KR102494766B1 - 발효 노니를 포함하는 아토피 예방 및 개선용 식품 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
발효 노니를 포함하는 아토피 예방 및 개선용 식품 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 발효 노니를 포함하는 아토피 피부염 개선 및 예방용 식품 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 상기 발효 노니는 이리도이드(iridoid) 화합물의 생물전환능을 갖는 신규 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)이 접종된 후 발효되어 고함량의 이리도이드 성분을 포함하게 되어, 항아토피 피부염 효능을 나타낼 수 있다.
Description
본 발명은 발효 노니를 포함하는 아토피 예방 및 개선용 식품 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
노니(Noni)는 그 학명이 모린다 시트리폴리아(Morinda Citrifolia)로서, 2000년 동안 화산성 토질인 폴리네시아, 남태평양 군도, 타히티(Tahiti), 하와이, 말레이시아, 중국 등에서 식생하는 꼭두서니목 꼭두서니과 식물로서, 그 열매, 잎사귀, 뿌리, 줄기 씨 등은 알로베라, 켈프, 파파야, 파크노제롤과 함께 남태평양 지역에서 자연치료제로 널리 사용되어 왔다.
이와 같은 노니에는 제로닌(Xeronine), 프로제로나제(Proxeronase), 세로토닌(Serotonin), 안트라퀴논(Anthraquinones) 등의 성분이 함유되어 있어 섭취시 소화작용을 돕고 통증을 줄여주며 고혈압과 암 등에도 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.
또한, 17종의 각종 아미노산과 미네랄 성분 등 70여 가지의 인체에 유용한 성분이 풍부하게 함유되어 있기 때문에 노니 추출물은 섭취시 인간의 면역체계를 강화시켜 인체의 자연치유력을 향상시키는 기능을 하며, 우수한 산화방지성분이 함유되어 있어 인체내의 유해산소가 자체적으로 제거될 수 있도록 도와주는 역할을 하는 것으로 알려지고 있다.
또한, 노니 추출물은 섭취시 적절한 소화를 지원하여 세포에서 더 많은 영양을 흡수할 수 있도록 하며, 인체의 여러 조직에 유익하기 때문에 머리카락에 건강한 광택을 주고 피부를 탄력있게 유지시켜주는 것으로 알려진다.
이와 같이, 노니에 포함된 성분들의 유익한 효능들을 다양한 분야에 활용하고자 하는 기술들이 개발되고 있다.
특히, 아토피 피부염은 피부를 통해 그 주요 증상이 발현되는 질병으로, 수많은 치료제와 기능성 식품들이 개발되었음에도 아직까지도, 그 증상을 완전히 제거할 수 있는 없을 뿐더러, 부작용 역시 여전히 해결해야 할 문제로 남아 있다.
따라서, 천연물을 이용하여 부작용 없이 아토피 피부염을 예방하고 개선할 수 있는 식품에 대한 관심이 증대하고 있다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 이리도이드(iridoid) 화합물의 생물전환능을 갖는 신규 균주로서 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)을 노니 열매에 접종 및 배양하여 이리도이드 성분 함량이 높은 발효 노니를 제조하였으며, 상기 발효 노니가 항아토피 피부염 활성을 나타낸다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 이리도이드 화합물의 생물전환능을 갖는 신규 균주로서 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)을 제공한다.
본 발명은 상기 신규 균주를 접종 및 배양하여 이리오이드 성분 함량이 증가된 발효 노니을 포함하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 발효 노니를 이리도이드(iridoid) 화합물로 생물전환시키는 신규 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)을 제공한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)로 발효된, 이리도이드 성분을 함유하는 발효 노니 추출물을 포함하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 생물전환된 이리도이드는 디아세틸아스페루로시딕산(deacetylasperulosidic acid) 및 아스페루로시딕산(asperulosidic acid)일 수 있다.
본 발명에서 디아세틸아스페루로시딕산(deacetylasperulosidic acid)의 함량은 12 ㎎/g 내지 15 ㎎/g일 수 있다.
본 발명에서 아스페루로시딕산(asperulosidic acid)의 함량은 2 ㎎/g 내지 5 ㎎/g일 수 있다.
본 발명은 또한, (S1) 노니 열매에 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)을 접종하는 단계; 및 (S2) 상기 발효 및 숙성시켜 얻은 발효 노니를 여과시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)는 상기 노니 열매 전체 중량을 기준으로 1 내지 5 중량% 접종시킬 수 있다.
본 발명에서 발효는 30℃ 내지 100℃에서 10분 내지 80시간 동안 발효시키는 것일 수 있다.
본 발명에 의해 새롭게 분리된 락토바실러스속 미생물 즉, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)는 우수한 배당체 이리도이드 화합물 생물전환능을 갖는다.
따라서, 상기 미생물을 노니 열매에 접종하고 배양할 경우, 이리도이드 함량이 높은 발효 노니 추출물을 얻을 수 있다.
특히, 상기 발효 노니추출물의 이리도이드 중에서도 디아세틸아스페루로시딕산(deacetylasperulosidic acid) 및 아스페루로시딕산(asperulosidic acid)의 함량이 높아, 알러지, 혈당 수치 감소 및 중성지방, 콜레스테롤 수치 감소 효과가 있어 지질 대사를 개선할 수 있으며, 이에 따라, 동맥경화증 유발 등 심혈관계 질환의 개선 또는 예방 효과를 기재할 수 있다.
도 1은 실시예 2의 발효 노니 추출물(F.NONI) 및 비교예 1의 노니 추출물(NONI) 에 대해서 HPLC-UV 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 마지막 실험 날의 각 실험군에서 관찰된 피부 병변을 나타낸 사진이고, 도 2b는 실험예 2의 각 실험군의 (a) 피부염 점수, (b) 귀 두께 및 (c) 긁는 행동에 대한 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 실험예 2의 각 실험군에서 DNCB에 의해 유도된 조직학적 특징을 나타낸 사진이다. 도 3b는 실험예 2의 각 실험군에서 측정된 표피의 두께(thicknesses of epidermis), 비만세포의 수(number of mast cells) 및 침윤 호산구의 수(number of eosinophils)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 IgG, 히스타민(histamine), TARC 및TSLP과 발효 노니의 상관 관계에 대해 측정한 그래프이다.
도 5a는 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31 및 IL-33의 수준을 나타낸 그래프이고, 도 5b는 사이토카인 IL-12 및 IFN-γ의 수준을 나타낸 그래프이며, 도 5c는 사이토카인 IL-6, IL-17 및 IL-22의 수준을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 및 TSLP의 유전자 발현(gene expression)에 대한 그래프이고, 도 6b는 사이토카인 IL-12p40 및 IFN-γ의 유전자 발현에 대한 그래프이며, 도 6c는 사이토카인 IL-6, IL-17A 및 IL-22의 유전자 발현에 대한 그래프이다.
