DE60005028T2

DE60005028T2 - Verwendung von streptococcus thermophilus stämmen in milchprodukten, die harnstoff nicht hydrolisieren können

Info

Publication number: DE60005028T2
Application number: DE60005028T
Authority: DE
Inventors: Anne-Marie Sepulchre; Christophe Monnet; Georges Corrieu
Original assignee: TEXEL DANGE SAINT ROMAIN SOC; Texel Ste; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: TEXEL DANGE SAINT ROMAIN SOC; Texel Ste; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1999-09-17
Filing date: 2000-09-15
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2020-09-16
Also published as: FR2798560A1; EP1211947B1; ATE248521T1; EP1211947A1; PT1211947E; PL354101A1; BR0014522A; AU7527400A; ES2207555T3; WO2001022828A1; US6962721B1; AU775269B2; NO20021319D0; NO20021319L; FR2798560B1; DE60005028D1; NZ518222A; DK1211947T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Beherrschung der Kinetik der Ansäuerung von Milch bei der Herstellung von Käsen oder von fermentierten Milchprodukten wie Joghurts durch Einsatz von Bakterien Streptococcus thermophilus, welche wenigstens teilweise, bevorzugt vollständig unfähig sind, Harnstoff zu hydrolysieren.
Streptococcus thermophilus ist ein thermophiles Milchbakterium, welches als Milchferment in der Milchindustrie verwendet wird. Hauptsächlich verwendet bei der Herstellung von fermentierten Milchprodukten wie Joghurt wird es jetzt mehr und mehr bei der Herstellung von Käsen verwendet.
Dieses Bakterium wandelt die Lactose in Milchsäure um und weist daher eine ansäuernde Aktivität auf. Insbesondere im Fall von Käsen begünstigt diese Ansäuerung nicht nur die; Wirkung von Lab und die Synäresis des Gerinnens, sondern hindert auch das Wachstum von zahlreichen unerwünschten Bakterien, wovon einige pathogene Bakterien sind, und erlaubt darüber hinaus mehr oder weniger rasch ihre Ausschaltung.
Die ansäuernde Aktivität dieses Bakteriums wird jedoch von einer Aktivität der Hydrolyse von Harnstoff begleitet, eine Aktivität, welche die Kinetik der Ansäuerung beeinträchtigt. Tinson et al (1982a) haben gezeigt, daß die Hydrolysereaktion von Harnstoff, welche Kohlendioxid und Ammoniak ergibt, eine zeitweilige Verminderung der Geschwindigkeit der Ansäuerung induziert, gemessen durch eine pH-Sonde. Die Autoren dieses Aufsatzes haben daraus geschlossen, daß man die Veränderungen des pH-Wertes zur Messung der Erzeugung von Milchsäure in Kulturen von S. thermophilus nicht verwenden kann, da die Ergebnisse, welche man erhalten würde, wegen der Erzeugung von Ammoniak falsch seien. Darüber hinaus haben Spinnler und Corrieu 1989 beobachtet, daß eine Zugabe von Harnstoff zu einer Absenkung der Ansäuerungsgeschwindigkeit führt.
Im industriellen Maßstab stellt die Hydrolyse von Harnstoff durch Streptococcus thermophilus eine bestimmte Anzahl von Problemen dar.
Tatsächlich müssen beispielsweise bei Käseherstellungen die technischen Vorgänge (Zerkleinern der geronnenen Milch, das Umrühren, etc.) bei bestimmten vorgegebenen pH-Werten erfolgen, in der Praxis werden diese Arbeitsvorgänge jedoch im allgemeinen zu vorbestimmten Zeiten durchgeführt. Hieraus bringen die Veränderungen der Ansäuerungsaktivität als Folge der Hydrolyse von Harnstoff Fehler und wesentliche Veränderungen bei den Käsen (Textur, Feuchtigkeitsgehalt, Weiterbehandlung) mit sich. Martin et al (1997) haben so beobachten, daß die Veränderungen von Gehalten an Harnstoff Modifikationen in den kinetischen Abläufen der Ansäuerung und in der Textur der Käse vom Reblochontyp hervorriefen, welche die von Spinnler und Corrieu (1989) erhaltenen Ergebnisse bestätigten.
Darüber hinaus erhöht die Erzeugung von Ammoniak die erforderliche Zeit zum Erreichen eines vorgegebenen pH. Dieses überträgt sich in eine stärkere Immobilisierung des Materials wie auch in eine Erhöhung der Gefahr der Kontaminierung durch unerwünschte Mikroorganismen.
Darüber hinaus ist es erwünscht, daß die Molke bei der Käseherstellung nicht eine Überschußmenge von Ammoniak enthält, da diese Molke häufig als Tierfutter verwendet wird.
