JP6861162B2 - アポエクオリン含有組成物および神経細胞の炎症を治療するためのアポエクオリンの使用方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互関係
本出願は、２０１４年１１月１１日に出願された米国仮出願第６２／０７８，０９９号の優先権を主張する。前記仮出願の全開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、一般に、神経細胞の炎症の治療に有用な組成物に関する。より具体的には、本発明は、アポエクオリン含有組成物、および神経細胞の炎症を治療するためのそれらの組成物の使用に関する。

２００９年に、脳卒中は、米国において１９人の死亡者のうちの約１人を占め、心臓病および癌に続く死亡原因の第３位になった。その結果、脳卒中後の傷害を改善する方法を見つけることは不可欠となっている。虚血後の毒性作用をブロックすることにより、虚血および潜在的な神経保護におけるカルシウムの役割が注目されている。

カルシウム（Ｃａ²⁺）は、神経伝達物質放出およびシナプス可塑性を含む様々な神経プロセスにおいて中心的な役割を果たす。神経細胞は、進行中の活性の結果として、細胞内Ｃａ²⁺の変動を継続的に受けるが、細胞内Ｃａ²⁺の過剰または持続的増加は、神経細胞に対して有毒であり得る。したがって、神経細胞の細胞内Ｃａ²⁺は非常に厳密に制御されており、神経細胞が細胞質Ｃａ²⁺レベルを制限または制御することを可能にするいくつかのメカニズムが存在する。特に、カルシウム結合タンパク質（ＣａＢＰ；カルビンジン、パルブアルブミン、およびカルレチニンなど）は、細胞質ゾルＣａ²⁺の結合および緩衝に重要である。

海馬における研究は、ＣａＢＰの存在が、通常は細胞死をもたらす興奮毒性傷害に対する何らかの防御を与えることを示している。興味深いことに、進行性の年齢およびアルツハイマー病およびパーキンソン病を含む神経変性障害において、ＣａＢＰのレベルの低下が観察される。虚血性傷害の前にＣａＢＰを投与することによる虚血の間のＣａ²⁺毒性を最小限に抑えることを目的とした治療もまた肯定的な結果をもたらした。例えば、Ｙｅｎａｒｉらは、虚血を誘導する前にカルビンジンで処置した動物を処置し、カルビンジンの過剰発現が神経保護的であることを見出した。さらに、Ｆａｎらは、虚血前にカルビンジンを投与したラットに投与し、カルビンジン処置動物において、より小さい梗塞体積、より良好な行動回復およびアポトーシスの減少を示した。実際、脳卒中の有害な影響を理解することに多くの研究が集中している。興味深いことに、脳卒中の主要な危険因子は老化であり、脳の老化に関する１つの有力な仮説は、老化のＣａ²⁺仮説（ｔｈｅ Ｃａ²⁺ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｇｉｎｇ）である。この仮説は、老齢に関連するカルシウムおよびカルシウム依存性プロセスを調節する能力の変化が、認知低下および神経変性疾患に対する感受性の増加に重要な寄与をすると主張している。これらの老化に関連するＣａ²⁺の変化、および虚血性細胞死におけるＣａ²⁺の重要な役割を考慮すると、多くの研究が神経細胞およびグリアの両方におけるＣａ²⁺調節不全に焦点を当てている。

虚血後の過剰な細胞内Ｃａ²⁺蓄積は、興奮毒性によって細胞死を増強することが知られている。虚血性傷害後、Ｃａ²⁺は、電位依存性Ｃａ²⁺チャネル（ＶＧＣＣｓ）を介して、ＮＭＤＡ受容体を介して、および細胞内オルガネラから放出されることによって、細胞内に蓄積する。多数の研究により、ＮＭＤＡ受容体、ＶＧＣＣｓ、またはその両方を組み合わせたＣａ²⁺流入を阻止することが、虚血に対して神経保護性であり得ることが示されている。興味深いことに、ＮＭＤＡ受容体ブロッカーが臨床試験で使用されたとき、神経保護を提供することができず、幻覚および昏睡などの望ましくない副作用を生じた。なぜＮＭＤＡ受容体遮断薬が臨床試験で失敗したのかは不明であるが、虚血性脳卒中の致命的な影響を改善することに焦点を当てた継続的な研究が必要であることは明らかである。

進歩してはいるが、神経細胞の炎症を治療する新規および代替の治療法に対する必要性が依然として存在する。特に、従来の薬剤と比較して副作用が低減された医薬組成物または栄養補助食品組成物が望まれており、発見されれば、医療および栄養健康地域において長い間感じられた必要性を満たすであろう。

本発明は、アポエクオリン、カルシウム結合タンパク質、およびアポエクオリンが新規な神経保護能力を有するという予期せぬ発見に関する本発明者らの最近の研究に部分的に基づいている。特に、アポエクオリンは、その後の神経細胞の炎症を軽減するために対象の神経細胞を前処理するのに有用であることが判明している。したがって、本発明は、神経保護適用において実質的に有利なアポエクオリン含有組成物および使用方法を提供する。

第１の態様において、本発明は対象の神経細胞の炎症を減少させるために神経細胞を前処理する方法に関する。そのような方法には、対象にアポエクオリンを投与するステップが含まれ、対象の神経細胞は、神経細胞の炎症を軽減するために前処理される。

一実施態様では、対象への投与は注射による。別の実施態様では、対象への投与は、例えば、錠剤またはカプセルから選択された単位剤形で処方されたアポエクオリンによる経口送達による。特定の実施態様において、アポエクオリンは、栄養補助食品組成物の形態で対象に投与される。

理解されるように、本発明は、対象の神経細胞の炎症を軽減するために神経細胞を前処理するためのアポエクオリン、ならびに対象の神経細胞の炎症を軽減するために神経細胞を前処理するための組成物の製造のためのアポエクオリンの使用を含む。

別の態様では、本発明は、対象における腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）タンパク質レベルを低下させる方法に関する。そのような方法には、対象にアポエクオリンを投与する工程が含まれ、対象のＴＮＦαタンパク質のレベルが低下する。

特定の実施態様では、対象への投与は注射による。代替的な実施態様では、対象への投与は、例えば、錠剤またはカプセルから選択される単位剤形で製剤化されたアポエクオリンによる経口送達による。特定の実施態様において、アポエクオリンは、栄養補給組成物の形態で対象に投与される。

理解されるように、本発明は、対象におけるＴＮＦαタンパク質レベルを低下させるためのアポエクオリン、ならびに対象におけるＴＮＦαタンパク質レベルを低減するための組成物の製造のためのアポエクオリンの使用を包含する。

本発明は、その神経保護機能による被験者の精神的および肉体的健康の一般的な改善を提供する点で、従来の組成物および方法よりも様々な利点を提供する。

本発明の他の目的、特徴および利点は、本明細書および特許請求の範囲を検討した後に明らかになるであろう。

図１Ａ−Ｃは、急性海馬脳スライスにおける細胞死に対する酸素グルコース欠乏の効果を示す。Ａ）は実験デザインの図である。冠動脈海馬スライスを人工大脳脊髄液（ａＣＳＦ）中で１時間インキュベートした。スライスの半分を酸素−グルコース欠乏（ＯＧＤ）の５分間虚血状態に移し、残りの半分は正常酸素状態（ＯＧＤなし）のままにした。全てのスライスをその後ａＣＳＦに移して３０分間の再灌流およびトリパンブルー染色を行った。次いで、スライスを１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。Ｂ）は酸素正常状態（ＯＧＤなし）および５分間のＯＧＤを受けたスライス中の海馬の領域ＣＡ１におけるトリパンブルー染色の代表的な画像である。ＯＧＤスライスと比較して、酸素正常スライスでの染色が少ないことに注目されたい。Ｃ）において、酸素正常状態のままであるスライス（＊、ｐ＜．０１）と比較して、海馬の領域ＣＡ１におけるトリパンブルー染色された神経細胞の数は、５分のＯＧＤを受けたスライスから有意に増加した。 図２Ａ−Ｃは、虚血性細胞死に対するアポエクオリンの用量依存的効果を示す。Ａ）は、実験デザインの図である。背側海馬で両側にカニューレ挿入されたラットに、一方の半球に０、０．４、１、４％のアポエクオリン（ＡＱ）を注入し、他方の半球にビヒクル（０％ＡＱ）を注入した。注入の１日後、コロニー海馬スライスを切断し、人工大脳脊髄液（ａＣＳＦ）中で１時間インキュベートした。すべてのスライスを５分間の酸素−グルコース欠乏（ＯＧＤ）のために虚血状態に移した。次いで、スライスをａＣＳＦに移して３０分間の再灌流およびトリパンブルー染色を行った。次いで、スライスを１０％中性緩衝ホルマリン中に固定した。Ｂ）は、ビヒクル処置スライスまたは４％ＡＱ処置スライスにおける虚血後の海馬の領域ＣＡ１におけるトリパンブルー染色の代表的画像である。ビヒクルで処理したスライスと比較して、ＡＱ処理したスライスでの染色がより少ないことに注目されたい。Ｃ）グラフは、アポエクオリンの用量の関数としての神経保護（救済された細胞の割合）を示す。０％ＡＱ（ビヒクル；＊、ｐ＜．０１）と比較し、１または４％のＡＱ（０．４％ＡＱではなく）で処置したラットにおいて、有意な神経保護があった。 図３Ａ−Ｃは、虚血性細胞死に対するアポエクオリンの時間依存性効果を示す。Ａ）は、実験デザインの図である。背側海馬の両側にカニューレを挿入したラットに、一方の半球に４％のアポエクオリン（ＡＱ）を、他方の半球にビヒクル（０％ＡＱ）を注入した。コロナ海馬スライスを、注入後１時間、１日、２日、３日または５日後に切断し、スライスを人工大脳脊髄液（ａＣＳＦ）中で１時間インキュベートした。全てのスライスを５分間の酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）のために虚血状態に移した。次いで、スライスをａＣＳＦに移して３０分間の再灌流およびトリパンブルー染色を行った。次いで、スライスを１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。ラットの第２のセットに４％ＡＱの両側注入を与え、脳を注入の１時間後、１日後、２日後、または３日後に取り出して、ウェスタンブロッティングに使用した。Ｂ）４％ＡＱの注入は、虚血の１または２日前に有意な神経保護をもたらしたが、注入後３または５日で神経保護効果はもはや明白ではなかった。ＡＱは、虚血の１時間前に注入した場合にも神経保護性ではないことに留意されたい（ｐ＝．７８）。Ｃ）は、２２ｋＤでのＡＱタンパク質のウエスタンブロット分析である。ＡＱは、１時間および１日目に背側海馬（ＡＱ−ｄｈｐｃ）に存在するが、注入後３日目ではもはや存在しない。注入２日後には、ラットのわずか２９％にバンドが存在する。注入時間にかかわらず、腹側海馬（ＡＱ−ｖｈｐｃ）にバンドが存在しないことに留意されたい。β−アクチン（４５ｋＤ）の分析は、背側（アクチン−ｄｈｐｃ）または腹側（アクチン−ｈｈｐｃ）海馬のいずれかの時点でタンパク質負荷の効果を示さなかった。＊、ｐ＜．０１。 図４Ａ−Ｂは、インターロイキン−１０ｍＲＮＡ発現に対するアポエクオリンの効果を示す。Ａ）インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）ｍＲＮＡ発現は、４％ＡＱが背側海馬に注入された１時間後に有意に増加した。この統計学的に有意な増加は、生物学的に関連する２〜３倍の増加が依然として観察されたが、ＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現が１〜２日以内にベースラインレベル近くに戻ったときに一過性のものであった。Ｂ）β−アクチンｍＲＮＡの発現は、４％ＡＱとビヒクル処置半球との間で有意な違いはなかった（ｐ＝．５２）。両方のグラフについて、データは、ビヒクル処理対照半球からの倍数変化として表される。 図５は、実施例２で利用された実験的方法論を示す。 図６Ａ−Ｂは、ＡＱの海馬内注入が神経保護的であることを表すデータを示す。 図７Ａ−Ｄは、ＡＱ注入後のサイトカイン発現を示す。 図８Ａ−Ｃは、ＡＱの経口投与が神経保護性であることを表すデータを示す。 図９Ａ−Ｃは、ＡＱ注入がＩＬ−１０およびＴＮＦ−αタンパク質発現を変化させることを表すデータを示す。 図１０Ａ−Ｃは、老齢ラットにおけるＡＱ注入および痕跡恐怖条件付けを示す。 図１１Ａ−Ｃは、ＡＱの経口投与が時間および用量依存性であることを示す。 図１２は、実施例４で利用された実験的方法を示す。 図１３Ａ−Ｃは、ＡＱの経口投与が神経保護的であることを示す。 図１４Ａ−Ｄは、ＡＱの経口投与がサイトカインタンパク質発現を変化させることを表すデータを示す。 図１５Ａ−Ｂは、ＡＱの海馬内注入を示すデータが、サイトカインタンパク質発現を変化させることを示す。 図１６は、ＩＬ−１０ｎＡｂがＡＱの神経保護効果を逆転させることを表すデータを示す。

Ｉ．一般論
本発明の材料および方法の記載以前に、本発明は特定の方法および材料に限定されず、これらは変更され得ることが理解される。本明細書で使用する用語は、特定の実施態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数形が含まれることに留意されたい。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つの」は、本明細書では交換可能に使用することができる。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、交換可能に使用することができることにも留意されたい。

