KR101490657B1 - 유단백질 마이얄반응물의 발효물을 함유하는 심혈관질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유단백질 마이얄반응물의 발효물을 함유하는 심혈관질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 심혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 콜레스테롤 저하용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물은 트롬빈 활성의 저해, 콜레스테롤의 합성 저해 및 감소를 통해 혈중 콜레스테롤 저하 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 상기 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 이용하여 심혈관질환의 예방 및 치료를 위한 유제품, 의약품, 기능성 식품 등을 개발할 수 있다.
본 발명에 따르면, 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물은 트롬빈 활성의 저해, 콜레스테롤의 합성 저해 및 감소를 통해 혈중 콜레스테롤 저하 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 상기 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 이용하여 심혈관질환의 예방 및 치료를 위한 유제품, 의약품, 기능성 식품 등을 개발할 수 있다.
Description
본 발명은 유단백질 마이얄반응물의 발효물을 함유하는 심혈관질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 심혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 콜레스테롤 저하용 조성물에 관한 것이다.
우유 단백질은 여러 생물학적 활성 물질을 포함하는 것으로 알려져 있어 식품 가공분야에서 기능성 원료로 폭넓게 사용되어 왔다. 우유 단백질은 약 80%를 차지하는 카제인(casein)과 약 20%를 차지하는 유청 단백질(whey protein)의 두 개의 주요한 그룹으로 분류될 수 있다. 우유 단백질의 효소적 가수분해는 그 물리적 및 화학적 특성을 증진시킨다는 사실이 알려져 있기도 하다 (Bertrand-Harb et al., Nahrung(2002), 46(4):283-289).
비효소적 갈변 현상으로도 알려져 있는 마이얄반응(Maillard reaction)은 식품 가공 및 저장 중에 카보닐(carbonyl)기와 아민(amine)기 사이에서 발생하는 복합적인 반응이다. 상기 마이얄반응에 의해 향, 색상, 맛, 질감 등 식품의 특성을 결정하는 중요한 마이얄반응 생성물(Maillard reaction products, MRPs)들이 많이 생성되게 된다 (Fayle et al., Royal Society of Chemistry(2002), Vol. 5).
우유 단백질과 당류의 마이얄반응 효과에 대한 일부 연구가 보고되어 있다. MRPs는 화학적 모델 및 식품 시스템 모두에서 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 가열된 카제인-포도당 혼합물은 유화 리놀레산(emulsified linoleic acid) 모델에서 지질 과산화 비율을 감소시킨다. 또한 카제인-당 유래 마이얄반응 생성물은 팬톤(Fenton)에 의해 유발된 하이드로실 자유 라디칼에 대해서는 항산화 활성을 보였으나, 소수성 라디칼에 대해서는 활성을 나타내지 않았다 (Gu et al., Food Chemistry(2009), 117(1):48-54). 또한, 또한, 마이얄 반응은 유청 단백질의 열 안정성, 유화 특성 및 항산화 활성을 증진시키는 것으로 보고되어 있다 (Chevalier et al., J Agric Food Chem.(2001), 49(10):5031-5038).
한편, 생체내에서 혈액은 복잡하고 정교한 조절 시스템에 의해 항상 평형을 이루고 있기 때문에 정상적인 상태에서는 출혈이나 혈전 등에 의해 그 흐름이 방해받지 않는다. 그러나 여러 요인에 의해 이러한 평형상태가 깨지게 되면 혈관의 흐름이 원활하지 못하게 되어 심혈관 질환이 발생하게 된다. 심혈관질환 중 가장 대표적인 것은 동맥경화증인데, 이는 심장이나 뇌 등 중요장기에 허혈성 상태를 초래하여 심근경색이나 뇌경색을 일으키는 매우 위험한 질환이다.
동맥경화증 발생 시 혈관 내막에 존재하는 혈관내피세포의 기능은 저하되거나 손상되며 이로 인해 세포부착물질이 높게 발현되어 단핵구(monocyte), T-림프구(lymphocyte), 및 혈소판 등이 혈관 내막에 부착하게 되고, 이들이 혈관내피세포 사이를 통과하여 혈관벽 속으로 침윤하게 된다. 혈관벽 속에 들어온 단핵구들은 지질단백질을 탐식하여 대식세포로 변형되고, 혈관 벽의 평활근세포의 증식 및 활성화가 일어나 세포외 기질(extracelluar matrix, ECM)을 생성하고, 여기에 지방이 더욱 축적되어 동맥경화증이 발생하게 된다. 동맥경화가 발생하면 혈관의 기능은 약화되고 유연성도 감소하여 약한 자극에도 쉽게 파열될 수 있으며, 이때 혈관 내벽의 콜라겐 등 세포외 기질이 노출되면 혈액 중의 혈소판이 점착, 활성화, 및 응집되고 혈액응고계를 활성화하여 급속한 혈전을 형성하게 된다. 이러한 현상은 심근경색에 의한 돌연사에서 흔히 관찰되며, 사망한 환자의 관상동맥을 현미경으로 자세히 조사하면 동맥경화에 의한 혈관의 협착과 혈관을 완전히 폐쇄한 혈전을 볼 수 있다. 그 결과 심장에 혈액공급을 순간적으로 차단하고 허혈성 상태를 지나 조직의 괴사를 일으키게 한다. 따라서 심혈관질환을 효과적으로 예방하기 위해서는 혈중 콜레스테롤의 감소, 혈소판 활성, 혈액응고활성의 억제 등이 요구된다.