도 7a는 Western Blot Analysis 결과 프로테인 수준을 나타낸 사진이고, 도7b 는 프로테인 수준을 나타낸 그래프이고, 도 7c는 pro-FTG의 유전자 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 마지막 실험 날의 각 실험군에서 관찰된 피부 병변을 나타낸 사진이고, 도 2b는 실험예 2의 각 실험군의 (a) 피부염 점수, (b) 귀 두께 및 (c) 긁는 행동에 대한 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 실험예 2의 각 실험군에서 DNCB에 의해 유도된 조직학적 특징을 나타낸 사진이다. 도 3b는 실험예 2의 각 실험군에서 측정된 표피의 두께(thicknesses of epidermis), 비만세포의 수(number of mast cells) 및 침윤 호산구의 수(number of eosinophils)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 IgG, 히스타민(histamine), TARC 및TSLP과 발효 노니의 상관 관계에 대해 측정한 그래프이다.
도 5a는 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31 및 IL-33의 수준을 나타낸 그래프이고, 도 5b는 사이토카인 IL-12 및 IFN-γ의 수준을 나타낸 그래프이며, 도 5c는 사이토카인 IL-6, IL-17 및 IL-22의 수준을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 및 TSLP의 유전자 발현(gene expression)에 대한 그래프이고, 도 6b는 사이토카인 IL-12p40 및 IFN-γ의 유전자 발현에 대한 그래프이며, 도 6c는 사이토카인 IL-6, IL-17A 및 IL-22의 유전자 발현에 대한 그래프이다.
도 7a는 Western Blot Analysis 결과 프로테인 수준을 나타낸 사진이고, 도7b 는 프로테인 수준을 나타낸 그래프이고, 도 7c는 pro-FTG의 유전자 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
신규 락토바실러스속 균주
본 발명은 이리도이드(iridoid) 화합물의 생물전환능을 갖는 신규 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)에 관한 것이다.
본 발명은 배당체 이리도이드 생물전환능을 갖는 미생물로서, 우수한 디아세틸아스페루로시딕산(deacetylasperulosidic acid) 및 아스페루로시딕산(asperulosidic acid) 생성능을 갖는 신규의 미생물 즉, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)을 제공한다.
본 발명자들은 전국 각지에서 분변 및 김치액을 수집하였으며, 유산균 분리용 배지(MRS-BCP 배지)를 사용하여 단일 집락을 형성하는 균주들을 분리하였다. 얻어진 균주들을 노니 농축액에 가하여 대사 활성을 측정하였으며, 발효 활성을 갖는 수십종의 미생물을 분리하였다. 얻어진 미생물들로부터 배당체 이리도이드 생물전환능, 특히 디아세틸아스페루로시딕산(deacetylasperulosidic acid) 및 아스페루로시딕산(asperulosidic acid) 생성능이 특히 높은 미생물 1종을 선별하였다. 분리된 1종의 미생물의 16S rRNA 유전자 서열을 분석한 결과, 각각 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는다는 것이 밝혀졌고, 이를 BLAST를 사용하여 상동성을 비교하고 균주의 특성을 분석한 결과, 락토바실러스 플랜타럼에 속하는 새로운 균주로 판명되었다. 상기 1종의 균주 즉, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST 1805를 한국미생물보존센터에 2020년 11월 13일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM12833P를 부여받았다.
발효 노니를 포함하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물
본 발명은 또한, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)로 발효된, 고함량의 이리도이드 성분을 함유하는 발효 노니 추출물을 포함하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 발효 노니 추출물은 상기 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%, 바람직하게는 2 내지 8 중량%, 보다 바람직하게는 3 내지 6 중량% 만큼 포함될 수 있다. 상기 범위 미만이면 아토피 피부염 예방 및 개선 효과가 미미하고, 상기 범위 초과이면 발효 노니 함량이 증가한다고 하여 아토피 피부염 예방 및 개선 효과가 지속적으로 증가하는 것은 아니다.
또한, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)에 의해 접종된 노니 열매는 발효 과정에서 생성되는 효소 및 천연 방부제 역할을 하는 물질에 의해 소화 흡수율이 좋아지고 보관성이 좋아져 장기간 저장할 수 있다.
상기 발효 노니는 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)에 의해 발효되는 과정을 통해, 상기 노니 열매에 포함된 생리 활성 성분 중 일부가 생물전환 되어, 염증성 질환을 유도하는 매개물질 분비 억제를 통한 항아토피 피부염 효능을 나타내는 성분을 포함하는 발효 노니를 얻을 수 있다. 이때, 생물전환이란, 생물의 생리적 기능을 이용해 첨가된 물질을 화학적으로 변형된 형태로 전환시키는 것을 의미하는 것으로, 이리도이드 화합물의 일종인 하기 디아세틸아스페루로시딕산 및 아스페루로시딕산은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P) 접종에 의해 흡수율이 향상되고 항아토피 피부염 효과가 보완된 형태의 성분을 의미한다.
다시 말해, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)을 접종할 경우, 생물전환에 의해 발효 노니가 고함량의 디아세틸아스페루로시딕산 (deacetylasperulosidic acid) 및 아스페루로시딕산(asperulosidic acid)를 포함하는 형태로 얻어지고, 또한, 이들 2가지 성분이 염증성 질환을 유도하는 매개물질 분비억제를 통한 항아토피 피부염 효과를 나타내는 함량 범위로 포함될 수 있다.
상기 발효 노니에 포함된 고함량의 이리도이드 화합물은, 디아세틸아스페루로시딕산 (deacetylasperulosidic acid) 12 ㎎/g 내지 15 ㎎/g 및 아스페루로시딕산(asperulosidic acid) 2 ㎎/g 내지 5 ㎎/g 인 것일 수 있다. 상기와 같은 발효 노니에 포함된 디아세틸아스페루로시딕산 및 아스페루로시딕산 함량은 염증 질환을 유도하는 매개물질 분비 억제를 통한 항아토피 피부염 효과가 가장 뚜렷하게 나타날 때의 함량 범위이며, 상기 범위를 벗어날 경우 항아토피 피부염 효과가 미미하게 나타날 수 있다. 구체적으로, 상기 발효 노니는 홍반/부종, 건조함, 부식, 표피박리 및 태선과 같은 아토피 피부염 병변히 개선시키고, 긁는 행동도 현저하게 감소시킬 수 있다.
즉, 상기 발효 노니 안에는 전술한 바와 같은 디아세틸아스페루로시딕산(deacetylasperulosidic acid) 및 아스페루로시딕산(asperulosidic acid)이 상기 언급한 바와 같이 함유될 경우 항아토피 피부염 효과가 가장 우수할 수 있다.
