BR112021009169A2

BR112021009169A2 - composição anticâncer

Info

Publication number: BR112021009169A2
Application number: BR112021009169-6A
Authority: BR
Inventors: Man-Chul Suh; Yieun Jung; Eun Ji Kim; Jae In Jung
Original assignee: Noahm Inc.
Priority date: 2018-11-12
Filing date: 2019-11-11
Publication date: 2021-08-17
Also published as: EP3880190B1; US20220000810A1; JP2022509552A; AU2019381050B2; KR102141971B1; CA3119713A1; CN113271933B; CN113271933A; AU2019381050A1; SG11202104832VA; JP7149025B2; KR20200054710A; WO2020101302A1; EP3880190A1; EP3880190A4

Abstract

COMPOSIÇÃO ANTICÂNCER. A presente invenção se refere à uma combinação que compreende, como ingredientes ativos: (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D-glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos. A composição de acordo com a presente invenção exibe um efeito anticâncer sinérgico combinando-se adequadamente fármacos específicos que têm um problema que precisam ser usados em uma grande quantidade, possibilitando, através disso, exterminar as células cancerosas em uma pequena quantidade e tratar de modo eficaz o câncer. Além disso, a composição da presente invenção pode exterminar apenas células cancerosas sem efeitos colaterais exibindo-se um efeito tóxico específico nas células cancerosas sem mostrar a toxicidade em células normais e, assim, pode ser usualmente usada como um agente anticâncer e para prevenir ou melhorar o câncer.

Description

“COMPOSIÇÃO ANTICÂNCER” 【Campo Técnico】

[0001] A presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar câncer e uma composição alimentícia para prevenir ou melhorar o câncer que compreende, como ingredientes ativos: (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D-glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos.

【Técnica Anterior】

[0002] A quimioterapia é um método de tratamento que usa fármacos anticâncer para suprimir e modificar o crescimento de tumores malignos e foi usada em 60 a 75 % dos pacientes com câncer como primeira terapia seletiva ou terapia adjuvante antes e após cirurgia e tratamento com radiação, dependendo do tumor.

[0003] Quando o câncer é causado atualmente, uma combinação de dois ou mais tratamentos é a base do tratamento do câncer. Embora a monoterapia ainda seja amplamente usada como um método de tratamento para vários tipos de câncer, esses métodos convencionais são geralmente menos eficazes que as terapias combinadas. As técnicas convencionais de monoterapia têm como alvo seletivo as células em proliferação ativa, levando à destruição de células saudáveis e cancerosas (Mokhtari et al., Oncotarget. 2017; 8: 38022-38043).

[0004] Como tal, a quimioterapia exibe toxicidade às células envolvendo-se as vias metabólicas das células cancerosas para interferir nos processos de replicação, transcrição e tradução do DNA por meio da interação direta com o DNA, interrompendo-se a síntese de precursores de ácido nucleico e inibindo-se a divisão celular. Consequentemente, o agente anticâncer danifica fatalmente as células normais para causar vários efeitos colaterais, como hematocitopenia de leucócitos, plaquetas e eritrócitos e similares causados pela destruição da medula óssea; queda de cabelo devido à destruição do folículo capilar; irregularidades menstruais e infertilidade masculina como efeitos colaterais nos ovários e testículos; estomatite, náusea, vômito e dificuldade para engolir e transtornos digestivos como efeitos colaterais da destruição das células da membrana mucosa do sistema digestivo; sintomas de diarreia; nefrotoxicidade devido a necrose tubular; neurite periférica e fraqueza causadas por transtornos do sistema nervoso; transtornos vasculares, como dor vascular e erupção cutânea e similares; e descoloração da pele e das unhas e similares. Portanto, pesquisas para aumentar os efeitos terapêuticos enquanto minimiza os efeitos colaterais causados por fármacos anticâncer são urgentemente necessárias.

[0005] Além disso, a principal razão para o fracasso da quimioterapia consiste no fato de que o fármaco anticâncer é eficaz inicialmente, mas gradualmente, a resistência ao fármaco é expressa e a imunidade está extremamente deteriorada. Portanto, há uma necessidade de um método para aprimorar a eficácia do tratamento do câncer sem aumentar a toxicidade do medicamento. A combinação de fármacos anticâncer pode ser usada como um método para aprimorar a eficácia dos fármacos anticâncer, mas infelizmente, não se pode esperar que a combinação de fármacos anticâncer seja sinérgica, e encontrar uma combinação de fármacos que tenham um efeito sinérgico é muito difícil. Portanto, é urgente desenvolver preparações complexas anticâncer que possam maximizar o efeito anticâncer enquanto minimizam os efeitos colaterais dos fármacos anticâncer.

[0006] Recentemente, houve muito interesse no desenvolvimento de terapias anticâncer direcionadas às vias de entrega de sinal celular que são importantes para o metabolismo e crescimento das células cancerosas e os fármacos representativos que envolvem o metabolismo das células cancerosas incluem metformina e 2-deoxi-D-glicose que são compostos à base de biguanida (Wokoun et al., Oncol Rep. 2017;37:2418-2424).

[0007] Como um agente anti-hiperglicêmico, a metformina tem sido usada como um primeiro agente terapêutico para diabetes tipo 2 por décadas. Apesar do uso difundido de metformina como um agente antidiabético, os efeitos anticâncer potenciais em mamíferos foram relatados pela primeira vez em 2001. Além disso, o primeiro relatório sobre a redução do risco de câncer em pacientes com diabetes tipo 2 tratados com metformina foi publicado há apenas 10 anos. Desde então, em muitos artigos, a metformina tem mostrado atividade antiproliferativa consistente em várias linhagens de células cancerosas, incluindo câncer de ovário e animais xenotransplantados ou camundongos transgênicos. Em relação ao metabolismo, a metformina foi encontrada como uma nova classe de inibidores do complexo I e ATP sintase, atua diretamente na mitocôndria para restringir a respiração e tornar a energia ineficiente e reduz o metabolismo da glicose através da circulação do ácido cítrico (Andrzejewski et al., 2014; 2: 12-25).

[0008] 2-deoxi-D-glicose foi considerada como um agente anticâncer potencial devido à sua dependência das células tumorais para a glicólise. 2-deoxi-D-glicose é um análogo da glicose que pode ser facilmente absorvido pelos transportadores de glicose e atua como um inibidor competitivo da glicólise, reduzindo, assim, a produção de ATP para induzir a morte celular através da ativação de caspase-3 em tumores sólidos (Zhang et al., Cancer Lett. 2014;355:176-183).

[0009] Estudos mostraram que uma combinação de dois fármacos, metformina e 2-deoxi-D-glicose, visando duas fontes principais de energia celular pode ter uma vantagem significativa em comparação com a quimioterapia convencional sozinha. Ou seja, a metformina não apenas reduz o açúcar no sangue, mas também bloqueia a cadeia respiratória na mitocôndria, que produz a energia necessária para a atividade celular, e a 2-deoxi-D-glicose inibe a degradação da glicose, de modo que a combinação dois fármacos, por fim, impeça um processo de transferência de energia das células. Quando esses processos metabólicos são ativados, as células cancerosas são vulneráveis a ataques externos devido ao fato de que a energia a ser fornecida diminui, mesmo que o consumo de energia aumente.

[0010] De acordo com os relatórios de vários tipos de tumor, sabe-se que a combinação de metformina e 2-deoxi-D-

glicose inibe o metabolismo celular e causa a morte de células tumorais, e a redução marcante e dependente da dose da sobrevivência de células de câncer de mama humano foi causada por transtornos metabólicos simultâneos em glicosilação (como 2-deoxi-D-glicose) e fosforilação oxidativa (como metformina) (Bizjak et al., Sci Rep. 2017;7:1761-1774).

[0011] No entanto, as doses comumente usadas de metformina e 2-deoxi-D-glicose são insuficientes para curar o câncer de forma suficiente e têm uma limitação de que podem ocorrer reações adversas no tratamento com altas doses (Raez et al., Cancer Chemother Pharmacol. 2013; 71: 523-530). O tratamento de combinação de metformina e 2- deoxi-D-glicose estudado por Cheong et al. foi eficaz em linhagens de células de câncer de mama, mas foi superior a uma concentração suportável no corpo humano ou uma concentração administrável no plasma (Cheong et al., Mol Cancer Ther. 2011;10:2350-2362). Em outro artigo, uma combinação de metformina e 2-deoxi-D-glicose foi testada com sucesso em células de câncer de próstata usando uma concentração de metformina maior que a concentração disponível no plasma humano (Ben Sahra et al., Cancer Res. 2010;70:2465-2475).

[0012] Isso sugere que é preferencial que os agentes anticâncer clinicamente eficazes, metformina e 2-deoxi-D- glicose, baixem as suas concentrações terapêuticas dentro de uma faixa que pode ser razoavelmente alcançada in vivo.

[0013] Enquanto isso, o hexafosfato de inositol e o inositol são compostos naturalmente orgânicos de fósforo que estão contidos em grandes quantidades na maioria dos grãos, sementes e leguminosas e estão presentes até mesmo em células de mamíferos, e estão presentes junto com uma forma de fosfato (IP1-5) com baixo teor de fosfatos. O hexafosfato de inositol desempenha uma função importante na regulação de funções celulares importantes, como transdução de sinal, proliferação celular e diferenciação de várias células e é reconhecido como um antioxidante natural (Shamsuddin et al., J Nutr. 2003;133:3778S-3784S).

