ES2910021T3 - Composiciones que contienen apoecuorina y métodos de uso de las mismas para tratar la inflamación neuronal - Google Patents

Abstract

Apoecuorina para su uso en un método de terapia que comprende el acondicionamiento previo de las neuronas para reducir la muerte de células neuronales después de la isquemia en un sujeto susceptible a la muerte celular por isquemia, proporcionando dicha apoecuorina en una dosificación terapéuticamente eficaz para acondicionar de manera previa las neuronas en el sujeto para reducir la muerte de células neuronales y en donde dicha apoecuorina se administra por vía oral en forma de una composición nutracéutica.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que contienen apoecuorina y métodos de uso de las mismas para tratar la inflamación neuronal

Campo de la invención

En general, la presente invención se refiere a composiciones útiles para el tratamiento de la inflamación neuronal. De manera más específica, la presente invención se dirige a la apoecuorina para su uso en el tratamiento de la inflamación neuronal.

Antecedentes de la invención

En 2009, el ictus representó aproximadamente una de cada 19 muertes en los Estados Unidos, lo que la convierte en la tercera causa principal de muerte detrás de las enfermedades cardíacas y el cáncer. Como resultado, es imperativo encontrar formas de mejorar las lesiones después de un ictus. Se ha prestado mucha atención al papel del calcio en la isquemia y a la posible neuroprotección mediante el bloqueo de sus efectos tóxicos tras la isquemia.

El calcio (Ca2+) juega un papel fundamental en varios procesos neuronales, incluida la liberación de neurotransmisores y la plasticidad sináptica. Las neuronas están continuamente sometidas a fluctuaciones de Ca2+ intracelular como resultado de la actividad en curso, sin embargo, aumentos excesivos o sostenidos de Ca2+ intracelular pueden ser tóxicos para las neuronas. Por lo tanto, el Ca2+ intracelular neuronal está muy estrechamente regulado y existen varios mecanismos que permiten a las neuronas limitar o controlar los niveles de Ca2+ citosólico. En particular, las proteínas de unión al calcio (CaBP, del inglés "calcium binding proteins"; tales como la calbindina, la parvalbúmina y la calretinina) son importantes para unir y amortiguar el Ca2+ citosólico.

Los estudios en el hipocampo han demostrado que la presencia de CaBP confiere cierta protección contra las lesiones excitotóxicas que normalmente provocan la muerte celular. De manera interesante, se observan niveles disminuidos de CaBP con la edad avanzada y en trastornos neurodegenerativos, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Los tratamientos destinados a minimizar la toxicidad del Ca2+ durante la isquemia mediante la administración de CaBP antes de una lesión isquémica también han tenido resultados positivos. Por ejemplo, Yenari et al. trataron animales con calbindina antes de inducir la isquemia y descubrieron que la sobreexpresión de calbindina era neuroprotectora. Además, Fan et al. trataron ratas con calbindina antes de la isquemia y demostraron un volumen de infarto más pequeño, mejor recuperación del comportamiento y disminución de la apoptosis en los animales tratados con calbindina. De hecho, mucha investigación se ha centrado en comprender los efectos nocivos del ictus. De manera interesante, un factor de riesgo importante para el ictus es el envejecimiento y una hipótesis destacada del envejecimiento del cerebro es la hipótesis del envejecimiento asociado al Ca2+. Esta hipótesis sostiene que un cambio relacionado con el envejecimiento en la capacidad de regular el calcio y los procesos dependientes del calcio es un factor fundamental que contribuye a aumentar la susceptibilidad al deterioro cognitivo y a los trastornos neurodegenerativos. Dados estos cambios en el Ca2+ relacionados con el envejecimiento y el papel fundamental del Ca2+ en la muerte celular por isquemia, muchas investigaciones se han centrado en la desregulación del Ca2+ tanto en las neuronas como en la glía.

Se sabe que la acumulación excesiva de Ca2+ intracelular después de la isquemia potencia la muerte celular a través de la excitotoxicidad. Después de una lesión isquémica, el Ca2+ se acumula dentro de la célula a través de canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VGCC, del inglés "voltage-gated Ca2+ channels"), a través de los receptores NMDA y a través de la liberación de orgánulos intracelulares. Numerosos estudios han demostrado que el bloqueo de la entrada de Ca2+ a través de los receptores NMDA, los VGCC o ambos en combinación puede ser neuroprotector contra la isquemia. De manera interesante, cuando los bloqueadores de os receptores NMDA se llevaron a los ensayos clínicos, no consiguieron proporcionar neuroprotección y produjeron efectos secundarios indeseables, tales como alucinaciones y coma. Si bien no está claro por qué los bloqueadores de los receptores NMDA fallaron en los ensayos clínicos, está claro que existe una necesidad de continuar la investigación centrada en mejorar los efectos devastadores del ictus isquémico.

A pesar de los avances, todavía existe una necesidad de terapias nuevas y alternativas que traten la inflamación neuronal. En particular, se desean composiciones farmacéuticas o nutracéuticas que tengan efectos secundarios reducidos en comparación con los agentes anteriores y, si se descubren, satisfarían una necesidad sentida durante mucho tiempo en las comunidades de salud médica y nutricional.

Hochstetter et al., (Soc of Neuroscience Meeting, octubre de 2012, resumen de presentación 860.03/J1) divulgan que la apoecuorina protege a las neuronas de la isquemia y altera los niveles de ARNm de las citocinas en el hipocampo de rata.

El documento US 2011/0130336 divulga composiciones que contienen apoecuorina y métodos para su uso en el tratamiento de lesiones isquémicas, en particular, la reducción de la muerte de células neuronales después de una lesión isquémica.

El documento WO2013/074798 divulga métodos para acondicionar de manera previa neuronas en un sujeto para reducir la muerte de células neuronales debido a isquemia cerebral utilizando composiciones que contienen apoecuorina.

El documento US2011/0124562 divulga métodos para tratar síntomas y trastornos relacionados con desequilibrios del calcio, tales como la calidad del sueño, la calidad del estado de ánimo, la calidad de la memoria y el dolor utilizando composiciones que contienen apoecuorina.

Detert et al., (PLOS One, 2013, vol 8, e79002) divulga el tratamiento previo con apoecuorina que protege las neuronas del hipocampo de la privación de oxígeno y glucosa.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en parte en la investigación reciente de los inventores sobre la apoecuorina, una proteína de unión al calcio, y el descubrimiento inesperado de que la apoecuorina posee capacidades neuroprotectoras novedosas. En particular, se ha encontrado que la apoecuorina es útil en el acondicionamiento previo de las neuronas en un sujeto para reducir la muerte de las células neuronales después de la isquemia.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a la apoecuorina para su uso en un método de terapia que comprende el acondicionamiento previo de las neuronas para reducir la muerte de células neuronales después de la isquemia en un sujeto susceptible a la muerte celular por isquemia, proporcionando dicha apoecuorina en una dosificación terapéuticamente eficaz para acondicionar de manera previa las neuronas en el sujeto para reducir la muerte de células neuronales y en donde dicha apoecuorina se administra por vía oral en forma de una composición nutracéutica.

En una realización, la apoecuorina está en una forma de dosificación unitaria seleccionada de un comprimido o una cápsula.

La presente invención proporciona varias ventajas sobre las composiciones y métodos anteriores en el sentido de que proporciona la mejora general de la salud mental y física de un sujeto a través de sus funciones neuroprotectoras.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes después de la revisión de la memoria descriptiva y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A a C representan los efectos de la privación de oxígeno y glucosa en la muerte celular en cortes agudos del hipocampo del cerebro. A) Diagrama de diseño experimental. Los cortes coronales del hipocampo se incubaron durante 1 h en líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa). La mitad de los cortes se transfirieron a la condición isquémica durante 5 min de privación de oxígeno y glucosa (POG), mientras que la otra mitad permaneció normóxica (sin POG). A continuación, todos los cortes se transfirieron a LCRa para una reperfusión de 30 min y tinción con azul tripano. Después, los cortes se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %. B) Imágenes representativas de la tinción con azul tripano en el área CA1 del hipocampo en un corte que permaneció normóxico (sin POG) y en un corte sometido a POG durante 5 min. Se observa que hay menos tinción en el corte normóxico en comparación con el corte con POG. C) Hubo un aumento significativo en el número de neuronas teñidas con azul tripano en el área CA1 del hipocampo de los cortes que se sometieron a 5 min de POG en comparación con los cortes que permanecieron normóxicos (*, p <0,01).

Las figuras 2A a C representan los efectos dependientes de la dosis de la apoecuorina en la muerte celular por isquemia. A) Diagrama de diseño experimental. A las ratas que se canularon de manera bilateral en el hipocampo dorsal se les administró una infusión de apoecuorina (AQ, del inglés "apoaequorina") al 0, 0,4, 1 o 4 % en un hemisferio y vehículo (AQ al 0 %) en el otro hemisferio. Un día después de la infusión, se hicieron cortes del hipocampo coronal y se incubaron en líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) durante 1 h. Todos los cortes se transfirieron a la condición isquémica durante 5 min de privación de oxígeno y glucosa (POG). A continuación, los cortes se transfirieron a LCRa para una reperfusión de 30 min y tinción con azul tripano. Después, los cortes se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %. B) Imágenes representativas de la tinción con azul tripano en el área CA1 del hipocampo después de la isquemia en un corte tratado con vehículo o un corte tratado con AQ al 4 %. Se observa que hay menos tinción en el corte tratado con AQ en comparación con el corte tratado con vehículo. C) El gráfico muestra la neuroprotección (porcentaje de células rescatadas) en función de la dosis de apoecuorina. Hubo una neuroprotección significativa en las ratas tratadas con AQ al 1 o al 4 % (pero no con AQ al 0,4 %) en comparación con AQ al 0 % (vehículo; *, p <0,01).

Las figuras 3A a C representan los efectos dependientes del tiempo de la apoecuorina en la muerte celular por isquemia. A) Diagrama de diseño experimental. A las ratas que se canularon de manera bilateral en el hipocampo dorsal se les administró una infusión de apoecuorina (AQ) al 4 % en un hemisferio y vehículo (AQ al 0 %) en el otro hemisferio. Se hicieron cortes del hipocampo coronal 1 h, 1 día, 2 días, 3 días o 5 días después de la infusión, y los cortes se incubaron durante 1 h en líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa). Todos los cortes se transfirieron a la condición isquémica durante 5 min de privación de oxígeno y glucosa (POG). A continuación, los cortes se transfirieron a LCRa para una reperfusión de 30 min y tinción con azul tripano. Después, los cortes se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %. A un segundo grupo de ratas se le administró una infusión bilateral de AQ al 4 % y se extrajeron los cerebros 1 h, 1 día, 2 días o 3 días después de la infusión para utilizarlos en una transferencia Western. B) Una infusión de AQ al 4 % 1 o 2 días antes de la isquemia dio como resultado una neuroprotección significativa, pero el efecto neuroprotector ya no era evidente a los 3 o 5 días después de la infusión. Hay que tener en cuenta que la AQ tampoco es neuroprotector cuando se infunde solo 1 h antes de la isquemia (p = 0,78). C). Análisis de transferencia Western de la proteína AQ de 22 kD. La AQ está presente en el hipocampo dorsal (AQ-hpcd) 1 h y 1 día, pero ya no está presente 3 días después de la infusión. A los 2 días después de la infusión, una banda está presente en solo el 29 % de las ratas. Se observa que nunca hay una banda en el hipocampo ventral (AQ-hpcv), independientemente del tiempo de infusión. El análisis de p-actina (45 kD) no reveló ningún efecto de la carga de proteínas en ningún momento en el hipocampo dorsal (actina-hpcd) o ventral (actina-hpcv). * p <0,01

Las figuras 4A y B representan los efectos de la apoecuorina en la expresión del ARNm de la interleucina-10. A) La expresión del ARNm de la interleucina-10 (IL-10) aumenta de manera significativa 1 hora después de la infusión ^de aQ ^{al 4 % en el hipocampo dorsal. Este aumento estadísticamente significativo fue transitorio, ya que la} expresión del ARNm de la IL-10 volvió a los niveles casi iniciales en 1 o 2 días, aunque todavía se observó un aumento de 2 a 3 veces biológicamente de interés. B) La expresión del ARNm de la p-actina no difirió de manera significativa entre el hemisferio tratado con AQ al 4 % y el vehículo (p = 0,52). Para ambos gráficos, los datos se expresan como veces de cambio a partir del hemisferio de control tratado con vehículo.

