KR20210129073A - 생 약독화된 인플루엔자 백신 조성물 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 방어를 제공하기 위해 비강내로 전달될 수 있는 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 조성물을 제조 및 수득하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 LAIV 균주는 야생형 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 균주의 표면 당단백질 유전자를 함유하는 마스터 공여자 바이러스 (MDV)의 저온 적응, 온도 민감성 및 약독화된 표현형을 기반으로 한다. 또한, 상기 LAIV 균주는 MDCK 세포 (마딘 다르비(Madin Darby) 개 신장 세포)에서 성장하도록 추가로 적합화된다. 유정란 사용은 대규모 백신 제조에서는 회피되고 있다. 정제 프로세스는 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는다. 상기 LAIV 조성물은 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스를 포함하고, 중합체 및 계면활성제를 포함하지 않는다.

Description

생 약독화된 인플루엔자 백신 조성물 및 그의 제조 방법

본 개시내용은 바이러스 백신 제조 분야에 관한 것이고, 더욱 특히 본 개시내용은 생 약독화된 인플루엔자 백신 조성물 및 그를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 세포 배양에 의해 제조되는 바이러스, 또는 바이러스 항원을 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 수득가능한 바이러스 또는 바이러스 항원, 및 상기 바이러스 또는 바이러스 항원을 함유하는 백신에 관한 것이다.

하기 본원의 배경 정보는 본 개시내용에 관한 것이지만, 반드시 선행 기술일 필요는 없다.

감염원으로 인한 전염병 및 범유행은 수세기 동안 다양한 이환율과 사망률로 주요 혼란을 일으키면서 발생하고 있다. 인플루엔자 바이러스는 범유행 역사에서 주요 참여자 중 하나였다. 지난 세기에 4건의 인플루엔자 범유행이 발생하였으며, 지금까지 최소 15건의 인플루엔자 범유행이 보고되었으며, 1918-19년에만 5천만 명이 사망한 것으로 추산된다.

백신은 바이러스 확산을 통제하는 데 중요한 역할을 하며, 불활성화된 인플루엔자 백신 (IIV) 뿐만 아니라, 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV)이 수년 동안 사용되어 왔다. 널리 사용되는, 비경구적으로 투여되는 불활성화된 인플루엔자 백신은 순환 균주가 항원과 관련하여 백신에 매칭될 때, 인플루엔자 질병을 효과적으로 예방하는 혈청 항체 반응을 유도한다. 대조적으로, 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV)은 자연 감염을 모방하여 비강내로 투여되고, 국부 및 전신 체액성 및 세포성 면역 반응을 모두 유도하여 매칭된 균주 뿐만 아니라 소변이된 균주에 대한 방어를 부여한다. 추가로, LAIV의 무바늘 적용은 허용 임계값을 낮추어 인플루엔자 백신 적용 범위를 증가시킬 수 있다.

현재까지 LAIV는 미국 (2003년 이후), 유럽 (2010년 이후), 러시아 (1980년대 이후) 및 인도 (2010년 이후)에서 라이선스를 받았다. LAIV는 1960년대 미국과 러시아에서 독립적으로, 그러나, 본질적으로는 동일한 방식으로 개발된 약독화된 인플루엔자 A 및 B 마스터 공여자 바이러스 (MDV)를 기반으로 한다. 메드이뮨(MedImmune) 계절성 및 범유행성 LAIV 바이러스는 현재 역 유전학 (RG)을 통해 제조된다. 대조적으로, 러시아 LAIV는 부화 유정란에서 고전 유전자 재편성에 의해 제조되고 있다. 러시아 LAIV는 최근 중국 및 태국에서 사용을 위해 등록 중에 있다.

러시아 LAIV는 (MDV)로부터 유래된 남은 6개의 내부 단백질 유전자 (PB1, PB2, PA, NP, M 및 NS)의 백본 상에 관심 순환 야생형 (WT) 바이러스로부터의 헤마글루티닌 (HA) 및 대부분의 경우 뉴라미니다제 (NA) 유전자 분절을 함유하는, 재편성 바이러스로 이루어진다. A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2) (Len-MDV) 및 B/USSR/60/69 MDV는 현재 러시아에서 LAIV용 MDV로 사용되고 있다. MDV는 다수의 유전자 분절에서 이들을 저온 적응 (ca), 온도 민감성 (ts) 및 약독화 (att) 상태로 만드는 돌연변이를 함유한다. 현 균주의 표면 당단백질 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA)는 재편성에 의해 이들 MDV 내로 도입된다. 그의 ca, ts 및 att 표현형은 LAIV가 저온에서 복제하고, 더 높은 온도(>38℃)에서 복제를 중지하여 상부 호흡기로 복제를 제한함을 나타낸다. 미국에서 사용되는 MDV와 비교하여, 러시아 MDV는 더 적은 수의 돌연변이를 함유하고, 이들은 유전자 분절의 상이한 부위에 존재하며, 이는 이들이 상이하게 약독화될 수 있다는 것을 시사한다. 동물과 사람에서의 직접 비교는, 러시아 MDV와 그로부터 유래된 단일 균주 재편성체가 등가물보다 면역원성이 더 높았다는 것을 시사하였다.