[0014] Recentemente, foi relatado que o hexafosfato de inositol teve alguns efeitos na prevenção do câncer e na inibição do crescimento, progressão e metástase de tumores experimentais (Vucenik et al., Nutr Cancer. 2006;55:109- 125).

[0015] Em estudos clínicos preliminares, é relatado que o hexafosfato de inositol e o inositol são administrados em combinação com a quimioterapia para reduzir os efeitos colaterais da quimioterapia e melhorar a qualidade de vida em pacientes com câncer de mama ou colorretal que sofrem de metástase hepática. No entanto, ainda é difícil suprimir de modo eficaz o crescimento de células cancerosas apenas usando hexafosfato de inositol ou uma formulação de combinação de hexafosfato de inositol e inositol.

【Revelação】【Problema Técnico】

[0016] Portanto, os presentes inventores confirmaram que, quando o hexafosfato de inositol, inositol ou uma mistura dos mesmos foi usado como uma formulação complexa, enquanto os compostos à base de biguanida, metformina ou fenformina e 2-deoxi-D-glicose foram reduzidos para concentrações terapêuticas que podem ser razoavelmente alcançadas in vivo, um efeito de inibição do crescimento de células cancerosas foi significativamente aumentado e completou a presente invenção. Uma vez que os presentes inventores confirmaram que a formulação complexa pode matar de modo eficaz as células cancerosas, mesmo com uma combinação de baixas concentrações dos compostos, espera-se que sejam amplamente utilizados no campo do tratamento do câncer no futuro, bem como para garantir a segurança do corpo do ser humano.

[0017] Isto é, um objetivo da presente invenção consiste em fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar o câncer, que pode tratar de modo eficaz o câncer, mesmo com uma pequena quantidade de fármacos e exibe efeitos tóxicos em células cancerosas específicas, reduzindo, assim, os efeitos colaterais.

[0018] Além disso, outro objetivo da presente invenção consiste em fornecer uma composição alimentícia para prevenir ou melhorar o câncer.

【Solução Técnica】

[0019] Como um aspecto para alcançar os objetivos, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar câncer que compreende, como ingredientes ativos: (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D- glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos.

[0020] Como outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar câncer que compreende: (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D- glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos.

[0021] Como outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição alimentícia para prevenir ou melhorar o câncer que compreende, como ingredientes ativos: (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D-glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos.

[0022] Doravante no presente documento, a presente invenção será descrita em detalhes.

[0023] Em um aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar câncer que compreende, como ingredientes ativos: (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D-glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos.

[0024] Na presente invenção, preparando-se uma formulação complexa que compreende, como ingredientes ativos: (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D- glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol, ou uma mistura dos mesmos, um agente anticâncer excelente capaz de tratar de modo eficaz o câncer, mesmo com uma pequena quantidade com menos efeitos colaterais, foi desenvolvido.

[0025] A formulação complexa da presente invenção pode usar uma quantidade menor de composto individual incluído na formulação complexa que quando tratada com um único composto, reduzindo, através disso, significativamente o risco e/ou gravidade dos efeitos colaterais e aumentando significativamente o efeito geral do tratamento.

[0026] Na presente invenção, o composto à base de biguanida é, por exemplo, metformina ou fenformina. Especificamente, a metformina tem uma fórmula estrutural de Fórmula Química 1.

[0027] [Fórmula Química 1]

[0028]

[0029]

[0030] Especificamente, a fenformina tem uma fórmula estrutural de Fórmula Química 2.

[0031] [Fórmula Química 2]

[0032]

[0033]

[0034] Na presente invenção, quando (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D-glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos são usados como uma formulação complexa, os compostos exibem um alto efeito anticâncer mesmo em uma concentração baixa.

[0035] Os fármacos à base de biguanida não se limitam aos mesmos, mas têm um efeito anticâncer por meio de um mecanismo de ação que ativa uma enzima chamada quinase ativada por AMP (AMPK), que desempenha uma função fundamental no equilíbrio energético intracelular e na regulação metabólica de nutrientes.

[0036] Quando a metformina é administrada por via oral a ratos, pode-se ver que a metformina, LD50 da mesma é 1.450 mg/kg, é um composto muito seguro, mas ainda há um problema de que a metformina precisa ser usada em altas doses. Entretanto, a fenformina foi desenvolvida no final da década de 50 como um tratamento oral para diabetes e destinava-se ser usada no tratamento de diabetes independente da insulina (diabetes tipo 2), mas devido a um efeito colateral grave chamado acidose láctica, o uso de fenformina foi completamente banido no final dos anos 70.

[0037] Na presente invenção, uma composição compreendendo pelo menos três tipos de compostos foi preparada usando (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D- glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos como uma formulação complexa. Foi confirmado que a composição exibiu um alto efeito anticâncer mesmo em uma concentração muito mais baixa que a de cada agente único ou uma composição de uma combinação de dois compostos, melhorando, assim, um problema de administração de alta dose ou um problema de efeitos colaterais de metformina ou fenformina (consulte FIGS 1 a 4 e FIGS. 6 a 9).

[0038] Na presente invenção, 2-deoxi-D-glicose tem uma estrutura representada pela Fórmula Química 3.

[0039] [Fórmula Química 3]

[0040]

[0041]

[0042] O composto de Fórmula Química 3 tem um efeito de ação como um inibidor de glicólise.

[0043] Na presente invenção, quando 2-deoxi-D-glicose e um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos é usada como uma formulação complexa, confirmou-se que tinha um alto efeito anticâncer mesmo em baixas concentrações. 2-deoxi-D-glicose, um derivado de glicose, tem um efeito de ação de inibição de glicólise em um metabolismo de glicose e inibição de glicosilação de proteínas no retículo endoplasmático para induzir estresse ventricular. Tal como, 2-deoxi-D-glicose, um inibidor de degradação de glicose, não demonstrou exterminar células cancerosas por si só, mas forma uma formulação complexa da presente invenção por ter excelentes efeitos anticâncer.

[0044] Na presente invenção, hexafosfato de inositol e/ou inositol podem regular várias vias importantes em células cancerosas. Na presente invenção, o hexafosfato de inositol tem especificamente uma estrutura de Fórmula

Química 4.

[0045] [Fórmula Química 4]

[0046]

[0047]

[0048] Na presente invenção, o inositol tem especificamente uma estrutura de Fórmula Química 5.

[0049] [Fórmula Química 5]

[0050]

[0051]

[0052] Na presente invenção, confirmou-se que hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos são combinados com um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e 2-deoxi-D-glicose para terem um alto efeito anticâncer mesmo em uma baixa concentração.

[0053] Na presente invenção, o composto à base de biguanida e hexafosfato de inositol podem estar presentes na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Como o sal, os sais de adição de ácido formados com ácidos livres farmaceuticamente aceitáveis são úteis. O termo "sal farmaceuticamente aceitável" usado na presente invenção se refere a qualquer sal de adição orgânico ou inorgânico em que a uma concentração que tem efeitos relativamente não tóxicos e inofensivos em um paciente, os efeitos colaterais causados pelo sal não degradam um efeito benéfico do composto à base de biguanida e hexafosfato de inositol.

[0054] Ao mesmo tempo, como o sal de adição, ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido tartárico, etc. podem ser usados como ácido inorgânico e ácido metanossulfônico, ácido p- toluenossulfônico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido maleico, ácido succínico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido mandérico, ácido propiônico, ácido cítrico, ácido lático, ácido glicólico, ácido glucônico, ácido galacturônico, ácido glutâmico, ácido glutárico, ácido glucurônico, ácido aspártico, ácido ascórbico, ácido carbônico, ácido vanílico, ácido iodídrico, etc. podem ser usados como ácido orgânico, porém sem limitação.

[0055] Além disso, as bases podem apenas ser usadas para preparar sais de metal farmaceuticamente aceitáveis. Um sal de metal alcalino ou um sal de metal alcalinoterroso pode ser obtido, por exemplo, dissolvendo-se o composto em uma grande quantidade de solução de hidróxido de metal alcalino ou hidróxido de metal alcalinoterroso, filtrando-se um sal de compostos não dissolvido e, então, evaporando-se e secando-se um filtrado. Nesse caso, o sal de metal é farmaceuticamente adequado para preparar, particularmente, sais de sódio, potássio, cálcio e magnésio ou sais misturados dos mesmos, porém sem limitação.

[0056] Um sal farmaceuticamente aceitável de cada um dentre composto à base de biguanida (metformina ou fenformina) e hexafosfato de inositol pode ser um sal de grupo ácido ou básico que pode estar presente em cada um dentre o composto à base de biguanida (metformina ou fenformina) e hexafosfato de inositol, salvo se indicado o contrário. Por exemplo, o sal farmaceuticamente aceitável pode incluir sais de sódio, potássio, cálcio ou magnésio e similares de um grupo hidróxi, e outros sais farmaceuticamente aceitáveis de um grupo amino incluem sais de bromidrato, sulfato, hidrogenossulfato, fosfato, hidrogenofosfato, di-hidrogenofosfato, acetato, succinato, citrato, tartarato, lactato, mandelato, metanossulfonato (mesilato) e p-toluenossulfonato (tosilato) e similares, que podem ser preparados através de um método para preparar um sal conhecido na técnica.