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同様の意味を有する。

動物：９２匹の雄Ｆ３４４成体ラットを使用した。ラットは１４／１０時間の昼／夜のサイクルで自由に食物と水にアクセスできるように飼育した。有意な体重増加および／または減少を説明するために、各動物の体重を週２回記録した。

薬物：アポエクオリン（ＡＱ；クインシーバイオサイエンス）を濃度７．４％の二重脱イオン水中で調製した。用量依存的な実験（ｎ＝１８）の実験群は０（ｎ＝４）、３．６（ｎ＝５）、４８（ｎ＝４）、２４０（ｎ＝３）または４８０ｍｇ／ｋｇのＡＱを彼らの毎日のＰＢに混ぜて投与された。残りの実験では、ラット（ｎ＝７３）は、４８ｍｇ／ｋｇのＡＱを毎日のＰＢに混ぜて投与された。動物は５つのグループのうちの１つに割り当てられた。１日のＡＱ（ｎ＝１５）、１日のＡＱ（ｎ＝１５）、２日のＡＱ（ｎ＝１５）、および７日間のＡＱ（ｎ＝１４）は、毎日指定された時間にケージ内のペトリ皿に置いた。ラットは、毎日指定された時間にケージ内のペトリ皿に置かれた１／４ティースプーンのＰＢを与えられた。ペトリ皿はすべてのＰＢが消費されるまで除去されなかった。動物は、適切なＡＱ投与量を維持するために週２回体重を測定した。

注入研究のためのＡＱは、上述のように調製した（Ｄｅｔｅｒｔら、２０１３）。ＩＬ−１０中和抗体（ｎＡｂ）およびそのＩｇＧ対照を滅菌ＰＢＳ中で調製した。０．５μｇを、１μｌのハミルトンシリンジを通して１μｌ／分の速度で注入した。

酸素−グルコース枯渇：投与の最終日に、ラットにＰＢ投与後、消化のために１時間与え、イソフルランで深く麻酔し、背側海馬の冠状スライス（４００μｍ）（ｄｈｐｃ；Ｂｒｅｂｍａ^-３．１４〜^-４．１６；Ｐａｘｉｎｏｓ ＆ Ｗａｔｓｏｎ、１９９８）を、標準手順を用いて準備した（Ｍｏｙｅｒ ＆ Ｂｒｏｗｎ、２００７）。ａＣＳＦにおける１時間のスライス回復の後、各脳の１つの半球（釣り合いをとった（counterbalanced））を酸素グルコース欠乏チャンバーに移してインビトロ虚血に供し（グルコースをフルクトースで置き換え、９５％Ｎ₂−５％ＣＯ₂で泡立たせた９５％Ｏ₂−５％ＣＯ₂）５分間処理したが、残りの半球は回復したままであった。全てのスライスを、０．２％トリパンブルーを含有する酸素化ａＣＳＦ中に３０分の再灌流期間中保持した。トリパンブルーは死細胞を染色し、生細胞は染色されずに残す（ＤｅＲｅｎｚｉｓ ＆ Ｓｃｈｅｃｈｔｍａｎ、１９７３）。スライスを酸素添加した室温ａＣＳＦ中で２回すすぎ、次いで冷蔵庫内で一晩１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。スライスを３０％スクロース中で凍結保護し、クリオスタット（４０μｍ）上でスライスにし、細胞計数のために下位スライド上に載せた。

細胞数：スライスを１０倍Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡（デジタルカメラを装備）下で検査し、写真を撮った（ＣｅｌｌＳｅｎｓ）。ＣＡ１内のトリパンブルー染色された神経細胞（約８００μｍのスライス）を、実験条件に盲検された実験者によって計数した。統計解析は、ＳＰＳＳ（ｖ２１．０．０；ＩＢＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ）を用いて行った。ＡＮＯＶＡを用いて薬物効果を評価し、フィッシャーのＬＳＤ事後評価を用いて群相互作用を評価した。アスタリスク（＊）はｐ＜．０５を示す。

ウエスタンブロット：動物をイソフルランで深く麻酔し、脳を迅速に取り出し、凍結し、−８０℃で保存した。解剖の時点で、試料をｄｈｐｃ（Ｂｒｅｂｍａ^-３．１４〜^-４．１６ｍｍ）から解剖した。試料をホモジナイズし、４０００ＲＰＭで２０分間遠心分離し、上清を除去し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質を測定した。タンパク質サンプルを標準化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）にロードした。タンパク質（３０μｇ）を、Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ膜上に移した。膜をブロッキング緩衝液（２時間）、一次抗体（４℃で一晩；１：１０００マウス抗エクオリン［Ｃｈｅｍｉｃｏｎ］または１：１０００ウサギ抗β−アクチン［Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］）および二次抗体（９０分；１：２０，０００ヤギ抗マウス［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］または１：４０，０００ヤギ抗ウサギ［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］）でインキュベートした。続いて膜を洗浄し、化学発光溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れ、Ｓｙｎｇｅｎｅ ＧＢｏｘで画像化した。ＧｅｎｅＳｏｏｌｓソフトウェア（ｖ１．２．４．０；Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓカメラ４．２ＭＰ）で画像を撮影し、各バンドの蛍光をＧｅｎｅＴｏｏｌｓソフトウェア（ｖ４．０２；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて評価し、値は対照動物のパーセンテージとして表した。統計はＳＰＳＳ（ｖ．２１）で行った。

本明細書に記載されているものと類似または同等な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物および特許は、本発明に関連して使用され得る刊行物に報告される化学物質、機器、統計的分析および方法論を記述および開示することを含む。本明細書で引用される全ての参考文献は、当業者のレベルを示すものとみなされる。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明により、それらの開示に先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるものではない。

ＩＩ．本発明
虚血性脳卒中は、米国で毎年約７９５，０００人の人々に影響を及ぼし、その結果年間推定費用は７３７億ドルになる。カルシウムは、様々な神経細胞のシグナル伝達カスケードにおいて重要であるが、虚血の間、過剰なカルシウム流入は、興奮毒性細胞死を引き起こす可能性がある。カルシウム結合タンパク質は、神経細胞が虚血の間に細胞内カルシウムレベルを調節／緩衝するのを助ける。エクオリンはクラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａから単離されたカルシウム結合タンパク質であり、カルシウム指標として長年使用されてきたが、その神経保護特性についてはほとんど知られていない。本研究は、アポエクオリン（エクオリンのカルシウム結合成分）の海馬内注入が、虚血性細胞死から神経細胞を保護するという仮説を試験するためのインビトロラット脳スライス調製を使用した。両側にカニューレを挿入したラットは、一方の半球においてアポエクオリン注入を受け、他方の半分においてビヒクル対照を受けた。次に、海馬スライスを調製し、５分間の酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）に供し、トリパンブルー排除によって細胞死をアッセイした。アポエクオリンは、用量依存的にＯＧＤから神経細胞を保護した−トリパンブルー標識神経細胞の数を有意に減少させたのは、１％および４％（０．４％ではなく）の用量であった。この効果もまた時間依存性であり、最大４８時間持続した。この時間依存性効果は、サイトカインおよびケモカイン発現の変化と並行して、アポエクオリンが神経免疫調節機構を介して神経細胞を保護し得ることを示している。これらのデータは、アポエクオリンによる前処理が神経細胞を虚血細胞死から保護し、効果的な神経治療薬であるという仮説を支持する。

エクオリンは、もともと発光性クラゲおよび他の海洋生物から単離された光タンパク質である。エクオリン複合体は、２２，２８５ダルトンのアポエクオリンタンパク質、分子状酸素及びルミノフォアセレンテラジンを含む。３つのＣａ²⁺イオンがこの複合体に結合すると、セレンテラジンは酸化されて二酸化炭素と青色光の放出を伴ってセレンテラミドになる。エクオリンは細胞によって輸出されたり分泌されたり、細胞内で区画化されたり隔離されたりしない。したがって、エクオリン測定は、比較的長期間にわたって起こるＣａ²⁺変化を検出するために使用されてきた。いくつかの実験系では、エクオリンの発光は細胞負荷の後数時間から数日で検出可能であった。エクオリンはまた、細胞機能または胚発生を破壊しないことがさらに知られている。

そのＣａ²⁺依存性発光のために、エクオリン複合体は、細胞内Ｃａ²⁺指示薬として広範に使用されている。Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ａｅｑｕｏｒｉｎは、（１）単一の副腎クロム親和性細胞のニコチン性コリン作動性アゴニストに対する分泌応答を分析する；（２）心筋損傷におけるＣａ²⁺放出の役割を明確にする；（３）受精中のＣａ²⁺の大量放出を実証する；（４）ニワトリ筋芽細胞の発達における筋小胞体Ｃａ²⁺ポンプ発現の調節を研究する；そして（５）わずか３ピコリットルの注入量でマイクロピペットを較正する。

アポエクオリンは、およそ２２ｋＤａの分子量を有する。アポエクオリンは、アポエクオリン中のジスルフィド結合を還元することによってエクオリンを再生するために使用することができる。カルシウムを負荷したアポエクオリンは、結合した基質を含む未反応の発光タンパク質と同じコンパクトな足場および全体の折り畳みパターンを保持する。

クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａからのエクオリンの従来の精製は、面倒な抽出手順を必要とし、時には実質的に不均一であるか、または研究中の生物にとって毒性である調製物を生じる。２トンのクラゲは、典型的に約１２５ｍｇの精製された発光タンパク質を産生する。対照的に、組換えエクオリンは、好ましくは、遺伝子改変された大腸菌からアポエクオリンを精製し、続いて純粋なセレンテラジンでインビトロでエクオリン複合体を再構成することによって産生される。本発明に有用なアポエクオリンはＳ．Ｉｎｏｕｙｅ、Ｓ．Ｚｅｎｎｏ、Ｙ．Ｓａｋａｋｉ、およびＦ．Ｔｓｕｊｉ アポエクオリンの高レベル発現と精製、（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ２、１２２−１２６、に記載されており、当業者に公知の精製スキームおよび／または合成によって商業的に入手可能である。

エクオリンは、腔腸動物Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａから単離されたＣａＢＰである。エクオリンは、哺乳動物のＣａＢＰと密接に関連するＥＦハンドループを有する、ＥＦハンドのＣａＢＰファミリーに属する。さらに、エクオリンは、Ｃａ²⁺の指標として長年使用されており、細胞によって安全でよく耐容されることが示されている。しかしながら、これまでのところ、その治療可能性を研究した研究はない。エクオリンは、カルシウム結合成分アポエクオリン（ＡＱ）と化学発光分子セレンテラジンの２つの成分で構成されている。このタンパク質のＡＱ部分はカルシウム結合ドメインを含むので、本研究ではＡＱを使用した。

本実験では、我々は、急性海馬脳スライスにおける包括的虚血のインビトロモデルを使用した。急性海馬スライスにおいて、ＯＧＤ誘発損傷は、海馬の領域ＣＡ１において最も顕著であり、インビボで見られるものと同様である。急性海馬スライスは、細胞形態およびインビボモデルの使用よりも多くの利点を提供し、組織形態はインタクトな動物と比較して比較的変わらず、細胞外イオン濃度の変化および神経伝達物質の放出はインビボで報告されたものと類似しており、インビボで制御することができない血管系または他の全身性応答が挙げられる。急性スライスにおけるＯＧＤ後の神経細胞損傷は、再灌流の最初の３０分以内に見られるが、スライスの寿命が短いため、虚血の早期変化のみを分析することができる。海馬神経細胞は虚血後の細胞死に対して脆弱であるため、ＡＱを海馬に直接注入すると、虚血性傷害の前に投与された場合に神経保護性であるという仮説を試験した。

本発明は、アポエクオリン含有組成物を対象に投与して、一般に対象におけるカルシウム収支を補正または維持することに関する。血漿および体液中のイオン性カルシウム濃度の維持は、神経細胞興奮性、筋肉収縮、膜透過性、細胞分裂、ホルモン分泌、骨石灰化、または虚血後の細胞死の予防に限定されない多種多様な身体機能にとって重要であると理解される。カルシウム恒常性の崩壊、すなわちカルシウム不均衡は、多くの疾患、症候群および状態を引き起こしおよび／またはそれと相関すると理解される。例示的な疾患、症候群および状態には、睡眠の質、エネルギーの質、気分の質、記憶の質および痛みの知覚に関連するものが含まれる。ＣａＢＰの研究は、適切なイオン性カルシウムレベルの維持に働く保護因子としての認識を導いている。

特定の実施態様では、本発明の方法は、神経防護を提供するため、神経細胞の炎症の進行を遅らせるため、神経細胞の炎症の発症を予防するため、および再発を予防および／または治療するためのアポエクオリンを唯一の有効成分として投与することを含む。特定の実施態様では、本発明は、既知の治療または栄養補助食品の価値を有する１つまたは複数の追加の薬剤と組み合わせてアポエクオリンを投与することを含む方法を提供する。

本明細書中で使用される場合、用語「治療する」には、予防および障害寛解処置が含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「減少する」、「緩和する」、「抑制する」および「阻害する」は、一般に理解されている小さくするまたは減少するを意味する。本明細書で使用する「進行」という用語は、範囲または重症度の増加、進行、成長または悪化を意味する。本明細書中で使用される場合、用語「再発」は、寛解後の疾患の復帰を意味する。

