보노이드(bioflavonoid)가 또한 항산화제로서 효과적이다. 바이오플라보노이드의 주요한 이로운 역할은 체내에서 비타민 C를 산화로부터 보호할 수 있다는 점이다. 이는 신체가 비타민 C 또는 아스코르브산을 더욱 이용가능하게 만든다.

바이오플라보노이드, 예를 들어, 케르세틴은 또한 효과적인 항염증제이고, 이는 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 식물 또는 초본으로부터 유래된 항염증성 초본 보충물 및 항염증성 화합물은 또한 본 발명의 조성물에서 항염증제로 사용될 수 있다. 이는 파인애플에서 발견되는 단백질분해성 효소인 브로몰라인(bromolain); 스팅잉 네틀(stinging nettle)의 차 및 추출물; 심황의 추출물인 튜메릭(turmeric), 또는 튜메릭으로부터 분리된 황색 색소인 커큐민(curcumin)을 포함한다.

본 발명에 사용될 수 있는 또 다른 보충제는 징지버(Zingiber) 속의 초본으로부터 유래된 생강이다. 이는 징제롤(gingerol) 및 관련 화합물 쇼가올(shogaol)과 같은 화합물로 인해 강심 활성을 지니고, 어지럼증 및 전정 질환의 치료에 이점을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 생강은 또한 구역 및 다른 위 질환의 치료에 효과적이다.

연조직 구조 복구, 특히 연골 복구를 돕는 보충제가 관절염 및 다른 관절 장애의 동통을 치료하기 위한 조성물에 유용하다. 글루코사민, 글루코사민 설페이트, 콘드로이틴이 다양한 공급원, 예를 들어, 엘크인 벨벳 앤틀러 (Elk Velvet Antler)로부터 유래될 수 있다. 해양 지질 복합체인 오메가 3 지방산 복합체, 및 물고기 오일이 또한 관절염과 관련된 동통을 치료하는데 유용한 것으로 공지되어 있다.

편두통을 치료하는데 유용한 보충제는 화란국화(feverfew) 및 징코 빌로바(Gingko biloba)를 포함한다. 화란국화의 주요 활성 성분은 이후의 혈관 내에서의 혈관경축 활성을 통해 동통을 초래하는 프로스타글란딘의 분비를 억제하는 세스퀴테르펜 락톤 파르테놀라이드이다. 화란국화는 또한 항염증 특성을 나타낸다. 혈소판 안정화 및 항혈관경축 작용으로 인해 물고기 오일이 또한 편두통을 치료하는데 유용할 수 있다. 초본 징코 빌로바는 또한 동맥을 안정화시키고, 혈액 순환을 개선시킴으로써 편두통의 치료를 돕는다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 고려하여 더욱 충분히 이해될 것이다.

실시예

실시예 1. 아포에쿼린으로의 전처리는 산소-글루코오스 결핍으로부터 해마 CA1 뉴런을 보호한다.

재료 및 방법

대상체

대상체는 142마리 성체 수컷 F344 쥐 (평균 월령 4.0 ± 0.1 mo.; Harlan)이다. 대상체는 실험동물관리평가인증 협회 (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care: AAALAC) 승인된 시설에서 14시간 명-10시간 암 사이클로 유지시키고, 식량과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 개별적으로 하우징시켰다.

수술

수술 전 적어도 하루 동안 및 수술 후 2일 동안 쥐에 이부프로펜 물 (15 mg/kg/일)을 제공하였다. 수술 당일에, 쥐를 이소플루란으로 마취시키고, 입체 정위 장치에 탑재시켰다. 무균 상태하에서, 양쪽 26-게이지 스테인레스 강철 가이드 캐뉼라를 등쪽 해마 (브레그마 대비: AP -3.5 mm, L ± 2.6 mm, V -3.0 mm)에 이식하였다. 캐뉼라는 스테인레스 강철 스크류와 아크릴 시멘트로 두개골에 고정하였다. 스테인레스 강철 캡을 폐색을 방지하기 위해 가이드 캐뉼러에 넣고, 쥐를 주입 전 적어도 7일에 회복되게 하였다.

해마내 주입

에쿼린 단백질은 2개의 구성요소인 아포에쿼린 및 코엘렌테라진으로 구성된다. 아포에쿼린 구성요소 (AQ)는 Ca^{2 +}에 결합하는 EF-핸드를 함유하며 [51], 따라서 본 연구에 사용된 구성요소이다. 쥐에게 제로 Ca^{2 +} 인공 뇌척수액 (aCSF; mM: 124.00 NaCl, 2.80 KCl, 2.00 MgSO₄, 1.25 NaH₂PO₄, 26.00 NaHCO₃, 10.00 D-글루코오스 및 0.40 Na-아스코르베이트) 중의 AQ를 주입하였으며, 상기 뇌척수액은 또한 6% DMSO를 함유하여 AQ의 뉴런 흡수를 촉진한다. 쥐에 60초에 걸쳐 양쪽 주입 (0.5 μl/반구)을 수행하고, 팁에서 멀리 확산되게 하기 위해 주입 캐뉼러를 추가로 2분 동안 그대로 유지시켰다. 33-게이지 주입 캐뉼러를 가이드 캐뉼러를 넘어 0.5 mm 연장되도록 절단하였다. AQ의 용량-의존적 신경보호를 측정하기 위해, 동물의 한쪽 반구 (카운터밸런스)에는 0.4, 1 또는 4% AQ (w/v; Quincy Bioscience, Madison, WI)를 주입하고, 나머지 한쪽에는 비히클을 주입하였다. 또한, 쥐의 서브셋의 양쪽 반구에 비히클 (0% AQ)을 주입하여 대조군 (각 군에 있어서 n=11)으로서 제공하였다.