[0057] Como o sal do composto à base de biguanida (metformina ou fenformina) da presente invenção, como um sal farmaceuticamente aceitável, qualquer um dos sais de metformina ou fenformina exibindo efeitos anticâncer equivalentes à metformina ou fenformina pode ser usado. Preferencialmente, podem ser usados, porém sem limitação, cloridrato de metformina, succinato de metformina, citrato de metformina ou cloridrato de fenformina, succinato de fenformina, ácido cítrico de fenformina e similares.

[0058] Como o sal de hexafosfato de inositol da presente invenção, como um sal farmaceuticamente aceitável, qualquer sal de hexafosfato de inositol que exibe um efeito anticâncer equivalente à hexafosfato de inositol pode ser usado. Preferencialmente, hexafosfato de inositol de sódio, hexafosfato de inositol de potássio, hexafosfato de inositol de cálcio, hexafosfato de inositol de amônio, hexafosfato de inositol de magnésio, hexafosfato de inositol de cálcio de magnésio e similares podem ser usados, porém sem limitação.

[0059] O composto à base de biguanida, 2-deoxi-D-glicose e hexafosfato de inositol da presente invenção também inclui derivados dos mesmos. O termo "derivado" se refere a um composto preparado alterando-se quimicamente uma parte do composto, por exemplo, introdução, substituição e deleção de um grupo funcional, desde que a atividade anticâncer do composto não seja alterada e possa ser incluída sem limitação na presente invenção.

[0060] Na presente invenção, o inositol pode existir na forma de vários isômeros. Os isômeros incluem enantiômeros e diastereômeros. Qualquer inositol que tenha um efeito farmacologicamente anticâncer pode ser usado e, preferencialmente, pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em D-quiro-inositol, L-quiro-inositol, mio-inositol e cilo-inositol podem ser usados, porém sem limitação.

[0061] Mesmo combinando dois ou mais fármacos, cada um dos quais é conhecido por ter um efeito anticâncer, não se pode esperar que o fármaco combinado exiba um efeito sinérgico e, em vez disso, uma função do fármaco é compensada pela combinação, de modo que seja muito difícil encontrar uma combinação de fármacos com efeito sinérgico. Na presente invenção, foi desenvolvida uma formulação de complexo anticâncer capaz de maximizar o efeito anticâncer enquanto minimiza os efeitos colaterais usando uma concentração mínima de fármacos anticâncer.

[0062] Na presente invenção, um aspecto preferencial da composição farmacêutica para prevenir ou tratar o câncer pode ser uma composição compreendendo um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, 2-deoxi-D-glicose e hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos; uma composição que compreende um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, 2-deoxi-D-glicose e inositol; ou uma composição que compreende um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, 2-deoxi-D-glicose e hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e inositol.

[0063] Na presente invenção, o composto à base de biguanida pode ser metformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, ou fenformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

[0064] Ao descrever uma composição baseada em metformina como o composto à base de biguanida, a composição farmacêutica para prevenir ou tratar o câncer pode ser uma composição que compreende metformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, 2-deoxi-D-glicose e hexafosfato de inositol ou um farmaceuticamente aceitável sal do mesmo; uma composição que compreende metformina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesma, 2-deoxi-D- glicose e inositol; ou uma composição que compreende metformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, 2-deoxi-D-glicose e hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e inositol.

[0065] Ao descrever uma composição baseada em fenformina como outro composto à base de biguanida, a composição para prevenir ou tratar o câncer pode ser uma composição que compreende fenformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, 2-deoxi-D-glicose, e hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; uma composição que compreende fenformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, 2-deoxi-D-glicose e inositol; ou uma composição que compreende fenformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, 2-deoxi-D-glicose e hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e inositol.

[0066] Em uma modalidade da presente invenção, confirmou-se que uma formulação complexa que consiste em um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, 2-deoxi-D-glicose, e hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode inibir a proliferação celular de linhagens de célula cancerosa in vitro (Exemplo 1).

[0067] Além disso, no caso de usar uma formulação complexa que consiste em três ou mais compostos constituídos por uma composição que compreende um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, 2-deoxi-D-glicose e hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; uma composição que compreende um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, 2-deoxi-D-glicose e inositol; ou uma composição que compreende um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, 2-deoxi-D-glicose, hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e inositol, devido à combinação dos compostos, confirmou-se que um efeito sinérgico para prevenir ou tratar o câncer foi mostrado in vivo e uma concentração de supressão de câncer foi significativamente reduzida (Exemplos 5 a 9).

[0068] Isto é, de acordo com a presente invenção, no caso de usar cada um dentre o composto à base de biguanida, 2-deoxi-D-glicose, hexafosfato de inositol e inositol sozinho, uma grande quantidade dos mesmos precisa ser usada devido aos efeitos anticâncer insuficientes, mas quando uma formulação complexa que combina os compostos é usada, confirmou-se que as células cancerosas podem ser exterminadas de modo eficaz mesmo em uma pequena quantidade.

[0069] Em particular, uma formulação complexa de metformina/2-deoxi-D-glicose/hexafosfato de inositol, uma formulação complexa de metformina/2-deoxi-D- glicose/inositol, e uma formulação complexa de metformina/2-deoxi-D-glicose/hexafosfato de inositol/inositol mostrou um efeito muito maior na redução de uma concentração de supressão de câncer que uma formulação única de cada composto ou uma formulação complexa de dois compostos, como metformina/2-deoxi-D- glicose.

[0070] Em cada formulação complexa de acordo com a presente invenção, uma razão de peso da combinação de cada composto não é particularmente limitada.

[0071] Por exemplo, uma razão de peso de metformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma: 2-deoxi-D- glicose:hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode estar em uma faixa de 1: 0,2: 0,5 a

1: 5: 20, e uma quantidade relativa de combinação pode variar dependendo de um tipo de câncer a ser tratado.

[0072] Em outro exemplo, uma razão de peso de fenformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma: 2-deoxi-D- glicose:hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode estar em uma faixa de 1: 1: 1 a 1: 50: 200, e uma quantidade relativa de combinação pode variar dependendo de um tipo de câncer a ser tratado.

[0073] Em outro exemplo, uma razão de peso de metformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma: 2-deoxi-D- glicose: inositol pode estar em uma faixa de 1: 0,2: 0,5 a 1: 5: 20, e uma quantidade relativa de combinação pode variar dependendo de um tipo de câncer a ser tratado.

[0074] Em outro exemplo, uma razão de peso de fenformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma: 2-deoxi-D- glicose: inositol pode estar em uma faixa de 1: 1: 1 a 1: 50: 200, e uma quantidade relativa de combinação pode variar dependendo de um tipo de câncer a ser tratado.

[0075] Em outro exemplo, uma razão de peso de metformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma: 2-deoxi-D- glicose:hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:inositol pode estar em uma faixa de 1: 0,2: 0,5: 0,5 a 1: 5: 20: 20, e uma quantidade relativa de combinação pode variar dependendo de um tipo de câncer a ser tratado.

[0076] Em outro exemplo, uma razão de peso de fenformina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma: 2-deoxi-D- glicose:hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:inositol pode estar em uma faixa de 1: 1: 1: 1 a 1: 50: 200: 200, e uma quantidade relativa de combinação pode variar dependendo de um tipo de câncer a ser tratado.

Na presente invenção, o termo "câncer" se refere a uma doença associada ao controle da morte celular e se refere a uma doença causada pela proliferação excessiva de células quando um equilíbrio apoptótico normal é rompido.

Essas células em proliferação excessiva anormal invadem os tecidos e órgãos circundantes para formar massas em alguns casos e destroem ou modificam a estrutura normal do corpo, que é chamada de câncer.

Em geral, o termo "tumor" se refere a uma massa que cresce anormalmente por supercrescimento autônomo de tecidos corporais e pode ser classificado em um tumor benigno e um tumor maligno.

O tumor maligno cresce muito mais rápido que o tumor benigno e invade os tecidos circundantes, como resultado, ocorre metástase que ameaça a vida.

O tumor maligno é comumente referido como "câncer" e os tipos de câncer incluem tumor da medula espinhal cerebral, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer de mama, tumor tímico, câncer de esôfago, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer do trato biliar, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer testicular, tumor de células germinativas, câncer de ovário, câncer cervical, câncer endometrial, linfoma, leucemia aguda, leucemia crônica, mieloma múltiplo, sarcoma, melanoma maligno e câncer de pele e similares.

A composição anticâncer da presente invenção pode ser usada sem limitação ao tipo de câncer, mas pode ser usada para prevenir ou tratar pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de pâncreas, câncer de cólon,

câncer cervical, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de cérebro, osteossarcoma e câncer de bexiga.

[0077] O termo "prevenir ou tratar" usado na presente invenção se refere a todas as ações que inibem ou atrasam o desenvolvimento do câncer usando a composição que compreende, como ingredientes ativos: (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D-glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos e, particularmente, "tratar" se refere a todas as ações de melhora ou modificação de modo benéfico do câncer usando a composição.

[0078] Portanto, a presente invenção fornece um método para tratar câncer que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D-glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos a um indivíduo em necessidade de tratamento do mesmo.

[0079] O termo "administrar" usado na presente invenção se refere ao fornecimento a um indivíduo da composição de acordo com a presente invenção de qualquer maneira adequada. Nesse momento, o indivíduo se refere a um animal, e pode ser um mamífero que pode exibir um efeito benéfico, tipicamente com tratamento com a composição de acordo com a presente invenção. Os exemplos preferenciais de tais indivíduos podem incluir primatas, como humanos.

[0080] A composição para prevenir ou tratar o câncer da presente invenção pode incluir adicionalmente um agente quimioterápico para o tratamento do câncer, se necessário, além dos ingredientes ativos mencionados acima.