Diese Erscheinung ist schwierig zu beherrschen, insbesondere da der Gehalt der Milch an Harnstoff variabel (im allgemeinen von 2 bis 8 mM) ist, und daß er insbesondere von der Ernährung des Weideviehs abhängt. Zur Lösung dieses Problems haben Martin et al (1997) vorgeschlagen, die Gehalte an der Milch an Harnstoff zu messen und anschließend die Herstellungsparameter anzupassen. Jedoch ist der Einsatz eines solchen Systems der Dosierung von Harnstoff sehr umständlich und löste überhaupt nicht die Mängel, die Folge einer Verlangsamung der Ansäuerungsgeschwindigkeit in Anwesenheit von Harnstoff (längere Dauer der Immobilisierung des Materials, Erhöhung der Gefahr der Kontamination, etc.) und einem erhöhten Gehalt der Molke an Ammoniak sind.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß die Verwendung von Stämmen von Streptococcus thermophi- lus, welche nicht oder nicht vollständig Harnstoff hydroly- sieren, als Milchfermente bei der Herstellung von Milchprodukten es erlaubten, die zuvor genannten Probleme zu lösen. Diese Stämme werden als "Stämme ur(–)" in der vorliegenden Beschreibung verwendet.
Bislang sind die einzigen Stämme von Streptococcus thermophilus ur(–), die beschrieben wurden, der Stamm CNRZ 407 (Juilliard et al, 1988) und der Mutantenstamm, isoliert von Tinson et al (1982b). Jedoch erlaubten es die bekannten Informationen dieser beiden Stämme es nicht, über das technische Interesse der Stämme ur(–) zu berichten.
Die vorliegende Erfindung hat daher das Ziel der Verwendung von wenigstens einem Stamm Streptococcus thermophilus, der wenigstens teilweise und bevorzugt vollständig zur Hydrolyse von Harnstoff bei der Herstellung von Käsen oder fermentierten Milchprodukten, wie Joghurten, nicht in der Lage ist, um eine kinetische Ansäuerung zu erhalten, welche von dem Gehalt der Milch an ihren Bestandteilen im wesentlichen unabhängig ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter "Kinetik der Ansäuerung" die Veränderung des pH des Fermentationsmediums in Abhängigkeit von der Zeit zu verstehen.
Unter "Gehalt der Milch an ihren Bestandteilen" versteht man insbesondere die Gehalte an Harnstoff in diesen Milchsorten, welche sich von einer Milch zu einer anderen Milch entsprechend dem Ursprung des Tieres oder seinem Futter unterscheiden. Ebenfalls versteht man darunter die Gehalte an an deren Bestandteilen der Milch, welche in dem Metabolismus von Harnstoff eingebunden sind. Unter diesen Bestandteilen kann man beispielsweise Nickel oder Kobalt zitieren. Diese Bestandteile können natürlich in dem eingesetzten Ausgangsmaterial (der Milch) vorliegen oder zugesetzt sein.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls ein Verfahren zum Ziel, um bei der Herstellung von Käsen oder fermentierten Milchprodukten wie von Joghurtprodukten eine Kinetik der Ansäuerung zu erhalten, welche im wesentlichen unabhängig von dem Gehalt der Milch an ihren Bestandteilen ist, bei welchem man der Milch wenigstens einen Stamm Streptococcus thermophilus zugibt, welcher wenigstens teilweise und bevorzugt vollständig zur Hydrolyse von Harnstoff nicht in der Lage ist.
Die Stämme Streptococcus thermophilus ur(-), welche gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können durch eine Mutagenbehandlung oder durch spontane Mutation erhalten werden oder auch aus der Natur isoliert werden.
Die Stämme 298-K und 298-10, welche eine spontane Mutante bzw. eine nach einer Mutagenbehandlung erhaltene Mutante sind, wurden bei CNCM am 14. September 1999 unter den Nummern I-2311 bzw. I-2312 hinterlegt.
Jeder Stamm ur(–), der gemäß dem Protokoll von Tinson et al (1982b) oder vorzugsweise gemäß dem in Beispiel I beschriebenen Protokoll klassiert wurde, kann ebenfalls verwendet werden.
Die Stämme von Streptococcus thermophilus ur(–) können alleine oder in Mischung mit anderen Mikroorganismen wie Laktokokken oder jedem anderen in der Milchindustrie einsetzbaren Mikroorganismus verwendet werden.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, daß das Interesse an Stämmen Streptococcus thermophilus ur(–) mehrfach besteht. Tatsächlich haben sie gezeigt, daß die Mutanten ur(–) nicht nur die Beherrschung der Veränderungen der kinetischen Ansäuerung erlauben, sondern daß sie darüber hinaus stabil sind und ein gutes Wachstum in der Milch zeigen.
Darüber hinaus erlauben es die Stämme ur(–), regelmäßige kinetische Ansäuerungen der Milch zu erhalten, welche keine zeitweilige Verlangsamung, die Funktion der Ansammlung von Harnstoff ist, zeigen, im Gegensatz zu bei den mit Stämmen ur(+) beobachteten kinetischen Verhalten.
Die Stämme ur(–) erzeugen Ammoniak nicht bei ihrem Wachstum in der Milch, welches vorteilhaft unter dem Gesichtspunkt einer Verwendung der Molke als Tierfutter ist.