本明細書で使用する「投与する」という用語は、患者、組織、器官または細胞をアポエクオリンと接触させることを指す。本明細書中で使用される場合、投与はインビトロで、すなわち試験管内で、またはインビボで、すなわち生体の細胞または組織、例えばヒトにおいて達成され得る。好ましい実施態様において、本発明は、本発明において有用な組成物を患者または対象に投与することを包含する。本明細書において同等に使用される「患者」または「対象」は、（１）アポエクオリンの投与によって矯正可能または治療可能な神経細胞の炎症を有するか、または（２）アポエクオリンを投与することによって予防可能な神経細胞の炎症に感受性である。

本明細書で使用される場合、用語「有効量」および「治療上有効量」は、毒性、刺激またはアレルギー反応のような過度の有害な副作用なしに所望の治療応答を生じるのに十分な活性物質の量をいう。特定の「有効量」は、明らかに、治療される特定の状態、患者の身体状態、治療される動物のタイプ、治療の持続時間、併用療法の性質（存在する場合）ならびに使用される特定の製剤および化合物またはその誘導体の構造などの要因によって変化するであろう。この場合、量は、以下の１つまたは複数の結果をもたらした場合、治療上有効であるとみなされるであろう：（１）神経細胞の炎症の予防および；（２）神経細胞の炎症の反転または安定化。最適な有効量は、通常の実験を用いて当業者が容易に決定することができる。

対象への経口投与のための特定の好ましい組成物では、アポエクオリンは、約１０ｍｇ／用量の投与量で、好ましくはカプセル形態の用量で、少なくとも約１０ｍｇ／日（すなわち、１日１カプセル）である。

本発明による組成物は、液体または凍結乾燥された、またはさもなければ乾燥された製剤を含み、様々な緩衝液含量（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）の希釈剤、ｐＨおよびイオン強度、吸収を防止するアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（グリセロール、ポリエチレングリセロールなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウムなど）、防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ、ベンジルアルコール、パラベン）、バルキング物質または張度調整剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールなどのポリマーのタンパク質への共有結合、金属イオンとの錯体化、または高分子化合物の粒状調製物リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、層状または多層状の小胞、赤血球ゴーストまたはスフェロプラスト上に存在することができる。そのような組成物は、物理的状態、溶解性、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼすであろう。制御放出組成物または持続放出組成物は、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）中の製剤を含む。

ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）でコーティングされた粒状組成物を投与する方法も、本発明に包含される。組成物の他の実施態様は、非経口、肺、鼻及び経口を含む様々な投与経路のための粒状形態保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤又は浸透増強剤を組み込む。ある実施態様では、組成物は、非経口的、ガン近傍（ｐａｒａｃａｎｃｅｒｌｌｙ）に、経粘膜的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内にまたは腫瘍内に投与される。

さらに、本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、当業者に周知であり、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．９％生理食塩水を含むが、これに限定されない。さらに、このような薬学的に許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液および乳濁液であってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。

非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガーおよび固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充剤、リンガーデキストロースに基づく電解質補充剤などが含まれる。防腐剤および他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、照合剤、不活性ガスなどを含んでもよい。

本発明のアポエクオリン含有組成物は、注射可能な担体系と組み合わせたアポエクオリンを含む薬学的な注射可能な用量の形態で処方される場合に特に有用である。本明細書で使用されるように、注射剤および注入剤形（すなわち、非経口剤形）は、特に限定されないが、活性薬物物質をカプセル化するリン脂質を有するリポソーム注射剤または脂質二重層小胞が含まれる。注射には、非経口的使用を意図した滅菌調製物が含まれる。

乳剤、脂質、粉末、溶液および懸濁液の５つの異なるクラスの注射がＵＳＰによって定義されている。エマルジョン注入には、非経口的に投与されることを意図した無菌の発熱物質を含まない調製物を含むエマルジョンが含まれる。溶液注射用の脂質複合体および粉末は、非経口的使用のための溶液を形成するための再構成を意図した無菌調製物である。懸濁液用粉末は、非経口的使用のための懸濁液を形成するための再構成を意図した滅菌調製物である。リポソーム懸濁液注入のために凍結乾燥された粉末は、脂質二重層内に活性薬物物質をカプセル化するために使用されるリン脂質を有する脂質二重層小胞のようなリポソームの組み込みを可能にするように処方される、非経口使用のための再構成を意図した滅菌凍結乾燥製剤である。溶液注入のために凍結乾燥された粉末は、凍結乾燥によって調製された溶液（「凍結乾燥」）を意図した投与形態であり、これによりこの方法は極めて低い圧力で凍結状態の生成物から水を除去することを含み、そしてそれにより、つづく液体の添加は、すべての点で注射の必要条件に適合する溶液を形成する。懸濁液注入のために凍結乾燥された粉末は、適切な液体媒体中に懸濁された固体を含む非経口使用を意図した液体製剤であり、滅菌懸濁液のための要件にすべて適合することにより、懸濁液を意図する医薬品は凍結乾燥によって調製される。溶液注入は、注射に適した適切な溶媒または相互に混和性のある溶媒の混合物に溶解した１つまたは複数の薬物を含む液体製剤を含む。溶液濃縮物の注入には、適切な溶媒を添加すると、注射の必要条件にすべての点で適合する溶液が得られる、非経口使用のための滅菌調製物が含まれる。懸濁液注入は、液相全体に分散された固体粒子を含む液体調製物（注射に適している）を含み、それにより粒子は不溶性であり、それによって油相は水相全体に分散されるか、またはその逆である。懸濁液リポソーム注射剤は、リポソーム（脂質二重層ベシクルは、通常、脂質二重層内または脂質二重層内のいずれかに活性薬物物質をカプセル化するために使用されるリン脂質を含有するように、水相全体に分散された油相を有する液体製剤水性空間）が形成される。懸濁超音波注入は、液相全体に分散された固体粒子を含む液体調製物（注射に適している）であり、それによって粒子は不溶性である。さらに、生成物は、ガスが懸濁液を通って泡立ち、固体粒子によるマイクロスフェアの形成をもたらすので、超音波処理されてもよい。

非経口担体系は、溶媒および共溶媒、可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤、増粘剤、乳化剤、キレート剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、酸化防止剤、還元剤などの１つまたは複数の薬学的に適切なビヒクル、抗菌防腐剤、増量剤、保護剤、等張化剤、および特別な添加剤を含む。

本発明に従って投与可能な制御放出組成物または持続放出組成物は、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）中の製剤を含む。本発明はまた、ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）で被覆された粒子状組成物および組織特異的受容体、リガンドまたは抗原に対する抗体または組織特異的受容体のリガンドに結合した抗体に結合された化合物を包含する。

本発明に従って投与される組成物の他の実施態様は、非経口、肺、経鼻、眼科および経口を含む、様々な投与経路のための粒状形態、保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤または浸透増強剤を組み込む。

ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリンのような水溶性ポリマーの共有結合によって修飾された化学物質は、血液中で実質的により長い半減期を示すことが知られている静脈注射後に対応する非修飾化合物よりも優れている。このような修飾はまた、水溶液中の化学物質の溶解性を増加させ、凝集を排除し、化合物の物理的および化学的安定性を増強し、化合物の免疫原性および反応性を大きく低下させる。結果として、所望の生体内生物学的活性は、修飾されていない実体より少ない頻度で、またはより低い用量で、このようなポリマー実体アブダクトの投与によって達成され得る。

本発明によるさらに別の方法では、組成物を制御放出系で送達することができる。例えば、薬剤は、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式を用いて投与することができる。一実施態様では、ポンプを使用することができる。別の実施態様では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施態様では、制御放出系を治療標的、すなわち脳に近接して配置することができ、全身投与量のほんの一部しか必要としない。

組成物は、アポエクオリン単独でも、または薬学的に許容される担体をさらに含んでもよく、錠剤、散剤、カプセル、ペレット、溶液、懸濁液、エリキシル、シロップ、飲料、エマルジョン、ゲル、クリーム、眼科用製剤、または直腸および尿道坐剤を含む坐剤などの固体または液体形態とすることができる。薬学的に許容される担体はまた、ガム、デンプン、糖、セルロース材料、およびそれらの混合物を含む。アポエクオリンを含有する組成物は、例えば、ペレットの皮下移植によって患者に投与することができる。さらなる実施態様では、ペレットは、ある期間にわたりアポエクオリンの制御された放出を提供する。組成物はまた、静脈内、動脈内、液体の筋肉内注射、液体または固体の経口投与によって、または局所適用によって投与することができる。直腸坐剤または尿道座薬の使用によって投与を行うこともできる。

本発明により投与可能な組成物は、公知の溶解、混合、粒状化、または錠剤形成プロセスにより調整可能である。経口投与のためには、アポエクオリンまたはその生理学的に許容される誘導体、例えば塩、エステル、Ｎ−オキシドなどをこの目的のために慣用のビヒクル、添加剤と混合し、安定剤または不活性希釈剤と混合し、そして通常の方法により、投与のために適切な形態、例えば錠剤、被覆錠剤、硬質または軟質ゼラチンカプセル、水性、アルコール性または油性溶液に変換される。

好ましい不活性ビヒクルの例として、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンなどの結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤またはステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤と組み合わせた、ラクトース、スクロース、またはコーンスターチなどの従来の錠剤基剤があげられる。

好ましい油性ビヒクルまたは溶媒の例として、ヒマワリ油または魚肝油のような植物油または動物油があげられる。組成物は、乾燥顆粒および湿潤顆粒の両方で達成することができる。非経口投与（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射）のために、塩、エステル、Ｎ−オキシドなどの化学物質またはその生理学的に許容される誘導体は、必要に応じてこの目的のために慣用されかつ好ましい物質、例えば可溶化剤または他の補助剤とともに溶液、懸濁液または排出物に変換される。

例は、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントの添加の有無にかかわらず、水および油などの滅菌液体である。例示的な油は、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油または鉱油である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射液のための好ましい液体担体である。

活性成分を含有する組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されている。そのような組成物は、鼻咽頭に送達されるエアロゾルとして、または液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射剤として調製され得る；しかしながら、注射前に液体中に溶解または懸濁するのに適した固体形態もまた調製することができる。組成物は、乳化することもできる。活性治療成分は、しばしば、薬学的に許容され、活性成分と適合するビヒクルと混合される。適切なビヒクルには、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。さらに、組成物は、湿潤剤または乳化剤、活性成分の有効性を高めるｐＨ緩衝剤のような少量の補助物質を含有することができる。

活性成分は、中和された薬学的に許容される塩形態として組成物中に処方され得る。薬学的に許容される塩は、無機酸、例えば塩酸またはリン酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基から形成される塩としては、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等が挙げられる。

例えば、クリーム、ゲル、滴などを用いた体表面への局所投与のために、アポエクオリンまたはその生理学的に許容される誘導体は調製され、薬学的担体の有無にかかわらず、生理学的に許容される希釈剤中の溶液、懸濁液またはエマルションとして適用される。

本発明による別の方法では、活性成分を小胞、特にリポソームに送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９））。

アポエクオリンの塩は、好ましくは薬学的に許容される塩である。しかしながら、他の塩も、本発明による組成物またはそれらの薬学的に許容される塩の調製において有用であり得る。適切な薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸のような薬学的に許容される酸の溶液とアポエクオリンの溶液とを混合することによって形成され得る酸付加塩を含む。

さらに、本明細書に記載されるアポエクオリン含有組成物は、アポエクオリンが神経細胞の炎症の様々な有害な効果の発症を予防する、または軽減する、または安定化させる栄養補給組成物の形態で提供され得る。本明細書の目的のための用語「栄養補助食品」または「栄養補助食品組成物」は、疾患の予防および／または治療を含む医療上の利益を提供する食品または食品の一部を指す。本発明の栄養補助食品組成物はさらに、ビタミン、補酵素、ミネラル、ハーブ、アミノ酸、およびその物質の総摂取量を増加させることにより食物を含む栄養補助食品と混合して、含んでいてもよい。

従って、本発明は、アポエクオリンを含有する栄養補給組成物を患者に投与する工程を含む、患者に栄養補給の利益を提供する方法を提供する。このような組成物は、一般に、本明細書で言及されるように、経口経路に適した前述の薬学的に許容される担体を含む経口送達に適した担体である「栄養補助食品として許容される担体」を含む。特定の実施態様では、本発明による栄養補助食品組成物は、機能的基準で定義される栄養補助食品を含み、免疫増強剤、抗炎症剤、抗酸化剤、抗ウイルス剤、またはそれらの混合物を含む。

免疫ブースターおよび／または抗ウイルス剤は、創傷治癒および改善された免疫機能を促進するために有用である；これらは、Ｃｏｎｅｆｌｏｗｅｒｓからの抽出物、またはＥｃｈｉｎａｃｅａ属のハーブ、Ｓａｍｂｕｃａ属の抽出物、およびＧｏｌｄｅｎｓｅａｌ抽出物を含む。Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ属のハーブはまた、天然または加工形態のいずれかで効果的な免疫ブースターである。Ａｓｔｒａｇａｌｕｓは、骨髄およびリンパ組織の活性免疫細胞における幹細胞の発達を刺激する。グルコン酸亜鉛および酢酸亜鉛のような亜鉛およびその生物活性塩もまた、風邪の治療において免疫増強剤として作用する。