[0081] Além disso, a composição para prevenir ou tratar o câncer da presente invenção pode incluir adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição da presente invenção, de acordo com o propósito de uso, pode ser formulada e usada por formulação oral, como pós, grânulos, comprimidos, cápsulas, suspensões, emulsões, xaropes e aerossóis e similares, soluções injetáveis estéreis, formas externas, como pomadas e similares, e supositórios e similares de acordo com os métodos gerais. Um carreador, um excipiente e um diluente que podem ser incluídos na composição podem incluir lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metilcelulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio e óleo mineral e similares.

[0082] Uma formulação sólida para administração oral inclui um comprimido, uma pílula, um pó, um grânulo, uma cápsula e similares, e tal formulação sólida pode ser formulada pela mistura de pelo menos um excipiente, por exemplo, amido, carbonato de cálcio, sacarose, lactose, gelatina e similares com a composição. Além disso, lubrificantes, como estearato de magnésio e talco, também podem ser usados além dos excipientes simples. Uma formulação líquida para administração oral pode corresponder a uma suspensão, uma solução aplicada internamente, uma emulsão, um xarope e similares, e pode incluir vários excipientes, por exemplo, um agente umectante, um adoçante, um agente aromático, um agente conservante e similares, além de água e parafina líquida que são comumente usados como diluentes simples.

[0083] Uma formulação para administração parenteral inclui uma solução aquosa estéril, uma solução não aquosa, uma suspensão, uma emulsão e um agente de liofilização e um supositório. Como a solução não aquosa e a suspensão, podem ser usados propilenoglicol, polietilenoglicol, óleo vegetal, como azeite, éster injetável, como oleato de etila e similares. As bases para o agente injetável podem incluir aditivos convencionais, como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, emulsificantes, estabilizantes e conservantes.

[0084] A composição da presente invenção pode ser administrada usando uma variedade de métodos, como administração oral, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intranasal, intraperitoneal, intramuscular e transdérmica e similares, e a dosagem pode variar dependendo da idade, sexo e peso do paciente e pode ser facilmente determinada por aqueles técnicos no assunto. A dosagem da composição de acordo com a presente invenção pode ser aumentada ou diminuída dependendo da via de administração, da gravidade da doença, do sexo, do peso, da idade e similares. Preferencialmente, no caso de uma formulação complexa de quatro compostos, a metformina como o composto à base de biguanida pode ser usada com 5 a 80 mg/kg (peso corporal) por dia, a fenformina pode ser usada com 0,1 a 10 mg/kg (peso corporal) por dia, 2-deoxi-D-glicose pode ser usada com 0,1 a 160 mg/kg (peso corporal) por dia, hexafosfato de inositol pode ser usado com 2 a 600 mg/kg (peso corporal) por dia, e inositol pode ser usado com 2 a 600 mg/kg (peso corporal) por dia. No entanto, o escopo da presente invenção não é limitado pela dosagem.

[0085] Como outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para tratar o câncer que compreende administrar, a um indivíduo, (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D- glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos.

[0086] Como ainda outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição para uso no tratamento de câncer que compreende: (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D- glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos.

[0087] Como ainda outro aspecto, a presente invenção se refere a um uso da composição que compreende: (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D-glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos para preparar um fármaco para prevenir ou tratar o câncer.

[0088] Como ainda outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição alimentícia para prevenir ou melhorar o câncer que compreende, como ingredientes ativos: (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D- glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos.

[0089] O composto à base de biguanida pode ser metformina ou fenformina.

[0090] A composição pode incluir aditivos de suplemento alimentar aceitáveis para o alimento, além dos ingredientes ativos.

[0091] O termo "aditivo de suplemento alimentar" usado na presente invenção significa um componente que pode ser adicionado suplementarmente ao alimento e pode ser apropriadamente selecionado e usado por aqueles técnicos no assunto como sendo adicionado para preparar um alimento funcional saudável de cada formulação. Exemplos de aditivos de suplemento alimentar incluem vários nutrientes, vitaminas, minerais (eletrólitos), sabores, como sabores sintéticos e naturais e similares, corantes e enchimentos, ácido péctico e sais do mesmo, ácido algínico e sais do mesmo, ácidos orgânicos, espessantes coloidais protetores, ajustadores de pH, estabilizadores, conservantes, glicerina, álcoois e agentes de carbonatação usados em bebidas carbonatadas e similares, mas os tipos de aditivos de suplemento da presente invenção não são limitados pelos exemplos acima.

[0092] A composição alimentícia da presente invenção pode incluir um alimento funcional saudável. O termo "alimento funcional saudável" usado na presente invenção se refere a alimentos preparados e processados na forma de comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, líquidos e pílulas e similares usando matérias-primas ou ingredientes com funcionalidades úteis para o corpo humano. No presente documento, a “funcionalidade” se refere ao ajuste de nutrientes à estrutura e função do corpo humano ou à obtenção de efeitos úteis para aplicações de saúde, como ação fisiológica e similares. O alimento funcional saudável da presente invenção pode ser preparado por métodos que são comumente usados na técnica e pode ser preparado pela adição de matérias-primas e ingredientes que são comumente adicionados na técnica na preparação. Além disso, a formulação do alimento funcional saudável também pode ser preparada sem limitação, desde que a formulação seja reconhecida como um alimento funcional saudável. A composição alimentícia da presente invenção pode ser preparada em vários tipos de formulações e, ao contrário de fármacos gerais, a composição alimentícia feita a partir de alimentos como matéria-prima tem a vantagem de não haver nenhum efeito colateral que pode ocorrer quando se toma um uso de longo prazo do fármaco e tem excelente portabilidade, e o alimento funcional saudável da presente invenção pode ser tomado como suplementos para aumentar os efeitos dos fármacos anticâncer.

【Efeitos Vantajosos】

[0093] A composição da presente invenção exibe um efeito anticâncer sinérgico combinando-se adequadamente fármacos específicos que têm um problema de que precisam ser usados em uma grande quantidade, possibilitando, através disso, exterminar as células cancerosas em uma pequena quantidade e tratar de modo eficaz o câncer. Além disso, a composição da presente invenção pode exterminar apenas células cancerosas sem efeitos colaterais exibindo-se um efeito tóxico específico nas células cancerosas sem mostrar a toxicidade em células normais e, assim, pode ser usualmente usada como um agente anticâncer e para prevenir ou melhorar o câncer.

【Descrição dos Desenhos】

[0094] As FIGS. 1 e 2 são gráficos que mostram a taxa de sobrevivência celular por ensaio de MTT como uma porcentagem após 48 horas tratando-se formulações únicas e complexas de metformina (MET), 2-deoxi-D-glicose (2DG) e hexafosfato de inositol (IP6) para linhagens de célula cancerosa derivada de humano em uma baixa concentração utilizável no plasma humano. Uma barra vertical de cada barra representa um desvio padrão. A análise estatística foi realizada por testagem ANOVA de uma via usando pós- análise de comparação múltipla de Tukey usando o software GraphPad Prism 6.0.

[0095] A FIG. 1A é um gráfico do exame de uma linhagem celular HepG2 como células cancerosas derivadas de fígado humano. A FIG. 1B é um gráfico do exame de uma linhagem celular A549 como células cancerosas derivadas do pulmão humano. A FIG. 1C é um gráfico do exame de uma linhagem de célula AGC como células cancerosas derivadas do estômago humano. A FIG. 1D é um gráfico do exame de uma linhagem de célula PANC-1 como células cancerosas derivadas do pâncreas humano. A FIG. 1E é um gráfico do exame de uma linhagem de célula DLD-1 como células cancerosas derivadas do cólon humano. A FIG. 1F é um gráfico do exame de uma linhagem de célula HeLa como células cancerosas derivadas do colo uterino humano. A FIG. 2A é um gráfico do exame de uma linhagem de célula MDA-MB-231 como células cancerosas derivadas do seio humano. A FIG. 2B é um gráfico do exame de uma linhagem de célula PC-3 como células cancerosas derivadas da próstata humana. A FIG. 2C é um gráfico do exame de uma linhagem de célula SK-OV-3 como células cancerosas derivadas do ovário humano. A FIG. 2D é um gráfico do exame de uma linhagem de célula T24 como células cancerosas derivadas da bexiga humana. A FIG. 2E é um gráfico do exame de uma linhagem de célula U-87 MG como células cancerosas derivadas do cérebro humano. A FIG. 2F é um gráfico do exame de uma linhagem de célula Saos-2 como células cancerosas derivadas dos ossos humanos. **** p < 0,0001.

[0096] As FIGS. 3 e 4 são gráficos que mostram a taxa de sobrevivência celular por ensaio de MTT como uma porcentagem após 48 horas tratando-se formulações únicas e complexas de fenformina (PHE), 2DG e IP6 para linhagens de célula cancerosa derivada de humano em uma baixa concentração utilizável no plasma humano. Uma barra vertical de cada barra representa um desvio padrão. A análise estatística foi realizada por testagem ANOVA de uma via usando pós-análise de comparação múltipla de Tukey usando o software GraphPad Prism 6.0.