수년에 걸쳐 러시아 LAIV는 7,500만 명 이상의 사람들에게 안전하게 투여되었으며, 약독화 (유전자 안정성) 및 전염 측면에서 안전한 것으로 나타났다. 독성으로의 복귀 (약독화된 표현형의 손실)는 관찰된 바 없고, 이는 1 초과의 유전자 분절 중의 다중 돌연변이의 복귀가 필요하기 때문에 발생할 가능성이 매우 낮다. 러시아 LAIV 바이러스의 신경독성은 보고된 바 없으며, MDV 및 그로부터 유래된 재편성체 모두 신경독성 특성은 없는 것으로 나타났다. LAIV 투여 후, 드문 사례로 보고된 자기 제한성 독감 유사 증상 (콧물, 코막힘, 인후통, 기침, 두통 및 미열)을 제외하면, 면역화와 연관된 심각한 부작용에 대해서는 보고된 바 없다. 안전할 뿐만 아니라, LAIV는 인플루엔자 바이러스 감염으로 유발되는 질병을 방어하는 데 효과적인 것으로 나타났다. LAIV에 의해 유도된 면역은 광범위하고, 소변이된 균주에 대해 방어하는 것으로 나타났다. 특히 소아에서 LAIV는 임상적 방어 및/또는 배양 확인된 인플루엔자에 대한 방어에서 불활성화된 인플루엔자 백신보다 더 효과적인 것으로 나타났으며, 집단 면역도 부여하는 것으로 나타났다.

불활성화된 인플루엔자 백신과 같이, 러시아 LAIV는 발육 닭 유정란을 사용하여 제조되는데, 이는 백신 품질 및 특정 병원균이 없는 유정란(egg)의 제한된 공급업체는 대규모 백신 생산을 위해 유정란을 사용할 수 있으려면 최소 4개월의 준비 기간을 갖고 사전 주문해야 한다는 그 자체의 고유한 단점이 있다. 유정란 부화, 수확 등을 위한 전문 시설이 결국에는 빠른 규모 확장 능력을 제한한다. 유정란 의존형 백신을 생산하는 데 필요한 연장된 시간으로 인해 2009년에 발생한 것과 같은 범유행성 상황에 대응하거나, 고병원성 인플루엔자 바이러스에서 비롯된 범유행을 중단시키는 데 사용가능한 용량이 너무 적을 수 있다. 따라서, 현행 백신 생산 시스템은 인플루엔자 범유행에 대응하기에는 부적절할 것이며, 이에 따라 신규하고 신속한 비상 백신 제조 프로세스가 요구된다. 이론적으로, 세포 배양으로 인플루엔자 백신을 생산하는 것은 범유행의 경우에 중요한 이점을 제공한다. 다른 바이러스 백신의 기존 조직 배양 제조 장치를 사용하여 대규모 백신 제조를 쉽게 달성할 수 있다.

기질 일관성의 유용성과 생산의 유연성에 대한 제어, 범유행인 경우에 특히 중요한 신속한 규모 확장, 유정란 공급 및 닭 무리 유지로부터의 독립성은 조직 배양 방법의 주요 이점이다. 유정란 껍질은 다공성 구조이며, 유정란은 외부에서 비멸균 상태이다. 유정란에서 인플루엔자 바이러스를 성장시키기 위한 제조 프로세스는 접종을 위해 유정란 껍질에 구멍을 뚫고 수확을 위해 개방 취급을 해야 할 필요가 있어 고유한 오염의 위험이 있다. 추가로, 세포 배양은 우수 제조 품질 관리 기준(Good Manufacturing Practic: GMP)에 따라 정의된 세포 배양 배지 및 검증된 세포 은행을 사용하는 더욱 통제된 시스템이다. 따라서, 유정란에서 세포 배양으로 생산을 이전하려는 시도가 있었다.

현재 여러 세포주가 세포 배양 기반 인플루엔자 생산을 위해 연구되고 있으며, MRC-5 세포 (문헌 [de Ona et al. (1995) J Clin Microbiol 33:1948-49] 참조), HepG2 세포 (문헌 [Ollier et al. (2004) J Clin Microbiol 42(12):5861-5] 참조), LLC-MK2 세포 (문헌 [Schepetiuk & Kok (1993) J Virol Methods 42(2-3):241-50] 참조), 마딘-다르비 개 신장(Madin-Darby canine kidney: MDCK) 세포 (문헌 [Tobita et al. (1975) Med Microbiol Immunol ( Berl ). 162(1):9-14 and 23-27] 참조), 아프리카 녹색 원숭이 Vero 세포 (문헌 [Monto et al. (1981) J Clin Microbiol 13(1): 233 -235] 및 [Govorkova et al. (1995) J Infect Dis . 172(1):250-3] 참조), 및 PER.C6 세포 (문헌 [Cox, R.J.et al.; Vaccine 2009, 27, 1889-1897] 참조)의 사용이 보고되었다. 앞서, MRC-5, WI-38 및 FRhL 세포의 경우, 역가가 5.0 log₁₀ TCID₅₀/ml 이하인, 낮은 바이러스 역가 내지 중간 정도의 바이러스 역가가 보고된 반면, MDCK 세포의 경우, 최대 6.7 log₁₀ TCID₅₀/mL의 역가가 보고되었다. 유럽 (옵타플루 노파르티스(Optaflu Novartis), 2007)과 미국 (플루셀박스 노파르티스(Flucelvax Novartis), 2012)에서 세포 배양 유래 인플루엔자 백신 (세포 배양에서 성장하도록 조정/최적화된 유정란 단리된 인플루엔자 바이러스)이 라이선스를 받았지만, 세포 배양 유래 인플루엔자 백신 중 극히 일부만이 시판되고 있다. 이는 세포 배양 생산 시스템을 고전적 정제 방법 및 번거로운 안정화 방법과 함께 조합하여 사용함에 따라 인플루엔자 백신 수율이 일관되지 않기 때문일 수 있다. 예컨대, MDCK 세포와 같은 연속 세포주의 사용과 관련된 이론적 안전성 문제가 백신 제조에서의 사용과 관련하여 제기되었다 (VRBPAC, 2008). 이러한 문제는 주로 백신 약물 제품의 잔류 세포 성분 (DNA 및 단백질)과 관련이 있으며, 특히 종래의 불활성화된 인플루엔자 백신의 경우와 같이, 불활성화되지도 않았고, 철저한 생화학적 정제도 거치지 않은 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 제품과 관련이 있다. 이러한 위험을 최소화하기 위해 2가지 전략법: 세포주 특징화 및 백신 정제 프로세싱 단계에 착수하게 되었다. 정제 프로세스의 특정 측면은 백신 제품에 남아 있는 숙주 세포 DNA의 양과 크기를 감소시키는 것이다. 옵타플루 노파르티스 (2007) 제조는 잔류 숙주 세포 DNA를 제거하기 위해 여러 단계를 포함한다. 이는 인플루엔자 바이러스에 결합하고, DNA가 통과하도록 하는 셀룰로스 술페이트 이온 교환 크로마토그래피, 및 이어서, 특히, DNA를 침전시키는 후속 CTAB 침전 단계를 포함한다.