슬라이스 제조

허혈의 급성 뇌 슬라이스 모델에 대한 AQ의 신경보호 효과를 측정하기 위해, 94마리의 수컷 F344 쥐를 사용하였다 (평균 월령 4.4 ± 0.2 mo.). 뇌 슬라이스를 대조군 쥐 (0% AQ, n = 10)로부터 또는 주입 후 하기 시점 중 하나에서 AQ를 주입한 쥐로부터 상기 기술된 바와 같이 준비하였다: 1시간 (n = 10), 1일 (n = 10), 2일 (n = 10), 3일 (n = 10), 또는 5일 (n = 5). 간략하게는, 쥐를 이소플루란으로 깊게 마취시키고, 오름 대동맥을 통해 빙냉의 산소화된 (95% O₂/5% CO₂) 수크로오스-CSF (mM: 206.00 수크로오스, 2.80 KCl, 2.00 MgSO₄, 1.25 NaH₂PO₄, 1.00 CaCl₂, 1.00 MgCl₂, 26.00 NaHCO₃, 10.00 D-글루코오스, 및 0.40 Na-아스코르베이트)를 관류시키고, 뇌를 신속히 제거하고, 빙냉 산소화된 수크로오스-CSF에 위치시켰다. 뇌는 캐뉼라의 부위 근처에서 막혔으며, 400 μm 두께의 관상 슬라이스를 이전에 기술된 바와 같이 온도-제어된 바이브라톰 (Vibratome) 상에서 절단하였다. 캐뉼라 배치 바로 뒤쪽에 (그리고, 임의의 보이는 캐뉼라 트랙이 없는) 처음 5개 슬라이스만을 수집하고 하기 기술된 실험에 사용하였다. 슬라이스를 산소화된(95% O₂/5% CO₂), aCSF (조성 (mM): 124.00 NaCl, 2.80 KCl, 2.00 MgSO₄, 1.25 NaH₂PO₄, 2.00 CaCl₂, 26.00 NaHCO₃, 10.00 D-글루코오스, 및 0.40 Na-아스코르베이트)에 잠긴 메쉬 네트 상에서 35℃에서 인큐베이션하였다. 1시간 회복 후, 슬라이스를 5분간 산소-글루코오스 결핍 (OGD) 처리하여 허혈을 유도하였다. OGD는 슬라이스를 95% N₂/5% CO₂ (O₂가 N₂로 대체됨)로 버블링된 프룩토오스-CSF (글루코오스를 등몰 농도의 프룩토오스로 대체시킴)의 35℃ 용액으로 슬라이스를 옮김으로써 유도되었다. OGD 후, 슬라이스는 30분의 재관류를 위해 산소화된 aCSF 플러스 0.2% 트리판 블루 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 함유한 35℃ 용액으로 옮겼다. 트리판 블루는 죽은 세포와 죽어가는 세포를 관통하고 이들을 청색으로 염색하는 반면, 살아있는 세포는 염색하지 못한다. 이어서, 슬라이스를 실온에서 산소화된 aCSF로 간단히 헹구고, 냉장고에서 밤새 10% 중성 완충된 포르말린에서 즉각 고정시켰다. 슬라이스를 최소 1일 동안 30% 수크로오스와 한랭보호시키고, 그 후 이들을 냉동미세절단기에서 40 μm로 세분화시키고, 젤라틴-코팅된 슬라이드 상에 탑재시키고, 증가하는 알코올 단계에서 탈수시키고, 퍼마운트(Permount)로 덮개를 씌웠다.

세포 계수

슬라이스를 디지털 카메라 (Olympus DP70) 및 10X 대물 렌즈가 장착된 직립 현미경 (Olympus BX51) 하에서 검사하였다. 각 40 μm 서브섹션 내에서 CA1 세포 체층 (치아 이환의 상부 블레이드 끝에서)의 사진을 찍었다. 초기 해마 슬라이스 제조 결과로서 뉴런 손상으로 인한 과도한 염색을 피하기 위해, 단지 내부 서브섹션만을 분석을 위해 촬영하였다. 이어서, 처리 조건에 대해 맹검 상태로 개체가 전체 이미지에 걸쳐 위치한 트리판 블루 염색된 뉴런의 수를 세었다. 데이터는 단지 하나의 서브섹션으로부터 계수되었다. 신경보호 퍼센트는 AQ-처리된 반구로부터 비히클-처리된 반구까지의 데이터를 표준화함으로써 각 동물에 대해 평가하였다.

웨스턴 블롯 분석

AQ가 주입 후 등쪽 해마에 얼마나 오래 잔존하는지를 측정하기 위해, 24마리의 성체 수컷 F344 쥐 (평균 월령 4.2 ± 0.1 mo.)의 양쪽 반구 모두에 4% AQ를 주입하였다. 쥐를 주입 후 1h (n = 4), 1d (n = 7), 2d (n = 7), 또는 3d (n = 6)에 과량의 이소플루란으로 마취시키고, 뇌를 제거하고, 드라이아이스에 급속 동결시키고, -80℃에서 보관하였다. 각 쥐로부터 2개의 양측 뇌 영역 (등쪽 해마 및 배쪽 해마; 각각 dhpc 및 vhpc)을 해부 절개하여 각각 균질화시켰다. 샘플을 4000rpm에서 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 브래드포드 단백질 검정 키트 (Bradford protein assay kit) (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 측정하였다. 단백질 샘플을 표준화시키고 (50 또는 150 μg/레인), SDS-PAGE (10%)에 대해 로딩하였다. 단백질을 반건조 이동 장치 (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 PVDF 막 상으로 옮겼다. 이어서 막을 차단 완충액 (3% 탈지 분유)에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, 그 후 이들을 1차 항체 (밤새 4℃; 1:5000 마우스 항-에쿼린 [Millipore, Billerica, MA] 또는 1:1000 토끼 항-β-액틴 [Cell Signaling Technology, Boston, MA]) 이어서, 2차 항체 (90분; 1:5000 염소 항-마우스 [Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA] 또는 1:5000 염소 항-토끼 [Millipore])에서 인큐베이션하였다. 이어서, 막을 세척하고 (트리스-완충된 염수 중 0.05% Tween-20), 화학발광 용액 (Santa Cruz Biotechnology)에 넣고 자동방사 필름 (Hyperfilm MP)에 노출시켰다. 이미지를 촬영하고, 밀도계측을 NIH Image J Software를 사용하여 수행하였다. 밴드의 광학 밀도 값 (각 레인의 배경을 뺀 것)이 배쪽 해마 밴드의 평균보다 2개 표준 편차를 초과하는 경우 밴드는 양성으로 간주되었다. 이러한 정량화로부터, 1시간 밴드의 100%, 1일 밴드의 83%, 2일 밴드의 29%, 3일 밴드의 0%, 및 vhpc 레인의 0%에서 양성 밴드가 관찰되었다. 복부 해마와 비교를 수행하였는데, 이는 AQ를 함유하지 않아야 하는 인접한 뇌 구조이며, 따라서 음성 대조군 구조로서 사용되기 때문이다.

정량적 RT- PCR

상기 설명한 바와 같이 12마리의 수컷 쥐 (각각 3.8 mo.)에 4% AQ를 한쪽에 주입하였고, 조직을 주입 후 1시간, 1일 또는 2일에 수집하였다 (군 당 n = 4). 해마를 절제하고 즉시 TRIzol 시약 (Life Technologies Corp., Carlsbad, California)에 넣었다. 조직을 25-게이지 바늘과 주사기를 사용하여 균질화하고 샘플을 RNA 분리까지 -80℃에서 보관하였다. TRIzol 방법 (Life Technologies Corp, Carlsbad, CA)을 사용하여 모든 조직으로부터의 RNA 분리를 제조사의 지시에 따라 동시에 수행하였다. 분리된 RNA를 50 μl RNase 비함유 H₂O에 용해시키고, RNA 순도를 260nm 및 280nm의 흡광도 비에 기초하여 계산하였다. 1.8에서 2.1 사이로 판독되는 흡광도는 역전사로 진행하기에 충분히 순수한 것으로 간주되었다. 1.8 미만의 비율로 존재하는 샘플을 제조자의 지시에 따라 퀴아겐 알엔에아지 민엘루트 클린업 키트 ( Qiagen RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, Valencia, CA))를 사용하여 추가로 정제하고, 정제된 RNA를 50 μl의 RNase 비함유 H₂O에 재현탁시켰다. 모든 샘플의 총 RNA를 퀴아겐 RT2 HT 퍼스트 스트랜드 키트-96 (Qiagen RT2 HT First Strand Kit-96 (Qiagen))을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 스텝원 이얼 타임 PCR (StepOne Real Time PCR) 시스템과 소프트웨어 (Life Technologies Corp., Carlsbad, California)에 RT² SYBR Green qPCR 마스터맥스 (Qiagen)와 쥐 IL-10 및 β-액틴(RT2 qPRC Primer Assay, Qiagen)에 특이적인 프라이머를 사용하여 96-웰 플레이트에서 3중으로 증폭시켰다. 비히클 처리에 비해 AQ 처리에 의한 IL-10 유전자 발현의 변화는 Pfaffl 방정식을 사용하여 계산하였고, 각 시점에서 상응하는 샘플에서 β-액틴 발현으로 표준화시키고, 각 쥐로부터 분리된 비히클-처리된 해마와 비교하였다. 프라이머 효율은 IL-10 및 β-액틴에 대해 무작위로 선택된 두개 샘플의 희석 곡선에 기초하여 계산하였다. β-액틴 발현은 aCSF가 주입된 조직과 비교할 경우 AQ 주입에 의해 변화되지 않았으며, 이는 AQ 주입이 일반적으로 또는 비특이적으로 유전자 전사에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.