본 발명에 있어서, '식품 조성물'이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
또한, '예방 및 개선용 식품 조성물'이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
본 발명에 따른 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 나아가 본 발명은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 성분은 발효 노니의 아토피 피부염 예방 및 개선 효능을 저해하지 않는 범위 내에서 적정량 첨가될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분은 상기 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 1 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 상기 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할수 있으며, 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물은 다양한 형태로 제형이 가능하므로 그 형태는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게 상기 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물은 음료, 과립, 정제, 파우더, 환, 캡슐 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 형성될 수 있다.
이러한 음료, 과립, 정제, 파우더, 환, 캡슐 제형을 갖는 예방 및 개선용 식품 조성물은 휴대가 간편하고 언제 어디서나 수시로 섭취하기가 용이하다.
발효 노니를 포함하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조방법
본 발명은 또한, 발효 노니를 포함하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조방법에 관한 것으로, (S1) 노니 열매에 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)를 접종하는 단계; 및 (S2) 상기 접종된 노니 열매를 발효 및 숙성시켜 얻은 발효 노니 추출물을 여과시키는 단계; 를 포함할 수 있다.
이하, 각 단계별로 본 발명에 따른 발효 노니를 포함하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조방법을 보다 상세히 설명한다.
(S1) 단계
(S1) 단계에서는, 노니 열매에 유산균을 접종하여 발효 및 숙성시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 노니 열매를 발효시키기 위해 사용되는 유산균은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P) 일 수 있다.
상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)에 의하여, 발효 과정에서 생성되는 효소 및 천연 방부제 역할을 하는 물질에 의해 소화 흡수율이 좋아지고 보관성이 좋아져 장기간 저장할 수 있다.
상기 유산균은 유산균액, 바람직하게는 유산균 수용액의 형태로 노니 열매에 접종될 수 있다. 이때, 상기 노니 열매 전체 중량을 기준으로 1 내지 5 중량%를 접종시킬 수 있다. 이와 같은, 유산균액의 접종량을 만족시킬 경우, 상술한 바와 같은 생물 전환이 원활하게 이루어져, 유의미한 항아토피 피부염 효과를 나타내는 성분의 발효 노니를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발효 및 숙성은 30℃ 내지 100℃에서 10분 내지 80시간 동안 이루어질 수 있다.
구체적으로, 상기 발효는 발효 시작일로부터 10분 이상 발효 및 숙성함으로써, 곰팡이의 생성을 방지하고 발효액을 균질화시킬 수 있다.
상기 발효 및 숙성 온도는 30 내지 100℃일 수 있다. 발효 및 숙성 온도가 30℃ 미만이면 발효가 정상적으로 이루어지지 않을 수 있고, 상기 100℃ 초과되면 발효 및 숙성 시간이 길어져, 유산균이 죽거나 발효 노니의 맛과 향이 저하될 수 있다.
(S2) 단계
(S2) 단계에서는 상기 접종된 노니 열매를 발효 및 숙성시켜 얻은 발효 노니 추출물을 여과시키는 단계시킬 수 있다.
상기 접종된 노니 열매를 발효 및 숙성하는 단계는 통상의 공지된 방법을 사용하였다. 추가로, 상기 발효 노니를 착즙 후 여과시킬 수도 있다. 이때, 발효 및 숙성 과정을 거친 발효 노니에는 노니 열매와 발효액이 함께 포함될 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변경 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 균주의 분리 및 동정
(1) 균주 분리
전국 각지로부터 수집한 김치액을 4℃에 냉장보관하였다. 수집된 분변 및 김치액을 균일하게 교반한 다음, 0.9% 멸균생리식염수를 이용하여 단계적으로 희석하고(10-2, 10-4, 10-6 및 10-8), 유산균 분리용 배지인 MRS(deMan Rogosa Sharpe, Difco TM, Becton Dickinson and Company, USA)-BCP(Bromocresol Purple) 평판배지에 도말하였다. 도말한 배지는 30℃에서 집락의 형성을 관찰하였으며, 유의한 수준의 집락이 형성될 때까지 24-48시간 동안 배양하였다. 단일 집락으로서 구분 가능한 수준의 희석 농도의 배지에서 원래 배지의 색인 보라색이 균주의 젖산 형성을 통해 노란색의 집락 및 경계를 형성하는 균주 집락을 선별하였다. 선택된 집락들을 다시 MRS-BCP 평판 배지에 계대배양하여 단일 집락임을 다시 확인하고, 단일 집락으로 확인된 균주들에 대해서 대사 활성을 측정하였다.
상기 활성은 얻어진 균주들을 노니 배당체 이리도이드에 가하여 대사 활성을 갖는지 여부를 확인함으로써 수행하였으며, 구체적으로는 노니 이리도이드 추출분말(전북 군산시소재의 엔헬시바이오) 1g를 취한 후 0.9% 식염수로 적절하게 연속 희석한 다음 MRS 한천(agar)(Difco Laboratories, 덱스트로오즈 20.0g/ℓ; 미트 펩톤(meat peptone) 10.0g/ℓ; 비프 추출물(beef extract) 10.0g/ℓ; 효모 추출물 5.0g/ℓ; 소듐 아세테이트 5.0g/ℓ; 디소듐 포스페이트 2.0g/ℓ; 암모늄 시트레이트 2.0g/ℓ; 트윈 80 1.0g/ℓ; 마그네슘 설페이트 0.1g/ℓ; 망간 설페이트 0.05g/ℓ; 아가(agar) 15g/ℓ)에 도말한 후 30℃와 37℃에서 72시간과 48시간 동안 각각 배양하였다.
상기와 같이 대사활성을 측정한 결과, 약 10종의 미생물을 분리하였다. 각각 분리된 미생물을 이용하여 홍삼추출물 10g에 물 90㎖를 가하고, 85℃ 에서 멸균한 다음, 미생물을 약 5 %의 농도로 접종한 후, 37 ℃에서 2일 동안 배양하였다. 얻어진 배양액을 85℃에서 24 시간 동안 숙성 및 멸균 처리한 다음, HPLC로 이리도이드를 분석한 결과, 디아세틸아스페루로시딕산(deacetylasperulosidic acid) 및 아스페루로시딕산(asperulosidic acid) 생성능이 특히 높은 미생물 1종(NST 1805)을 선별하였다. 상기 미생물인 NST 1805은 김치액에서 분리된 균주이다.