앞서 보고된 정제 프로세스는 히드록시아파타이트, 친화성, 음이온 교환 및 크기 배제로부터 하나 이상의 크로마토그래피(들)를 사용하기 때문에, 비용과 시간이 많이 소요된다. 바이러스의 전회수율은 크로마토그래피 방법을 사용하는 통상의 백신 생산에는 적합하지 않은 것으로 보고되었다. 추가로, 순환 인플루엔자 바이러스는 이 바이러스에서 관찰되는 항원 소변이 및 대변이로 인해 바이러스 입자의 항원 특성이 변경된다. 이러한 변화는 바이러스의 물리화학적 특성에 영향을 미침에 따라, 이어서, 크로마토그래피 매트릭스에 대한 바이러스의 결합 능력에도 영향을 미치게 된다. 이는 소변이된 또는 대변이된 균주의 수율에 높은 수준의 변동을 일으켜 크로마토그래피를 통상의 생산에 부적합한 것으로 만들 수 있다. 또 다른 방법이 숙주 세포 DNA의 제거/감소를 위해 사용된다.

고농도의 벤조나제 (예컨대, 50 U/ml, 100 U/ml)를 사용하며, 이는 비용이 많이 든다.

제약 제제에 사용되는 전형적인 비-이온성 계면활성제는 트리톤(Triton)™ X-100, 플루로닉(Pluronic)® F-68, F-88, 및 F-127 (폴록사머), Brij 35 (폴리옥시-에틸렌 알킬 에테르), 폴리옥실 스테아레이트 40, 크레모포르(Cremophor)® EL, 및 알파-토코페롤 TPGS를 포함한다. 각각의 이들 계면활성제는 이들이 모두 폴리옥시에틸렌 모이어티를 함유하고, 따라서, 다소간 폴리옥시에틸렌 모이어티가 자가 산화되어 반응성 과산화물을 생성하여 원치않는 단백질 면역원성을 증가시킨다는 유사한 문제를 나타낸다는 공통적인 사실을 가지고 있다 (문헌 [Edward T. Maggio et al; Polysorbates, peroxides, protein aggregation, immunogenicity - a growing concern; Journal of Excipients and Food Chemical 3(2):46-53; 2012] 참조).

백신 제제를 안정화시켜 원하는 저장 수명을 달성하는 데 다양한 안정화제가 사용된다. 안정화제, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 트레할로스 및 소르비톨이 또한 바이러스 제제에 사용된다. 그러나, PVP는 생 약독화된 바이러스 제제를 불안정화시키는 것으로 보고되었다 (문헌 [JA White et al.; Development of a stable liquid formulation of live attenuated influenza vaccine; Vaccine Volume 34, Issue 32, 12 July 2016, Pages 3676-3683; 2016] 참조).

트레할로스는 고가이고; 안정성을 달성하기 위해서는 다른 당 및 단백질 첨가제 (젤라틴)와 조합되어야 한다. 또한, 동결건조된 백신의 저장 수명 안정성을 증진시키는 데에는 다른 안정화제가 트레할로스보다 더 우수하다.

소르비톨은 유리 전이 온도 (Tg) (-1.6℃)가 낮으므로, 제제 주성분으로 사용될 수 없다. 소르비톨의 낮은 Tg가 그의 사용을 제한한다. 소르비톨은 안정성을 달성하기 위해서는 다른 당 및 단백질 첨가제 (젤라틴)와 조합되어야 한다.

조직 분포 및 제거율이 투여 방식에 따라 달라질 수 있으므로, 백신 투여 경로를 위해서는 숙주 잔류 DNA가 제품 안전성에 미치는 이론적 영향이 고려되어야 한다고 제안되었다. 연구를 통해 조직으로부터 MDCK DNA를 흡수 및 제거하는 것은 투여 경로에 따라 달라진다는 것이 입증된다. DNA를 비강내로 투여하였을 때, 근육내 투여와 비교하면, 검출가능한 DNA 수준은 모든 시점에서 더 낮았다. 따라서, 비강내 백신 투여 경로가 세포 배양으로 제조된 최종 백신 생성물에 존재할 수 있는 잔류 숙주 세포 DNA와 연관된 잠재적 위험을 감소시키는 것으로 보인다 (문헌 [D.E. Tabor et al.; Biologicals 41 (2013) 247-253] 참조).

