KR20190082159A - 초유의 호기성 발효산물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 초유의 호기성 발효산물에 관한 것으로써, 더욱 상세하게는 초유를 호기성 조건에서 발효 처리하여 얻어진 초유의 호기성 발효산물과 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제조된 초유의 호기성 발효산물은 다양한 피부개선 효과와 항균, 항염, 항여드름, 항아토피 등의 효과를 나타내므로 화장료 조성물로 사용할 수 있으며, 그 외에도 식품조성물, 약제조성물 등으로 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 초유의 호기성 발효산물에 관한 것으로써, 더욱 상세하게는 초유를 호기성 조건에서 발효 처리하여 얻어진 초유의 호기성 발효산물과 그 제조방법에 관한 것이다.
인간이 가지고 있는 기관 중 가장 큰 기관이 피부이다. 피부는 표피와 진피로 구성이 되어있다. 표피는 지속적으로 세포가 분열을 하며, 여러 종류의 층을 만들게 된다. 이때 가장 바깥쪽의 세포들은 죽고 단단해 지게 되어 외부의 스트레스로부터 신체를 보호하여 주는 가장 뛰어난 방어기관 중에 하나이며, 세균 또한 이 피부를 뚫지 못한다.
피부의 경우 피지선과 땀샘을 가지고 있기 때문에 피지선에서는 피지를, 땀샘에서는 수분을 분비하여 인간 스스로 피지 막을 만들어 내고 각질층을 보호하게 되는데, 이 때문에 사람의 피부는 항상 촉촉하며, 윤기가 흐르고 매끄러운 상태를 유지할 수 있게 된다.
사람의 경우 이 각질층의 수분함량이 20%가 되었을 때가 가장 이상적인 피부이며, 아름다움이 한껏 돋보이는 상태이다. 하지만, 수분 함량이 10% 이하로 떨어지게 되면 피부를 지켜주어야 할 각질이 제자리에 있을 수 없고 떨어져 나가거나 그 사이가 벌어지게 되어, 이물질이나 세균의 침투가 용이하게 되어 염증이 생기거나 질병, 알레르기 등이 발생할 확률이 증가한다. 또한, 신진대사를 원활히 못하게 되어 위와 같은 자극이 더 가중된다. 게다가 자연 공해, 자외선, 실내 환경 등에 의해 민감성 피부를 가진 사람들이 증가하고 있는 추세다. 이런 민감성 피부의 경우, 대중적인 피부 화장품 조성물을 사용할 때에 부작용을 일으켜, 홍반, 따가움, 가려움, 심할 경우 염증반응을 나타내게 된다.
화장품이란 피부를 외부로부터 보호, 단장, 청결을 목적으로 하는 것이지만, 화장품의 조성물을 자세히 보게 되면 본래의 뜻과는 다르게 제품의 형성에 있어서 필요한 성분이 들어가게 되고 그 성분들이 오히려 피부를 자극할 수 있다. 예를 들어, 유화제, 향료 그리고 방부제 등이 이에 속한다. 이들은 화학 반응 합성으로 만들어지는 경우가 대부분이기 때문에 민감성 피부의 경우, 염증 반응, 알러지, 홍반 등을 동반할 확률이 증가하게 된다.
이러한 피부에 적용하기 위한 바람직한 기능성을 가지는 화장품으로써 최근 연구된 초유 화장품이 있다. 이는 초유에 함유된 여러가지 유익한 성분에 기초한다고 볼 수 있다.
기존의 초유에는 락토페린(Lactoferrin)이 존재하기 때문에 항염의 효과가 있다. 락토페린의 경우, Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α)나 Interleukin-1(IL-1)등의 조절에 대한 역할을 하는 것으로 익히 알려져 있다(Yamanaka, 2003).
또한, 초유에는 Insulin-like Growth Factor-1(IGF-1)이 함유되어 있는데, IGF-1은 전체적인 성장을 촉진하며, 세포 성장과 증폭을 조절할 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Uruakpa et al, 2002).
초유에 함유되어 있는 카세인(casein)의 경우 우유 전체 성분의 3%, 유단백질중 약 80%를 차지하고 있고, 섭취 시 우리 몸에 알러지를 일으키는 성분으로 밝혀져 있다(G. H. Docena et al, 1996). 또한, 카세인은 화장품 성분으로 쓰이고 있으나, 연구가 충분히 진행되어 있지 않다.
인터루킨(Interleukin)-1(IL-1)은 활성화 된 단핵식균세포, 상피세포 또는 혈관내피세포 등 여러 세포에서 만들어지며, 염증반응을 매개하는 사이토카인(cytokine)의 한 종류이다. 또 다른 대표적인 염증성분에는 cytokine Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α)가 존재한다.
반대로 염증 반응을 감소시키는 사이토카인도 있는데 Interleukin-10이다. Interleukin-10의 경우는 대식세포에 존재하는 inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 inducible cyclooxyganase(COX-2) 등 염증과 관계되는 효소의 표현을 억제하는 역할을 한다.(Niiro, Hiroaki, et al, 1995)
그 외에도, 초유에는 각질제거 성분이 함유되어 있으며(권유빈, et al. 2007), 멜라닌 색소를 억제하여 미백효과를 야기하는 TGF-beta가 함유되어 있는 것으로도 알려져 있으며(Martinez-Esparza M, et al, 1997), 또한 초유에는 보습효과가 뛰어나다고 증명된 히알루론산이 많이 함유되어 있다(Pedersen, et al, 2014).
기존에 이러한 초유를 이용한 화장품 조성물로써, 한국등록특허 제10-0964831호에서는 초유를 유효성분을 함유하는 피부 각질분화 촉진용 화장료 조성물이 제안되어 있는데, 여기서는 초유 성분이 항염, 항알러지, 보습 효과에 대해 설명하고 있는 등 초유 성분의 피부 각질분화 촉진 효능을 비롯한 화장품 적용의 다양한 유용성에 대해 설명하고 있다.
또한, 한국등록특허 제10-0619289호에서는 초유의 알부민을 미백제인 알부틴과 연계한 미백 화장품의 제조방법에 대해 공지되어 있고, 미국등록특허 제5750149호에서는 말의 초유로부터 유래되는 물질을 함유하는 화장품에 관한 기술이 제안되어 있다.
그러나 이러한 초유의 가공기술은 화장품에 적용하기 위하여 단순하게 초유 성분을 활용하는 것에 불과하고, 일부에서는 초유를 발효하여 화장품이 아닌 다른 용도로 적용하는 기술이 제안되어 있다.
그 예로써, 한국특허공개 제2002-0021908호에서는 초유에 젖산균을 첨가하여 발효시킨 발효산물을 주재로 함을 특징으로 하는 초유를 이용한 건강보조식품에 관하여 제안하고 있으며, 분유, 액상 요구르트, 분말 요구르트, 장용캡슐 제품 등에 이용하는 것을 교시하고 있다.
또한, EP 2376644 B1에서는 유산균과 유청 혼합물을 혐기성 조건에서 발효시켜 식품첨가물로 사용하는 기술이 제안되어 있으며, 일본특허등록 제4512265호에서는 우유를 불활성 기체의 혐기조건에서 유산균으로 배양하는 기술이 제안되어 있고, 그 외에도 초유 유산균 발효기술에서는 저온 발효나 혐기성 발효기술에 의해서만 발효가 원활하게 이루어지는 것으로 알려져 있다. 특히 기존에 우유를 혐기성 조건에서 유산균으로 발효시켜서 치즈나 요구르트 등으로 제조되는 것으로 잘 알려져 있다.
이와 같이 종래 기술에서 초유를 발효시킴에 있어서는 혐기조건에서 발효를 진행하는데 이는 초유가 쉽게 부패하고, 외부 공기와 접촉하는 경우 세균 등으로 인해 그 부패정도가 더욱 촉진되는 문제가 있기 때문이다.
그러므로 기존에는 초유의 발효를 위해 혐기조건에서 발효가 이루어져야 하는 부담감으로 인해 발효 공정이 복잡하고 저온에서 발효하였고. 특히 발효 초기에 발효가 잘 이루어지지 않는 등의 문제점이 있었다.
또한, 초유를 혐기성 조건에서 발효하는 경우 발효균의 활성이 저하되어 발효산물의 역가가 저하되는 문제도 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고 초유 성분의 활용성을 연구하던 결과를 토대로 하여, 초유 성분을 발효 처리함에 있어서 보다 간편한 발효공정으로도 고품질, 고효율로 발효가 가능하도록 하는 것을 해결과제로 한다.
따라서 본 발명의 목적은 초유를 호기성 조건에 발효하여 얻어진 초유의 호기성 발효산물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 초유를 호기성 조건에서 간단하게 발효 처리하여 발효산물을 얻을 수 있도록 하는 초유의 호기성 발효산물의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 과제 해결을 위하여, 본 발명은 초유가 호기성 조건에서 발효균에 의해 발효되어 이루어진 초유의 호기성 발효산물을 제공한다.
또한, 본 발명은 초유를 호기성 조건에서 발효균으로 발효하는 단계를 포함하는 초유의 호기성 발효산물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 초유의 호기성 발효산물을 포함하는 화장료 조성물, 식품조성물 또는 약제조성물을 포함한다.
본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물은 천연 성분인 초유에 함유된 유효성분을 보다 증대시키고 나아가 발효 효율을 개선함으로써 기존의 초유나 우유 등 유사 성분에 비해 우수한 활성성분이 함유되어 있다.
특히, 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물은 그 제조가 간단하고 용이하며, 종래부터 식품제조에 이용되고 있는 천연 미생물을 이용한 것이므로 안전성이 높다. 또한, 호기성 발효에 의해 얻어진 초유의 호기성 발효산물은 기존에 비해 각종 피부개선 효과와 항여드름, 항균, 항아토피, 항염 효과 및 피부자극완화 효과를 나타낸다.
그러므로 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물을 이용하여 화장품을 제조하는 경우 기존 초유성분에서 발현되는 주름개선, 미백, 보습, 각질 제거 효과 이외에도 항여드름, 항균, 항아토피, 피부염증 및 피부트러블의 완화 효과를 얻을 수가 있어서, 화장품, 식품, 의약품 제조에 매우 유용한 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 일 구현예로써, 실시예에서 적용한 호기성 발효산물의 제조과정의 일예를 도식화한 공정도이다.
도 2는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 세포 독성 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 타이로시나제 활성저해시험을 활용한 미백 효과 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 멜라닌 생합성 저해능 측정 시험을 활용한 미백효과 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 AQP3 mRNA 발현양 확인을 활용한 보습능 실험결과 중 비교예 1, 비교예 2를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 AQP3 mRNA 발현양 확인을 활용한 보습능 실험결과 중 비교예 3, 실시예 1을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 히알루로니데이즈 활성저해능 측정을 활용한 보습능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 수분 손실량 측정을 활용한 보습능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 콜라게네이즈 활성 저해능을 활용한 주름개선효과 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 세라마이드 합성능을 활용한 주름개선효과 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 콜라겐 합성능을 활용한 주름개선효과 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 SOD활성 저해율 측정을 활용한 항산화효능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 XOdase 활성 저해능을 활용한 항산화효능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 DPPH를 활용한 항산화효능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 PGE2 생성 억제능을 활용한 항염효능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 세포 독성 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 타이로시나제 활성저해시험을 활용한 미백 효과 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 멜라닌 생합성 저해능 측정 시험을 활용한 미백효과 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 AQP3 mRNA 발현양 확인을 활용한 보습능 실험결과 중 비교예 1, 비교예 2를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 AQP3 mRNA 발현양 확인을 활용한 보습능 실험결과 중 비교예 3, 실시예 1을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 히알루로니데이즈 활성저해능 측정을 활용한 보습능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 수분 손실량 측정을 활용한 보습능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 콜라게네이즈 활성 저해능을 활용한 주름개선효과 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 세라마이드 합성능을 활용한 주름개선효과 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 콜라겐 합성능을 활용한 주름개선효과 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 SOD활성 저해율 측정을 활용한 항산화효능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 XOdase 활성 저해능을 활용한 항산화효능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 DPPH를 활용한 항산화효능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물에 대한 실험예로써, 실시예에서 제조된 초유의 호기성 발효산물의 PGE2 생성 억제능을 활용한 항염효능 실험결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하나의 구현예로써 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 초유에서 얻어지는 보다 활용성이 우수한 발효산물로써 초유를 호기성 조건에서 발효균으로 발효하여 얻어지는 새로운 조성의 초유의 호기성 발효산물에 관한 것이다.