(2) 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석에 의한 분리 균주의 동정
분리된 2종의 미생물의 16S rRNA 유전자 서열 분석을 수행하였다. 16S rRNA 유전자 서열 분석은, Lane, D. J. (1991), 16S/23S sequencing. In: Nucleic Acids Techniques in Bacterial Systematics, Eds.: Stackebrandt, E. and Goodfellow, M. pp. 115-175, John Wiley and Sons, New York 및 Harju, S., et al., 2004, Rapid isolation of yeast genomic DNA: Bust n' Grab. BMC Biotech. 21:4-8에 개시된 방법에 따라 실시하였다.
상기 2종의 미생물을 MRS 액체 배지 10 ㎖에 접종하고 회전식 배양기 내에서 80 rpm, 30℃에서 2일간 배양하였다. 상기 배양액 1 ㎖을 1.5 ㎖ 원심분리 튜브에 넣고 15,000 x g로 5분간 원심분리하였다. 게놈 DNA를 추출하기 위해서 상층액을 제거한 후 튜브에 라이시스 완충액(2 %(v/v) Triton X-100, 1%(w/v) SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl 및 1 mM EDTA; pH 8.0) 200 ㎕를 첨가하여 균질한 상태로 만든 뒤, 상기 튜브를 -80 ℃에서 4분간 얼리고, 곧이어 끓는 물에서 다시 2분간 중탕하였다. 이렇게 얼리고 녹이는 과정을 두 차례 수행한 뒤, 30초간 볼텍싱하였다. 그리고 200 ㎕의 클로로포름을 넣고 다시 2분간 볼텍싱한 뒤, 4℃에서 15,000 x g로 5분간 원심분리하였다. 상층액만 분리하여 2 ㎕의 RNaseI 용액(mg/ml)을 처리한 후 에탄올 침전법을 이용하여 게놈 DNA를 분리하고 TE 용액 200 ㎕에 용해하고, 이를 16S rRNA 유전자를 증폭하는 데에 사용하였다.
상기 미생물의 염색체 DNA로부터 16S rRNA 유전자를 프라이머 8F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 서열번호 3)와 1541R(AAGGAGGTGATCCAGCC, 서열번호 4)을 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭을 위한 PCR 프로그램은 다음과 같이 수행하였다. 94℃에서 5분 동안 반응시킨 다음 94℃에서 30초, 55℃에서 40초 및 72℃에서 1분 30초로 이루어진 사이클을 35회 반복하고 최종 신장 단계로서 72℃에서 5분간 반응시켰다. 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 산물을 Accu Prep gel 정제 키트(Accu. Chem. Sci. Corp. Westbury, N.Y.)를 사용하여 정제하였다. 이렇게 얻어진 각각의 PCR 증폭 산물을 각각 pPCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen, USA)에 도입하고 이 벡터를 이용하여 E. coli DH5a(Real Biotech, Inc., Taiwan)를 형질전환하였다. 유효한 E. coli DH5a 균주를 확인한 후 여기에서 플라스미드를 분리 정제하였다. 이렇게 해서 얻어진 플라스미드인 pM-2 및 pM-3에 있는 16S rRNA의 시퀀싱을 실시하였다. 서열분석 결과, 상기 미생물, 즉 NST 186의 16S rRNA 서열은 각각 서열번호 1로 확인되었다(1417 bp). 상기 유전자 서열을 BLAST를 사용하여 상동성을 분석한 결과, NST 1805 균주는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)에 속하는 새로운 균주로 판명되었다.
(3) 당 발효능 분석(생화학적 특성 규명)
16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통하여 얻어진 미생물, 즉 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P) 균주에 대하여, API 50 CHL 키트(BioMerieux, France)를 이용하여 49종의 당에 대한 발효 검사를 실시하였고, 그 결과는 표 1 및 2와 같다.
No. | 측정항목 | Lb. plantarum NST 1805 |
1 | 글라이세롤 (Glycerol) | - |
2 | 에리스리톨 (Erythritol) | - |
3 | D-아라비노즈 (D-Arabinose) | - |
4 | L-아라비노즈 (L-Arabinose) | + |
5 | D-리보스 (D-Ribose) | + |
6 | D-자일로스 (D-Xylose) | - |
7 | L-자일로스 (L-Xylose) | - |
8 | D-아도니톨 (D-Adonitol) | - |
9 | 메틸-β-D-자일로피라노사이드(Methyl-β-D-Xylopyranoside) | - |
10 | D-갈락토스 (D-Galactose) | + |
11 | D-글루코스 (D-Glucose) | + |
12 | D-프록토스 (D-Fructose) | + |
13 | D-만노스 (D-Mannose) | + |
14 | L-소르보스 (L-Sorbose) | - |
15 | L-람노스 (L-Rhamnose) | - |
16 | 둘시톨 (Dulcitol) | - |
17 | 이노시톨 (Inositol) | - |
18 | D-만니톨 (D-Mannitol) | + |
19 | D-소르비톨 (D-Sorbitol) | + |
20 | 메틸-a-D-만노피라노사이드(Methyl-a-D-Mannopyranoside) | + |
21 | 메틸-a-D-글루코피라노사이드(Methyl-a-D-Glucopyranoside) | - |
22 | N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine) | + |
23 | 아미그달린 (Amygdalin) | + |
24 | 아르부틴 (Arbutin) | + |
25 | 에스큘린 페릭 시트레이트(Esculin ferric citrate) | + |
No. | 측정항목 | Lb. plantarum NST 1805 |
26 | 살리신 (Salicine) | + |
27 | D-셀로비오스 (D-Cellobiose) | + |
28 | D-말토스 (D-Maltose) | + |
29 | D-락토스 (D-Lactose) | + |
30 | D-멜리비오스 (D-Melibiose) | + |
31 | D-사카로스 (D-Saccharose) | + |
32 | D-트레할로스 (D-Trehalose) | + |
33 | 이눌린 (Inulin) | - |
34 | D-멜리지토스 (D-Melezitose) | + |
35 | D-라피노스 (D-Raffinose) | - |
36 | 아미돈 (전분) (Amidon (starch)) | - |
37 | 글라이코겐 (Glycogen) | - |
38 | 자일리톨 (Xylitol) | - |
39 | 젠티오비오스 (Gentiobiose) | + |
40 | D-투란노스 (D-Turanose) | + |
41 | D-락소스 (D-Lyxose) | - |
42 | D-타가토스 (D-Tagatose) | - |
43 | D-퓨코스 (D-Fucose) | - |
44 | L-퓨코스 (L-Fucose) | - |
45 | D-아라비톨 (D-Arabitol) | - |
46 | L-아라비톨 (L-Arabitol) | - |
47 | 포타슘 글루코네이트(Potassium Gluconate) | + |
48 | 포타슘 2-케토글루코네이트(Potassium 2-Ketogluconate) | - |
49 | 포타슘 5-케토글루코네이트(Potassium 5-Ketogluconate) | - |
상기 표 1a 및 1b에서 "+"는 당을 이용하여 발효한 것, -는 해당하는 당을 이용하여 발효하지 못한 것을 나타낸다.