La figura 5 ilustra la metodología experimental utilizada en el ejemplo 2.

Las figuras 6A y B representan datos que muestran que la infusión intrahipocampal de AQ es neuroprotectora. Las figuras 7A a D representan la expresión de citocinas después de la infusión de AQ.

Las figuras 8A a C ilustran datos que demuestran que la administración oral de AQ es neuroprotectora.

Las figuras 9A a C representan datos que muestran que la infusión de AQ altera la expresión de las proteínas IL-10 y TNF-a.

Las figuras 10A a C ilustran la infusión de AQ y el acondicionamiento del miedo en ratas envejecidas.

Las figura 11A a C muestran que la administración oral de AQ depende del tiempo y de la dosis.

La figura 12 representa la metodología experimental utilizada en el ejemplo 4.

Las figuras 13A a C representan que la administración oral de AQ es neuroprotectora.

Las figuras 14A a D muestran datos que demuestran que la administración oral de AQ altera la expresión de proteínas citocinas.

Las figuras 15A a B representan datos que demuestran que la infusión intrahipocampal de AQ altera la expresión de la proteína citocina.

La figura 16 ilustra datos que muestran que el Acn de IL-10 invierte el efecto neuroprotector de la AQ.

Descripción detallada de la invención

I. EN GENERAL

Antes de describir los presentes materiales y métodos, se entiende que la presente invención no se limita a la metodología particular y los materiales descritos, ya que estos pueden variar. También ha de entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el fin de describir únicamente realizaciones particulares.

Cabe destacar que, como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referencias en plural, salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Asimismo, los términos "un" (o "una"), "uno/a o más" y "al menos uno/a" se pueden usar indistintamente en el presente documento. También cabe señalar que las expresiones "que comprende/n", "que incluye/n" y "que tiene/n" se pueden usar indistintamente.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos y las expresiones científicas y técnicas usadas en el presente documento tienen los mismos significados que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención.

Animales. Se utilizaron 92 ratas adultas F344 macho. Las ratas se mantuvieron en un ciclo día/noche de 14/10 horas con acceso a comida y agua a demanda. El peso de cada animal se registró dos veces por semana, para tener en cuenta aumentos y/o disminuciones de peso significativos.

Fármacos. La apoecuorina (AQ; Quincy Bioscience) se preparó en agua doblemente desionizada a una concentración del 7,4 %. Los grupos experimentales en los experimentos dependientes de la dosis (n = 18) recibieron 0 (n = 4), 3,6 (n = 5), 48 (n = 4), 240 (n = 3) o 480 mg/kg de AQ mezclada con su MC diaria. Para el resto de los estudios, las ratas (n = 73) recibieron 48 mg/kg de AQ mezclada con su MC diaria. Los animales se asignaron a uno de cinco grupos; Sin Aq ^{(n = 12), AQ 1 hora (n = 17), AQ 1 día (n = 15), AQ 2 días (n = 15) y AQ 7 días (n = 14. Las ratas recibieron % de} cucharadita de MC colocada en una placa de Petri en la jaula todos los días a la hora designada. Las placas de Petri no se retiraron hasta que se consumió toda la MC. Los animales se pesaron dos veces por semana, para mantener la ^{dosis adecuada de} aQ.

La AQ para estudios de infusión se preparó como se describió previamente (Detert et al., 2013). El anticuerpo neutralizante (Acn) de IL-10 y su control de IgG se prepararon en PBS estéril. Se infundieron 0,5 |jg a una velocidad de 1 jl/m in a través de jeringas Hamilton de 1 jl.

Privación de oxígeno y glucosa. En el último día de la administración, se permitió a las ratas, 1 hora después del consumo de la MC, que hicieran la digestión, se anestesiaron profundamente con isoflurano y se prepararon cortes coronales (400 |jm) del hipocampo dorsal (hpcd; Bregma - 3,14 - -4,16; Paxinos y Watson, 1998) utilizando procedimientos convencionales (Moyer y Brown, 2007). Después de 1 h de recuperación de los cortes en LCRa, un hemisferio de cada cerebro (contrabalanceado) se sometió a isquemia in vitro mediante la transferencia de los cortes a una cámara con privación de oxígeno y glucosa (glucosa reemplazada por fructosa y burbujeada con N² al 95 % y CO² al 5 % en lugar de O² al 95 % y CO² al 5 %) durante 5 min, mientras que el otro hemisferio se mantuvo en recuperación. A continuación, todos los cortes se colocaron en LCRa oxigenado que contenía azul tripano al 0,2 % durante un período de reperfusión de 30 min. El azul tripano tiñe las células muertas mientras deja las células vivas sin teñir (DeRenzis y Schechtman, 1973). Los cortes se enjuagaron dos veces en LCRa oxigenado a temperatura ambiente y después se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % durante la noche en el frigorífico. A continuación, los cortes se crioprotegieron en sacarosa al 30 %, se seccionaron en un criostato (40 jm ) y se montó en portaobjetos recubiertos para el recuento de células.

Recuentos celulares. Los cortes se examinaron en un microscopio Olympus (equipado con una cámara digital) a 10* y se tomaron fotografías (CellSens). Un investigador con condiciones experimentales enmascaradas contó las neuronas teñidas con azul tripano dentro de CA1 (una sección de aproximadamente 800 jm ). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS (v 21.0.0; IBM Corporation; Armonk, NY). Se utilizó un ANOVA para evaluar el efecto de un fármaco y se utilizaron a posteriori evaluaciones de LSD de Fisher para evaluar las interacciones entre grupos. El asterisco (*) indica p <0,05.

Transferencias Western. Se anestesiaron profundamente a los animales con isoflurano, se extrajeron rápidamente los cerebros, se congelaron y se almacenaron a -80 °C. En el momento de la disección, se diseccionaron muestras de hpcd (Bregma '3,14 - '4,16 mm). Las muestras se homogeneizaron, se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 min, se eliminó el sobrenadante y se midió la proteína con un kit de ensayo de proteínas Bradford (Bio-Rad). Las muestras de proteínas se normalizaron y cargaron para SDS-PAGE (12 %). Las proteínas (30 jg ) se transfirieron a membranas de PVDF con el Turbo Transfer System (Bio-Rad). Las membranas se incubaron en tampón de bloqueo (2 h), anticuerpo primario (durante la noche a 4 °C; antiecuorina de ratón 1:1000 [Chemicon] o anti-p-actina de conejo 1:1000 [Cell Signaling Technology] y anticuerpo secundario (90 min; antirratón de cabra 1:20.000 [Santa Cruz Biotechnology] o anticonejo de cabra 1:40.000 [Millipore]). A continuación, se lavaron las membranas, se colocaron en una solución de quimioluminiscencia (Thermo Scientific) y se tomaron fotografías con un Syngene GBox. Las imágenes se tomaron con el programa informático GeneSys (v 1.2.4.0; cámara sinóptica 4.2MP) y la fluorescencia de cada banda se evaluó con el programa informático GeneTools (v 4.02; Cambridge, Inglaterra). Los valores se expresan como porcentaje de los animales de control. Las estadísticas se realizaron con SPSS (v. 21).

Aunque pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las referencias citadas en la presente memoria descriptiva deben tomarse como indicativas del nivel de experiencia en la materia. Nada de lo expuesto en el presente documento se ha de interpretar como un reconocimiento de que la invención no tenga derecho a preceder tal divulgación en virtud de la invención anterior.

II. LA INVENCIÓN

El ictus isquémico afecta a ~795.000 personas cada año en EE. UU., lo que provoca un coste anual estimado de 73,7 mil millones USD. El calcio es fundamental en una variedad de cascadas de señalización neuronal, sin embargo, durante la isquemia, el exceso de entrada de calcio puede desencadenar la muerte celular excitotóxica. Las proteínas de unión al calcio ayudan a las neuronas a regular o amortiguar los niveles de calcio intracelular durante la isquemia. La ecuorina es una proteína de unión al calcio aislada de las medusas Aequorea victoria y se ha utilizado durante años como indicador de calcio, pero se sabe poco sobre sus propiedades neuroprotectoras. El presente estudio utilizó una preparación de cortes de cerebro de rata in vitro para probar la hipótesis de que una infusión intrahipocampal de apoecuorina (el componente de unión al calcio de la ecuorina) protege a las neuronas de la muerte celular por isquemia. Las ratas canuladas de manera bilateral recibieron una infusión de apoecuorina en un hemisferio y control de vehículo en el otro. A continuación, se prepararon cortes de hipocampo y se sometieron a privación de oxígeno y glucosa (POG) durante 5 minutos y se analizó la muerte celular por exclusión con azul tripano. La apoecuorina protegió a las neuronas de la POG de forma dependiente de la dosis: las dosis al 1 % y al 4 % (pero no al 0,4 %) redujeron de manera significativa el número de neuronas marcadas con azul tripano. Este efecto también fue dependiente del tiempo, con una duración de hasta 48 horas. Este efecto dependiente del tiempo fue paralelo a cambios en la expresión de citocinas y quimiocinas, lo que indica que la apoecuorina puede proteger a las neuronas a través de un mecanismo neuroinmunomodulador. Estos datos apoyan la hipótesis de que un tratamiento previo con apoecuorina protege a las neuronas contra la muerte celular por isquemia y puede ser un neuroterapéutico eficaz.

La ecuorina es una fotoproteína aislada originalmente de medusas luminiscentes y otros organismos marinos. El complejo de ecuorina comprende una proteína de apoecuorina de 22.285 dalton, oxígeno molecular y el luminóforo coelenteracina. Cuando tres iones de Ca2+ se unen a este complejo, la coelenteracina se oxida a coelentermida, con una liberación simultánea de dióxido de carbono y luz azul. La ecuorina no es exportada ni secretada por las células, ni está compartimentada o secuestrada dentro de las células. En consecuencia, las mediciones de ecuorina se han utilizado para detectar cambios del Ca2+ que se producen durante periodos relativamente largos. En varios sistemas experimentales, la luminiscencia de la ecuorina fue detectable muchas horas o días después de la carga de la célula. Se sabe además que la ecuorina tampoco altera las funciones celulares ni el desarrollo embrionario.