본 개시내용은 상기 언급한 한계를 극복하고, 마찬가지로 인플루엔자 바이러스를 방어하기 위한 MDCK (마딘 다르비 개 신장) 세포 기반의 비강내 전달용 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV)의 제조를 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 본 개시내용은 추가로 저농도의 엔도뉴클레아제, 더욱 특히 벤조나제를 이용하고, 대규모 세포 배양물 제조에 적합화될 수 있는 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는 개선된 제조 프로세스를 제공한다. 추가로 또한, 본 개시내용은 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스를 포함하는, 중합체 및 계면활성제를 포함하지 않는 LAIV 제제를 제공한다.

본 개시내용은

a) 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스이며;

여기서, 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스 균주는 야생형 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자, 및 PB1, PB2, PA, NP, M 및 NS 단백질, 및 일부 경우에, 마스터 공여자 바이러스 (MDV) A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2) 및/또는 B/USSR/60/69 균주로부터 유래된 NA 단백질을 발현하는 유전자로 본질적으로 이루어진 재편성체의 "고전" 또는 "역 유전학" 방법에 의해 유래된 것인 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스,

b) 하나 이상의 아미노산,

c) 하나 이상의 탄수화물, 및

d) 젤라틴

으로 구성된 MDCK 세포 기반의 비강내 전달용 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 조성물을 제공한다.

본 개시내용은 상기 백신 조성물/제제를 제조하는 방법을 추가로 제공한다.

목적

본원의 적어도 하나의 실시양태가 충족시키는 본 개시내용의 목적 중 일부는 하기와 같다:

본 개시내용의 목적은 선행 기술의 하나 이상의 문제를 개선시키거나, 또는 적어도 유용한 대안을 제공하고자 하는 것이다.

본 개시내용의 또 다른 목적은 비강내로 전달될 수 있는 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV)을 제공하기 위한 백신 조성물 및 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 개시내용의 추가의 또 다른 목적은 유정란의 사용이 전면 회피되는 마딘 다르비 개 신장 (MDCK) 세포 기반 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 개시내용의 추가의 또 다른 목적은 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스를 포함하고, 중합체 및 계면활성제는 포함하지 않는 LAIV 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 개시내용의 추가의 또 다른 목적은 LAIV 균주가 야생형 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 균주의 표면 당단백질 중 하나 또는 2개를 함유하는 마스터 공여자 바이러스 (MDV)의 저온 적응, 온도 민감성 및 약독화된 표현형을 기반으로 하는, 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스를 포함하는 LAIV 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 개시내용의 추가의 또 다른 목적은 조성물이 면역원성 및 안정성을 비롯한, 바이러스의 바람직한 특징을 보존하는 것인, MDCK 세포 기반의 비강내 전달용 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 개시내용의 추가의 또 다른 목적은 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 데, 또는 그의 임상적 소견을 예방, 호전시키거나, 또는 그의 발병 또는 진행을 지연시키는 데 적합한 MDCK 세포 기반의 비강내 전달용 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 조성물/제제를 제공하고자 하는 것이다.

본 개시내용의 추가의 또 다른 목적은 대규모 세포 배양물 제조를 위해 적합화될 수 있는 MDCK 세포 기반 생 약독화된 인플루엔자 백신 생산 분야의 개선된 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 개시내용의 다른 목적 및 이점은 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아닌 하기의 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

