JP4417273B2 - 精子活性化剤および精子不活性化剤 - Google Patents
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Yanagimachi, R. (1917) J. Reprod. Fertil. 23, 193-196. Neill, J. M. & Olds-Clarke, P. (1987) Gamete Res. 18, 122-140. Niwa, K. & Iritani, A. (1978) J. Reprod. Fertil. 53, 267-271. Fraser, L. R. & Quinn, P. J. (1981) J. Reprod. Fertil. 61, 25-35. Suarez, S. & Osman, R. A. (1987) Biol. Reprod. 36, 1191-1198. Cooper, T. G. (1984) Gamete Res. 9, 55-74. Ford, W. C. L. &Harrison, A. (1981) J. Reprod. Fertil. 63, 271-278. Ford, W. C. L. & Ress, J. M. (1990) in Controls of Sperm Motility: Biological and Clinical Aspects, ed. Gagnon, C. (CRC Press, Fla), pp. 175-202. Williams, A. C. & Ford, C. L. (2001) J. Androl.22, 680-695. Bone, W. et al. (2001) J. Androl. 22, 464-470. Suter, D. et al. (1979) Biol. Reprod. 20, 505-510. Coates, A. et al. (1999) Fertil. Steril. 72, 229-232. Mitchell, G. A. et al. (1995) Clin. Invest. Med. 18, 193-216. Williamson, D. H. et al. (1971) Biochemical J. 121, 41-47. Fukao, T. et al. (1997) Pediatric Res. 42, 498-502. Koga, M. et al. (2000) Biol. Reprod. 63, 1601-1609. Tanaka, H. et al. (2001a) in Andrology in the 21st Century. Proceeding of VIIth international congress of andrology, eds Robaire, B., Chemes, H. & Morales, R. C., MEDIMOND Press, New York), pp. 157-161. Tanaka, H. et al. (2001b) Mol. Hum. Reprod. 8, 16-23. Tanaka, H. et al. (2003) Int. J. Androl. 26, 52-56.
(1−1)実験動物
実験用のC57BL/6系統の雄マウスは日本CLEA社より購入し、約2〜3ヶ月齢時点で使用した。先体反応のリアルタイム変化を観察するため、アクロシン/EGFP導入遺伝子を持つ遺伝子導入マウスの精子を利用した(Nakanishi, T. et al. (1999) FEBS Lett. 449, 277-283)。全動物実験は大阪大学微生物研究所の実験動物委員会による承認を受けた。
(1−2)精巣上体尾部からの精子の収集
6個の精巣上体尾部を流動パラフィン(Nacalai社)中に収集した。グルコース、ピルビン酸ナトリウム、BSAフリー基礎TYH培地(bTYH)(119mM NaCl、4.8mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.0mM MgSO4、25mM NaHCO3)(Toyoda, Y. et al. (1971) Jpn. J. Anim. Reprod. 16, 147-151)(800μl)に対して0.5mMのピルビン酸ナトリウム(bTYH+pyr)、1.7mM CaCl2(bTYH+Ca)、またはピルビン酸塩とカルシウムの両者(bTYH+Ca,pyr)を添加したものを、30mm組織培養皿(NUNC社、デンマーク)中の4mlの流動パラフィンに入れた。精巣上体尾部を切除し、ピンセットにより精子塊を流動パラフィンで覆われた培地に入れた。続いて加湿されたインキュベータ内に培養皿を入れ、5% CO2:95%空気条件で1時間にわたりインキュベートした。精子を含む数滴をピペットでCASAチェンバー内に入れ、精子運動の分析を行った。カルシウムとピルビン酸塩を含む培地(bTYH+Ca, Pyr)中の精子を1.5ml試験管内に入れ、室温で1分間にわたり5,000gの遠心分離を行ってから、次の実験に用いた。上清を除去し、1.7mMカルシウムを含むbTYH(bTYH+Ca)700μlを添加し、ピペッティングにより緩やかに混合した。それぞれピルビン酸塩、グルコース、アセト酢酸塩(City Chemical社、米国)または適切濃度の3β-ヒドロキシ酪酸塩(Sigma社、米国)を添加した50μlのbTYH+Ca、あるいはアルファクロロヒドリン(Sigma社、米国)を入れた複数の皿に、精子を含む数滴(50μl)を移した。次にCO2インキュベータ内で各培養皿をインキュベートした。
(1−3)精子運動度の観察
精子を各種炭水化物の含まれた新鮮な培地に移してから適当な時間が経過した時点で、適切な培地中の精子懸濁液の部分滴10μlを1:10-40に希釈し、血球計算スライド上に置いた。運動性の精子と非運動性の精子数を記録し、これらの値を用いて運動性の細胞比率を求めた。