유전자 발현 어레이

cDNA를 RT-PCR에 사용된 쥐로부터 취하였다 (방법 참조). PCR 분석은 염증성 사이토킨 및 수용체의 전반적인 유전자 마커에 중점을 두고 있으며, 퀴아겐의 RT2 프로파일러 어레이 (RT2 Profiler Arrays)를 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단하게는, 2X RT2 SYBR 그린 마스터믹스 (2X RT2 SYBR Green Mastermix), cDNA (상기 참조) 및 RNase-비함유 물을 혼합하고, 25 μl의 이 혼합물을 96-웰 PCR 프로파일러 어레이 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 샘플을 스텝원 리얼 타임 PCR 시스템 및 소프트웨어를 사용하여 진행시키고, 다중 용융 곡선을 갖는 이들 샘플을 분석에서 제외시켰다 (n=2 배제됨). 평균에서 2개 표준 편차 대비 유전자 발현의 일반적인 다양성으로 인해, 연구에서 한 마리의 동물을 완전히 배제시켜야 했다. 유전자 발현 변화는 퀴아겐의 웹-베이스드 RT2 프로파일러 PCR 어레이 어날리시스 소프트웨어 (Web-Based RT2 Profiler PCR Array Analysis Software) v3.5를 사용하여 계산하였다.

데이터 분석 및 통계

통계 분석은 스테이트뷰(Statview; v 5.0, SAS Institute, Inc., Cary, NC)를 사용하여 수행하였다. ANOVA를 사용하여 치료 효과를 평가하였다. Fisher의 PLSD는 사후 비교에 사용하였다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 보고된다.

결과

산소-글루코오스 결핍은 현저한 세포사를 초래한다.

급성 해마 슬라이스를 준비하고, 5분간 산소-글루코오스 결핍 (OGD)에 노출시키고, 이들을 트리판 블루를 함유하는 산소화된-aCSF로 옮겨 염색시켰다 (방법 참조). 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, OGD는 OGD 처리되지 않은 대조군 슬라이스와 비교하여 현저하게 더 많은 세포사를 초래하였다. 허혈성 또는 비허혈성 상태에서 트리판 블루-염색된 세포의 평균 수를 분석하는 ANOVA는 허혈의 통계학적으로 유의한 효과를 입증하였다 (F(1, 12) = 9.65, p < .01). 이러한 결과는, OGD가 해마의 CA1 영역에서 현저한 세포사를 초래함을 나타내는 이전 연구와 일치한다 [52].

아포에쿼린 처리로 인한 감소된 세포사

OGD 전에 아포에쿼린 (AQ)의 해마내 주입의 잠재적인 신경보호 효과를 조사하기 위해, 쥐에 OGD 전 24시간에 0, 0.4, 1, 또는 4% AQ를 주입하였다 (도 2A 참조). AQ는 용량-의존적 방식으로 신경보호성이어서, 허혈 전에 1% 또는 4% AQ의 해마내 주입이 비히클 (0% AQ) 주입과 비교하여 신경보호를 현저하게 증가시켰다 (F(3, 40) = 3.61, p < .05) (도 2B&C). 사후 분석은 1 또는 4% AQ의 주입이 0% AQ 군과 비교하여 신경보호를 현저하게 향상시키며 (p<.01), 0.4% AQ의 주입은 다른 군의 어느 것과도 통계적으로 차이가 나지 않음을 드러냈다. 신경보호의 양은 1% 및 4% AQ 처리 군 사이에 차이가 없다는 점이 또한 주목할 만하다.

AQ가 신경보호성임을 시간 경과에 따라 평가하기 위해, 쥐에 OGD 전의 다양한 시간 (1h, 1d, 2d, 3d, 또는 5d)에 4% AQ를 주입하였다 (도 3A). 원-웨이 ANOVA는 AQ의 해마내 주입이 후속 OGD로부터 뉴런을 보호하는 능력에 대한 시간의 유의한 효과가 있음을 나타냈다 (F(5, 49) = 3.35, p < .05). 사후 평가는 AQ의 신경보호 효과는 적어도 1일 나타나야 하고, 적어도 2일 지속됨을 나타냈다 (각 시점에 있어서 p < .05). 슬라이스를 AQ 주입 후 3일 또는 5일에 OGD로 처리할 경우 통계학적으로 유의한 신경보호가 관찰되지 않았다 (각각 p = .10 및 p = .47).

아포에쿼린의 웨스턴 블롯 분석

해마내 주입 후 등쪽 해마 내에 AQ가 얼마나 오래 잔존하는 지를 측정하기 위해, 4% AQ를 등쪽 해마로 양쪽 주입한 후 다양한 시간 (1h, 1d, 2d, 또는 3d)에서 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 AQ 단백질 수준을 측정하였다. 도 3C는 등쪽 해마 내에서 AQ가 주입 후 1h 및 1d에 존재하고, 2d에는 거의 볼 수 없으며, 3d에는 더 이상 존재하지 않음을 예시한다. 따라서, 1h 레인 100%, 1d 레인 83%, 2d 레인 29%, 및 3d 레인 0%로 양성 밴드가 관찰되었다. 예상대로, AQ는 배쪽 해마 (vhpc)에서는 검출되지 않았으며, 이는 주사 부위로부터 거리가 두고 제공된 음성 대조군 구조로서 사용되었다 (도 3C 참조). 매우 희미한 밴드도 시각화할 수 있도록 충분한 단백질이 겔에 로딩되는 것을 확실히 하기 위해, 웨스턴 블롯을 서브세트 동물에서 반복하였으며, 레인당 150 μg의 단백질 (레인당 일반적인 50 μg 대신)을 겔에 로딩하였다. 이들 블롯에서, 추가적인 밴드가 2- 및 3-일 레인을 통해 나타났으며, 2d의 57% 및 3d 레인의 25%는 양성 밴드를 가지며, 이는 AQ가 등쪽 해마 주입 후 최대 3일 동안 등쪽 해마 내에서 검출 가능함을 시사한다. 중요하게는, 샘플이 β-액틴에 대해 염색될 때 시간에 따른 변화는 관찰되지 않았으며, 이러한 차이는 단백질 함량의 일반적인 변화가 아니라 AQ의 존재시 시간-의존적 변화를 반영함을 시사한다 (도 3C 참조).