본 개시내용은 이제 하기 열거된 첨부 도면의 도움으로 설명될 것이다:
도 1은 재편성 백신 균주를 생성하는 야생형 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 바이러스 및 약독화된 MDV의 재편성을 개략적으로 나타낸 대표도를 도시한 것이며, 여기서, (A)는 야생형 바이러스 야생형 바이러스 감염성 병원체를 나타내는 것이고, (B)는 온도 민감성 (ts) 저온 적응 (ca) 및 약독화된 (at) 표현형 유전자 분절을 포함하는 마스터 공여자 바이러스를 나타내는 것이고, (C)는 재편성 백신 균주를 나타내는 것이다.
도 2: 그래프는 표-3B에 개시된 바와 같은 안정화제 조성물 1을 이용하였을 때의, 인플루엔자 A 균주 (A/17/터키/터키/05/133 - A/H5N2) 바이러스 로그 수율 역가 (EID₅₀/0.5 ml)의 37℃에서의 안정성을 도시하는 것이다.
도 3: 그래프는 표-3A에 개시된 바와 같은 안정화제 조성물 1을 이용하였을 때의, 인플루엔자 A 균주 (A/17/터키/터키/05/133 - A/H5N2 & A/17/안후이/2013/61 - A/H7N9) 바이러스 로그 수율 역가 (EID₅₀/0.5 ml)의 2 내지 8℃에서의 안정성을 도시하는 것이다.
도 4: 그래프는 표-3B에 개시된 바와 같은 안정화제 조성물 3을 이용하였을 때의, 인플루엔자 A 균주 (A/17/캘리포니아/2009/38 - A/H1N1) & 인플루엔자 B 균주 (B/텍사스/02/13-CDC) 바이러스 로그 수율 역가 (EID₅₀/0.5 ml)의 37℃에서의 안정성을 도시하는 것이다.
도 5: 그래프는 표-3A에 개시된 바와 같은 안정화제 조성물 3을 이용하였을 때의, 인플루엔자 A 균주 (A/17/캘리포니아/2009/38 - A/H1N1) & 인플루엔자 B 균주 (B/텍사스/02/13-CDC) 바이러스 로그 수율 역가 (EID₅₀/0.5 ml)의 2 내지 8℃에서의 안정성을 도시하는 것이다.
도 6: 그래프는 표-3B에 개시된 바와 같은 안정화제 조성물 4를 이용하였을 때의, 인플루엔자 A 균주 (A/17/캘리포니아/2009/38 - A/H1N1) & 인플루엔자 B 균주 (B/텍사스/02/13-CDC) 바이러스 로그 수율 역가 (EID₅₀/0.5 ml)의 37℃에서의 안정성을 도시하는 것이다.
도 7: 그래프는 표-3A에 개시된 바와 같은 안정화제 조성물 4를 이용하였을 때의, 인플루엔자 A 균주 (A/17/캘리포니아/2009/38 - A/H1N1) & 인플루엔자 B 균주 (B/텍사스/02/13-CDC) 바이러스 로그 수율 역가 (EID₅₀/0.5 ml)의 2 내지 8℃에서의 안정성을 도시하는 것이다.
도 8: 그래프는 표-3B에 개시된 바와 같은 안정화제 조성물 2를 이용하였을 때의, 인플루엔자 A 균주 (A/남아프리카/3626/13 - H1N1) & 인플루엔자 B 균주 (B/텍사스/02/13-CDC) 바이러스 로그 수율 역가 (EID₅₀/0.5 ml)의 37℃에서의 안정성을 도시하는 것이다.
도 9: 그래프는 표-3A에 개시된 바와 같은 안정화제 조성물 2를 이용하였을 때의, 인플루엔자 A 균주 (A/남아프리카/3626/13 - H1N1) & 인플루엔자 B 균주 (B/텍사스/02/13-CDC) 바이러스 로그 수율 역가 (EID₅₀/0.5 ml)의 2 내지 8℃에서의 안정성을 도시하는 것이다.
도 10: 그래프는 표-3B에 개시된 바와 같은 안정화제 조성물 1을 이용하였을 때의, 인플루엔자 A 균주 (A/남아프리카/3626/13 - H1N1) & 인플루엔자 B 균주 (B/텍사스/02/13-CDC) 바이러스 로그 수율 역가 (EID₅₀/0.5 ml)의 37℃에서의 안정성을 도시하는 것이다.
도 11: 그래프는 표-3A에 개시된 바와 같은 안정화제 조성물 1을 이용하였을 때의, 인플루엔자 A 균주 (A/남아프리카/3626/13 - H1N1) & 인플루엔자 B 균주 (B/텍사스/02/13-CDC) 바이러스 로그 수율 역가 (EID₅₀/0.5 ml)의 2 내지 8℃에서의 안정성을 도시하는 것이다.
도 12: 비갑개 및 폐 샘플에서의 감염 바이러스 시험. H5 LAIV, H7 LAIV 또는 위약의 1 또는 2회 용량을 동물에 백신접종하였다. 1군 내지 4군은 H5/tk/Tk로 챌린지하고, 5군 및 6군은 H5/Vt로 챌린지하고, 7군 내지 10군은 H7/An으로 챌린지하였다. 감염 후 4일째 수집된 비갑개 샘플 (a) 및 폐 샘플 (b)을 복제 능력이 있는 바이러스 입자의 존재에 대해 적정하였다. 개체 역가가 제시되어 있고, 군 평균은 검은색 실선으로 표시되어 있다.
도 13: 면역화 후 HI 및 VN 항체 반응. H5 LAIV 면역화된 동물의 경우, 상동성 챌린지 바이러스 H5/tk/Tk, 및 H7 LAIV 면역화된 동물의 경우, H7/An에 대한, 최종 면역화 후 28일째 (단일 투약 요법인 경우, 연구 28일째, 및 2회 투약 요법인 경우, 연구 56일째)의 기하 평균 항체 반응. (a) HI 항체 역가 (b) VN 항체 역가. N = 군당 6마리, 오차 막대는 평균 표준 오차를 나타낸다. 통계적 유의도는 만-휘트니 U 검정(Mann-Whitney's U test)으로 측정하였다. *p < 0.05 및 **p < 0.01.

비록 본 개시내용은 다른 실시양태에 영향을 받기 쉬울 수 있지만, 본 개시내용은 본 개시내용의 원리의 예시로 간주될 수 있고, 본 개시내용의 범주를, 본 설명에서 예시되고, 개시된 것으로 제한하려는 의도가 아님을 이해하면서, 특정 실시양태가 도면 및 하기 상세한 논의에서 제시된다.

본 개시내용의 실시양태는 이제 첨부 도면을 참조로 하여 설명될 것이다.

실시양태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 개시내용의 범주를 완전하고, 충분히 전달하기 위해 제공된다. 본 개시내용의 실시양태에 대한 완전한 이해를 제공하기 위해 특정 성분, 및 방법과 관련하여 다수의 세부사항이 제시된다. 실시양태에 제공된 세부사항이 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 널리 공지된 프로세스, 널리 공지된 장치 구조, 및 널리 공지된 기술은 상세하게 설명되지 않는다.

본 개시내용에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 목적으로 사용되는 것이며, 상기 용어가 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본 개시내용에서 사용되는 바와 같이, "단수 형태"는 문맥상 달리 명확하게 제안되지 않는 한, 복수 형태를 포함하는 것으로 의도될 수 있다.

제1, 제2, 제3 등의 용어는 전술한 용어가 단지 하나의 요소, 성분, 영역, 층 또는 섹션을 또 다른 성분, 영역, 층 또는 섹션과 구별하기 위해 사용될 수 있으며, 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예컨대, 제1, 제2, 제3 등과 같은 용어가 본원에서 사용될 때, 본 개시내용에 의해 명확하게 제안되지 않는 한, 특정 시퀀스 또는 순서를 의미하지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "인플루엔자 바이러스"라는 용어는 옥소믹소비리다에(Orthomyxoviridae)과를 대표하는 인플루엔자 A, B, C 및 D 바이러스를 포함하는 RNA 바이러스를 지칭한다. 인플루엔자 바이러스는 생 야생형 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 바이러스, 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스, 불활성화된 인플루엔자 바이러스, 키메라 인플루엔자 바이러스, 또는 재조합 인플루엔자 바이러스일 수 있다.