(1−4)先体反応を生じた精子の蛍光活性化セルソーター(FACS)による検出
アクロシン-EGFP導入遺伝子により標識した緑色精子の分析は、精子懸濁液に対してヨウ化プロピジウムを添加した後、FACS(FACS-Calibur, Becton Dickinson社)により実施した。生きている精子(ヨウ化プロピジウム陰性)を元に、精子総数中で先体反応を生じた精子(GFP陰性)の百分率を計数した(Nakanishi, T. et al. (1999) FEBS Lett. 449, 277-283)。
(1−5)コンピュータ補助精子分析(CASA)
1.7mMカルシウムの存在下または非存在下でのbTYH培地中におけるインキュベーション(60分間)終了時に、各試料10μlをピペットでMakler計数チャンバー(Sefi Medical Instrument社、イスラエル)に移し、HTM-IVOS Ver.10(Hamilton Thorne Research社、米国)により精子運動を分析した。この機器を用いて少なくとも200個の精子を計数し、進行的運動型精子の比率、直線速度(VSL)、曲線速度(VCL)、外側頭部置換振幅(ALH)、直線性(LIN)などを評価した(Mortimer, S. T. (1997) Hum. Reprod. Update 3, 403-439参照)。精子運動分析は標準CASA(コンピュータ補助精子分析)として実施し、製造元の指示に従って以下のパラメータを用いた。温度、37℃;逆位相差光学系;補足フレーム、30;フレームレート、60Hz;最小コントラスト、60;最小セルサイズ、3ピクセル;最大静止コントラスト、30;低VAPカットオフ、5.0μm/s;静的ヘッドサイズ、0.32〜2.99;静的ヘッド強度、0.42〜1.60;倍率、1.95。分析中にはプレイバック機能を用いて、衝突により明らかにミストラッキングされた精子を削除した。16ポイント未満のトラックは除去した。
(1−6)統計
精子の運動パラメータは平均値で表現し、併せて運動性と進行率では95%信頼区間を、他のパラメータでは平均の標準誤差(SEM)を示した。統計分析のためには、スチューデントのt検定を適用して、各時点での事例と対照を比較した。p値が0.05未満である場合に統計的有意であるとみなした。
(2)結果
(2−1)精子の調製
精子標本はインキュベーション前培地中において超活性化されており、これはCa依存性運動性パラメータにより決定された。
(2−2)超活性化された精子の運動比率にケトン体(3-β-ヒドロキシ酪酸またはアセト酢酸)が及ぼす影響
グルコース含有培地にて180分間インキュベーションを行った後、ほぼ等比率の精子が運動を保持していた。グルコースやピルビン酸と同様に、ケトン体(ヒドロキシ酪酸とアセト酢酸)はいずれも精子運動の維持に有効であった(図2)。
(2−3)解糖系阻害による精子運動性の障害、ならびに精子運動の回復にヒドロキシ酪酸が果たす影響
エネルギー源枯渇のため一度停止した精子の運動性は、グルコース添加により回復するが(図2と3)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase)阻害剤であるアルファ-クロロヒドリン(ACH)(Bone, W. et al. (2001) J. Androl. 22, 464-470)を培地に添加することにより、グルコースにより回復した精子の運動が用量依存的に阻害される。この阻害剤を高濃度で添加しグルコースと等濃度にすると、グルコースによる精子運動性の回復は全く観察されなくなる(図4)。このため解糖系の阻害は精子運動性に対する有害作用を示すので、男性避妊薬開発のために研究された(Bone, W. et al. (2001) J. Androl. 22, 464-470)。興味深いことにグルコース媒介性の精子運動をACHで阻害した場合、ヒドロキシ酪酸の添加により完全回復した。この結果からヒドロキシ酪酸により補助される超活性化精子の運動は、解糖系を使用していないことが示される。
(2−4)ピルビン酸、グルコースならびにケトン体が精子の受精能獲得に及ぼす影響
通常は受精能獲得に伴って超活性化が生じるが、これは単に受精能獲得の結果起こるものではなく、別個の過程であるらしい。これら2種類の過程の関係を調べるため、ここではケトン体が精子の受精能獲得に及ぼす影響を調べた。受精能獲得のモニタリングは、先体反応をおこした精子の時間依存的出現を利用する。先体反応はアクロシン-EGFP遺伝子導入マウスの精子を用いるならば、蛍光の消失により容易に検出可能である(Nakanishi, T. et al. (1999) FEBS Lett. 449, 277-283)。遺伝子導入された精子を、Ca存在下にてグルコース含有基礎TYH培地(bTYH+Ca,glu)でインキュベートした場合、先体反応をおこした精子数はインキュベーション時間に従って増加した。60%以上の精子が蛍光を消失したが、これは先体反応によるEGFP蛋白質の放出によるものであり、当該培地での精子の受精能獲得を示している。Ca欠如性グルコース培地(bTYH-glu)にて精子をインキュベートした場合には、先体反応をおこした精子数の増加は全くみられなかった(図5)。ヒドロキシ酪酸含有培地では先体反応の刺激はおこらず、Ca非含有培地におけるインキュベーションと類似しており、グルコースとCaの添加培地(bTYH+Ca,glu)の事例とは異なる結果であった。さらに解糖系阻害剤ACHは、グルコース媒介性の精子の受精能獲得を明らかに阻害した(図5)。
Claims (2)
- 精巣特異的なサクシニールCoA転移酵素(SCOT-t)の脂質代謝産物であるケトン体を含有し、精子の先体反応を抑制する精子用培地。
- ケトン体が、アセト酢酸または3ヒドロキシ酪酸である請求項1の精子用培地。
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