AQ-주입 후 사이토킨 및 케모카인 발현

단백질이 거의 존재하지 않는 시점에서 AQ의 해마내 주입이 유의적인 신경보호를 유발한다는 것은, AQ가 허혈성 손상으로부터 궁극적으로 뉴런을 보호하는 일부 캐스케이드 사건을 촉발시킬 수 있음을 시사한다. 하나의 가능성은 AQ가 전처리-유사 효과를 유도한다는 것이며, 이는 후속 시점에서의 감소된 세포사를 발생시킨다. 허혈성 전-처리는 짧은 허혈성 에피소드가 후속의 더욱 심한 허혈성 상해에 의해 초래된 손상을 약화시키는 현상이다. 최근의 증거는 다중의 사이토킨 및 케모카인이 허혈성 전치리와 관련됨을 보여주었다. 허혈성 전-처리와 사이토킨 생성의 변화 사이의 연관성을 고려하여, 본 발명자들은 AQ 주입이 사이토킨 또는 케모카인 발현의 증가로 이어질 수 있으며, 이는 후속 허혈성 손상을 견딜 수 있는 뉴런의 능력에 궁극적으로 영향을 미친다는 가설을 시험하였다. RT-PCR은 항-염증성 사이토킨 인터류킨-10 (IL-10)의 mRNA 변화를 조사하는데 이용되었으며, PCR 어레이는 AQ 주입 후 다중 유전자 발현 변화를 관찰하는데 이용되었다. 성체 쥐는 한쪽 반구에는 4% AQ 및 다른 쪽에는 비히클을 기술된 바와 같이 주입하였다 (방법 참조). AQ 주입 후 다양한 시간 (1h, 1d 또는 2d 후)에, 해마를 제거하고, 정량적 RT-PCR을 수행하여 시간- 및 처리-의존적 변화를 평가하였다. 원-웨이 ANOVA는 4개의 처리 군 사이의 현저한 차이를 나타냈다 (F(3, 19) = 9.55, p < .0005). 사후 분석은, IL-10 mRNA가 비히클-처리된 반구와 비교하여 AQ-처리된 반구에서 주입 후 1h에 현저하게 증가되었음을 드러냈다 (p < .001; 도 4A 참조). 더욱이, 1h에서 IL-10 발현의 이러한 AQ-유도된 증가는 1d (p < .001) 또는 2d (p < .001)에서의 증가보다 현저하게 더 컸다. IL-10 발현은 후속 시점에서 2-3배 증가되었으나, 비히클-처리된 반구와 통계학적으로 유의한 차이가 존재하지 않았으며, 이는 1시간에서 관찰된 IL-10에서의 유의한 증가가 AQ 주입에 대한 급성 반응으로 인한 것일 수 있음을 시사한다.

사이토킨 발현에서 AQ-관련된 변화가 mRNA 발현 패턴에서의 더욱 전체적인 변화의 일부보다 IL-10에 제한적인지의 여부를 평가하기 위해, PCR 어레이를 수행하였다. 사이토킨 및 케모카인 반응과 관련된 82개 총 유전자를 조사하였다. 이 중 80개 유전자는 대조군 반구에서 다양한 정도로 존재하였으며, 2개 유전자 (CCR8, 케모카인 수용체 8; 및 CRP, C-반응성 단백질)는 검출되지 않았다. 검출 가능한 80개 유전자 중, 단지 16개만이 AQ- 및 비히클-처리된 반구 사이에 현저한 차이가 있었다 (표 1 참조, 반응 시간에 의해 정리된 데이터). 대다수의 유전자는 AQ 주입 후 1시간에 증가 되었으며, 그 후 1일에 기저선 수준까지 또는 그 근처로 감소되었다. 1시간에 현저하게 상향조절된 8개 유전자 중, 단지 하나만이 주입 시점 후 2-일에 걸쳐 증가 된 채 유지되었다 (케모카인 리간드 10 (CXCL10)). 6개 유전자는 AQ 주입 후 1시간에서 유의하게 상향조절되지 않았으며, 1-일째에는 상향조절되었다. 이들 6개 중 2개만이 2일째에 상승된채 유지되지 않았다 - 케모카인 리간드 11 (CXCL11) 및 인터류킨-1 수용체 타입 II (IL-1rII). 단지 2개의 유전자만이 AQ 주입 시점 후 2일에서 배타적으로 유의하게 상향조절되었다 - 케모카인 수용체 1 (XCR1) 및 보체 성분 3 (C3). 이러한 결과는 AQ의 등쪽 해마 주입이 단기 및 장기 시점 모두에서 사이토킨 및 케모카인 mRNA 발현에 극적인 효과를 가짐을 나타낸다.

논의

현재의 연구는 칼슘 결합 단백질 아포에쿼린 (AQ)이 허혈성 손상 전에 투여될 때 시간- 및 용량-의존적 방식으로 신경보호성임을 입증한다. 1% 또는 4% AQ의 해마내 주입은 대조군 주입된 동물과 비교하여 현저하게 더 적은 죽은 또는 죽어가는 뉴런을 발생시켰다 (도 2 참조). 이러한 신경보호는 발생에 1 또는 2일 걸리며 3 내지 5일에 진정되었다는 점에서 시간 의존적이다. 신경보호는 전-처리 유사 효과를 포함할 수 있으며, 이에 의해 AQ 주입이 사이토킨 및 케모카인 발현을 조절하며, 이는 후속하여 산소-글루코오스 결핍 (OGD)으로부터 뉴런을 보호한다.

이전의 연구는 CaBP에 대한 신경보호적인 역할을 제시하였다. 예를 들어, CaBP 칼빈딘을 함유하는 뉴런은 칼빈딘이 결여된 뉴런보다 흥분독성 및 허혈성-관련 손상에 대해 더 내성이다. 또한, 일부 연구에서는 칼빈딘 발현이 외상성 뇌 손상 및 허혈 후 증가됨을 주목하였으며, 이는 칼빈딘이 Ca^{2 +} 항상성을 유지하고 흥분독성에 대해 보호하기 위해 증가될 수 있음을 나타낸다. 마찬가지로, 유전자 요법 또는 단백질 형질도입을 이용하여, 허혈 전 CaBP의 과다발현이 또한 신경보호성인 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 칼빈딘이 치아 이랑 (허혈성 세포사에 대해 내성인 영역) 및 CA1 (세포사에 취약한 영역) 둘 모두에 존재한다는 점은 신경보호에서 칼빈딘의 역활에 대한 논증으로서 이용되었다. 마지막으로, 다른 연구가들은 허혈로부터의 회복이 칼빈딘 넉아웃 마우스에서 향상되었음을 보고하였다. 이들은 유도성 넉아웃은 아니기 때문에, 다른 보상 메카니즘이 관찰된 신경보호에서 역할을 담당했을 가능성이 있다.