(4) 균주기탁
상기에서 분리된 균주 즉, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST 1805을 한국미생물보존센터에 2020년 11월 13일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM12833P를 부여받았다.
실시예 2: 발효 노니 추출물 제조
노니 열매를 세척하고 -27℃에서 냉동시켜서 박테리아를 제거하였다. 해동된 노니 열매를 슬라스한 후, 2% Lactobacillus plantarum NST 1805 (기탁번호: KCCM12833P) 수용액과 함께 30℃에서 21일 동안 배양하였다. 그 후, 90℃에서 30분 동안 가열 및 증발시켜 농축하여 발효하였다.
그 후, 노니 발효액을 Whatman 필터와 진공 여과를 사용해서 여과하고 스톡 용액으로부터 잔해물과 열매 입자를 제거하여, 발효 노니 추출물을 제조하였다.
비교예 1: 노니 추출물 제조
발효 공정을 실시하지 않은 것을 제외하고 실시예 2와 동일한 방법으로 실시하여 노니 추출물을 제조하였다.
실험예 1: HPLC-UV 분석 (High Performance Liquid Chromatography with UV detection).
실시예 2의 발효 노니 추출물(F.NONI) 및 비교예 1의 노니 추출물(NONI) 에 대해서 HPLC-UV 분석을 실시하여, 디아세틸아스페루로시딕산 (DAA) 및 아스페루로시딕산(AA)의 함량을 확인하였다.
실시예 2에서 제조된 발효 노니 1g을 5ml의 H2O-MeOH (1:1)로 희석하고 완전히 혼합했다. 용약을 HPLC 분석을 위해 5ml의 정량 플라스크에 수집하였다. 추출물의 모아서 여과한 후 50 °C에서 진공인 상태에서 회전식 증발 농축기 에서 건조 시켰다. 건조된 추출물을 HPLC로 분석하기 위해 MeOH 로 다시 용해시켰다. C18 컬럼 (4.6 mm Х 250 mm; 5 μm, Waters Corporation, Milford, MA, USA) 이 장착된 20A UV 검출기와 결합된 Shimadzu 20A 분리 모듈에서 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 펌프는 2개의 이동상-A , MeCN; 그리고 B, H20에서 포름산 0.1% (v/v) - 그리고 elute data flow rate는 0.8 mL/분 이었다. 이동상은 다음과 같이 선형 경사로 연속적으로 다음과 같이 프로그래밍되었다 : 0-5 분, 0% A; 그리고 40 분, 30% A. UV 검출기는 235nm의 범위에서 모니터링 되었다. 각 샘플 용액에 대한 주입량은 10 μL이다. 컬럼의 온도는 25℃ 에서 유지되었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 비교예 1에 비해 실시예 2에서 DAA(DeacetylAsperulosidic Acid)와 AA(Asperulosidic Acid)의 함량이 증가된 것을 알 수 있다 (A: DAA 및 AA; B: 비교예 1의 노니 추출물; C: 실시예 2의 발효 노니 추출물).
상기 DAA와 AA의 구체적인 함량은 하기 표 3에 기재된 바와 같다.
DAA (g/mg) |
AA (g/mg) |
||
비교예 1 | NONI | 9.303 ± 0.146 | 1.470 ± 0.065 |
실시예 2 | F.NONI | 13.219 ± 0.146 | 2.266 ± 0.065 |
실험예 2: 동물모델에서의 항 아토피 피부염 효과 측정
실시예 2에서 제조된 발효 노니에 대한 생체(in vitro)의 항 아토피 피부염 능력을 확인하기 위하여 실험을 실시하였다.
2-1. 동물모델
NC/Nga 쥐 (n = 48)는 SLC (일본 시즈오카)에서 입수하였다. 쥐를 12시간 명암 주기로 특정 병원체가 없는(SPF, specific pathogen free) 조건하에 개별 통풍 케이지(IVCs, individually ventilated cages)에서 23 ± 3 ℃에서 55% ± 5% 습도를 유지시켰다. 쥐에게 표준 실험실 식단 (Central Lab Animal , 한국 , 서울) 및 물을 자유롭게 먹였다. 모든 실험 절차는 경희대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 의해 승인된 규범 (approval no. KHUASP(SE)-18-079)에 따라 수행되었으며 최종 실험의 날까지 탈락된 쥐는 0 마리였다.
2-2. 아토피 피부염(AD)-유사 피부 병변의 유도 및 발효 노니 적용
AD-유사 피부 병변은 NC/Nga 쥐에 DNCB (2,4-dinitrochlorobenzene, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 국소 적용하여 유도하였다. 구체적으로, 순응 1주 후, 전기 면도기를 이용해 NC/Nga의 등 털을 제거했다. 털을 제거한 후 쥐를 무작위로 다음 6그룹으로 나누고 8마리의 쥐(n=8)를 할당했다. 비 처리 통제 집단 (정상, nave 통제 집단), DNCB-처리 그룹 (통제 , 음성 통제 집단) DNCB-처리 + prednisolone 3 mg/kg (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 집단 (PD , 양성 통제 집단) 및 DNCB-처리 + 발효 노니 250, 500, 1000 mg/kg 그룹 (발효 노니 250 , 발효 노니 500 , 발효 노니 1000).
이와 같이 실험군은 하기 표 4에 나타난 바와 같다.
실험군 | ||
Native | DNCB 미처리 | - |
Control | DNCB 처리 | - |
PD | PD 처리 | |
F.NONI 250 | 발효 노니 250 mg/kg 처리 | |
F.NONI 500 | 발효 노니 500 mg/kg 처리 | |
F.NONI 1000 | 발효 노니 1050 mg/kg 처리 |
AD-유사 피부 병변을 유도하기 위해 1% DNCB를 아세톤 및 에탄올 혼합물 (2:3 v/v)에 용해시킨 다음 면도 등 부위 (200 μL) 와 오른쪽 귀 (100 μL)에 감작을 위해 일주일에 2번씩 적용했다. 감작 이후 아세톤과 올리브 오일 혼합물 (3:1 (v/v))에 용해된 0.4% DNCB는 등 피부 (150 μL) 및 오른쪽 귀 (50 μL)에 9주 동안 일주일에 3번 반복적으로 시도하였다. 정상군(Native)과 대조군(Control)의 쥐에 0.5% 카복시메틸셀룰로오스(0.5% CMC(carboxymethyl cellulose))를 경구 투여 했다. PD (3 mg/kg prednisolone) 및 발효 노니 (250, 500, 1000 mg/kg)의 투여는 4주 동안 매일 수행하였다. AD-유사 피부 병변은 피부염 점수, 긁는 행동, 조직학 또는 면역의 파라미터로 결정하였다.