Schließlich weisen die für den Phänotyp ur(–) ausgewählten Stämme in überraschender Weise variable Ansäuerungsmuster auf, im Vergleich zu dem kinetischen Verhalten bei der Ansäuerung, das mit Ausgangsstämmen beobachtet wurde.
Unter "variable kinetische Ansäuerung" versteht man eine Kinetik der Ansäuerung, beispielsweise rascher oder langsamer im Vergleich zu dem kinetischen Verhalten der Ansäuerung, das mit den Ausgangsstämmen beobachtet wird. Ebenfalls kann man. von "Heterogenität" zwischen dem kinetischen Verhalten der Ansäuerung von unterschiedlichen Mutanten ur(–) gegenüber den Ausgangsstämmen sprechen.
Die Erfindung hat daher ebenfalls das Ziel eines Verfahrens der Auswahl von Stämmen Streptococcus thermophilus, welche bei der Herstellung von Käsen oder von fermentierten Milchprodukten verwendet werden, wobei die Stämme von Mutanten von Streptococcus thermophilus zumindest teilweise und bevorzugt vollständig nicht in der Lage sind, Harnstoff zu hydrolysieren, es ermöglichen, eine Kinetik der Ansäuerung zu erreichen, welche im wesentlichen unabhängig von dem Gehalt der Milch an ihren Bestandteilen ist, die hinsichtlich ihrer Fähigkeit ausgewählt sind, eine Milch mit variablen kinetischen Ansäuerungen im Vergleich zu kinetischen Ansäuerungen der Ausgangsstämme anzusäuern.
Allgemein kann die Auswahl der Ansäuerungseigenschaften der Stämme ur(–) in Abhängigkeit von der Technologie der Käseherstellung oder der Herstellung von fermentierten Milch produkten, bei denen diese Stämme eingesetzt werden, erfol- gen.
Daher zeichnen sich bestimmte Stämme ur(–) insbesondere durch ein Fehlen der Erscheinung der Nachansäuerung aus.
Für andere Stämme erweist sich die zum Erreichen eines vorgegebenen pH-Wertes erforderliche Zeit kürzer als für die Ausgangsstämme ur(+). Daher erlaubt es diese Eigenschaft, die Milch mit einem Stamm der Mutanteur(–) mit einem geringeren Prozentsatz zu impfen gegenüber dem Prozentsatz, der üblicherweise für den Ausgangsstamm ur(+) verwendet wird. Dieser Prozentsatz kann unterhalb von ungefähr 25% liegen, d.h. bei ungefähr 50%, bezogen auf den Prozentsatz, der für den Ausgangsstamm verwendet würde.
Die vorliegende Erfindung hat daher ein Verfahren gemäß der Erfindung zur Aufgabe, bei welchem man der Milch wenigstens einen Stamm von der Mutante Streptococcus thermophillis zusetzt, welcher wenigstens teilweise und bevorzugt vollständig nicht in der Lage ist, Harnstoff zu hydrolysieren, und zwar bei einem Prozentsatz der Impfung, der üblicherweise unterhalb des Prozentsatzes der Impfung liegt, die bei dem Ausgangsstamm Streptococcus thermophilus, der zur Hydrolyse von Harnstoff in der Lage ist, verwendet wird.
Die angefügten Figuren der Beispiele erläutern die Erfindung, ohne ihren Umfang einzuschränken.
LEGENDE DER FIGUREN
Die 1 gibt die Ansäuerungskurven von entrahmter rekonstituierter Milch wieder, die mit dem Stamm RD298 ur(+) wie auch mit den spontanen Mutanten ur(–) (1A) erhalten wurden, oder die nach einer Behandlung mit NTG (1B) erhalten wurden.
Die 2 gibt die Ansäuerungskurven von rekonstituierter entrahmter Milch wieder, die mit dem Stamm ST888 wie auch mit den spontanen Mutanten ur(–) (2A) erhalten wurden, oder die nach einer Behandlung mit NTG (2B) erhalten wurden.
Die 3 gibt die Ansäuerungskurven von entrahmter Milch UHT wieder, die mit dem Stamm RD298 wie auch mit den spontanen Mutanten ur(–) (3A) erhalten wurden oder die nach einer Behandlung mit NTG (3B) erhalten wurden.
Die 4 gibt die Ansäuerungskurven von entrahmter Milch UHT wieder, die mit dem Stamm ST888 wie auch mit den spontanen Mutanten ur(–) (4A) erhalten wurden oder die mit einer Behandlung mit NTG (4B) erhalten wurden.
Die 5 gibt die Ansäuerungskurven wieder, welche mit dem Stamm RD298 (5A) und den Mutanten ur(–) RD 298-K (5B) und RD298-10 (5C) an entrahmter Milch UHT, ergänzt mit unterschiedlichen Harnstoffmengen, erhalten wurden.
Die 6 gibt die Ansäuerungskurven wieder, welche mit dem Stamm RD298 (6A) und den Mutanten ur(–) RD298-K (6B) und RD298-10 (6C) an entrahmter Milch UHT, ergänzt oder nicht ergänzt mit Nickel (10 μg/l NiSO₄·7 H₂O) erhalten wurden.