抗酸化剤には、血液中の抗酸化酵素のレベルを増加させるように作用する天然の含硫アミノ酸アリシンが含まれる。アリシンを含むニンニクなどのハーブまたはハーブエキスも有効な抗酸化物質である。カテキン類、およびカテキン類を含む緑茶のようなハーブの抽出物も有効な抗酸化剤である。Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ属の抽出物も抗酸化活性を示す。ケルセチン、ヘスペリジン、ルチン、およびそれらの混合物などのバイオフラボノイドも抗酸化剤として有効である。バイオフラボノイドの主な有益な役割は、体内の酸化からビタミンＣを保護することである。これにより、より多くのビタミンＣまたはアスコルビン酸が体内で利用できるようになる。

ケルセチンのようなバイオフラボノイドも有効な抗炎症剤であり、本発明の組成物においてそのまま使用することができる。抗炎症性ハーブサプリメントおよび植物またはハーブ由来の抗炎症性化合物も、本発明の組成物中の抗炎症剤として使用することができる。これらには、パイナップルに見出されるタンパク質分解酵素であるブロモレイン（ｂｒｏｍｏｌａｉｎ）、紅茶とはちみつの抽出物、ウコン、ウコンの抽出物、またはクルクミン、ウコンから単離された黄色の色素が含まれる。

本発明で使用することができる別のサプリメントはジンジャー（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ）属のハーブに由来するショウガである。これは、ジンゲロールおよび関連化合物ショウガオールのような化合物に起因する強心活動を有すること、ならびにめまいおよび前庭障害の治療において利益を提供することが分かっている。ジンジャーは悪心や他の胃疾患の治療にも有効である。

関節軟骨および他の関節障害の痛みを治療するための組成物において、軟骨組織の再建、特に軟骨の再建を助けるサプリメントが有用である。グルコサミン、硫酸グルコサミン、コンドロイチンは、ヘラジカベルベット枝角のような様々な供給源から得られる。海洋の脂質複合体、オメガ３脂肪酸複合体、および魚油もまた、関節炎に関連する痛みを治療するのに有用であることが知られている。

片頭痛の治療に有用なサプリメントは、ナツシロギクおよびイチョウが含まれる。ナツシロギクの主な有効成分は、セスキテルペンラクトンパルテノライドであり、プロスタグランジンの分泌を阻害し、血管内の血管攣縮活性により痛みを引き起こす。ナツシロギクは抗炎症性も示す。魚油は、その血小板安定化作用および抗血管痙攣作用のために、片頭痛の治療にも有用であり得る。イチョウはまた、動脈を安定化させ、血液循環を改善することによって偏頭痛の治療を支援する。

本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮してより完全に理解されるであろう。

［実施例１］
海馬ＣＡ１神経細胞を酸素−グルコース枯渇から保護するアポエクオリンによる前処理

材料および方法
対象
対象は成体雄Ｆ３４４ラット（平均年齢４．０±０．１ヶ月、Ｈａｒｌａｎ）１４２例であった。対象は、１４時間明−１０時間暗期で、実験動物管理（ＡＡＡＬＡＣ）認定施設の評価および認定協会で維持され、食物および水に自由にアクセスできるように個別に収容された。

手術
イブプロフェン水（１５ｍｇ／ｋｇ／日）を手術前の少なくとも１日および手術後の２日にラットに投与した。手術の日に、ラットをイソフルランで麻酔し、定位固定装置に装着した。無菌条件下で、両側の２６ゲージステンレス鋼製ガイドカニューレを背側海馬に移植した（Ｂｒｅｇｍａ：ＡＰ−３．５ｍｍ、Ｌ±２．６ｍｍ、Ｖ−３．０ｍｍに対して）。カニューレは、ステンレス鋼のネジとアクリルセメントで頭蓋骨に固定した。ステンレス鋼キャップを閉塞を防ぐためにガイドカニューレに入れ、ラットを注入の少なくとも７日前に回復させた。

海馬内注入
エクオリンタンパク質は、アポエクオリンとセレンテラジンの２つの成分で構成されている。アポエクオリン成分（ＡＱ）は、Ｃａ²⁺に結合するＥＦ−ｈａｎｄｓ、すなわち今回の研究で使用される成分、を含有している[５１]。ラットには、ゼロＣａ²⁺人工大脳脊髄液、これはＡＱの神経細胞摂取を促進するための６％ＤＭＳＯも含む、（ａＣＳＦ；ｍＭ：１２４．００ ＮａＣｌ、２．８０ ＫＣｌ、２．００ ＭｇＳＯ₄、１．２５ ＮａＨ₂ＰＯ₄、２６．００ ＮａＨＣＯ₃、１０．００ Ｄ−グルコース、および０．４０ Ｎａ−アスコルビン酸塩）中にＡＱを含む輸液を注入した。ラットは、６０秒にわたって両側注入（０．５μｌ／半球）を受け、注入カニューレは、チップからの拡散を確実にするために、さらに２分間定位置にとどまった。３３ゲージの注入カニューレを切断してガイドカニューレを０．５ｍｍ越えて延ばした。ＡＱの用量依存性神経保護を決定するために、一方の半球（釣り合いをとる（ｃｏｕｎｔｅｒｂａｌａｎｃｅｄ））に０．４、１または４％のＡＱ（ｗ／ｖ；クインシーバイオサイエンス、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を注入し、他方にビヒクルを注入した。加えて、ラットのサブセットに、両半球のビヒクル（０％ＡＱ）を対照として注入した（各群についてｎ＝１１）。

スライスの準備
虚血の急性脳スライスモデルに対するＡＱの神経保護効果を測定するために、９４匹の雄Ｆ３４４ラット（平均年齢４．４±０．２ヶ月）を使用した。脳スライスは、対照ラット（０％ＡＱ、ｎ＝１０）または注入後の以下の時点の1つでＡＱを注入したラットから上述のように調製した：１時間後（ｎ＝１０）、１日後（ｎ＝１０）、２日（ｎ＝１０）、３日（ｎ＝１０）、または５日（ｎ＝５）。簡単には、ラットをイソフルランで深く麻酔し、氷冷酸素添加（９５％Ｏ₂／５％ＣＯ₂）スクロース−ＣＳＦ（ｍＭ：２０６．００ スクロース、２．８０ ＫＣｌ、２．００ ＭｇＳＯ₄、１．２５ ＮａＨ₂ＰＯ₄、１．００ ＣａＣｌ₂、１．００ ＭｇＣｌ₂、２６．００ ＮａＨＣＯ₃、１０．００Ｄ−グルコース、および０．４０ Ｎａ−アスコルビン酸塩）を添加し、脳を迅速に取り出し、氷冷した酸素添加スクロース−ＣＳＦに入れた。脳は、カニューレの部位の近くでブロックし、厚さ４００μｍの冠状スライスを、上述のように、温度制御されたＶｉｂｒａｔｏｍｅで切断した。カニューレの配置の直後の（そして目に見えるカニューレトラックがない）最初の５つのスライスのみを収集し、以下に記載される実験で使用した。スライスを、水面下のメッシュネット上で、酸素添加（９５％Ｏ₂／５％ＣＯ₂）したａＣＳＦ（ｍＭの組成：１２４．００ ＮａＣｌ、２．８０ ＫＣｌ、２．００ ＭｇＳＯ₄、１．２５ ＮａＨ₂ＰＯ₄、２．００ ＣａＣｌ ２、２６．００ ＮａＨＣＯ₃、１０．００ Ｄ−グルコースおよび０．４０Ｎａ−アスコルビン酸）中３５℃でインキュベートした。１時間の回復後、スライスを５分間の酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）に付して、虚血を誘発した。ＯＧＤは９５％Ｎ₂／５％ＣＯ₂（Ｏ₂をＮ₂に置き換えた）でバブリングしたフルクトース−ＣＳＦ（グルコースを等モル濃度のフルクトースで置換したもの）の３５℃溶液にスライスを移すことによって誘導した。ＯＧＤの後、スライスを酸素化ａＣＳＦ＋０．２％トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する３５℃の溶液に３０分間再灌流した。トリパンブルーは死んだ、および死んでいく細胞に浸透して青色に染色し、生きている細胞を染色しない。次いでスライスを室温、酸素化ａＣＳＦ中で短時間すすぎ、直ちに冷蔵庫中で一晩中１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。スライスを３０％スクロースで少なくとも１日間凍結保護し、その後、４０μｍのクライオスタット上でサブセクションし、ゼラチンコーティングしたスライドにマウントし、アルコールの増加段階で脱水し、そしてＰｅｒｍｏｕｎｔでカバーガラスを覆った。

細胞数
スライスを、デジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７０）および１０倍対物レンズを備えた直立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１）下で検査した。各４０μｍサブセクション内で、ＣＡ１細胞体層（歯状回の上葉の先端）の写真を撮影した。最初の海馬スライス調製の結果としての神経損傷による過剰な染色を回避するために、分析のために内部サブセクションのみを撮影した。次いで、個々の治療条件に対して盲検して、画像全体にわたって位置するトリパンブルー染色された神経細胞の数を数えた。データは１つのサブセクションのみから計数した。ＡＱ処理半球からビヒクル処理半球へのデータを標準化することにより、各動物の神経保護率を評価した。

ウエスタンブロット解析
ＡＱが注入後にどのくらい長く背側海馬に残っているかを決定するために、２４匹の成体雄Ｆ３４４ラット（平均４．２±０．１ヶ月）に両半球の４％ＡＱを注入した。ラットを、注入後１時間（ｎ＝４）、１日（ｎ＝７）、２日（ｎ＝７）、または３日（ｎ＝６）で過剰のイソフルランで麻酔し、ドライアイスで急速凍結し、−８０℃で保存した。各ラットから、２つの両側脳領域（背側海馬および腹側海馬；それぞれｄｈｐｃおよびｖｈｐｃ）を取り出し、別々にホモジナイズした。サンプルを４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を取り出し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて測定した。タンパク質サンプルを標準化し（５０または１５０μｇ／レーン）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）にロードした。セミドライ移送装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に移した。膜を一次抗体（４℃で一晩；１：５０００マウス抗エクオリン［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ］または１：１０００ウサギ抗β−アクチン［Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ］）、次に２次抗体（９０分；１：５０００ヤギ抗マウス［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ］または１：５０００ヤギ抗ウサギ［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］）でインキュベートした後、ブロッキング緩衝液（３％脱脂粉乳）中で２時間インキュベートした。その後、膜を洗浄し（トリス緩衝生理食塩水中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）、化学発光溶液（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中に保持し、オートラジオグラフィーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＭＰ）に曝露した。画像を採取し、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてデンシトメトリーを行った。バンドの光学濃度値（各レーンのバックグラウンドを差し引いたもの）が腹側海馬バンドの平均よりも２標準偏差を上回る場合、バンドは陽性とみなした。この定量から、１時間バンドの１００％、１日バンドの８３％、２日間バンドの２９％、３日間バンドの０％、およびｖｈｐｃレーンの０％において正のバンドが観察された。ＡＱを含有すべきでない隣接脳構造であるため、腹側海馬との比較を行ったので、ネガティブコントロール構造として使用した。

定量的ＲＴ−ＰＣＲ
上記のように１２匹の雄ラット（それぞれ３．８カ月齢）は４％ＡＱの片側注入を受け、注入後１時間、１日、または２日目に組織を採取した（ｎ＝４／群）。海馬を摘出し、すぐにＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に入れた。２５ゲージの針とシリンジを用いて組織をホモジナイズし、サンプルをＲＮＡ分離まで−８０℃で保存した。ＴＲＩｚｏｌ法（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、製造者の指示に従って、全ての組織からのＲＮＡ単離を同時に行った。単離したＲＮＡを５０μｌのＲＮａｓｅを含まないＨ₂Ｏに溶解し、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度比に基づいてＲＮＡ純度を計算した。１．８と２．１との間の吸光度読み取り値は、逆転写を進行させるのに十分に純粋であると考えられた。１．８未満の比で存在するサンプルを、製造者の説明書に従いＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてさらに精製し、精製したＲＮＡを５０μｌのＲＮａｓｅを含まないＨ₂Ｏに再懸濁した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＴ２ ＨＴ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ−９６（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全サンプルからの全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。サンプルは、ラットＩＬ−１０およびβ−アクチン（ＲＴ２ ｑＰＲＣプライマーアッセイ；Ｑｉａｇｅｎ）に特異的なプライマー、及びＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステムおよびソフトウェア（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｅｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上でＲＴ² ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて９６ウェルプレートで三倍に増幅された。ビヒクル処理と比較してＡＱ処理によるＩＬ−１０遺伝子発現の変化を、各時点での対応するサンプルにおけるβ−アクチン発現に対して標準化し、各ラットから単離したビヒクル処理海馬と比較するＰｆａｆｆｌ式を用いて計算した。プライマー効率は、ＩＬ−１０およびβ−アクチンについて２つのランダムに選択されたサンプルの希釈曲線に基づいて計算した。β−アクチン発現は、ａＣＳＦを注入した組織と比較した場合、ＡＱの注入によって変化しなかった。これは、ＡＱ注入が遺伝子転写に一般的または非特異的に影響しないことを示す。