[0097] A FIG. 3A é um gráfico do exame de uma linhagem celular HepG2 como células cancerosas derivadas de fígado humano. A FIG. 3B é um gráfico do exame de uma linhagem celular A549 como células cancerosas derivadas do pulmão humano. A FIG. 3C é um gráfico do exame de uma linhagem de célula AGC como células cancerosas derivadas do estômago humano. A FIG. 3D é um gráfico do exame de uma linhagem de célula PANC-1 como células cancerosas derivadas do pâncreas humano. A FIG. 3E é um gráfico do exame de uma linhagem de célula DLD-1 como células cancerosas derivadas do cólon humano. A FIG. 3F é um gráfico do exame de uma linhagem de célula HeLa como células cancerosas derivadas do colo uterino humano. A FIG. 4A é um gráfico do exame de uma linhagem de célula MDA-MB-231 como células cancerosas derivadas do seio humano. A FIG. 4B é um gráfico do exame de uma linhagem de célula PC-3 como células cancerosas derivadas da próstata humana. A FIG. 4C é um gráfico do exame de uma linhagem de célula SK-OV-3 como células cancerosas derivadas do ovário humano. A FIG. 4D é um gráfico do exame de uma linhagem de célula T24 como células cancerosas derivadas da bexiga humana. A FIG. 4E é um gráfico do exame de uma linhagem de célula U-87 MG como células cancerosas derivadas do cérebro humano. A FIG. 4F é um gráfico do exame de uma linhagem de célula Saos-2 como células cancerosas derivadas dos ossos humanos. **** p < 0,0001.

[0098] A FIG. 5 é um gráfico que mostra a taxa de sobrevivência celular por ensaio de MTT como uma porcentagem após 48 horas tratando-se uma formulação complexa de MET, 2DG e IP6 para linhagens de célula normal derivada de humano em uma baixa concentração utilizável no plasma humano. **** p < 0,0001.

[0099] A FIG. 6 é um diagrama que mostra a taxa de sobrevivência celular e expressão de proteína em células 4T1 usando formulações únicas e complexas de MET, 2DG e IP6.

* p < 0,05. **** p < 0,0001.

[0100] A FIG. 7 é um gráfico de inibição de síntese de ATP de formulações únicas e complexas de MET, 2DG e IP6 para células 4T1. * p < 0,05. **** p < 0,0001.

[0101] A FIG. 8 é um gráfico de volumes de tumor medidos em intervalos de três dias de acordo com a administração de formulações únicas e complexas de MET, 2DG, IP6 e Ins em um animal de teste. * p < 0,05, **** p < 0,0001.

[0102] A FIG. 9 é um gráfico de pesos de tumor medidos no dia 19 após administração de formulações únicas e complexas de MET, 2DG, IP6 e Ins em um animal de teste. * p < 0,05, ** p < 0,01, **** p < 0,0001.

[0103] A FIG. 10 é um gráfico de pesos medidos no dia 18 após administração de formulações únicas e complexas de MET, 2DG, IP6 e Ins em um animal de teste. NS (nenhuma diferença significativa).

[0104] A FIG. 11 é um gráfico do exame da incidência de metástase pulmonar de formulações únicas e complexas de MET, 2DG, IP6 e Ins.

[0105] A FIG. 12 é um diagrama de coloração de hematoxilina & eosina para examinar os efeitos de formulações únicas e complexas de MET, 2DG, IP6 e Ins nas alterações histomorfológicas dos tecidos tumorais.

【Modo para a Invenção】

[0106] Vantagens e recursos da presente invenção e métodos para realizar os mesmos serão evidentes com referência às modalidades descritas abaixo em detalhes. No entanto, a presente invenção não está limitada às seguintes modalidades exemplificativas, mas pode ser implementada em várias formas diferentes. As modalidades exemplificativas são fornecidas apenas para completar a revelação da presente invenção e para fornecer totalmente um técnico no assunto ao qual a presente invenção pertence com a categoria da invenção, e a presente invenção será definida apenas pelas reivindicações anexas.

[0107] Nos Exemplos abaixo, cloridrato de metformina (HCl de Metformina) e cloridrato de fenformina (HCl de Fenformina) foram usados entre várias formas de sal farmaceuticamente aceitáveis de metformina ou fenformina como um composto à base de biguanida. A forma desses sais não é limitada pelos exemplos.

[0108] Nos exemplos seguintes, hexafosfato de inositol (ácido fítico) foi usado entre várias formas de sal farmaceuticamente aceitável de hexafosfato de inositol. A forma desses sais não é limitada pelos exemplos.

[0109] Nos exemplos seguintes, o mio-inositol foi usado como um isômero de inositol. Esses isômeros não são limitados pelos Exemplos.

[0110] Cultura celular

[0111] As células usadas no teste foram câncer de fígado (HepG2), câncer de pulmão (A549), câncer de estômago (AGS), câncer de pâncreas (PANC-1), câncer de cólon (DLD-1), câncer cervical (HeLa), câncer de mama (MDA- MB-231), câncer de próstata (PC-3), câncer de ovário (SK-OV-3), câncer de bexiga (T24), glioblastoma (U-87 MG), osteossarcoma (Saos-2) e câncer de mama derivado de camundongo (4T1) como células tumorais e as linhagens celulares de próstata (PZ-HPV-7), cólon (CCD-18Co) e pulmão (MRC5) como células não tumorais. Todas as linhagens celulares foram adquiridas e utilizadas em Korean Cell Line Bank ou US American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, EUA).

[0112] As células foram cultivadas e mantidas em uma incubadora de 37 ℃ (5 % de CO2/95 % de ar) usando uma solução de cultura celular obtida pela adição de 10 % de soro fetal bovino (FBS, Hyclone) e 1 % de penicilina/estreptomicina (P/S, Hyclone) para um meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640, Hyclone, Logan, UT, EUA). Quando as células foram preenchidas até cerca de 80 % de um prato de cultura, uma única camada das células foi lavada com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS, Hyclone) e subcultivada com tripsina a 0,25 %-2,65 mM de EDTA (Hyclone) e o meio foi trocado a cada dois dias.

[0113] Fármaco usado

[0114] HCl de metformina (doravante no presente documento, referido como MET), HCl de fenformina (doravante no presente documento, referido como PHE), 2-deoxi-D- glicose (doravante no presente documento, referido como 2DG), hexafosfato de inositol (ácido fítico, doravante no presente documento, referido como IP6) e o mio-inositol (doravante no presente documento referido como Ins) foram adquiridos junto a Sigma (St. Louis, EUA). Na presente invenção, todos os fármacos usados na Tabela e os desenhos que resumem os resultados obtidos através de um teste foram indicados como abreviaturas.

[0115] Exemplo de Referência 1: Ensaio de Inibição de Crescimento Celular In Vitro

[0116] A citotoxicidade de MET ou PHE, 2DG e IP6 foi confirmada pelo ensaio MTT [ensaio de brometo de 3-(4,5- dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazólio]. Após a dispensação das células (3 a 4 × 105 células/poço) em uma placa de cultura de 96 poços e estabilização por 12 horas ou mais, o meio de cada poço foi removido e MET ou PHE, 2DG e IP6 para cada célula foram misturados para cada concentração e tratado com um meio sem soro. Para células de controle, PBS foi adicionado ao meio. Após incubação a 37 ℃ com CO2 por 48 horas, o meio contendo o controle e a mistura foi claramente removido e cultivado a 37 ℃ por 4 horas com um reagente de MTT (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) (0,5 mg/ml). Depois disso, o meio contendo o reagente de MTT foi claramente removido e os cristais de MTT em Formazan formados pelas células vivas foram deixados e dissolvidos à temperatura ambiente por 15 minutos ou mais pela adição de DMSO (Sigma). A absorbância foi medida em um comprimento de onda de 560 nm usando um leitor de microplacas (BioTek® Instruments, Inc., Winooski, VT, EUA).

[0117] Exemplo de Referência 2: Método de Teste para Formulação Única e Formulação Complexa

[0118] As células (3 a 4 × 105 células/poço) foram semeadas em uma placa de 96 poços e tratadas com cada um dentre MET ou PHE, 2DG e IP6 como uma única formulação para cada concentração para confirmar uma taxa de inibição da proliferação celular.

[0119] O fármaco de formulação complexa foi tratado com uma concentração de um fármaco correspondente a IC50 de uma formulação complexa que consiste em dois ou mais compostos selecionados do grupo que consiste em MET ou PHE, 2DG e IP6. Todas as linhagens celulares foram cultivadas por 48 horas na concentração de uma formulação única ou complexa e um efeito de inibição de crescimento foi medido pelo ensaio MTT.

[0120] Exemplo de Referência 3: Análise de Western Blot

[0121] A fim de isolar proteínas em células, um tampão de lise total (Tris a 50 mM, NaCl a 150 mM, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 5 mM, ditiotreitol a 1 mM (DTT), 0,5 % de nonidet P-40, fluoreto de fenilmetilsulfonil a 100 mM (PMSF), aprotinina a 20 mM, leupeptina a 20 mM, pH 8,0) foi adicionado e dissolvido a 4 ℃ por 30 minutos e, em seguida, centrifugado (12.000 rpm, 10 minutos) para obter um sobrenadante.

[0122] Além disso, a fim de isolar proteínas no citoplasma/núcleo, uma solução tampão A (Hepes a 10 mM (pH 7,9), MgCl2 a 1,5 mM, KCl a 10 mM, DTT a 0,5 mM, Sacarose a 300 mM, 0,1 % de NP-10, PMSF a 0,5 mM) foi adicionada às células e dissolvida a 4 ℃ por 5 minutos e centrifugada (1.000 rpm, 1 minuto) para isolar um pélete (proteína nuclear). O pélete isolado foi dissolvido com uma solução de tampão B (Hepes a 20 mM (pH 7,9), 20 % de glicerol, KCl a 100 mM, NaCl2 a 100 mM, EDTA a 0,2 mM, DTT a 0,5 mM, PMSF a 0,5 mM) por 15 minutos a 4 ℃ e centrifugado (10.000 rpm, 5 minutos) para isolar uma proteína no núcleo.