2-3. 피부염, 귀 두께 및 긁는 행동 측정 점수와 귀 두께
상기 각 실험 군의 피부염(dermatitis), 귀 두께(ear thickness) 및 긁는 행동(scratching behavior)에 대하여 아래와 같은 방법으로 측정하다.
(a)피부염 점수(dermatitis score)
피부염 점수는 일주일에 세 번(화요일, 목요일, 토요일 14;00) 기록하였다. 5가지 증상(홍반/부종, 건조함, 부식, 표피박리 및 태선) 에 대해 0 (없음), 1(가벼움), 2(보통) 및 3(심함)으로 등급이 매겨진 점수를 측정했다. 총 피부염 점수는 5가지 증상에 대한 모든 개별 점수의 합으로 정량화 하였다(최대 점수 : 15점).
(b)귀 두께(ear thickness)
귀 두께는, 두께 측정기(Mitutoyo Corporation, Tokyo, Japan)를 사용하여 일주일에 3회 각 쥐의 오른쪽 귀 두께를 측정하였다.
(c) 긁는 행동(scratching behavior)
긁는 행동의 측정은 일주일에 3번(월요일, 수요일 및 금요일 14:00분) 기록하였다. 용액 투여 후 쥐는 적어도 1시간 동안 아크릴 케이지에 두었다. 그리고 30분 동안 뒷발로 목, 귀 및 등 피부를 긁는 동작을 측정하고 기록하였으며, 이를 0, 2 및 4 중에서 선택되는 점수로 매겼다 (0: 없음, 2: 1.5s 보다 짧게 긁음, 4: 1.5s 보다 길게 긁음). 긁는 행동의 총 점수는 개별 측정 기록의 합계로 결정하였다.
도 2a는 마지막 실험 날의 각 실험군에서 관찰된 피부 병변을 나타낸 사진이고, 도 2b는 실험예 2의 각 실험군의 (a) 피부염 점수, (b) 귀 두께 및 (c) 긁는 행동에 대한 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2a에 나타난 바와 같이, DNCB를 반복적으로 국소 적용하면, 부종성 홍반, 부식, 태선, 표피박리 및 건조를 포함하는 AD 유사 병변과 함께 긁는 행동을 더욱 악화시켰다. 그러나, 발효 노니(F.NONI) 또는 PD를 투여할 경우 이러한 병변이 회복됨을 알 수 있다.
또한, 도 2b에 나타난 바와 같이, 발효 노니는 용량-의존적인 방식으로 피부염 점수를 감소시키고, 가려움증을 없애주며, 긁는 행동을 상당히 감소시킨 것을 알 수 있다. 즉, 발효 노니는 DNCB로 유도된 AD 유사 병변 뿐만 아니라 긁는 행동 역시 개선시키는 것을 알 수 있다.
2-3. 조직학 분석
쥐의 등 피부 조직을 조직학적 분석을 위해 절단하고 10% 중성 포르말린에 고정시켰다. 그 후, 고정된 조직을 파라핀에 깊숙이 박고 4 μm 두께의 부분으로 슬라이스했다. 조직 부분을 hematoxylin, eosin (H&E) 및 toluidine blue (TB)로 염색했다. 염색된 조직은 한국 병리 기술 센터 (한국 청주)에서 입수한 것이다.
염색 후 등 이미지를 광학 현미경 (400Х, DP Controller Software; Olympus Optical, 일본 도쿄)으로 촬영하였다. 피부 표피 두께와 침윤된 염증 세포의 수는 mage J 소프트웨어 (National Institute of Health, Starkville, MD, USA)를 사용하여 각 6개 위치에서 측정하였다.
도 3a는 실험예 2의 각 실험군에서 DNCB에 의해 유도된 조직학적 특징을 나타낸 사진이다. 도 3b는 실험예 2의 각 실험군에서 측정된 표피의 두께(thicknesses of epidermis), 비만세포의 수(number of mast cells) 및 침윤 호산구의 수(number of eosinophils)를 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, H&E 염색은 고각화증 및 표피박리에 의한 표피 농화 및 피부로의 호산구의 침윤이 정상 그룹(Normal)에 비해 통제 집단(control)에서 유의미하게 증가함을 알 수 있었다.
또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, 발효 노니의 투여는 용량-의존적으로 표피 두께를 회복시키고 등 피부에서 호산구의 수를 감소시키는 것을 알 수 있다. 또한, 통제 집단(control)의 비만 세포의 수는 정상(Normal)의 경우에 비해 증가한 반면 발효 노니의 투여는 침윤된 비만 세포의 수를 감소시켰다. 발효 노니 1000(F.NONI 1000)을 투여할 경우, PD보다 염증 세포의 침윤 및 표피 두께를 감소시키는 경향이 있었다.
이로부터, 발효 노니는 염증 세포의 침윤을 약화시키고 표피 두께를 회복시키는 것을 알 수 있다.
2-4. 혈청 면역글로불린과 사이토카인 분석
쥐를 희생시킨 후 즉시 혈액을 수집하였다. 혈액 수집 방법은 기관의 동물 윤리 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행하였다. 실험의 마지막 날에 isoflurane (2-2.5%)을 흡입시켜 쥐를 마취시키고 정맥에서 혈액 샘플을 빼냈다. 혈청 샘플은 원심 분리기(3000Хg, 4 ℃, 15 분)를 사용하여 혈액으로부터 얻었으며, 80 ℃에 저장하였다. 혈청 중의 IgG, 흉선 그리고 활성화 조절 케모카인 (TARC), TSLP(thymic stromal lymphopoietin) 그리고 히스타민 농도의 수준을 쥐 효소결합면역흡착측정법 (ELISA) 키트를 사용하여 측정하였다 (IgE, Shibayagi, Gunma, Japan; IgG1 and IgG2a, Enzo Life Sciences, USA; TARC, TSLP, and histamine, Elabscience, Huston, ID, USA).
도 4는 IgG, 히스타민(histamine), TARC 및TSLP과 발효 노니의 상관 관계에 대해 측정한 그래프이다.
하기 표 5는 측정된 IgG을 기재한 것이다.
