KR102361556B1

KR102361556B1 - 유산균의 균체외 다당 및 그 용도

Info

Publication number: KR102361556B1
Application number: KR1020197004479A
Authority: KR
Inventors: 마사노리 스기야마
Original assignee: 소네팜 가부시키가이샤
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2022-02-09
Anticipated expiration: 2038-05-28
Also published as: CN109996885A; CA3032579C; NZ750198A; JPWO2018225557A1; EP3483281A1; TW201902501A; TWI713850B; JP6523579B2; AU2018281512B2; EP3483281A4; WO2018225557A1; CA3032579A1; AU2018281512A1; US20230183388A1; BR112019000066A2; KR20190104308A

Abstract

무화과 유래의 유산균으로서 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균의 균체외 다당은, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 포함하고, 히알루로니다제를 저해하는 활성을 갖기 때문에, 항알레르기 효과 등을 발휘하는 음식품, 의약품, 사료, 화장품 등에 유용하다.

Description

유산균의 균체외 다당 및 그 용도

본 발명은 유산균의 균체외 다당 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은, 무화과 유래의 유산균으로서 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균의 균체외 다당, 및 그것을 함유하는 항알레르기 효과 등을 발휘하는 음식품 조성물, 의약 조성물, 사료 조성물, 화장품 조성물 등의 조성물에 관한 것이다.

유산균은, 글루코스 등의 탄수화물을 발효하여 에너지를 획득해 다량의 락트산을 생성하는 한 무리의 세균으로, 비병원성이며 비포자형성성의 그람 양성균이다. 유산균은, 예로부터 요구르트, 치즈 등의 발효 식품의 제조에 사용되고, 또한, 적절한 양으로 투여하면 숙주의 헬스 케어에 있어서 유익한 효과를 발휘하기 때문에, 프로바이오틱스로서도 널리 사용되고 있다.

프로바이오틱스로서 효과가 있는 유산균으로는, 예를 들어, 혈청 지질에 대한 효과를 갖는 락토바실러스·플란타럼(Lactobacillus plantarum) MA2주(비특허문헌 1), 콜레스테롤 저하 작용을 갖는 Lactobacillus plantarum PH04주(비특허문헌 2) 등이 알려져 있다. 또한, 식물 유래의 유산균으로서, 지방간의 개선 및 체내 지방의 축적 억제 효과를 갖는 페디오코커스·펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) LP28주(비특허문헌 3) 등도 알려져 있다.

락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균주에 대해서도, 항알레르기 작용을 갖는 Lactobacillus paracasei K71주(특허문헌 1), 항인플루엔자 바이러스 활성을 갖는 Lactobacillus paracasei MCC1375주(특허문헌 2), 인터류킨-12 생성을 활성화하는 Lactobacillus paracasei KW3110주(비특허문헌 4) 등이 알려져 있다.

한편, 유산균이 생성하는 균체외 다당에 관해서는, 균체외 다당을 생성하는 유산균을 요구르트의 스타터균으로서 사용함으로써, 요구르트의 점성이 증가하여 분리를 방지하는 동시에, 요구르트다운 순한 식감이 생기는 것이 알려져, 균체외 다당을 생성하는 유산균은 식품에 널리 사용되고 있다. 또한, 균체외 다당은 식품의 증점제로서도 사용할 수도 있다. 또한, 몇 가지 유산균주는, 인간의 건강의 유지나 향상에 기여하는 생리 활성 물질로서 균체외 다당(exopolysaccharide)을 생성하는 것이 알려져 있다. 유산균에 의해 생성되는 균체외 다당은 면역 조절 기능이나 위염의 예방 개선 기능을 발휘하는 것이 나타내어져 있다(비특허문헌 5 및 6). 또한, Lactobacillus paracasei에 속하는 유산균에 의해 생성되는 균체외 다당에 대해서도 알려져 있으며, Lactobacillus paracasei DG주는 람노스가 풍부한 균체외 다당을 생성하고(비특허문헌 7), Lactobacillus paracasei KB28주는 글루코스가 풍부한 균체외 다당을 생성하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 8). Lactobacillus paracasei 34-1주는, D-갈락토오스, 2-아세트아미드-2-디옥시-D-갈락토오스 및 sn-글리세롤 3-포스페이트로 이루어지는 균체외 다당을 생성하는 것도 보고되어 있다(비특허문헌 9).

특허문헌 1: 국제 공개 제WO2009/131208호 특허문헌 2: 국제 공개 제WO2012/133827호

비특허문헌 1: Appl. Microbiol. Biotechnol., 84, 341-347(2009) 비특허문헌 2: Int. J. Food Microbiol., 113, 358-361(2007) 비특허문헌 3: PLoS One e30696(2012) 비특허문헌 4: Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 1561-1565 비특허문헌 5: Carbohydr. Polym., 124, 292-301(2015) 비특허문헌 6: Biol. Pharm. Bull., 17, 1012-1017(1994) 비특허문헌 7: Appl. Environ. Microbiol., 83, e02702-16(2107) 비특허문헌 8: J. Microbiol. Biotechnol., 21, 1174-1178(2011) 비특허문헌 9: Carbohdr. Res., 285, 129-139(1996)

이러한 배경 기술 하에 있어서는, 유산균이 생성하는 새로운 균체외 다당의 개발이 요망되고 있다. 따라서, 본 발명은, 음식품 조성물, 의약 조성물, 사료 조성물, 화장품 조성물 등의 유효 성분으로서 유효한, 유산균이 생성하는 새로운 균체외 다당 및 그 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 유산균이 생성하는 새로운 균체외 다당을 개발하는 것을 목적으로 하여 예의 검토한 결과, 무화과로부터 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 새로운 유산균이 분리·동정되고, 이 유산균이, 히알루로니다제 저해 활성을 갖는 균체외 다당을 생성하고, 특히, 종래의 유산균에서는 전혀 볼 수 없었던 N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 새로운 중성 다당을 생성하는 것을 알아내고, 이러한 지견에 기초하여 더욱 연구를 거듭하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 국면에서는, 본 발명은, 무화과 유래의 유산균으로서 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균의 균체외 다당에 관한 것이다.

본 발명의 균체외 다당은, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당이 바람직하고, 이 중성 다당은 히알루로니다제 저해 활성을 갖는다.

또한, 본 발명의 균체외 다당은, 주로 글루코스와 만노스로 구성되는 산성 다당이 바람직하고, 이 산성 다당은 히알루로니다제 저해 활성을 갖는다.

본 발명의 균체외 다당을 생성하는 유산균은, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주(수탁 번호 NITE BP-02242) 또는 그것과 동등한 유산균주가 바람직하다.

본 발명의 균체외 다당을 생성하는 유산균은, 무화과 유래의 유산균으로서 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균의 배양물로부터 얻어지는 다당체를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 정제하여 얻을 수 있다. 보다 구체적으로는, (1) 무화과 유래의 유산균으로서 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균의 배양물로부터 원심 분리에 의해 균체를 제거하는 공정; (2) 공정(1)에서 얻어진 배양물로부터, 에탄올 또는 아세톤에 의한 침전에 의해 다당체 및 단백질을 침전으로서 회수하는 공정; (3) 회수한 침전으로부터 단백질을 제거하여 균체외 다당체를 회수하는 공정; 및 (4) 회수된 균체외 다당체를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 정제하는 공정에 의해 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 국면에서는, 본 발명은, 이들 균체외 다당을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

조성물은 음식품 조성물이 바람직하고, 음식품으로는, 기능성 식품, 발효 식품, 음료 또는 서플리먼트가 바람직하다. 또한, 이 조성물은 의약 조성물이 바람직하다. 또한, 이 조성물은 사료 조성물 및 화장품 조성물이 바람직하다.

이들 조성물은, 바람직하게는, 히알루로니다제 저해 또는 항알레르기를 위하여 사용된다.