Die 7 gibt die Ansäuerungskurven wieder, welche mit dem Stamm RD672 und Mutanten ur(–), die aus diesem Stamm hervorgingen, an entrahmter rekonstituierter Milch erhalten wurden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Methode der Gewinnung von Bakterien ur(–) auf Petrischale
Ein Gelatinemedium, dessen Zusammensetzung in der Tabelle 1 angegeben ist, wird hergestellt und in Petrischalen mit einem Durchmesser von 9 cm eingegossen. Tabelle 1 Zusammensetzung des Gewinnungsmediums
Gegebenenfalls kann man diesem Medium einen Cofaktor von Urease zusetzen. Einstellen des pH auf 7,0 und Autoklavenbehandlung für 15 Minuten bei 115°C.
Die Zellen von zu analysierendem St. thermophilus werden auf diesem Medium derart eingeimpft, um ungefähr 100 Kolonien pro Petrischale zu erhalten. Die Kulturen werden anaerob bei einer Temperatur von 35–45°C, bevorzugt 37–42°C gehalten.
Nach Kultivierung für zwei Tage gießt man auf jede Petrischale ungefähr 20 ml einer Gelierlösung, hergestellt in folgender Weise: Auflösen unter Erwärmen von 15 g Agar in 1 l einer Natriumphosphatpufferlösung von 50 mM (pH 6), ergänzt; mit 100 mg/l Bromthymol, Abkühlen der Lösung auf 50°C, Zugabe von 10 g Harnstoff und Ansäuern des Mediums mit Salzsäure bis zum Erhalt einer gelb-orangen Färbung.
Nach Verfestigung des Geliermaterials werden die Petrischalen 1 h bei 37°C inkubiert. Die Klone ur(+) bilden Halos von blauer Farbe als Folgeder Bildung von Ammoniak, während die Klone ur(–) gelbe Kolonien bilden. Wenn die Mutanten ur(–) untersucht werden, werden die keinen blauen Halo bil- denden Klone gewonnen und erneut auf demselben Untersuchungsmedium getestet, um die Eigenschaft ur(–) zu bestätigen. Es genügt ebenfalls zu verifizieren, daß die Mutanten Harnstoff nicht verbrauchen, um die Eigenschaft ur(–) zu bestätigen. Es genügt ebenfalls zu verifizieren, daß diese Mutanten Harnstoff nicht verbrauchen (oder ihn nur teilweise verbrauchen), wenn sie in Milch kultiviert werden.
Beispiel 2
Selektion von Mutanten für den Metabolismus von Harnstoff Die Harnstoff nicht verbrauchenden Mutanten oder ihn nur schwach verbrauchenden Mutanten wurden aus den Stämmen St. thermophilus RD298, RD672 und ST888 untersucht. Zwei Versuche wurden angewandt. Bei dem ersten Versuch wurden die Mutanten nach einer Behandlung mit einem Mutagenmittel untersucht, während bei dem zweiten Versuch die spontanen Mutanten untersucht wurden.
a) Selektion mit Hilfe eines Mutagenmittels
Die Mutagenbehandlung wird wie im folgenden beschrieben durchgeführt.
Die Stämme werden bei 42°C in 5 ml Bouillon M17 (Terzaghi und Sandine, 1975) kultiviert. Die Kultur wird am Ende der exponentiellen Phase angehalten, und die Zellen werden durch Zentrifugieren gewonnen, dann mit einem Phosphatpuffer 100 mM (pH 7) gewaschen. Die Zellen werden anschließend in 1 ml Puffer, der einen variablen Gehalt an N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) enthält, eingegeben und während 1 Stunde bei 42°C inkubiert. Die Zellen werden anschließend zweimal mit 5 ml Puffer gewaschen und in dem Untersuchungsmedium eingeimpft, um ungefähr 100 Kolonien pro Petrischale zu erhalten. Die Untersuchung wird wie zuvor (Beispiel 1) beschrieben durchgeführt. Die Tabelle 2 beschreibt die während 3 Mutagenbehandlungen erhaltenen Ergebnisse.
Tabelle 2
Selektion von Mutanten ur(–) nach Behandlung mit einem Mutagenmittel (NTG).
