KR20150118568A - 감마아미노부틸산 고생산성 락토바실러스 브레비스 및 그의 용도 - Google Patents

감마아미노부틸산 고생산성 락토바실러스 브레비스 및 그의 용도 Download PDF

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KR20150118568A KR1020150137823A KR20150137823A KR20150118568A KR 20150118568 A KR20150118568 A KR 20150118568A KR 1020150137823 A KR1020150137823 A KR 1020150137823A KR 20150137823 A KR20150137823 A KR 20150137823A KR 20150118568 A KR20150118568 A KR 20150118568A
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김인철
유문려
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목포대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 김치로부터 분리되고 감마아미노부틸산(GABA) 생산능을 갖는 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주; 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물; 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 발효 스타터(starter), 상기 균주 발효시킨 발효식품 및 상기 균주를 이용한 감마아미노부틸산 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주는 높은 감마아미노부틸산 생산능, 구체적으로 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)가 첨가된 배지에서 97% 이상, 특정 조건에서는 100%의 전환율로 감마아미노부틸산을 생산할 수 있는 높은 감마아미노부틸산 생산능을 가진 균주로, 높은 기질 함량 즉, 글루탐산 나트륨염 또는 모노소디움 글루타메이트의 함량이 10%인 배지에서 72시간 반응시킨 결과, 97% 이상의 높은 전환률로 모노소디움 글루타메이트을 감마아미노부틸산으로 전환시킬 수 있으므로, 산업적 측면에서도 우수한 생산능을 가지고 있으므로, 자연상태에서 낮은 함량으로 식품 등에 포함된 고기능성을 갖는 물질인 감마아미노부틸산의 활용과 관련된 식품, 사료 또는 의학 관련 산업에서 유용하게 활용할 수 있다.

Description

감마아미노부틸산 고생산성 락토바실러스 브레비스 및 그의 용도{Lactobacillus Brevis Having a High ProductionAbility of Gamma-Aminobutyric Acid}
본 발명은 감마아미노부틸산을 높은 생산수율로 생산할 수 있는 유산균 및 이의 용도에 관한 것이다.
감마아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)는 자연계에 널리 분포하는 비단백질성 아미노산의 일종으로, 사람에 있어서는 신경계 및 혈액에서 발견되고, 뇌와 척추에 많이 존재하는 흥분 억제성 신경전달물질로 알려져 있다.
구체적으로, 상기 감마아미노부틸산은 억제성 시냅스 후 전위를 일으킬 수 있으며, 글루타민산이나 글라이신과 함께 포유류의 중추 신경계에서 가장 일반적으로 쓰이는 신경 전달 물질 중 하나인 흥분 억제성 신경전달물질이다. 상기 감마아미노부틸산은 중추신경계 전체 신경전달물질 중 약 30%를 차지하는 것으로 알려져 있다.
상기 감마아미노부틸산은 동물의 경우 포유동물의 소뇌나 골수 또는 갑각류의 신경근 접합부에 많이 존재하고, 식물에서는 발아현미를 비롯한 발아곡류, 차, 황기, 뽕 등에 널리 존재하며, 홍국 중에도 다량 존재하는 것으로 알려져 있다.
1950년대에 상기 감마아미노부틸산이 포유동물의 뇌신경조직에 많이 분포되어 있다는 것이 발견되면서 뇌의 신경기능에 영양을 미칠 것으로 추정되었고, 이후 감마아미노부틸산가 생체내에서 글루탐산으로부터 생합성되어 생성되는 것과 뇌의 혈류를 활발하게 하고 뇌의 산소공급량을 증진시킴으로서 뇌세포의 대사기능을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다.
이후, 상기 감마아미노부틸산이 뇌 혈류개선, 뇌 대사증진 작용, 정신안정, 중풍 및 치매의 예방, 기억력증진, 불면증 개선과 같은 뇌 기능 개선 및 학습능력 향상에 효과가 있는 것으로 연구되었고, 고혈압 예방, 이뇨작용, 간 기능개선 또는 비만개선 등의 효과가 연구되면서, 다양한 기능성을 바탕으로 의약품과 기능성 식품의 소재로 응용되고 있다. 일 예로, 상기 감마아미노부틸산은 뇌졸증 치료제로서 의약품으로 등록되어 있다.
이러한 다양한 기능성으로 인해 의약품이나 기능성 식품의 소재로서 감마아미노부틸산에 대한 관심이 고조되고 있으나 일반적으로 식물체가 함유하고 있는 감마아미노부틸산는 양이 많지 않아 순수한 감마아미노부틸산를 회수하는 것이 매우 어려워 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.
일 예로, 식물 중에 감마아미노부틸산의 함량이 높은 것으로 알려진 발아현미, 구체적으로 발아현미의 배, 녹차 또는 뽕잎의 경우에도, 상기 식물의 섭취를 통하여 섭취될 수 있는 감마아미노부틸산의 함량은 약리작용을 발휘하기에는 턱없이 낮아 자연적인 섭취로 감마아미노부틸산의 생리작용을 기대하기는 어려운 실정이다. 또한, 지난 수년 동안 연구되어온 감마아미노부틸산의 화학적 합성법에 의해 제조된 합성 감마아미노부틸산의 경우 식욕부진, 변비 또는 설사 등의 부작용이 있는 문제점이 있고, 발효 제법을 통한 감마아미노부틸산의 생산법의 경우 수율이 낮은 문제점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위한 연구들이 다수 진행되고 있다. 일 예로, 식물내 감마아미노부틸산 함유량을 높이기 위해서 보리맥아의 제조시 발아된 보리의 혐기적 처리법 또는 현미 발아시 글루탐산(glutamic acid) 첨가를 통하여 식물체내 감마아미노부틸산 함량을 증가시키기 위한 방법이 제안되었으나, 효율과 수율의 측면에서 문제점이 있는 것으로 지적되고 있다.