본 발명의 유산균이 생성하는 균체외 다당은, 히알루론산을 가수분해하는 효소인 히알루로니다제를 저해하는 활성을 나타내기 때문에, 항알레르기 효과 등을 나타내는 음식품, 의약품, 사료, 화장품으로서 유효하다.

도 1은 본 발명에 의해 분리 동정된 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 현미경 사진이다. 도 1의 (A)가 그람 염색 현미경 사진, (B)가 주사형 전자 현미경(SEM) 사진이다.
도 2는 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 균체외 다당체의 음이온 교환 크로마토그래피(TOYOPEARL DEAE-650M 수지(토소 주식회사))에 의한 분리 프로파일이다. 0 mM~500 mM의 구배 농도의 NaCl(파선)로 균체외 다당체를 용출시키고, 각 획분 중의 균체외 다당을 페놀황산법에 의해 490 nm에서 모니터하였다(직선).
도 3은 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 균체외 다당체를 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 얻어진 균체외 중성 다당을, 프로톤-NMR 및 카본-NMR 처리하여 얻어진 각각의 NMR 프로파일을 나타낸다. 도 3의 (A)가 프로톤-NMR의 NMR 프로파일이고, (B)가 카본-NMR의 NMR 프로파일이다.
도 4는 NMR 프로파일로부터의 균체외 중성 다당의 구조 해석 결과를 나타낸다. 이 구조 해석 결과로부터, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 균체외 중성 다당은, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 것이 분명해졌다.
도 5는 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 게놈 DNA의 pcel 클러스터 및 pce2 클러스터라고 명명한 균체외 다당 생합성 유전자 클러스터의 조직도이다.
도 6은 (A)가 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주, ATCC 334주 및 JCM 8130T주의 3개의 유산균 사이의 게놈 재편성 맵을 나타내고, (B)가 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 pce1 유전자 클러스터와 JCM 8130T주에서의 유전자 클러스터의 대응이다.

이하, 본 발명의 균체외 다당 및 그 용도에 대하여 상세하게 설명한다.

1. 본 발명의 유산균

본 발명의 균체외 다당을 생성하는 유산균은, 무화과 유래의 유산균으로서 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균이다. 이 유산균은 무화과의 잎·줄기·과실 등으로부터 분리할 수 있다. 본 발명의 균체외 다당을 생성하는 유산균은, 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균으로서, 특별히 특정한 균주에 한정되지 않는다.

구체적으로는, 본 발명에 의해, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 균체외 다당으로서 생성하는 유산균으로서, 무화과의 잎으로부터, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주가 단리 동정되었다. 이 균주는, 2016년 4월 19일에 독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 센터(우편번호 292-0818 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8 122호실)에 수탁 번호 NITE P-02242로서 국내 기탁되고, 그 후에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어, 2017년 5월 26일에 NITE BP-02242로서 국제 기탁의 수탁 번호가 부여되어 있다.

무화과의 잎으로부터 단리 동정된 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주는, 도 1의 사진에 나타내는 바와 같이, 카탈라아제 음성의 그람 양성 간균이고, 또한, 백색 콜로니 형성성을 갖고, 조건적 헤테로 락트산 발효의 특성을 갖는다는 균학적 성질을 갖는다. 나아가서는, 다당체, 특히, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 생성하는 능력을 갖고 있다.

이 중성 다당은, 후술하는 실시예 4에 기재하는 바와 같이, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 배양물로부터 얻어지는 다당체를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 정제함으로써 얻을 수 있다. 이 중성 다당은, 도 3에 나타내는 프로톤-NMR 및 카본-NMR의 NMR 프로파일로부터, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 것이 분명해졌다. 또한, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주는, 주로 글루코스와 만노스로 구성되는 산성 다당을 균체외로 분비한다. 보다 구체적으로는, 산성 다당은, 글루코스, 만노스, 갈락토오스 및 람노스로 구성되고, 그들의 조성비는, 대략 10:170:2:1이다.

이들 중성 다당 및 산성 다당은, 후술하는 실시예 4에 기재하는 바와 같이, 히알루론산을 가수분해하는 효소인 히알루로니다제를 저해하는 활성을 나타낸다.

또한, 후술하는 실시예 3의 표 1에 나타내는 바와 같이, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주는 당류에 대한 자화 능력을 갖는다. 특히, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주는, 다른 Lactobacillus paracasei에 비하여, 분해되면 청산을 발생할 가능성이 있는 아미그달린이나, 멜라닌 생성을 저해하여 미백 효과가 명시되어 있는 알부틴을 자화하지 않는다는 특징을 갖는 당류 자화 능력을 갖고 있다.

Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 전체 게놈 서열의 해석으로부터, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 게놈 DNA는 GC 함량 46.37%의 3,084,917 bp로 이루어지고, 구조 유전자의 수는 2,963개라고 예측되었다. 또한, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주는 2개의 플라스미드를 갖고, 그 중의 하나가 적어도 51 kb이고, 다른 하나가 45,267 bp의 사이즈인 것을 나타냈다. 다른 유산균과 비교하면, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주는, 보다 큰 게놈 사이즈 및 구조 유전자수를 갖는다.

또한, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 게놈 DNA 서열에, 2개의 균체외 다당 생합성 유전자 클러스터가 발견되어, 그 중의 하나의 23 kb의 클러스터를 pcel 클러스터라고 명명하고, 다른 하나의 28 kb의 클러스터를 pce2 클러스터라고 명명하였다. 그리고, pce2 클러스터에 있어서, pce2J라고 명명한 글리코실트랜스페라제 유전자의 하나로부터 추정된 단백질은, 이미 알려져 있는 β-1,6-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제에 보이는 pfam02485 모티프 또는 도메인(Genes Dev. 1993 Mar; 7(3): 468-478 및 J. Biol. Chem. 1999 Jan 29; 274(5): 3215-3221)과 동일한 모티프 또는 도메인을 갖는 것이 발견된 점에서, pce2 클러스터 중의 이 구조 유전자가 중성 다당의 생합성에 관여하고 있는 것이 시사되었다.

본 발명에서는, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주와 동등한 유산균도 본 발명의 유산균에 포함된다. 여기서, 동등한 유산균이란, Lactobacillus paracasei에 속하는 유산균으로서, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 생성하는 능력을 갖는 유산균을 가리킨다. 또한, 동등한 유산균이란, 락토바실러스·파라카제이에 속하는 균주로서, 그 16S rDNA 유전자의 염기 서열이, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 16S rDNA 유전자의 서열 번호 3의 염기 서열과 98% 이상, 바람직하게는 99% 이상, 보다 바람직하게는 100%의 동일성을 갖고, 또한, 바람직하게는 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주와 동일한 균학적 성질 및/또는 동일한 당류 자화 능력을 갖는 균주를 가리킨다. 또한, 동등한 유산균이란, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주가 생성하는 균체외 다당과 마찬가지로 히알루로니다제 저해 활성을 갖는 균체외 다당을 생성하는 균주를 가리킨다.

이들 동등한 유산균은, 예를 들어, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주에 대하여 돌연변이, 유전자 재조합 등의 통상의 변이 처리 기술을 행함으로써 얻을 수 있고, 또한, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 자연 변이주의 선택 등에 의해 육종된 균주여도 된다.

2. 본 발명의 유산균의 취득 및 증식

본 발명의 유산균은, 후술하는 실시예 4에 기재하는 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주와 동일하게 하여, 무화과로부터 취득할 수 있다.

본 발명의 유산균은, 그들을 배양함으로써 용이하게 증식시킬 수 있다. 배양하는 방법은, 유산균을 증식할 수 있는 배양 방법이면 되며, 특정한 배양 방법에 한정되지 않고, 유산균의 배양에 통상 이용되는 방법을 그대로, 혹은 필요에 따라 적당히 수정하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 통상 25~50℃이면 되며, 35~42℃인 것이 바람직하다. 배양은 호기 조건 및 혐기 조건 하의 어느 쪽에서 행하여도 되며, 특히 혐기 조건 하에서 행하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 탄산 가스나 질소 가스 등의 혐기성 가스를 적당한 농도로 통기하면서 배양할 수 있다. 또한, 액체 정치 배양 등의 미호기적 조건 하에서 배양해도 된다.