이에 본 발명자들은 유단백질의 다양한 기능적 활성을 개선시키기 위해 실험을 거듭한 끝에, 마이얄반응과 유산균 발효를 통해 심혈관질환의 예방 및 치료에 요구되는 혈액응고활성의 억제, 콜레스테롤 합성의 저해, 그리고 콜레스테롤 감소 효과를 나타낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 트롬빈 활성의 저해 및 콜레스테롤 감소 효과를 갖는 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 심혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 심혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유단백질은 유청 단백질일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마이얄반응물은 유단백질과 유당을 혼합하여 마이얄반응(Maillard reaction)을 통해 생성될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유산균 발효물은 유단백질 마이얄반응물이 포함된 배지에서 유산균을 배양하여 수득된 배양액의 상등액일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유산균 발효물은 트롬빈 활성의 저해, HMG-CoA 환원효소 활성의 저해, 및 콜레스테롤 감소 효과를 나타낸다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 심혈관질환은 고혈압, 뇌졸중, 협심증, 심부전, 심근경색 및 동맥경화로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물 및 기능성 식품을 제공한다.
본 발명에 따르면, 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물은 트롬빈 활성의 저해, 콜레스테롤의 합성 저해 및 감소를 통해 혈중 콜레스테롤 저하 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 상기 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 이용하여 심혈관질환의 예방 및 치료를 위한 유제품, 의약품, 기능성 식품 등을 개발할 수 있다.
도 1a는 본 발명에 따라 제조된 마이얄반응물(L+WPC)에 대한 형광 측정 결과를 나타낸 그래프이고,
도 1b는 본 발명에 따라 제조된 마이얄반응물(L+WPC)에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 유단백질과 유단백질 마이얄반응물(MRP), 및 유산균 발효된 MRP의 트롬빈 저해 활성을 나타낸 결과이다.
도 3은 유단백질과 유단백질 마이얄반응물(MRP), 및 유산균 발효된 MRP의 HMGR 저해 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 유단백질과 유단백질 마이얄반응물(MRP), 및 유산균 발효된 MRP의 콜레스테롤 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 마우스 모델에서 출혈 시간을 분석하여 MRP 및 유산균 발효된 MRP의 항트롬빈 효과를 나타낸 결과이다.
도 1b는 본 발명에 따라 제조된 마이얄반응물(L+WPC)에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 유단백질과 유단백질 마이얄반응물(MRP), 및 유산균 발효된 MRP의 트롬빈 저해 활성을 나타낸 결과이다.
도 3은 유단백질과 유단백질 마이얄반응물(MRP), 및 유산균 발효된 MRP의 HMGR 저해 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 유단백질과 유단백질 마이얄반응물(MRP), 및 유산균 발효된 MRP의 콜레스테롤 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 마우스 모델에서 출혈 시간을 분석하여 MRP 및 유산균 발효된 MRP의 항트롬빈 효과를 나타낸 결과이다.
본 발명은 유단백질의 마이얄 반응 생성물을 유산균 발효를 통해 가수분해시킨 발효생성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 유단백질인 유청 단백질(Whey protein concentrates, WPC)과 카제인 단백질(sodium caseinate, SC)로부터 유래한 마이얄반응 생성물의 유산균 발효물의 콜레스테롤 저하 효과 및 심혈관질환의 예방 및 치료를 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 심혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물은 그 역가가 치료용의 의약품보다 낮다 하더라도 항상 섭취가 가능하다는 점에서 장점이 있으며 화학적 합성물질이 아닌 천연 물질이므로 안전성과 함께 의약품, 가공식품 등에 신속히 적용이 가능하다. 인체의 혈관 안에서 혈전이 혈관을 따라 흐르며, 이러한 혈전이 혈관에 축적됨으로서 뇌출혈, 뇌혈전증, 심부전증, 심근경색 등의 혈관계 질환을 초래하고 있다. 따라서 혈관계 질환은 혈전 용해와 콜레스테롤 감소를 통해 예방 및 치료할 수 있으며, 본 발명에 따른 유산균 발효물을 심혈관 보호를 위한 기능성 신소재로서 적용 가능한 다양한 제품의 개발을 기대할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 “마이얄반응(Maillard reaction)”은 아미노산의 아미노기와 환원당의 카보닐기가 축합하여 새로운 물질이 만들어지는 현상으로, 유단백질은 마이얄반응을 통해 열 안정성, 유화특성, 항산화 활성 등의 기능성이 향상되는 것으로 알려져 있다 (Chevalier et al., J Agric Food Chem. 2001, 49(10):5031-5038).