이러한 문제점으로 인해, 식물을 원재료로 한 감마아미노부틸산 의 생산에는 한계가 있으므로, 미생물을 이용하여 감마아미노부틸산을 대량생산하기 위한 연구가 수행되고 있다.
상기 미생물을 이용한 연구와 관련하여, 안전성의 측면에서 GRAS(Generally regarded as safe) 미생물인 유산균을 이용한 연구가 주로 진행되고 있다.
상기 유산균은 당류를 발효해서 50% 이상 젖산을 생성하는 세균으로, 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물을 의미한다. 음식물뿐만 아니라 포유동물의 구강과 소화관, 토양 등 자연계에 널리 분포하고 있으며, 식품의 보존과 관능적 특성과 관련된 중요한 역할 등을 수행하는 인간생활에 유익한 균주이다. 전 세계적으로 오랜 기간에 걸쳐 유산균 함유 발효 식품으로 널리 식품으로 사용된 유산균은 GRAS 미생물로 안정성을 인정받고 있다.
한편, 김치는 특별한 지식 없이도 가정에서 누구나 전래의 보편적인 방법으로 제조 가능한 식품으로, 보다 구체적으로는 삼국시대부터 발달한 한국의 대표적 전통발효식품으로 소금물에 절인 배추나 무 등의 채소류에 고춧가루, 파, 마늘 등의 양념류를 혼합하여 생활환경 주변에 존재하는 미생들에 의한 발효과정을 거쳐 숙성되는 대표적인 한국의 발효식품 중 하나이다.
최근에는 김치의 유용성에 관한 연구가 다수 발표되었으며, 일 예로 면역활성 증진 및 항암효과 등의 생리활성 기능이 밝혀지면서 영양공급 외에도 건강유지에 꼭 필요한 식품으로 인식되고 있고, 신선한 야채를 열처리하지 않고 담그기 때문에 야채의 모든 영양소가 유지되어 유산균에게 좋은 서식환경을 제공할 수 있으므로 유산균의 함유량이 발효유제품에 비하여 놓은 것으로 보고되어 있다.
상기 유산균에 대한 연구는 주로 유제품에 대해서 진행되어 왔으며, 오랜 역사에 비해 김치발효과정에 관여하는 유산균에 대해서는 최근에서야 체계적이고 과학적인 연구가 진행되고 있다.
상기 유산균을 이용한 감마아미노부틸산 생산 연구와 관련해서 일 예로, 유산균, 구체적으로 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)나 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 스타터(starter)로 하여 만들어진 치즈와 유산균 발효유에서 감마아미노부틸산가 생산된다는 연구가 보고되고 있다. 또한, 최근에는 김치, 젖갈 또는 된장이나 청국장과 같은 콩 발효 식품 등의 우리나라 전통 발효식품로부터 감마아미노부틸산을 생성할 수 있는 균주가 분리된 것으로 알려 있다.
그러나, 아직은 상기 감마아미노부틸산의 효능 연구 또는 상기 감마아미노부틸산가 포함된 식품에 대한 연구에 비하여, 상기 감마아미노부틸산의 생산에 관한 연구는 아직 미비한 실정이다.
따라서, 상기 감마아미노부틸산의 활용 측면에서 감마아미노부틸산을 대량 생산할 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 증대되고 있으며, 이와 관련하여 균주를 이용한 대량생산법에 대한 연구의 필요성이 증대되고 있다. 이러한 측면에서, 우수한 감마아미노부틸산 생성능 즉, 글루탐산으로부터 감마아미노부틸산을 높은 수율로 전환할 수 있는 미생물에 대한 연구의 필요성이 증대되고 있다.
KR 1020040094489 A KR 100755508 B
본 발명의 목적은 감마아미노부틸산의 생산효율이 우수한 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주의 배양물로부터 감마아미노부틸산을 제조하는 방법 및 상기 균주를 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감마아미노부틸산(GABA) 생산능이 우수한 균주, 구체적으로 감마아미노부틸산 생산능이 우수한 유산균을 제공한다.
상기 균주는 김치로부터 분리되고 감마아미노부틸산(GABA) 생산능을 갖는 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주일 수 있다. 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 글루탐산 또는 이의 염, 구체적으로 글루탐산 나트륨염 또는 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)을 감마아미노부틸산(GABA)으로 전환시키는 전환능인 감마아미노부틸산(GABA) 전환률이 97% 내지 100%인 균주일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 발효 스타터(starter)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 상기 발효 스타터 또는 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주로 발효시킨 발효식품을 제공한다. 상기 발효식품은 김치일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주를 이용한 감마아미노부틸산 제조방법을 제공한다.