유산균을 배양하는 배지로는, 특별히 한정되지 않고, 유산균의 배양에 통상 사용되는 배지를 필요에 따라 적당히 수정하여 사용할 수 있다. 즉, 탄소원으로는, 예를 들어, 갈락토오스, 글루코스, 프룩토오스, 만노스, 소르보스, 만니톨, 살리신, 셀로비오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 전분 가수분해물, 폐당밀 등의 당류를 자화성에 따라 사용할 수 있다. 질소원으로는, 예를 들어, 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 등의 암모늄염류나 질산염류를 사용할 수 있다. 또한, 무기염류로는, 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 인산칼륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 질산칼슘, 염화망간, 황산제1철 등을 사용할 수 있다. 또한, 펩톤, 술지게미, 유청(훼이), 대두분, 탈지 대두박, 고기 엑기스, 효모 엑기스 등의 유기 성분을 사용해도 된다. 또한, 조제가 완료된 배지로는, 예를 들어 MRS 배지 또는 그 수정 배지를 호적하게 사용할 수 있다.

3. 균체외 다당의 분리 정제

본 발명의 균체외 다당은, 상술한 무화과 유래의 유산균으로서 Lactobacillus paracasei에 속하는 유산균을, 상술한 방법에 의해 배양하고, 예를 들어, 그 배양물로부터 얻어지는 다당체를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 정제함으로써 얻을 수 있다.

보다 구체적으로는, 예를 들어, (1) 원심 분리에 의해 배양액물로부터 균체를 제거하는 공정; (2) 공정(1)에서 얻어진 배양물로부터, 에탄올 또는 아세톤에 의한 침전에 의해 다당체 및 단백질을 침전으로서 회수하는 공정; (3) 회수한 침전으로부터 단백질을 제거하여 균체외 다당체를 회수하는 공정; 및 (4) 회수된 균체외 다당체를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 정제하는 공정에 의해, 본 발명의 균체외 다당을 얻을 수 있다.

여기서, 상기의, 회수한 침전으로부터 단백질을 제거하여 균체외 다당체를 회수하는 공정(3)으로는, 예를 들어, 1) 트리클로로아세트산 수용액으로 단백질을 침전시키고, 원심 분리하여 제거하는 방법; 2) 가열 처리하여 단백질을 열변성하고, 원심 분리에 의해 제거하는 방법; 3) 방법 2) 후에 추가로 프로테이나제에 의한 단백질 분해 및/또는 DNase에 의한 핵산의 분해 처리를 행하는 방법 등을 들 수 있다. 또한, 균체외 다당체를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 정제할 때에, 예를 들어, NaCl의 농도 구배 용출액으로 균체외 다당을 용출함으로써, 중성 다당과 산성 다당을 분리 정제할 수 있다.

또한, 이들 공정(1)~(4)는 적당히 필요에 따라, 각각을 복수회 실시해도 되고, 혹은 일부를 생략할 수도 있다. 또한, 추가로, 필요에 따라, 투석이나 겔 여과, 한외 여과 등을 조합할 수도 있다. 이와 같이 하여 얻어진 균체외 다당은, 필요에 따라 동결 건조 등의 추가 조작을 더할 수도 있다.

4. 본 발명의 균체외 다당의 용도

본 발명의 균체외 다당은, 히알루론산을 가수분해하는 효소인 히알루로니다제를 저해하는 활성을 나타낸다. 본 발명의 균체외 다당은, 음식품 조성물, 의약 조성물, 사료 조성물, 화장품 조성물 등의 각종 조성물의 유효 성분으로서 널리 사용할 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다제 저해용, 항알레르기용 등의 음식품 조성물, 의약 조성물, 사료 조성물, 화장품 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 균체외 다당을 이러한 용도로 사용할 때에는, 균체외 다당을 생성하는 유산균을 배양하여 얻어진 배양물을, 균체외 다당으로서 사용할 수도 있다. 이러한 경우에는, 얻어진 배양물을 희석 또는 농축하여 사용해도 되고, 배양물로부터 회수한 균체를 사용해도 된다. 본 발명의 효과를 손상하지 않는 한, 배양 후에 가열, 및 동결 건조 등의 여러 추가 조작을 행할 수도 있다. 추가의 조작은, 유산균의 생존율이 높은 것인 것이 바람직하다. 또한, 유산균은, 생균이어도 되고 사균이어도 되며, 생균 및 사균의 양방이어도 된다. 사균은, 파쇄물이어도 된다.

본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 균체외 다당을 함유하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 의약 조성물은, 통상, 본 발명의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등을 생리적으로 허용되는 액체 또는 고체의 제제 담체에 배합해 제제화하여 사용된다.

본 발명의 의약 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는, 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캡슐제, 시럽제, 좌제, 주사제, 연고제, 첩부제, 점안제, 및 점비제 등을 예시할 수 있다. 제제화에 있어서는, 제제 담체로서 통상 사용되는 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 안정제, 교미교취제, 희석제, 계면 활성제, 또는 주사제용 용제 등의 첨가제를 사용할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 제제에 있어서의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등의 함유량은, 제형, 용법, 대상의 연령, 성별, 질환의 종류, 질환의 정도, 및 그 밖의 조건 등에 따라 적당히 설정되는데, 예를 들어, 균체외 다당의 중량 환산으로 통상 0.001 중량% 이상, 0.01 중량% 이상으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 효과를 손상하지 않는 한, 본 발명의 균체외 다당과, 다른 유효 성분으로서, 예를 들어, 면역 부활제 등을 용도에 따라 적당히 병용해도 된다.

본 발명의 의약 조성물의 투여 시기는 특별히 한정되지 않고, 적용 대상에 따라, 적당히 투여 시기를 선택할 수 있다. 또한, 예방적으로 투여해도 되고, 건강 유지에 사용해도 된다. 투여 형태는 제제 형태, 투여 대상의 연령, 성별, 그 밖의 조건, 투여 대상의 증상의 정도 등에 따라 적당히 결정되는 것이 바람직하다. 본 발명의 의약 조성물은, 어느 경우도 1일 1회 또는 복수회로 나누어 투여할 수 있고, 또한, 수 일 또는 수 주일에 1회의 투여로 해도 된다.

본 발명의 의약 조성물은, 예를 들어, 투여 대상의 알레르기를 저감화시키기 위하여 사용할 수 있다.

본 발명의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등을 포함하는 음식품 조성물의 음식품은, 본 발명의 균체외 다당을 함유하는 한 특별히 제한되지 않고, 음식품으로는, 청량 음료, 탄산 음료, 영양 음료, 과즙 음료, 유산균 음료 등의 음료, 이들 음료의 농축 원액, 조제용 분말 등; 아이스크림, 셔벗, 빙수 등의 빙과; 엿, 추잉껌, 구미, 시리얼, 캔디, 껌, 초콜릿, 정과, 스낵 과자, 비스킷, 젤리, 잼, 크림, 및 구운 과자 등의 과자류; 가공유, 유음료, 발효유, 드링크 요구르트, 버터 등의 유제품; 빵; 경장 영양식, 유동식, 육아용 밀크, 스포츠 음료; 퓌레 등의 식품; 기타 기능성 식품 등이 예시된다. 또한, 음식품은, 서플리먼트여도 되고, 예를 들어, 과립상, 분말상, 태블릿상의 서플리먼트여도 된다. 서플리먼트인 경우에는, 1일당의 식사량 및 섭취 칼로리에 대하여 다른 식품에 영향받지 않고, 유산균을 섭취할 수 있다.