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 유단백질은 유산균 발효에 이용되기 위한 마이얄반응물의 재료가 되는 것으로, 마이얄-반응한 카제인과 마이얄-반응한 유청 단백질이 이미 알려져 있기 때문에 우유 단백질인 카제인 또는 유청 단백질 모두 사용 가능하다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 마이얄반응물은 유단백질과 유당을 혼합하여 마이얄반응(Maillard reaction)을 통해 생성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구현예에 따르면, 유단백질과 유당을 액체 상태로 혼합하여 40 내지 70℃에서 1일 내지 7일간 반응시킨 후 반응하지 않은 당을 제거하는 공정을 통해 마이얄반응물(Maillard reaction products, MRPs)을 수득할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 유산균은 유제품의 발효 공정에 통상적으로 사용되는 유산균이라면 특별히 한정되지는 않으나, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 락토바실러스 균주로는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 등에서 선택될 수 있다. 또한 상기 유산균의 배양에 사용되는 배지는 각각의 유산균에 맞게 MRS(Man-Rogosa-Sharpe), 락토오스, M17 및 APT 배지로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 유산균 발효물은 유단백질 마이얄반응물이 포함된 배지에서 유산균을 배양하여 수득된 배양액의 상등액인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구현예에 따르면, 상기 유산균 균주를 접종원으로 하여 종균 배양한 후 마이얄반응물(MRP)이 포함된 배지에 유산균을 접종한 후 20 내지 40℃에서 1일 내지 5일 동안 배양을 진행한 후, 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액을 유산균 발효물로서 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균 발효물은 트롬빈 활성의 저해 및 HMG-CoA 환원효소 활성의 저해를 통해 콜레스테롤 감소 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물은 혈액 응고의 본질인 혈액 속의 가용성 피브리노겐을 가수분해하여 불용성인 피브린으로 변화시켜 혈액을 응고시키는 트롬빈(thrombin)의 활성을 저해시킬 수 있다 (도 2 참조). 또한 심혈관질환을 일으키는 위험요소로서 효소인 HMG-CoA 환원효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase)의 활성을 억제시켜 콜레스테롤 합성을 저해시키는 효과를 나타낸다 (도 3, 4 참조).
종래 심혈관질환 동물모델을 이용한 연구에서는 우유 단백질인 유청 단백질과 카제인이 HMG-CoA 환원효소 생성에 관여하는 HMGR 유전자의 발현을 억제시킨다는 보고가 있으며, (Chung et al. European journal of pharmacology 2008, 578(2-3):159-170). 또한, HMG-CoA 환원효소 저해제인 스타틴(statin) 계열의 물질들이 심혈관치료제로 사용되고 있음이 잘 알려져 있다 (David et al. Clinical pharmacokinetics 2002, 41(6):343-370). 그러므로, 본 발명에 따른 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물은 상기와 같은 HMG-CoA 환원효소의 활성 저해를 통해 심혈관질환의 예방, 개선 및 치료 효과를 나타낼 수 있음은 자명한 것이다.
따라서 본 발명의 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 포함하는 조성물은, 트롬빈 활성의 저해 및 콜레스테롤 감소를 통해 고혈압, 뇌졸중, 협심증, 심부전, 심근경색 및 동맥경화와 같은 심혈관질환의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물 및 기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1 ㎎ 내지 10 g, 바람직하게는 10 mg 내지 5 g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
또한, 상술한 바와 같이, 상기 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 포함하는 기능성 식품 조성물 또한, 우수한 콜레스테롤 저하 효과를 나타낼 수 있다.
상기 “식품”이란 본 발명의 콜레스테롤 저하 효과를 갖는 마이얄반응물의 유산균 발효물을 함유함으로써 일정수준의 약리적 효능을 기대할 수 있는 식품으로서, 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 콜레스테롤 저하용 조성물을 첨가한 것도 포함된다.