일반적으로 발효에 관계되는 미생물은 효모, 사상균, 방선균, 유산균 등이 있으며, 유기물과 수분 등이 적당한 온도가 되면 발효가 진행된다.
발효는 호기성 조건과 혐기성 조건에서 발효를 진행할 수 있는바, 통상적으로 식품의 경우는 대개 혐기성 발효과정에서 포도당이나 알코올, 아미노산 등이 생성될 수 있다.
또한, 대부분의 발효식품들은 혐기성 미생물의 발효과정을 이용하고 있다. 특히, 초유와 같이 쉽게 부패하는 특성을 가지는 물질은 혐기성 조건에서 발효를 시행하지 않으면 세균 번식으로 부패가 신속하게 진행되어 혐기성 조건에서 발효시킨다.
예컨대, 김치의 경우 로이코노스톡균이나 젖산균 등의 미생물들이 이용되고 있고 치즈나 요구르트의 경우에도 많은 유산균들이 이용되고 있으나, 호기성 조건에서는 잘 분해되지 않아 대부분 혐기성 발효에 관여하는 광합성균, 유산균, 비호기성 유산균, 효모 등의 혐기성 미생물을 사용하고 있다.
혐기성 미생물은 유리산소가 존재하는 물속이나 땅속에서는 활동을 하질 못하고 유리산소가 없는 산소 결핍상태에서 활발히 활동하는 미생물로써, 산화물의 산소를 뺏어 호흡하는 혐기성 발효 조건에서 발효열은 45℃를 넘지 않고 저온 발효가 이루진다. 특히, 이러한 혐기성 발효조건에서는 젖산, 낙산 등의 유기산이 생성되므로 초유의 발효는 혐기성 조건에서 발효하는 것이 당연시되고 있다.
그러나 본 발명은 식품으로 호기성 조건에서는 쉽게 부패하고 발효가 이루어지지 않는 것으로 알려져 당연하게 혐기성 조건에서 원활하게 발효가 이루어지는 것으로 알려진 초유의 발효를 전혀 예측하기 어려운 호기성 조건에서 발효하는 새로운 개념을 제시하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 초유에 대한 호기성 발효 조건은 15-50℃, 더욱 바람직하기로는 20-38℃에서 특별한 공정 조건없이 시행될 수 있다. 즉, 별도의 불활성 기체가 필요 없고, 공기 존재 하에 매우 간편하게 이루어질 수 있다.
본 발명에 따르면, 이러한 호기성 조건에서 초유의 발효는 기존에 예측할 수 없었던 것으로써, 초유를 매우 간단하고 용이한 공정조건에서 경제적으로 제조할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이러한 호기성 조건에서 초유 발효에 적용되는 발효균으로써, 통상 혐기성균, 유산균, 곰팡이 등이 전형적으로 적용될 수 있다. 더욱 바람직하게는 예컨대 유산균 또는 유산균과 다른 발효균, 예컨대 스트렙토코커스균(Streptococcus)이 복합균으로 바람직하게 사용될 수 있다.
발효균으로 적용할 수 있는 유산균으로써는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus), 락토바실러스 람노서스지지 (Lactobacillus rhamnosus GG), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 등이 사용될 수 있고, 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) 등이 사용될 수 있으며, 스트렙토코커스 균으로써, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)가 사용될 수 있고, 그 외에도 엔테로코커스(Enterococcus), 락토코커스(Lactococcus) 등이 사용될 수 있다.
이러한 발효균의 일 예로써는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus)와 락토바실러스 람노서스지지 (Lactobacillus rhamnosus GG) 중 하나 이상의 유산균, 또는 락토바실러스균(Lactobacillus)과 스트렙토코커스균(Streptococcus)이 혼합된 복합 유산균을 포함하는 유산균으로 바람직하게 발효될 수 있다.
그러므로 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이러한 발효균의 호기성 발효에 의해 얻어지는 초유의 호기성 발효산물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따라 얻어지는 초유의 호기성 발효산물은 기존에 비해 초유의 유익한 성분이 더욱 과량으로 함유되고, 기존에 비해 현저하게 개선된 발효산물의 물성을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 적용되는 초유의 호기성 발효는 지방이 제거된 초유에 적용할 수 있다. 이 경우 발효 공정상으로나 발효 후 얻어지는 발효산물의 특성 면에서 모두 더욱 바람직한 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 초유에 대한 지방제거는 부분적으로 또는 실질적으로 완전하게 지방이 제거된 경우를 모두 포함한다. 이러한 지방의 제거는 통상적인 원심분리법, 여과방법, 지방 응집제 이용방법 등으로 수행될 수 있다.
본 발명은 발효 원료로써 초유를 효율적으로 사용하여 그 활용성을 높이고자 하는 것에서 출발한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 초유가 특정 락토바실러스균(Lactobacillus)인 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus) 또는 락토바실러스 람노서스지지(Lactobacillus rhamnosus GG)를 포함하는 유산균으로 호기성 조건에서 발효된, 초유의 호기성 발효산물을 제공할 수 있다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 초유가 락토바실러스균(Lactobacillus)과 스트렙토코커스균(Streptococcus)이 혼합된 복합 유산균을 포함하는 유산균으로 호기성 조건에서 발효된, 초유의 호기성 발효산물을 제공할 수 있다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 초유가 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus), 락토바실러스 람노서스지지 (Lactobacillus rhamnosus GG) 중에서 선택된 하나 이상의 유산균과 여기에 스트렙토코커스균(Streptococcus), 더욱 좋기로는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)를 혼합한 복합 유산균을 포함하는 유산균으로 호기성 조건에서 발효된, 초유의 호기성 발효산물이 제공될 수 있다.
본 발명에서 발효 원료로써 사용되는 초유는 통상적으로 분만 후 3일 이내에 짠 젖을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명은 발효 원료로써 사용되는 초유는 바람직하게는 소 초유를 사용할 수 있고, 여기서 초유는 통상적으로 염소, 산양 등 가축동물의 초유를 포함하는 개념이며, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 초유를 이용하기 위해서는 예컨대 초유를 급속 냉각한 다음 저온살균 처리하여 발효원료를 준비하는 단계를 거친다.
본 발명에서의 저온살균 처리는 통상의 저온 살균법에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계에서 얻은 발효원료에 발효균을 접종하고 발효하여 발효액을 얻는 단계를 거친다.
예컨대, 유산균이나 유산균을 포함하는 복합 유산균을 적용하는 경우 초유의 락토페린과 함께 항균, 항염 효과를 증진시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 예컨대 유산균으로 사용되는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus)와 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)는 두 균의 서로에게 폴리아민을 제공하여 산화적 스트레스로부터 스스로를 지킬 수 있게 된다는 점에서 혼합 사용의 경우 더욱 바람직한 상승효과를 기대할 수 있다.
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 락토바실러스균(Lactobacillus)과 스트렙토코커스균(Streptococcus)이 혼합된 복합 유산균을 사용하는 경우는 젖산의 생성을 바람직하게 유도하고 항균, 항염 효과를 증진시키므로 상기와 같은 상승효과를 기대할 수 있을 것이다.
예를 들어, 바람직한 예로써 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus), 락토바실러스 람노서스지지(Lactobacillus rhamnosus GG) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 등 상기 3종의 균을 함께 사용하는 경우에는 더욱 증진된 상승효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 발효 원료인 저온 살균한 초유에 발효균을 접종하고 온도 15-50℃에서 30~120분간 발효시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 호기성 발효 과정을 거친 다음에는 이를 원심분리하여 발효액을 얻는 단계를 거쳐서 초유의 호기성 발효산물을 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명이 초유의 호기성 발효산물은 카세인이 제거된 것일 수 있다.
따라서 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 초유의 호기성 발효산물은 바람직하게도 추가적으로 상기 발효액을 효소를 이용하여 발효추출물을 얻는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면 상기 발효액을 효소를 이용하여 발효추출물을 얻는 단계는 예컨대, 호기성 발효과정을 거친 초유 발효액을 정제하기 위한 응집과정을 거치는 것이 바람직하다.
그러므로 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 발효액을 효소를 이용하여 응집하여 호기성 발효산물을 추출물 형태로 얻는 단계를 포함할 수 있다.
이 과정에서는 유산균 발효에 의해 얻어진 발효액에 함유된 카세인(casein) 등의 부정적 영향을 줄 수 있는 것들을 제거하기 위하여, 또는 유단백질 중 함유량이 많은 카세인을 제거함으로써 기능성 성분 함량을 증가시킬 수 있다. 그러므로 효소를 첨가하여 응집반응을 통해 카세인 등의 성분을 제거하는 과정을 거치는 것이다.
따라서 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 효소 첨가 이후에는 추가적으로 효소 첨가물을 원심분리하고 여과하는 단계를 포함하는 정제 과정을 포함할 수 있다. 이러한 과정을 거친 후, 보다 정제된 발효산물인 유산균 발효 초유 추출물 형태로 초유의 호기성 발효산물을 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 카세인 등의 제거를 위해 사용되는 효소로써는 예컨대 응고효소 역할을 위한 효소 복합체를 사용할 수 있으며, 구체적으로는 예를 들어 렌넷(rennet)을 바람직하게 사용할 수 있다.
여기서 예시된 렌넷은 반추동물의 배속에 있는 효소 복합체를 뜻한다. 즉, 렌넷은 단백질 가수 분해 효소의 하나인 레닌(rennin)을 함유하는 응고효소(凝固酵素)로써, 송아지의 위액(胃液) 속에 펩신과 함께 들어 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 렌넷은 우유에 작용하여 카세인을 침전시키는 특성을 가지는 것으로 알려져 있고, 소의 위장 효소 렌넷을 사용해 짧게 숙성시킨 치즈는 향이 좋고 입에 닿는 느낌이 매끄럽다고 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 효소는 상기 언급한 렌넷과 유사한 성질을 나타내는 효소를 모두 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명에 따르면, 이러한 렌넷으로 대표되는 효소를 사용하는 경우 유산균 발효 초유에 함유된 카세인과 응집반응을 일으켜 카세인을 제거하는데 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 효소 첨가 과정에서는 바람직하게는 호기성 조건 발효 후 얻어진 초유의 호기성 발효액을 30~40℃에서 효소를 첨가한 다음 30~120분간 응집시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 효소 첨가 과정에서는 추가적으로 이렇게 카세인 등의 성분에 대한 응집과정을 거친 다음 원심분리하고 여과하여 발효액을 회수하는 단계를 거칠 수 있다. 이러한 과정을 거침으로써 카세인 성분이 실질적으로 제거된 초유의 호기성 발효산물을 얻을 수가 있는 것이다. 이렇게 얻어진 초유의 호기성 발효산물은 예컨대 카세인이 제거된 호기성 발효산물의 추출물 형태로 제조될 수 있는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 다른 예로써 이와 유사한 방법을 적용하여 초유의 발효 전에 지방과 카세인이 제거된 형태로 발효산물을 제조할 수도 있다.