본 개시내용은 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터의 방어를 위한, 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 하나 이상의 인플루엔자 백신 바이러스를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법을 추가로 제공한다.

본 개시내용의 제1 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 탄수화물 및 젤라틴을 포함할 수 있다.

"생"이라는 용어는 그의 통상적인 의미로 사용되며, 생 바이러스는 불활성화되지 않은 바이러스, 즉, 허용 세포 상에서 복제할 수 있는 바이러스이다. 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스는 동물 또는 인간에서 상응하는 야생형 바이러스에 의해 유발되는 질환을 유도하지 않고, 특정 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스이다.

본 개시내용의 제2 실시양태에 따라, 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 유전자 분절을 포함하는 것으로 "고전" 또는 "역 유전학" 재편성 방법에 의해 유래된 것일 수 있다.

제2 실시양태의 제1 측면에 따라, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스는 마스터 공여자 바이러스 (MDV) 균주의 저온 적응, 온도 민감성 및/또는 약독화된 표현형 유전자 분절 (PB1, PB2, PA, NP, M 및/또는 NS 단백질), 및 야생형 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 타입 A 또는 B 또는 C 바이러스 균주의 헤마글루티닌 (HA) 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자 분절을 1:7, 2:6, 3:5, 4:4, 5:3, 6:2 또는 7:1의 비로 포함하는 재편성 LAIV 바이러스이다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스는 (도 1에 도시된 바와 같이) 마스터 공여자 바이러스 (MDV) 균주 및 야생형 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 유전자 분절을 6:2의 비로 포함할 수 있다

제2 실시양태의 제2 측면에 따라, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스는 임의의 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래, 또는 임의의 서브타입의 인플루엔자 B 바이러스로부터 유래될 수 있는 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스는 A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2) 인플루엔자 A 균주, B/USSR/60/69 인플루엔자 B 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 타입 A 백신 바이러스는 A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2) 인플루엔자 A 균주로 구성된 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 타입 A 바이러스 균주 -A/17/캘리포니아/2009/38은 A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2) 인플루엔자 A 균주로 구성된 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 타입 A 바이러스 균주 - A/17/터키/터키/05/133은 A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2) 인플루엔자 A로 구성된 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 타입 A 바이러스 균주 - A/17/ 안후이 /2013/61은 A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2) 인플루엔자 A로 구성된 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 타입 A 바이러스 균주 - A/17/뉴욕/15/5364는 A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2) 인플루엔자 A로 구성된 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 타입 A 바이러스 균주 - A/17/홍콩/2014/8296은 A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2) 인플루엔자 A로 구성된 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 타입 A 바이러스 균주 - A/남아프리카/3626/2013- CDC - LV14A는 A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2) 인플루엔자 A로 구성된 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 타입 B 백신 바이러스는 B/USSR/60/69 인플루엔자 B 균주로 구성된 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 타입 B 바이러스 균주 - B/텍사스/02/2013- CDC - LV8B는 B/USSR/60/69 인플루엔자 B 균주로 구성된 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 타입 B 바이러스 균주 - B/ 푸켓 /3073/2013은 B/USSR/60/69 인플루엔자 B 균주로 구성된 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 타입 B 바이러스 균주 - B/56/브리즈번/60/08은 B/USSR/60/69 인플루엔자 B 균주로 구성된 마스터 공여자 바이러스 (MDV)로부터의 유전자 분절을 포함할 수 있다.

제2 실시양태의 제3 측면에 따라, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스 또는 인플루엔자 C 바이러스로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 A 백신 바이러스 균주는 인플루엔자 A 바이러스 HA 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 또는 H18 또는 보고된 임의의 다른 HA 서브타입으로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자, 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 NA 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N10 또는 N11 또는 보고된 임의의 다른 NA 서브타입으로부터의 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스는 범유행성 인플루엔자 바이러스 균주 또는 잠재적으로 범유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스는 계절성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 포함할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스 균주는 인플루엔자 A 바이러스 서브타입 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H5N2, H9N2, H7N1, H7N3, H7N7, H6N1, H7N9, 및 H10N8 또는 앞서 보고되었거나, 또는 새로 검출되는 임의의 다른 바이러스 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 함유할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스 균주는 인플루엔자 A 바이러스 pdmH1N1 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 함유할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스 균주는 인플루엔자 A 바이러스 A/캘리포니아/07/2009 (A/Cal로 지칭)-유사 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 함유할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스 균주는 인플루엔자 A 바이러스 A/미시간/45/2015-유사 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 함유할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스 균주는 인플루엔자 A 바이러스 균주 - A/남아프리카/3626/2013 유사 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 함유할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스 균주는 인플루엔자 A 바이러스 H3N2-A/홍콩/4801/2014 유사 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 함유할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스 균주는 야마가타-유사 또는 빅토리아-유사인 것인 2개의 상이한 계통에 속하는 인플루엔자 B 바이러스로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 함유할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스 균주는 인플루엔자 B 바이러스 빅토리아 계통-B/브리즈번/60/2008-유사 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 함유할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 재편성 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스 균주는 인플루엔자 B 바이러스 야마가타 계통-B/푸켓/3073/2013-유사 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 함유할 수 있다.