상기 감마아미노부틸산 제조방법은 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주를 배양배지에서 배양하는 단계; 및 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주가 배양된 배양배지로부터 감마아미노부틸산을 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 배양배지는 글루탐산 또는 이의 염은 글루탐산 나트륨염이 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 배양배지는 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)가 전체 배양배지 부피를 기준으로 0.5%(w/v) 내지 10%(w/v) 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 발명자들은 다양한 기능성을 가진 감마아미노부틸산을 다량으로 생산하기 위한 방법, 구체적으로 미생물을 이용한 방법과 관련하여, GRAS 미생물인 유산균 중에서 높은 감마아미노부틸산 생산능을 갖는 유산균에 대해 연구하던 중, 김치, 구체적으로 전남지역에서 제조된 깍두기로부터 분리된 유산균으로부터 기존 보고된 감마아미노부틸산 생산능을 가진 유산균에 비하여 현저하게 우수한 감마아미노부틸산 생산능을 가진 유산균을 확인하였고, 추가 실험에 의하여 상기 균주가 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)가 배지 부피를 기준으로 1%(w/v) 및 5%(w/v) 포함된 배지에서 상기 모노소디움 글루타메이트 전량을 감마아미노부틸산으로 전환시켜 감마아미노부틸산 전환능이 100%인 것을 확인하였으며, 배지 내에 글루탐산 나트륨염 또는 모노소디움 글루타메이트의 함량이 10%(w/v)인 배지에서 72시간 반응시킨 결과 감마아미노부틸산으로 전환시키는 전환능인 감마아미노부틸산 전환률이 97.4%여서, 매우 높은 수율로 감마아미노부틸산을 생산할 수 있어, 산업적인 의미가 매우 큰 것으로 확인되었고, 상기 균주가 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)에 속하는 균주임을 동정하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 있어서, 배양물이란 특정미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 상기 특정 미생물을 포함하거나 포함하지 아니할 수 있다. 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 않고, 일 예로 액체 또는 고체 일 수 있다. 상기 배양배지란 동물세포나 식물세포 또는 세균 따위의 생장에 필요한 영양소가 들어있는 고체 또는 액체를 의미한다.
본 발명에 있어서, 배양액이란 액체배지에 균주를 접종하여 배양하는 것을 의미한다. 상기 배양액은 균주를 포함하는 것 또는 균주를 접종하여 배양한 후, 제균 즉 균주를 제거(cell-free)한 배양여액 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 발효용 스타터(stater)란 발효에 관여하는 유산균 또는 세균 등을 포함하는 미생물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 상기 발효용 스타터는 발효식품 등의 생산 시 첨가하여 발효식품에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 발효용 스타터를 사용하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여 발효식품의 품질을 일정하게 조절하거나, 발효의 속도 또는 단계를 조절할 수 있으며, 특정한 목적을 달성한 발효 식품을 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 종균이란 발효에 이용되는 미생물로서, 발효를 위하여 기질 또는 식품에 접종되는 미생물을 의미하고, 종균 조성물이란 발효를 개시하는데 필요한 하나 이상의 접종균체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하고, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공규, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으며 본 발명에서 발효식품, 기능성 식품 및 가공식품을 포함하는 것을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 발효식품이란 유산균이나 효소 등 미생물을 한가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젓갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함된다.
본 발명에 있어서 김치란 무, 배추, 오이 등과 같은 채소를 소금에 절이고, 고추, 파, 마늘, 생강 등 여러 가지 양념을 버무려 담근 채소의 염장 발효식품을 모두 포함하는 것을 의미하고, 본 발명에서는 배추를 이용한 것을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.
본 발명은 감마아미노부틸산 생산능이 우수한 유산균에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 김치로부터 분리되고 감마아미노부틸산(GABA) 생산능을 갖는 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주일 수 있다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 글루탐산 또는 이의 염, 구체적으로 글루탐산 나트륨염 또는 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)을 감마아미노부틸산(GABA)으로 전환시키는 전환능인 감마아미노부틸산(GABA) 전환률이 97% 내지 100%인 균주일 수 있다.
또한, 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 산업적 활용이란 측면에서, 배지 내에 글루탐산 나트륨염 또는 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)의 함량이 10%(w/v)인 배지에서 감마아미노부틸산(GABA)으로 전환시키는 전환능인 감마아미노부틸산(GABA) 전환률이 90% 이상, 바람직하게는 97% 이상인 것으로 확인되었다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 경기도 수원시 권선구 서호로 34에 위치한 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2013년 02월 06일자로 기탁하여, 2013년 2월 20일 자로 수탁번호 KACC91784P를 부여 받았다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 하기와 같은 균학적 성질을 갖는 균주이다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 김치, 구체적으로 깍두기로부터 분리된 유산균으로, 그람 양성(Gram-positive)의 막대형인 간균(rod)이고, MRS 배지에서 배양 시 배양배지의 pH로부터 확인한 최적 생육 pH는 pH 4.78 내지 pH 4.84이며, 내산성(acid tolerance) 및 내담즙성(acid tolerance)을 가진다.
또한, 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 당 대사능을 확인한 결과, 만니톨(Mannitol), 에스큘린(esculin), 2-케토글루코네이트(2 keto-gluconate), 5-케토글루코네이트(5 keto-gluconate), L-아라비노스(L-arabinose), 리보스(Ribose), D-자일로스(D-xylose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 과당(fructose) 및 말토스(maltose)를 이용가능한 것 즉, 상기 당에 대한 당대사능을 가진다.
상기 감마아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)은 포유류의 중추신경계에 작용하는 억제 신경전달물질로 작용하는 비단백질성 아미노산으로, 신경계에서 신경흥분을 조절하는 역할을 맡고 있으며, 인간의 경우 감마아미노부틸산에 의해 근육의 상태를 직접적으로 조절할 수 있다.