그러므로 본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명은 지방이 제거된 초유로부터 호기성 발효에 의해 얻어지는 초유의 호기성 발효산물을 포함한다. 이 경우 지방은 전혀 함유되지 않은 경우이거나, 실질적으로 전부 제거되거나 일부 제거된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로써, 지방 및 카세인이 제거된 초유에 발효균을 호기성 조건에서 발효시켜 수득한 초유의 호기성 발효산물로 제조될 수 있다. 본 발명에 따르면 이러한 카세인 제거는 상기와 유사하게 렌넷 처리에 의해 카세인이 제거된 초유가 사용될 수 있다.
또 다른 구현예로서는 지방 및 카세인이 제거된 초유를 발효균으로 호기성 조건에서 발효시켜 수득한 초유의 호기성 발효산물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기와 같이 발효 전에 카세인을 제거한 다음 발효원료를 이용하여 발효한 경우, 발효 후에도 상기와 같은 카세인 제거 공정을 추가로 시행할 수 있다.
그러므로 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 초유의 호기성 발효산물은 초유의 발효 전, 발효 후 또는 발효 전후에 카세인이 제거된 것으로부터 바람직하게 얻어질 수 있다.
또 다른 경우로써, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 예컨대 초유의 호기성 발효물을 예컨대 렌넷으로 처리하거나 다른 방법으로 처리하여 글리코마크로펩타이드(Glycomacropeptide, GMP)를 함유하는 초유의 호기성 발효산물로 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 초유의 발효산물에 글리코마크로펩타이드가 함유된 발효산물은 제조된 바 없다. 이러한 글리코마크로펩타이드는 치즈 제조 과정에서 생성되는 것으로 알려져 있지만 물에 잘 녹는 특성이 있어서 치즈 제조 부산물과 함께 제거되어 버려지게 된다.
일반적으로 글리코마크로펩타이드는 당성분이 상당량 함유되어 있지만, 대장균이나 비브리오균이 생산하는 미생물의 독소를 중화시키는 능력이 있고 면역의 활성을 증대시켜주는 능력과 장내 비피더스균의 증식을 도와주고 혈압강하와 혈액응고를 줄여줌으로써 혈류의 흐름을 원활하게 해주는 등의 기능이 있다. 또한, 충치균이 치아에 부착되는 것을 막아 주어 치아 건강에도 좋다.
또한, 글리코마크로펩타이드에 함유되어 있는 사이알린산 성분은 동물실험결과 뇌기능의 발달과 기억력 증진에도 효과가 있다.
그 외에도, 소화기능의 증진, 식욕조절, 췌장의 소화효소 분비, 소장 내 콜레시스토키닌의 분비를 촉진하여 피부 미용에도 영향을 준다.
따라서 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물은 글리코마크로펩타이드를 함유하여 건강기능식품으로 유용하다. 또한, 해당 증상의 개선을 위한 약제 조성물로도 유용하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물은 글리코마크로펩타이드를 0.001-15중량%로 함유할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 초유의 호기성 발효산물은 추가적으로 여과하여 살균하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따라 얻어진 초유의 호기성 발효산물은 제조 후에 2회 또는 수회의 여과를 거쳐 혹시 있을지 모를 균을 제거하여 사용할 수도 있다.
본 발명에 따라 상기와 같은 단계를 거쳐 얻은 초유의 호기성 발효산물의 일예로써, 기존에 초유로부터 유래된 어느 성분과도 상이한 매우 유용한 성질을 나타내는 것으로 확인되었다.
따라서 이러한 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물은 초유를 혐기성 조건에서 발효하는 것으로 알려 있던 발효균을 호기성 조건으로 발효하여 얻어지는 발효액, 실질적으로 카세인이 제거된 발효액, 살균 처리된 발효액, 발효액이 정제 처리된 추출물 중에서 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물로써 가장 바람직한 유형의 일예는 발효액을 정제하여 카세인이 함유되지 않고 살균 처리한 정제된 추출물 형태일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 초유의 호기성 발효산물은 바람직한 일예로서는 발효균으로 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)와 락토바실러스(Lactobacillus)로 초유를 발효하여 얻은 용해물을 여과한 락토바실러스 스트렙토코커스 써모필러스 초유 발효 용해 여과물인 것을 특징으로 하는 초유의 호기성 발효산물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기와 같이 초유를 호기성 조건에서 발효 처리함으로써 종래와는 달리 우수한 효과를 나타낼 수 있으며, 특히 발효균의 조합과 선택에 따라서는 더욱 좋은 상승효과를 발휘할 수 있으며, 호기성 발효산물은 기존에 비하여 월등하게 우수한 활성을 나타내는 것이 확인되었다.
이와 같이, 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물, 예컨대 특히 초유 발효 추출물은 초유의 호기성 발효산물의 제조과정에서 GMP가 생성되어 함유된 것으로 확인되며, 이러한 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물은 사이토카인 발생의 억제, 항균, 항염, 항여드름, 항아토피 효과와 주름개선, 미백, 보습, 피부개선 등의 효과를 얻을 수 있는 놀라운 효과가 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 초유의 호기성 발효산물은 기존의 우유나 초유와는 달리 여드름 원인균인 Propionibacterium acnes균에 대한 실질적인 항여드름 활성을 나타내면서 초유 호기성 발효산물에 함유된 다양한 성분들에 의해 피부환경을 개선해 줌으로써, 천연 화장품으로 여드름이 생기지 않도록 피부환경을 만들어 줄 수 있으므로 항여드름용 화장료로 적합하게 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 초유 호기성 발효산물은 기존의 우유나 초유와는 달리 보습 및 항아토피 효과를 나타내므로 이를 이용하는 용도의 화장료로 적합하게 이용될 수 있다. 또한, 아토피와 유사한 건선, 태선 등의 치료에도 효과가 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 초유 발효산물은 멜라닌 생성을 유발하는 Tyrosinase 효소를 억제하여 실질적인 피부미백 활성을 나타내면서 초유 발효산물에 함유된 다양한 성분들에 의해 피부환경을 개선해 줌으로써, 천연 화장품으로 피부에 색소침착 등이 생기지 않도록 피부환경을 만들어 줄 수 있으므로 피부미백용 화장료로도 적합하게 이용될 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물은 호기성 발효에 의해 우수한 유익 성분 구성을 가질 수 있으며, 특히 사이토카인 발생의 억제, 항염 활성 등 유용한 효과에 대한 효과를 얻음과 동시에 정제 과정을 거치는 경우 카세인 등에 의한 단점을 배제하고 기능성 성분의 함유량을 증가시킴으로써, 다양한 피부 개선 효과와, 항염, 항균, 항여드름, 항아토피 등의 효과를 동시에 얻을 수가 있는 예측할 수 없었던 우수한 효과를 나타낼 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 초유의 호기성 발효산물을 포함하는 항염 및 피부자극완화용 화장료를 제공한다.
한편, 본 발명은 초유가 발효균에 의해 호기성 조건에서 발효되어 이루어진 초유의 호기성 발효산물을 포함하는 식품 조성물을 포함한다. 이러한 호기성 발효산물은 식품으로 섭취하더라도 유사한 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 초유의 호기성 발효산물을 포함하는 식품 조성물은 특히 주름개선, 미백, 보습, 항아토피 항여드름, 항염, 항균, 피부자극완화 중에서 선택된 하나 이상의 유효성분으로 함유하는 피부미용 증진용 식품조성물, 바람직하게는 건강기능식품으로 활용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물은 약제 조성물로도 활용이 가능하므로 본 발명은 초유의 호기성 발효산물을 유효성분으로 함유하는 약제조성물을 포함한다. 이러한 약제 조성물로서는 아토피, 건선, 태선 등의 치료용 약제 조성물로 적용 가능하다. 그 외에도 주름개선, 미백, 보습, 항여드름, 항염, 항균, 피부자극완화 등을 위한 피부미용개선용 약제조성물로서 적용 가능하다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 효과의 초유의 호기성 발효산물을 제조하기 위하여, 초유를 급냉한 다음 저온 살균 처리하여 발효원료를 준비하는 단계; 상기 단계에서 얻은 발효원료에 발효균을 접종하고 호기성 조건에서 발효하여 발효액을 얻는 단계를 포함하는 초유의 호기성 발효산물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발효산물을 추가적으로 효소를 이용하여 발효추출물을 얻는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 초유의 호기성 발효산물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 초유의 호기성 발효산물을 함유하는 화장료 조성물의 경우 염증유발 사토카인의 발생을 억제하고 인터루킨-10(Interleukin-10) 발현이 촉진됨으로써 매우 유의성이 있는 피부의 항염 및 피부자극완화 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화장료 조성물에서 초유의 호기성 발효산물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.01~40중량%의 양으로 함유될 수 있다. 상기의 함량 범위의 하한치를 벗어나면 그 효과가 현저하게 감소되며, 상한치를 벗어나면 화장료 제형으로 제조하기 곤란하거나, 경제적인 측면에서 바람직하지 아니하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기와 같은 방법으로 제조된 초유의 호기성 발효산물은 화장료 조성물에 여러 가지 성상으로 첨가할 수 있으며, 예컨대, 분말상, 액상, 나노캡슐, 복합체 등의 형태로 첨가될 수 있으며, 바람직한 예로써는 액상으로 첨가될 수 있다.
본 발명에 따르면, 초유의 호기성 발효산물이 함유된 화장료 조성물을 이용한 화장품으로써는 화장수(스킨로션), 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 영양에센스, 클렌져, 마스크팩 등의 화장료 제형으로 사용될 수 있으며, 특별히 여기에 한정하는 것은 아니며, 기타 모발용 제제나 다양한 기능성 효과를 위한 피부용 제제에 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 화장료 조성물에 함유된 초유의 호기성 발효산물은 그 제조과정에서 사용된 원료는 초유이고 이를 발효하는데 사용된 발효균은 종래부터 식품제조에 이용되고 있는 천연 미생물이므로 추출물 자체에 대한 안전성이 높다. 특히, 호기성 발효를 통해 상승효과로 발현되는 우수한 피부개선 효과인 주름개선, 미백, 보습효과와 항균, 항아토피, 항여드름, 항염 및 피부자극완화 효과로 인하여 이러한 성분이 함유된 화장품을 피부에 사용하는 경우 염증 발생을 사전에 예방할 수 있는 신개념 화장품 조성물로 매우 유용할 것으로 기대된다.
그러므로 본 발명에 따른 초유의 호기성 발효산물은 예컨대 이를 유효성분으로 하는 약제 조성물로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 주름개선, 미백, 보습효과와 항균, 항아토피, 항여드름, 항염 및 피부자극완화용 약제 조성물로 이용될 수 있다.
이러한 본 발명에 따른 약제 조성물은 캡슐제, 정제, 그래뉼, 환제, 액제, 피부연고제 등으로 제형화하여 다양하게 활용할 수 있으며, 예컨대 200mg/g, 500mg/g, 700mg/g의 함량으로 1일 1-3회 경구 투여하거나 피부연고제의 경우 50mg/ml, 100mg/ml, 200mg/ml, 400mg/ml 등의 다양한 함량으로 제형화될 수 있으며, 이를 1일 수회 피부에 도포하여 적용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
초유로부터 호기성 발효산물을 제조하기 위하여 도 1의 공정도와 같은 과정을 거쳐서 초유의 호기성 발효산물을 제조하였다.