Debido a su luminiscencia dependiente del Ca2+, el complejo de ecuorina se ha utilizado ampliamente como indicador de Ca2+ intracelular. La ecuorina de Aequorea victoria se ha utilizado de manera específica para: (1) analizar la respuesta de secreción de las células cromafines suprarrenales individuales a los agonistas colinérgicos nicotínicos; (2) aclarar el papel de la liberación del Ca2+ en el daño del músculo cardíaco; (3) demostrar la liberación masiva de Ca2+ durante la fecundación; (4) estudiar la regulación de la expresión de la bomba de Ca2+ del retículo sarcoplásmico en el desarrollo de mioblastos de pollo; y (5) calibrar micropipetas con volúmenes de inyección de tan solo tres picolitros.

La apoecuorina tiene un peso molecular aproximado de 22 kDa. La apoecuorina se puede utilizar para regenerar ecuorina mediante la reducción del enlace disulfuro en la apoecuorina. La apoecuorina cargada con calcio conserva la misma estructura compacta y el patrón de plegamiento general que las fotoproteínas sin reaccionar que contienen un sustrato unido.

La purificación convencional de la ecuorina de la medusa Aequorea victoria requiere procedimientos de extracción laboriosos y, a veces, produce preparaciones que son sustancialmente heterogéneas o que son tóxicas para los organismos en estudio. Dos toneladas de medusas suelen producir aproximadamente 125 mg de la fotoproteína purificada. En cambio, la ecuorina recombinante se produce preferentemente mediante la purificación de la apoecuorina a partir de Escherichia coli genomanipulada, seguida de la reconstitución del complejo de ecuorina in vitro con coelenteracina pura. Se ha descrito apoecuorina útil en la presente invención y se puede obtener de manera comercial a través de esquemas de purificación y/o síntesis conocidos por los expertos en la materia. S. Inouye, S. Zenno, Y. Sakaki y F. Tsuji. High level expression and purification of apoaequorin. (1991) Protein Expression and Purification 2, 122-126.

La ecuorina es una CaBP aislada del celenterado Aequorea victoria. La ecuorina pertenece a la familia de CaBP mano EF, con bucles de mano EF que están estrechamente relacionados con las CaBP en mamíferos. Además, la ecuorina se ha utilizado durante años como un indicador de Ca2+ y ha demostrado ser seguro y bien tolerado por las células. Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha investigado su potencial terapéutico. La ecuorina se compone de dos componentes: el componente de unión al calcio apoecuorina (AQ) y la molécula quimioluminiscente coelenteracina. Dado que la porción Aq de esta proteína contiene los dominios de unión al calcio, se utilizó la AQ en los presentes estudios.

Para los experimentos actuales, se utilizó un modelo in vitro de isquemia global en cortes agudos del hipocampo del cerebro. En cortes hipocampales agudos, el daño inducido por POG es más evidente en el área CA1 del hipocampo, similar al visto in vivo. Los cortes agudos de hipocampo ofrecen muchas ventajas sobre el uso de cultivos celulares y modelos in vivo, incluyendo que la morfología del tejido no tiene relativamente cambios con respecto al animal inalterado, los cambios en la concentración de iones extracelulares y la liberación de neurotransmisores son similares a los informados in vivo y no hay respuestas vasculares o sistémicas que no puedan controlarse in vivo. El daño neuronal después de la POG en cortes agudos se observa dentro de los primeros 30 minutos de la reperfusión, sin embargo, debido a la corta vida de los cortes, solo se pueden analizar cambios tempranos en la isquemia. Debido a que las neuronas del hipocampo son vulnerables a la muerte celular después de la isquemia, se analizó la hipótesis de que una infusión de AQ directamente en el hipocampo será neuroprotectora cuando se administre antes de una lesión isquémica.

La administración de composiciones que contienen apoecuorina a un sujeto puede utilizarse para corregir o mantener el equilibrio de calcio en ese sujeto. Se entiende que el mantenimiento de las concentraciones de calcio iónico en el plasma y los líquidos corporales es fundamental para una amplia variedad de funciones corporales, que incluyen, pero sin limitación, excitabilidad neuronal, contracción muscular, permeabilidad de membrana, división celular, secreción de hormonas, mineralización ósea o la prevención de la muerte celular después de la isquemia. La alteración de la homeostasis del calcio, es decir, un desequilibrio de calcio, se entiende que provoca y/o se correlaciona con muchas enfermedades, síndromes y afecciones. Los ejemplos de enfermedades, síndromes y afecciones incluyen aquellas asociadas con la calidad del sueño, la calidad de la energía, la calidad del estado de ánimo, la calidad de la memoria y la percepción del dolor. El estudio de las CaBP ha llevado a su reconocimiento como factores protectores que actúan en el mantenimiento de los niveles adecuados de calcio iónico.

En determinadas realizaciones, la apoecuorina puede administrarse como único principio activo para proporcionar neuroprotección, para retrasar la progresión de la inflamación neuronal, para prevenir la aparición de la inflamación neuronal y para prevenir y/o tratar la recaída de la inflamación neuronal. En determinadas realizaciones, la apoecuorina puede administrarse en combinación con uno o más agentes adicionales que tengan un valor terapéutico o nutracéutico conocido.

Como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" incluye el tratamiento preventivo así como el de remisión del trastorno. Como se utiliza en el presente documento, los términos "reducir", "aliviar", "suprimir" e "inhibir" tienen el significado comúnmente entendido de atenuar o disminuir. Como se utiliza en el presente documento, el término "progresión" significa aumentar en alcance o intensidad, avanzar, crecer o empeorar. Como se utiliza en el presente documento, el término "recaída" significa el regreso de una enfermedad después de una remisión.

Como se utiliza en el presente documento, el término "administrar" se refiere a poner en contacto a un paciente, tejido, órgano o célula con la apoecuorina. Como se utiliza en el presente documento, la administración se puede lograr in vitro, es decir, en un tubo de ensayo, o in vivo, es decir, en células o tejidos de organismos vivos, por ejemplo, seres humanos. Un "paciente" o "sujeto", utilizado de manera equivalente en el presente documento, se refiere a un mamífero, preferentemente un ser humano, que: (1) tiene inflamación neuronal remediable o tratable mediante la administración de apoecuorina; o (2) es susceptible a una inflamación neuronal que se puede prevenir mediante la administración de apoecuorina.

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a la cantidad de agentes activos suficiente para producir una respuesta terapéutica deseada sin efectos secundarios adversos indebidos tales como toxicidad, irritación o respuesta alérgica. La "cantidad eficaz" específica variará, obviamente, con factores como la afección particular que se está tratando, el estado físico del paciente, el tipo de animal a tratar, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia simultánea (si existe) y las formulaciones específicas empleadas y la estructura de los compuestos o sus derivados. En este caso, una cantidad se consideraría terapéuticamente eficaz si diera como resultado uno o más de los siguientes: (1) la prevención de la inflamación neuronal; y (2) la reversión o estabilización de una inflamación neuronal. Las cantidades eficaces óptimas se pueden determinar fácilmente por un experto habitual en la materia utilizando experimentación rutinaria.

En determinadas composiciones preferidas para administración oral a sujetos, la apoecuorina está formulada con al menos un vehículo aceptable en una dosis de aproximadamente 10 mg/dosis, una dosis preferiblemente en forma de cápsula, con la dosis recomendada para un sujeto de aproximadamente 10 mg/día (es decir, una cápsula por día).

Las composiciones de acuerdo con la presente invención incluyen formulaciones líquidas o liofilizadas o secadas de otro modo e incluyen diluyentes de varios contenidos de tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato y fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para evitar la absorción a las superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol, polietilenglicerol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), sustancias voluminosas o modificadores de la tonicidad (por ejemplo, lactosa, manitol), unión covalente de polímeros tales como el polietilenglicol a la proteína, formación de complejos con iones metálicos o incorporación del material en o sobre preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico o hidrogeles, o en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas lamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoplastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de aclaramiento in vivo. Las composiciones de liberación controlada o sostenida incluyen formulaciones en depósitos lipófilos (por ejemplo, ácidos grasos, ceras, aceites).

También se divulgan en el presente documento composiciones en partículas recubiertas con polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas). Otras realizaciones de las composiciones incorporan recubrimientos protectores en forma de partículas, inhibidores de proteasa o potenciadores de la permeación para la administración oral.

Asimismo, como se utiliza en el presente documento, los "vehículos farmacéuticamente aceptables" son bien conocidos para los expertos en la materia e incluyen, pero sin limitación, tampón de fosfato de 0,01 a 0,1 M y preferentemente 0,05 M o solución salina al 0,9 %. Además, dichos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio tamponado.

Otras realizaciones de las composiciones administradas de acuerdo con la invención incorporan formas particuladas, recubrimientos protectores, inhibidores de proteasa o potenciadores de la permeación para la administración oral.

Las entidades químicas modificadas mediante el enlace covalente de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona o poliprolina se sabe que presentan semividas en sangre sustancialmente más largas tras una inyección intravenosa que los compuestos no modificados correspondientes. Dichas modificaciones pueden aumentar también la solubilidad de la entidad química en solución acuosa, eliminar la agregación, potenciar la estabilidad física y química del compuesto, y reducir mucho la inmunogenia y la reactividad del compuesto. Como resultado, se puede conseguir la actividad biológica deseada in vivo mediante la administración de dichos aductos de entidades poliméricas con menor frecuencia o en dosis inferiores que con la entidad no modificada.

La composición puede comprender apoecuorina sola o puede incluir además un vehículo farmacéuticamente aceptable y puede estar en forma sólida o líquida tal como comprimidos, polvos, cápsulas, miniesferas, soluciones, suspensiones, elixires, jarabes, bebidas, emulsiones y geles. Los vehículos farmacéuticamente aceptables también incluyen gomas, almidones, azúcares, materiales celulósicos y mezclas de los mismos.

Las composiciones administrables por la invención se pueden preparar mediante procesos conocidos de disolución, mezcla, granulación o formación de comprimidos. Para la administración oral, la apoecuorina o sus derivados fisiológicamente tolerados tales como sales, ésteres, N-óxidos y similares se mezclan con aditivos habituales para este propósito, tales como vehículos, estabilizantes o diluyentes inertes, y se convierten mediante métodos habituales en formas adecuadas para la administración, tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas duras o blandas de gelatina, soluciones acuosas, alcohólicas o aceitosas.

Los ejemplos de vehículos inertes adecuados son bases de comprimidos convencionales tales como lactosa, sacarosa o almidón de maíz en combinación con aglutinantes tales como acacia, almidón de maíz, gelatina, con agentes desintegrantes tales como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, o con un lubricante tal como ácido esteárico o estearato de magnesio.