본 발명의 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 콜레스테롤 저하용 식품 조성물을 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.1 내지 70 중량부, 바람직하게는 2 내지 50 중량부 첨가될 수 있다. 상기 콜레스테롤 저하용 식품 조성물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 콜레스테롤 저하용 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
상기 콜레스테롤 저하용 식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 유제품, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 유당과
유단백질을
이용한
마이얄반응
생성물의 제조
유단백질(whey protein concentrate, WPC; sodium caseinate, SC)은 서울우유로부터 제공받아 실험에 사용하였으며, 유당은 시그마사(sigma-aldrich, D-Lactose monohydrate, 61345)로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
유단백질과 유당의 마이얄반응을 용이하게 하기 위하여, 0.1 M 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.4)에 시료(WPC+lactose 또는 WPC)를 액체 상태로 섞어서 사용하였다. 55℃의 진탕반응기(shaking water bath)에서 60 rpm으로 7일간 반응을 하였으며, 반응 날짜별로 시료를 취해 75℃에서 보관하였다. 시료내의 반응하지 않은 당을 제거하기 위해서 3,500 MWCO membrane (Molecular Weight Cut Off, Spectra/por Dialysis Membrane MWCO: 3,500, 132720; Spectrumlabs.com에서 구입)을 이용하여 투석을 24시간 동안 진행하였으며, 투석된 시료를 3일간 동결 건조하여 마이얄 반응 생성물(Maillard reaction product, MRP)을 얻었고, 이후 실험에 사용하였다. 이하 실험 결과에서, 사용된 유단백질이 유청단백질(WPC)인 경우에는 wMRP로, 카제인(SC)인 경우에는 cMRP로 각각 표기하였다.
실시예
2.
마이얄반응
생성물(
MRP
)의 제조 검증
실시예 1에서 제조된 MRP 시료는 형광 측정과 SDS-PAGE를 통해 제조 여부를 확인하였다. 단백질의 아미노기와 환원당의 카르보닐기의 마이얄반응으로 생성된 마이얄반응 생성물은 여기(excitation) 370 nm와 방출(emission) 440 nm의 특정 파장에서 형광을 나타내며, 이를 형광분석기(Victor3; Perkin Elmer co.)를 이용하여 측정하였다.
SDS-PAGE는 단백질을 음전하로 코팅하여 폴리아크릴아마이드겔에서 단백질 분자량에 따라 전기영동하는 방법으로 유단백질인 WPC(>14 kDa)가 유당(342.3 Da)과 반응하여 합성되면 단백질 자체 질량보다 무거운 영역에서 전기영동 밴드로 나타나게 된다.
SDS-PAGE 실험에 사용된 방법은 Laemmli’s discontinous법을 따랐으며, 겔은 12% 아크릴아마이드겔을 사용하였고 러닝겔(running gel)과 스택킹겔(stacking gel)의 조성은 하기 표 1과 같다. 모든 시료들은 BCA 정량법에 의해 동량의 단백질 함량(24 μg)으로 로딩(loading)되었으며, 겔 염색은 쿠마시블루 염색(coomassie blue staining)을 실시하였다.
| Reagent | 12% running gel (mL) | 5% stacking gel (mL) |
| H2O | 8.24 | 2.753 |
| 1.5M Tris-HCl | 6.25 (pH 8.8) | 0.5 (pH 6.8) |
| 30% Acryl/bis Acryl | 10 | 0.667 |
| 10% SDS | 0.25 | 0.04 |
| 10% APS | 0.25 | 0.04 |
| TEMED | 0.01 | 0.004 |
도 1a는 본 발명에 따라 제조된 마이얄반응물(MRP)에 대한 형광 측정 결과를 나타낸 그래프이고, 도 1b는 본 발명에 따라 제조된 마이얄반응물(MRP)에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진이다.
도 1a에서, 유단백질(WPC)과 당(Lactose)이 첨가된 반응물(L+WPC) 및 유단백질만 첨가된 반응물(WPC) 모두 24시간 동안 형광도가 증가하였으며, 반응 24시간 때 WPC의 형광도 값은 L+WPC 보다 약 1.42배 높게 나타났다. 또한 도 1b에서, 형광도와 마찬가지로 SDS-PAGE 결과를 보면, 반응하지 않은 WPC에선 보이지 않던 upper band가 WPC와 L+WPC 모두 비슷한 수준으로 생성되었음을 확인하였으며, 24시간 반응으로 MRP의 제조가 잘 이루어졌음을 확인하였다.
실시예
3.