각 단계별 과정은 다음과 같이 실시하였다.
제1단계 : 원료 준비
갓 짠 소의 초유를 급속 냉각한 후 항온수조에 넣어 초유의 온도가 63℃가 된 후부터 30분간 살균처리한 후 35℃까지 온도를 낮추어 발효 원료를 준비한다.
제2단계 : 유산균 발효액의 제조
발효균으로 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus , ATCC 11842), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus , ATCC 19258), 락토바실러스 람노서스지지(Lactobacillus rhamnosus GG , ATCC 53103)의 3종의 복합균을 상기 제1단계의 발효 원료에 접종하고 호기성 조건에서 온도 35℃에서 60분간 발효시켜 발효물(발효액)을 얻는다.
제3단계 : 유산균 발효 초유 추출물의 제조
상기 제2단계에서 얻은 발효액을 2000rpm, 20분 원심분리하여 부유물을 제거하고 침전물을 제외한 상층액을 회수하여 발효초유액을 초유의 호기성 발효산물로 얻는다.
상기 발효 초유액을 33℃로 맞추고 렌넷(Rennet)을 첨가하여 60분간 응집시킨 후 발효액 초유가공물을 회수한다. 상기에서 얻은 발효액 초유가공물을 13000rpm에서 60분 원심분리하여 상층액을 유산균 발효산물인 발효 초유 추출물로 얻는다.
상기 상층액을 0.4 ㎛와 0.2㎛의 여과지로 2차 여과시킨 후 최종적인 초유의 호기성 발효산물로써 유산균발효 초유 추출물을 제조하였다.
실시예 2 - 7
상기 실시예 1에서 제1단계의 발효 원료에 접종시킨 균 또는 복합균 등의 발효균을 하기 표 1과 같이 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 초유의 호기성 발효산물을 제조하였다.
| 구분 | 사용 균주 |
| 실시예 2 | 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus , ATCC 11842) |
| 실시예 3 | 락토바실러스 람노서스지지(Lactobacillus rhamnosus GG , ATCC 53103) |
| 실시예 4 | 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus , ATCC 11842) + 락토바실러스 람노서스지지 (Lactobacillus rhamnosus GG , ATCC 53103) |
| 실시예 5 | 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus , ATCC 11842) + 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus , ATCC 19258) |
| 실시예 6 | 락토바실러스 람노서스지지(Lactobacillus rhamnosus GG , ATCC 53103) + 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus , ATCC 19258) |
| 실시예 7 | 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus , ATCC 19258) |
비교예 1
상기 실시예 1에서 발효원료를 우유로 대체하고, 원료에 발효균을 접종하지 아니한 채 실시예 1과 동일한 방법으로 우유 산물을 제조하였다.
비교예 2
상기 실시예 1에서 발효 원료를 우유로 대체하여 실시예 1과 동일한 방법으로 우유 발효산물을 제조하였다.
비교예 3
상기 실시예 1에서 원료에 발효균을 접종하지 아니하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 초유 산물을 제조하였다.
비교예 4
상기 실시예 1에서 호기성 조건 대신 혐기성 조건에서 발효하여 초유의 혐기성 발효산물을 제조하였다.
비교예 5
상기 실시예 1에서 원료에 지방을 제거하지 아니하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 초유 발효 산물을 제조하였다.
실험예 1 : 악취 비교 실험
화장품에 있어 향은 소비자에게 가장 먼저 호감을 살 수 있는 요소 중 하나이다. 따라서 화장품 원료를 생산함에 있어, 악취를 덜 나게 하거나 없애는 것이 바람직하다.
따라서 실시예 및 비교예에 따른 산물에 대하여 악취 비교 실험을 진행하였다.
실험 방법으로는 피시험자 성인 남녀 20명(남자 10명, 여자 10명)에게 실시예1, 비교예 1, 2, 3, 4, 5 원료 냄새를 맡게 한 후 악취 정도를 하기 판정기준에 따라 판정하였다.
- 0.0(무취) : 상대적인 무취로 평상시 후각으로 아무것도 감지 못하는 상태
- 1.0(감지냄새) : 무슨냄새인지 알 수 없으나 냄새를 느낄 수 있는 정도의 상태
- 2.0(보통냄새) : 무슨냄새인지 알 수 있는 정도의 상태
- 3.0(강한 냄새) : 쉽게 감지할 수 있는 정도의 강한냄새
- 4.0(극심한 냄새) : 아주 강한 냄새
- 5.0(참기 어려운 냄새) : 견디기 어려운 강렬한 냄새로써 호흡이 정지될 것 같이 느껴지는 정도의 냄새
하기 표 2에 나타난 바와 같이, 비교예에 비하여 실시예 1의 호기성 발효산물이 악취가 가장 약한 것을 확인할 수 있었다.
| 비교예1 | 비교예2 | 비교예3 | 비교예4 | 비교예5 | 실시예1 | |
| 피실험자 1 | 2 | 1 | 2 | 2 | 5 | 0 |
| 피실험자 2 | 2 | 1 | 2 | 2 | 3 | 0 |
| 피실험자 3 | 4 | 3 | 2 | 3 | 4 | 1 |
| 피실험자 4 | 2 | 1 | 4 | 3 | 4 | 0 |
| 피실험자 5 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 0 |
| 피실험자 6 | 2 | 1 | 2 | 3 | 3 | 1 |
| 피실험자 7 | 3 | 1 | 2 | 3 | 4 | 0 |
| 피실험자 8 | 4 | 1 | 2 | 2 | 4 | 1 |
| 피실험자 9 | 2 | 1 | 3 | 3 | 4 | 0 |
| 피실험자 10 | 3 | 3 | 2 | 4 | 4 | 0 |
| 피실험자 11 | 3 | 1 | 2 | 2 | 5 | 0 |
| 피실험자 12 | 4 | 1 | 4 | 3 | 4 | 1 |
| 피실험자 13 | 3 | 1 | 2 | 3 | 4 | 0 |
| 피실험자 14 | 2 | 1 | 3 | 3 | 5 | 1 |
| 피실험자 15 | 2 | 2 | 3 | 3 | 4 | 1 |
| 피실험자 16 | 4 | 1 | 3 | 4 | 4 | 0 |
| 피실험자 17 | 2 | 3 | 4 | 3 | 4 | 0 |
| 피실험자 18 | 4 | 1 | 2 | 2 | 4 | 1 |
| 피실험자 19 | 3 | 1 | 2 | 2 | 4 | 0 |
| 피실험자 20 | 3 | 1 | 2 | 2 | 5 | 0 |
| 평균 | 2.8 | 1.4 | 2.55 | 2.75 | 4.15 | 0.35 |
실험예 2 : 저장성 및 물성 안정성 시험 평가
모든 제품은 유통기한이 길수록 시장성 가치가 상승한다. 또한, 유통기한은 제품의 신선도와 직결된다. 그렇기 때문에 시간에 따른 물성 변화를 확인하는 것은 유통기한이 정해지는 척도가 된다.
따라서 실시예 및 비교예에 따른 산물에 대하여 물성 안정성 실험을 진행하였으며, 일반적으로 안정성 시험에 들어가는 pH, 색, 상태를 확인하였으며, 추가적으로 향 실험을 진행하였다.
실험 방법으로는 각각의 원료를 준비 한 후 4℃, 상온(25℃), 60℃에서 0일, 1일, 3일, 7일, 15일, 30일에 각각의 요소를 측정하였다. 측정방법으로는 pH는 pH리더기, 색 및 상태는 육안 관찰, 악취는 표1의 판정기준으로 악취도를 측정하여, 표 3은 4℃, 표4는 상온(25℃), 표5는 60℃일 경우로 나누어 작성하였다.
하기 표 3, 4, 5에 나타난 바와 같이, 비교예에 비하여 실시예1의 호기성 발효산물이 물성 변화가 가장 없는 것을 확인하였다.
| 4°C | 0일 | 1일 | 3일 | 7일 | 15일 | 30일 | |
| pH | 비교예1 | 7 | 7 | 6.9 | 6.7 | 6.2 | 5.7 |
| 비교예2 | 6.4 | 6.4 | 6.3 | 6.2 | 6 | 5.4 | |
| 비교예3 | 7 | 7 | 6.9 | 6.6 | 6.1 | 5.6 | |
| 비교예4 | 6.3 | 6.3 | 6.3 | 6.1 | 5.9 | 5.5 | |
| 비교예5 | 6.3 | 6.3 | 6.2 | 6 | 5.8 | 5.2 | |
| 실시예1 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | |
| 색 | 비교예1 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 주황 | 갈색 |
| 비교예2 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 주황 | 갈색 | |
| 비교예3 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 적갈색 | 갈색 | 검은색 | |
| 비교예4 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 적갈색 | 갈색 | 검은색 | |
| 비교예5 | 뿌연노랑 | 뿌연노랑 | 적갈색 | 갈색 | 검은색 | 검은색 | |
| 실시예1 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | |
| 상태 | 비교예1 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 고체 생김 | 고체 생김 | 고체 생김 |
| 비교예2 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 고체 생김 | |
| 비교예3 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 고체 생김 | 고체 생김 | 고체 생김 | |
| 비교예4 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 액상 | 고체 생김 | 고체 생김 | |
| 비교예5 | 맑은액상 | 맑은액상 | 고체 생김 | 고체 생김 | 고체 생김 | 고체 생김 | |
| 실시예1 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | |
| 악취 | 비교예1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 2 | 2 |
| 비교예2 | 0 | 0 | 0 | 1 | 2 | 3 | |
| 비교예3 | 0 | 0 | 1 | 1 | 2 | 2 | |
| 비교예4 | 0 | 0 | 1 | 2 | 3 | 3 | |
| 비교예5 | 1 | 1 | 2 | 2 | 3 | 4 | |
| 실시예1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 25°C(상온) | 0일 | 1일 | 3일 | 7일 | 15일 | 30일 | |
| pH | 비교예1 | 7 | 7 | 6.8 | 6.5 | 5.7 | 5.5 |
| 비교예2 | 6.4 | 6.4 | 6.2 | 5.9 | 5.4 | 5.2 | |
| 비교예3 | 7 | 6.8 | 6.5 | 6.1 | 5.3 | 5.3 | |
| 비교예4 | 6.3 | 6.3 | 5.9 | 5.5 | 5.3 | 5.2 | |
| 비교예5 | 6.3 | 6.3 | 5.9 | 5.3 | 5.2 | 5.2 | |
| 실시예1 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6.1 | |
| 색 | 비교예1 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 주황 | 갈색 | 검은색 | 검은색 |
| 비교예2 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 주황 | 갈색 | 검은색 | |
| 비교예3 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 갈색 | 검은색 | 검은색 | |
| 비교예4 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 갈색 | 검은색 | |
| 비교예5 | 뿌연노랑 | 뿌연노랑 | 갈색 | 검은색 | 검은색 | 검은색 | |
| 실시예1 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | |
| 상태 | 비교예1 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 고체 생김 | 고체 생김 | 고체 생김 |
| 비교예2 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 고체 생김 | |
| 비교예3 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 고체 생김 | 고체 생김 | 고체 생김 | |
| 비교예4 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 액상 | 고체 생김 | 고체 생김 | |
| 비교예5 | 맑은액상 | 맑은액상 | 고체 생김 | 고체 생김 | 고체 생김 | 고체 생김 | |
| 실시예1 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | |
| 악취 | 비교예1 | 0 | 0 | 1 | 2 | 3 | 3 |
| 비교예2 | 0 | 0 | 1 | 2 | 3 | 3 | |
| 비교예3 | 0 | 0 | 1 | 3 | 3 | 4 | |
| 비교예4 | 0 | 0 | 1 | 2 | 3 | 3 | |
| 비교예5 | 1 | 1 | 2 | 2 | 3 | 4 | |
| 실시예1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 60°C | 0일 | 1일 | 3일 | 7일 | 15일 | 30일 | |
| pH | 비교예1 | 7 | 7 | 6.8 | 6.5 | 6.2 | 6.2 |
| 비교예2 | 6.4 | 6.4 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6 | |
| 비교예3 | 7 | 6.8 | 6.7 | 6.5 | 6.2 | 6.1 | |
| 비교예4 | 6.3 | 6.3 | 5.9 | 5.3 | 5.3 | 5.3 | |
| 비교예5 | 6.3 | 6.1 | 5.8 | 5.2 | 5.2 | 5.2 | |
| 실시예1 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6.1 | |
| 색 | 비교예1 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 주황 | 갈색 | 검은색 | 검은색 |
| 비교예2 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 옅은노랑 | 주황 | 갈색 | 검은색 | |
| 비교예3 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 갈색 | 검은색 | 검은색 | |
| 비교예4 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 갈색 | 검은색 | |
| 비교예5 | 뿌연노랑 | 뿌연노랑 | 갈색 | 검은색 | 검은색 | 검은색 | |
| 실시예1 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | 진한노랑 | |
| 상태 | 비교예1 | 맑은액상 | 맑은액상 | 뿌연 액상 | 뿌연액상, 고체생김 |
뿌연액상, 고체생김 |
뿌연액상, 고체생김 |
| 비교예2 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 뿌연 액상 | 뿌연액상, 고체생김 |
뿌연액상, 고체생김 |
|
| 비교예3 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 뿌연액상, 고체생김 |
뿌연액상, 고체생김 |
뿌연액상, 고체생김 |
|
| 비교예4 | 맑은액상 | 맑은액상 | 뿌연액상, 고체생김 |
뿌연액상, 고체생김 |
뿌연액상, 고체생김 |
뿌연액상, 고체생김 |
|
| 비교예5 | 불투명액상 | 불투명액상 | 뿌연액상, 고체생김 |
뿌연액상, 고체생김 |
뿌연액상, 고체생김 |
뿌연액상, 고체생김 |
|
| 실시예1 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 맑은액상 | 뿌연액상 | |
| 악취 | 비교예1 | 0 | 1 | 2 | 1 | 2 | 2 |
| 비교예2 | 0 | 1 | 2 | 1 | 2 | 3 | |
| 비교예3 | 0 | 1 | 3 | 3 | 3 | 4 | |
| 비교예4 | 0 | 1 | 3 | 3 | 3 | 4 | |
| 비교예5 | 1 | 1 | 3 | 4 | 4 | 4 | |
| 실시예1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | |
실험예 3 : 세포독성 실험
각 샘플에 대하여 세포생존율을 MTT assay를 통해 측정하였다.