遺伝子発現アレイ
ＲＴ−ＰＣＲに使用したラットからｃＤＮＡを採取した（方法参照）。ＰＣＲ分析は、製造元のプロトコルに従って実施されたＱｉａｇｅｎのＲＴ２プロファイラアレイを用いて、炎症性サイトカインおよび受容体の全体的な遺伝的マーカーに焦点を当てた。簡潔には、２Ｘ ＲＴ２ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、ｃＤＮＡ（上記参照）、およびＲＮａｓｅフリー水を合わせ、この混合物２５μｌを９６ウェルＰＣＲ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｒｒａｙウェルプレートの各ウェルに添加した。ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステムおよびソフトウェアを使用してサンプルを実行し、複数の融解曲線を有するサンプルを分析から除外した（ｎ＝２を除く）。研究からの１匹の動物は、平均からの２標準偏差を超える遺伝子発現の一般的な変動のために、完全に排除されなければならなかった。ＱｉａｇｅｎのＷｅｂ−Ｂａｓｅｄ ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲアレイ解析ソフトウェアｖ３．５を用いて遺伝子発現の変化を計算した。

データ分析と統計
統計分析は、Ｓｔａｔｖｉｅｗ（ｖ５．０；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて行った。ＡＮＯＶＡを用いて治療効果を評価した。ポストホック比較のためにフィッシャーのＰＬＳＤを使用した。データは、平均の平均±標準誤差として報告する。

結果
有意な細胞死における酸素−グルコース欠乏の結果
急性海馬スライスを調製し、５分間の酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）に曝し、トリパンブルーを含む酸素化ａＣＳＦにそれらを移すことにより染色した（方法参照）。図１に見られるように、ＯＧＤは、ＯＧＤを受けなかったコントロールスライスと比較して、有意により多くの細胞死をもたらした。虚血状態または非虚血状態におけるトリパンブルー染色細胞の平均数を分析するＡＮＯＶＡは、虚血の統計学的に有意な効果を示した（Ｆ（１，１２）＝９．６５、ｐ＜．０１）。これらの所見は、ＯＧＤが海馬のＣＡ１領域で有意な細胞死をもたらすことを示す先行研究と一致する［５２］。

アポエクオリン治療による細胞死の減少
ＯＧＤの前にアポエクオリン（ＡＱ）の海馬内注入の潜在的な神経保護効果を調べるために、ＯＧＤの２４時間前にラットに０、０．４、１、４％のＡＱを注入した（図２Ａ参照）。ＡＱは、虚血前に１％または４％ＡＱのいずれかを有する海馬内注入が、ビヒクル（０％ＡＱ）注入と比較して神経保護の有意な増加をもたらしたような用量依存的な方法で神経保護性であった、Ｆ（３，４０）＝３．６１、ｐ＜．０５（図２ＢおよびＣ）。ポストホック分析では、１または４％のＡＱの注入は、０％のＡＱ群に対して神経保護を有意に増強し、０．４％のＡＱの注入は他の群と統計的に異ならないことが明らかになった。１％と４％のＡＱ治療群では、神経保護の量に違いはなかったことも注目に値する。

ＡＱが神経保護性である時間経過を評価するために、ＯＧＤの前に、様々な時間（１時間、１日、２日、３日または５日）で４％ＡＱをラットに注入した（図３Ａ）。一元配置ＡＮＯＶＡは、後のＯＧＤから神経細胞を保護するＡＱの海馬内注入の能力に時間の有意な効果があったことを示した（Ｆ（５，４９）＝３．３５、ｐ＜０．０５）。ポストホック分析では、ＡＱの神経保護効果が少なくとも１日必要であり、少なくとも２日間持続することが明らかになった（各時点でｐ＜．０５）。スライスをＡＱ点滴の３または５日後にＯＧＤに付した場合、統計的に有意な神経保護は観察されなかった（それぞれｐ＝．１０およびｐ＝．４７）。

アポエクオリンのウエスタンブロット分析
海馬内注入後にＡＱが背側海馬内にどのくらい長く残っているかを決定するために、４％ＡＱの両側注入後に異なる時間（１時間、１日、２日または３日）でウエスタンブロット分析を用いてＡＱタンパク質レベルを測定した背側海馬に投与する。図３Ｃは、背側海馬内でＡＱが１時間および１日に存在し、２日でほとんど見えず、注入後３日ではもはや存在しないことを示している。したがって、正のバンドが１時間の１００％、１日の８３％、２日の２９％、および３ｄレーンの０％で観察された。予想通り、ＡＱは腹側海馬（ｖｈｐｃ）で検出されず、そしてそれは注射部位からの距離が与えられたネガティブコントロール構造として用いられた（図３Ｃ参照）。非常に弱いバンドの可視化のために十分なタンパク質がゲルにロードされたことを確実にするため、動物のサブセットでウエスタンブロットを繰り返したが、ゲルにはレーン当たりタンパク質１５０μｇをロードした（レーン当たり通常の５０μｇではなく）。これらのブロットでは、２日および３日のレーンにさらにバンドがあり、２日の５７％および３日のレーンの２５％がＡＱが、背側海馬内で背側海馬注入後３日まで検出可能であることが示唆された。重要なことに、サンプルがβ−アクチンについて染色された場合、時間依存性の変化は観察されず、これらの差異はＡＱの存在下での時間依存的変化を反映し、タンパク質含量の一般的な変化ではないことを示唆した（図３Ｃ参照）。

ＡＱ注入後のサイトカインおよびケモカイン発現
ＡＱの海馬内注入により、タンパク質がほとんど存在しない時点で有意な神経保護がもたらされたということは、ＡＱが虚血発作から神経細胞を最終的に保護する事象のいくつかのカスケードを引き起こす可能性があることを示唆している。１つの可能性は、ＡＱが前処理様の効果を誘発し、後の時点で細胞死を減少させることである。虚血性前処理は、短時間の虚血性エピソードがその後のより重度の虚血性傷害によって引き起こされる損傷を減弱させる現象である。最近の証拠は、複数のサイトカインおよびケモカインが虚血前処理に関連していることを示している。虚血前処理とサイトカイン産生の変化との関係を考えると、我々は、ＡＱの注入がサイトカインまたはケモカイン発現の増加をもたらし、最終的には後の虚血性傷害を許容する神経細胞の能力に影響を及ぼす可能性があるという仮説を試験した。抗炎症性サイトカインインターロイキン１０（ＩＬ−１０）におけるｍＲＮＡの変化を調べるためにＲＴ−ＰＣＲを用い、ＰＣＲアレイを用いてＡＱ注入後の複数の遺伝子発現の変化を調べた。成体ラットには、一方の半球に４％のＡＱを注入し、他方のビヒクルには、記載されているように（方法参照）、注入した。ＡＱ注入（１時間後、１日後、または２日後）の異なる時点で、海馬を除去し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行って、時間および治療依存性の変化を評価した。一元配置ＡＮＯＶＡは、４つの処置群、Ｆ（３，１９）＝９．５５、ｐ＜．０００５の間に有意差を示した。ポストホック分析は、ＩＬ−１０ｍＲＮＡが、ビヒクル処置半球と比較してＡＱ−注入後１時間で有意に増加したことを明らかにした（ｐ＜．００１；図４Ａ参照）。さらに、１時間でのＡＱ誘導性ＩＬ−１０発現の増強は、１日（ｐ＜．００１）または２日（ｐ＜．００１）での増強よりも有意に大きかった。ＩＬ−１０の発現は後の時点で２〜３倍に増加したが、これらはビヒクル処理した半球と統計的に有意差がなく１時間で観察されるＩＬ−１０の有意な増加は、ＡＱ注入に対する急性反応によるものであり得る。

サイトカイン発現のＡＱ関連変化が、ｍＲＮＡ発現パターンのより全体的な変化の一部ではなくＩＬ−１０に限定されているかどうかを調べるために、ＰＣＲアレイを実施した。サイトカインおよびケモカイン応答に関連する８２の全遺伝子を調査した。これらのうち、８０個の遺伝子は、様々な制御半球内のエクステントと２つの遺伝子に存在していた（ＣＣＲ８、ケモカイン受容体８；およびＣＲＰ、Ｃ反応性タンパク質）が検出されなかった。検出された８０個の遺伝子のうち、わずか１６はＡＱ−とビヒクル処置半球（表１、応答時間によって編成されたデータを参照）の間で有意に異なっていた。大部分の遺伝子は、ＡＱ注入後１時間で増加し、その後、ベースラインレベルまでまたはその近くまで１日で減少した。１時間で有意にアップレギュレートされた８つのうち、１つだけが、注入後２日の時点でケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）を通して上昇したままであった。６つの遺伝子は１時間で有意にアップレギュレートされなかったが、ＡＱ注入後１日でアップレギュレートされた。これらの６つのうち２つだけが２日間で上昇しなかった−ケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）およびインターロイキン−１受容体ＩＩ型（ＩＬ−１ｒＩＩ）。２つの遺伝子のみが、ＡＱ注入後２日目に、ケモカイン受容体１（ＸＣＲ１）および補体成分３（Ｃ３）で排他的に有意に上方制御された。これらの結果は、背側海馬へのＡＱの注入が、短期および長期の両方の時点でのサイトカインおよびケモカインｍＲＮＡ発現に劇的な効果を有することを示す。

議論
本研究は、カルシウム結合タンパク質アポエクオリン（ＡＱ）が、虚血性損傷の前に投与される場合、時間および用量依存的に神経保護性であることを実証している。１％または４％ＡＱのいずれかの海馬内注入は、対照で注入された動物と比較して死亡または死に至る神経細胞を有意に少なかった（図２参照）。この神経保護は、発達に１〜２日かかり、３〜５日で収縮するという点で、時間依存性であった。神経保護は、ＡＱ注入がサイトカインおよびケモカイン発現を調節し、続いて神経細胞を酸素−グルコース欠乏（ＯＧＤ）から保護する、前処理様の効果を含み得る。

これまでの研究は、ＣａＢＰの神経保護的役割を示唆している。例えば、ＣａＢＰカルビンジンを含む神経細胞は、カルビンジンを欠く神経細胞よりも、興奮毒性および虚血関連損傷に対してより耐性である。さらに、いくつかの研究では、カルビンジンの発現が外傷性脳損傷および虚血後に増加し、カルビンジンがＣａ²⁺恒常性を維持し、興奮毒性から保護するために増加し得ることが示された。同様に、遺伝子治療またはタンパク質形質導入のいずれかを用いて、虚血前のＣａＢＰの過剰発現も神経保護であることが判明している。対照的に、そのカルビンジンは歯状回（虚血細胞死に耐性のある領域）およびＣＡ１（細胞死に脆弱な領域）の両方に存在し、神経保護におけるカルビンジンの役割に対する議論として用いられている。最後に、カルビンジンノックアウトマウスにおいて、虚血からの回復が増強されるとの報告もある。これらは誘導性ノックアウトではなかったので、他の代償機構が観察された神経保護において役割を果たす可能性がある。

興奮毒性に対する人工カルシウムキレート化剤（例えば、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、ＥＧＴＡなど）の効果を調べる研究は、神経保護を見出す研究および細胞死に対する脆弱性を増強するいくつかの研究で、混合結果をもたらした。Ｎｉｋｏｎｅｎｋｏらは、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ミベフラジル、クルトキシン、ニッケル、亜鉛、およびピモジドで処理したスライスにおけるＯＧＤ後のラットの器官型海馬スライス培養物における神経保護を実証した。逆に、Ａｂｄｅｌ−ＨａｍｉｄおよびＢａｉｍｂｒｉｄｇｅは、カルシウムキレート剤ＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いて培養海馬神経細胞を負荷し、それらの神経細胞においてグルタミン酸興奮毒性を増強することを見出した。本発明者らは、人工カルシウムキレート剤の存在が、細胞へのＣａ²⁺流入を妨げる正常なＣａ²⁺依存性メカニズムを妨害することを示唆している。これらの反対の結果は、興奮毒性を誘導する様式、使用されるＣａ²⁺キレーターの種類、または急性脳薄片と比較した培養神経細胞の使用を含む多くの要因に起因する可能性がある。

興味深いことに、ＡＱタンパク質が背側海馬で、注入後１時間で最も容易に検出された場合、神経保護は観察されなかった（図３参照）。ＡＱがどのように細胞に入るか、またはＡＱが細胞に入るかどうかは不明であるが、本研究では、薬物を膜の向こう側に輸送するために使用される注入のためにＡＱを用いたＤＭＳＯを使用した。したがって、ＡＱは細胞に入る機会を得た可能性が高い。さらに、ウエスタンブロット試料の遠心分離プロセスは、細胞の細胞内成分を単離するように設計されており（低速遠心分離による）、これらの試料中のＡＱの存在は、細胞内にＡＱが存在することを強く示唆する。有意な神経保護は注入後１および２日目に明らかであったが、ＡＱは背側海馬で明らかであり（図３Ｃ）、神経保護は単にＡＱ結合Ｃａ²⁺の即時効果から生じるに過ぎないことを示唆した。むしろ、データは、神経保護が、ＡＱ注入によって引き起こされる事象のカスケードから生じることを示唆している。神経保護効果は、タンパク質がほとんど存在しないかまたは検出されなかった（ＡＱ発現が最高である場合には１時間ではない）注入後１日および２日に観察されたので、このカスケードは他のＡＱ誘発性注入後の前処理のような効果を含むメカニズムを含む。このタイプの効果は発達するのに時間がかかり、なぜ神経保護が直ちに観察されないのか（例えば、注入後１時間）を説明するであろう。前処理はまた、これらの時点でのタンパク質の検出が低いにもかかわらず、注入後１日または２日で強力な神経保護が観察された理由を説明することができる。正確なメカニズムは現在のところ不明であるが、サイトカインとケモカインが前処理に関わっているとの研究がある。