실험군 | 중량 (mg/kg body weight) |
혈청 (㎍/㎖) | IgG1/ IgG2a | |
IgG1 | IgG2a | |||
Native | - | 722.6 ± 107.9 | 597.8 ± 279.5 | 1.0 |
Control | - | 2414.9 ± 215.4 ### | 1687.8 ± 268.4 ## | 1.8 ## |
PD | 3 | 1992.1 ± 251.9 *** | 1038.9 ± 152.4 *** | 1.2 * |
F.NONI 250 | 250 | 1992.1 ± 251.9 * | 1368.5 ± 140.3 | 1.7 |
F.NONI 500 | 500 | 1688.7 ± 258.5 ** | 1389.5 ± 242.8 | 1.4 * |
F.NONI 1000 | 1000 | 1273.6 ± 231.8 *** | 1485.8 ± 116.5 | 1.1 ** |
## p < 0.01, ### p < 0.001 vs. normal, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 vs. control. |
도 4 및 표 4에 나타난 바와 같이, IgE 및 IgG1 의 수치는 정상 그룹(Normal)보다 통제 집단에서 더 증가했다. 그러나 IgE 및 IgG1은 통제 집단(Control)에 비해 발효 노니 군에서 용량 의존적으로 감소한 반면 IgG2a의 수치는 통제 그룹에 비해 발효 노니 투여에 의해 달라지지 않았다. 프레드니솔론은 IgE , IgG1 그리고 IgG2a 의 생성을 억제한다고 알려져 있다. 상기 결과에 따르면, 면역 억제제로서 PD의 투여는 통제 집단의 것과 비교하였을 때 IgE, IgG1 그리고 IgG2a 의 수치를 상당히 감소시켰다. 상기 표 3에 나타난 바와 같이 IgG1/IgG2a의 비율은 통제 집단(Control)과 비교하였을 때 용량 의존적인 방식으로 발효 노니의 투여 후 현저하게 감소하였다. 또한, 히스타민, TARC 그리고 TSLP의 혈청 수준은 통제 집단(Control)이 정상 그룹(Normal) 보다 더 증가하였다.
발효 노니 투여 실험군에서는 용량 의존적이 방식으로 이러한 증가 현상이 완화되었고, 히스타민 , TARC 그리고 TSLP 에 대한 발효 노니 1000(F.NONI)의 효능은 PD의 효능과 유사한 경향을 나타내었다.
따라서, 발효 노니는 면역 반응의 불균형을 개선시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
2-5. 비장 세포 분리 및 비장 사이토카인 분석
비장에서 AD 관련 사이토카인 생성에 대한 발효 노니의 효과를 조사하기 위해 생체 외 실험을 수행하였다.
마지막 치료 후 각 NC/Nga 쥐로부터 비장을 분리하여 관찰하였다. 비장을 NC/Nga 쥐로부터 무균성으로 수집하고 멸균 주사기 플런저(plunger)로 부스러뜨리고 cell strainer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)를 통해 단일 세포 현탁액으로 분산시켰다. 적혈수 용해 완충액 (lysing buffer) Hybri-Max (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 처리한 후, 소 태아 혈청 (Gemcell FBS; Gemini Bio-products, West Sacramento, CA, USA), 100 U/mL 페니실린 (CALSSON, Smithfield, UT, USA) 및 50 mg/mL 스트렙토마이신 (CALSSON, Smithfield, UT, USA)이 보충된 RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, NY, USA)를 이용하여 비장 세포를 3번 씻었다. 분리된 비장 세포를 24- 웰 플레이트에 72시간 동안 5% CO2 인큐베이터에 37 ℃로 5 μg/mL 콘카나발린 A (Con-A) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 1 Х 106 세포/웰의 농도로 배양했다. 배양 후 상청액을 수집하고 비장 세포를 cOmplete?? 프로테아제 억제 혼합 알약 (complete?? protease inhibitor cocktail tablets) (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)을 함유하는 용해 완충액에서 균질화 시켰다. 용해물은 4 ℃에서 15분동안 10,000Х g에서 원심분리 한 후 수집되었다. 수집된 비장 세포 및 용해물의 상청액을 후속 사이토카인 분석을 위해 70 ℃에서 얼렸다. 상청에서 사이토카인 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-13, IL-17, IL-22, IL-31, IL-33, 및 IFN-γ)의 농도는 제조사의 설명서 (Elabscience, Houston, ID, USA)에 따라 ELISA 키트를 사용하여 측정했다. 용해물 안의 단백질 농도는 Pierce?? BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였다. 상청액의 사이토카인 수준은 용해물의 단백질 농도로 표준화하였다.
도 5a는 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31 및 IL-33의 수준을 나타낸 그래프이고, 도 5b는 사이토카인 IL-12 및 IFN-γ의 수준을 나타낸 그래프이며, 도 5c는 사이토카인 IL-6, IL-17 및 IL-22의 수준을 나타낸 그래프이다.
도 5a에 나타난 바와 같이, Th2 매개 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31 그리고 IL-33의 생산은 통제 그룹에서 유의미하게 증가하였고 이는 용량 의존적인 방식으로 발효 노니의 투여에 의해 회복되었다. 또한, 도 5c에 나타난 바와 같이, 사이토카인 IL-6, IL-17 그리고 IL-22의 수치는 정상 그룹보다 통제 그룹에서 유의미하게 증가한 반면 발효 노니 그룹에서는 통제 그룹(Contol)보다 더 큰 감소를 나타냈다. 그러나 Th1 매개 사이토카인 IL-12 및 IFN-γ의 수준은 정상 그룹(Normal)과 비교하였을 때 통제 그룹에서 유의미한 차이를 나타내지 않았다. 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, 발효 노니의 투여량은 통제 그룹(Control)에서의 투여량보다 증가하는 경향이 있었다. PD는 Th2 매개 사이토카인 뿐만 아니라 Th1, Th17, 및 Th22 매개 사이토카인을 억제하였다.
결국, 발효 노니는 비장에서 사이토카인 생산의 균형을 조절하는 것을 알 수 있었다.
2-6. RNA 분리 및 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석
쥐의 등 피부에서 AD 관련 사이토 카인 유전자 발현에 대한 발효 노니의 효과를 조사하기 위해 RT-qPCR 분석을 수행하였다.
Easy-RED total RNA extraction kit (Intron Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 등 피부 조직으로부터 총 RNA를 얻었다. RNA를 추출한 후 우리는 NanoDrop ND-1000 분광 광도계 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 RNA를 정량화했다. 추출된 RNA와 함께 cDNA 합성 키트 (TaKaRa Bio, Shiga, Japan)를 사용하여 상보적 DNA(cDNA) 합성을 수행하였다. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응 (qRT-PCR)을 합성된 cDNA 와 SYBR Premix EX Taq (TaKaRa Bio, Shiga, Japan)를 사용하여 ABI StepOnePlus?? 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)으로 수행하였다. 프라이머 서열은 하기 표 6에 기재된 바와 같다.
각 유전자의 mRNA 발현 수준을 ΔCt 방법을 사용하여 cycle threshold(Ct)값으로 계산하고 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)로 표준화 하였다.
도 6a는 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 및 TSLP의 유전자 발현(gene expression)에 대한 그래프이고, 도 6b는 사이토카인 IL-12p40 및 IFN-γ의 유전자 발현에 대한 그래프이며, 도 6c는 사이토카인 IL-6, IL-17A 및 IL-22의 유전자 발현에 대한 그래프이다.