흥분독성에 대한 인공 칼슘 킬레이터 (예를 들어, BAPTA-AM, EGTA, 등...)의 효과를 시험하는 연구는 혼합된 결과를 갖는데, 일부 연구는 신경보호를 발견하였으며, 다른 연구는 세포사에 대한 증가된 취약성을 발견하였다. 닉코넨코(Nikonenko) 등은 EGTA, BAPTA, 미베프라딜(Mibefradil), 쿠르톡신(Kurtoxin), 니켈(Nickel), 아연(Zinc), 및 피모지드(Pimozide) 처리된 슬라이스에서 OGD 후에 쥐의 기관형 해마 슬라이스 배양에서 신경보호를 입증하였다. 반대로, 압델-하ㅁ미(Abdel-Hamid) 및 밤브릿지(Baimbridge)는 배양된 해마 뉴런에 칼슘 킬레이터 BAPTA-AM을 로딩하고 이들 뉴런에서 글루타메이트 흥분독성이 증가된 것을 발견하였다. 저자들은 인공 칼슘 킬레이터의 존재가 세포 내로의 Ca^{2 +} 유입을 방지하는 정상적인 Ca^{2 +}-의존적 메카니즘을 방해한다고 제시하였다. 이러한 반대되는 결과는 흥분독성 유도 방식, 사용된 Ca^{2 +} 킬레이터의 유형, 또는 급성 뇌 슬라이스와 비교하여 배양된 뉴런의 사용을 포함한 많은 요인으로 인한 것일 수 있다.

흥미롭게도, AQ 단백질이 주입 후 1시간째에 등쪽 해마에서 가장 용이하게 검출될 경우, 신경보호는 관찰되지 않았다 (도 3 참조). AQ가 어떻게 세포 내로 유입되는지 또는 AQ가 세포 내로 유입되는지의 여부는 알지 못하지만, 본 연구는 주입용 AQ를 갖는 DMSO를 사용하였으며, 이는 막을 가로질러 약물을 수송하는데 사용된다. 따라서, AQ가 세포에 유입될 가능성이 있는 것으로 보인다. 게다가, 웨스턴 블롯 샘플에 대한 원심분리 공정은 (저속 원심분리에 의해) 세포의 세포내 구성요소를 분리하도록 설계되었으며, 이들 샘플 중의 AQ 존재는 세포 내부에서의 이의 존재를 강력하게 시사한다. 현저한 신경보호가 주입 후 1 및 2일에 입증되었음에도 불구하고, 훨씬 적은 AQ가 등쪽 해마에서 입증되었으며 (도 3C), 이는 신경보호가 단순히 Ca^{2 +}에 결합하는 AQ의 즉각적인 효과로 인한 것이 아님을 시사한다. 오히려, 데이터는 신경보호가 AQ 주입에 의해 초래된 사건의 캐스케이드로부터 발생함을 시사한다. 단백질이 거의 존재하지 않거나 검출되지 않을때 신경보호 효과가 주입 후 1 및 2일에 관찰되었기 때문에 (AQ 발현이 이의 최고 수준에 있을 때의 1시간은 제외됨), 이러한 캐스케이드는 아마도 주입 후 전-처리 유사 효과를 포함하는 다른 AQ-촉발된 메카니즘으로 인한 것으로 보인다. 이러한 유형의 효과는 발생하는데 시간이 걸릴 것이며, 신경보호가 왜 즉각적으로 관찰되지 않는지를 설명해준다 (예를 들어, 주입 후 1시간). 전처리는 또한, 주입 후 1 또는 2일에서 단백질의 더 낮은 검출에도 불구하고, 강력한 신경보호가 이들 시점에서 관찰되는 지를 설명할 수 있다. 정확한 메카니즘은 현재 알려지지 않았지만, 연구는 전처리에서의 사이토킨 및 케모카인이 연류됨을 보여준다.

AQ 주입 후 관찰된 신경보호가 전처리-유사 효과로 인한 것인지의 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 전처리에 관련된 것으로 알려진 항-염증성 사이토킨인 IL-10 mRNA에서의 변화를 측정하였다. IL-10 mRNA에서 통계학적으로 유의한 증가가 주입 후 1시간에 관찰되었다. 통계학적으로 유의하지는 않지만, IL-10 mRNA의 생물학적으로 유의한 (>2-배) 증가가 AQ 주입 후 최대 2일 동안 계속 관찰되었다 (도 4A 참조). 항-염증성 사이토킨은 사이토킨 분비를 통해 보호성을 띠는 세포 군집을 모집하고, 이어서 염증전 면역 반응 손상의 유도를 예방 또는 하향 조절하고, 향후 손상을 능동적으로 보호함으로써 작용할 수 있다. AQ 주입 후 1시간에 증가된 IL-10 발현은 곧 있을 OGD 손상에 대한 보호성 프라이머로서 역할을 하여 1-2일 후 뇌는 완전히 프라이밍되고 허혈성 손상을 더욱 잘 견딜 수 있게 된다. 이러한 효과는 오래 지속되지 않아서 AQ 주입 후 3-5일까지는 신경보호가 거의 입증되지 않았다.

AQ 주입 후 1시간에 IL-10 mRNA에서의 증가가 조처리-유사 효과를 시사함을 고려하여, 다중-유전자 PCR 어레이를 광범위한 사이토킨 및 케모카인의 발현에 대한 AQ의 효과를 평가하는데 사용하였다 (표 1 참조). 이들 연구는 AQ 주입이 비히클-처리된 반구와 비교하여 많은 사이토킨 및 사이토킨 수용체 유전자의 발현을 시간 의존적 방식으로 차등 조절함을 드러냈다. 어레이에서 시험한 총 82개 유전자 중 16개가 AQ 주입 후 유의하게 상향조절되었다. 이들 16개 유전자 내에서, 시간-의존적 효과가 입증되었는데, 8개는 AQ 주입 직 후 신속하게 상향조절된 반면, 나머지 8개는 단지 1- 또는 2-일 지연 후에 상향조절되었다.

표 1. 반응 시간에 따라 그룹화된 4% AQ 주입 후 유전자의 배수 변화

숫자는 비히클 주입된 반구로부터의 배수 변화를 나타낸다 (* p <.05;

p <.01).