MTT assa y는 살아있는 세포의 수를 측정함으로써, 세포증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로, 살아있는 세포는 미토콘드리아 내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT가 숙신산탈수소효소에 의해 수불용성인 파란색의 포르마잔 유도체로 환원 되는 원리를 이용하는 것이다.
먼저 6-well plate에 1x10^5cells/well 의 밀도로 HaCaT cell을 접종하 고 37℃에서 하루동안 배양하였다. 그 후 각각의 well에 각각의 시료를 농도별(1,10,20ug/ml)로 처리하였다. 그 후 37℃에서 12시간 배양한 뒤에 MTT solution을 처리하고 1시간 activation을 시킨 후 ELISA reader로 450nm에서 측정하였다. 컨트롤은 H2O2로 진행하였으며, 컨트롤군 대비 세포 생존율 을 나타내었다.
그 실험결과는 다음 표 6와 도 2에 나타내었는바, 초유 호기성 발효 산물에서 다른 비교군에 비해 월등한 생존율을 나타내는 것을 확인되었다.
| 12H | |||
| control | 100 | 0.1 (표준오차) |
|
| 비교예 1 | 1ug/ml | 93 | 0.08 |
| 10ug/ml | 109 | 0.13 | |
| 20ug/ml | 108 | 0.16 | |
| 비교예 2 | 1ug/ml | 101 | 0.21 |
| 10ug/ml | 103 | 0.2 | |
| 20ug/ml | 96 | 0.07 | |
| 비교예 3 | 1ug/ml | 84 | 0.2 |
| 10ug/ml | 107 | 0.17 | |
| 20ug/ml | 109 | 0.03 | |
| 비교예 4 | 1ug/ml | 98 | 0.18 |
| 10ug/ml | 103 | 0.26 | |
| 20ug/ml | 97 | 0.27 | |
| 실시예 1 | 1ug/ml | 124 | 0.16 |
| 10ug/ml | 128 | 0.09 | |
| 20ug/ml | 127 | 0.17 | |
실험예 4 : In vitro tyrosinase inhibition assay (타이로시나제 활성저해시험)
멜라닌은 페놀류가 산화효소에 의해 산화되어 유도된 갈색 또는 흑색 고분자 색소의 총칭으로 동식물계에 널리 분포하고 있으며, 생체 안에서는 빛을 흡수하는 역할을 한다. 멜라닌의 전구체인 Tyrosine이 자연산화하면 Tyrosinase라는 효소의 작용으로 Dopa와 Dopaquinone을 거쳐 멜라닌이 합성된다. 이때, Tyrosinase는 인체 내의 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도 결정 단계에 관여하는 효소로서 많은 미백 성분이 이 효소를 억제하는 작용기전을 가지고 있다.
따라서 시험관내에서 실시예 및 비교예에 따른 원료에 대하여 Tyrosinase 효소의 활성을 저해하는 정도를 평가하여 미백 효능을 평가하였다.
실험 방법으로는 시험관에 0.1M 인산염완충액 220ul와 시료액 20ul 그리고 mushroom tyrosinase(1500U~2000U/ml)액 20ul를 순서대로 넣는다. 이 용액에 1.5mM tyrosine액 40ul를 넣고 37℃에서 10~15분 동안 반응시킨다. 그리고 이것을 ELISA reader를 이용하여 492nm에서 흡광도를 측정한다. 공시료액으로는 시료액 대신 0.1M 인산염완충액을 넣는다.
이렇게 나온 결과 값은 Tyrosinase 활성 저해율을 산출하기 위해 하기 수학식 1에 대입하여 구하였다. 시료는 실시예1, 2, 3, 5, 6, 비교예1, 2, 3, 4를 사용하였다.
[수학식 1]
상기 식에서 a는 공시료액의 반응 후의 흡광도, b는 시료액의 반응 후의 흡광도, a’와 b’는 각각 Tyrosinase 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도를 의미한다.
이렇게 평가된 미백 평가 결과는 하기 표 7에 나타낸 바와 같다. 또한 이 결과는 도 3에 그래프로 비교하여 나타내었다.
하기 표 7과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 비교예에 비하여 실시예의 호기성 발효산물이 Tyrosinase inhibition 효과가 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.
| Sample | Average |
| 비교예1 | 17.78 ± 1.18 |
| 비교예2 | 12.9 ± 1.2 |
| 비교예3 | 15.96 ± 0.41 |
| 비교예4 | 13.08 ± 0.69 |
| 실시예1 | 35.66 ± 0.47 |
| 실시예2 | 28.16 ± 0.55 |
| 실시예3 | 28.87 ± 0.61 |
| 실시예5 | 33.48 ± 0.43 |
| 실시예6 | 32.43 ± 0.25 |
실험예 5 :피부 멜라노마 세포로부터의 melanin 생합성 저해 측정
사람의 피부색을 결정하는 가장 중요한 요인인 멜라닌(melanin)은 피부의 광노화나 일광각화증을 억제할 뿐만 아니라, 기미, 주근깨, 검버섯 등의 부분적인 hyperpigmentation을 일으키는 역할을 하고 있다. 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 melanocyte 내의 소기관인 melanosome에서 생합성되며, melanocyte의 수지상 돌기를 통하여 주위의 keratinocyte로 전달되고, 피부의 각질층으로 이행하였다. Melanosome 내에서의 melanin 생성과정은 tyrosine이 tyrosinase의 작용에 의해 DOPA, DOPA quinone으로 산화되고, 이들은 효소의 작용 및 자동산화 반응에 의해 DOPA chrome, indole carboxylic acid, indole quinone류 등으로 대사되어 최종적으로 melanin을 합성한다.
실험방법으로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지로 배양된 B16F10 세포를 100mm culture dish에 1×10^6cell/dish가 되게 분주하고 24시간 배양 후 시료를 2mL 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액(pH 7.4)으로 세척하였다. 그 다음 0.25M trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 1×10^6세포 당 1mL의 5% TCA로 처리하고, 2,500rpm으로 2회 원심분리한 후 분리된 melanin을 인산완충액으로 세척한 뒤 ether:ethanol(1:3) 1mL를 가하여 2회 원심분리한 후 ether 1mL로 세척 건조시켰다. 건조된 melanin에 1N NaOH를 1mL 가하여 80℃에서 1시간 반응시킨 후 분광 광도계 405nm에서 흡광도를 측정하였다. Melanin 생합성저해는 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
[수학식 2]
Melanin 생합성 저해 활성(%)=(1-S/C)X100
(상기 식에서, S는 시료와 효소 포함 반응액의 흡광도이고, C 무첨가군의 흡광도이다.)
| Sample | average |
| 비교예1 | 2.67 ± 0.45 |
| 비교예2 | 1.59 ± 0.22 |
| 비교예3 | 10.09 ± 0.75 |
| 비교예4 | 15.73 ± 0.65 |
| 실시예1 | 39.64 ± 0.55 |
| 실시예2 | 29.43 ± 0.88 |
| 실시예3 | 28.83 ± 0.39 |
| 실시예5 | 33.32 ± 0.61 |
| 실시예6 | 31.98 ± 0.92 |
시험 결과는 표 8, 도 4로 나타내었으며, 초유 호기성 발효에서 Melanin Production 저해 활성이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.
실험예 6 : Keratinocyte를 이용한 AQP3 mRNA 발현양 확인
포유동물에서 13가지의 aquaporins(AQP0-AQ P12)이 존재한다. 인간의 각질형성 세포, 멜라닌 세포, 피부 섬유아세포 등 피부 관련 세포로 확인해보았을 때, AQP 1, 3, 5, 7, 9, 10 총 6가지를 발견할 수 있다. 그 중에서 AQP3는 Epidermis에서 발견되어 물 및 글리세롤을 모두 투과시키는 역할을 한다. 결론적으로 AQP3 결 실은 정상적인 피부 구조를 나타내지만, 각질층의 수분 감소, 물과 글리세롤 표피 투과성을 감소시키는 효과가 있다. 이에 따라 AQP3 mRNA 발현양을 이용하여 보습효과를 확인하였다.
실험방법으로는 먼저 6 well plate에 keratino cyte를 4x10^5cells/well이 되게 분주하고 24시간 배양 후 각 시료(실시예1, 비교예1, 2, 3)를 농도별(0, 1, 10, 100ug/ml)로 처리하였다. 3시간 후 cell을 수거하여 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. 생산한 cDNA로 real-time PCR을 진행하여 mRNA의 발현양을 측정하였으며, 무첨가군 대비 증가율을 나타내었다.