Los ejemplos de vehículos oleosos o disolventes adecuados son aceites vegetales o animales tales como aceite de girasol o aceite de hígado de pescado. Las composiciones pueden efectuarse tanto como gránulos secos como húmedos. Para la administración parenteral (inyección subcutánea, intravenosa, intraarterial o intramuscular), la entidad química o sus derivados fisiológicamente tolerados tales como sales, ésteres, N-óxidos y similares se convierten en una solución, suspensión o expulsión, si se desea con las sustancias habituales y adecuadas para este fin, por ejemplo, solubilizantes u otros auxiliares.

Los ejemplos son líquidos estériles tales como agua y aceites, con o sin la adición de un tensioactivo y otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Los aceites ilustrativos son los procedentes del petróleo, animal, vegetal o de origen sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja o aceite mineral. En general, los vehículos líquidos preferidos son agua, solución salina, soluciones acuosas de dextrosa y azúcares relacionados y los glicoles tales como los propilenglicoles o el polietilenglicol, particularmente para soluciones inyectables.

Se entiende bien en la materia la preparación de composiciones que contienen un componente activo. El principio terapéutico activo se mezcla a menudo con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares o cualquier combinación de los mismos. Además, la composición puede contener cantidades mínimas de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH que potencian la eficacia del principio activo.

Se puede formular un componente activo en la composición como formas salinas farmacéuticamente aceptables neutralizadas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido, que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas a partir de grupos carboxilo libres pueden proceder también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína y similares.

Preferentemente las sales de apoecuorina son sales farmacéuticamente aceptables. Otras sales pueden, sin embargo, ser útiles en la preparación de las composiciones de acuerdo con la invención o de sus sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen sales de adición de ácidos que pueden, por ejemplo, formarse mediante la mezcla de una solución de apoecuorina con una solución de un ácido farmacéuticamente aceptable tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido metanosulfónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzoico, ácido oxálico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico o ácido fosfórico.

Las composiciones que contienen apoecuorina descritas en el presente documento se proporcionan en forma de composiciones nutracéuticas en las que la apoecuorina previene la aparición o reduce o estabiliza varios efectos nocivos de la inflamación neuronal. El término "nutracéutico" o "composición nutracéutica", para los fines de la presente memoria descriptiva, se refiere a un alimento, o una parte de un alimento, que ofrece beneficios médicos para la salud, incluyendo prevención y/o tratamiento de una enfermedad. Una composición nutracéutica de acuerdo con la presente invención puede contener solo apoecuorina como principio activo, o de manera alternativa, puede comprender además, en mezcla con suplementos dietéticos que incluyen vitaminas, coenzimas, minerales, hierbas, aminoácidos y similares que complementan la dieta mediante el aumento de la ingesta total de esa sustancia.

Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para proporcionar beneficios nutracéuticos a un paciente que comprende la etapa de administrar al paciente una composición nutracéutica que contiene apoecuorina. En general, dichas composiciones incluyen un "vehículo nutracéuticamente aceptable" que, como se hace referencia en el presente documento, es cualquier vehículo adecuado para la administración oral, incluidos los vehículos farmacéuticamente aceptables mencionados anteriormente adecuados para la vía oral. En determinadas realizaciones, las composiciones nutracéuticas de acuerdo con la invención comprenden suplementos dietéticos que, definidos sobre una base funcional, incluyen agentes inmunoestimulantes, agentes antiinflamatorios, agentes antioxidantes, agentes antivíricos o mezclas de los mismos.

Los agentes inmunoestimulantes y/o antivíricos son útiles para acelerar la cicatrización de heridas y mejorar la función inmunitaria; e incluyen extractos de equináceas, o hierbas del género Echinacea, extractos de hierbas del género Sambuca y extractos de sello de oro. Las hierbas del genero Astragalus también son inmunoestimulantes eficaces en sus formas naturales o procesadas. Astragalus estimula el desarrollo de células madre en la médula y células inmunitarias activas del tejido linfático. El zinc y sus sales bioactivas, tales como el gluconato de zinc y el acetato de zinc, también actúan como inmunoestimulantes en el tratamiento del resfriado común.

Los antioxidantes incluyen el aminoácido alicina natural que contiene azufre, que actúa para aumentar el nivel de enzimas antioxidantes en la sangre. Las hierbas o extractos de hierbas, tales como ajo, que contienen alicina, también son antioxidantes eficaces. Las catequinas y los extractos de hierbas tales como el té verde que contienen catequinas, también son antioxidantes eficaces. Los extractos del género Astragalus también muestran actividad antioxidante. Los bioflavonoides, tales como la quercetina, hesperidina, rutina y mezclas de los mismos, también son eficaces como antioxidantes. El principal papel beneficioso de los bioflavonoides puede ser proteger a la vitamina C de la oxidación en el cuerpo. Esto produce más vitamina C, o ácido ascórbico, disponible para su uso por el cuerpo.

Los bioflavonoides tales como la quercetina también son agentes antiinflamatorios eficaces y pueden utilizarse como tales en las composiciones de la invención. Los complementos herbales antiinflamatorios y los compuestos antiinflamatorios procedentes de plantas o hierbas también se pueden utilizar como agentes antiinflamatorios en la composición inventiva. Estos incluyen bromolina, una enzima proteolítica que se encuentra en la piña; tés y extractos de ortiga; cúrcuma, extractos de cúrcuma, o curcumina, un pigmento amarillo aislado de la cúrcuma.

Otro complemento que se puede utilizar en la presente invención es el jengibre, procedente de hierbas del género Zingiber. Se ha descubierto que posee actividad cardiotónica debido a compuestos tales como el gingerol y el compuesto relacionado shogaol, además de proporcionar beneficios en el tratamiento de mareos y trastornos vestibulares. El jengibre también es eficaz en el tratamiento de las náuseas y otros trastornos estomacales.

Los complementos que ayudan a reconstruir las estructuras de los tejidos blandos, en particular, en la reconstrucción del cartílago, son útiles en composiciones para tratar el dolor de la artritis y otros trastornos de las articulaciones. La glucosamina, el sulfato de glucosamina, y la condroitina pueden proceder de una variedad de fuentes tales como Elk Velvet Antler. También se sabe que los complejos lipídicos marinos, los complejos de ácidos grasos omega 3 y el aceite de pescado son útiles para tratar el dolor asociado con la artritis.

Los complementos útiles en el tratamiento de las migrañas incluyen la matricaria y Ginkgo biloba. El principal principio activo de la matricaria es la partenolida de lactona sesquiterpénica, que inhibe las secreciones de prostaglandinas que a su vez provocan dolor a través de la actividad vasoespástica en los vasos sanguíneos. La matricaria también presenta propiedades antiinflamatorias. El aceite de pescado, debido a su acción estabilizadora de plaquetas y antivasoespástica, también puede ser útil en el tratamiento de dolores de cabeza por migraña. La hierba Ginkgo biloba también ayuda en el tratamiento de las migrañas mediante la estabilización de las arterias y la mejora de la circulación sanguínea.

La invención se entenderá más completamente al considerar los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1. El tratamiento previo con apoecuorina protege las neuronas del hipocampo CA1 de la privación de oxígeno y glucosa.

[Ejemplo de referencia]

Materiales y métodos

Sujetos

Los sujetos fueron 142 ratas F344 macho adultas (edad media 4,0 ± 0,1 meses; Harlan). Los sujetos se mantuvieron en una instalación acreditada por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) en un ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad y se alojaron individualmente con libre acceso a alimentos y agua.

Cirugía

A las ratas se les administró agua con ibuprofeno (15 mg/kg/día) durante al menos un día antes y dos días después de la cirugía. El día de la cirugía, las ratas se anestesiaron con isoflurano y se montaron en un aparato estereotáxico. En condiciones asépticas, se implantaron cánulas guía bilaterales de acero inoxidable de calibre 26 en el hipocampo dorsal (en relación con el bregma: AP -3,5 mm, L ± 2,6 mm, V -3,0 mm). Las cánulas se aseguraron al cráneo con tornillos de acero inoxidable y cemento acrílico. Se colocaron tapones de acero inoxidable en las cánulas guía para evitar la oclusión y se permitió que las ratas se recuperaran al menos 7 días antes de la infusión.

Infusiones intrahipocampales

La proteína ecuorina se compone de dos componentes, la apoecuorina y la coelenteracina. El componente de apoecuorina (AQ) contiene las manos EF que unen el Ca2+ [51] y, por lo tanto, fue el componente utilizado en los estudios actuales. A las ratas se les administró una infusión de a Q en el líquido cefalorraquídeo artificial con Ca2+ cero (LCRa; en mM: NaCl 124,00, KCl 2,80, MgSO42,00, NaH2PO41,25, NaHCOs 26,00, D-glucosa 10,00 y Na-ascorbato 0,40), que también contenía DMSO 6 %para facilitar la captación neuronal de AQ. Las ratas recibieron infusiones bilaterales (0,5 pl/hemisferio) durante 60 s y las cánulas de infusión permanecieron en su lugar durante 2 min adicionales para asegurar la difusión lejos de la punta. Las cánulas de infusión de calibre 33 se cortaron para extenderse 0,5 mm más allá de las cánulas de guía. Para determinar la neuroprotección dependiente de la dosis de AQ, a los animales se les infundió AQ al 0,4, 1 o 4 % (p/v; Quincy Bioscience, Madison, WI) en un hemisferio (contrabalanceado) y el otro se infundió con vehículo. Además, a un subconjunto de ratas se le infundió vehículo (AQ al 0 %) en ambos hemisferios para que sirviera como control (n = 11 para cada grupo).

Preparación de los cortes

Para determinar el efecto neuroprotector de la AQ en un modelo de corte de cerebro agudo de isquemia, se utilizaron 94 ratas F344 macho (edad media 4,4 ± 0,2 meses). Se prepararon cortes de cerebro como se describió anteriormente a partir de ratas de control (AQ al 0 %, n = 10) o a partir de ratas a las que se les infundió AQ en uno de los siguientes momentos después de la infusión: 1 h (n = 10), 1 día (n = 10), 2 días (n = 10), 3 días (n = 10) o 5 días (n = 5). En resumen, se anestesiaron profundamente a las ratas con isoflurano, perfundidas a través de la aorta ascendente con sacarosa-LCR frío y oxigenado (O² al 95 %/CO² al 5 %) (en mM: sacarosa 206,00, KCl 2,80, MgSO42,00, NaH2PO4 1,25, CaCl² 1,00, MgCl² 1,00, NaHCO3 26,00, D-glucosa 10,00 y Na-ascorbato 0,40) y el cerebro se extrajo rápidamente y se colocó en sacarosa-LCR frío y oxigenado. Se bloqueó el cerebro cerca del sitio de la cánula, y se realizaron cortes coronales de 400 pm de espesor en un vibratomo de temperatura controlada como se describió anteriormente. Solo los primeros 5 cortes inmediatamente posteriores a la colocación de la cánula (y desprovistos de cualquier pista visible de la cánula) se recogieron y se utilizaron en los experimentos que se describen a continuación. Los cortes se incubaron en una red de malla sumergidos en LCRa oxigenado (O² al 95 %/CO² al 5 %) (composición en mM: NaCl 124,00, KCl 2,80, MgSO4 2,00, NaH2PO4 1,25, CaCb 2,00, NaHCOa 26,00, D-glucosa 10,00 y Naascorbato 0,40) a 35 °C. Después de una recuperación de 1 hora, los cortes se sometieron a privación de oxígeno y glucosa (POG) durante 5 min para inducir la isquemia. La POG se indujo mediante la transferencia de los cortes a una solución de fructosa-LCR a 35 °C (en la que se sustituyó la glucosa por una concentración equimolar de fructosa), que se burbujeó con N² al 95 %/CO² al 5 % (en el que el N² reemplazó al O²). Después de la POG, los cortes se transfirieron a una solución a 35 °C que contenía LCRa oxigenado más azul tripano al 0,2 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para una reperfusión de 30 min. El azul tripano penetra en las células muertas y moribundas y las tiñe de azul mientras deja las células vivas sin teñir. A continuación, los cortes se enjuagaron brevemente en LCRa oxigenado a temperatura ambiente e inmediatamente se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % durante la noche en el frigorífico. Los cortes se crioprotegieron con sacarosa al 30 % durante un mínimo de 1 día, después de lo cual se subdividieron en un criostato a 40 pm, se montaron en portaobjetos recubiertos de gelatina, se deshidrataron en etapas crecientes de alcohol y se cubrieron con Permount.

