CH640568A5 - Procede de production ou maintien d'une culture stable d'un microorganisme du genre lactobacillus. - Google Patents

Procede de production ou maintien d'une culture stable d'un microorganisme du genre lactobacillus. Download PDF

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Description

La présente invention a pour objet un procédé de production ou maintien d'une culture stable d'un micro-organisme du genre Lactobacillus présentant au moins un élément génétique extrachromosomal stimulant, d'une part, son aptitude à produire de l'acide lactique à partir du lactose et contrôlant, d'autre part, son aptitude à métaboliser la N-acétyl-D-glucosamine.
Un problème important de l'industrie des produits laitiers, tels que les fromages et les yogourts par exemple, réside dans l'instabilité des souches de micro-organismes élevés pour et utilisés dans la fabrication de ces produits, notamment les micro-organismes producteurs de l'acide lactique à partir du lactose, par exemple les espèces du genre Lactobacillus. En effet, il est connu que l'aptitude des mi-cro-organismes dits lactiques à produire de l'acide lactique à partir du lactose, que l'on nommera également dans la suite de cet exposé activité ou capacité de production d'acide lactique, peut diminuer avec le temps.
Certains spécialistes ont étudié le mécanisme de la production d'acide lactique par le biais de la génétique. C'est ainsi que l'on sait maintenant qu'un plasmide est responsable de la fermentation du lactose par le Streptococcus lactis et que des Plasmides peuvent être impliqués dans le métabolisme du lactose de certains Lactobacilli.
Les plasmides sont des éléments génétiques extrachromosomaux qui se présentent sous la forme d'une molécule circulaire d'acide désoxyribonucléique (DNA) dont le poids équivaut à quelques pour mille ou dizaines de pour mille du poids du chromosome du microorganisme.
Cependant, à moins qu'un plasmide soit entièrement responsable de la fermentation du lactose par un micro-organisme, auquel cas il suffit de cultiver le micro-organisme dans le lait pour conserver son activité, l'état actuel des connaissances ne peut guère être mis au service de l'industrie en matière de stabilité de l'activité des microorganismes lactiques.
On sait, par ailleurs, que différentes souches de la même espèce de micro-organisme peuvent différer notablement quant à leur capacité de production d'acide lactique. C'est notamment vrai pour le micro-organisme Lactobacillus helveticus sous-espèce jugurti. Ce micro-organisme est utilisé dans la fabrication du gruyère, de l'emmental et du parmesan. En d'autres termes, ce serait tout, sauf un exercice académique que de trouver une solution à cette disparité et de pouvoir garantir une activité maximale de chaque souche.
La présente invention donne une solution à ce problème.
Le procédé selon l'invention est caractérisé par le fait que l'on cultive et maintient le micro-organisme dans un milieu nutritif dont la source principale de carbone assimilable est constituée par la N-acétyl-D-glucosamine.
Par l'expression source principale de carbone assimilable, on entend source déterminante, sans laquelle le micro-organisme ne pourrait pas se développer, ce qui n'exclut pas la présence d'autres sources mineures qui seraient ajoutées au milieu avec une source d'oligo-éléments et de vitamines, telle qu'un extrait de levure par exemple.
On a constaté, en effet, au cours d'une étude comparée approfondie des propriétés de deux souches d'une même espèce de Lacto-5 bacillus, en l'occurrence de Lactobacillus helveticus sous-espèce jugurti, dont l'une avait une capacité de production d'acide lactique nettement plus forte que l'autre, que cette forte capacité était due à la présence d'un plasmide de 13,17 kilobases (kb). Ce plasmide était absent chez la souche à faible capacité. On a découvert que ce plas-îo mide ne contrôle pas l'aptitude de la souche à produire de l'acide lactique à partir du lactose, mais qu'il stimule cette aptitude, autrement dit, qu'il contrôle un facteur stimulant la production d'acide lactique, cette production, stimulée ou non, forte ou faible, étant contrôlée par des gênes situés sur le chromosome. On a découvert, 15 en outre, que ce même plasmide contrôle entièrement l'aptitude du micro-organisme à métaboliser la N-acétyl-D-glucosamine. C'est ainsi que l'on a mis en évidence la raison pour laquelle les deux souches de la même espèce n'ont pas la même capacité de dégradation de l'acide lactique et que l'on a trouvé un moyen hautement uti-20 lisable pour l'industrie de cultiver et de maintenir des souches stables à forte activité de ces micro-organismes.
En effet, les plasmides sont susceptibles d'être perdus lors de la division des cellules. D'une part, la réplication des chromosomes n'est pas nécessairement accompagnée de la réplication des plasmi-25 des et, d'autre part, les plasmides issus de réplications ne sont pas nécessairement distribués en parts égales aux cellules issues de divisions cellulaires. Mais si les cellules sont cultivées sur un milieu dont la source de carbone ne peut être exploitée que grâce au plasmide, les cellules sans plasmides ne seront pas viables et elles disparaîtront 30 à mesure au profit des cellules avec plasmide.