b) Selektion von spontanen Mutanten
In einer Population von Mikroorganismen existieren häufig spontane Mutanten für ein Gen oder eine vorgegebene Eigenschaft. Dieser Mutantentyp ist sehr interessant, da überhaupt kein Mutagenmittel verwendet wurde, was die Gefahr der Induzierung von nicht untersuchten Mutationen (anders als für die untersuchte Eigenschaft) unterdrückt, wobei diese die technologischen Fähigkeiten der Stämme verändern könnten. Jedoch ist die Häufigkeit von spontanen Mutanten innerhalb einer Population für eine vorgegebene Eigenschaft im allgemeinen sehr gering, in der Größenordnung von 1 zu 1 Million (variabel als Funktion der Stämme und ihrer Eigenschaften). Daher erfordert die Selektion von spontanen Mutanten im allgemeinen entweder den Einsatz einer Methode, welche die Untersuchung einer sehr großen Zahl von Klonen ermöglicht, oder die Auswahl einer Anreicherungsmethode für Mutanten. Keine Arbeitsweise der Anreicherung von Mutanten ur(–) wurde zuvor beschrieben. Darüber hinaus ist zu erwarten, daß wegen der Tatsache, daß die Arbeitsweise der Untersuchung an Petrischalen die Analyse von mehr als 100 Kolonien von St. thermophilus pro Schale nicht erlaubt, daß die Selektion von spontanen Mutanten nicht realisierbar wäre, da die Untersuchung von mehreren tausend, beispielsweise Dutzenden von tausenden Petrischalen erforderlich wäre, um Chancen zur Isolierung einer spontanen Mutante zu haben. Dagegen haben die Autoren der vorliegenden Erfindung erkannt, daß in Kulturen von St. thermophilus der Anteil von spontanen Mutanten ur(–) erhöht war (ungefähr 1 zu 2500 für ST888, 1 zu 4000 für RD672 und 1 zu 1200 für RD298) und daß es daher möglich war, in einfacher Weise diesen Mutantentyp zu isolieren (Tabelle 3).
Tabelle 3
Selektion von spontanen Mutanten ur(–). Das verwendete Protokoll ist dasselbe, wie es in Absatz a) "Se- lektion mit Hilfe eines Mutagenmittels" beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß das Mutagenmittel weggelassen wird.
Tabelle 3
Selektion von spontanen Mutanten ur(–). Das verwendete Protokoll ist dasselbe, wie es in Absatz a) "Auswahl mit Hilfe eines Mutagenmittels" beschrieben wurde, ausgenommen das Weglassen des Mutagenmittels.
47 von 90 erhaltenen Mutanten wurden untersucht. Die Ergebnisse, welche die Stabilität, die enzymatische Charakterisierung wie auch das Ansäuerungsverhalten dieser Mutanten betreffen, sind im folgenden beschrieben.
Beispiel 3
Eigenschaften von Mutanten ur(–).
a) Stabilität von Mutanten
Um im industriellen Maßstab verwendbar zu sein, müssen die Mutanten ur(-) stabil sein. Es existierte überhaupt keine Angabe hinsichtlich der Stabilitäten von Mutanten ur(–) von St. thermophilus. Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben die Stabilität von 47 Mutanten, herrührend aus den Stämmen ST888, RD672 und RD298 untersucht. Die Stämme wurden täglich in 10 ml Bouillon M17 und dies während 20 Tagen eingeimpft. Die Kulturen wurden mit 1% eingeimpft und bei 42°C inkubiert. Die Gesamtheit von 20 erneuten Einimpfungen stellt ungefähr 130 Generationen dar. Nach der 20sten erneuten Einimpfung wurden die Stämme in Milch erneut eingegeben und man bestimmte, ob sie Harnstoff verbrauchten oder nicht verbrauchten (Kulturen von 15 Stunden bei 42°C). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Es wurde festgestellt, daß die Mutanten ur(–), erhalten entweder durch eine Mutagenbehandlung oder wenn es sich um spontane Mutanten handelte, sehr stabil sind. Tatsächlich wurden lediglich zwei Rückumwandlungen an den 47 untersuchten Mutanten festgestellt.
Tabelle 4
Untersuchung der Stabilität von Mutanten ur(–). Der Verbrauch von Harnstoff wurde an Kulturen auf Milch getestet, und zwar nach 20 aufeinanderfolgenden Einimpfungen in einer Bouillon M17.
b) Enzymatische Charakterisierung von Mutanten
Die untersuchten Stämme wurden während 24 Stunden anaerob und bei 37°C in einer flüssigen Bouillon kultiviert, deren Zusammensetzung in Tabelle 5 angegeben ist. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, mit Puffer gewaschen (HEPES 50 mM – EDTR 1 mM, pH 7,5), dann in einem Puffervolumen wieder eingegeben, das 2% des Volumens der Kultur ausmachte. Die Ureaseaktivität wurde anschließend an von Zellen befreiten Extrakten gemessen (Behandlung der Zellen in einer Kugelbrechapparatur und Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit des Zentrifugierens während 5 min bei 20.000 g). Tabelle 5 Zusammensetzung von für die Herstellung von Extrakten verwendeter Bouillon
Einstellen des pH auf 7,0 und Autoklavenbehandlung während 15 Minuten bei 115°C.
Die Messungen der Ureaseaktivität wurden bei 37°C in Puffer HEPES 50 mM – EDTA 1 mM (pH 7,5) durchgeführt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 25 mM Harnstoff gestartet und man mißt den in 20 Minuten gebildeten Ammoniak unter Verwendung von Nessler-Reagens. Die Ergebnisse sind in Einheiten von Ureaseaktivität (U) (eine Einheit entspricht einem Mikromol erzeugtem Ammoniak pro Minute) pro Milligramm von Protein angegeben.