상기 감마아미노부틸산는 척추동물에서 뇌의 억제 시냅스의 원형질 막 안의 수용기에 결속되고, 이로 인해 세포의 이온통로를 열어 음전하로 하전된 염소이온을 들이며, 양전하로 하전된 칼륨 이온을 배출하기도 한다. 상기 감마아미노부틸산은 성장한 척추동물의 수용기에서 억제작용을 하고, 전체 분비선의 자극에도 영향을 미치며, 포유류의 두뇌의 해마와 피질에 주요한 자극을 주어 글루타민산염 시냅스가 성장할 때까지 두뇌의 많은 부위의 주요 자극물질이 된다. 또한, 성장단계에서 시냅스간 연결구조에 앞서 감마아미노부틸산이 신경에 합성되어 각각의 동일한 세포와 가까운 세포간 신호조정자 역할을 하게 된다. 따라서, 상기 감마아미노부틸산은 신경조세포의 확산, 이동, 분화, 신경돌기의 연장 및 시냅스 형성에 기여하고, 배아줄기세포와 신경줄기세포의 성장을 조절하며, 뇌신경자극 유도인자를 거쳐 신경조세포의 성장에 영향을 줄 수 있다.
상기 감마아미노부틸산을 식품 또는 약품을 통해서 지속적으로 섭취하는 경우 뇌세포 대사촉진, 뇌 혈류 개선, 체내 산소 공금 증가, 간기능 개선, 중성지방의 축적 억제, 변비의 완화, 혈압 강하, 신경의 안정, 신장 및 간장의 기능 활성화, 스트레스 해소, 빈혈 및 대장암의 예방, 불면 해소, 기억력 증가, 우울증 완화, 중풍 및 치매 예방, 알코올대사 촉진, 갱년기 장애 및 초기노화 개선, 정신장애 개선, 불안해소 및 항우울 해소와 같은 질환에 대한 치료, 예방 또는 개선 효과를 누릴 수 있다.
상기 균주가 생산하는 감마아미노부틸산은 상기 균주 자체와 혼합하여 또는 단독으로 식품제조분야, 사료제조분야 등에 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있고, 체내 감마아미노부틸산 농도의 극심한 부족을 겪고 있는 사람들에게는 상기 감마아미노부틸산 의 부족으로 인한 증세의 완화 내지 치료를 위한 약제학적 조성물의 유효성분으로도 제공될 수 있다.
또한, 상기 확인된 결과로부터 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 감마아미노부틸산의 생산능력이 다른 균주보다 우수하여 감마아미노부틸산 생산을 위한 용도로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 내산성 및 내담즙성을 가지고 있어 복용을 통하여 인체 내에서 즉, 장 내에서 감마아미노부틸산을 생산할 수 있으므로, 생균활성제 또는 프로바이오틱 유산균(probiotics)으로 활용될 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 식품 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주 또는 이의 배양물, 구체적으로 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 배양물은 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주를 배양배지에서 배양한 결과물을 모두 포함하는 것으로, 구체적으로 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주에 대하여는 상기의 기재와 같다.
상기 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스 이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 유효성분은 식품류, 음료, 건강음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류의 제조 시 원료 물질에 첨가되거나 조리된 식품에 적절히 혼합하는 방법으로 첨가될 수 있으며, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제와 함께 첨가될 수 있다.
상기 식품 조성물에 포함되는 상기 유효성분의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있고, 예를 들어 전체 조성물을 기준으로 0.01 내지 99 중량부, 바람직하게는 0.1 내지 90 중량부, 더욱 바람직하게는 1 내지 75 중량부일 수 있다. 상기 항균조성물에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 식품은 일 예로 발효식품, 건강식품 또는 음료일 수 있다.
본 발명에서 발효식품이란 유산균이나 효모 등 미생물을 한 가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젖갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함되며, 바람직하게는 김치일 수 있다.
또한, 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주은 발효식품용 종균으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 김치의 종균으로 사용될 수 있다. 이때 종균의 사용량은 발효식품의 종류 및 종균의 종류에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다. 일 예로, 상기 균주는 식품 주재료 100 중량을 기준으로 0.0001 내지 0.01 중량부(습윤 중량부)로 첨가 즉, 접종되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하고 주류, 청량음료, 물, 시럽, 차, 커피, 과실음료 등이 이에 해당되며 유산균 음료를 포함한다. 유산균 음료란 유산균을 배양하여 유산발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 음료를 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 균주가 생산하는 감마아미노부틸산는 상기 균주 자체와 혼합하여 또는 단독으로 식품 조성물로 포함하여 섭취하는 경우 체내 감마아미노부틸산 농도의 극심한 부족을 겪고 있는 사람들에게는 상기 감마아미노부틸산의 부족으로 인한 증세의 예방 또는 개선의 효과를 기대할 수 있다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주는 발효식품인 김치로부터 분리된 것이므로, 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 발효식품의 종균으로 사용될 수 있고, 이러한 측면에서 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주 또는 이의 배양물은 발효 스타터로 사용될 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 발효 스타터(starter)에 관한 것이다.
상기 발효용 스타터를 발효식품의 생산 시 첨가하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 발효용 스타터에 포함된 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 의하여 발효식품의 품질을 일정하게 조절할 수 있고, 상기 스타터의 첨가량 또는 초기 균수에 의하여 발효의 속도를 조절할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 발효용 스타터를 발효식품, 바람직하게는 김치의 제조에 사용하는 경우, 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주에 의해 김치의 발효 과정에서 감마아미노부틸산이 생산되어 축적될 수 있으므로, 상기 발효용 스타터에 의해 제조된 발효식품, 바람직하게는 김치는 기존 발효식품에 비하여 다량의 감마아미노부틸산을 포함한 발효식품일 수 있다.
상기 발효용 스타터에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 높은 수율로 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)을 감마아미노부틸산으로 전환시켜, 음식에 첨가된 모노소디움 글루타메이트를 발효 과정에서 감마아미노부틸산으로 전환시킬 수 있으므로, 모노소디움 글루타메이트의 다량 섭취에 의한 문제점이 발생되지 아니할 수 있다. 이러한 측면에서, 상기 발효용 스타터는 글루탐산 또는 이의 염, 바람직하게는 글루탐산 나트륨염 또는 모노소디움 글루타메이트을 더욱 포함하는 것일 수 있다. 이 외에 상기 발효용 스타터는 균주의 생육에 필요한 배지 성분 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 발효식품 제조용 종균 조성물에 관한 것이다. 상기 발효식품은 김치일 수 있고, 이러한 측면에서 상기 종균 조성물은 김치 제조용 종균 조성물일 수 있다.