상기와 같은 음식품은, 음식품의 원료에 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등을 첨가함으로써 제조할 수 있고, 혹은 통상의 음식품과 동일하게 하여 제조할 수 있다. 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등의 첨가는, 음식품의 제조 공정의 어느 단계에서 행하여도 된다. 첨가한 후에 발효 공정을 거쳐, 음식품이 제조되어도 된다. 그러한 음식품으로는, 유산균 음료, 발효유 등의 발효 식품 등을 들 수 있다. 식품 또는 음료의 원료로는, 통상의 음료나 식품에 사용되고 있는 원료를 사용할 수 있다. 제조된 음식품은, 경구적으로 섭취하는 것이 가능하다.

본 발명의 음식품에는, 음식품 제조를 위한 원료, 및 식품 첨가물 등, 음식품의 제조 공정 또는 제조 후에 음식품에 첨가되는 것도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등은, 발효유 제조용 스타터로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등을, 제조된 발효유에 나중에 첨가할 수도 있다.

음식품 조성물에 있어서의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등의 함유량은, 음식품의 양태에 따라 적당히 설정되는데, 통상, 음식품 중에, 균체외 다당의 중량 환산으로 통상 0.001 중량% 이상, 나아가서는 0.01 중량% 이상으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 균체외 다당을 포함하는 음식품 조성물은, 항알레르기 효과나 항알코올상해 효과를 이용하는 여러 용도로 사용할 수 있다.

본 발명의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등을 포함하는 음식품은, 그 용도가 표시된 음식품으로서 제조·판매할 수 있다. 그러한 음식품에는, 「알레르기 개선용」 등의 표시를 할 수 있다. 이것 이외에도, 그러한 개선 효과에 의해 이차적으로 발생하는 효과를 나타내는 표시이면, 사용할 수 있는 것은 말할 필요도 없다. 여기서, 「표시」란, 수요자에 대하여 상기 용도를 알리기 위한 모든 행위를 의미하며, 상기 용도를 상기·유추시킬 수 있는 것과 같은 표시이면, 표시의 목적, 표시의 내용, 표시하는 대상물 및 매체 등의 여하에 상관없이, 전부 「표시」에 해당한다. 그러나, 수요자가 상기 용도를 직접적으로 인식할 수 있는 것과 같은 표현에 의해 표시하는 것이 바람직하다.

구체적으로는, 본 발명의 음식품에 관련된 상품 또는 상품의 포장에 상기 용도를 표시하는 것을 예시할 수 있고, 특히 포장, 용기, 카탈로그, 팸플릿, POP 등의 판매 현장에 있어서의 선전재, 그 밖의 서류 등에 대한 표시가 바람직하다. 또한, 표시로는, 예를 들어, 건강 식품, 기능성 식품, 경장 영양 식품, 특별 용도 식품, 영양 기능 식품, 의약용 부외품, 특정 보건용 식품 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등을 포함하는 사료 조성물의 사료로는, 펫 푸드, 가축 사료, 양어 사료 등을 들 수 있다. 이러한 사료는, 일반적인 사료, 예를 들어, 곡류, 지게미류, 겨붙이류, 어분, 골분, 유지류, 탈지 분유, 유청(훼이), 간수, 광물질 사료, 효모류 등에 본 발명의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물을 혼합함으로써 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어, 사일리지의 경우와 같이, 발효 공정을 거쳐, 사료가 제조되어도 된다. 제조된 사료는, 일반적인 포유 동물, 가축류, 양어류, 애완 동물 등에 경구적으로 투여할 수 있다. 또한, 양어류의 경우에는, 본 발명의 유산균을 첨가한 발효물을 양어장에 뿌리는 방법을 채용할 수도 있다.

사료 조성물에 있어서의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등의 함유량은, 사료의 양태나 투여 대상에 따라 적당히 설정되는데, 균체외 다당의 중량 환산으로 통상 0.001 중량% 이상, 0.01 중량% 이상으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등을 포함하는 사료 조성물은, 예를 들어, 항알레르기 효과를 이용하는 여러 용도로 사용할 수 있다.

본 발명의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등을 포함하는 화장품 조성물의 화장품으로는, 예를 들어, 비누, 바디 샴푸, 클렌징 크림, 세안료 등의 세정료; 화장수(로션), 세안 폼, 배니싱 크림, 콜드 크림, 에몰리언트 크림, 마사지 크림 등의 크림; 유액, 미용액 등을 들 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 사용하는 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등의 함유량은, 화장품의 양태나 적용 부위에 따라 적당히 설정되는데, 예를 들어, 균체외 다당의 중량 환산으로 통상 0.001 중량% 이상, 나아가서는 0.01 중량% 이상으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 균체외 다당, 그것을 생성하는 유산균의 배양물 등을 포함하는 화장품 조성물은, 예를 들어, 항알레르기 효과를 이용하는 여러 용도로 사용할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

유산균의 분리 및 동정

1. 유산균 샘플의 분리

무화과(품종 「토요미츠히메」)의 잎, 줄기, 및 과실을 선택하고, 살균 완료 핀셋과 가위를 사용하여 2~3 mm로 세단편화한 후, 멸균이 완료된 MRS 액체 배지가 들어간 시험관에 5~6개씩의 세편을 넣고, 28℃ 및 37℃에서, 유산균의 표준 배지인 MRS 배지가 흐려질(증식할) 때까지 정치 배양하였다. 덧붙여, 유산균 후보주의 증식을 목시할 수 있을 때까지 2~4일간을 필요로 하였다.

상기 유산균 후보주의 각 배양액의 일부를 MRS 한천 배지 상에 디스포저블 루프로 선화도균(線畵塗菌) 후, 정치 배양을 행하였다. 한천 배지 상에 형성된 콜로니 중, 「색, 윤기, 형상이 다른 것」을 전부 픽업하고, 프레시한 MRS 한천 배지 상에 선화도균을 행하여, 콜로니를 순화하였다.

순화된 각 콜로니에 대하여, 카탈라아제 효소의 생성 유무를 검증하기 위하여, H₂O₂ 테스트를 행하였다. 이것은, 10%의 H₂O₂ 용액에 균체를 노출시켰을 때에 일어나는, 카탈라아제가 존재하면 생성되는 산소의 발생 유무를 관찰하는 시험법이다. 덧붙여, 유산균은 카탈라아제를 생성하지 않는다.

무화과로부터의 탐색 분리를 시도한 결과, 무화과의 잎을 분리원으로 한 것으로부터, 카탈라아제 음성을 나타내는 유산균 후보주를 1주 얻을 수 있었다.

2. 분리주의 동정

상기 유산균 후보주를 MRS 액체 배지에서 다시 배양하고, 원심에 의해 균체를 취득하였다. 세포벽 용해 효소로 처리한 후, DNAzol 시약을 사용하여, 게놈 DNA를 추출하였다.

Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, pp.115-175. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester: Wiley에 기재된 방법에 따라, 게놈 DNA를 주형으로 하여, 27f 프라이머(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(서열표의 서열 번호 1) 및 1525r 프라이머(5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3')(서열표의 서열 번호 2)를 사용한 PCR 반응에 의해 16S rDNA 부분을 증폭시키고, NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit(마슈레이·나겔사 제조)에 의해, 아가로스 겔로부터 목적 단편을 회수하였다. 염기 서열 결정을 위한 다이 터미네이터법에 의한 시퀀스 반응은, Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit ver.3.1(ThermoFisher Scientific사 제조)로 행하고, ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer(ThermoFisher Scientific사 제조)로 해석하였다. 해석한 16S rDNA의 염기 서열은 서열표의 서열 번호 3의 염기 서열을 갖고 있었다. 이 염기 서열에 대하여 BLAST program에 의한 상동성 검색을 행하고, DNA data bank(DDBJ/EMBL/GenBank)의 데이터베이스와 비교함으로써, 분리주의 분류학적 동정을 행하였다.