Die Tabelle 6 gibt die erhaltenen Aktivitätswerte wieder. Die Mutanten ur(–) wiesen keine nachweisbare Ureaseaktivität mit Ausnahme von Mutanten 298-3.17 und 888-1.5 auf. Diese letzteren entsprechen Mutanten vom Phenotyp ur(+) in Anwesenheit von Nickel und ur(–) bei Abwesenheit dieser Verbindung. Außerdem enthielt das verwendete Kulturmedium zur Herstellung von zellfreien Extrakten Nickelsulfat. Bei diesen beiden Stämmen beruht die Mutation wahrscheinlich auf dem System des Nickeltransportes oder auf dem System, das seinen Einbau in den aktiven Platz der Urease erlaubt.
Diese Stämme von St. thermophilus könnten ebenfalls einen Phänotyp ur(–) als Folge der Unfähigkeit zum Transport von Harnstoff aufweisen. Solche Stämme besitzen daher immer eine meßbare Ureaseaktivität in zellfreien Extrakten.
Tabelle 6 Messung der Ureaseaktivität von zellfreien Extrakten, erhalten aus Ausgangsstämmen wie aus Mutanten ur(–).
c) Säuerungsverhalten von Mutanten
Um den technischen Vorteil von Stämmen ur(–) zu zeigen, haben die Autoren der Erfindung ihre Ansäuerungscharakteri stika mit denjenigen von entsprechenden Ausgangsstämmen verglichen.
Es wurden die folgenden Ergebnisse festgestellt:

– im Gegensatz zu Ausgangsstämmen zeigen die Mutanten ur(–) keine zeitweilige Verlangsamung der Ansäuerungsgeschwindig- keit als Folge der Hydrolyse von Harnstoff, ihre Ansäuerungskurven sind daher regelmäßiger;
– die Kinetik der Ansäuerung von Milch durch die Mutanten ur(–) sind gering oder überhaupt nicht durch die Gehalte an Harnstoff, an Nickel und an Kobalt beeinträchtigt;
– darüber hinaus beobachtet man eine starke Variabilität der Ansäuerungsaktivitäten zwischen den Mutanten ur(–), bezogen auf die Ansäuerungsaktivitäten von Ausgangsstämmen.

Die Einzelheiten der erhaltenen Ergebnisse werden im folgenden angegeben. Die Kulturen wurden mit 1% mit einer Vorkultur geimpft, realisiert auf entrahmter rekonstituierter sterilisierter Milch, anschließend kultiviert bei 37°C.
– Kulturen in rekonstituierter entrahmter Milch
Die Milch wurde bei 100 g/l rekonstituiert und während 10 Minuten bei 90°C pasteurisiert.
Nach ungefähr 2 Stunden Kultivierung beobachtet man ein Ansteigen des pH in der Kultur des Stammes RD298 (1). Die 6 spontanen Mutanten zeigen eine regelmäßigere Ansäuerungskurve ohne Ansteigen des pH und ohne zeitweilige Verlangsamung der Ansäuerungsgeschwindigkeit. Bei bestimmten Zeitpunkten der Kultur erreicht die Absenkung der Ansäuerung, bezogen auf den Ausgangsstamm, nahezu 4 Stunden. Dies ermöglicht daher das schnellere Erreichen eines vorgegebenen pH-Wertes. Das Interesse dieser Beobachtung ist: wenn man einen vorgegebenen pH ohne Verminderung der Inkubationsdauer erreichen will, kann man einen Stamm ur(–) unter Verminderung der Einimpfmenge, bezogen auf die mit einem Stamm ur(+) verwendete Menge, verwenden. Bestimmte der nach einer Behandlung mit NTG erhaltenen Mutanten haben ein ähnliches Verhalten wie die spontanen Mutanten, indem sie das Medium langsamer (298-3.3) oder rascher (298-10) ansäuern.
Mit Ausnahme der Mutante 888-1 zeigen die spontanen Mutanten ur(–) von ST888 dieselbe Ansäuerungskurve. Wie für RD298 beobachtet man eine regelmäßigere und schnellere Ansäuerung mit den Mutanten (2).
– Kulturen in sterilisierter entrahmter Milch UHT (Lactel^®)
Wie für die in rekonstituierter Milch realisierten Kulturen beobachtet man ein zeitweiliges Anhalten der Absenkung von pH mit dem Stamm RD298, wobei diese Erscheinung in den Kulturen von spontanen Mutanten ur(–) (3) fehlt.
Die aus ST888 isolierten Mutanten ur(–), gleichgültig ob sie spontan sind oder durch eine Behandlung mit NTG erhalten wurden, haben eine regelmäßigere Ansäuerungskurve als diejenigen des Ausgangsstammes (4).