상기 종균 조성물을 발효식품의 생산 시 첨가하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 종균 조성물에 포함된 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주에 의해 발효식품의 품질을 일정하게 조절할 수 있고, 상기 종균 조성물의 첨가량 또는 초기 균수에 의하여 발효의 속도를 조절할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 종균 조성물을 발효식품 제조, 구체적으로 김치의 제조에 사용하는 경우, 상기 종균 조성물 내의 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주에 의해 김치의 발효 과정에서 감마아미노부틸산이 생산되어 축적될 수 있으므로, 상기 발효용 스타터에 의해 제조된 발효식품, 바람직하게는 김치는 기존 발효식품에 비하여 다량의 감마아미노부틸산을 포함한 발효식품일 수 있다.
상기 종균 조성물에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 높은 수율로 모노소디움 글루타메이트를 감마아미노부틸산으로 전환시켜, 음식에 첨가된 모노소디움 글루타메이트를 발효 과정에서 감마아미노부틸산으로 전환시킬 수 있으므로, 모노소디움 글루타메이트의 다량 섭취에 의한 문제점이 발생되지 아니할 수 있다. 이러한 측면에서, 상기 종균 조성물은 글루탐산 또는 이의 염, 바람직하게는 글루탐산 나트륨염 또는 모노소디움 글루타메이트를 더욱 포함하는 것일 수 있다. 이 외에 상기 종균 조성물은 균주의 생육에 필요한 배지 성분 등을 포함할 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명은 상기 발효 스타터 또는 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주로 발효시킨 발효식품을 제공한다. 상기 발효식품은 김치일 수 있다.
또한, 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주로 발효된 발효식품은 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주에 의해 감마아미노부틸산이 다량 함유될 수 있으며, 상기 발효식품에 다량 함유된 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주가 생산하는 감마아미노부틸산는 체내 감마아미노부틸산 농도의 극심한 부족을 겪고 있는 사람들의 감마아미노부틸산의 부족으로 인한 증세의 예방 또는 개선의 효과를 제공할 수 있다.
또한, 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 높은 수율로 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)을 감마아미노부틸산으로 전환시켜, 음식에 첨가된 모노소디움 글루타메이트을 발효 과정에서 감마아미노부틸산으로 전환시킬 수 있으므로, 모노소디움 글루타메이트의 다량 섭취에 의한 문제점이 발생되지 아니할 수 있다. 이러한 측면에서, 상기 발효식품의 제조과정에 모노소디움 글루타메이트을 상기 발효 스타터 또는 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주와 함께 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 일 실시예에 따라 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주를 이용한 감마아미노부틸산 제조방법을 제공한다.
상기 감마아미노부틸산 제조방법은 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주를 배양하는 단계; 및 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주의 배양물, 구체적으로 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주가 배양된 배양배지로부터 감마아미노부틸산을 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 배양물은 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주를 배양배지에서 배양한 결과물을 모두 포함하는 것으로, 구체적으로 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.
상기 배양배지란 동물세포, 식물세포 또는 세균 따위를 기르는데 필요한 영양소가 들어있는 고체배지 또는 액체배지를 의미하고, 배양액이란 액체배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미한다. 상기 배양액은 균주를 포함하는 것 또는 균주를 접종하여 배양한 후 제균 즉 균주를 제거(cell-free)한 배양여액 일 수 있다. 상기 배양액의 농축액은 상기 배양액을 농축시켜 농도를 높인 것 일 수 있고, 상기 배양액의 건조물은 상기 배양액에서 수분을 제거하여 건조물로 제조한 것 일 수 있다.
상기 배양배지는 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주를 배양할 수 있는 모든 배양배지를 포함하고, 일 예로 유산균 배양을 위한 배지 또는 MRS 배지일 수 있다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주를 배양하는 단계, 구체적으로 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주를 배양배지에서 배양하는 단계는 유산균, 구체적으로 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 배양할 수 있는 통상적인 방법으로 수행할 수 있으며 일 예로 28℃ 내지 32℃의 온도조건에서 MRS 배지를 이용하여 배양할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 감마아미노부틸산 분리하는 단계 즉, 감마아미노부틸산을 수득하는 단계는 본 발명이 속하는 분야에서 균주 또는 이의 배양물로부터 물질을 수득하는 통상적인 방법을 이용하여 수행할 수 있고, 일 예로 배양물을 여과 또는 동결건조하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 여과는 본 발명이 속하는 분야에서 배양액을 여과하는 통상적인 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)을 감마아미노부틸산으로 전환시킬 수 있으므로, 이러한 측면에서 상기 배양배지는 글루탐산 또는 이의 염은 글루탐산 나트륨염이 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 배양배지는 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)가 전체 배양배지 부피를 기준으로 0.5%(w/v) 내지 10%(w/v) 또는 1%(w/v) 내지 5%(w/v) 포함된 것일 수 있다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 산업적인 측면에서 높은 기질 함량 즉, 글루탐산 나트륨염 또는 모노소디움 글루타메이트의 함량이 10%(w/v)인 배지에서 72시간 반응시킨 결과 감마아미노부틸산으로 전환시키는 전환능인 감마아미노부틸산 전환률이 97.4%여서, 매우 높은 수율로 감마아미노부틸산을 생산할 수 있어, 산업적인 의미가 매우 큰 것으로 예상되었다.