그 결과는 하기 표 9과 도 5, 도 6에 나타내었다.
상기 시험 결과, 비교예1과 비교예3에서는 유의미한 보습 효과를 얻지 못하였다. 그러나 비교예2와 실시예1에서는 농도 의존적으로 mRNA 발현양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 실시예1 중 100ug/ml에서는 mRNA 발현량이 무첨가군 대비 무려 8배 이상 증가하여 보습효과가 매우 뛰어남을 확인하였다.
| 비교예1 (ug/ml) |
평균 | 평균의 표준오차 | 비교예2 (ug/ml) |
평균 | 평균의 표준오차 |
| 0 | 1.0020 | 0.05112 | 0 | 1.0073 | 0.05174 |
| 1 | 0.9027 | 0.04108 | 1 | 1.0244 | 0.03575 |
| 10 | 0.8134 | 0.04001 | 10 | 1.0826 | 0.02845 |
| 100 | 0.9910 | 0.02600 | 100 | 1.3522 | 0.00927 |
| 비교예3 (ug/ml) |
평균 | 평균의 표준오차 | 실시예1 (ug/ml) |
평균 | 평균의 표준오차 |
| 0 | 1.0032 | 0.03244 | 0 | 1.0033 | 0.02640 |
| 1 | 0.8007 | 0.00750 | 1 | 1.1453 | 0.04475 |
| 10 | 0.9215 | 0.09430 | 10 | 1.2371 | 0.11740 |
| 100 | 0.8954 | 0.10283 | 100 | 3.1207 | 0.22110 |
실험예 7 : 히알루로니다아제(hyaluronidase) 활성 억제효과 측정
히알루로니다아제(hyaluronidase)는 피부에 있어 보습역할을 해주는 히알루론산을 가수분해하는 효소이다. 따라서 히알루로니다아제의 활성이 많을 경우, 피부의 보습능을 감소시키는 효과를 야기한다. Hyaluronidase 저해활성 측정은 기질로 첨가된 히알루론산(sodium-hyaluronic acid ; HA)으로부터 형성된 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)이 glucoxazoline 유도체로 변형된 후 발색제로 첨가된 p-dimethylamino benzaldehyde(DMAB)과 반응하여 발색 된 것을 흡광도의 감소 정도를 측정하여 효소 저해효과를 측정하였다.
실험방법으로는 0.1M acetate buffer (pH 3.5)에 녹인 히알루로니다아제(7,900 unit/mL) 0.05ml와 시료용액 0.1ml을 혼합하여 37℃에서 20분간 반응 시킨 다음 12.5mM 염화칼슘(CaCl2) 0.1ml을 가하고 혼합 후 다시 20분간 반응시켰다. 대조군은 히알루로니다아제(7,900 unit/mL) 0.05ml과 삼백초 추출물 대신 증류수 0.1 ml을 혼합하였고, 기질로서 0.1M acetate buffer(pH 3.5)에 녹인 히아루론산(hyaluronic, HA; 12 mg/mL)을 첨가하여 다시 40분간 반응시켜 0.4N potassium tetraborate 0.1ml 및 0.4N NaOH 용액을 0.1 ml 반응 혼합물에 첨가하여 3분 동안 수욕상에서 가열한 후 완전히 냉각시켰다. 냉각시킨 반응물에 발색제인 p-dimethylamino benzaldehyde(DMAB) 시약(4 g of p-dimethylamino benzaldehyde dissolved in 350 ml of 100% acetic acid and 50 ml of 10 N hydrochloric acid) 3mL를 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 다음 585nm에서 흡광도를 측정하여 저해활성을 산출하였다. 그 결과 값은 표10, 도 7로 나타내었다.
Hyaluronidase 저해 활성도는 하기의 수학식으로 산출하였다.
[수학식 3]
Hyaluronidase 저해 활성(%)=(1-S/C)X100
(상기 식에서, S는 시료와 효소 포함 반응액의 흡광도이고, C는 시료 무첨가액의 흡광도이다.)
| Sample | Average |
| 비교예1 | -6.98 ± 0.90 |
| 비교예2 | -2.95 ± 0.38 |
| 비교예3 | 2.75 ± 0.28 |
| 비교예4 | 1.25 ± 0.44 |
| 실시예1 | 21.76 ± 0.59 |
| 실시예2 | 13.84 ± 0.64 |
| 실시예3 | 15.26 ± 0.92 |
| 실시예5 | 18.99 ± 0.1 |
| 실시예6 | 18.48 ± 0.72 |
실험예 8 : 보습력 측정
시료의 보습력은 100 mL 비커 안에 실시예1, 비교예1, 2, 3, 4, 5를 각각 부어 25°C, 상대습도 50% 조건의 항온·항습기에서 2시간마다 24시간 동안 중량을 측정하여 중량감소율 차이로 보습력을 비교 하였다. 컨트롤로는 1차 증류수를 사용하였다.
시험 결과는 도8로 나타내었으며, 초유 호기성 발효산물에서 수분 손실량이 가장 적게 나타났다.
실험예 9 : Collagenase의 저해활성 측정
Collagenase는 세포외기질 단백질을 분해하는 효소로서 피부의 주름생성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 이에 추출물에 따른 Collagenase의 활성을 저해하여 피부노화를 억제시킬 수 있는지 측정하였다.
실험 방법으로는 0.1M tris-HCl buffer(pH7.5)에 4mM CaCl2를 첨가하여 준비하였다. 그 후 0.3mg/ml의 농도로 4-phenylazobenzylocycarbonyl- Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg을 녹여 기질액을 준비하였다. 기질액 0.25ml와 시료용액 0.1ml을 잘 섞어 준 후, 혼합액에 collagenase(0.2mg/ml) 0.15ml을 첨가하여 37℃ water bath에서 20분간 방치하여 가수분해를 진행시켰다. 그 후 6% citric acid 0.5ml을 넣어 반응을 정지시킨 후, ethyl acetate 1.5ml을 첨가하여 320nm에서 흡광도를 측정하였다.
Collagenase 저해 활성도는 하기의 식으로 산출하였다. control에는 시료 대신 에탄올을 사용하였다.
[수학식4]
(C : control의 흡광도, S : Sample의 흡광도, B : Blank)
시험 결과는 표 11, 도 9로 나타내었으며, 초유 호기성 발효산물에서 Collagenase 저해 활성이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.
| Sample | Average |
| 비교예1 | 9.07 ± 0.61 |
| 비교예2 | 18.38 ± 0.48 |
| 비교예3 | 21.14 ± 0.85 |
| 비교예4 | 16.73 ± 0.75 |
| 실시예1 | 52.46 ± 0.06 |
| 실시예2 | 37.64 ± 0.72 |
| 실시예3 | 38.42 ± 0.16 |
| 실시예5 | 47.09 ± 0.11 |
| 실시예6 | 46.74 ± 0.95 |
실험예 10 : 세포내 세라마이드 합성능 확인
세라마이드(Ceramide)는 피부를 보호하는 피부 보호막이라고 불리우는 각질층을 구성하는 지질 성분 중 가장 중요한 성분으로 알려져 있고, 수분의 증발을 억제함과 동시에 수분과 결합되어 피부의 수분을 함유하는 기능이 뛰어난 것으로 알려져 피부가 최적의 대사기능을 수행하는데 최적의 환경을 제공한다.
실험방법으로는 세라마이드 생합성 여부를 HaCaT(Keratinocyte) 셀라인을 이용하여 확인하였다. 48-well plate에 well당 5×10^4개로 분주한 다음 세포배양조건에서 24시간 배양하고, 이어 배지를 버리고 10% PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음 새로운 배지와 시료용액(우유, 우유발효, 초유, 초유발효)을 첨가하여 24시간 배양 후 배양액을 취하여 세라마이드 양을 측정하였다. 측정된 세라마이드 양은 Bradford assay로 구한 총 세라마이드 양으로 보정하였으며, 무첨가군 대비 증가율을 나타내었다.
시험 결과는 표 12, 도 10으로 나타내었으며, 호기성 초유 발효산물에서 Ceramide production 활성이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.
| Sample | average |
| 무처리군 | 100% ± 0.23 |
| 비교예1 | 107.28 ± 0.27 |
| 비교예2 | 116.75 ± 0.22 |
| 비교예3 | 109.60 ± 0.29 |
| 비교예4 | 105.38 ± 0.28 |
| 실시예1 | 133.28 ± 0.31 |
| 실시예2 | 132.47 ± 0.09 |
| 실시예3 | 131.88 ± 0.83 |
| 실시예5 | 135.26 ± 0.49 |
| 실시예6 | 135.43 ± 0.38 |
실험예 11 : 세포내 콜라겐 생성시험(Collagen Synthesis Assay)
콜라겐은 피부 아래에 있는 ‘진피’에 풍부하게 들어 있으며, 피부의 탄력을 만들어 낸다. 사람의 몸이 노화되면 콜라겐이 합성되는 양이 줄어들어, 주름이 늘어나는 원인의 하나가 된다. 따라서 세포내 콜라겐 생성 시험을 통하여 주름 개선 효과를 알아보는 실험이다.
섬유아세포(fibroblast) 배양 시 시료의 세포내 콜라겐 생성 증가 정도를 공시험액과 비교하는 것으로, 식품의약품안전처에서 제시하는 기능성화장품의 유효성 평가를 위한 가이드라인 중 주름개선에 도움을 주는 기능성화장품의 유효성 평가를 위한 가이드라인(Guideline for Efficacy Evaluation of Functional Cosmetics)에 따라 시험하였다. 이때 섬유아세포는 사람섬유아세포(primary cell line)인 HaCaT를 사용하였다. 섬유아세포를 48-well plate에 well당 5×10^4 개로 분주한 다음 세포배양조건에서 24시간 배양하고, 이어 배지를 버리고 10% PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음 검액 및 새로운 배지를 넣고 24시간 배양한 후 배양액을 취하여 콜라겐 양을 측정하였다. 측정된 콜라겐 양은 Bradford assay로 구한 총 콜라겐 양으로 보정하였으며, 무첨가군 대비 증가율을 나타내었다.
시험 결과는 표 13, 도 11로 나타내었으며, 초유의 호기성 발효 산물에서 Collagen production 활성이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.
| Sample | Average |
| 무처리군 | 100 ± 0.98 |
| 비교예1 | 107.64 ± 0.37 |
| 비교예2 | 111.98 ± 0.35 |
| 비교예3 | 112.91 ± 0.38 |
| 비교예4 | 121.72 ± 0.44 |
| 실시예1 | 137.98 ± 0.37 |
| 실시예2 | 132.08 ± 0.35 |
| 실시예3 | 132.34 ± 0.98 |
| 실시예5 | 136.15 ± 0.42 |
| 실시예6 | 135.9 ± 0.76 |
실험예 12 : 항산화 효능 시험(SOD생성능 확인)
생명체는 호흡을 통해 에너지를 얻으며 사용한 산소의 2% 정도가 활성산소로 생성이 되는데, 이 활성산소는 free radical을 지닌 산소를 의미한다. 이 활성산소가 지질성분을 공격하면 세포독성으로 작용하는 과산화지질을 생성하여 세포막을 파괴하고, 암을 유발하며 질병과 노화를 촉진하며, 단백질을 공격하면 carbonyl group이 생성되어 세포를 파괴하고, DNA를 공격하면 다양한 유전적 돌연변이가 생기게 된다.