– Einfluß der Variationen der Zusammensetzung der Milch auf die Ansäuerungskurven
Der Stamm RD298, wie auch die Mutanten ur(–) 298-K und. 298-10, wurden auf sterilisierter entrahmter Milch UHT, ergänzt oder nicht ergänzt mit unterschiedlichen Mengen von Harnstoff, kultiviert. Die Anfangskonzentration der Milch an Harnstoff war 3 mM, und die Gehalte an Harnstoff von unterschiedlichen Kulturen lagen zwischen den Variationszonen, die man üblicherweise mit Kuhmilch beobachtet. Es wurde festgestellt, daß im Gegensatz zu den Mutanten ur(–) die Ansäuerungskurven, welche mit dem Ausgangsstamm erhalten wurden, sehr abhängig von dem Gehalt der Milch an Harnstoff (5) sind.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben ebenfalls beobachtet, daß die Ansäuerungskurven, welche mit dem Aus gangsstamm erhalten wurden, von dem Gehalt der Milch an Nickel und an Kobalt abhängig sind, wobei dies für die Mutanten ur(–) nicht der Fall ist (6).
– Erzeugung von Ammoniak
In allen zuvor beschriebenen Kulturen beobachtete man, daß die Stämme RD298 und 5T888 Ammoniak erzeugten und die Gesamtheit des in der Milch enthaltenen Harnstoffs hydrolysierten. Keine Erzeugung von Ammoniak wurde mit den Mutanten beobachtet. Dies zeigt an, daß der Harnstoff das Hauptsubstrat ist, welches von St. thermophilus zur Erzeugung von Ammoniak benutzt wird. Daher erlaubt die Verwendung von Stämmen ur(–) die Vermeidung jeder Bildung von Ammoniak als Folge von St. thermophilus bei der Herstellung von Käseprodukten. Daher können die Gehalte an Ammoniak der Molke aus dem Käsebetrieb limitiert werden.
– Variabilität der Ansäuerungsaktivitäten
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben interessanterweise beobachtet, daß die Ansäuerungskurven in rekonstituierter entrahmter Milch, erhalten mit mehreren Mutantenstämmen ur(–) wesentliche Variationen bezogen auf die Kurve, welche mit ihrem Ausgangsstamm erhalten wurde, zeigten.
Die 7 zeigt daher die Ansäuerungskurven von rekonstituierter entrahmter Milch, erhalten mit dem Stamm RD672, wie auch mit den Mutanten ur(–), die aus diesem Stamm herrühren.
Der Stamm RD672 ist wenig ansäuernd (Technologie des Typs weicher solubilisierter Teig). Die Mutante 672-47(0) ist wesentlich stärker ansäuernd als der Ausgangsstamm, während die Mutante 672-36(50) eine ziemlich naheliegende kinetische Ansäuerung zeigt. Die Mutante 672-70(0) ist stark weniger ansäuernd als der Ausgangsstamm, und die Mutante 672-24(50) ist ein wenig geringer ansäuernd als der Ausgangsstamm.
Beispiel 4
Herstellung von Käsen vom Typ "weicher solubilisierter Teig" unter Einsatz entweder des industriellen Stammes ur(+) RD298 oder des Mutantenstammes ur(–) 298-10 (Mutante von RD298).
a) Allgemeine Angaben
Unter der allgemeinen Käsebezeichnung findet sich eine sehr große Anzahl von Produkten, die sehr unterschiedliche Technologie, Flora und organoleptische Eigenschaften besitzen.
Hinsichtlich der Technologie resultiert der Käse in erster Linie aus der Koagulation von Milch, welche durch Impfung mit Kälberlab erhalten wurden, gefolgt von Abtropfenlassen des so erhaltenen Koagulates (mechanische Operationen wie Zerschneiden, Umrühren und Umwenden).
Im Verlauf der Herstellung bewirkt die Entwicklung von zugesetzten Fermenten eine Absenkung des pH des Koagulates. Die Kinetik der Ansäuerung (Entwicklung des pH als Funktion der Zeit) und die Kinetik des Abtropfens bestimmen die endgültige Zusammensetzung des Quarks und damit die hiermit verbundenen Eigenschaften der Käse. Daher ist für eine vorgegebene Technologie die Beherrschung der Kinetik in der Ansäurung und des Abtropfens essentiell.
b) Besonderheiten der angewandten Technologie für "weicher solubilisierter Teig"
Die Herstellung von Käsen vom Typ "weicher solubilisierter Teig" entspricht dem Einsatz einer Technologie mit enzymatischer Dominanz (wesentliche Rolle des Kälberlabs) mit spezifischen Profilen der Herstellungstemperatur, wie diese in der Tabelle 7 beschrieben sind.
Die Durchführung des Abtropfens ist ausgezeichnet durch:

– eine wesentliche Ansäuerung zu Beginn des Verfahrens, welche das Niveau des Abtropfens bestimmt. Die Ansäuerung wird durch Streptococcus thermophils sichergestellt; die untersuchten pH-Werte zum Erreichen von unterschiedlichen Stadien der Herstellung sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
– Eine rasche Entfernung der Molke, unterstützt durch mechanische Arbeitsvorgänge (Zerschneiden, Umrühren und Formung des Koagulates bzw. Bruches).
– Arbeitsvorgänge, welche die Entfernung der Molke erleich- tern (Wenden).