이러한 측면에서 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주를 이용하여 감마아미노부틸산을 제조하는 방법으로 산업적 의미가 매우 클 것으로 예상된다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주는 고효율로 감마아미노부틸산을 생산할 수 있는 균주, 구체적으로 높은 감마아미노부틸산 생산능, 구체적으로 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)가 첨가된 배지에서 97% 이상, 특정 조건에서는 100%의 전환율로 감마아미노부틸산을 생산할 수 있는 높은 감마아미노부틸산 생산능을 가지고, 고농도의 기질 즉, 고농도의 모노소디움 글루타메이트가 포함된 배지에서도 97% 이상의 높은 전환율로 감마아미노부틸산을 생산할 수 있는 균주이므로, 자연상태에서 낮은 함량으로 식품 등에 포함되어 있으나, 고기능성을 갖는 물질인 감마아미노부틸산의 활용에 이바지할 수 있으므로, 식품산업이나 의약산업을 포함한 감마아미노부틸산과 관련된 여러 산업분야에 다양한 용도로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 F109-MD3 균주의 형태를 확인하기 위한 사진으로, 도 1a는 F109-MD3 균주를 그램 염색하고 현미경(x1,000)으로 확인한 결과를 나타낸 사진이고, 도 1b는 F109-MD3 균주를 전자현미경(SEM, x20,000)으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 F109-MD3 균주의 16S rRNA의 염기서열이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 F109-MD3 균주의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 그림이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
< 준비예 : 실험재료의 준비>
MRS 배지는 CRITERIONTM(SantaMaria, USA)에서 구입하여 사용하였고, Sodium L-glutamate(MSG)는 Yakuri Pure Chemicals Co.(일본)에서 구입하여 사용하였으며, γ-Aminobutyric acid standard, phenyl isothiocyanate(PITC, protein sequencing grade) 및 triethylamine(TEA, minimum 99%)는 Sigma Chemical Co.(USA)에서 구입하여 사용하였다. 또한, Acetonitrile 및 methanol는 Merck Chemical Co.(영국)에서 구입하여 사용하였고, Ninhydrin monohydrate(99%)는 Alfa Aesar(USA)에서 구입하여 사용하였다.
< 실시예1 : 유산균주의 분리 및 동정>
1-1. 김치로부터 유산균의 분리
전국 각 지역에서 수집된 약 30 종류의 김치 중, 신선하고 맛이 좋은 깍두기를 선택하여, 상기 깍두기로부터 균주를 분리하였다.
상기 균주는 상기 깍두기의 무게 10g을 측정한 후, 90 ml의 멸균수에 넣고 믹서기를 이용하여 내용물 전체를 파쇄하여 10%(w/v) 농도의 시료액을 제조하였다. 이를 단계별로 희석(serial dilution)한 후, 탄산칼슘(CaCO3)이 0.5%(w/v) 포함된 MRS 배지(Difco Co., 프랑스) 배지에 분주하고, 30℃에서 2일간 배양하였다. 상기 배양 배지에서 투명환을 형성하는 균주를 분리하였다.
상기 분리된 균주 중 GRAS(generally regarded as safe) 미생물인 유산균을 분리하기 위하여, 그람 염색 테스트(Gram stain kit, BD Co., USA)와 과산화수소분해효소 시험(Catalase test kit, Biomrieus Co., 프랑스)을 수행하여, 그람양성이고, 카탈라아제 음성인 집락(colony)을 잠정적으로 유산균으로 분리하고, F109-MD3으로 명명하였다.
상기 잠정적으로 유산균으로 분리된 균주를 5 mL 액체 MRS 배지에 접종한 후, 30℃의 온도 조건에서 18시간 동안 배양하였으며, 배양 중 배양배지의 pH를 pH 미터기(pH-200L, Istek Inc., 대한민국)를 이용하여 측정하였다. 상기 배양된 F109-MD3는 25% glycerol stock을 만들어, 실험 수행 전까지 - 70℃에서 보관하였다.
1-2. 분리된 균주의 동정
상기 실시예 1-1에서 잠정적으로 유산균으로 분리된 F109-MD3 균주에 대해 상기 균주를 동정하기 위하여, 형태학적 동정, 생화학적 동정 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 동정을 수행하였다.
상기 형태학적 동정은 상기 균주의 그람 염색여부 및 현미경을 이용한 관찰을 통한 형태를 확인하는 방법으로 수행하였다.
또한, 내산성 및 내담즙성은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.
우선, 유산균을 5 mL MRS 액체 배지에 한 콜로니를 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 이것의 0.1%를 새로운 액체 배지에 접종하여 본 배양하였다. 상기 내산성을 측정하기 위한 배지는 MRS 액체배지(pH 6.2)를 0.1 N HCl로 pH 2.0이 되도록 조절한 다음 감압살균하여 제조하였다. 상기 본 배양된 유산균 배양액 5 mL을 1,100×g에서 10분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 상기 유산균의 내산성을 1차적으로 선별하기 위해, 상기 회수된 균체에 동일한 부피의 MRS(pH 2.0)배지를 넣어 현탁시켜 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 생존균수는 plate count 방법을 사용하여 측정하였다. 또한, 상기 내담즙성은 상기 내산성과 동일한 방법으로 수행하되, 0.5% oxgall이 들어 있는 MRS 액체배지에 24시간 동안 배양한 후 생존균수를 측정하는 방법으로 수행하였다.