SOD(Superoxide dismutase)는 Superoxide anion을 산소와 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉매하는 중요한 항산화 효소이다. WST(Water Soluble Tetrazolium salt)는 XO(Xanthine Oxidase)에 의해 생성된 superoxide anion(O2-)의해 환원되어 WST-1 formazan을 형성하여 주황색을 띄게 된다. 따라서 SOD 활성이 좋을수록 무색에 가까워 흡광도가 낮게 나오는 것을 이용하여 SOD 활성을 측정하였다.
실험방법으로는 인간 피부세포(HaCaT)에 6-well plate에 1x10^5cells/well 의 밀도로 HaCaT cell을 접종하고 37℃에서 하루동안 배양하였다. 그 후 무처리(control), 우유, 발효우유, 초유, 발효초유를 각각 10, 20, 30, 40, 50mg/ml의 농도로 처리하여 12시간동안 배양하였다. 그 후 세포와 WST-1 시약을 15분간 반응시킨 후, ELISA reader로 450nm에서 측정하였다. SOD 생성능은 다음 수학식으로 산출하였고, 그 결과는 다음 표 14와 도 12에 비교 그래프로 나타내었다.
[수학식 5]
SOD생성능(WST-1환원 반응 저해능)(%)=(1-S/C)X100
(상기 식에서, S는 시료와 효소 포함 반응액의 흡광도이고, C는 시료 무첨가액의 흡광도이다.)
| Sample | 30mg/ml | 40mg/ml | 50mg/ml |
| 비교예1 | -28.17 | -27.47 | -24.23 |
| 비교예2 | -19.55 | -16.28 | -3.81 |
| 비교예3 | 29.16 | 38.33 | 38.48 |
| 비교예4 | 21.76 | 32.69 | 42.23 |
| 실시예1 | 46.91 | 54.15 | 61.08 |
| 실시예2 | 38.01 | 47.43 | 52.61 |
| 실시예3 | 42.5 | 48.28 | 51.18 |
| 실시예5 | 41.58 | 51.77 | 56.11 |
| 실시예6 | 42.28 | 51.46 | 56.83 |
실험예 13 : Xanthine Oxidase (크산틴산화효소) 활성 저해능 평가
XOase는 purine대사에 관여하는 효소로서 xanthine, hypoxanthine으로부터 urate를 형성하고, urate가 혈장 내에 증가되면 골절에 축적되므로 통증을 동반하는 통풍을 일으키는 효소로서, 분자상의 산소를 수소(전자)수용체로 이용하여 xanthine을 uric acid형으로 산화하는 반응을 촉매한다. 따라서 XOase의 저해효과는 유리라디칼의 생성 억제와 더불어 생물학적으로 중요한 의의를 가진다고 할 수 있다.
실험방법으로는 Xanthine Oxidase 저해활성 측정은, 반응구는 0.1M potassium phosphate buffer(pH7.5) 0.5㎖에 xanthine 2mM을 녹인 기질액 1.0㎖에 시료용액 0.5㎖과 효소액 0.1㎖(40mU/㎖)를 가하고 37℃에서 15분간 반응시킨 후, 1N HCl 1.0㎖를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 uric acid를 흡광도 290㎚에서 측정하여 다음의 식으로 저해율을 구하였다.
[수학식 6]
(상기 식에서, S는 시료와 효소 포함 반응액의 흡광도이고, B는 효소 대신 0.1M potassium phosphate buffer(pH7.5)를 첨가한 반응액의 흡광도이고, 그리고 C는 시료 대신 0.1M potassium phosphate buffer(pH7.5)를 첨가한 반응액의 흡광도이다.)
시험 결과는 표 15, 도 13으로 나타내었으며, 초유 호기성 발효산물에서 Xanthine Oxidase 저해 활성이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.
| Sample | average |
| 비교예1 | 13.97 ± 0.59 |
| 비교예2 | 13.61 ± 0.3 |
| 비교예3 | 19.08 ± 0.35 |
| 비교예4 | 15.44 ± 0.44 |
| 실시예1 | 38.64 ± 0.49 |
| 실시예2 | 33.15 ± 0.65 |
| 실시예3 | 26.84 ± 0.81 |
| 실시예5 | 32.28 ± 0.11 |
| 실시예6 | 34.67 ± 0.38 |
실험예 14 : 항산화 효능평가 시험(DPPH)
생명체는 호흡을 통해 에너지를 얻으며 사용한 산소의 2% 정도가 활성산소로 생성이 되는데, 이 활성산소는 free radical을 지닌 산소를 의미한다. 이 활성산소가 지질성분을 공격하면 세포독성으로 작용하는 과산화지질을 생성하여 세포막을 파괴하고, 암을 유발하며 질병과 노화를 촉진하며, 단백질을 공격하면 carbonyl group이 생성되어 세포를 파괴하고, DNA를 공격하면 다양한 유전적 돌연변이가 생기게 된다.
따라서 시험관 내에서 초유 추출물과 DPPH를 반응시켜, free radical이 감소하는 정도를 ELISA로 측정하여 항산화 활성도를 측정하였다.
실험 방법으로는 brown Eppendorf tube에 0.25mM DPPH 시약과 추출물을 각각 400㎕씩 mix한다. 그리고 15min 암실에서 반응시킨 후, centrifuge 3,000×g, 5min 동안 spin down하여 상층액만 96well plate에 각 well당 200㎕씩 분주하여 ELISA reader로 517nm에서 측정한다. 시료는 농도별(20, 30, 40mg/mL)로 사용하였다.
실험결과 항산화 활성 평가는 다음 수학식 7로 산출하였고, 그 결과는 다음 표 16과 도 14에 비교 그래프로 나타내었다.
[수학식 7]
Scavenging activity (%) = [(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100
| Sample | 20mg/ml | 30mg/ml | 40mg/ml |
| 비교예1 | 5.91 | 21.42 | 18.72 |
| 비교예2 | 7.82 | 25.07 | 25.30 |
| 비교예3 | 38.85 | 60.90 | 68.40 |
| 비교예4 | 28.15 | 45.96 | 61.54 |
| 실시예1 | 47.72 | 74.17 | 88.20 |
| 실시예2 | 41.26 | 58.18 | 74.81 |
| 실시예3 | 41.08 | 56.89 | 78.48 |
| 실시예5 | 42.96 | 63.84 | 83.94 |
| 실시예6 | 43.18 | 65.18 | 82.88 |
위에서 나타낸 바와 같이, 비교예에 비하여 실시예의 호기성 발효산물이 항산화 효과가 우수함을 확인하였다.
실험예 15 : 프로스타글란딘(Prostaglandin E2) 생성 억제 효과 확인
염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2, PGE2) 생성 억제 효과를 알아보았다. Cyclooxygenase(COX)는 아라키돈산(arachidonic acid)을 프로스타글란딘으로 전환하는 효소로 COX-1과 COX-2로 분류된다. COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장기능의 유지 등 정상적인 생체기능에 작용하며, COX-2는 염증매개 물질인 PGE2를 형성시킨다. PGE2는 염증반응, 면역반응 그리고 혈관형성을 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.
실험방법으로는 THP-1 cell을 12 well plate 각 well 당 1 X 106 개 씩 분주하고 넣어 준비된 시료에 LPS를 1㎍/㎖의 농도로 혼합하여 cell에 동시에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 더 배양하였다. 생성된 PGE2의 양은 PGE2 ELISA kit를 이용하여 측정한 값을 하기 계산식으로 계산하여 나타내었다. 대조군은 LPS를 단독으로 처리한 실험군으로 하였다. PGE2 생성 억제율은 하기 수학식 8에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 17 및 도 15에 나타내었다.
[수학식 8]
PGE2 Production 저해 활성(%)=(1-S/C)X100
(상기 식에서, S는 시료처리에서의 PGE2 양이고, C는 LPS를 단독으로 처리한 실험군에서의 PGE2 양이다.)
| Sample | Average |
| 비교예1 | -2.8 ± 0.32 |
| 비교예2 | 6.8 ± 0.23 |
| 비교예3 | 7.4 ± 0.33 |
| 비교예4 | 8.2 ± 0.29 |
| 실시예1 | 26.2 ± 0.36 |
| 실시예2 | 14.8 ± 0.33 |
| 실시예3 | 16.2 ± 0.29 |
| 실시예5 | 22.1 ± 0.38 |
| 실시예6 | 21.5 ± 0.32 |
실험예 16 : 시료별 항여드름 디스크 확산 시험(Paper Disk diffusion assay)
여드름은 피지선과 피지에서 과다한 지방 분비 영향을 받아 모낭과 피지선에 Propionibacterium acnes균이 침입하여 생성된다. Propionibacterium acnes균은 Gram 양성균으로 혐기성 조건이 갖추어졌을 때 증식한다.
따라서 본 실험에서는 Propionibacterium acnes의 Paper Disk diffusion assay를 통해 생육 저해 정도를 확인하여 항균 효능을 평가하였다.
실험 방법으로는 Propionibacterium acnes균을 5ml MH broth에 접종하고, Gas Pack을 이용하여 혐기성 조건을 만들어준 뒤 37℃에서 48-72시간 동안 배양하여 활성화 시켰다. 냉장보관 된 Blood Plate는 사용 전 멸균된 장소에서 air dry를 통해 Plate를 건조하였다. MH 배지 균을 도말하기 전, 도말을 위한 Pipette을 알코올 램프의 열로 삼각형 형태로 구부려서 준비하였다.
또한, 우유, 발효우유, 초유, 그리고 상기 실시예 1에서 제조된 발효초유 시료를 ultra pure water로 녹여 준비하였다. Blood Plate에 활성화 시킨 균 배양액 300ul를 분주하였고, 구부린 유리막대를 이용하여 Blood Plate에 균일하게 분포시켰다. 멸균된 공간에서 Blood Plate의 균을 포함한 배양액을 증발시키고 배지 위에 멸균된 8mm filter paper disc를 적정 배율로 배치한 후, 시험군으로써 우유, 발효우유, 초유, 발효초유(실시예 1)의 각각 시료를 500mg/disc의 농도로 흡수시켰다.
시험 plate는 Shaking Incubator에서 Gas Pack을 넣어 혐기성 조건을 만들어준 뒤 37℃ 온도 하에 48-72시간 동안 배양하였다. 48-72시간 배양 후 disc 주위의 clear zone의 직경(mm)을 측정하여 생육저해환으로써 항생효과 정도를 비교하였다.
대조군으로는 Sample의 용매인 Ultra pure water와 Ampicillin(30mg/disc), Kanamycin(30mg/disc)과 같은 항생제를 사용하였다.
이렇게 평가된 여드름균 항균 효능 평가 결과는 하기 표 18의 생육저해환으로 나타난 디스크 확산 시험 결과로 나타내었으며, 생육저해환의 크기를 측정한 결이다.
| Sample | 직경(mm) |
| Amp | 24 |
| Kana | 20 |
| D.W | 0 |
| 우유(비교예1) | 0 |
| 발효우유(비교예2) | 0 |
| 초유(비교예3) | 9 |
| 호기성 발효초유(실시예 1) | 20 |
상기 표 18에서 확인되는 바와 같이, 미발효 초유추출물에 비하여 호기성 발효초유 추출물이 Propionibacterium acnes균에 대한 항균 효과가 현저하게 우수한 것을 확인하였다.
실험예 17 : 항여드름 시험
상기 실험예와 같은 방법으로 디스크 확신 시험을 시행하되 실험 대상의 시료 상기 실시에 1에서 제조된 초유 발효산물을 발효초유 시료를 사용하였다.
초유 발효산물의 시료를 하기 표 19의 농도로 각각 Propionibacterium acnes균에 대하여 처리하였을 때의 직경을 측정하였으며, 이렇게 측정된 Propionibacterium acnes균에 대한 항균 효능 평가 결과는 하기 표 19와 같다.