마이얄반응물
유산균
발효물의
제조
마이얄반응물(MRP)의 유산균 발효에 사용된 균주는 Lactobacilli 증균배지로 사용되는 de Man rogosa (MRS) 배지에 3번 계대배양을 진행한 균주로서, Lactobacillus gasseri MF31 (KCCM11532P), Lactobacillus fermentum MF27 (KCCM11534P)을 사용하였다. MRP이 포함된 배지에 107 CFU/ml 수준으로 균을 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 배양을 진행하였다. 배양 후, 배양액을 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 얻은 상등액을 동결건조하여 마이얄반응물의 유산균 발효물(MRP의 12~48시간 발효물)을 얻었고, 이후 실험에 사용하였다. 상기 균주의 배양에 사용된 배지의 조성은 다음과 같다: 글루코오스 2 중량%, GPML 3 중량%, 프로테오스 펩톤(Proteose peptone No.3) 0.1 중량%, 아세트산나트륨(sodium acetate) 0.3 중량%, 구연산암모늄(Ammonium citrate) 0.2%, 디포타슘 포스페이트(Dipotassium phosphate) 0.2 중량%, 황산마그네슘 0.01 중량%, 황산망간(Manganese sulfate) 0.005 중량%, 트윈 80 0.1 중량% (W/V).
실시예
4.
트롬빈
저해 효과
트롬빈 저해능은 Yang 등의 방법(Yang, W. et al., 2007. Chin . Chem . Lett. 18(4):449-451)을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 양성 대조군으로서 피브리노겐(fibrinogen), 트롬빈(thrombin) 및 헤파린(heparin)은 0.12 mM NaCl을 포함하는 0.05 M TrisHCl 버퍼(pH 7.2)에 모두 용해하였다. 0.2% (w/v) 피브리노겐 용액(140 μL)과 40 μL의 샘플을 웰 플레이트에 첨가하고 혼합한 다음, 샘플 플랭크의 흡광도를 405 nM에서 측정하였다. 다음으로, 10 μL의 트롬빈 용액(20 IU/mL)을 상기 웰에 첨가하여 트롬빈-촉매된 피브리노겐 응집(coagulation) 반응을 수행하였다. 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 샘플의 흡광도를 405 nm에서 다시 측정하였다. 헤파린(100 IU/ml)은 양성대조군으로 사용하였고, 저해 효과는 하기 식 1을 이용하여 계산하였다.
[식 1]
항-트롬빈 펩티드(Antithrombotic peptides)는 심혈관질환(Cardiovascular Disease, CVD) 예방 및 치료에 널리 적용되고 있다 (Silva, S. V. et al., 2005. Int . Dairy J. 15(1):1-15). 본 발명에서는 상기 유산균 2종에 의해 발효된 마이얄반응물(MRP)의 가수분해물에 대한 항-트롬빈 효과를 조사하였다.
도 2a는 WPC와 wMRP(0h), 및 발효된 wMRP(12-48h)의 트롬빈 저해 활성을 나타낸 결과이고, 도 2b는 SC와 cMRP(0h), 및 발효된 cMRP(12-48h)의 트롬빈 저해 활성을 나타낸 결과이다.
도 2a에서, 트롬빈 저해 효과는 헤파린을 100%로 하여 비교한 결과로서, WPC는 마이얄 반응(0h)에 의해 저해율이 약 25% 증가하였으며, 발효된 wMRP(12~48h)는 wMRP 보다 약 10% 정도 더 유의하게 증가하였다. 또한 도 2b에서는, SC는 마이얄 반응(0h)에 의해 저해율이 약 20% 증가하였으며, 발효된 cMRP(12~48h)는 cMRP 보다 약 5% 정도 더 유의하게 증가하였다. 이는 유단백질의 마이얄 반응물(MRP)을 유산균 발효-가수분해함으로써 트롬빈 활성의 저해를 더욱 현저하게 증가시킬 수 있음을 보여주는 결과이다.
실시예
5.
HMG
-
CoA
환원효소 저해 효과
HMGR(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase) 저해능은 HMG-CoA 환원효소 분석키트(Sigma Chemical Co. St. Louis, USA)를 이용하여 측정하였다. 180 μL의 분석버퍼, 2 μL의 샘플 또는 양성대조군으로서 프라바스타틴(pravastatin), NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 및 HMG-CoA를 플레이트 웰에 첨가하고, 혼합하여 37℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이 후, HMGR을 상기 웰에 첨가하여 기질 HMG-CoA가 있는 상태로 촉매 서브유닛 HMGR에 의한 NADPH의 산화반응을 수행하였다. 37℃에서 10분 동안 반응 혼합물을 반응시킨 후, 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교를 위해, 활성-블랭크 및 블랭크를 동일한 방식으로 수행하되, 블랭크에 대해서는 HMGR를 첨가하지 않았다. 저해 효과는 하기 식 2를 이용하여 계산하였다.