Recuentos celulares

Los cortes se examinaron bajo un microscopio vertical (Olympus BX51) equipado con una cámara digital (Olympus DP70) y un objetivo 10*. Dentro de cada subsección de 40 pm, se tomó una fotografía de la capa del cuerpo celular CA1 (en la punta de la hoja superior de la circunvolución dentada). Para evitar una tinción excesiva debido al daño neuronal como resultado de la preparación inicial del corte del hipocampo, solo se fotografiaron las subsecciones interiores para su análisis. A continuación, un individuo con enmascaramientos a la condición del tratamiento contó el número de neuronas teñidas con azul tripano ubicadas en toda la imagen. Los datos se contaron de una sola subsección. Se evaluó el porcentaje de neuroprotección para cada animal mediante la normalización de los datos del hemisferio tratado con AQ al hemisferio tratado con vehículo.

Análisis por transferencia Western

Para determinar cuánto tiempo permaneció la AQ en el hipocampo dorsal después de una infusión, a 24 ratas F344 macho adultas (edad media 4,2 ±0,1 meses) se les infundió AQ al 4 % en ambos hemisferios. Las ratas se anestesiaron con una sobredosis de isoflurano 1 h (n = 4), 1 d (n = 7), 2 d (n = 7) o 3 d (n = 6) después de la infusión y se extrajo el cerebro, se congeló rápidamente en hielo seco y se almacenó a -80 °C. De cada rata, dos regiones cerebrales bilaterales (hipocampo dorsal e hipocampo ventral; hpcd e hpcv, respectivamente) se diseccionaron y homogeneizaron por separado. Las muestras se centrifugaron a 4000 rpm y el sobrenadante se extrajo y se midió con un kit de ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). Las muestras de proteínas se normalizaron (50 o 150 |jg/carr¡l) y se cargaron para SDS-PAGE (10 %). Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF utilizando un aparato de transferencia semiseco (Bio-Rad, Hercules, CA). A continuación, las membranas se incubaron durante 2 horas en tampón de bloqueo (leche en polvo desnatada al 3 %) y, a continuación, se incubaron en anticuerpo primario (durante la noche a 4 °C; antiecuorina de ratón 1:5000 [Millipore, Billerica, MA] o anti-p-actina de conejo 1:1000 [Cell Signaling Technology, Boston, MA]) seguido de anticuerpo secundario (90 min; antirratón de cabra 1:5000 [Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA] o anticonejo de cabra 1:5000 [Millipore]). A continuación, se lavaron las membranas (Tween-20 al 0,05 % en solución salina tamponada con tris), se colocaron en una solución de quimioluminiscencia (Santa Cruz Biotechnology) y se expusieron una a película autorradiográfica (Hyperfilm MP). Se tomaron imágenes y se realizó una densitometría utilizando NIH Image J Software. Una banda se consideró positiva si el valor de la densidad óptica de la banda (menos el fondo de cada carril) era superior a 2 desviaciones estándar por encima de la media de las bandas del hipocampo ventral. A partir de esta cuantificación, se observó una banda positiva en el 100 % de las bandas de 1 hora, 83 % de las bandas de 1 día, 29 % de las bandas de 2 días, 0 % de las bandas de 3 días y 0 % de los carriles de hpcv. Se hizo una comparación con el hipocampo ventral porque se trata de una estructura cerebral adyacente que no debería contener AQ y, por lo tanto, se utilizó como estructura de control negativo.

RT-PCR cuantitativa

Doce ratas macho (cada una de 3,8 meses) recibieron infusiones unilaterales de AQ al 4 % como se describió anteriormente y se recogió tejido 1 hora, 1 día o 2 días después de la infusión (n = 4 por grupo). Se extirparon los hipocampos e inmediatamente se colocaron en el reactivo TRlzol (Life Technologies Corp., Carlsbad, California). Los tejidos se homogeneizaron con una aguja y una jeringa de calibre 25 y las muestras se almacenaron a -80 °C hasta el aislamiento del ARN. El aislamiento del ARN de todos los tejidos se realizó al mismo tiempo utilizando el método TRIzol (Life Technologies Corp, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN aislado se disolvió en 50 j l de H²O sin ARNasa y la pureza del ARN se calculó en función de la relación de absorbencia de 260 nm y 280 nm. Una lectura de absorbencia entre 1,8 y 2,1 se consideró suficientemente pura para proceder con la transcripción inversa. Las muestras que presentaban una relación inferior a 1,8 se purificaron aún más utilizando el kit de limpieza Qiagen RNeasy MinElute (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el ARN purificado se resuspendió en 50 j l de H²O sin ARNasa. El ARN total de todas las muestras se transcribió inversamente a ADNc utilizando el Qiagen RT2 HT First Strand Kit-96 (Qiagen). Las muestras se amplificaron por triplicado en placas de 96 pocillos utilizando cebadores específicos para IL-10 y p-actina de rata (RT2 qPRC Primer Assay; Qiagen) y RT2 SYBR Green qPCR mastermix (Qiagen) en un sistema y programa informático de PCR en tiempo real StepOne (Life Technologies Corp., Carlsbad, California). Los cambios en la expresión del gen IL-10 con el tratamiento con AQ en relación con el tratamiento con vehículo se calcularon utilizando la ecuación de Pfaffl, normalizando la expresión de pactina en muestras correspondientes en cada punto temporal y en comparación con hipocampos tratados con vehículo aislados de cada rata. La eficacia del cebador se calculó en función de las curvas de dilución de dos muestras seleccionadas al azar para IL-10 y p-actina. La expresión de p-actina no se vio alterada por la infusión de AQ en comparación con el tejido infundido con LCRa, lo que indica que la infusión de AQ no afectó de forma general o inespecífica a la transcripción génica.

Matrices de expresión génica

Se tomó ADNc de las ratas utilizadas para RT-PCR (véase Métodos). Los análisis de PCR se centraron en los marcadores genéticos generales de citocinas y receptores inflamatorios, con matrices de perfilador RT2 de Qiagen realizadas según el protocolo del fabricante. En resumen, se combinaron la mezcla maestra verde 2X RT2 SYBR, ADNc (véase arriba) y agua sin ARNasa, y se añadieron 25 j l de esta mezcla a cada pocillo de la placa de pocillos de 96 pocillos PCR Profiler Array. Las muestras se procesaron con el sistema y el programa informático de PCR en tiempo real StepOne y aquellas muestras con múltiples curvas de fusión se eliminaron del análisis (n = 2 excluidos). Un animal del estudio tuvo que ser eliminado por completo, debido a la variabilidad general en la expresión génica sobre dos desviaciones estándar de la media. Los cambios en la expresión génica se calcularon utilizando el programa informático de análisis de matriz de PCR RT2 Profiler basado en la web de Qiagen v3.5. Análisis de datos y estadísticas

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Statview (v 5.0; SAS Institute, Inc., Cary, NC). Se utilizó un ANOVA para evaluar los efectos del tratamiento. Se utilizó el PLSD de Fisher para comparaciones a posteriori. Los datos se informan como el media ± error estándar de la media (EEM).

Resultados

La privación de oxígeno y glucosa provoca una muerte celular significativa

Se prepararon cortes agudos de hipocampo, se expusieron a 5 minutos de privación de oxígeno y glucosa (POG) y se tiñeron mediante la transferencia a un LCRa oxigenado que contenía azul tripano (véanse los métodos). Como puede observarse en la figura 1, la POG dio como resultado una muerte celular significativamente mayor en comparación con los cortes de control que no se sometieron a POG. Un ANOVA que analizó el número promedio de células teñidas con azul tripano en condiciones de isquemia o no de isquemia mostró un efecto estadísticamente significativo de la isquemia, F(1, 12) = 9,65, p <0,01. Estos hallazgos son coherentes con estudios previos que indican que la POG da como resultado una muerte celular significativa en la región CA1 del hipocampo [52].

Disminución de la muerte celular con tratamiento con apoecuorina

Para examinar los posibles efectos neuroprotectores de una infusión intrahipocampal de apoecuorina (AQ) antes de la POG, a las ratas se les infundió AQ al 0, 0,4, 1 o 4 % 24 horas antes de la POG (véase la figura 2A). La AQ fue neuroprotector de una manera dependiente de la dosis, de modo que las infusiones intrahipocampales con AQ al 1 % o al 4 % antes de la isquemia dieron como resultado un aumento significativo en la neuroprotección en comparación con la infusión de vehículo (AQ al 0 %), F(3, 40) = 3,61, p <0,05 (Figura 2B y C). El análisis a posteriori reveló que las infusiones de AQ al 1 o al 4 % mejoraron de manera significativa la neuroprotección en relación con el grupo de AQ al 0 %, p <0,01, y que la infusión de AQ al 0,4 % no fue estadísticamente diferente de ninguno de los otros grupos. También valió la pena señalar que esa cantidad de neuroprotección no fue diferente entre los grupos de tratamiento con AQ al 1 % y al 4 %.

Para evaluar la evolución temporal durante la cual la AQ es neuroprotector, a las ratas se les infundió AQ al 4 % en varios momentos (1 h, 1 d, 2 d, 3 d o 5 d) antes de la POG (Figura 3A). El ANOVA unidireccional indicó que hubo un efecto significativo del tiempo en la capacidad de una infusión intrahipocampal de AQ para proteger las neuronas de una POG posterior, F(5, 49) = 3,35, p <0,05. Las pruebas a posteriori revelaron que los efectos neuroprotectores de la AQ necesitaron al menos 1 día para aparecer y que duraron al menos 2 días (p <0,05 para cada punto temporal). No se observó neuroprotección estadísticamente significativa cuando los cortes se sometieron a POG 3 o 5 días después de la infusión de AQ (p = 0,10 y p = 0,47, respectivamente).