무화과의 잎으로부터 분리된 주를, IJH-SONE68주라고 명명하고, DNA data bank(DDBJ/EMBL/GenBank)에 이미 등록되어 있는 「Lactobacillus paracasei R094」의 균주에서 염기 서열의 accession 번호가 「NR_025880」인 염기 서열과 100% 일치하였기 때문에, Lactobacillus paracasei로 동정하였다.

이 균주는, 2016년 4월 19일에 독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 센터(우편번호 292-0818 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8 122호실)에 수탁 번호 NITE P-02242로서 국내 기탁되고, 그 후에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어, 2017년 5월 26일에 NITE BP-02242로서 국제 기탁의 수탁 번호가 부여되어 있다.

3. 게놈 DNA의 서열 분석

IJH-SONE68주로부터의 게놈 DNA에 대하여, P6 폴리메라아제 및 C4 케미스트리(P6C4)를 사용한 단일 분자 리얼 타임(SMRT) 셀로, PacBio RS II(Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, U.S.A.)에 의해 게놈 DNA 서열 결정을 행하였다. 정제된 게놈 DNA 시료를, g-TUBE 키트(Covaris, Woburn, MA, U.S.A.)를 사용하여 단편으로 전단하였다. 이어서, 전단된 단편을 AMPure PB 키트(Pacific Biosciences)를 사용하여 정제하였다. PacBio DNA 템플레이트 조제 키트 1.0(Pacific Biosciences) 및 PacBio DNA/Polymerase Binding Kit P6(Pacific Biosciences)을 사용하여 DNA 라이브러리를 구축하였다. 짧은 단편을 Blue Pippin(Sage Science, Beverly, MA, U.S.A.)에 의해 제거하고, 이어서 정제 DNA 라이브러리를 PacBio SMRT 플랫폼 상에서 서열 결정하였다. 계층적 게놈 어셈블리 프로세스(HGAP) 프로토콜(Nat. Methods, 10, 563-56933)로 드노보 어셈블리를 행하고, 얻어진 전체 게놈 콘티그를 미생물 게놈 어노테이션 파이프라인(MiGAP)에 의해 어노테이션을 행하였다(The 20th International Conference on Genome Informatics(GIW2009) Poster and Software Demonstrations(Yokohama), S001-1-2).

4. 게놈 DNA의 서열 분석 결과

IJH-SONE68주의 전체 게놈 서열을 결정하고, 그 결과, 게놈 DNA는 GC 함량 46.37%의 3,084,917 bp로 이루어지고, 구조 유전자의 수는 MiGAP에 의해 2,963개라고 예측되었다. 또한, 서열의 결과로부터, IJH-SONE68주는 2개의 플라스미드를 포함하고, 그 중의 하나가 적어도 51 kb이고, 또 하나가 45,267 bp의 사이즈인 것을 나타냈다. 다른 유산균과 비교하면, IJH-SONE68주는, 보다 큰 게놈 사이즈 및 구조 유전자수를 갖는다.

실시예 2

분리 동정된 유산균의 균학적 성질

분리 동정된 상기 유산균 IJH-SONE68주는, 도 1의 사진에 나타내는 바와 같이, 카탈라아제 음성의 그람 양성 간균이고, 또한, 백색 콜로니 형성성을 갖고, 조건적 헤테로 락트산 발효의 특성을 갖는 동시에, 다당체를 생성하는 능력을 갖고 있었다.

실시예 3

분리 동정된 유산균의 당 자화 능력

1. 자화 능력의 시험 방법

IJH-SONE68주의 49종류의 당류에 대한 자화 능력에 대하여 이하의 시험 방법에 의해 조사하였다.

IJH-SONE68주를 MRS 액체 배지에서 증식의 정상기까지 정치 배양하였다. 원심하여 얻어진 균체를 적량의 suspension medium(비오메류사 제조)으로 세정한 후, 최종적으로 2 mL의 suspension medium에 현탁하였다. 이 일부를, 5 mL의 suspension medium에 첨가하여 맥팔랜드 탁도가 2가 되는 양(n)을 구하였다. 계속해서, API 50 CHL 배지(비오메류사 제조)에 2 n의 균액을 첨가하고, 이것을 API 50 CHL 키트(비오메류사 제조, 각 웰의 바닥에는 각각 49종류의 당이 발라져 있다)의 각 웰에 분주하였다. 마지막으로 미네랄 오일을 중층하고, 멸균수를 넣은 트레이에 세트하였다. 37℃에서 48시간 배양한 후에, 각 웰에 있어서의 색조의 변화를 관찰함으로써, 자화능 유무의 판정을 행하였다.

2. 자화 능력의 시험 결과

IJH-SONE68주의 49종류의 당류에 대한 자화 능력을 조사한 결과는, 표 1에 나타낸 바와 같다. 표 1에는, 특허 공개 공보에 기재된, 다른 Lactobacillus paracasei에 대하여 동일한 키트를 사용하여 조사한 자화 능력도 더불어 나타냈다.

표 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, IJH-SONE68주는, 다른 Lactobacillus paracasei에 비하여, 분해되면 청산을 발생할 가능성이 있는 아미그달린이나, 멜라닌 생성을 저해하여 미백 효과가 명시되어 있는 알부틴을 자화할 수 없어, 분해되지 않기 때문에, 안전성이 우수하고, 화장품의 첨가제로서 사용한 경우에 미백 효과가 우수하다고 할 수 있다. 또한, 다른 Lactobacillus paracasei는 D-아도니톨을 자화할 수 없고, D-튜라노스를 자화할 수 있는 반면, IJH-SONE68주는 D-아도니톨을 자화할 수 있고, D-튜라노스를 자화할 수 없다는 특징도 갖는다.

실시예 4

1. IJH-SONE68주가 생성하는 다당체의 분리 정제

IJH-SONE68주가 생성하는 균체외 다당을 이하의 방법으로 분리 정제하였다.

IJH-SONE68주를 MRS 액체 배지에서 증식의 정상기까지 정치 배양하였다. 이 배양액 5 mL를 종배양액으로 하고, 5 L의 균체외 다당체 생성용 반합성 배지(그 조성은 후술한다)에 식균한 후, 37℃에서 120시간 정치 배양하였다. 배양액을 4℃로 냉각한 후, 배양액 상청 중에 포함되는 단백질을 변성시켜, 나중 단계에서 침전으로서 제거하기 위하여, 202.5 mL의 100% 트리클로로아세트산 수용액을 첨가하고, 혼화한 후에 30분간 정치하였다. 원심에 의해 침전을 제거하고, 회수한 상청에 등량의 아세톤을 첨가하여 혼화한 후, 4℃에서 하룻밤 정치시킴으로써, IJH-SONE68주가 생성하는 다당체를 침전시켰다. 침전물을 원심에 의해 회수한 후, 250 mL의 70% 에탄올로 침전물의 세정을 행하였다. 침전물을 바람 건조시킨 후, 75 mL의 50 mM Tris-HCl 버퍼(buffer)(pH 8.0)를 첨가하여 1시간 혼화함으로써, 침전물을 용해시켰다. 원심에 의해 불용성의 협잡물을 제거한 후, 회수한 상청에 대하여, 각각 750 μL의 1 mg/mL DNase 용액(Worthington사) 및 1 mg/mL RNase 용액(나카라이테스크사)을 첨가하고, 37℃에서 8시간 반응시켰다. 계속해서 750 μL의 2 mg/mL proteinase K 용액(와코 순약 공업사)을 첨가하고, 37℃에서 16시간 반응시켰다. 반응 후의 용액을 4℃로 냉각한 후, 첨가한 각 효소를 변성시켜, 다음의 원심에서 침전으로서 제거하기 위하여, 8.75 mL의 100% 트리클로로아세트산 수용액을 첨가하여 혼화하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 원심에 의해 침전물을 제거하고, 얻어진 상청에 대하여 262.5 mL의 100% 에탄올을 첨가하여, 확실히 혼화한 후, 원심에 의해 IJH-SONE68주가 생성하는 다당체를 침전물로서 회수하였다. 50 mL의 70% 에탄올로 침전물을 세정한 후에 바람 건조시키고, 적량(약 25 mL)의 정제수를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 정치함으로써, 다당체를 용해시켰다. 용해 후의 다당체 샘플은, 10,000 MWCO의 한외 여과 유닛(메르크사)을 사용하여, 용매를 정제수로 치환하면서, 회수한 샘플 중의 단당류 등의 소분자를 제거하여, 정제된 다당체 샘플을 얻었다.