재편성체를 생성하는 방법에는 2가지가 있다.

1. 고전 재편성 방법

재편성 균주를 생성하는 야생형 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 백신 바이러스 및 약독화된 MDV의 재편성 프로세스는 배양 숙주, 일반적으로, 유정란을 MDV 균주 및 야생형 바이러스 균주로 공동 형질감염시키는 단계를 포함한다. 재편성 바이러스는, 야생형 바이러스 균주의 HA 및/또는 NA 단백질을 함유하는 재편성 바이러스를 선별하기 위하여 MDV의 HA 및/또는 NA 단백질에 대해 특이성을 갖는 항체를 첨가함으로써 선별된다. 여러 계대에 걸쳐 상기 처리를 수행함으로써 야생형 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 백신 바이러스 균주 HA 및/또는 NA 분절, 및 MDV의 내부 유전자를 함유하는, 빠르게 성장하는 재편성 바이러스를 선별해 낼 수 있다.

2. 역 유전학 재편성 방법

역 유전학은 DNA 카피로부터 감염성 바이러스 입자를 생성하는 방법이다. MDV의 6개의 내부 유전자, 및 백신에 포함시키기 위한 것으로 권고된, 야생형 균주로부터의 HA 및 NA 유전자를, 배양 세포에 형질감염되었을 때 전장 바이러스 RNA를 생성할 수 있는 플라스미드에서 클로닝한다. 이러한 플라스미드를, 바이러스 폴리머라제 서브유닛을 발현하는 4개의 플라스미드와 함께 배양 세포에 형질감염시킨다. 폴리머라제 서브유닛의 발현 및 전장 바이러스 RNA 생성을 통해 바이러스는 어셈블리되고, 감염성 바이러스 입자가 상청액 중에 방출된다. 상기 구제된 바이러스는 권고된 균주의 항원성 특징 및 MDV의 ca, ts, att 표현형을 나타낸다.

재편성 LAIV 균주는 실험 의학 연구소(Institute of Experimental Medicine: IEM: 러시아 상트페테르부르크) 또는 WHO 협력 센터, 예컨대, 질병 통제 예방 센터(Centre for Disease Control and Prevention: CDC: 미국 애틀랜타)로부터 조달된 것이다.

본 개시내용의 제3 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 비제한적으로 천연 탄수화물, 합성 탄수화물, 폴리올, 유리 전이 촉진제, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당 및 그의 상응하는 당 알콜, 폴리히드록실 화합물, 예컨대, 탄수화물 유도체 및 화학적으로 변형된 탄수화물, 히드록시에틸 전분 및 당 공중합체의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다. 천연 및 합성 탄수화물, 둘 모두 사용하기에 적합하다. 합성 탄수화물은 글리코시드 결합이 티올 또는 탄소 결합으로 대체된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 탄수화물의 D 및 L 형태, 둘 모두 사용될 수 있다. 탄수화물은 비-환원성 또는 환원성일 수 있다. 환원성 탄수화물이 사용되는 경우, 메일라드(Maillard) 반응 억제제를 첨가하는 것이 바람직하다. 조성물에 사용하기에 적합한 환원성 탄수화물은 관련 기술분야에 공지된 것이며, 글루코스, 수크로스, 말토스, 락토스, 푸코스, 갈락토스, 만노스, 말툴로스 및 락툴로스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 비-환원성 탄수화물은 당 알콜 및 다른 직쇄 폴리알콜로부터 선택되는 폴리히드록실 화합물의 비-환원성 글리코시드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 유용한 탄수화물은 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 셀리비오스, 만노비오스 및 당 알콜을 포함한다. 당 알콜 글리코시드는 바람직하게, 모노글리코시드, 특히, 이당류, 예컨대, 락토스, 말토스, 락툴로스 및 말툴로스의 환원에 의해 수득되는 화합물이다. 유리 형성제는 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 만노스, 라피노스, 락티톨, 락토비온산, 글루코스, 말툴로스, 이소-말툴로스, 말토스, 락토스 소르비톨, 덱스트로스, 푸코스, 글리세롤, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가로, 제3 실시양태의 바람직한 측면에 따라, LAIV 조성물은 적합한 탄수화물 안정화제로서 수크로스를 1% 중량/부피 내지 20% 중량/부피, 바람직하게, 1-10% (w/v), 더욱 바람직하게, 3-6% (w/v)의 범위로, 가장 바람직하게, 4% (w/v)로 포함할 수 있다.

본 개시내용의 제4 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 비제한적으로 트리신, 아르기닌, 류신, 이소-류신, 히스티딘, 글리신, 글루타민, 리신, 알라닌, 펩티드, 가수분해된 단백질 또는 단백질, 예컨대, 혈청 알부민의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

추가로, 제4 실시양태의 바람직한 측면에 따라, LAIV 조성물은 적합한 아미노산으로서 트리신, 아르기닌, 히스티딘 및 알라닌으로 개별적으로 또는 조합하여 구성될 수 있다.

추가로, 제4 실시양태의 바람직한 측면에 따라, 하나 이상의 아미노산은 트리신을 0.1% 중량/부피 (w/v) 내지 2% 중량/부피 (w/v), 바람직하게, 0.1-1% (w/v), 더욱 바람직하게, 0.1-0.5% (w/v)의 범위로, 가장 바람직하게, 0.3% (w/v)로 포함할 수 있다.

추가로, 제4 실시양태의 바람직한 측면에 따라, 하나 이상의 아미노산은 히스티딘을 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v), 바람직하게, 0.1-1% (w/v), 더욱 바람직하게, 0.1-0.5% (w/v)의 범위로, 가장 바람직하게, 0.21% (w/v)로 포함할 수 있다.