Análisis de transferencia Western de la apoecuorina

Para determinar cuánto tiempo permanece la AQ dentro del hipocampo dorsal después de una infusión intrahipocampal, se midieron los niveles de proteína AQ mediante análisis de transferencia Western en diferentes momentos (1 h, 1 d, 2 d o 3 d) después de la infusión bilateral de AQ al 4 % en el hipocampo dorsal. La figura 3C ilustra que dentro del hipocampo dorsal la AQ está presente a 1 h y 1 d, apenas visible a los 2 d y ya no está presente a los 3 d después de la infusión. Por lo tanto, se observaron bandas positivas en el 100 % de los carriles de 1 h, 83 % de 1 d, 29 % de 2 d y 0 % de 3 d. Como se esperaba, no se detectó AQ en el hipocampo ventral (hpcv), que se utilizó como estructura de control negativo dada su distancia desde el sitio de la inyección (véase la figura 3C). Para asegurar que se cargara suficiente proteína en los geles para permitir la visualización de bandas extremadamente débiles, las transferencias Western se repitieron en un subconjunto de animales, pero los geles se cargaron con 150 |jg de proteína por carril (en lugar de los 50 jg normales por carril). En estas transferencias, aparecieron bandas adicionales en los carriles de 2 y 3 días, de modo que el 57 % de los carriles de 2 días y el 25 % de los carriles de 3 días tenían bandas positivas, lo que sugiere que la A q es detectable dentro del hipocampo dorsal hasta 3 días después de las infusiones en el hipocampo dorsal. Cabe destacar que, no se observaron cambios dependientes del tiempo cuando las muestras se tiñeron para p-actina, lo que sugiere que estas diferencias reflejaban cambios dependientes del tiempo en presencia de la AQ y no un cambio general en el contenido de proteínas (véase la figura 3C).

Expresión de citocinas y quimiocinas después de la infusión de AQ

Que una infusión intrahipocampal de AQ diera como resultado una neuroprotección significativa en momentos en los que había muy poca proteína sugiere que la AQ puede desencadenar una cascada de acontecimientos que finalmente protegen a las neuronas de una lesión isquémica. Una posibilidad es que la AQ induzca un efecto similar al acondicionamiento previo, que da como resultado una muerte celular reducida en puntos temporales posteriores. El acondicionamiento previo isquémico es un fenómeno por el cual un episodio isquémico breve atenúa el daño provocado por una lesión isquémica posterior más intensa. La evidencia reciente ha demostrado que múltiples citocinas y quimiocinas están asociadas con el acondicionamiento previo isquémico. Dado el vínculo entre el acondicionamiento previo isquémico y las alteraciones en la producción de citocinas, se analizó la hipótesis de que una infusión de AQ puede conducir a un aumento en la expresión de citocinas o quimiocinas, lo que en última instancia puede afectar la capacidad de las neuronas para tolerar una lesión isquémica posterior. Se utilizó RT-PCR para investigar los cambios en el ARNm de la citocina antiinflamatoria interleucina-10 (IL-10) y se utilizaron matrices de PCR para observar múltiples cambios en la expresión génica después de la infusión de AQ. Las ratas adultas recibieron una infusión de AQ al 4 % en un hemisferio y vehículo en el otro, como se describe (véase Métodos). En diferentes momentos después de la infusión de AQ (1 h, 1 d o 2 d después), se extrajeron los hipocampos y se realizó una RT-PCR cuantitativa para evaluar los cambios dependientes del tiempo y del tratamiento. Un ANOVA unidireccional indicó una diferencia significativa entre los cuatro grupos de tratamiento, F(3, 19) = 9,55, p <0,0005. Los análisis a posteriori revelaron que el ARNm de IL-10 aumentó significativamente 1 h después de la infusión en el hemisferio tratado con AQ en relación con el tratado con vehículo (p <0,001; véase la figura 4a ). Aún más, esta mejora de la expresión de IL-10 inducida por la AQ a 1 h fue significativamente mayor que la mejora a 1 d (p <0,001) o 2 d (p <0,001). Aunque la expresión de IL-10 aumentó de 2 a 3 veces en los puntos temporales posteriores, estos no fueron significativamente diferentes desde el punto de vista estadístico de los hemisferios tratados con vehículo, lo que sugiere que el aumento significativo de IL-10 observado a 1 h puede deberse a una respuesta aguda a la infusión de AQ.

Para investigar si el cambio relacionado con la AQ en la expresión de citocinas estaba restringido a IL-10 en lugar de ser parte de un cambio más global en los patrones de expresión del ARNm, se realizaron matrices de PCR. Se examinaron ochenta y dos genes totales relacionados con las respuestas de citocinas y quimiocinas. Entre estos, 80 genes estaban presentes en diversos grados en el hemisferio de control y 2 genes (CCR8, receptor 8 de quimiocinas; y CRP, proteína C reactiva) no se detectaron. De los 80 genes que se detectaron, solo 16 fueron significativamente diferentes entre los hemisferios tratados con AQ y con vehículo (véase la tabla 1, datos organizados por tiempo de respuesta). La mayoría de los genes aumentaron 1 hora después de la infusión de AQ y, a partir de entonces, disminuyeron hasta los niveles iniciales o cerca de ellos en 1 día. De los 8 que aumentaron de manera significativa en 1 hora, solo uno permaneció elevado durante los 2 días posteriores a la infusión, el ligando 10 de quimiocina (CXCL10). Seis genes no aumentaron de manera significativa al cabo de 1 hora, pero aumentaron 1 día después de la infusión de la AQ. De estos seis, solo dos no permanecieron elevados a los 2 días: el ligando 11 de quimiocina (CXCL11) y el receptor de interleucina-1 de tipo II (IL-1rII). Solo dos genes aumentaron de manera significativa exclusivamente a los 2 días de la infusión de la AQ: el receptor 1 de quimiocina (XCR1) y el componente 3 del complemento (C3). Estos resultados indican que una infusión de AQ en el hipocampo dorsal tiene un efecto considerable en la expresión del ARNm de citocinas y quimiocinas en puntos temporales tanto a corto como a largo plazo.

Análisis

El estudio actual demuestra que la proteína de unión al calcio apoecuorina (AQ) es neuroprotectora de manera dependiente del tiempo y la dosis cuando se administra antes de la lesión isquémica. La infusión intrahipocampal de aQ ^{al 1 % o al 4 % dio como resultado una cantidad significativamente menor de neuronas muertas o moribundas en} comparación con los animales que recibieron la infusión de control (véase la figura 2). Esta neuroprotección dependía del tiempo, en el sentido en que tardó hasta 1 o 2 días en desarrollarse y disminuyó a los 3 o 5 días. La neuroprotección puede implicar un efecto similar al acondicionamiento previo, mediante el cual una infusión de AQ modula la expresión de citocinas y quimiocinas, que posteriormente protege a las neuronas de la privación de oxígeno y glucosa (POG).

Estudios previos han sugerido un papel neuroprotector para las CaBP. Por ejemplo, las neuronas que contienen la CaBP calbindina son más resistentes a las lesiones relacionadas con la isquemia y excitotóxicas que las neuronas que carecen de calbindina. Además, algunos estudios han observado que la expresión de calbindina aumenta después de una lesión cerebral traumática e isquemia, lo que indica que se puede aumentar la calbindina para mantener la homeostasis del Ca2+ y proteger contra la excitotoxicidad. De igual modo, mediante terapia génica o transducción de proteínas, también se ha descubierto que la sobreexpresión de CaBP antes de la isquemia es neuroprotectora. En cambio, que la calbindina está presente tanto en la circunvolución dentada (un área resistente a la muerte celular isquémica) como en CA1 (un área vulnerable a la muerte celular) se ha utilizado como argumento en contra del papel de la calbindina en la neuroprotección. Por último, otros han informado que la recuperación de la isquemia mejora en ratones con genes de la calbindina inactivados. Dado que estos no eran inactivados inducibles, es posible que otros mecanismos compensatorios desempeñaran un papel en la neuroprotección observada.

Los estudios que examinan el efecto de los quelantes de calcio artificiales (por ejemplo, BAPTA-AM, EGTA, etc...) en la excitotoxicidad han tenido resultados mixtos, con algunos estudios que encuentran neuroprotección y otros que encuentran una mayor vulnerabilidad a la muerte celular. Nikonenko et al. demostraron la neuroprotección en cultivos de cortes de hipocampo organotípicos de rata después de POG en cortes tratados con EGTA, BAPTA, mibefradilo, kurtoxina, níquel, zinc y pimozida. Por el contrario, Abdel-Hamid y Baimbridge cargaron neuronas hipocampales cultivadas con el quelante de calcio BAPTA-AM y encontraron una mayor excitotoxicidad del glutamato en esas neuronas. Los autores sugieren que la presencia de quelantes de calcio artificiales interfiere con los mecanismos normales dependiente del Ca2+ que impiden la entrada de Ca2+ en la célula. Estos resultados opuestos pueden deberse a una serie de factores, que incluyen el modo de inducir la excitotoxicidad, el tipo de quelante de Ca2+ utilizado o el uso de neuronas cultivadas en comparación con cortes de cerebro agudo.

De manera interesante, cuando la proteína AQ se detectó más fácilmente en el hipocampo dorsal, 1 hora después de la infusión, no se observó neuroprotección (véase la figura 3). Aunque se desconoce cómo o si la AQ entra en la célula, el estudio actual utilizó DMSO con la AQ para las infusiones, que se utiliza para transportar fármacos a través de las membranas. Por lo tanto, es probable que la AQ tuviera la oportunidad de entrar a las células. Aún más, el proceso de centrifugación de las muestras de transferencia Western se diseñó para aislar los componentes intracelulares de ^{la célula (mediante centrifugación a baja velocidad) y la presencia de} Aq ^{en estas muestras sugiere claramente su} presencia dentro de las células. Aunque se evidenció una neuroprotección significativa 1 y 2 días después de la infusión, mucho menos AQ fue evidente en el hipocampo dorsal (Figura 3C), lo que sugiere que la neuroprotección no resultó simplemente del efecto inmediato de la unión de la AQ al Ca2+. Más bien, los datos sugieren que la neuroprotección resulta de una cascada de acontecimientos provocados por la infusión de la AQ. Dado que los efectos neuroprotectores se observaron 1 y 2 días después de la infusión cuando la proteína apenas estaba presente o no se detectó (pero no 1 hora cuando la expresión de la AQ estaba en su punto más alto), es probable que esta cascada se deba a otros mecanismos desencadenados por la AQ, que incluyen un efecto similar al del acondicionamiento previo posterior a la infusión. Este tipo de efecto tardaría en desarrollarse y explicaría por qué no se observó inmediatamente la neuroprotección (por ejemplo, 1 hora después de la infusión). El acondicionamiento previo también puede explicar por qué se observó una fuerte neuroprotección 1 o 2 días después de la infusión, a pesar de una menor detección de la proteína en estos puntos temporales. Si bien los mecanismos exactos son actualmente desconocidos, los estudios han implicado a las citocinas y a las quimiocinas en el acondicionamiento previo.