도 6a에 나온 것과 같이 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33, 및 TSLP를 포함한 Th2 매개 사이토카인의 발현은 정상그룹의 그것들에 비해 통제그룹에서 유의미 하게 증가하였다.
또한, 도 6c에 나타난 바와 같이, TNF-α, IL-6, IL-17A, 및 IL-22를 포함한 Th17 , Th22 그리고 염증성 사이토카인의 발현은 대조군에서 현저하게 상향 조절되었다. 그러나 발효 노니의 투여는 이러한 AD 관련 사이토카인 유전자 발현을 용량 의존적인 방식으로 대조군과 비교하여 하양조절하였다.
또한, 도 6b에 나타난 바와 같이, IL-12p40 그리고 IFN-γ를 포함한 Th1 매개 사이토카인의 유전자 발현은 정상 그룹보다 통제 그룹에서 더 감소한 반면 발효 노니 그룹은 이러한 사이토카인 유전자 발현을 정상 수준으로 회복시켰다. 모든 AD 관련 사이토카인의 유전자 발현은 대조군에서와 비교하여 PD 그룹에서 감소했다.
이로부터, 발효 노니는 등 피부에서 AD 관련 및 염증성 사이토카인 발현의 조절을 통해 면역 불균형을 개선시킨 것을 확인하였다.
2-7. Western Blot Analysis
피부 장벽 기능에 대한 발효 노니의 효과를 조사하기 위해 등 피부의 피부 장벽 단백질 및 mRNA를 측정하였다.
쥐의 등쪽 피부 조직을 액체 질소로 동결 시킨 후 유봉을 이용하여 분쇄하였다. 이어서 피부 조직을 completeTM protease inhibitor cocktail tablets (Roche Diagnostics, Indianapolis, ID, USA)을 함유하는 용해 완충제로 균질화시켰다. 등 피부 조직의 용해물을 초음파 처리하고 4 ℃에서 15분 동안 10,000x g에서 원심 분리 했다. 상청액으로부터 단백질의 농도를 PierceTM BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량화 하였다. 정량 후 전기 영동법을 위해 동일한 양의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (SDS-PAGE; Bio-Rad, CA, USA)에 7.5% 혹은 12%로 로드(loaded)하고 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막으로 옮겼다. 0.5% Tween-20 (TBST)가 있는 Tris-buffered saline 중 5% 탈지 우유로 막을 차단하고 4℃에서 밤새 1:1000 1차 항체에서 배양하였다. 다음날 막을 horseradish peroxidase-conjugated (HRP) 2차 항체 (GeneTex, Inc., Irvine, CA, USA)로 2 시간 동안 1:5000으로 희석된 농도로 처리하고 ChemiDoc??XRS + System (Bio-Rad, Richmond, CA, USA)을 사용하여 가시화하였다. 각 단백질의 발현 수준을 Image Lab 통계 소프트웨어 (Bio-Rad, CA, USA)에 의해 분석하고 β-actin으로 정규화 하였다. Western 면역 블러팅법에 사용된 일차 항체는 다음과 같다: filaggrin (FLG) (GeneTex, Inc., Irvine, CA, USA), loricrin (LOR) (GeneTex, Inc., Irvine, CA, USA), involucrin (IVL) (Santa Cruz, CA, USA), occluding (OCC) (Abcam, Cambridge, MA, USA), zonula occludens-1 (ZO-1) (Abcam, Cambridge, MA, USA), 그리고 β-actin (Santa Cruz, CA, USA)
도 7a는 Western Blot Analysis 결과 프로테인 수준을 나타낸 사진이고, 도7b 는 프로테인 수준을 나타낸 그래프이고, 도 7c는 pro-FTG의 유전자 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이, FLG, LOR, IVL, OCC, 그리고 ZO-1과 같은 단단한 접점을 포함하는 피부 장벽의 단백질 수준은 정상 그룹에 비해 통제 집단에서 현저하게 감소했다. 이러한 단백질 발현 수준은 발효 노니 그룹에서 용량 의존적으로 회복되었다.
또한, 도 7c에 나타난 바와 같이, pro-FLG의 mRNA 발현은 정상 그룹에서와 비교하였을 때 통제 그룹에서 현저하게 감소되었다. 발효 노니 처리군에서 pro-FLG의 유전자 발현의 감소가 회복되었다. 발효 노니 500 그리고 1000은 PD보다 모든 mRNA 및 단백질 발현을 보다 효과적으로 증가시켰다.
이로부터, 발효 노니는 피부 장벽의 mRNA 및 단백질 발현의 증가를 통해 피부 장벽 기능 장애를 회복시키는 것을 확인하였다.
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Fermented Noni and Method for Preparing the Same
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus plantarum NST 1805
<400> 1
caagtcgaac gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt 60
ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa 120
cagatgctaa taccgcataa caacttggac cgcatggtcc gagyttgaaa gatggcttcg 180
gctatcactt ttggatggtc ccgcggcgta ttagctagat ggtgrggtaa cggctcacca 240
tggcaatgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc 300
ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga 360
gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac 420
atatctgaga gtaactgttc aggtattgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta 480
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa 540
agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg 600
catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg 660
aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga 720
cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccataccgt 780
aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta 840
agcattccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt 960
gacatactat gcaaatctaa gagattagac gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt 1020
gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080
ccttattatc agttgccagc attaagttgg gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc 1140
ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200
ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaac tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca 1260
ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1320
cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380
tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg gtaacct 1417
Claims (8)
- 발효 노니를 이리도이드(iridoid) 화합물로 생물전환시키는 신규 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P).
- 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)로 발효된, 이리도이드 성분을 함유하는 발효 노니 추출물을 포함하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 생물전환된 이리도이드는 디아세틸아스페루로시딕산(deacetylasperulosidic acid) 및 아스페루로시딕산(asperulosidic acid)인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 디아세틸아스페루로시딕산(deacetylasperulosidic acid)의 함량은 12 ㎎/g 내지 15 ㎎/g인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 아스페루로시딕산(asperulosidic acid)의 함량은 2 ㎎/g 내지 5 ㎎/g인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물. - (S1) 노니 열매에 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)를 접종하는 단계; 및
(S2) 상기 접종된 노니 열매를 발효 및 숙성시켜 얻은 발효 노니 추출물을 여과시키는 단계;
를 포함하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) NST1805 (기탁번호: KCCM12833P)는 상기 노니 열매 전체 중량을 기준으로 1 내지 5 중량% 접종시키는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 발효는 30℃ 내지 100℃에서 10분 내지 80시간 동안 발효시키는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조방법.
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