ＡＱ注入後の観察された神経保護が前処理様の効果によるものかどうかを調べるために、前処理に関与することが知られている抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０ｍＲＮＡの変化を測定した。注入１時間後にＩＬ−１０ｍＲＮＡの統計的に有意な増加が観察された。統計的に有意ではないが、ＩＬ−１０ｍＲＮＡの生物学的に有意な（＞２倍）増加が、ＡＱ注入後２日まで観察され続けた（図４Ａ参照）。抗炎症性サイトカインは、サイトカイン分泌を介して保護的である細胞集団を動員することによって作用することができ、これにより損傷前炎症性免疫応答の誘導を防止または下方制御し、将来の傷害に対して積極的に防御する。ＡＱ注入後１時間でのＩＬ−１０発現の増加は、１〜２日後に脳が充分準備され、虚血性傷害に耐えることができるように、今後のＯＧＤ傷害の保護プライマーとしての役割を果たす可能性がある。この効果は、ＡＱ注入後３〜５日までに神経保護がほとんどまたは全く認められないように短命である。

ＡＱ注入後１時間でのＩＬ−１０ｍＲＮＡの増加が前処理様の効果を示唆していることから、多遺伝子ＰＣＲアレイを用いて、多種多様なサイトカインおよびケモカインの発現に対するＡＱの効果を評価した（表１）。これらの研究は、ＡＱ注入が、ビヒクル処理半球と比較して、多くのサイトカインおよびサイトカイン受容体遺伝子の発現を時間依存的に差異的に調節することを明らかにした。アレイで検査された総８２個の遺伝子のうち、ＡＱの注入後に１６個が有意に上方制御された。これらの１６内では、ＡＱ注入の直後に８個が急速に上方制御され、残りの８個は１〜２日遅れてのみ上方制御されるような時間依存効果が明らかであった。

ＡＱ注入後にアップレギュレートされたサイトカインのうち、前処理の効果は、（１）インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、（２）ＩＬ−１０、（３）腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、および（４）補体成分３（Ｃ３）である。これらのサイトカインの４つ全ては、前処理後に増加することが示されている。炎症誘発性サイトカインであるＩＬ−１βは、前処理後６時間以内に増加することが示され、その後３〜４日以内にベースラインに戻る。これは、ＩＬ−１βｍＲＮＡの急速な増加、続いてＡＱ後２日までのベースラインレベルへの復帰を示す本研究と一致する（表１）。ＩＬ−１βは前炎症性サイトカインであるが、中等度の増加は神経保護性でありうる。同様に、ＩＬ−１０は、前処理後に急速に増加することも示されており、かなり早くベースラインに戻る。ここでは、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（図４）およびＰＣＲアレイ（表１）の両方を用いて、ＩＬ−１０がＡＱ注入の１時間後に有意に上方制御されることを示す。ＩＬ−１０は、ＴＮＦ−αの放出を減少させ、ラットにおける局所虚血後の脳損傷を減少させることが示されている。前処理後、ＴＮＦ−αは急速にアップレギュレートされ、２日間まで持続し、３〜４日後にはもはや検出されない。本実験は、１時間でＴＮＦ−α遺伝子発現の増加を示すが、ＡＱ注入後１または２日では増加しないことを実証する。Ｃ３は、リポ多糖（ＬＰＳ）前処理の２４時間後に有意に上方制御された。ここでは、ＡＱ注入の２日後にＣ３遺伝子発現の有意な増加が観察された。Ｃ３を含む補体宿主防御システムの活性化は、有害な効果および保護効果の両方を有することが示されている。まとめると、これらのデータは、本実験におけるＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−αおよびＣ３の増加が、ＡＱ注入の神経保護効果の１つの理由であり得ることを示す。

前処理ではアップレギュレートされたサイトカインのうちの４つのみが検査されているが、１６のほとんどすべてが脳虚血後に検査されている。ケモカインリガンド９（ＣＸＣＬ９）、ケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）およびケモカインレセプター１（ＸＣＲ１）は、これまで虚血との関係では調べられていない。他のサイトカインのうち、インターロイキン２レセプターβ（ＩＬ−２ｒβ）を除いて、全てが虚血後に増加することが示されている。正常条件下では、ＩＬ−２ｒβは海馬ＣＡ１錐体神経細胞の細胞膜内に見出される。虚血後、ＩＬ−２ｒβはＣＡ１内で減少するだけでなく、細胞膜から細胞質および核にも移行する。サイトカインが虚血後にどのように機能するかは、それらが神経保護性であるか否かに影響を及ぼし得るそれらの発現パターンにおそらく依存する。例えば、ＣＤ４０リガンドは、炎症および組織損傷において役割を果たすが、それは、局所虚血後にアップレギュレートされる。しかし、ＣＤ４０リガンドは、神経細胞のストレスから神経細胞を保護し、ＣＤ４０リガンドが神経細胞の機能不全をもたらし、ＣＤ４０リガンドが一般的な神経細胞機能にとって重要であることを示す。本データは、ＡＱ注入後１日目および２日目の両方におけるＣＤ４０リガンドの有意な増加を示す。このＣＤ４０リガンドの持続的な増加は、観察された神経保護の時間経過に寄与する可能性がある。本研究の範囲を超えてはいるが、虚血のインビボモデルを使用して、より長い時間枠にわたってＡＱの神経保護効果をさらに評価することは重要である（そしてデータは価値があることが示唆される）。

結論として、本実験は、ＡＱが虚血発作の前に脳に直接投与されたときに虚血から神経細胞を保護するという仮説を支持する。これらの効果は、ＡＱの単一の海馬内注入が２日間までのＯＧＤからの神経細胞を保護するように、用量依存的および時間依存的である。さらに、ＡＱ注入は、虚血前処理で見られるものと同様の様式で、サイトカインおよびケモカイン遺伝子発現を活性化した。したがって、ＡＱによる前処理は、化学的前処理剤として作用することにより、虚血性脳卒中から神経細胞を保護する有効な方法であり得る。

［実施例２］
アポエクオリンの海馬内注入がサイトカインタンパク質発現に及ぼす影響

これまでの実験において我々の研究室では、インビトロ虚血性傷害の２４時間前および４８時間前にＡＱを１回海馬内注入することにより、細胞死を有意に減少することを示した（Ｄｅｔｅｒｔら、２０１３）。インターロイキン１０（ＩＬ−１０）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α；Ｄｅｔｅｒｔら、２０１３）を含む、ＡＱ注入後のサイトカインｍＲＮＡの同時変化があることもまた見出されている。これらのデータは、ＡＱの神経保護機構が、おそらく前処理様の効果を含む、ある種の抗炎症性分子および炎症促進性分子の調節を含み得ることを示している。本研究は、サイトカインタンパク質発現が、ＡＱの海馬内注入後に時間依存的に変化するかどうかをさらに調べるために設計された。ＡＱが様々なサイトカインを調節し、最終的にＡＱが酸素−グルコース欠乏から神経細胞を保護するメカニズムを理解する程度をよりよく理解することが望まれる。

我々の研究室では、海馬のＣＡ１領域へのアポエクオリン（ＡＱ）の注入は、時間および用量依存的に神経保護性であることをすでに示している（Ｄｅｔｅｒｔら、２０１３）。

有意な神経保護が１および２日目に認められたが、ＡＱ注入後１時間ではなかった。これは、変化したサイトカインｍＲＮＡ発現と並行して、この虚血性神経保護が神経免疫調節応答を伴い得ることを示唆している（Ｄｅｔｅｒｔら、２０１３）。

軽度のストレス刺激の誘発は、炎症性サイトカイン発現の調節を介して虚血性前処理を誘発し得る（Ｇｉｄｄａｙ、２００６）。

ＩＬ−１０は、インビトロおよびインビボの両方で神経細胞を虚血損傷から保護する（Ｇｒｉｌｌｉら、２０００）。

ＩＬ−１０は、出血性脳卒中の病理学的メカニズムに関与する炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αのアップレギュレーションを阻害する（Ｅｗｅｎら、２０１３）。

本実施例は、ＡＱの海馬内注入が、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αタンパク質発現の変化を引き起こす神経免疫調節応答を開始することを示す。この結論を支持するデータを、図５、６Ａ−Ｂ、７Ａ−Ｄおよび８Ａ−Ｃに示す。

［実施例３］
カルシウム結合タンパク質アポエクオリンの神経治療効果
カルシウム結合タンパク質（ＣａＢＰ）は、虚血細胞死を緩和する。

我々の研究室のデータから、ＣａＢＰアポエクオリン（ＡＱ）はインビトロ虚血前に背側海馬に注入されると神経保護作用を示し、前処理におけるＡＱの役割を示唆するＩＬ−１０およびＴＮＦ−αｍＲＮＡの時間特異的上昇をもたらす（Ｄｅｔｅｒｔら、２０１３）。

本実施例は、ＡＱの単一の海馬注入が、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αタンパク質発現を示差的に調節することを実証する。

カルシウムの毒性は、正常な老化において明らかである。老化のカルシウム仮説によれば、カルシウムホメオスタシスの調節不全は、正常な老化における認知低下に寄与する（Ｋｈａｃｈａｔｕｒｉａｎ、１９８７）。

年齢に関連したＣａＢＰの減少があり（ＤｅＪｏｎｇら、１９９６；Ｂｕら、２００３；Ｍｏｙｅｒら、２０１１）、我々の研究室からの所見は、追跡恐怖学習のために重要な構造である海馬におけるＣａＢＰ発現の減少を示している（ＭｃＥｃｈｒｏｎら、１９９８）。追跡恐怖調整は、正常な老化において損なわれる（Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌら、２００４；ＭｃＥｃｈｒｏｎら、２００４；Ｍｏｙｅｒら、２００６）。過剰なカルシウムを軽減することは、老齢動物における改善された認知機能をもたらす（Ｄｅｙｏら、１９８９；Ｖｅｎｇら、２００３）。

この実施例は、ＡＱの単一の海馬注入が、追跡恐怖調整の獲得における廊下に関連する欠損を緩和することをさらに実証する。

送達方法としては、経口投与が用いられた。ヘーゼルナッツスプレッドＮｕｔｅｌｌａ（登録商標）またはピーナッツバターをビヒクルとして用いて、ラットへの化合物の送達を経口的に達成することができる（Ｉｓａｋｓｓｏｎら、２０１１；Ｃｕｎｄｅｌｌら、２００３）。

我々の研究室の最近のデータは、ＡＱがインビトロ虚血の前に単回投与で経口投与された場合に神経保護性であることを示している（Ａｄａｍｓら、ＳｆＮ ２０１３）。この実施例は、ＡＱ経口投与の神経保護効果が、用量および時間依存性であることをさらに実証する。

図９Ａ−Ｃ、１０Ａ−Ｃおよび１１Ａ−Ｃは、以下の結論を支持する。ＡＱの直接注入は、ビヒクルと比較して変化したＩＬ−１０およびＴＮＦ−αタンパク質発現をもたらす。ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αの両方は、ＡＱ注入後の異なる発現パターンを示し、ＡＱの神経保護効果が免疫調節応答によって媒介され得ることを示す。

ＡＱの注入は、老齢動物における追跡恐怖学習障害を救わなかったが、成体においてはこのタスクの学習を妨げることはなかった。老齢ラットは成体に比べて前処理後２４時間の音（the tone）への氷点減少（decreased freezing）を示したが、ＡＱの投与は、老齢ラットでは氷点増加（increased freezing）を導かなかった。

ＡＱの経口投与は、時間および用量依存性である神経保護をもたらす。４８ｍｇ／ｋｇのＡＱの用量および７日間の経口投与は、虚血後の細胞死の有意な減少をもたらした。

［実施例４］
ＡＱの経口投与は、急性スライスモデルにおいて神経保護性である
我々の研究室は、最近、アポエクオリン（ＡＱ）が、酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）と呼ばれる虚血性脳卒中の急性脳スライスモデルにおいて神経保護性であることを実証した。４％ＡＱ注入を受けたラットは、ＯＧＤ後の細胞死の減少を示した（Ｄｅｔｅｒｔら、２０１３）。

この実施例は、サイトカインｍＲＮＡの時間依存的変化を含む免疫調節機構による細胞死の減少を示す。

ラットへの化合物の経口投与は、ヘーゼルナッツスプレッドＮｕｔｅｌｌａ（登録商標）（Ｉｓａｋｓｓｏｎら、２０１１）またはピーナッツバター（Ｃｕｎｄｅｌｌら、２００３）をビヒクルとして用いて達成した。最近、ＡＱは、強制飼養によってラットに投与された場合、非毒性であることが示されている（Ｍｏｒａｎら、２０１３）。ピーナッツバターのようなビヒクル中に送達されるＡＱの経口投与は、他の方法（例えば、ウイルス送達、直接注入または強制送達）よりも侵襲性が低く、経口送達システムはヒトの研究に一般化することができる。