AQ 주입 후 상향조절된 사이토킨 중에서, 전처리의 효과는 단지 4개만 시험하였다: 인터류킨-1β (IL-1β), (2) IL-10, (3) 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 및 (4) 보체 성분 3 (C3). 이들 사이토킨 중 4개 모두는 전처리 후 증가되는 것으로 나타냈다. 전-염증성 사이토킨인 IL-1β 전처리 후 6시간 이내에 증가하는 것으로 나타났으며, 이후 3-4 일 내에 기저선으로 되돌아간다. 이는 IL-1β mRNA의 급격한 증가에 이어 AQ 후 2일까지 기저선 수준으로 복귀됨을 입증하는 본 연구와 일치한다 (표 1). IL-1β가 전-염증성 사이토킨이지만, 중등도의 증가는 신경보호성일 수 있다. 마찬가지로, IL-10 또한, 전처리 후 급격히 증가되는 것으로 나타났으며, 기저선으로 매우 신속하게 복귀된다. 여기에서 본 발명자들은 정량적 RT-PCR (도 4) 및 PCR 어레이 (표 1) 둘 모두를 이용하여, IL-10이 AQ 주입 후 1시간에 현저하게 상향조절됨을 보여주었다. IL-10은 TNF-α 방출을 감소시키고, 쥐에서 국소 허혈 후 뇌 손상을 감소시키는 것으로 나타났다. 전처리 후, TNF-α는 급속히 상향조절되며, 최대 2일 동안 지속되며, 3-4일 후 더 이상 검출되지 않는다. 본 실험은 1시간에서 TNF-α 유전자 발현의 증가를 입증하지만, AQ 주입 후 1 또는 2일에는 그렇지 않다. C3는 리포폴리사카라이드 (LPS) 전처리 후 24시간에 유의하게 상향조절되었다. 여기서 AQ 주입 후 2일에 C3 유전자 발현의 유의한 증가가 관찰되었다. C3를 포함하는 보완적 숙주 방어 시스템의 활성화는 손상 및 보호 효과 둘 모두를 갖는 것으로 나타났다. 종합적으로 말하면, 이들 데이터는 본 실험에서 IL-1β, IL-10, TNF-α 및 C3의 증가가 AQ-주입의 신경보호 효과에 대한 한 이유일 수 있음을 나타낸다.

상향조절된 사이토킨 중 단지 4개만이 전처리에서 시험되었지만, 16개 중 거의 모두를 뇌 허혈 후 시험하였다. 본 발명자들이 알기로는 단지 케모카인 리간드-9 (CXCL9), 케모카인 리간드-11 (CXCL11) 및 케모카인 수용체-1(XCR1)은 뇌 허혈과의 이들의 관련성이 이전에 조사된 적이 없었다. 나머지 사이토킨 중에서, 인터류킨-2 수용체, 베타 (IL-2rβ)를 제외한 모두는 허혈 후 증가하는 것으로 나타났다. 정상 조건하에서, IL-2rβ는 해마 CA1 피라미드 뉴런의 세포 막 내에서 발견되었다. 허혈 후, IL-2rβ는 CA1 내에서 증가할 뿐만 아니라 세포 막으로부터 세포질 및 핵으로 이동한다. 일부 사이토킨이 허혈 후 어떻게 작용하는 지는 아마도 이들의 발현 패턴에 의존적인 것으로 보이며, 이는 이들이 신경보호성일 때 또는 아닐 때에 영향을 미칠 수 있으며, 이들이 신경보호성인 지의 여부에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, CD40 리간드는 염증 및 조직 손상에서 역할을 하며, 국소 허혈 후 상향조절된다. 그러나, CD40 리간드는 또한, 뉴런 스트레스로부터 뉴런을 보호하고 CD40 리간드에서의 결핍은 뉴런 기능장애를 발생시키며, 이는 CD40 리간드가 일반적인 뉴런 기능에 중요함을 나타낸다. 본 데이터는 AQ 주입 후 1 및 2일 모두에서 CD40 리간드의 유의한 증가를 나타낸다. 이러한 CD40 리간드의 지속적인 증가는 본 발명자들의 관찰된 신경보호의 시간 경과에 기여할 수 있다. 본 연구의 범위를 벗어나지만, 허혈의 생체내 모델을 이용하여 더욱 긴 시간 프레임에 걸쳐 AQ의 신경보호 효과를 추가로 평가하는 것이 중요할 것이다 (그리고, 데이터는 가치가 있음을 시사함).

결론적으로, 본 실험은 AQ가 허혈 손상 전에 뇌에 직접 투여될 경우 허혈에 대하여 뉴런을 보호한다는 가설을 지지한다. 이러한 효과는 용량- 및 시간- 둘 모두에 의존적인데 AQ의 단일 해마내 주입이 최대 2일 동안 OGD로부터 뉴런을 보호한다. 또한, AQ 주입은 허혈성 전처리로 관찰된 것과 유사한 방식으로 사이토킨 및 케모카인 유전자 발현을 활성화시켰다. 따라서, AQ를 이용한 사전처리(pretreatment)는 화학적 전처리 제제로서 작용함으로써 허혈성 뇌졸중에 대하여 뉴런을 보호하는 효과적인 방법일 수 있다.

실시예 2. 사이토킨 단백질 발현에 대한 아포에쿼린의 해마내 주입의 효과.

이전의 실험에서, 본 발명자의 연구실은 시험관내 허혈성 손상 전 24시간 및 48시간에 AQ의 단일 해마내 주입이 세포사를 현저하게 감소시킴을 나타냈다 (Detert et al., 2013). 인터류킨-10 (IL-10)과 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α; Detert et al., 2013)를 포함하여, AQ 주입 후 사이토킨 mRNA의 동시 변화가 있음이 또한 밝혀졌다. 이들 데이터는 AQ의 신경보호 메카니즘이 가능하게는 전처리-유사 효과를 포함하여, 특정 항- 및 전-염증 분자의 조절을 포함할 수 있음을 나타낸다. 본 연구는 AQ의 해마내 주입 후 사이토킨 단백질 발현이 또한 시간-의존적인 방식으로 변화되는지의 여부를 추가로 조사하도록 설계되었다. 단백질 수준의 가능한 변화에 초점을 맞춤으로써, 본 발명자들은 AQ가 다양한 사이토킨을 조절하는 정도를 더욱 잘 이해하고 궁극적으로 AQ가 산소-글루코오스 결핍으로부터 뉴런을 보호하는 메커니즘을 이해하기를 희망한다.

본 발명자들의 연구실은 이전에 해마의 CA1 영역으로의 아포에쿼린 (AQ)의 주입이 시간- 및 용량-의존적 방식으로 신경보호성임을 이전에 입증하였다 (Detert et al., 2013).

유의한 신경보호는 AQ가 주입 후 1시간은 제외하고 1일 및 2일에 관찰되었다 (1시간은 아님). 이는 변형된 사이토킨 mRNA 발현과 병행되었으며, 이는 이러한 허혈성 신경보호가 신경면역조절 반응을 포함할 수 있음을 암시한다 (Detert et al., 2013).

가벼운 스트레스 자극의 유도는 염증성 사이토킨 발현의 조절을 통해 허혈성 전처리를 촉발시킬 수 있다 (Gidday, 2006).

IL-10은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 허혈성 손상으로부터 뉴런을 보호한다 (Grilli et al., 2000).

IL-10은 출혈성 뇌졸중의 병인 기전에 관여하는 염증전 사이토킨인 TNF-α의 상향 조절을 억제한다 (Ewen et al., 2013).

본 실시예는 AQ의 해마내 주입이 IL-10 및 TNF-α 단백질 발현의 변화를 촉발시키는 신경면역조절 반응을 개시함을 입증한다. 이 결론을 뒷받침하는 데이터가 도 5, 6A-B, 7A-D 및 8A-C에 제공된다.