하기 표는 상기 각 시료에 대하여 실험한 결과 생육저해환으로 보여지는 디스크 확산 시험 결과를 나타낸 것으로서, 생육저해환의 크기를 측정한 결과이다.
| Sample (mg/ml) | 직경 (mm) |
| 500 | 22 |
| 400 | 22 |
| 300 | 20 |
| 200 | 19 |
| 100 | 15 |
| 50 | 12 |
| 10 | 11 |
상기와 같은 실험 결과, 초유 발효산물인 발효초유의 농도가 높아질수록 직경이 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 어느 정도의 함량에서는 그 직경이 별차이 없이 유지되는 것으로 확인되었다.
실험예 18 : 발효균에 따른 피부자극완화 효과 평가
피부반응은 CTFA(The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association) 가이드라인에 제시된 방법에 의거하여 검사하였고, 평균 피부반응도(Mean score)는 하기의 수학식 9에 따라 산정하였다.
[수학식 9]
평균 반응도 = (반응값 × 반응인원수) / (최대값 × 전체인원수 × No. of visual scoring) × 100
실험 방법으로는 피시험자 20대 성인 남녀 20명(남자 10명, 여자 10명)의 전완부에 IQ 챔버를 이용하여 첩포 시험을 실시하였다. 피부자극은 0.1중량% SLS(sodium lauryl sulfate)를 사용하였고, 시료와 0.1중량% SLS를 섞어 각각 피부에 하루 동안 첩포하였다. 첩포가 끝난 후에는 펜으로 시험 부위를 표시하고 24시간 경과한 다음 시험 부위의 피부 반응을 하기 표 20의 판정기준에 따라 판정하였다.
| 점수 | 판정기준 |
| 0.0 | 염증성의 징후를 보이지 않음(건강하고 정상적 피부). |
| 0.5 | 부위 외관에 광택이 있거나 또는 겨우 인지될 정도의 홍반 발생 |
| 1.0 | 약간의 홍반 발생 |
| 2.0 | 중등도의 홍반 발생, 가장자리에 겨우 인지될 정도의 부종을 수반하는 가능성, 구진(丘疹)의 가능성 |
| 3.0 | 전체에 부종을 수반하는 중등도의 홍반 발생 |
| 4.0 | 강도의 부종을 수반하는 강도의 홍반 발생, 그러나 작은 수포를 수반하거나 수반하지 않음. |
| 5.0 | 첩포부위를 넘어서 퍼진 강도의 반응을 나타냄. |
상기와 같은 피부자극완화 효과에 대한 평가결과는 다음 표 21에 나타낸 바와 같다.
| Sample | 평균 반응도 |
| 0.1% SLS | 4.36 |
| 0.1% SLS + a 호기성 발효 초유 추출물(실시예2) | 3.12 |
| 0.1% SLS + b 호기성 발효 초유 추출물(실시예3) | 3.11 |
| 0.1% SLS + c 호기성 발효 초유 추출물(실시예7) | 3.53 |
| 0.1% SLS + (a + b) 호기성 발효 초유 추출물(실시예4) | 3.01 |
| 0.1% SLS + (a + c) 호기성 발효 초유 추출물(실시예5) | 2.42 |
| 0.1% SLS + (b + c) 호기성 발효 초유 추출물(실시예6) | 2.28 |
| 0.1% SLS + (a + b + c) 호기성 발효 초유 추출물(실시예1) | 1.43 |
| 0.1% SLS + (a + b + c) 혐기성 발효 초유 추출물(비교예4) | 2.83 |
| a : 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, ATCC 11842) b : 락토바실러스 람노서스지지(Lactobacillus rhamnosus GG, ATCC 53103) c : 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus, ATCC 19258) |
|
상기 표 21의 결과에 따르면, 실시예1에 의한 초유의 호기성 발효산물은 혐기성 발효 산물보다 피부자극을 현저하게 억제시킴을 확인할 수 있었다.
실험예 19 : 발효균에 따른 Nitric oxide(NO) 생성 억제 활성 측정
상기 실시예에서 사용된 각 사용균을 이용하여 제조한 초유의 발효산물에 대하여 항염 효과를 비교 확인하기 위하여 실험을 진행하였다.
염증 모델로 주로 사용되는 Lipopolysaccharide(LPS)는 대식세포를 활성화 시킨다. 활성화된 대식세포는 염증 유발 사이토카인인 TNF-α. IL-1β, IL-12, IFNγ 등의 발현 양을 증가시킨다. 염증 유발 사이토카인은 Nitric oxide(NO)을 생성한다. 따라서 NO 발현 양 감소를 통해 항염증 효과를 평가했다.
실험 방법으로는 RAW 264.7 cell을 10% FBS를 포함하는 DMEM(Dubelccos Modified Eagle Medium, Gibco) 동물세포배양 배지에 현탁하여 24 well plate 각 well 당 5 X 105 개씩 넣어 37℃, 5% CO2 조건에서 하루 동안 배양한다. 그 후, 배지를 2번 세척하고 시료를 준비한 후 준비된 시료에 LPS를 1㎍/㎖의 농도로 혼합하여 cell에 동시에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 18시간 더 배양하였다. 배양 후에는 세포 상등액 100㎕와 Griess 시약 100㎕를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정한다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였으며 sodium nitrite (NaNO2)를 standard로 사용하였다.
LPS 단독 처리 군은 NO의 생성을 유도하였고, 각 시료에 대한 NO 생성 억제 활성을 측정하였다. 각 시료는 실시예 1-7에서 제조된 초유의 호기성 발효산물을 사용하였으며, 그 실험결과는 하기 표 22에 기재하였다.
| Sample | NO production (%) |
| LPS ( - ) | - |
| LPS (+, 1 ㎍/㎖ ) | 100 |
| LPS (1㎍/㎖) + a 호기성 발효 초유 추출물(실시예2) | 47.2 ± 1.8 |
| LPS (1㎍/㎖) + b 호기성 발효 초유 추출물(실시예3) | 48.6 ± 2.0 |
| LPS (1㎍/㎖) + c 호기성 발효 초유 추출물(실시예7) | 62.3 ± 1.4 |
| LPS (1㎍/㎖) + (a + b) 호기성 발효 초유 추출물(실시예4) | 46.2 ± 2.0 |
| LPS (1㎍/㎖) + (a + c) 호기성 발효 초유 추출물(실시예5) | 33.1 ± 2.4 |
| LPS (1㎍/㎖) + (b + c) 호기성 발효 초유 추출물(실시예6) | 32.6 ± 1.5 |
| LPS (1㎍/㎖) + (a + b + c) 호기성 발효 초유 추출물(실시예1) | 14.6 ± 0.9 |
| LPS (1㎍/㎖) + (a + b + c) 혐기성 발효 초유 추출물(비교예4) | 43.4 ± 1.2 |
| a : 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, ATCC 11842) b : 락토바실러스 람노서스지지(Lactobacillus rhamnosus GG, ATCC 53103) c : 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus, ATCC 19258) |
|
이 실험 결과, 상기와 같이 실시예에서 제조된 호기성 발효 초유 추출물을 사용하였을 때 우수하고, 특히 복합균의 경우 상승효과로 인해 NO 생성 억제 효과가 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.
특히, 호기성 조건에서 유산균을 사용한 경우와 복합균을 사용한 경우가 더욱 우수함을 확인할 수 있었다.
이 결과로부터, 초유의 호기성 발효산물은 우수한 항염 효과가 있고, 특히 유산균과 스크렙토코커스균의 복합균을 사용하는 경우에는 복합균에 의한 상승효과가 있는 것으로 확인되었다.
실험예 20 : GMP 함량 탐색
상기 실시예의 호기성 발효산물에 대하여 GMP가 함유되어 있는지의 여부를 판단한 위하여 각 시료에 대하여 GMP 함량을 측정하였다. 대조군으로 초유를 사용하였다.
그 결과는 다음 표 23과 같다.
| Sample | GMP 함량 |
| 초유(대조군) | 0.0001 ± 0.0001 |
| c 호기성 발효 초유 추출물(실시예7) | 4.67 ± 1.07 |
| (a + b + c) 호기성 발효 초유 추출물(실시예1) | 6.13 ± 0.49 |
| a : 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, ATCC 11842) b : 락토바실러스 람노서스지지(Lactobacillus rhamnosus GG, ATCC 53103) c : 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus, ATCC 19258) |
|
상기 실험결과, 초유(대조군)에서는 GMP가 함유되어 있지 않은데 반하여, 실시예의 방법으로 제조된 초유의 호기성 발효산물에서는 GMP가 다량 함유된 것으로 확인되었다.
Claims (16)
- 초유가 호기성 조건에서 발효균에 의해 발효되어 이루어진 초유의 호기성 발효산물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 초유는 지방이 제거된 것인 초유의 호기성 발효산물.
- 청구항 1에 있어서, 초유의 발효 전, 발효 후 또는 발효 전후에 카세인이 제거된 것인 초유의 호기성 발효산물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 카세인 제거는 렌넷 처리에 의해 제거된 것인 초유의 호기성 발효산물.
- 청구항 1에 있어서, 글리코마크로펩타이드(GMP)를 함유하는 초유의 호기성 발효산물.
- 청구항 1에 있어서, 글리코마크로펩타이드(GMP)는 0.001-15중량%로 함유되어 있는 초유의 호기성 발효산물.
- 초유를 급냉한 다음 저온 살균 처리하여 발효원료를 준비하는 단계와;
상기 단계에서 얻은 발효원료에 발효균을 접종하고 호기성 조건에서 발효하여 발효액을 얻는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 초유의 호기성 발효산물의 제조방법.
- 청구항 7에 있어서, 발효원료를 준비하는 단계는 초유에서 지방을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초유의 호기성 발효산물의 제조방법.
- 청구항 7에 있어서, 발효액은 발효균을 접종 발효 후에 얻어진 발효물을 원심분리하여 발효액을 얻는 단계를 추가적으로 포함하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 초유의 호기성 발효산물의 제조방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 발효액을 효소를 이용하여 추출물을 얻는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 초유의 호기성 발효산물의 제조방법.
- 청구항 10에 있어서, 효소로는 렌넷(rennet)을 사용하는 것을 특징으로 하는 초유의 호기성 발효산물의 제조방법.
- 청구항 1 내지 청구항 6 중에서 선택된 어느 하나의 항에 따른 초유의 호기성 발효산물을 함유하는 화장료 조성물.
- 청구항 12에 있어서, 주름개선, 미백, 보습, 항아토피, 항여드름, 항균, 항염, 항산화 및 피부자극완화 중에서 하나 이상의 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
- 청구항 1 내지 청구항 6 중에서 선택된 어느 하나의 항에 따른 초유의 호기성 발효산물을 주름개선, 미백, 보습, 항아토피, 항여드름, 항균, 항염, 항산화 및 피부자극완화 중에서 하나 이상에 대한 유효성분으로 함유하는 피부미용 증진용 식품조성물.
- 청구항 1 내지 청구항 6 중에서 선택된 어느 하나의 항에 따른 초유의 호기성 발효산물을 함유하는 항아토피, 건선 또는 태선 치료용 약제조성물.
- 청구항 1 내지 청구항 6 중에서 선택된 어느 하나의 항에 따른 초유의 호기성 발효산물을 주름개선, 미백, 보습, 항아토피, 항여드름, 항균, 항염, 항산화 및 피부자극완화 중에서 하나 이상의 유효성분으로 함유하는 피부미용 개선용 약제조성물.
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