Para investigar si la neuroprotección observada después de la infusión de la AQ se debe a un efecto similar al acondicionamiento previo, se midieron los cambios en el ARNm de IL-10, una citocina antiinflamatoria conocida por estar implicada en el acondicionamiento previo. Se observó un aumento estadísticamente significativo en el ARNm de IL-10 1 hora después de la infusión. Aunque no estadísticamente significativo, se siguió observando un aumento biológicamente significativo (>2 veces) en el ARNm de IL-10 hasta 2 días después de la infusión de AQ (véase la figura 4A). Las citocinas antiinflamatorias pueden actuar reclutando poblaciones celulares que son protectoras a través de la secreción de citocinas, que a su vez previenen o disminuyen la inducción de una respuesta inmunitaria proinflamatoria dañina, protegiendo activamente contra futuras lesiones. El aumento de la expresión de IL-10 1 hora después de la infusión de AQ puede servir como base protectora para la próxima lesión por POG, de modo que 1 o 2 días después, el cerebro está completamente preparado y es más capaz de resistir una lesión isquémica. Este efecto es de corta duración, de modo que entre 3 y 5 días después de la infusión de AQ, se evidencia poca o ninguna neuroprotección.

Dado que un aumento en el ARNm de IL-10 1 hora después de la infusión de AQ sugiere un efecto similar al acondicionamiento previo, se utilizaron matrices de PCR multigénicas para evaluar los efectos de la AQ en la expresión de una amplia variedad de citocinas y quimiocinas (véase la tabla 1). Estos estudios revelaron que la infusión de AQ regula diferencialmente, de una manera dependiente del tiempo, la expresión de varios genes de citocinas y de receptores de citocinas en comparación con el hemisferio tratado con vehículo. De los 82 genes totales examinados en la matriz, 16 aumentaron de manera significativa después de la infusión de AQ. Dentro de estos 16, un efecto dependiente del tiempo fue evidente, de modo que 8 aumentaron de manera rápida inmediatamente después de la infusión de AQ, mientras que los 8 restantes aumentaron solo después de un retraso de 1 o 2 días.

Tabla 1. Veces de cambio en los genes después de la infusión de AQ al 4 %, agrupados por tiempo de respuesta Tiempo desde la infusión de AQ

Que responde rápido (dentro de 1 hora) 1 hora 1 día 2 días Ligando 1 de quimiocina (CXCL1) 19,36f 1,77 -1,81

Ligando 3 de quimiocina (CCL3) 20,07f 8,85* 1,15

Ligando 4 de quimiocina (CCL4) 33,89f 6,20* 1,68

Ligando 10 de quimiocina (CXCL10) 9,59* 6,27 8,45* Interleucina 1 a (IL-1a) 36,63f 1,23 1,25 Interleucina 1 p (IL-1p) 32,46f 8,94* 1,43 Interleucina-10 (IL-10) 5,26* 4,27 3,14

Factor de necrosis tumoral (TNF-a) 23,15f 4,64 -1,29

Que responden más lento (dentro de 1 día)

Ligando de CD40 1,62 17,91f 7,15* Ligando 9 de quimiocina (CXCL9) 1,27 26,46f 13,47* Ligando 11 de quimiocina (CXCL11) 4,47 15,22f 3,84 Receptor 3 de quimiocina (CXCR3) 1,17 35,51f 11,66f Receptor de interleucina 1, de tipo II (IL-1rII) 2,09 6,90* -1,16 Receptor de interleucina 2, p (IL-2rp) 1,74 11,92f 6,70*

Que responden más lento (dentro de 2 días)

Receptor 1 de quimiocina (XCR1) -2,04 3,19 8,81* Componente 3 del complemento (C3) 2,07 3,93 10,11

Los números representan las veces de cambio del hemisferio infundido con vehículo (* p <0,05; f p <0,01).

De las citocinas que aumentaron después de la infusión de AQ, los efectos del acondicionamiento previo se han examinado solo en cuatro: (1) interleucina-1p (IL-1 p), (2) IL-10, (3) factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) y (4) componente 3 del complemento (C3). Se ha demostrado que estas cuatro citocinas aumentan después del acondicionamiento previo. Se ha demostrado que la IL-1 p, una citocina proinflamatoria, aumenta dentro de las 6 horas posteriores al acondicionamiento previo después de lo cual vuelve a los valores iniciales dentro de los 3 a 4 días. Esto es coherente con el presente estudio, lo que demuestra un rápido aumento en el ARNm de IL-1 p seguido de un retorno a los niveles iniciales 2 días después de la AQ (Tabla 1). Mientras que la IL-1 p es una citocina proinflamatoria, aumentos moderados pueden ser neuroprotectores. De igual modo, también se ha demostrado que la IL-10 aumenta de manera rápida después del acondicionamiento previo, con un retorno bastante rápido a los valores iniciales. En el presente documento se muestra con el uso tanto de RT-PCR cuantitativa (Figura 4) como de matrices de PCR (Tabla 1) que la IL-10 aumenta significativamente 1 h después de la infusión de AQ. Se ha demostrado que la IL-10 disminuye la liberación de TNF-a y reduce la lesión cerebral después de la isquemia focal en ratas. Después del acondicionamiento previo, el TNF-a se regula rápidamente, persiste hasta por 2 días y ya no se detecta después de 3 a 4 días. Los experimentos actuales demuestran un aumento en la expresión génica de TNF-a 1 hora, pero no 1 o 2 días, después de la infusión de AQ. El C3 se reguló de manera significativa 24 horas después del acondicionamiento previo con lipopolisacáridos (LPS). En el presente documento, se observó un aumento significativo en la expresión del gen de C3 2 días después de la infusión de AQ. Se ha demostrado que la activación del sistema de defensa del hospedador del complemento, que incluye C3, tiene efectos dañinos y protectores. Considerados en conjunto, estos datos indican que el aumento de IL-1p, IL-10, TNF-a y C3 en el experimento actual puede ser una de las razones de los efectos neuroprotectores de la infusión de AQ.

Si bien solo cuatro de las citocinas aumentadas se han examinado en el acondicionamiento previo, casi todos los 16 se han examinado después de una isquemia cerebral. Solo el ligando 9 de quimiocina (CXCL9), el ligando 11 de quimiocina (CXCL11) y el receptor 1 de quimiocina (XCR1) no han sido, hasta donde comprende el conocimiento de los inventores, previamente examinados con sus relaciones con la isquemia cerebral. De las otras citocinas, se ha demostrado que todas aumentan después de la isquemia, excepto el receptor 2 de interleucina, p (IL-2rp). En condiciones normales, el IL-2rp se encuentra dentro de la membrana celular de las neuronas piramidales de CA1 del hipocampo. Después de la isquemia, el IL-2rp no solo disminuye dentro de CA1, sino también se transloca desde la membrana celular al citoplasma y al núcleo. La forma en que funcionan algunas citocinas después de la isquemia probablemente depende de sus patrones de expresión, lo que puede influir en cuándo y si son neuroprotectores o no. Por ejemplo, el ligando CD40 desempeña un papel en la inflamación y la lesión tisular, y aumenta después de la isquemia focal. Sin embargo, el ligando CD40 también protege a las neuronas del estrés neuronal y la deficiencia en el ligando CD40 da como resultado una disfunción neuronal, lo que indica que el ligando CD40 es importante para la función neuronal general. Los presentes datos indican un aumento significativo en el ligando CD40 tanto 1 como 2 días después de la infusión de AQ. Este aumento sostenido en el ligando CD40 puede contribuir a la evolución temporal de la presente neuroprotección observada. Aunque fuera del alcance del presente estudio, será importante (y los datos sugieren que vale la pena) evaluar más a fondo los efectos neuroprotectores de la AQ durante un período de tiempo más largo utilizando un modelo in vivo de isquemia.

En conclusión, los experimentos actuales respaldan la hipótesis de que la AQ protege a las neuronas contra la isquemia cuando se administra directamente al cerebro antes de una lesión isquémica. Estos efectos dependen tanto de la dosis como del tiempo, de modo que una sola infusión intrahipocampal de AQ protege las neuronas de la POG durante hasta 2 días. Aún más, las infusiones de AQ activaron la expresión génica de citocinas y quimiocinas de manera similar a las observadas con el acondicionamiento previo isquémico. Por lo tanto, el tratamiento previo con AQ puede ser una forma eficaz de proteger las neuronas contra el ictus isquémico al actuar como un agente de acondicionamiento previo químico.

Ejemplo 2. Efecto de la infusión intrahipocampal de apoecuorina en la expresión de proteínas citocinas. [Ejemplo de referencia]

En experimentos anteriores, el presente laboratorio ha demostrado que una sola infusión intrahipocampal de AQ 24 y 48 horas antes de una lesión isquémica in vitro reduce de manera significativa la muerte celular (Detert et al., 2013). También se ha encontrado que hay cambios simultáneos en el ARNm de citocinas después de la infusión de la AQ, incluidas la interleucina-10 (IL-10) y el factor de necrosis tumoral a (TNF-a; Detert et al., 2013). Estos datos indican que el mecanismo neuroprotector de la AQ puede implicar la modulación de determinadas moléculas antiinflamatorias y proinflamatorias, posiblemente implicando un efecto similar al acondicionamiento previo. El estudio actual se diseñó para investigar más a fondo si la expresión de la proteína citocina también cambia de manera dependiente del tiempo después de una infusión intrahipocampal de AQ. Al centrarse en los posibles cambios en los niveles de proteína, se espera obtener una mejor comprensión de la medida en que la AQ modula varias citocinas y, en última instancia, comprender el mecanismo por el cual la AQ protege a las neuronas de la privación de oxígeno y glucosa.

El presente laboratorio ha demostrado previamente que una infusión de apoecuorina (AQ) en la región CA1 del hipocampo es neuroprotectora de manera dependiente del tiempo y la dosis (Detert et al., 2013).

Se observó una neuroprotección significativa a los 1 y 2 días, pero no 1 hora después de la infusión de AQ. Esto fue paralelo a la expresión alterada del ARNm de citocinas, lo que sugiere que esta neuroprotección isquémica puede implicar una respuesta neuroinmunomoduladora (Detert et al., 2013).

La inducción de un estímulo de estrés leve puede desencadenar un acondicionamiento previo isquémico a través de la modulación de la expresión de citocinas inflamatorias (Gidday, 2006).

La IL-10 protege a las neuronas del daño isquémico tanto in vitro como in vivo (Grilli et al., 2000).

La IL-10 inhibe el aumento de TNF-a, una citocina proinflamatoria, que está implicada en los mecanismos patológicos del ictus hemorrágico (Ewen et al., 2013).

El presente ejemplo demuestra que la infusión intrahipocampal de AQ inicia una respuesta neuroinmunomoduladora que desencadena cambios en la expresión de las proteínas IL-10 y TNF-a. Los datos que respaldan esta conclusión se proporcionan en las figuras 5, 6A a B, 7A a D y 8A a C.

Ejemplo 3. Los efectos neuroterapéuticos de la proteína de unión al calcio apoecuorina.

Las proteínas de unión al calcio (CaBP) mitigan la muerte celular por isquemia.

Los datos del presente laboratorio muestran que la CaBP apoecuorina (AQ) es neuroprotectora cuando se infunde en el hipocampo dorsal antes de una isquemia in vitro y conduce a una elevación específica del tiempo del ARNm de IL-10 y de TNF-a, lo que sugiere un papel para la AQ en el acondicionamiento previo (Detert et al., 2013).

El presente ejemplo demuestra que la infusión individual de AQ en el hipocampo modulará de manera diferencial la expresión de las proteínas IL-10 y TNF-a.