실시예 3. 칼슘 결합 단백질 아포에쿼린의 신경치료학적 효과

칼슘-결합 단백질 (CaBP)가 허혈성 세포사를 완화시킨다.

본 발명자 연구실로부터의 데이터는, CaBP 아포에쿼린(AQ)이 시험관내 허혈 전에 등쪽 해마로 주입될 때 신경보호성이며, IL-10 및 TNF-α mRNA의 시간-특이적으로 상승으로 이어짐을 나타내며, 이는 전처리에서 AQ의 역할을 시사한다 (Detert et al., 2013).

본 실시예는 AQ의 단일 해마 주입이 IL-10 및 TNF-α 단백질 발현을 차등 조절할 것임을 입증한다.

칼슘 독성은 정상적인 노화에서 드러난다. 노화의 칼슘 가설에 따르면, 칼슘 항상성의 조절이상은 정상적인 노화에서 인지 감소에 기여한다 (Khachaturian, 1987).

CaBP의 연령-관련 감소가 있으며 (DeJong et al., 1996; Bu et al., 2003; Moyer et al., 2011), 본 발명자들의 연구실의 발견은 추적 공포 학습에 중요한 구조체인 해마에서의 감소된 CaBP 발현을 입증한다 (McEchron et al., 1998). 추적 공포 조건화는 정상적인 노화에서 손상된다 (Villarreal et al., 2004; McEchron et al., 2004; Moyer et al., 2006). 과량 칼슘의 경감은 노화 동물에서 향상된 인지 기능으로 이어진다 (Deyo et al., 1989; Veng et al., 2003).

이러한 실시예는 AQ의 단일 해마 주입이 추적 공포 조건화의 획득에서 노화 관련 결점을 완화시킬 것임을 추가로 입증한다.

경구 투여가 전달 방법으로 이용되었다. 비히클로서 헤이즐넛 스프레드 Nutella® 또는 피넛 버터를 사용하여, 화합물의 쥐로의 전달이 경구로 달성될 수 있다 (Isaksson et al., 2011; Cundell et al., 2003).

본 발명자들의 연구실로부터의 최근 데이터는 AQ가 시험관내 허혈 전에 단일 용량으로 경구 투여되는 경우 신경보호성임을 입증한다 (Adams et al., SfN 2013). 본 실시예는 AQ 경구 투여의 신경보호 효과가 용량- 및 시간-의존적임을 추가로 입증한다.

도 9A-C, 10A-C 및 11A-C는 다음의 결론을 지지한다. AQ의 직접 주입은 비히클에 비해 변경된 IL-10 및 TNF-α 단백질 발현을 발생시킨다. IL-10과 TNF-α 둘 모두는 AQ 주입 후 차별화된 발현 패턴을 나타내며, 이는 AQ의 신경보호 효과가 면역조절 반응에 의해 매개될 수 있음을 나타낸다.

AQ 주입은 노화 동물에서 추적 공포 학습 장애를 회복시키지 못하였으며, 성체에서 이러한 과제의 학습을 방해하지 않는다. 노화된 쥐는, 성체와 비교하여 조건화 후 24시간에 톤(tone)으로의 감소된 동결을 입증하지만, AQ 투여는 예측된 바와 같이 노화된 쥐에서 증가된 동결로 이어지지 않았다.

AQ의 경구 투여는 시간- 및 용량-의존적인 신경보호를 발생시킨다. 48 mg/㎏ 용량의 AQ 및 경구 투여 7일은 허혈 후 세포사의 현저한 감소로 이어진다.

실시예 4. AQ의 경구 투여는 급성 슬라이스 모델에서 신경보호성이다.

본 발명자의 연구실은 최근 아포에쿼린(AQ)이 산소 글루코오스 결핍 (OGD)으로 불리는 허혈성 뇌졸중의 급성 뇌 슬라이스 모델에서 신경보호성임을 입증하였다. 4% AQ를 주입받은 받은 쥐는 OGD후 감소된 세포사를 입증하였다 (Detert et al., 2013).

이러한 실시예는 세포사의 감소가 사이토킨 mRNA의 시간-의존적 변화를 포함하는 면역조절 메카니즘으로 인한 것임을 입증한다.

쥐로의 화합물의 경구 투여는 헤이즐넛 스프레드 Nutella® (Isaksson et al., 2011) 또는 땅콩 버터 (Cundell, et al., 2003)를 비히클로 사용하여 달성되었다. 최근에, AQ는 쥐로 위관영양법을 통해 투여되는 경우 비독성인 것으로 나타났다 (Moran, et al., 2013). 땅콩 버터와 같은 비히클에 전달되는 AQ의 경구 투여는 다른 방법 (예컨대, 바이러스 전달, 직접 주입 또는 위관 영양법)보다 덜 침습적이며, 구강 전달 시스템은 인간 연구도 일반화될 수 있다.

이러한 실시예는 AQ의 경구 투여가 산소 글루코오스 결핍-유도된 세포사로부터 뉴런을 보호함을 입증한다.

방법

동물. 92마리의 수컷 F344 성체 쥐를 사용하였다. 쥐는 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있게 하면서 14/10시간 주/야 주기로 유지하였다. 현저한 체중 증가 및/또는 감소를 설명하기 위해, 각 동물의 체중을 주당 2회 기록하였다.

약물. 아포에쿼린 (AQ; Quincy Bioscience)을 7.4%의 농도로 이중 탈이온수에서 제조하였다. 용량 의존적 실험에서 실험군 (n = 18)은 이들의 일일 PB에 혼합된 0 (n = 4), 3.6 (n = 5), 48 (n = 4), 240 (n = 3), 또는 480 mg/kg의 AQ를 투여받았다. 나머지 연구에 있어서, 쥐 (n = 73)는 이들의 일일 PB에 혼합된 48 mg/kg의 AQ를 투여받았다. 동물들은 다섯개의 군 중 하나에 배정되었다; AQ 비처리 (n = 12), 1시간 AQ (n = 17), 1일 AQ (n = 15), 2일 AQ (n = 15), 및 7일 AQ (n = 14). 쥐는 정해진 시간에 매일 케이지에서 페트리 디쉬에 놓인 1/4 티스푼의 PB를 투여받았다. 페트리 디쉬는 모든 PB가 소비될 때까지 제거하지 않았다. 적절한 AQ 투여량을 유지하기 위해 동물의 무게를 주 2회 측정하였다.

주입 연구를 위한 AQ는 이전에 기술된 바와 같이 제조하였다 (Detert et al., 2013). IL-10 중화 항체 (nAb) 및 이의 IgG 대조군을 무균 PBS 중에 제조하였다. 0.5 μg을 1 ul/분의 속도로 1 ul 해밀턴 주사기를 통해 주입하였다.