[식 2]
도 3은 WPC와 MRP(사각형 box), 및 발효된 MRP(12-48h)의 HMGR 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 3a는 WPC와 wMRP(0h), 및 발효된 wMRP(12-48h)의 HMGR 저해 효과를 나타낸 결과이고, 도 3b는 SC와 cMRP(0h), 및 발효된 cMRP(12-48h)의 HMGR 저해 효과를 나타낸 결과이다.
도 3a에서, HMGR 저해 효과는 심혈관치료제인 파라바스타틴을 100%로 하여 비교한 결과로서, WPC는 마이얄 반응(0h)에 의해 저해율이 약 17.8% 증가하였으며, 발효된 wMRP(12~48h)는 wMRP 보다 약 6% 더 유의하게 증가하였다. 또한 도 3b에서는, SC는 마이얄 반응(0h)에 의해 저해율이 약 13.5% 증가하였으며, 발효된 cMRP(12~48h)는 cMRP 보다 약 20% 더 유의하게 증가하였다. 이는 유단백질의 마이얄 반응물(MRP)을 유산균 발효-가수분해함으로써 HMGR 활성의 저해를 더욱 현저하게 증가시킬 수 있음을 보여주는 결과이다.
실시예
6. 콜레스테롤 감소 활성
콜레스테롤 감소 분석은 Kimoto et al. (Kimoto, H. et al., 2002. J. Dairy Sci. 85(12):3182-3188)의 방법을 변형하여 수행하였다. 신선하게 제조된 MRPs-THIO 배지(조성은 하기 표 2 참조)는 산소 스캐빈저로서 0.2% 소듐 티오글리콜산(sodium thioglycolic acid)과 담즙염(bile salt)로서 0.3% 옥스갈(oxgall)을 첨가하였다.
| Ingredienst | modified - MRS | MRPs solution | MRPs - THIO |
| Dextrose | 20 | 20 | 20 |
| Beef extract | - | - | - |
| Proteose peptone No.3 | 0.1 | - | 1.0 |
| Yeast extract | - | - | 1.0 |
| Sodium acetate | 5.0 | - | 5.0 |
| Ammonium citrate | - | - | 2.0 |
| Dipotassium phosphate | 2.0 | - | 2.0 |
| Magnesium sulfate | 0.1 | - | 0.1 |
| Manganese sulfate | 0.05 | - | 0.05 |
| Tween 80 | 1.0 | - | 1.0 |
| MRPs | 30 | 30 | 30 |
상기 배지에 여과-멸균된 콜레스테롤 용액(10 mg/mL in ethanol)을 100 μg/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 배지를 1%의 박테리아 세포(실시예 3에 사용된 균주 샘플)로 접종하여 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 제거하기 위해 15분간 11,000 rpm에서 원심분리한 후, 상층액을 Rudel et al.,의 비색분석법(Rudel, L. and M. Morris. 1973. J. Lipid Res. 14(3):364-366)에 의한 콜레스테롤 양을 측정하였다. 샘플 2 ml 및 97% 에탄올 3 ml을 깨끗한 튜브에 넣은 다음, 50% 수산화칼륨을 첨가하여 충분히 혼합하였다. 혼합물은 60℃ 수조에서 10분간 가온하고, 냉각한 후 5 ml의 헥산을 상기 튜브에 넣었다. 완전히 혼합한 후, 튜브는 상분리(phase separation)를 위해 방치하였다. 그 후, 헥산층 1.5 ml을 다른 깨끗한 튜브에 옮기고, 질소가스 하에서 60℃에서 증발시켰다. 상기 튜브에 OPA 시약(빙초산 ml 당 o-phthaldialdehyde 0.55 mg) 4 ml을 첨가하고 10분간 실온에 방치한 다음, 진한 황산(concentrated sulfuric acid) 2 ml을 튜브 내부에서 천천히 아래로 피펫팅하였다. 튜브를 즉시 격렬하게 혼합한 후, 실온에서 10분간 방치하고, 550 ml에서 흡광도를 측정하였다. 콜레스테롤의 양은 콜레스테롤(0, 50, 100, 150 및 200 μg/mL)을 이용하여 작성된 표준곡선으로부터 계산되었다. 콜레스테롤 감소 효과는 하기 식 3을 이용하여 계산하였다.
[식 3]
도 4는 WPC와 SC, MRPs, 및 유산균 발효된 wMRP, cMPR(MF31, MF27)의 콜레스테롤 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 4에서, WPC와 SC는 마이얄 반응(non-MPRs)에 의한 콜레스테롤 감소 효과는 거의 없었으며, 유산균 발효된 wMRP는 wMRP 보다 약 10% 더 증가하였고, 유산균 발효된 cMRP은 cMPR 보다 약 35% 더 증가하였다. 이는 유단백질의 마이얄 반응물(MRP)을 유산균 발효-가수분해함으로써 콜레스테롤 감소 효과를 현저하게 증가시킬 수 있음을 보여주는 결과이다.