[0123] A proteína extraída pelo método acima foi submetida a eletroforese em um gel de dodecil sulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida e a proteína foi submetida a eletroforese em uma membrana de nitrocelulose (Whatman, GE Health Care Corp., Fairfield, CT, EUA). A fim de pesquisar uma proteína específica, TBS-T contendo 5 % de leite desnatado (GIBCO-BRL, Invitrogen Co., Grand Island, NY,

EUA) foi reagido por 1 hora para bloquear uma proteína não específica e, em seguida, anticorpos pAMPKa, ACCpS79 e b- actina (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, EUA) para a proteína específica foram diluídos e reagidos em 1: 1000 em TBS-T contendo 2,5 % de leite desnatado.

[0124] A membrana reagida foi tratada com um anticorpo secundário para um anticorpo específico e, então, fotossensibilizada em um filme de raios-X usando quimioluminescência aprimorada (ECL, Amersham Life Science Corp. Arlington Heights, IL, EUA) para analisar a expressão da proteína específica.

[0125] Exemplo de Referência 4: Animais de Teste

[0126] Camundongos BALB/c sem patógenos específicos do sexo feminino com cinco semanas de idade foram adquiridos e usados em Orient Bio Co., Ltd. Após quarentena e adaptação por uma semana, os animais saudáveis sem perda de peso foram selecionados e usados no teste. Os animais de teste foram criados em um ambiente de reprodução ajustados a uma temperatura de 23 ± 3 ℃, umidade relativa de 50 ± 10 %, número de ventilação de 10 a 15 vezes/hora, tempo de iluminação de 12 horas (08:00 a 20:00) e iluminância de 150 a 300 Lux. Durante um período de pré-teste, permitiu-se que os animais de teste consumissem livremente a ração sólida para os animais de teste (Cargill Agripurina Co., Ltd.) e água potável.

[0127] Exemplo de Referência 5: Transplante de células tumorais e administração de substância de teste

[0128] Após um período de adaptação de uma semana, em camundongos nus BALB/c, células 4T1 (1 × 105 células/camundongo), células de câncer de mama, foram injetadas nos tecidos adiposos da mama esquerda dos animais de teste e, em seguida, os tecidos tumorais foram visualmente observados. Quando o tamanho do tecido tumoral dos animais de teste estava em cerca de 100 mm3, os animais de teste foram divididos em 9 grupos de teste com base em um desenho de bloco aleatório. Isto é, os 9 grupos de teste foram classificados em um grupo de controle, um grupo de MET (250 mg/kg de MET), um grupo de 2DG (500 mg/kg de 2DG), um grupo de Ins (500 mg/kg de Ins), um grupo de IP6 (500 mg/kg de IP6), um grupo de MET + 2DG (250 mg/kg de MET + 500 mg/kg de 2DG), um grupo de MET + 2DG + Ins (250 mg/kg de MET + 500 mg/kg de 2DG + 500 mg/kg de Ins), um grupo de MET + 2DG + IP6 (250 mg/kg de MET + 500 mg/kg de 2DG + 500 mg/kg de IP6), um grupo de MET + 2DG + IP6 + Ins (250 mg/kg de MET + 500 mg/kg de 2DG + 250 mg/kg de IP6 + 250 mg/kg de Ins), e cada grupo de teste usou 10 animais de teste. A substância de teste foi dissolvida em água destilada e administrada por via intraperitoneal em tempo fixo por 18 dias.

[0129] Exemplo de Referência 6: Medição de Peso Corporal de Animal de Teste e Volume de Tumor

[0130] O peso corporal do animal de teste durante o período de teste foi medido em um tempo fixo uma vez por semana a partir da data de administração de substância de teste. Um volume de tumor foi medido usando um calibrador digital a cada três dias, o comprimento e a largura do tumor foram medidos, e o volume de tumor foi calculado substituindo-se a seguinte Equação.

[0131] Volume de tumor (mm3) = (largura2 × comprimento) / 2

[0132] Exemplo de Referência 7: Medição de Peso de Tumor

[0133] Após 14 dias de administração da substância de teste, os animais de teste foram anestesiados usando um anestésico feito diluindo-se tribromoetanol com álcool terc-amílico e o sangue foi coletado da órbita. O sangue foi colocado em um tubo separado de soro (Becton Dickinson) e deixado à temperatura ambiente por 30 minutos e centrifugado a 3.000 rpm por 20 minutos para isolar o soro e o soro isolado foi armazenado a -70 ℃ até a análise. Após retirar o sangue dos animais de teste, o tumor foi extraído e pesado. Os tumores foram pesados e alguns foram fixados em formalina tamponada neutra a 10 % (NBF, Sigma- Aldrich Co.) e incluídos em parafina para realizar a imunocoloração do tecido. O pulmão foi fixado com uma solução de Bouin (Sigma-Aldrich Co.), e o nódulo tumoral metastatizado para o pulmão foi observado e a taxa de metástase pulmonar foi examinada.

[0134] Exemplo de Referência 8: Coloração de hematoxilina & eosina de tecido tumoral

[0135] Um tecido tumoral imobilizado com formalina tamponada neutra a 10 % foi embebido em parafina e 5 mm de cortes de tecido foram preparados a partir dos tecidos embebidos. Após a remoção da parafina, os tecidos foram hidratados reduzindo-se sequencialmente a % de álcool, começando com álcool a 100 % para etanol a 0 % (H2O). A coloração H&E foi realizada de acordo com um método geral para observação histomorfológica de tecidos tumorais, e alterações histomorfológicas dos tecidos tumorais foram observadas por uma microscopia óptica (Carl Zeiss).

[0136] Exemplo de Referência 9: Processamento estatístico

[0137] Todos os valores de análise foram expressos como média ± SD. Para comparar a diferença entre um grupo de controle e um grupo tratado com substância de teste, a significância foi verificada por ANOVA de uma via ou ANOVA de duas vias usando a pós-análise de comparação múltipla de Tukey usando o software GraphPad Prism 6.0. Determinou-se que havia significância estatística apenas quando p <0,05 ou mais.

[0138]

[0139] Exemplo 1. Teste de inibição de proliferação celular de formulação única e formulação complexa de MET (ou PHE), 2DG e IP6

[0140] Os efeitos de inibição da proliferação celular de uma única formulação e uma formulação complexa de MET (ou PHE), 2DG e IP6 foram comparados usando 12 tipos de células cancerosas.

[0141] Exemplo 1-1: Taxa de sobrevivência celular após a administração de MET, 2DG e IP6 em separado e em combinação

[0142] As FIGS. 1 e 2 são diagramas do exame da taxa de sobrevivência celular após a administração de MET, 2DG e IP6 em separado e em combinação com base em linhagens de células de câncer humano, como câncer de fígado (HepG2), câncer de pulmão (A549), câncer gástrico (AGS), câncer pancreático PANC-1), câncer de cólon (DLD-1), câncer cervical (HeLa), câncer de mama (MDA-MB- 231), câncer de próstata (PC-3), câncer de ovário (SK-OV-3), câncer de bexiga (T24), glioblastoma (U-87 MG) e osteossarcoma (Saos- 2).

[0143] A FIG. 1A mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de célula de câncer de fígado (HepG2) tratada em separado e em combinação com 4 mM de MET, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG + IP6 foi de 17,44 ± 4,8, que foi 2,6 vezes significativamente menor que 45,40 ± 4,2, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0144] A FIG. 1B mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de pulmão (A549) tratada em separado e em combinação com 4 mM de MET, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG + IP6 foi 19,43 ± 5,2, que foi 2,5 vezes significativamente menor que 48,84 ± 5,3, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0145] A FIG. 1C mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de estômago (AGS) tratada em separado e em combinação com 2 mM de MET, 0,7 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG +

IP6 foi de 15,20 ± 4,2, que foi 3,5 vezes significativamente menor que 53,00 ± 3,8, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0146] A FIG. 1D mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer pancreático (PANC-1) tratada em separado e em combinação com 5 mM de MET, 0,7 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG + IP6 foi de 25,27 ± 5,2, que foi 2,6 vezes significativamente menor que 65,40 ± 4,3, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0147] A FIG. 1E mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de cólon (DLD-1) tratada em separado e em combinação com 5 mM de MET, 0,4 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG + IP6 foi de 26,70 ± 4,7, que foi 2,4 vezes significativamente menor que 65,40 ± 4,6, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0148] A FIG. 1F mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer cervical (HeLa)tratada em separado e em combinação com 6 mM de MET, 0,5 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG + IP6 foi de 24,67 ± 3,6, que foi 2,1 vezes significativamente menor que 52,89 ± 4,6, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0149] A FIG. 2A mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de mama (MDA-MB-231) tratada em separado e em combinação com 6 mM de MET, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG + IP6 foi de 26,37 ± 5,3, que foi 2,1 vezes significativamente menor que 55,15 ± 4,5, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0150] A FIG. 2B mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de próstata (PC-3) tratada em separado e em combinação com 5 mM de MET, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG +

IP6 foi de 19,51 ± 5,6, que foi 3,4 vezes significativamente menor que 66,70 ± 4,6, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0151] A FIG. 2C mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer ovariano (SK-OV-3) tratada em separado e em combinação com 5 mM de MET, 0,5 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG + IP6 foi de 22,80 ± 5,2, que foi 2,9 vezes significativamente menor que 66,80 ± 3,6, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0152] A FIG. 2D mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de bexiga (T24) tratada em separado e em combinação com 4 mM de MET, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG + IP6 foi de 26,42 ± 4,8, que foi 2,4 vezes significativamente menor que 63,30 ± 4,2, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0153] A FIG. 2E mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de glioblastoma (U-87 MG)

tratada em separado e em combinação com 5 mM de MET, 0,4 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG + IP6 foi de 20,80 ± 5,7, que foi 2,9 vezes significativamente menor que 61,32 ± 4,8, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0154] A FIG. 2F mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de osteossarcoma (Saos-2) tratada em separado e em combinação com 5 mM de MET, 0,7 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG + IP6 foi de 24,52 ± 5,7, que foi 2,6 vezes significativamente menor que 64,33 ± 4,9, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de MET + 2DG (P < 0,0001).