La mise en œuvre du présent procédé implique donc l'usage d'un micro-organisme du genre Lactobacillus qui présente au moins un élément génétique extrachromosomal, autrement dit, au moins un plasmide stimulant, d'une part, son aptitude à produire de l'acide 35 lactique à partir du lactose et contrôlant, d'autre pârt, son aptitude à métaboliser la N-acétyl-D-glucosamine. De préférence, le microorganisme est le Lactobacillus helveticus de la sous-espèce jugurti de N° S 36-2 que l'on peut obtenir à l'Institut de microbiologie agronomique de l'Université de Bologne en Italie.
<to Le micro-organisme peut être maintenu ou conservé en le transférant chaque mois dans un milieu aqueux à 5-10% en poids de matière sèche contenant une source adéquate d'azote assimilable, des sels, des oligo-éléments et des vitamines, ainsi que de la N-acétyl-D-glucosamine comme principale source de carbone assimila-45 ble, ce milieu ayant été stérilisé avant le transfert, par exemple par chauffage en autoclave durant 30 min à 115°C. Le milieu ensemencé peut être incubé à une température favorable à la croissance du micro-organisme, par exemple 40-42° C, jusqu'à ce que sa densité optique corresponde à la demi-croissance logarithmique par 50 exemple. Il peut être maintenu entre les transferts à une température suffisamment basse pour que le micro-organisme ne se multiplie pas, par exemple 5-10°C. Lorsqu'on désire produire une quantité de mi-cro-organismes nécessaires pour une fabrication industrielle de fromage ou de yogourt par exemple, on peut partir des cultures ci-55 dessus, les cultiver et les transférer dans le lait le nombre de fois nécessaire, trois à quatre fois par exemple, à une température favorable à leur croissance. Les transferts peuvent se faire à raison de 0,5 à quelques pour-cents, de préférence 1 % en volume de la culture à transférer par rapport au volume du lait à inoculer.
60 L'exemple donné ci-après à titre d'illustration permettra de mieux comprendre la présente invention. Les pourcentages sont en poids.
Exemple:
65 D'une part, on cultive séparément deux souches de Lactobacillus helveticus sous-espèce jugurti, de respectivement Nos S 13-8 et S 36-2, obtenues auprès de l'Institut de microbiologie agronomique de l'Université de Bologne en Italie, dans une suspension de 10% de
3
640 568
lait écrémé en poudre et de 0,1 % d'extrait de levure dans l'eau, la suspension ayant été stérilisée en autoclave durant 30 min à 115°C. Après une incubation de 8 h à 42° C, la souche N° S 13-8 a produit 1,5% d'acide lactique dans la suspension et la souche N° S 36-2 2,4%. s
D'autre part, on fait croître la souche N° S 36-2 sur milieu MRS [J.C. de Man, M. Rogosa et M.F. Sharpe, «J. Appi. Bact.» 23,130-135 (I960)] pour lactobacilles. On transfert des échantillons de cette culture en milieu MRS frais auquel on a ajouté 7 |ig/ml d'acriflavine. On incube 24 h. On repique sur milieu MRS solidifié par addition de 10 1,5% d'agar et l'on incube sous atmosphère d'hydrogène et de C02. On isole des colonies individuelles.
Ensuite, dans un milieu MRS modifié présentant la composition suivante:
15
N-acétyl-D-glucosamine
10 g
Polypeptone
10 g
Extrait de levure
5 g
Tween 80*
1 ml k2hpo4
2 g
CH3COONa, 3H20
5 g
Citrate biammonique
2 g
MgS04, 7H20
0,2 g
MnS04, 4H20
0,05 g
Eau distillée
1 1
*(polyoxyéthylènesorbitanmonooléate)
On cultive individuellement un certain nombre d'échantillons de la souche N° S 36-2 qui n'ont pas subi le traitement à l'acriflavine et les colonies ci-dessus qui ont subi le traitement à l'acriflavine. On constate qu'environ 60% de ces colonies sont incapables de croître sur le milieu ci-dessus où la N-acétyl-D-glucosamine est la source principale de carbone assimilable, alors que seulement 1 % des échantillons de référence n'en est pas capable. On vérifie en suspension aqueuse à 10% de lait écrémé en poudre et 0,1% d'extrait de levure que les colonies qui ne sont pas capables de métaboliser la N-acétyl-D-glucosamine produisent en 8 h des quantités d'acide lactique comprises entre 1,3 et 1,6%, à savoir autant que la souche N° S 13-8. Au contraire, les échantillons de référence sont pratiquement tous capables de croître sur le milieu MRS modifié et ils produisent en 8 h 2,3-2,6% d'acide lactique sur le milieu de lait écrémé en poudre et d'extrait de levure. Cette propriété demeure intacte tant que l'on cultive ou maintient des échantillons sur le milieu MRS modifié.
On vérifie par des techniques appropriées d'hydrolyse, de séparation par centrifugation sous gradient de densité de CICs-bromure d'éthidium, et de microscopie électronique, que c'est un plasmide de 13,17 kb, présent dans la souche N° S 36-2, absent dans la souche N° S 13-8 et neutralisé dans la souche N° S 36-2 traitée à l'acriflavine, qui est responsable, d'une part, de l'élévation de la production d'acide lactique de environ 1,5 à environ 2,4%, telle que déterminée ci-dessus et, d'autre part, de la métabolisation de la N-acétyl-D-glucosamine.
R

Claims (2)

640 568 2 REVENDICATIONS
1. Procédé de production ou maintien d'une culture stable d'un micro-organisme du genre Lactobacillus présentant au moins un élément génétique extrachromosomal stimulant, d'une part, son aptitude à produire de l'acide lactique à partir du lactose et contrôlant, d'autre part, son aptitude à métaboliser la N-acétyl-D-glucosamine, caractérisé par le fait que l'on cultive et maintient le micro-orga-nisme dans un milieu nutritif dont la source principale de carbone assimilable est constituée par la N-acétyl-D-glucosamine.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le micro-organisme est le Lactobacillus helveticus de la sous-espèce jugurti de N° S 36-2 de l'Institut de microbiologie agronomique de l'Université de Bologne en Italie.
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