실시예
7. 동물 실험
(1) 실험방법
a) 마우스 모델
항트롬빈 효과를 확인하기 위해, 평균 무게 29 g인 5주령의 60마리 ICR 마우스(Samtako Bio Korea Co., Ltd, Gyeonggi-do, South Korea)를 입수하였다. 총 4개의 처리 그룹(n=15)으로 하여 1주 적응 후 1주 동안 다음과 같이 식이하였다: 음성대조군(NC group)으로서 정상 식이+PBS, 양성대조군(PC group)으로서 정상 식이+아스피린, 정상 식이+wMRP(wMRP group), 및 정상 식이+발효된 wMRP(MF31).
발효된 cMRP의 콜레스테롤 감소 효과를 확인하기 위해, 평균 무게 24g인 6주령의 50마리 C57BL/6 마우스를 입수하였다. 총 5개의 처리 그룹(n=10)으로 하여 1주 적응 후 4주 동안 다음과 같이 식이하였다: 정상 식이 + PBS (NC group), 고콜레스테롤 식이 + PBS (HCD group), 고콜레스테롤 식이 + MF27 균주 (MF27 group), 고콜레스테롤 식이 + cMRP (cMRP group), 및 고콜레스테롤 식이 + 발효된 cMRP (cMPR(MF27) group). 동물들은 개별적으로 그물-바닥(mesh-bottom) 스테인리스 스틸 케이지에서 실온(22.2℃), 12h 밤/낮 사이클로 사육하였다. 마우스들은 자유롭게 물을 섭취하게 하였다.
b)
ICR
마우스에서
항트롬빈
활성
꼬리 절단 출혈 시간(bleeding time)을 Dejana et al. (1979)의 방법에 따라 측정하였다. 마우스 꼬리를 끝에서부터 5 mm에서 절단(transection)한 후 즉시 37℃ 식염수(saline)에 담궜다. 출혈 시간은 꼬리 절단으로부터 60초 이상 출혈이 멈추는 시점으로 측정하였다. 통계분석을 위해, 600초를 초과한 출혈 시간을 컷오프(cut off)로 간주하였다.
항트롬빈 활성은 DiMinno와 Silver (1983)의 방법에 따라 급성 폐색전증(acute pulmonary thromboembolism, APT)이 유도된 마우스 모델에서 평가하였다. ICR 마우스는 밤새 단식시킨 후 사용하였다. 콜라겐 (collagen; 114 μg/mouse)과 에티네프린(epinephrine; 1.83 μg/mouse)의 혼합 용액을 약 20 μL/s의 속도로 꼬리 정맥으로 주사하여, 폐혈전증(pulmonary thrombosis)을 유도하였다. 본 실험에서 마비(paralysis)는 15분 이상 뒷다리의 기능의 상실을 지칭한다. 죽거나 마비된 마우스의 수는 15분까지 기록하였고, 보호 비율(protection percent)은 하기 식 4에 따라 계산하였다.
[식 4]
The protection percent(%)=(1-(dead or paralysed mice)/(total mice))×100
c) 혈청 콜레스테롤 분석
혈액 샘플은 케타민-자일라진(ketamine-xylazine; 90 mg per kg of body weight/10 mg per kg) 투여 후 심장천자(cardiac puncture)로 수집하였다. 대략 1 ml의 혈액을 각 마우스로부터 획득하여, 1.5 mL 튜브에 옮기고, 얼음 상에서 30분간 보관하였다. 튜브들을 2,000 g에서 20분간(4°C) 원심분리하여, 혈청을 수집한 다음, 총 콜레스테롤, 고밀도 지단백질(HDL) 콜레스테롤, 및 저밀도 지단백질(LDL) 콜레스테롤을 상업적으로 입수 가능한 키트를 이용하여 측정하였다.
(2) 실험결과
a)
항트롬빈
활성 측정
꼬리-끝부분 절단 후 마우스에서 출혈 시간을 분석하여, wMRP 및 유산균 발효된 wMRP의 효과를 측정하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이, wMRP 그룹 및 wMRP(MF31) 그룹에서 평균 출혈시간은 각각 224.00±31.30초 및 197.00±12.04초로 나타난 반면, PBS(대조군) 그룹은 82.60 ± 10.14초 동안만 출혈이 있었다 (n=5). wMRP 및 유산균 발효된 wMRP를 마우스에 7일 동안 복강내 주사로 투여하는 경우, 출혈 시간은 253.20±24.12초인 아스피린 만큼 현저하게 길어졌다.