정제한 다당체 샘플을, 미리 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)로 평형화한 TOYOPEARL DEAE-650M 수지(토소 주식회사)를 충전한 오픈 칼럼(2.5 × 22 cm)에 어플라이하고, 중성 다당 획분과 산성 다당 획분으로 분리 정제하기 위한 칼럼 워크를 행하였다. 용액은 동 버퍼를 사용하고, 유속은 1 mL/min으로 고정하였다. 또한, 용출액은 6 mL마다 다른 시험관에 회수하였다. 먼저, 개시부터 240분까지의 동안에는 동 버퍼로 용출시켰다(시험관 번호 1-40). 다음으로, 240분의 시점부터 600분의 시점까지는, 동 버퍼를 사용한 0-500 mM NaCl의 농도 구배를 만들고, 용출을 계속하였다(시험관 번호 41-100). 칼럼 분리 스펙트럼을 도 2에 나타낸다. 시험관에 용출시킨 모든 샘플에 대하여, 페놀황산법(후술한다)에 의해 다당체의 존재를 확인한 후, 해당하는 시험관 내의 용액을 각각 중성 다당 획분, 산성 다당 획분으로서 정리하였다. 각각의 획분은 10,000 MWCO의 한외 여과 유닛을 사용하여, 용매를 정제수로 치환하면서, 회수한 샘플 중의 단당류 등의 소분자를 제거하였다.

이상에 의해, IJH-SONE68주가 생성하는 균체외 다당으로서 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분이 분리 정제되었다.

다당체 생성용 반합성 배지는 Kimmel SA, Roberts RF. Development of a growth medium suitable for exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus RR. Int. J. Food Microbiol., 40, 87-92(1998)에 기재된 배지를 이하와 같이 개변하였다.

다당체 생성용 반합성 배지[g/L]

Glucose 20

Tween 80 1.0

Ammonium citrate 2.0

Sodium acetate 5.0

MgSO₄·7H₂O 0.1

MnSO₄·5H₂O 0.05

K₂HPO₄ 2.0

Bacto casitone 10.0

Vitamine Soln. 2 mL

Trace element Soln. 1 mL

Vitamine Soln. [g/L]

4-aminobenzoic acid 0.05

Biotin 0.001

Folic acid 0.025

Lipoic acid 0.025

Nicotinic acid 0.1

Pantothenic acid 0.05

Pyridoxamin-HCl 0.25

Vitamine B₁₂ 0.05

Pyridoxine 0.025

Riboflavin 0.05

Thiamine 0.1

Trace element Soln.은, Kets EPW, Galinski EA, de Bont JAM. Carnitine: a novel compatible solute in Lactobacillus plantarum. Arch. Microbiol., 192, 243-248(1994)에 기재되어 있고, 그 조성은 이하와 같다.

Trace element Soln. [g/L]

25% HCl 10 mL

FeCl₂·4H₂O 1.5

CoCl₂·6H₂O 0.19

MnCl₂·4H₂O 0.1

ZnCl₂ 0.07

H₃BO₃ 0.006

Na₂MoO₄·2H₂O 0.036

NiCl₂·6H₂O 0.024

CuCl₂·2H₂O 0.002

페놀황산법(DuBois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem., 28, 350-356(1956))

30 μL의 대상 샘플과 등량의 5 w/v % 페놀 수용액을 혼화한 후, 150 μL의 농황산을 첨가하여 혼화시키고, 반응을 개시시킨다. 10분 후에 즉시 빙냉하고, 반응을 정지시킨다. 반응액의 490 nm에 있어서의 흡광도를 측정함으로써, 당류의 농도를 측정하였다. 한편, 농도의 결정에는, 글루코스를 표품으로 하여 동 실험을 행함으로써 제작한 검량선을 사용하였다.

2. 균체외 중성 다당의 구조 해석

상기한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피(TOYOPEARL DEAE-650M 수지(토소 주식회사))에 의해 정제된 균체외 중성 다당을, 프로톤-NMR 및 카본-NMR 처리하여, 얻어진 각각의 NMR 프로파일을 도 3에 나타냈다. 이들 NMR 프로파일로부터의 균체외 중성 다당의 구조 해석 결과를 도 4에 나타냈다.

이 구조 해석 결과로부터, IJH-SONE68주가 생성하는 균체외 중성 다당은, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 것이 밝혀졌다.

3. 균체외 산성 다당의 당 조성 분석

상기한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제된 균체외 산성 다당의 당 조성 분석을 고속 액체 크로마토그래프(HPLC)법으로 측정함으로써 행하였다.

정제된 균체외 산성 다당(7.3 mg/mL) 10 μL와 물 60 μL를 혼합하여 7배 희석 시료 용액을 조제하고, 시험관에 조제하여 희석 시료 용액 20 μL를 채취하여, 감압 건고하고, 2 mol/L 트리플루오로아세트산 100 μL를 첨가하여 용해하고, 질소 치환, 감압 봉관, 100℃에서 6시간 가수분해하고, 이어서 감압 건고하였다. 얻어진 잔류물에 물 200 μL를 첨가하여 용해하고, 0.22 μm의 필터로 여과하여 측정용 시료 용액을 얻고, 측정용 시료 용액을 물로 10배 희석하여 희석 측정용 시료 용액을 얻었다. 이들 측정용 시료 용액 및 희석 측정용 시료 용액 50 μL를 분석하였다. 분석 기기로서, HPLC 시스템: LC-20A 시스템(주식회사 시마즈 제작소) 및 분광 형광 광도계 M-10AxL(주식회사 시마즈 제작소)을 사용하였다. 분석 조건은 이하와 같았다.

칼럼: TSK-gel Sugar AXG 4.6 mmI.D. × 15 cm(토소 주식회사)

칼럼 온도: 70℃

이동상: 0.5 mol/L 붕산칼륨 완충액, pH 8.7

이동상 유속: 0.4 mL/min

포스트 칼럼 표지: 반응 시약: l w/v% 아르기닌·3 w/v% 붕산

반응 시약 유속: 0.5 mL/min

반응 온도: 150℃

검출 파장: Ex.320 nm Em.430 nm

산성 당의 표준 용액 및 시료의 크로마토그램, 산성 당의 검량선 및 검량선 데이터를 구하고, 검량선으로부터 균체외 산성 다당의 구성 당의 시료 중 농도를 구하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타냈다.

4. IJH-SONE68주의 균체외 다당의 생합성 유전자 클러스터의 해석

실시예 1에 기재한 IJH-SONE68주의 게놈 서열의 어노테이션에 기초하여, 2개의 균체외 다당 생합성 유전자 클러스터가 게놈 DNA 상에 발견되었다(도 5). 그 중의 하나의 23 kb의 클러스터를 pcel 클러스터라고 명명하며, 이 pcel 클러스터는, 기능 불명의 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 18개의 오픈 리딩 프레임(ORF(pce1A~R))으로 구성되어 있었다. 다른 하나의 28 kb의 클러스터를 pce2 클러스터라고 명명하며, 이 pce2 클러스터는, 12개의 완전한 ORF와 3개의 단축(truncated) ORF(pce2A~O)를 포함하고 있었다. 또한, 12개의 트랜스포사제(transposase) 관련 유전자가 pce2 클러스터 상에 발견되었다. 균체외 다당의 생합성에 필요한 단백질을 코드하는 유전자에 관해서는, 쇄장 인자로서 작용하는 단백질-티로신포스파타제 Wzb를 코드하는 wzb 유전자(Yother J. Annu. Rev. Microbiol., 65, 563-581(2011))는 pcel 클러스터에는 발견되지 않았다. 한편, pce2 클러스터 상에는, 당 중합의 최초의 공정을 촉매하는 프라이밍 글리코실트랜스페라제(van Kranenburg R, Vos HR, van Swam II, Kleerebezem M, de Vos WM. J Bacteriol. 1999 Oct; 181(20): 6347-6353)와 상동성을 나타내는 유전자는 존재하지 않았다.