상기 방법에서 1차적 선별이 된 유산균은 장관 머무름 시간을 고려하여 2차 내산성 및 내담즙성을 측정하였다. 본 배양이 완료된 유산균의 균체를 회수한 뒤, 동일한 부피의 pH 2.0으로 조절된 MRS 액체배지에 현탁하여 30℃에서 3시간 동안 배양하였다. 다시 원심분리를 통해 균체를 회수하여 0.5% oxgall이 들어있는 MRS 배지에 현탁시켜 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 생균수는 단계별 희석하여 MRS 고체배지에 분주하고 30℃에서 2일 동안 배양 후, 콜로니를 계수하였다. 상기 2차 내산성 및 내담즙성 측정결과, 일정 수 이상의 콜로니가 계수된 경우, 내담증성 또는 내산성이 있는 것으로 결정하였다.
상기 분석결과를 하기 표 1과 도 1에 나타내었다. 하기 표 1에서 +는 양성 반응을 나타내거나 내성이 있는 경우이고, -는 음성반응을 나타내거나 내성이 없는 경우이다.
특 성 F109-MD3
Source 깍두기
형태(Morphology, Shape) 간균(rod)
그람염색(Gram-stain) 여부 +
Catalase test -
pH 4.81±0.03
Acid tolerance +
Bile tolerance +
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 F109-MD3 균주는 간균으로 그람염색이 되어 그람양성이며, 카탈라제 활성이 없고, 배양배지의 pH가 약 pH 4.81인 산성으로 상기 형태학적 특징은 유산균에 해당하는 것으로 검토되었다.
상기 생화학 동정은 API 키트를 이용하여 상기 균주의 당대사능을 확인하고, 다른 유산균 균주와 비교하는 방법으로 수행하였다. 상기 분석결과를 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2에서 +는 양성 반응, -는 음성반응, V는 variable, D는 반응이 지연된 것을 나타낸다. 하기 표 2의 Lactobacillus brevis NCL912(Annals of Microbiology, 58(4), 649-653(2008)), Lactobacillus brevis YSM-1(Microbiology and Biotechnology, 16(1), 68-76(2006) 및 Lactobacillus brevis KLDS1.0355(Journal of Shandong University (Natural Science), 43(7), 1-7(2008))의 결과는 공지된 결과로부터 수득된 것이다.
Figure pat00001
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 F109-MD3 균주는 만니톨(Mannitol), 에스큘린(esculin) L-아라비노스(L-arabinose), 리보스(Ribose), D-자일로스(D-xylose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 과당(fructose) 및 말토스(maltose) 등을 이용가능한 것으로 확인되었으며, 이러한 당대사능이 공지의 다른 Lactobacillus brevis 균주와 매우 유사한 것으로 검토되었다.
상기 형태학적 검토 및 생화학적 검토에 의해 유산균으로 검토된 상기 F109-MD3 균주에 대하여 최종적인 동정을 위하여 분리균주의 16s rDNA 염기서열을 결정하여 알려진 균주들과 비교하는 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 동정을 수행하였다. 상기 16s rDNA 염기서열을 분석하기 위하여, 상기 F109-MD3의 genomic DNA 추출은 Genome DNA kit(Q-Biogene, USA)을 사용하여 수행하였으며, 상기 추출된 genomic DNA 추출은 16s rDNA 증폭용 프라이머(primer)인 27F 프라이머(Forward primer)와 1492R 프라이머(Reverse primer)를 이용하여 PCR을 수행하여, 서열을 확인하였으며, 확인결과를 도 2에 나타내었다. 상기 확인된 총 1,411bp의 16S rDNA 염기서열을 기초로 상동성 분석을 수행하여, 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 확인하여 도 3에 나타내었다. 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 F109-MD3 균주는 Lactobacillus brevis M58810(ATCC 14869T)와 99% 상동성을 나타내어 최종적으로 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3)라 명명하였다.
상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3)는 대한민국 경기도 수원시 권선구 서호로 34에 위치한 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2013년 02월 06일자로 기탁하여, 2013년 2월 20일 자로 수탁번호 KACC91784P를 부여 받았다.
< 실시예2 : GABA 생성능 확인 >
상기 실시예 1에서 선별 및 동정된 락토바실러스 브레비스 F109-MD3의 감마아미노부틸산(GABA) 생산능을 확인하였다.
우선, 모노소디움 글루타메이트(MSG, monosodium glutamate)의 함량을 달리하면서, 시간의 경과에 따른 상기 모노소디움 글루타메이트을 전환시켜 생산된 감마아미노부틸산을 측정하여 감마아미노부틸산 생산능을 확인하였다.
구체적으로, MRS 배지에 배지 전체 부피를 기준으로 모노소디움 글루타메이트를 각각 1%(w/v), 5%(w/v), 7.5%(w/v) 및 10%(w/v) 첨가한 각각의 배지에 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주를 접종하고, 30℃ 조건에서 72시간 동안 배양하면서, 24시간시간 별로 24시간, 48시간 및 72시간에 배지에 포함된 감마아미노부틸산량을 HPLC법으로 측정하였다.
보다 구체적으로, 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주를 각각의 함량으로 모노소디움 글루타메이트가 포함된 배지에서 배양한 후, 배양배지를 4℃ 및 10,000 x g의 조건으로 5분 동안 원심분리(high speed centrifuge Supra 22K, 한일과학, 대한민국)하였다. 상기 원심분리를 통해 수득한 여액(supernant)은 PITC를 이용해서 유도(derivatized)하여, 0.45 μm 필터(Whatman, 영국)로 여과하였다. 상기 여과액에 포함된 감마아미노부틸산을 측정하기 위하여, HPLC를 수행하였다.