또한, 마우스에서 유도된 APT는 항트롬빈 치료제 및 천연물질을 in vivo에서 탐색하는데 널리 사용되는 모델이다. 콜라겐과 에피네프린의 용액을 꼬리 정맥으로 주사하여 APT를 유도하였다. 죽거나 마비된 마우스의 수는 10분 동안 카운트하여, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| Treatment | Doses |
Paralyzed
or
dead
mice
/ total |
Protection
(%) |
| PBS (control) |
10 mL/kg/day | 12/14 | 14.2 |
| Aspirin | 50 mg/kg/day | 2/15 | 86.6 |
| wMRP | 1500 mg/kg/day | 2/15 | 86.6 |
| Fermented wMRP (MF31) |
1500 mg/kg/day | 1/15 | 93.3 |
표 3에서 볼 수 있듯이, PBS에서 APT의 유도는 즉시 85.8%로 중증 마비되거나 죽었으며 14.2% 보호되었다. 반대로, wMRP 및 유산균 발효된 wMRR로 1주 동안 매일 투여한 경우는 혈전증에 대한 보호가 증가되었으며, 그 보호 비율은 각각 86.6% 및 93.3%였다. 이러한 보호 비율은 아스피린 그룹(양성대조군) 86.6%를 넘는 것이다.
b) 혈청 콜레스테롤 수준의 측정
혈액 지질의 좋지 못한 프로파일은 다양한 심혈관질환의 또 다른 중요한 위험요소이다. 고콜레스테롤 식이한 C57BL/6에서 cMRP, 유산균 및 유산균 발효된 cMRP의 효과를 위해, 혈청 콜레스테롤 수준을 측정하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
| Treatment1 |
Total
cholesterol
( mg / dL ) |
LDL
-
Cholesterol
( mg / dL ) |
HDL
-
Cholesterol
( mg / dL ) |
| ND | 112.4 ± 9.3b | 12.4 ± 2.6d | 125.2 ± 6.9a |
| HCD | 134.0 ± 15.9a | 41.6 ± 4.8a | 106.8 ± 6.7b |
| cMRP | 135.2 ± 18.0a | 42.0 ± 8.7a | 128.8 ± 11.2a |
| L. fermentum MF27 | 111.2 ± 6.1bb | 33.6 ± 6.2b | 109.2 ± 9.9b |
| Fermented cMRP (MF27) |
100.8 ± 9.8b | 24.0 ± 3.2c | 103.6 ± 9.5b |
1ND = normal diet; HCD = high cholesterol diet
표 4는 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 및 HDL 콜레스테롤의 혈청 수준에 대한 MRPs 및 유산균 발효된 MRPs 샘플의 효과를 나타낸 것이다. 표 4에서, 유산균 균주 및 발효된 MRPs를 투여한 그룹에 대한 총 콜레스테롤 수준은 HCD 그룹(134.0±15.9 mg/dL) 보다 현저하게 낮았다 (각각 112.2±6.1 mg/dL 및 100.8±9.8 mg/dL). 두 그룹 모두에 대한 LDL 콜레스테롤 수준 역시 HCD 그룹(41.6±4.8 mg/dL) 보다 현저하게 감소하였다 (각각 33.6±6.2 mg/dL 및 24.0 ± 3.2 mg/dL). 그러나 HDL 콜레스테롤 수준은 변화가 없었다. 특히, 유산균 발효된 cMRP 그룹은 가장 낮은 활성을 보였다.
이상의 결과를 종합하면, 트롬빈 저해, HMGR 저해, 콜레스테롤 감소 활성 측정 결과를 통해 유산균으로 발효한 마이얄반응 생성물의 발효물이 높은 심혈관 보호 기능성을 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 유단백질의 마이얄반응 생성물-발효 가수분해물은 심혈관 보호 기능성 신소재임을 확인하였으며 이를 이용한 유제품 개발을 기대할 수 있다. 또한 제약 및 유가공 산업에 심혈관 보호 활성을 지니는 유단백질 마이얄 생성물 발효 가수분해물을 기초로 하여 심혈관계 질환의 예방 및 치료 등의 다양한 분야에 적용할 수 있을 것이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (9)
- 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 심혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 유단백질은 유청 단백질 또는 카제인 단백질인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 마이얄반응물은 유단백질과 유당을 혼합하여 마이얄반응(Maillard reaction)을 통해 생성되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 또는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 유산균 발효물은 유단백질 마이얄반응물이 포함된 배지에서 유산균을 배양하여 수득된 배양액의 상등액인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 유산균 발효물은 트롬빈 활성의 저해, HMG-CoA 환원효소 활성의 저해, 및 콜레스테롤 감소 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 심혈관질환은 고혈압, 뇌졸중, 협심증, 심부전, 심근경색 및 동맥경화로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
- 유단백질 마이얄반응물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 저하용 기능성 식품.
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