[0155] A partir desses resultados, confirmou-se que a formulação complexa tripla de MET, 2DG e IP6 tinha um efeito inibitório de proliferação de células de câncer melhor que a formulação única ou complexa dupla.

[0156] Exemplo 1-2: Taxa de sobrevivência celular após a administração de PHE, 2DG e IP6 em separado e em combinação

[0157] As FIGS. 3 e 4 são diagramas do exame da taxa de sobrevivência celular após a administração de PHE, 2DG e

IP6 em separado e em combinação com base em linhagens de células de câncer humano, como câncer de fígado (HepG2), câncer de pulmão (A549), câncer gástrico (AGS), câncer pancreático PANC-1), câncer de cólon (DLD-1), câncer cervical (HeLa), câncer de mama (MDA-MB- 231), câncer de próstata (PC-3), câncer de ovário (SK-OV-3), câncer de bexiga (T24), glioblastoma (U-87 MG) e osteossarcoma (Saos- 2).

[0158] A FIG. 3A mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de célula de câncer de fígado (HepG2) tratada em separado e em combinação com 0,3 mM de PHE, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 20,21 ± 4,1, que foi 2,5 vezes significativamente menor que 49,55 ± 4,8, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0159] A FIG. 3B mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de pulmão (A549) tratada em separado e em combinação com 0,3 mM de PHE, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 22,41 ± 5,2, que foi 2,4 vezes significativamente menor que 54,77 ± 5,8, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0160] A FIG. 3C mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de estômago (AGS) tratada em separado e em combinação com 0,3 mM de PHE, 0,7 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 17,38 ± 3,8, que foi 2,9 vezes significativamente menor que 50,45 ± 3,9, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0161] A FIG. 3D mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer pancreático (PANC-1) tratada em separado e em combinação com 0,2 mM de PHE, 0,7 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 25,27 ± 5,2, que foi 2,6 vezes significativamente menor que 65,40 ± 4,3, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0162] A FIG. 3E mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de cólon (DLD-1) tratada em separado e em combinação com 0,3 mM de PHE, 0,4 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 22,21 ± 4,8, que foi 2,7 vezes significativamente menor que 60,98 ± 4,7, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0163] A FIG. 3F mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer cervical (HeLa)tratada em separado e em combinação com 0,2 mM de PHE, 0,5 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 25,65 ± 3,9, que foi 2,1 vezes significativamente menor que 54,67 ± 4,6, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0164] A FIG. 4A mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de mama (MDA-MB-231) tratada em separado e em combinação com 0,2 mM de PHE, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 20,76 ± 4,2, que foi 2,3 vezes significativamente menor que 48,54 ± 4,5, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0165] A FIG. 4B mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de próstata (PC-3) tratada em separado e em combinação com 0,3 mM de PHE, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 20,77 ± 4,3, que foi 2,9 vezes significativamente menor que 59,66 ± 4,6, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0166] A FIG. 4C mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer ovariano (SK-OV-3) tratada em separado e em combinação com 0,4 mM de PHE, 0,5 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 20,44 ± 4,2, que foi 3,0 vezes significativamente menor que 60,54 ± 5,1, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0167] A FIG. 4D mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de bexiga (T24) tratada em separado e em combinação com 0,4 mM de PHE, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 21,45 ± 4,2, que foi 2,7 vezes significativamente menor que 58,70 ± 4,5, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0168] A FIG. 4E mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de glioblastoma (U-87 MG) tratada em separado e em combinação com 0,2 mM de PHE, 0,4 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 15,76 ± 4,2, que foi 3,4 vezes significativamente menor que 54,32 ± 4,8, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0169] A FIG. 4F mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de osteossarcoma (Saos-2) tratada em separado e em combinação com 0,2 mM de PHE, 0,7 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Comparada entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG + IP6 foi de 22,76 ± 4,2, que foi 2,7 vezes significativamente menor que 61,93 ± 4,7, a taxa de sobrevivência celular de uma combinação de PHE + 2DG (P < 0,0001).

[0170] A partir desses resultados, confirmou-se que a formulação complexa tripla de PHE, 2DG e IP6 tinha um efeito inibitório de proliferação de células de câncer melhor que a formulação única ou complexa dupla.

[0171] Exemplo 2: Efeito de Formulação Complexa de MET, 2DG e IP6 em Células Normais

[0172] A FIG. 5 é um diagrama do exame de citotoxicidade por ensaio de MTT após 48 horas após tratamento de uma formulação de combinação tripla para linhagens de células de câncer de próstata (PC-3), câncer de cólon (DLD-1) e câncer de pulmão (A549) como células tumorais e linhagens de células de próstata (PZ-HPV-7), cólon (CCD-18Co) e pulmão (MRC5) como células não tumorais a fim de analisar um efeito de uma formulação complexa de MET, 2DG e IP6 em células normais.

[0173] Como um resultado em linhagens de células PC-3 e PZ-HPV-7 tratadas com uma formulação complexa de 5 mM de MET, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6, a taxa de sobrevivência celular foi significativamente reduzida em uma linhagem de célula PC-3 como células tumorais, enquanto uma linhagem de células PZ-HPV-7 como células não tumorais não afetou a taxa de sobrevivência celular (P < 0,0001).

[0174] Como um resultado em linhagens de células DLD-1 e CCD-18Co tratadas com uma formulação complexa de 5 mM de MET, 0,4 mM de 2DG e 1 mM de IP6, a sobrevivência celular foi significativamente reduzida em uma linhagem de célula DLD-1 como células tumorais, enquanto uma linhagem de células CCD-18Co como células não tumorais não afetou a taxa de sobrevivência celular (P < 0,0001).

[0175] Como um resultado em linhagens de células A549 e MRC5 tratadas com uma formulação complexa de 4 mM de MET, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6, a taxa de sobrevivência celular foi significativamente reduzida em uma linhagem de célula A549 como células tumorais, enquanto uma linhagem de células MRC5 como células não tumorais não afetou a taxa de sobrevivência celular (P < 0,0001).

[0176] A apoptose para cada uma das células não tumorais da formulação de combinação tripla mostrou um padrão diferente das células tumorais e a formulação de combinação tripla foi confirmada como um fármaco seguro in vivo.

[0177] Exemplo 3: Taxa de Sobrevivência Celular e Expressão de Proteína de Células 4T1 por Formulações Simples e Complexas de MET, 2DG e IP6

[0178] O metabolismo das células vivas usa ATP e ADP como fontes de energia e produz AMPs. A proteína quinase ativada por AMP (AMPK) é uma serina/treonina quinase conhecida como reguladora do metabolismo de lipídios e glicose e desempenha uma importante função reguladora em diabetes oftálmico. AMPK é ativada por AMP para inibir o uso de ATP, em que a AMP aumenta quando a energia celular é consumida e desempenha uma função fundamental na manutenção da homeostase, induzindo-se o catabolismo. A ativação de AMPK inibe a proliferação de células cancerosas e inibe a acetil CoA carboxilase (ACC), uma enzima que induz a síntese de ácidos graxos em termos de metabolismo de gordura.

[0179] A FIG. 6A mostra a taxa de sobrevivência celular em uma linhagem de células de câncer de mama derivado de camundongo (4T1) tratada em separado e em combinação com 5 mM de MET, 2 mM de 2DG e 1 mM de IP6. Uma formulação tratada com combinação teve taxa de sobrevivência significativamente menor que o tratamento único, incluindo um controle (P < 0,0001). Em comparação entre os grupos tratados com combinação, a taxa de sobrevivência celular de um grupo (MET + 2DG + IP6) foi de 23,04 ± 4,0, que foi reduzida em 2,2 vezes significativamente menor que 50,03 ± 4,0, a taxa de sobrevivência celular de um grupo (MET + 2DG) (P <0,0001).

[0180] Nas FIGS. 6B e 6C, AMPK é significativamente ativada (P <0,0001) e a fosforilação de ACC é reduzida (P <0,05) no grupo (MET + 2DG + IP6) em comparação com o grupo (MET + 2DG).

[0181] Exemplo 4. Inibição de síntese de ATP de formulações únicas e complexas de MET, 2DG e IP6 para células 4T1

[0182] ATP (trifosfato de adenosina) é uma fonte de energia para organismos vivos e, quando a síntese intracelular de ATP é inibida, a atividade do metabolismo energético é reduzida. Um efeito inibitório da síntese de ATP de MET, 2DG e IP6 foi confirmado em uma linhagem de células de câncer de mama derivado de camundongo 4T1 do Exemplo 3.