この実施例は、ＡＱの経口投与が、酸素グルコース欠乏誘発細胞死から神経細胞を保護することを実証する。
方法

動物：９２匹の雄Ｆ３４４成体ラットを使用した。ラットは１４／１０時間の昼／夜のサイクルで飼育し、自由に食物と水に接近させた。有意な体重増加および／または減少を説明するために、各動物の体重を週に２回記録した。

薬物：アポエクオリン（ＡＱ；Ｑｕｉｎｃｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を濃度７．４％の二重脱イオン水中で調製した。用量依存性実験（ｎ＝１８）における実験群は、毎日のＰＢの混合された、０（ｎ＝４）、３．６（ｎ＝５）、４８（ｎ＝４）、２４０（ｎ＝３）、または４８０ｍｇ／ｋｇのＡＱを投与された。残りの試験では、ラット（ｎ＝７３）は、毎日のＰＢに混合された４８ｍｇ／ｋｇのＡＱを投与された。動物は５つのグループのうちの１つに割り当てられた。ＡＱなし（ｎ＝１２）、１時間のＡＱ（ｎ＝１７）、１日のＡＱ（ｎ＝１５）、２日のＡＱ（ｎ＝１５）、および７日間のＡＱ（ｎ＝１４）は、毎日指定された時間にケージ内のペトリ皿に置いた。ペトリ皿はすべてのＰＢが消費されるまで除去されなかった。ＡＱ投与量を適正に維持するために、週２回動物の体重を測定した。

注入試験のためのＡＱは、上述のように調製した（Ｄｅｔｅｒｔら、２０１３）。ＩＬ−１０中和抗体（ｎＡｂ）およびそのＩｇＧ対照を滅菌ＰＢＳ中で調製した。０．５μｇを、１μｌのハミルトンシリンジを通して１μｌ／分の速度で注入した。

酸素−グルコース枯渇：投与の最終日に、消化のためにＰＢを消費した後、ラットをイソフルランで深く麻酔し、背側海馬の角膜スライス（４００μｍ）（ｄｈｐｃ；Ｂｒｅｇｍａ^-３．１４〜^-４．１６；Ｐａｘｉｎｏｓ ＆ Ｗａｔｓｏｎ、１９９８）は、標準手順を用いて調製した（Ｍｏｙｅｒ ＆ Ｂｒｏｗｎ、２００７）。ａＣＳＦにおける１時間のスライス回復の後、各脳の１つの半球（釣り合いをとった（counterbalanced））を酸素グルコース欠乏チャンバーに移して、５分間インビトロ虚血に供した（グルコースをフルクトースで置き換え、９５％Ｎ₂−５％ＣＯ₂で泡立てた９５％Ｏ₂−５％ＣＯ₂）、この間残りの半球は回復したままであった。全てのスライスを、０．２％トリパンブルーを含有する酸素化ａＣＳＦ中に３０分間の再灌流期間の間保持した。トリパンブルーは死細胞を染色し、生細胞は染色されずに残す（ＤｅＲｅｎｚｉｓ ＆ Ｓｃｈｅｃｈｔｍａｎ、１９７３）。スライスを酸素添加した室温ａＣＳＦ中で２回すすぎ、次いで冷蔵庫中にて一晩１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。スライスを３０％スクロース中で凍結保護し、クリオスタット（４０μｍ）上でスライスにし、細胞計数のために下位スライド上に載せた。

細胞数スライスを１０倍Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡（デジタルカメラを装備）下で検査し、写真を撮った（ＣｅｌｌＳｅｎｓ）。ＣＡ１内のトリパンブルー染色された神経細胞（約８００μｍのスライス）を、実験条件に盲検された実験者によって計数した。統計解析は、ＳＰＳＳ（ｖ２１．０．０；ＩＢＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ）を用いて行った。ＡＮＯＶＡを用いて薬物効果を評価し、フィッシャーのＬＳＤ事後評価を用いて群相互作用を評価した。アスタリスク（＊）はｐ＜．０５を示す。

ウエスタンブロット：動物をイソフルランで深く麻酔し、脳を迅速に取り出し、凍結し、−８０℃で保存した。解剖の際、試料をｄｈｐｃ（Ｂｒｅｇｍａ^-３．１４〜^-４．１６ｍｍ）から取り出した。試料をホモジナイズし、４０００ＲＰＭで２０分間遠心分離し、上清を除去し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質を測定した。タンパク質サンプルを標準化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）にロードした。タンパク質（３０μｇ）を、Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ膜上に移した。膜をブロッキング緩衝液（２時間）、一次抗体（４℃で一晩；１：１０００マウス抗エクオリン［Ｃｈｅｍｉｃｏｎ］または１：１０００ウサギ抗β−アクチン［Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］および二次抗体（９０分；１：２０，０００ヤギ抗マウス［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］または１：４０，０００ヤギ抗ウサギ［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］）でインキュベートした。次いで、膜を洗浄し、化学発光溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れ、Ｓｙｎｇｅｎｅ ＧＢｏｘで画像化した。ＧｅｎｅＳｏｏｌｓソフトウェア（ｖ１．２．４．０；Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓカメラ４．２ＭＰ）で画像を撮影し、各バンドの蛍光をＧｅｎｅＴｏｏｌｓソフトウェア（ｖ４．０２；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）で評価した。値は、対照動物のパーセンテージとして表される。統計はＳＰＳＳ（ｖ．２１）で行った。

概要
図１２、１３Ａ−Ｃ、１４Ａ−Ｄ、１５Ａ−Ｂおよび１６は以下の結論を支持する：アポエクオリンの神経保護効果は用量依存的である。経口投与された場合、ＡＱはＯＧＤ誘導細胞死を４８ｍｇ／ｋｇの用量で保護する。

アポエクオリンは長期間の神経保護作用を有する。ＡＱの経口投与を１時間、１日、２日または７日間受けたラットの脳スライスは、神経保護を示した。

アポエクオリン投与は、サイトカインタンパク質の発現を変化させる。

ＴＮＦ−αタンパク質発現は、ＡＱの２日間の経口投与後に増加するが、ＩＬ−１０タンパク質発現は変わらない。

注入時、ＩＬ−１０タンパク質発現は、ビヒクルが注入された半球と比較して１時間で増加する。さらに、ＴＮＦ−αは１日目に増加し、その後、タンパク質レベルはベースライン未満に低下する。アポエクオリンの神経保護効果は、ＩＬ−１０中和抗体によって逆転する。

インビトロＯＧＤの１日前に注入すると、ＡＱの神経保護効果はＩＬ−１０ｎＡｂと対になって消滅する。

現在のデータは、それがＩＬ−１０の中和によるものであろうと下流のカスケードによるものであろうと、ＡＱの神経保護効果がＩＬ−１０を含むことを示唆している。

本明細書に記載されている実施例は、説明目的だけのものであり、その観点から様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の精神と範囲、及び添付の特許請求の範囲に含まれる。本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