La toxicidad del calcio es evidente en el envejecimiento normal. De acuerdo con la hipótesis del calcio del envejecimiento, la desregulación de la homeostasis del calcio contribuye al deterioro cognitivo en el envejecimiento normal (Khachaturian, 1987).

Hay una reducción relacionada con la edad de las CaBP (DeJong et al., 1996; Bu et al., 2003; Moyer et al., 2011) y los hallazgos del presente laboratorio demuestran una expresión reducida de CaBP en el hipocampo, una estructura importante para el aprendizaje del miedo (McEchron et al., 1998). El acondicionamiento del miedo se altera en el envejecimiento normal (Villarreal et al., 2004; McEchron et al., 2004; Moyer et al., 2006). Mitigar el exceso de calcio conduce a una función cognitiva mejorada en animales que envejecen (Deyo et al., 1989; Veng et al., 2003).

Este ejemplo demuestra además que una infusión individual de AQ en el hipocampo mitigará los déficits relacionados con el envejecimiento en la adquisición del acondicionamiento del miedo.

Se utilizó la administración oral como método de administración. Usando la crema de avellanas Nutella® o la mantequilla de cacahuete como vehículo, la administración de los compuestos a ratas se puede lograr por vía oral (Isaksson et al., 2011; Cundell et al., 2003).

Datos recientes del presente laboratorio demuestran que la AQ es neuroprotectora cuando se administra por vía oral en una dosis única antes de la isquemia in vitro (Adams et al., SfN 2013). Este ejemplo demuestra además que los efectos neuroprotectores de la administración oral de AQ dependen de la dosis y del tiempo.

Las figuras 9A a C, 10A a C y 11A a C respaldan las siguientes conclusiones. La infusión directa de AQ da como resultado una expresión alterada de las proteínas IL-10 y TNF-a en relación con el vehículo. Tanto IL-10 como TNF-a muestran patrones de expresión diferencial después de la infusión de AQ, lo que indica que los efectos neuroprotectores de AQ pueden estar mediados por una respuesta inmunomoduladora.

La infusión de AQ no rescató las deficiencias en el aprendizaje del miedo en animales de edad avanzada y no interfirió con el aprendizaje de esta tarea en adultos. Las ratas envejecidas demuestran una disminución de la congelación al tono 24 h después del acondicionamiento en relación con los adultos, pero la administración de AQ no condujo a un aumento de la congelación en las ratas envejecidas como se predijo.

La administración oral de AQ da como resultado una neuroprotección que depende del tiempo y de la dosis. Una dosis de 48 mg/kg de AQ y 7 días de administración oral condujo a una reducción significativa de la muerte celular después de la isquemia.

Ejemplo 4. La administración oral de AQ es neuroprotectora en un modelo de corte agudo.

El presente laboratorio ha demostrado recientemente que la apoecuorina (AQ) es neuroprotectora en un modelo de corte cerebral agudo de ictus isquémico llamado privación de oxígeno y glucosa (POG). Las ratas que recibieron una infusión de AQ al 4 % demostraron una disminución de la muerte celular después de la POG (Detert et al., 2013).

Este ejemplo demuestra que la disminución de la muerte celular se debe a un mecanismo inmunomodulador, que implica cambios dependientes del tiempo en el ARNm de citocinas.

La administración oral de compuestos a ratas se logró mediante la utilización de la crema de avellanas Nutella® (Isaksson et al., 2011) o mantequilla de cacahuete (Cundell, et al., 2003) como vehículo. Recientemente, se ha demostrado que la AQ no es tóxica cuando se administra por sonda a las ratas (Moran, et al., 2013). La administración oral de AQ administrada en un vehículo, tal como la mantequilla de cacahuete, es menos invasiva que otros métodos (tales como la administración vírica, la infusión directa o la sonda) y un sistema de administración oral podría generalizarse a los estudios en seres humanos.

Este ejemplo demuestra que la administración oral de la AQ protege a las neuronas de la muerte celular inducida por la privación de oxígeno y glucosa.

Métodos

Animales. Se utilizaron 92 ratas adultas F344 macho. Las ratas se mantuvieron en un ciclo día/noche de 14/10 horas con acceso a comida y agua a demanda. El peso de cada animal se registró dos veces por semana, para tener en cuenta aumentos y/o disminuciones de peso significativos.

Fármacos. La apoecuorina (AQ; Quincy Bioscience) se preparó en agua doblemente desionizada a una concentración del 7,4 %. Los grupos experimentales en los experimentos dependientes de la dosis (n = 18) recibieron 0 (n = 4), 3,6 (n = 5), 48 (n = 4), 240 (n = 3) o 480 mg/kg de AQ mezclada con su MC diaria. Para el resto de los estudios, las ratas (n = 73) recibieron 48 mg/kg de AQ mezclada con su MC diaria. Los animales se asignaron a uno de cinco grupos; Sin Aq ^{(n = 12), AQ 1 hora (n = 17), AQ 1 día (n = 15), AQ 2 días (n = 15) y AQ 7 días (n = 14. Las ratas recibieron % de} cucharadita de MC colocada en una placa de Petri en la jaula todos los días a la hora designada. Las placas de Petri no se retiraron hasta que se consumió toda la MC. Los animales se pesaron dos veces por semana, para mantener la ^{dosis adecuada de} aQ.

La AQ para estudios de infusión se preparó como se describió previamente (Detert et al., 2013). El anticuerpo neutralizante (Acn) de IL-10 y su control de IgG se prepararon en PBS estéril. Se infundieron 0,5 |jg a una velocidad de 1 jl/m in a través de jeringas Hamilton de 1 jl.

Privación de oxígeno y glucosa. En el último día de la administración, se permitió a las ratas, 1 hora después del consumo de la MC, que hicieran la digestión, anestesiadas profundamente con isoflurano y se prepararon cortes coronales (400 pm) del hipocampo dorsal (hpcd; Bregma - 3,14 - -4,16; Paxinos & Watson, 1998) utilizando procedimientos convencionales (Moyer y Brown, 2007). Después de 1 h de recuperación de los cortes en LCRa, un hemisferio de cada cerebro (contrabalanceado) se sometió a isquemia in vitro mediante la transferencia de los cortes a una cámara con privación de oxígeno y glucosa (glucosa reemplazada por fructosa y burbujeada con N² al 95 % y CO² al 5 % en lugar de O² al 95 % y CO² al 5 %) durante 5 min, mientras que el otro hemisferio se mantuvo en recuperación. A continuación, todos los cortes se colocaron en LCRa oxigenado que contenía azul tripano al 0,2 % durante un período de reperfusión de 30 min. El azul tripano tiñe las células muertas mientras deja las células vivas sin teñir (DeRenzis y Schechtman, 1973). Los cortes se enjuagaron dos veces en LCRa oxigenado a temperatura ambiente y después se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % durante la noche en el frigorífico. A continuación, los cortes se crioprotegieron en sacarosa al 30 %, se seccionaron en un criostato (40 jm ) y se montó en portaobjetos recubiertos para el recuento de células.

Recuentos celulares. Los cortes se examinaron en un microscopio Olympus (equipado con una cámara digital) a 10* y se tomaron fotografías (CellSens). Un investigador con condiciones experimentales enmascaradas contó las neuronas teñidas con azul tripano dentro de CA1 (una sección de aproximadamente 800 pm). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS (v 21.0.0; IBM Corporation; Armonk, NY). Se utilizó un ANOVA para evaluar el efecto de un fármaco y se utilizaron a posteriori evaluaciones de LSD de Fisher para evaluar las interacciones entre grupos. El asterisco (*) indica p <0,05.

Transferencias Western. Se anestesiaron profundamente a los animales con isoflurano, se extrajeron rápidamente los cerebros, se congelaron y se almacenaron a -80 °C. En el momento de la disección, se diseccionaron muestras de hpcd (Bregma '3,14 - '4,16 mm). Las muestras se homogeneizaron, se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 min, se eliminó el sobrenadante y se midió la proteína con un kit de ensayo de proteínas Bradford (Bio-Rad). Las muestras de proteínas se normalizaron y cargaron para SDS-PAGE (12 %). Las proteínas (30 pg) se transfirieron a membranas de PVDF con el Turbo Transfer System (Bio-Rad). Las membranas se incubaron en tampón de bloqueo (2 h), anticuerpo primario (durante la noche a 4 °C; antiecuorina de ratón 1:1000 [Chemicon] o anti-p-actina de conejo 1:1000 [Cell Signaling Technology] y anticuerpo secundario (90 min; antirratón de cabra 1:20.000 [Santa Cruz Biotechnology] o anticonejo de cabra 1:40.000 [Millipore]). A continuación, se lavaron las membranas, se colocaron en una solución de quimioluminiscencia (Thermo Scientific) y se tomaron fotografías con un Syngene GBox. Las imágenes se tomaron con el programa informático GeneSys (v 1.2.4.0; cámara sinóptica 4.2MP) y la fluorescencia de cada banda se evaluó con el programa informático GeneTools (v 4.02; Cambridge, Inglaterra). Los valores se expresan como porcentaje de los animales de control. Las estadísticas se realizaron con SPSS (v. 21).

Sumario

Las figuras 12, 13A a C, 14A a D, 15A y B y 16 respaldan las siguientes conclusiones: El efecto neuroprotector de la apoecuorina depende de la dosis. Cuando se administra por vía oral, la AQ protege de la muerte celular inducida por POG a una dosis de 48 mg/kg.

La apoecuorina tiene un efecto neuroprotector de larga duración. Los cortes de cerebro de ratas que recibieron la administración oral de AQ durante 1 hora, 1 día, 2 días o 7 días mostraron neuroprotección.

La administración de apoecuorina altera la expresión de proteínas citocinas.

La expresión de la proteína TNF-a aumenta después de 2 días de la administración oral de AQ, mientras que la expresión de la proteína IL-10 sigue siendo la misma.

Cuando se infunde, la expresión de la proteína IL-10 aumenta en 1 hora en comparación con el hemisferio infundido con vehículo. Aún más, el TNF-a aumenta en 1 día y, posteriormente, los niveles de proteína caen por debajo del valor inicial. 4. El efecto neuroprotector de la apoecuorina es revertido por el anticuerpo neutralizante de IL-10.

Cuando se infunde 1 día antes de la POG in vitro, el efecto neuroprotector de la AQ se anula cuando se combina con un Acn de IL-10.

Los presentes datos sugieren que el efecto neuroprotector de la AQ implica a la IL-10; ya sea a través de la neutralización de IL-10 o de cascadas cadena abajo.

Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en el presente documento son solo para fines ilustrativos.

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Claims (2)

REIVINDICACIONES

1. Apoecuorina para su uso en un método de terapia que comprende el acondicionamiento previo de las neuronas para reducir la muerte de células neuronales después de la isquemia en un sujeto susceptible a la muerte celular por isquemia, proporcionando dicha apoecuorina en una dosificación terapéuticamente eficaz para acondicionar de manera previa las neuronas en el sujeto para reducir la muerte de células neuronales y en donde dicha apoecuorina se administra por vía oral en forma de una composición nutracéutica.

2. Apoecuorina para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la apoecuorina está en una forma de dosificación unitaria seleccionada de un comprimido o una cápsula.