c) Abfolge der Käseherstellungen
Die Tabelle 7 zeigt die unterschiedlichen Stufen der durchgeführten technologischen Herstellungen und gibt die technologischen Zeiten an, die bei jedem Versuch zum Erreichen der untersuchten pH-Werte von jeder dieser Stufen erforderlich waren.
Zwei unterschiedliche Milchsorten wurden verwendet, die bei einer weniger als 1 mM Harnstoff und für die andere 5 mM Harnstoff enthielten. Die verwendeten Fermente wurden aus einem industriellen Stamm RD298, der für seine Fähigkeit zum Hydrolysieren von Harnstoff ur(+) bekannt ist, der Stamm 298-10, eine spontane Mutante dieses Stammes, welche von der Fähhigkeit zur Hydrolyse von Harnstoff befreit war ur(–) gebildet.
Die Abfolgen der Ansäuerung der eine sehr geringe Menge von Harnstoff (weniger als 1 mM) enthaltenden Milch zeigten, daß die beiden eingesetzten Stämme das Erreichen von untersuchten pH-Werten in jeder Stufe in annähernd identischen Zeiten erlaubten. In gleicher Weise werden diese Ziele mit dem Stamm 298-10 ur(–) erreicht, wenn die Herstellungsmilch signifikante Harnstoffmengen (5 mM) enthält. Im Gegensatz dazu war es bei der Herstellung mit dem Stamm RD298 in der Milch, welche 5 mM Harnstoff enthielt, zum Erreichen der gewünschten pH-Werte erforderlich, die Arbeitszeiten beträchtlich zu verlängern.
Diese Untersuchung zeigt daher den technologischen Vorteil, der bei der Mutante 298-10 ur(–) gegeben ist, verglichen mit dem industriellen Mutterstamm RD298 ur(+).
BIBLIOGRAPHIE

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– Tinson W., Ratcliff M.F., Hillier A.J., Jago G.R. 1982b. Metabolism of Streptococcus thermophilus. 3. Influence on the level of bacterial metabolites in cheddar cheese. Australian Journal of Dairy Technology. 37:17-21.

Claims

Verwendung wenigstens eines Stammes von Streptococcus thermophilus, der wenigstens partiell, bevorzugt vollständig, zur Hydrolyse von Harnstoff nicht fähig ist, bei der Herstellung von fermentierten Käsen oder Milchprodukten, wie bei Joghurts, um eine kinetische Ansäuerung, die im wesentlichen unabhängig von dem Gehalt von Milch an ihren Bestandteilen ist, zu erhalten.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher die kinetische Ansäuerung im wesentlichen unabhängig von dem Gehalt der Milch an Harnstoff ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher die kinetische Ansäuerung der Milch im wesentlichen unabhängig von dem Gehalt der Milch an Nickel oder Kobalt ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welcher die kinetische Ansäuerung der Milch keine temporäre Verlangsamung darstellt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welcher der Stamm Streptococcus thermophilus der Stamm 298-K, hinterlegt bei der CNCM unter der Nummer I-2311, ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welcher der Stamm Streptococcus thermophilus der Stamm 298-10, hinterlegt bei der CNCM unter der Nummer I-2312, ist.
Verfahren, um bei der Herstellung von fermentierten Käsen oder Milchprodukten, wie bei Joghurts, eine kinetische Ansäuerung, die im wesentlichen -unabhängig von dem Gehalt von Milch an ihren Bestandteilen ist, zu erhalten, bei welchem mein der Milch wenigstens einen Stamm von Streptococcus thermophi- lus eingibt, der wenigstens partiell, bevorzugt vollständig, zur Hydrolyse von Harnstoff nicht fähig ist,
Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem. man der Milch wenigstens eine Mutante vom Stamm Streptococcus thermophilus, die wenigstens partiell, bevorzugt vollständig, zur Hydrolyse von Harnstoff nicht fähig ist, mit einem Impfgrad unterhalb des verwendeten Impfgrades für den Stamm Streptococcus thermophilus, der zur Hydrolyse von Harnstoff fähig ist, eingibt.
Verfahren zur Auswahl von Stämmen Streptococcus thermophilus, die bei der Herstellung von fermentierten Käsen oder Milchprodukten verwendet werden, umfassend: – den Vergleich der kinetischen Ansäuerung der Milch in Anwesenheit einer zu untersuchenden, wenigstens partiell, bevorzugt vollständig, zur Hydrolyse von Harnstoff nicht fähigen Mutante des Stammes Streptococcus thermophilus, was den Erhalt einer von dem Gehalt der Milch an ihren Bestandteilen im wesentlichen unabhängigen kinetischen Ansäuerung erlaubt, mit der kinetischen Ansäuerung der Milch in Anwesenheit eines Elternstammes des Mutanten-Stammes; – die Auswahl von Mutanten des Stammes von Streptococcus thermophilus, die zur Ansäuerung einer Milch gemäß variabler kinetischen Ansäuerung, bezogen auf kinetische Ansäuerung der Elternstämme, fähig sind.