参考文献
1.Go AS, Mozaffarian D, Roger VL, Benjamin EJ, Berry JD, et al. (2013) Executive summary: heart disease and stroke statistics--2013 update: a report from the American Heart Association. Circulation 127: 143-152.
2.Jones TA, Allred RP, Adkins DL, Hsu JE, O'Bryant A, et al. (2009) Remodeling the brain with behavioral experience after stroke. Stroke 40: S136-138.
3.Ginsberg MD (2009) Current status of neuroprotection for cerebral ischemia: synoptic overview. Stroke 40: S111-114.
4.Lin RC, Scheller RH (2000) Mechanisms of synaptic vesicle exocytosis. Ann Rev Cell Dev Biol 16: 19-49.
5.Berridge MJ (1998) Neuronal calcium signaling. Neuron 21: 13-26.
6.Bano D, Young KW, Guerin CJ, Lefeuvre R, Rothwell NJ, et al. (2005) Cleavage of the plasma membrane Na+/Ca2+ exchanger in excitotoxicity. Cell 120: 275-285.
7.Choi DW (1992) Excitotoxic cell death. J Neurobiol 23: 1261-1276.
8.Lee JM, Zipfel GJ, Choi DW (1999) The changing landscape of ischaemic brain injury mechanisms. Nature 399: A7-14.
9.Kristian T, Siesjo BK (1998) Calcium in ischemic cell death. Stroke 29: 705-718.
10.Baimbridge KG, Celio MR, Rogers JH (1992) Calcium-binding proteins in the nervous system. Trends Neurosci 15: 303-308.
11.Chard PS, Jordan J, Marcuccilli CJ, Miller RJ, Leiden JM, et al. (1995) Regulation of excitatory transmission at hippocampal synapses by calbindin D28k. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 5144-5148.
12.Lledo PM, Somasundaram B, Morton AJ, Emson PC, Mason WT (1992) Stable transfection of calbindin-D28k into the GH3 cell line alters calcium currents and intracellular calcium homeostasis. Neuron 9: 943-954.
13.Celio MR, Pauls TL, Schwaller B (1996) Introduction to EF-hand calcium-binding proteins. In: Celio MR, editor. Guidebook to the Calcium-binding Proteins. New York: Oxford University Press. pp. 15-20.
14.Freund TF, Buzsaki G, Leon A, Baimbridge KG, Somogyi P (1990) Relationship of neuronal vulnerability and calcium binding protein immunoreactivity in ischemia. Exp Brain Res 83: 55-66.
15.Gary DS, Sooy K, Chan SL, Christakos S, Mattson MP (2000) Concentration- and cell type-specific effects of calbindin D28k on vulnerability of hippocampal neurons to seizure-induced injury. Brain Res Mol Brain Res 75: 89-95.
16.Iacopino AM, Christakos S, German D, Sonsalla PK, Altar CA (1992) Calbindin-D28K-containing neurons in animal models of neurodegeneration: possible protection from excitotoxicity. Brain Res Mol Brain Res 13: 251-261.
17.Rami A, Rabie A, Thomasset M, Krieglstein J (1992) Calbindin-D28K and ischemic damage of pyramidal cells in rat hippocampus. J Neurosci Res 31: 89-95.
18.Choi JH, Lee CH, Yoo KY, Hwang IK, Lee IS, et al. (2010) Age-related changes in calbindin-D28k, parvalbumin, and calretinin immunoreactivity in the dog main olfactory bulb. Cell Mol Neurobiol 30: 1-12.
19.De Jong GI, Naber PA, Van der Zee EA, Thompson LT, Disterhoft JF, et al. (1996) Age-related loss of calcium binding proteins in rabbit hippocampus. Neurobiol Aging 17: 459-465.
20.Moyer JR, Jr., Furtak SC, McGann JP, Brown TH (2011) Aging-related changes in calcium-binding proteins in rat perirhinal cortex. Neurobiol Aging 32: 1693-1706.
21.Bu J, Sathyendra V, Nagykery N, Geula C (2003) Age-related changes in calbindin-D28k, calretinin, and parvalbumin-immunoreactive neurons in the human cerebral cortex. Exp Neurol 182: 220-231.
22.Krzywkowski P, Potier B, Billard JM, Dutar P, Lamour Y (1996) Synaptic mechanisms and calcium binding proteins in the aged rat brain. Life Sci 59: 421-428.
23.Villa A, Podini P, Panzeri MC, Racchetti G, Meldolesi J (1994) Cytosolic Ca2+ binding proteins during rat brain ageing: loss of calbindin and calretinin in the hippocampus, with no change in the cerebellum. Eur J Neurosci 6: 1491-1499.
24.Mattson MP, Magnus T (2006) Ageing and neuronal vulnerability. Nat Rev Neurosci 7: 278-294.
25.Iacopino AM, Christakos S (1990) Specific reduction of calcium-binding protein (28-kilodalton calbindin-D) gene expression in aging and neurodegenerative diseases. Proc Natl Acad Sci U S A 87: 4078-4082.
26.Thibault O, Gant JC, Landfield PW (2007) Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store. Aging Cell 6: 307-317.
27.Hof PR, Morrison JH (1991) Neocortical neuronal subpopulations labeled by a monoclonal antibody to calbindin exhibit differential vulnerability in Alzheimer's disease. Exp Neurol 111: 293-301.
28.Mikkonen M, Alafuzoff I, Tapiola T, Soininen H, Niettinen R (1999) Subfield- and layer-specific changes in parvalbumin, calretinin and calbindin-D28K immunoreactivity in the entorhinal cortex in Alzheimer's disease. Neuroscience 92: 515-532.
29.Sutherland MK, Wong L, Somerville MJ, Yoong LKK, Bergeron C, et al. (1993) Reduction of calbindin-28k mRNA levels in Alzheimer as compared to Huntington hippocampus. Brain Res Mol Brain Res 18: 32-42.
30.Yenari MA, Minami M, Sun GH, Meier TJ, Kunis DM, et al. (2001) Calbindin d28k overexpression protects striatal neurons from transient focal cerebral ischemia. Stroke 32: 1028-1035.
31.Fan Y, Shi L, Gu Y, Zhao Y, Xie J, et al. (2007) Pretreatment with PTD-calbindin D 28k alleviates rat brain injury induced by ischemia and reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab 27: 719-728.
32.Urra X, Chamorro A (2013) Emerging issues in acute ischemic stroke. J Neurol 260: 1687-1692.
33.Khachaturian ZS (1984) Towards theories of brain aging. In: Kay DWK, Burrows GD, editors. Handbook of Studies on Psychiatry and Old Age. New York: Elsevier. pp. 7-30.
34.Khachaturian ZS (1989) The role of calcium regulation in brain aging: reexamination of a hypothesis. Aging 1: 17-34.
35.Landfield PW (1987) 'Increased calcium-current' hypothesis of brain aging. Neurobiol Aging 8: 346-347.
36.Wu WW, Oh MM, Disterhoft JF (2002) Age-related biophysical alterations of hippocampal pyramidal neurons: implications for learning and memory. Ageing Res Rev 1: 181-207.
37.Disterhoft JF, Oh MM (2007) Alterations in intrinsic neuronal excitability during normal aging. Aging Cell 6: 327-336.
38.Brait VH, Arumugam TV, Drummond GR, Sobey CG (2012) Importance of T lymphocytes in brain injury, immunodeficiency, and recovery after cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 32: 598-611.
39.Mahesh VB, Dhandapani KM, Brann DW (2006) Role of astrocytes in reproduction and neuroprotection. Mol Cell Endocrinol 246: 1-9.
40.Sama DM, Norris CM (2013) Calcium dysregulation and neuroinflammation: Discrete and integrated mechanisms for age-related synaptic dysfunction. Ageing Res Rev.
41.Simon RP, Swan JH, Griffiths T, Meldrum BS (1984) Blockade of N-methyl-D-aspartate receptors may protect against ischemic damage in the brain. Science 226: 850-852.
42.Choi DW (1985) Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture is calcium dependent. Neurosci Lett 58: 293-297.
43.Lysko PG, Cox JA, Vigano MA, Henneberry RC (1989) Excitatory amino acid neurotoxicity at the N-methyl-D-aspartate receptor in cultured neurons: pharmacological characterization. Brain Res 499: 258-266.
44.Park CK, Nehls DG, Graham DI, Teasdale GM, McCulloch J (1988) The glutamate antagonist MK-801 reduces focal ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol 24: 543-551.
45.Nikonenko I, Bancila M, Bloc A, Muller D, Bijlenga P (2005) Inhibition of T-type calcium channels protects neurons from delayed ischemia-induced damage. Mol Pharmacol 68: 84-89.
46.Hadley MN, Zabramski JM, Spetzler RF, Rigamonti D, Fifield MS, et al. (1989) The efficacy of intravenous nimodipine in the treatment of focal cerebral ischemia in a primate model. Neurosurgery 25: 63-70.
47.Uematsu D, Araki N, Greenberg JH, Sladky J, Reivich M (1991) Combined therapy with MK-801 and nimodipine for protection of ischemic brain damage. Neurology 41: 88-94.
48.Lipton SA (2004) Failures and successes of NMDA receptor antagonists: molecular basis for the use of open-channel blockers like memantine in the treatment of acute and chronic neurologic insults. NeuroRx 1: 101-110.
49.Toma S, Chong KT, Nakagawa A, Teranishi K, Inouye S, et al. (2005) The crystal structures of semi-synthetic aequorins. Protein Sci 14: 409-416.
50.Cobbold PH, Lee JAC (1991) Aequorin measurements of cytoplasmic free calcium. In: McCormack JG, Cobbold PH, editors. Cellular calcium: a practical approach. New York: Oxford University Press. pp. 55-81.
51.Shimomura O, Inouye S (1996) Titration of recombinant aequorin with calcium chloride. Biochem Biophys Res Commun 221: 77-81.
52.Raley-Susman KM, Lipton P (1990) In vitro ischemia and protein synthesis in the rat hippocampal slice: the role of calcium and NMDA receptor activation. Brain Res 515: 27-38.
53.Newman GC, Hospod FE, Wu P (1989) Glucose utilization of ischemic hippocampal slices. J Neurosci Methods 28: 23-34.
54.Taylor CP, Burke SP, Weber ML (1995) Hippocampal slices: glutamate overflow and cellular damage from ischemia are reduced by sodium-channel blockade. J Neurosci Methods 59: 121-128.
55.Whittingham TS, Lust WD, Passonneau JV (1984) An in vitro model of ischemia: metabolic and electrical alterations in the hippocampal slice. J Neurosci 4: 793-802.
56.Pohorecki R, Becker GL, Reilly PJ, Landers DF (1990) Ischemic brain injury in vitro: protective effects of NMDA receptor antagonists and calmidazolium. Brain Res 528: 133-137.
57.Lipton P (1999) Ischemic cell death in brain neurons. Physiol Rev 79: 1431-1568.
58.Kirino T, Sano K (1984) Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathol 62: 201-208.
59.Moran DL, Marone PA, Bauter MR, Soni MG (2013) Safety assessment of Apoaequorin, a protein preparation: Subchronic toxicity study in rats. Food Chem Toxicol 57C: 1-10.
60.Moyer JR, Jr., Brown TM (2007) Visually-guided patch-clamp recordings in brain slices. In: Walz W, editor. Advanced Techniques for Patch-Clamp Analysis. 3rd ed. Totowa, NJ: Humana Press. pp. 169-227.
61.Moyer JR, Jr., Brown TH (1998) Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. J Neurosci Methods 86: 35-54.
62.DeRenzis FA, Schechtman A (1973) Staining by neutral red and trypan blue in sequence for assaying vital and nonvital cultured cells. Stain Technol 48: 135-136.
63.Pfaffl MW (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29: e45.
64.Simon RP, Niiro M, Gwinn R (1993) Prior ischemic stress protects against experimental stroke. Neurosci Lett 163: 135-137.
65.Xu GP, Dave KR, Vivero R, Schmidt-Kastner R, Sick TJ, et al. (2002) Improvement in neuronal survival after ischemic preconditioning in hippocampal slice cultures. Brain Res 952: 153-158.
66.Oh MM, Oliveira FA, Disterhoft JF (2010) Learning and aging related changes in intrinsic neuronal excitability. Front Aging Neurosci 2: 2.
67.Pera J, Zawadzka M, Kaminska B, Szczudlik A (2004) Influence of chemical and ischemic preconditioning on cytokine expression after focal brain ischemia. J Neurosci Res 78: 132-140.
68.Mattson MP, Rychlik B, Chu C, Christakos S (1991) Evidence for calcium-reducing and excito-protective roles for the calcium-binding protein calbindin-D28k in cultured hippocampal neurons. Neuron 6: 41-51.
69.Lowenstein DH, Gwinn RP, Seren MS, Simon RP, McIntosh TK (1994) Increased expression of mRNA encoding calbindin-D28K, the glucose-regulated proteins, or the 72 kDa heat-shock protein in three models of acute CNS injury. Brain Res Mol Brain Res 22: 299-308.
70.Mattson MP, Cheng B, Baldwin SA, Smith-Swintosky VL, Keller J, et al. (1995) Brain injury and tumor necrosis factors induce calbindin D-28k in astrocytes: evidence for a cytoprotective response. J Neurosci Res 42: 357-370.
71.Hwang IK, Kang TC, Lee JC, Park SK, An SJ, et al. (2003) Chronological alterations of calbindin D-28k immunoreactivity in the gerbil main olfactory bulb after ischemic insult. Brain Res 971: 250-254.
72.Freund TF, Ylinen A, Miettinen R, Pitkanen A, Lahtinen H, et al. (1992) Pattern of neuronal death in the rat hippocampus after status epilepticus. Relationship to calcium binding protein content and ischemic vulnerability. Brain Res Bull 28: 27-38.
73.Klapstein GJ, Vietla S, Lieberman DN, Gray PA, Airaksinen MS, et al. (1998) Calbindin-D28k fails to protect hippocampal neurons against ischemia in spite of its cytoplasmic calcium buffering properties: evidence from calbindin-D28k knockout mice. Neuroscience 85: 361-373.
74.Tymianski M, Wallace MC, Spigelman I, Uno M, Carlen PL, et al. (1993) Cell-permeant Ca2+ chelators reduce early excitotoxic and ischemic neuronal injury in vitro and in vivo. Neuron 11: 221-235.
75.Tymianski M, Spigelman I, Zhang L, Carlen PL, Tator CH, et al. (1994) Mechanism of action and persistence of neuroprotection by cell-permeant Ca2+ chelators. J Cereb Blood Flow Metab 14: 911-923.
76.Abdel-Hamid KM, Baimbridge KG (1997) The effects of artificial calcium buffers on calcium responses and glutamate-mediated excitotoxicity in cultured hippocampal neurons. Neuroscience 81: 673-687.
77.Cronberg T, Rytter A, Wieloch T (2005) Chelation of intracellular calcium reduces cell death after hyperglycemic in vitro ischemia in murine hippocampal slice cultures. Brain Res 1049: 120-127.
78.Dubinsky JM (1993) Effects of calcium chelators on intracellular calcium and excitotoxicity. Neurosci Lett 150: 129-132.
79.Barone FC, White RF, Spera PA, Ellison J, Currie RW, et al. (1998) Ischemic preconditioning and brain tolerance: temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression. Stroke 29: 1937-1950; discussion 1950-1931.
80.Kirino T (2002) Ischemic tolerance. J Cereb Blood Flow Metab 22: 1283-1296.
81.Jung M, Sola A, Hughes J, Kluth DC, Vinuesa E, et al. (2012) Infusion of IL-10-expressing cells protects against renal ischemia through induction of lipocalin-2. Kidney Int 81: 969-982.
82.Levin SG, Godukhin OV (2011) Anti-inflammatory cytokines, TGF-beta1 and IL-10, exert anti-hypoxic action and abolish posthypoxic hyperexcitability in hippocampal slice neurons: comparative aspects. Exp Neurol 232: 329-332.
83.Lin RC, Scheller RH (2000) Mechanisms of synaptic vesicle exocytosis. Annu Rev Cell Dev Biol 16: 19-49.
84.Hasko G, Szabo C, Nemeth ZH, Lendvai B, Vizi ES (1998) Modulation by dantrolene of endotoxin-induced interleukin-10, tumour necrosis factor-alpha and nitric oxide production in vivo and in vitro. Br J Pharmacol 124: 1099-1106.
85.Wang X, Li X, Erhardt JA, Barone FC, Feuerstein GZ (2000) Detection of tumor necrosis factor-alpha mRNA induction in ischemic brain tolerance by means of real-time polymerase chain reaction. J Cereb Blood Flow Metab 20: 15-20.
86.Wang X, Li X, Currie RW, Willette RN, Barone FC, et al. (2000) Application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1beta mRNA in ischemic brain tolerance. J Neurosci Res 59: 238-246.
87.Ohtsuki T, Ruetzler CA, Tasaki K, Hallenbeck JM (1996) Interleukin-1 mediates induction of tolerance to global ischemia in gerbil hippocampal CA1 neurons. J Cereb Blood Flow Metab 16: 1137-1142.
88.Mallard C, Hagberg H (2007) Inflammation-induced preconditioning in the immature brain. Semin Fetal Neonatal Med 12: 280-286.
89.Gerard C, Bruyns C, Marchant A, Abramowicz D, Vandenabeele P, et al. (1993) Interleukin 10 reduces the release of tumor necrosis factor and prevents lethality in experimental endotoxemia. J Exp Med 177: 547-550.
90.Spera PA, Ellison JA, Feuerstein GZ, Barone FC (1998) IL-10 reduces rat brain injury following focal stroke. Neurosci Lett 251: 189-192.
91.Yang J, Ahn HN, Chang M, Narasimhan P, Chan PH, et al. (2013) Complement component 3 inhibition by an antioxidant is neuroprotective after cerebral ischemia and reperfusion in mice. J Neurochem 124: 523-535.
92.Hwang IK, Yoo KY, Kim DW, Lee HJ, Kang HY, et al. (2006) Transient ischemia-induced changes of interleukin-2 and its receptor beta immunoreactivity and levels in the gerbil hippocampal CA1 region. Brain Res 1106: 197-204.
93.Ishikawa M, Vowinkel T, Stokes KY, Arumugam TV, Yilmaz G, et al. (2005) CD40/CD40 ligand signaling in mouse cerebral microvasculature after focal ischemia/reperfusion. Circulation 111: 1690-1696.
94.Tan J, Town T, Mori T, Obregon D, Wu Y, et al. (2002) CD40 is expressed and functional on neuronal cells. EMBO J 21: 643-652.

Claims (6)

1. 神経細胞の炎症を軽減するために、神経細胞の炎症に敏感な対象における、神経細胞の炎症を前処理するための経口投与組成物であって、対象における神経細胞の炎症軽減のため、神経細胞の前処理のための治療有効量のアポエクオリンを含む、組成物。
2. 前記組成物が錠剤またはカプセルから選択される単位剤形である、請求項１に記載の組成物。
3. アポエクオリンが栄養補助食品組成物の形態である、請求項１に記載の組成物。
4. 対象における腫瘍壊死因子α（TNFα）タンパク質レベルを低下させるための、アポエクオリンを含む経口投与組成物。
5. 前記組成物が錠剤またはカプセルから選択される単位剤形である、請求項４に記載の組成物。
6. アポエクオリンが栄養補助食品組成物の形態である、請求項４に記載の組成物。

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