상기 HPLC는 Shimadzu 계측기(Shimadzu Corp, 일본)와 C18(2) column(250×4.6 mm I.D., particle size 5 μm, Phenomenex® Luna, USA)을 이용하여 46℃에서 수행하였고, UV 감지기를 이용하여 254 nm에서 측정하였다. 용매 A는 1.4 mM sodium acetate, 0.1% TEA 및 6% Acetonitrile을 포함하도록 조성하였고, pH는 아세트산을 이용해서 pH 6.1로 적정하였다. 용매 B는 60% Acetonitrile을 포함하도록 조성하였다. 유량은 1.0 mL/min로 하였고, 용매 B의 농도 구배를 0 내지 100%로 선형증가 시키면서 20분간 컬럼에 용출시켰다.
상기 측정결과로부터 GABA 전환율(conversion rate) 즉, 감마아미노부틸산 생산량은 하기 계산식으로 계산하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 하기 계산식의 MS0는 첨가된 모노소디움 글루타메이트(MSG)의 농도(mM)이고, Ms는 배양된 배지에 포함되어 있는 모노소디움 글루타메이트(MSG)의 농도(mM) 이다.
[계산식]
GABA 전환율(%) = (MS0 - Ms) / MS0 × 100
초기 MSG 양(%) 균주 GABA 전환률(%)
24 hours 48 hours 72 hours
1 F109-MD3 99.2 100 -
5 F109-MD3 63.7 98.0 100
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 초기 모노소디움 글루타메이트의 양에 따라서 감마아미노부틸산으로 전환하는 시간에만 차이가 있을 뿐 모노소디움 글루타메이트을 감마아미노부틸산으로 100 %의 전환하는 것으로 확인되었다.
상기 결과를 바탕으로, MRS 배지 전체 중량을 기준으로 모노소디움 글루타메이트를 각각 1%(w/v), 5%(w/v), 7.5%(w/v) 및 10%(w/v) 첨가한 각각의 배지에 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주를 접종하고, 30℃ 조건에서 72시간 동안 배양하면서, 24시간시간 별로 24시간, 48시간 및 72시간에 배지에 포함된 감마아미노부틸산량을 측정하여, 최종적으로 모노소디움 글루타메이트을 감마아미노부틸산으로 100% 전환할 수 있는 시간을 측정하였으며, 이 결과를 기존 종래 공지 균주와 비교하여 하기 표 4에 나타내었다. 하기 표 4의 Lactobacillus brevis BH2(Biotechnology and Bioprocess Engineering, 12, 707-712(2007)), Lactobacillus brevis NCL 9121(Annals of Microbiology, 58(4), 649-653(2008)) 및 Lactobacillus paracasei NFRI 7415(Food Microbiology, 22, 497-504(2005))의 결과는 공지된 결과로부터 수득된 것이다.
균주 초기MSG 양(%) 반응시간(h) GABA 생산량(mM) 전환률(%)
Lb . brevis F109-MD3 1 24 53 99.2
48 53.4 100
5 48 261.9 98.0
72 267 100.0
7.5 72 398 99.3
10 72 520 97.4
Lb . brevis BH2 5 48 194 73
Lb . brevis NCL912 3 48 149.05 93
Lb . paracasei
NFRI 7415		 9.4 150 302 60.4
상기 표 4에 나타난 바와 같이 상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 다른 균주와 달리 현저하게 우수한 모노소디움 글루타메이트 전환능 즉, 감마아미노부틸산 생산능을 가지며, 상기 생산속도도 빠른 것으로 확인되었다. 구체적으로, 동종의 균주와 비교하여 Lactobacillus brevis BH2에 비해서는 동일한 시간인 48시간 반응 시 약 15% 정도 더 높은 전환률이 확인되었고, Lactobacillus brevis NCL 9121과 비교해서도 동일한 시간인 48시간을 반응시킨 결과, 더 높은 생산능을 갖는 것으로 확인되었다. 또한, 감마아미노부틸산 생산과 관련하여 현재 산업적 사용 가능성이 보고되고 있는 유산균인 Lactobacillus paracasei NFRI 7415(Food Microbiology, 22, 497-504(2005))의 경우와 비교해서도, 초기 모노소디움 글루타메이트의 함량이 높은 범위에서도 Lactobacillus paracasei NFRI 7415은 약 60% 정도의 전환율을 나타낸 반면, 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 초기 모노소디움의 함량이 더 높은 10%의 범위에서도 Lactobacillus paracasei NFRI 7415 반응시간의 절반인 72시간 만에 약 97.4%의 높은 전환율이 확인되었다.
상기 결과로부터 경우, 락토바실러스 브레비스 F109-MD3 균주는 모노소디움 글루타메이트 전환능 즉, 감마아미노부틸산 생산량과 관련하여, 높은 기질 함량 즉, 높은 모노소디움 글루타메이트 함량의 배지에서도 짧은 시간 안에 높은 수율로 감마아미노부틸산을 생산할 수 있는 균주임이 확인되었다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
농업생명공학연구원 KACC91784 20130220

Claims (7)

  1. 김치로부터 분리되고 감마아미노부틸산(GABA) 생산능을 갖는 락토바실러스
    브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주는 글루탐산 또는 이의 염을 감마아미노부틸산(GABA)으로 전환시키는 전환능인 감마아미노부틸산(GABA) 전환률이 97% 내지 100%인 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 글루탐산 또는 이의 염은 글루탐산 나트륨염인 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주.
  4. 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
  5. 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 발효 스타터(starter).
  6. 락토바실러스 브레비스 F109-MD3(Lactobacillus brevis F109-MD3, KACC91784P) 균주로 발효시킨 발효식품.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 발효식품은 김치인 발효식품.
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