IJH-SONE68주, ATCC 334주(Makarova, K. et. al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(42), 15611-15616(2006)) 및 JCM 8130T주(Toh, H. et. al, PLoS ONE 8, e75073(2013))의 3개의 유산균 사이의 게놈 재편성 맵을 작성하였다(도 6). 이 맵으로부터, pce2 클러스터 영역이 IJH-SONE68주에 특이적인 것을 알 수 있다. 한편, pcel 클러스터에 상동성을 나타내는 유전자 클러스터는, ATCC334주의 게놈에서는 보이지 않지만, JCM8130T주에는 존재하였다.

상기한 상동성 검색에 기초하여, pcel 클러스터 및 pce2 클러스터 상에 wzb 유전자 및 프라이밍 글리코실트랜스페라제 유전자와 각각 상동의 유전자가 보였다. IJH-SONE68주의 게놈 DNA에는 다른 클러스터 등은 발견되지 않았으므로, 균체외 다당의 생합성에 필요한 유전자는 pcel 클러스터 및 pce2 클러스터에서 서로 보완되어 있다고 생각되었다. 실제로, pcel 클러스터 및 pce2 클러스터는 불과 34 kb밖에 떨어져 있지 않았다.

pce2 클러스터에 있어서, pce2J라고 명명한 글리코실트랜스페라제 유전자의 하나로부터 추정된 단백질은, 이미 알려져 있는 β-1,6-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제에 보이는 pfam02485 모티프 또는 도메인(Genes Dev. 1993 Mar; 7(3): 468-478 및 J. Biol. Chem. 1999 Jan 29; 274(5): 3215-3221)과 동일한 모티프 또는 도메인을 갖고 있는 것이 발견된 점에서, pce2 클러스터 중의 이 단백질을 코드하는 구조 유전자가 중성 다당의 생합성에 관여하고 있는 것이 시사되었다. 실제로, pce2 클러스터는, ATCC 334주 및 JCM 8130T주와 비교하여 IJH-SONE68주 게놈에 특이적이며, pce2 클러스터로부터 신규한 구조의 중성 다당이 생합성된다고 생각된다.

실시예 5

IJH-SONE68주가 생성하는 다당체의 히알루로니다제 활성 저해

실시예 4에서 얻어진 IJH-SONE68주가 생성하는 균체외 다당인, 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분을 포함하는 다당체 샘플, 그리고 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분의 히알루로니다제 활성 저해를 조사하였다.

1. 시험 방법

실시예 4에서 얻어진 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분을 포함하는 다당체 샘플, 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분으로부터 임의의 농도로 조정한 다당을 포함하는 수용액 10 μL에 대하여, 5 μL의 히알루로니다제 효소 용액(MP Biomedicals사, 4 mg/mL, 100 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 4.0))을 첨가하고, 37℃에서 20분 인큐베이트하였다. 그 후, 10 μL의 효소 활성화 용액(0.5 mg/ml Compound 48/80(MP Biomedicals사), 3.75 mg CaCl₂·2H₂O, 100 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 4.0))을 첨가하고, 다시 37℃에서 20분간 인큐베이트하였다. 계속해서, 25 μL의 히알루론산나트륨 용액(와코 순약 공업사, 0.8 mg/mL, 100 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 4.0))을 첨가하고, 추가로 37℃에서 40분간 반응시켰다. 반응 후, 10 μL의 0.4 M NaOH 수용액을 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 계속해서 10 μL의 100 mM 붕산칼륨 버퍼(pH 10.0)를 첨가한 후에 100℃에서 3분간 가열하고, 즉시 빙냉하였다. 반응액 40 μL를 200 μL의 p-DMAB 용액(후술한다)과 혼화하고, 37℃에서 20분 반응시킨 후, 585 nm에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 컨트롤로서, 히알루로니다제 효소 용액을 포함하지 않는 반응액에 대해서도 동일하게 조제하고, 실험을 행하였다.

다당체 샘플에 있어서의 효소 활성 저해율에 대해서는, 이하의 식으로부터 구하였다.

저해율(%) = 100 - (S/C) × 100

이 식에 있어서, C는 샘플을 포함하지 않는 경우의 효소 활성, S는 샘플을 포함하는 경우의 효소 활성을 나타낸다. 또한, 다당체 샘플의 IC₅₀값에 대해서는, 함유 농도를 변화시킨 데이터를 복수 취득한 후, X축에 다당체 샘플 농도, Y축에 저해율을 취한 그래프로 플롯하고, 다음의 근사식으로부터 구하였다.

[수학식 1]

Y = α/(1 + βe^-γX)

식 중, α, β 및 γ는 정수를 나타낸다.

p-DMAB 용액(Fujitani N, Sakai S, Yamaguchi Y, Takenaka H. Inhibitory effects of microalgae on the activation of hyaluronidase. J. Appl. Phycol., 13, 489-492(2001))

10 × 스톡 용액(5 g의 p-dimethylaminobenzaldehyde, 6 ml의 10 M HCl, 44 ml의 아세트산)을 사용 직전에 아세트산으로 희석하여 p-DMAB 용액을 조제하였다.

2. 시험 결과

얻어진 히알루로니다제 활성 저해의 시험 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3의 결과로부터 분명한 바와 같이, IJH-SONE68주가 생성하는 균체외 다당인, 다당체 샘플(중성 다당 획분 및 산성 다당 획분을 포함한다), 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분은 높은 히알루로니다제 활성 저해를 나타냈다. 특히, 다당체 샘플 및 중성 다당 획분은 항염증 작용을 갖는 글리시리진산디칼륨과 동일 정도의 히알루로니다제 활성 저해를 나타냈다.

이상의 상세한 설명으로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 이하의 발명이 제공된다.

[1] 무화과 유래의 유산균으로서 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균의 균체외 다당.

[2] 균체외 다당은, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당인 상기 [1]에 기재된 균체외 다당.

[3] 균체외 다당이 주로 글루코스와 만노스로 구성되는 산성 다당인 상기 [1]에 기재된 균체외 다당.

[4] 히알루로니다제 활성 저해를 갖는 상기 [1]~[3] 중 어느 하나에 기재된 균체외 다당.

[5] 유산균이 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주(수탁 번호 NITE BP-02242) 또는 그것과 동등한 유산균인 상기 [1]~[4] 중 어느 하나에 기재된 균체외 다당.

[6] 무화과 유래의 유산균으로서 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균의 배양물로부터 얻어지는 다당체를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리 정제하여 얻을 수 있는 상기 [1]~[5] 중 어느 하나에 기재된 균체외 다당.

[7] (1) 무화과 유래의 유산균으로서 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균의 배양물로부터 원심 분리에 의해 균체를 제거하는 공정;

(2) 공정(1)에서 얻어진 배양물로부터, 에탄올 또는 아세톤에 의한 침전에 의해 균체외 다당체 및 단백질을 침전으로서 회수하는 공정;

(3) 회수한 침전으로부터 단백질을 제거하여 균체외 다당체를 회수하는 공정; 및

(4) 회수된 균체외 다당체를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 정제하는 공정

에 의해 얻을 수 있는 상기 [1]~[6] 중 어느 하나에 기재된 균체외 다당.

[8] 상기 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 균체외 다당을 함유하는 조성물.

[9] 조성물이 음식품 조성물인 상기 [8]에 기재된 조성물.