산소-글루코오스 결핍. 투여 마지막 날에, 쥐에게 소화를 위해 PB 소비 후 1시간을 허용하고, 이소플루란으로 깊게 마취시키고, 등쪽 해마 (dhpc; Bregma ^-3.14 - ^-4.16; Paxinos & Watson, 1998)의 관상 슬라이스 (400 μm)를 표준 절차를 이용하여 준비하였다 (Moyer & Brown, 2007). aCSF에서 1시간 슬라이스 회복 후, 각 뇌의 하나의 반구 (카운터발란스)는, 슬라이스를 5분 동안 산소-글루코오스 결핍 챔버 (글루코오스는 프룩토오스로 대체되고 95% O₂-5% CO₂ 대신에 95% N₂-5% CO₂로 버블링됨)로 옮김으로써 시험관내 허혈 처리하고, 나머지 반구는 회복되게 유지시켰다. 이어서, 모든 슬라이스를 30분 재관류 기간 동안 0.2% 트리판 블루를 함유하는 산소화된 aCSF에 넣었다. 트리판 블루는 죽은 세포는 염색시키는 반면, 살아있는 세포는 염색시키지 않는다 (DeRenzis & Schechtman, 1973). 슬라이스를 산소화된 실온 aCSF에서 2회 헹구고, 이어서 냉장고에서 밤새 10% 중성 완충된 포르말린으로 고정시켰다. 그 후, 슬라이스를 30% 수크로스에서 한랭보호하고, 냉동미세절단기 (cryostat)에서 절개하고 (40 μm), 세포 계수를 위해 교체된 슬라이드 상에 탑재시켰다.

세포 계수. 슬라이스를 올림푸스 현미경 (디지탈 카메라 장착됨)으로 10X로 시험하고, 사진을 촬영하였다 (CellSens). CA1 (약 800 μm 섹션) 내부의 트리판 블루 염색된 뉴런은 실험 조건에 대해 맹검 상태로 실험자에 의해 계수되었다. 통계 분석은 SPSS (v 21.0.0; IBM Corporation; Armonk, NY)를 사용하여 수행되었다. ANOVA를 사용하여 약물 효과를 평가하고, 피셔의 LSD 사후 평가를 이용하여 군 상호작용을 평가하였다. 별표 (^*)는 p <.05를 나타낸다.

웨스턴 블롯 . 동물들을 이소플루란으로 깊게 마취시키고, 뇌를 신속하게 제거하고, 냉동시키고 -80℃에서 보관하였다. 해부 시간에, 샘플을 dhpc로부터 해부하였다 (Bregma ^-3.14 - ^-4.16mm). 샘플을 균질화하고, 4000 RPM에서 20분간 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 단백질을 브래드포드 단백질 검정 키트 (Bio-Rad)를 사용하여 측정하였다. 단백질 샘플을 표준화하고 SDS-PAGE (12%)를 위해 로딩하였다. 단백질 (30μg)을 터보 트랜스퍼 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 PVDF 막 상으로 옮겼다. 막을 차단 완충액 (2시간), 1차 항체 (4℃에서 밤새; 1:1000 마우스 항-에쿼린 [Chemicon] 또는 1:1000 토끼 항-β-액틴 [Cell Signaling Technology] 및 2차 항체 (90분; 1:20,000 염소 항-마우스 [Santa Cruz Biotechnology] 또는 1:40,000 염소 항-토끼 [Millipore])에서 인큐베이션하였다. 이어서 막을 세척하고, 화학발광 용액 (Thermo Scientific)에 넣고, 진시스 소프트웨어 (v 1.2.4.0, Synoptics 카메라 4.2MP)로 이미지를 촬영하고, 각 밴드의 형광을 진툴스 소프트웨어 (v 4.02, Cambridge, England)로 평가하였다. 값은 대조군 동물의 백분율로 나타냈다. 통계는 SPSS로 수행하였다 (v. 21).

개요

도 12, 13A-C, 14A-D, 15A-B 및 16은 하기 결론을 지지한다: 아포에쿼린의 신경보호 효과는 용량-의존적이다. 경구 투여되는 경우, AQ는 48 mg/kg의 용량으로 OGD-유발된 세포사로부터 보호한다.

아포에쿼린은 오래 지속되는 신경보호 효과를 갖는다. AQ의 1시간, 1일, 2일 또는 7일 경구 투여된 쥐의 뇌 슬라이스는 신경보호를 나타냈다.

아포에쿼린 투여는 사이토킨 단백질 발현을 변화시킨다.

TNF-α 단백질 발현은 AQ의 2일 경구 투여 후 증가하는 반면, IL-10 단백질 발현은 동일하게 유지된다.

주입될 때, IL-10 단백질 발현은 비히클 주입된 반구와 비교하여 1시간에 증가한다. 게다가, TNF-α는 1일에 증가하고, 그 후 단백질 수준은 기저선 아래로 떨어진다. 4. 아포에쿼린의 신경보호 효과는 IL-10 중화 항체에 의해 역전된다.

시험관내 OGD 전 1일에 주입되는 경우, AQ의 신경보호 효과는 IL-10 nAb와 병행될 경우 무효화된다.

본 데이터는, AQ의 신경 보호 효과가 IL-10의 중화 또는 하류 캐스케이드를 통해서 인지의 여부와 상관없이 IL-10과 관련됨을 시사한다.

본원에서 기재된 실시예 및 구체예는 단지 예시 목적을 위한 것이며, 이의 약간의 다양한 변화 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이고 본 출원의 사상 및 영역 및 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 포함되어야 함이 이해될 것이다. 본원에서 인용된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해서 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.

참고 문헌

Claims (14)

1. 대상체에 아포에쿼린(apoaequorin)을 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 뉴런 염증(neuronal inflammation)을 감소시키기 위해 뉴런을 전처리(preconditioning)하는 방법으로서, 대상체의 뉴런이 전처리되어 뉴런 염증이 감소되는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 투여가 주사(injection)에 의한 것인 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 투여가 경구 전달에 의한 것인 방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 조성물이 정제 또는 캡슐로부터 선택된 단위 투약 형태로 존재하는 방법.
5. 제 3항에 있어서, 아포에쿼린이 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 조성물의 형태로 상기 대상체에 투여되는 방법.
6. 대상체에서 뉴런 염증을 감소시키기 위해 뉴런을 전처리하기 위한 아포에쿼린.
7. 대상체에서 뉴런 염증을 감소시키기 위해 뉴런을 전처리하기 위한 조성물의 제조에 있어서 아포에쿼린의 용도.
8. 대상체에 아포에쿼린을 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 종양 괴사 인자 α (TNFα) 단백질 수준을 감소시키는 방법으로서, 대상체의 TNFα 단백질 수준이 감소되는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 투여가 주사에 의한 것인 방법.
10. 제 8항에 있어서, 상기 투여가 경구 전달에 의한 것인 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 조성물이 정제 또는 캡슐로부터 선택된 단위 투약 형태로 존재하는 방법.
12. 제 10항에 있어서, 아포에쿼린이 뉴트라슈티컬 조성물의 형태로 상기 대상체에 투여되는 방법.
13. 대상체에서 종양 괴사 인자 α 단백질 수준을 감소시키기 위한 아포에쿼린.
14. 대상체에서 종양 괴사 인자 α (TNFα) 단백질 수준을 감소시키기 위한 조성물의 제조에 있어서 아포에쿼린의 용도.

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