[0183] Cada célula (103-104 células) de 4T1 foi incubada por 24 horas em um prato de cultura de 60 mm e tratada em separado e em combinação com 4 mM de MET, 1 mM de 2DG e 1 mM de IP6, e posteriormente incubada por 48 horas. Posteriormente, as células foram colhidas, contadas e diluídas em 100 ml de uma solução de cultura de RPMI contendo 10 % em volume de FBS e foi transferida para cada poço de uma placa de 96 poços. 100 ml de um tampão de ensaio (reagente rL/L + tampão de reconstituição) de um kit de ensaio Promega ATP (G7572, Promega, Durham, NC, EUA) foram adicionados aos poços contendo as células, e a emissão de fluorescência foi medida em 560 nm. Os resultados foram mostrados na FIG. 7.

[0184] Como mostrado na FIG. 7, os resultados de teste mostraram que a síntese de ATP foi inibida no tratamento de combinação em vez de tratamento único em tratamentos únicos e combinados em uma linhagem de células 4T1 usada no teste (P <0,0001). O grupo de MET + 2DG + IP6 inibiu significativamente a síntese de ATP em comparação ao grupo de MET + 2DG (P <0,05). Como resultado, pode ser visto que a formulação complexa do grupo de MET + 2DG + IP6 reduz o nível de energia de forma mais eficaz nas células cancerosas.

[0185] Exemplo 5. Efeito de formulações únicas e complexas de MET, 2DG, e IP6 em alteração de volume de tumor

[0186] Quando o tamanho de um tecido tumoral era de cerca de 100 mm3, os grupos de teste foram classificados e a administração da substância de teste foi iniciada e o volume de tumor foi medido em intervalos de 3 dias a partir da data de início da administração de substância de teste. Como resultado do teste, como mostrado na FIG. 8, os volumes de tumores dos grupos tratados de forma única e combinada foram reduzidos em comparação a um grupo de controle a partir do dia 3 da administração de substância de teste. No dia 18 da administração de substância de teste,

em comparação a um grupo de controle que tem um volume de tumor de 1486,8 ± 67,0 mm3, como grupos de administração única, como 1400,5 ± 58,6 mm3 em um grupo de MET, 1350,3 ± 55,2 mm3 em um grupo de 2DG, 1108,5 ± 66,3 mm3 em um grupo de IP6, e 1190,1 ± 67,3 mm3 em um grupo de Ins, os volumes de tumor forem ligeiramente reduzidos, mas não houve nenhuma diferença significativa. No entanto, 820,1 ± 67,0 mm3 do grupo de MET + 2DG mostraram uma diferença significativa maior que o grupo de controle e o grupo de administração única (P < 0,0001). O volume de tumor na formulação complexa, 515,02 ± 54,9 mm3 no grupo de MET + 2DG + IP6 e 350,03 ± 33,0 mm3 no grupo de MET + 2DG + IP6 + Ins, mostrou uma diferença significativa maior que o grupo de MET + 2DG (P < 0,0001). O grupo de MET + 2DG + IP6 e o grupo de MET+2DG+Ins mostraram uma diferença significativa em comparação ao grupo de MET + 2DG + IP6 + Ins (P < 0,05), e o grupo de MET + 2DG + IP6 + Ins teve a maior redução e mostrou um alto efeito inibitório de crescimento de tumor (FIG. 8).

[0187] Exemplo 6. Efeito de formulações únicas e complexas de MET, 2DG e IP6 no peso de tumor

[0188] No dia 19 da administração de uma substância de teste, os tumores foram extraídos sacrificando-se os animais de teste e os pesos dos tumores foram medidos e mostrados na FIG. 9. O peso de tumor de um grupo de controle foi 1,244 ± 0,22 g, os pesos de tumor foram 1,134 ± 0,15 g em um grupo de MET, 1,092 ± 0,18 g em um grupo de 2DG, 0,874 ± 0,18 g em um grupo de IP6, e 0,904 ± 0,20 g em um grupo de Ins, mas a formulação complexa diminuiu significativamente o peso de tumor como 0,621 ± 0,14 g em um grupo de MET + 2DG e 0,599 ± 0,12 g em um IP6+grupo de Ins (P < 0,0001). Além disso, 0,342 ± 0,11 g de um grupo de MET + 2DG + IP6 e 0,203 ± 0,06 g de um grupo de MET + 2DG + IP6 + Ins mostraram uma diferença significativa maior que um grupo de controle e a administração única (P < 0,0001) e mostraram uma diferença significativa do grupo de MET + 2DG como a formulação complexa dupla (P < 0,01). Também houve uma diferença significativa do grupo de MET + 2DG + IP6 e do grupo de MET + 2DG + IP6 + Ins (P < 0,05) e, em geral, o grupo de MET + 2DG + IP6 + Ins mostrou a maior redução do tamanho de tumor (FIG. 9).

[0189] Exemplo 7. Efeito no Peso Corporal de Animais de Teste

[0190] Os pesos corporais dos animais foram medidos uma vez a cada seis dias durante um período de teste. Não houve nenhuma diferença significativa na perda de peso entre os grupos de tratamento único e combinado em comparação ao grupo de controle no dia 6 de administração da substância de teste. No final do teste, no dia 18 de administração da substância de teste, não houve nenhuma diferença significativa na perda de peso como 22,90 ± 0,41 g no grupo de MET + 2DG, 22,90 ± 0,47 g no grupo de MET + 2DG + IP6, e 22,90 ± 0,50 g no grupo de MET + 2DG + IP6 + Ins em comparação a 23,34 ± 0,52 g no grupo de controle (FIG. 10).

[0191] Exemplo 8. Efeito de formulações únicas e complexas de MET, 2DG, e IP6 sobre a incidência de metástase pulmonar

[0192] Observou-se que as células cancerosas foram metastizadas para o pulmão em um modelo animal de tumor. A fim de examinar um efeito de uma substância de teste sobre a metástase, a incidência da metástase pulmonar foi examinada e mostrada na FIG. 11. A incidência da metástase pulmonar era 100 % (10 de 10) no controlo, grupos de MET, e grupos de 2DG, mas a incidência de metástase pulmonar foi reduzida para 90 % (9 de 10) no grupo de IP6, 90 % (9 de 10) no grupo de Ins, 80 % (8 de 10) no grupo de MET + 2DG, 80 % (8 de 10) do grupo de IP6 + Ins, 30 % (3 de 10) do grupo de MET + 2DG + IP6, 30 % (3 de 10) do grupo de MET + 2DG + Ins, e 20 % (2 de 10) do grupo de MET + 2DG + IP6 + Ins. A incidência de metástase pulmonar do grupo de MET + 2DG + IP6 + Ins mostrou a maior inibição entre cada grupo de teste (FIG. 11).

[0193] Exemplo 9. Efeito na alteração histomorfológica de tecido tumoral

[0194] A FIG. 12 mostra os resultados de observação microscópica após a coloração H & E para examinar as alterações histomorfológicas de tecidos tumorais pela substância de teste. A periferia externa do tecido tumoral de controle era densamente composta por células 4T1, e necrose coagulativa foi observada no centro. Os tecidos tumorais no grupo de MET + 2DG e no grupo de IP6 + Ins foram aumentados na região de necrose de coagulação do centro em comparação ao grupo de controle, e no caso do grupo de MET + 2DG + IP6, do grupo de MET + 2DG + Ins e do grupo de MET + 2DG + IP6 + Ins, uma razão de células 4T1 normais foi significativamente reduzida (FIG. 12).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma combinação que compreende (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-Dglicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar o câncer.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a combinação compreende um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, 2-deoxi-D-glicose e hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a combinação compreende um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, 2-deoxi-D-glicose e inositol.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a combinação compreende um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, 2-deoxi-D-glicose, hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e inositol.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto à base de biguanida é metformina ou fenformina.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um isômero do composto de inositol é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em D- quiro-inositol, L-quiro-inositol, mio-inositol e cilo- inositol.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o composto à base de biguanida é metformina e em que uma razão de peso de metformina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: 2-deoxi-D- glicose:hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo está em uma faixa de 1:0,2:0,5 a 1:5:20.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o composto à base de biguanida é fenformina e em que uma razão de peso de fenformina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: 2-deoxi-D- glicose:hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo está em uma faixa de 1:1:1 a 1:50:200.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o composto à base de biguanida é metformina e em que uma razão de peso de metformina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: 2-deoxi-D- glicose:inositol está em uma faixa de 1:0,2:0,5 a 1:5:20.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o composto à base de biguanida é fenformina e em que uma razão de peso de fenformina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: 2-deoxi-D-glicose:inositol está em uma faixa de 1:1:1 a 1:50:200.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o composto à base de biguanida é metformina e em que uma razão de peso de metformina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: 2-deoxi-D-glicose:hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: inositol está em uma faixa de 1:0,2:0,5:0,5 a 1:5:20:20.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o composto à base de biguanida é fenformina e em que uma razão de peso de fenformina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: 2-deoxi-D-glicose:hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: inositol está em uma faixa de 1:1:1:1 a 1:50:200:200.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o câncer é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de cólon, câncer cervical, câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer de cérebro, osteossarcoma e câncer de bexiga.

15. Combinação caracterizada por compreender (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D-glicose; e (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos.

16. Composição caracterizada por compreender (1) um composto à base de biguanida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (2) 2-deoxi-D-glicose; (3) hexafosfato de inositol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, inositol ou uma mistura dos mesmos; e um carreador farmaceuticamente aceitável.