[10] 음식품이, 기능성 식품, 발효 식품, 음료 또는 서플리먼트인 상기 [9]에 기재된 조성물.

[11] 조성물이 의약 조성물인 상기 [8]에 기재된 조성물.

[12] 조성물이 사료 조성물인 상기 [8]에 기재된 조성물.

[13] 조성물이 화장품 조성물인 상기 [8]에 기재된 조성물.

[14] 히알루로니다제 저해를 위한 상기 [8]~[13] 중 어느 하나에 기재된 조성물.

[15] 항알레르기를 위한 상기 [8]~[13] 중 어느 하나에 기재된 조성물.

[16] 상기 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 균체외 다당의 제조 방법으로서, 무화과 유래의 유산균으로서 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균의 배양물로부터 다당체를 얻고, 이어서, 얻어진 다당체를 이온 교환 크로마토그래피 처리하여, 상기 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 균체외 다당을 얻는, 제조 방법.

[17] (1) 무화과 유래의 유산균으로서 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균의 배양물로부터 원심 분리에 의해 균체를 제거하는 공정;

(2) 공정(1)에서 얻어진 배양물로부터, 에탄올 또는 아세톤에 의한 침전에 의해 다당체 및 단백질을 침전으로서 회수하는 공정;

(4) 회수된 균체외 다당체를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 정제하는 공정을 포함하는 상기 [16]에 기재된 제조 방법.

[18] 조성물의 유효 성분으로서의 상기 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 균체외 다당의 사용.

[19] 조성물이 음식품 조성물인 상기 [18]에 기재된 사용.

[20] 음식품이, 기능성 식품, 발효 식품, 음료 또는 서플리먼트인 상기 [19]에 기재된 사용.

[21] 조성물이 의약 조성물인 상기 [18]에 기재된 사용.

[22] 조성물이 사료 조성물인 상기 [18]에 기재된 사용.

[23] 조성물이 화장품 조성물인 상기 [18]에 기재된 사용.

[24] 조성물이 히알루로니다제 저해를 위한 조성물인 상기 [18]~[23] 중 어느 하나에 기재된 사용.

[25] 조성물이 항알레르기를 위한 조성물인 상기 [24]에 기재된 사용.

[26] 상기 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 균체외 다당과 다른 성분을 혼합하는 것을 포함하는 조성물의 제조 방법.

[27] 조성물이 음식품 조성물인 상기 [26]에 기재된 제조 방법.

[28] 음식품이, 음료, 기능성 식품, 발효 식품 또는 서플리먼트인 상기 [27]에 기재된 제조 방법.

[29] 조성물이 의약 조성물인 상기 [26]에 기재된 제조 방법.

[30] 조성물이 사료 조성물인 상기 [26]에 기재된 제조 방법.

[31] 조성물이 화장품 조성물인 상기 [26]에 기재된 제조 방법.

[32] 조성물이 히알루로니다제 저해를 위한 조성물인 상기 [26]~[31] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

[33] 조성물이 항알레르기를 위한 조성물인 상기 [26]~[31] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

[34] 상기 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 균체외 다당을, 그것을 필요로 하는 대상에 적용하는 방법으로서, 상기 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 균체외 다당을 함유하는 조성물을 대상에 적용하는 것을 포함하는 적용 방법.

[35] 조성물이 음식품 조성물인 상기 [34]에 기재된 적용 방법.

[36] 음식품이, 음료, 기능성 식품, 발효 식품 또는 서플리먼트인 상기 [35]에 기재된 적용 방법.

[37] 조성물이 의약 조성물인 상기 [34]에 기재된 적용 방법.

[38] 조성물이 사료 조성물인 상기 [34]에 기재된 적용 방법.

[39] 조성물이 화장품 조성물인 상기 [34]에 기재된 적용 방법.

[40] 대상에 대하여 히알루로니다제 저해 작용을 발휘하는 상기 [34]~[39] 중 어느 하나에 기재된 적용 방법.

[41] 대상에 대하여 항알레르기 작용을 발휘하는 상기 [34]~[39] 중 어느 하나에 기재된 적용 방법.

이상에 상세하게 설명한 바와 같이, 본 발명의 균체외 다당은, 히알루로니다제 활성 저해를 발휘하여 항알레르기 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 균체외 다당은, 음식품, 의약품, 사료, 화장품 등의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Asahi Kohsan Corporation <120> Exopolysaccharide of Lactic Acid Bacteria and Use Thereof <150> JP 2017-114172 <151> 2017.6.9 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 2 aaaggaggtg atccagcc 18 <210> 3 <211> 1549 <212> DNA <213> Lactobacillus sp. <400> 3 atttatatga gagtttgatc ctggctcagg atgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc? 60 aagtcgaacg agttctcgtt gatgatcggt gcttgcaccg agattcaaca tggaacgagt? 120 ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcccttaag tgggggataa catttggaaa? 180 cagatgctaa taccgcatag atccaagaac cgcatggttc ttggctgaaa gatggcgtaa? 240 gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca? 300 aggcgatgat acgtagccga actgagaggt tgatcggcca cattgggact gagacacggc? 360 ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga? 420 gcaacgccgc gtgagtgaag aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaat? 480 ggtcggcaga gtaactgttg tcggcgtgac ggtatccaac cagaaagcca cggctaacta? 540 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa? 600 agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagccc tcggcttaac cgaggaagcg? 660 catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg? 720 aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga? 780 cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt? 840 aaacgatgaa tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca gtgccgcagc taacgcatta? 900 agcattccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc? 960 gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt?1020 gacatctttt gatcacctga gagatcaggt ttccccttcg ggggcaaaat gacaggtggt?1080 gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac?1140 ccttatgact agttgccagc atttagttgg gcactctagt aagactgccg gtgacaaacc?1200 ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg?1260 ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaga ccgcgaggtc aagctaatct cttaaagcca?1320 ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa gtcggaatcg ctagtaatcg?1380 cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca?1440 tgagagtttg taacacccga agccggtggc gtaacccttt tagggagcga gccgtctaag?1500 gtgggacaaa tgattagggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtaggagaa ? 1549

Claims

락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei) IJH-SONE68주(수탁 번호 NITE BP-02242)인 유산균의 N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당.
제1항에 있어서,
히알루로니다제 저해 활성을 갖는 중성 다당.
제1항에 있어서,
락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei) IJH-SONE68주(수탁 번호 NITE BP-02242)인 유산균의 배양물로부터 얻어지는 다당체를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 정제하여 얻을 수 있는 중성 다당.
제1항에 있어서,
(1) 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei) IJH-SONE68주(수탁 번호 NITE BP-02242)인 유산균의 배양물로부터 원심 분리에 의해 균체를 제거하는 공정;
(2) 공정(1)에서 얻어진 배양물로부터, 에탄올 또는 아세톤에 의한 침전에 의해 다당체 및 단백질을 침전으로서 회수하는 공정;
(3) 회수한 침전으로부터 단백질을 제거하여 균체외 다당체를 회수하는 공정; 및
(4) 회수된 균체외 다당체를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 정제하는 공정
에 의해 얻을 수 있는 중성 다당.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 중성 다당을 함유하는 조성물.
제5항에 있어서,
락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei) IJH-SONE68주(수탁 번호 NITE BP-02242)인 유산균의 산성 다당으로서, 글루코스, 만노스, 갈락토오스 및 람노스로 구성되는 산성 다당을 더 함유하는 조성물.
제5항에 있어서,
조성물이 음식품 조성물인 조성물.
제7항에 있어서,
음식품이, 기능성 식품, 발효 식품, 음료 또는 서플리먼트인 조성물.
제5항에 있어서,
조성물이 사료 조성물인 조성물.
제5항에 있어서,
조성물이 화장품 조성물인 조성물.
제5항에 있어서,
히알루로니다제 저해를 위한 조성물.
제5항에 있어서,
항알레르기를 위한 조성물.
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