추가로, 제4 실시양태의 바람직한 측면에 따라, 하나 이상의 아미노산은 알라닌을 0.01% 중량/부피 내지 1% 중량/부피, 바람직하게, 0.05-0.5% (w/v), 더욱 바람직하게, 0.08-0.2% (w/v)의 범위로, 가장 바람직하게, 0.1% (w/v)로 포함할 수 있다.

추가로, 제4 실시양태의 바람직한 측면에 따라, 하나 이상의 아미노산은 아르기닌을 0.1% 중량/부피 내지 10% 중량/부피, 바람직하게, 0.1-5% (w/v), 더욱 바람직하게, 0.1-3% (w/v)의 범위로, 가장 바람직하게, 2.1% (w/v)로 포함할 수 있다.

본 개시내용의 제5 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 젤라틴을 0.1% 중량/부피 내지 10% 중량/부피, 바람직하게, 0.1-5% (w/v), 더욱 바람직하게, 0.1-3% (w/v)의 범위로, 가장 바람직하게, 0.85% (w/v)로 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "젤라틴"이라는 용어는, 가장 일반적으로 소, 돼지 및 생선 공급원으로 유래되며, 동물 콜라겐의 부분 산 가수분해 (A형 젤라틴) 또는 부분 알칼리 가수분해 (B형 젤라틴)에 의해 생성된 멸균 비발열성 단백질 제제 (예컨대, 분획)를 의미한다. 젤라틴은 다양한 분자량 범위로 수득될 수 있다. 젤라틴의 재조합 공급원 또한 사용될 수 있다.

본 개시내용의 제6 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 HEPES, 시트레이트-포스페이트, 카르보네이트, 포스페이트, 시트레이트, 락테이트, 글루코네이트 및 타르트레이트 완충화제 뿐만 아니라, 원하는 pH를 달성하도록 선택된 비로 인산나트륨 및/또는 인산칼륨을 함유하는 포스페이트 완충화제를 비롯한, 더욱 복합적인 유기 완충화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충화제를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 완충화제는 원하는 pH를 달성하도록 제제화된, 트리스(Tris) (히드록시메틸) 아미노메탄, 또는 "트리스"를 함유한다. 추가로, 또 다른 예에서, 완충화제는 행크스(Hanks) 염을 포함하는 최소 필수 배지일 수 있다.

본 개시내용의 제7 실시양태에 따라, 단일 용량 조성물은 보존제를 함유하지 않고, 다중 용량 조성물은 2-페녹시에탄올, 염화벤제토늄 (페메롤(Phemerol)), 페놀, m-크레졸, 티오메르살, 포름알데히드, 파라벤 에스테르 (예컨대, 메틸-, 에틸-, 프로필- 또는 부틸- 파라벤), 염화벤잘코늄, 벤질 알콜, 클로로부탄올, p-클로르-m-크레졸, 또는 벤질 알콜 또는 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 백신 조성물은 단일 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있거나, 또는 다중 면역화를 위한 물질 (즉, '다중 용량' 키트)을 포함할 수 있다. 보존제를 포함하는 것은 다중 투약 처리 방식에서 바람직하다. 다중 용량 조성물에 보존제를 포함하는 것에 대한 대안으로 (또는 그에 추가로), 조성물은 물질 제거용 무균 어댑터가 장착된 용기에 포함될 수 있다.

본 개시내용의 제8 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 제약상 허용되는 수송체, 부형제, 결합제, 담체, 등장화제, 유화제 또는 습윤제를 추가로 포함할 수 있고, 여기서, 제약상 허용되는 부형제는 계면활성제, 중합체 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 계면활성제의 예로는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 등을 포함할 수 있다. 중합체의 예로는 덱스트란, 카르복시메틸셀룰로스, 히알루론산, 시클로덱스트린 등을 포함할 수 있다. 염의 예로는 NaCl, KCl, KH₂PO₄, Na₂HPO₄.2H₂O, CaCl₂, MgCl₂ 등을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 제9 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 알루미늄 히드록시포스페이트, 및 황산알루미늄칼륨 또는 그의 혼합물의 군으로부터 선택되는 애주번트로 추가로 구성될 수 있다.

본 개시내용의 제10 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 추가로 유성 및 수성 에멀젼, MF-59, 리포솜, 지질다당류, 사포닌, 지질 A, 지질 A 유도체, 모노포스포릴 지질 A, 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A, AS01, AS03, 올리고뉴클레오티드, 적어도 하나의 비메틸화된 CpG 및/또는 리포솜을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 프로인트(Freund's) 애주번트, 프로인트 완전 애주번트, 프로인트 불완전 애주번트, 중합체, 공중합체, 예컨대, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 (블록 공중합체 포함), 중합체 p 1005, CRL-8300 애주번트, 뮤라밀 디펩티드, TLR-4 효능제, 플라겔린, 그람 음성 박테리아 유래 플라겔린, TLR-5 효능제, TLR-5 수용체에 결합할 수 있는 플라겔린의 단편, 알파-C-갈락토실세라마이드, 키토산, 인터류킨-2, QS-21, ISCOMS, 스테롤 및 지질과 사포닌 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역자극성 성분으로 구성될 수 있다.

본 개시내용의 제11 실시양태에 따라, MDCK 세포 배양 기반 LAIV 조성물을 제조하는 방법은 하기 단계의 임의의 서브세트 또는 그들 모두를 포함할 수 있다:

a) LAIV 후보 백신 바이러스를 먼저 유정란 기반 마스터 시드 바이러스 (MSV)를 생산하는 SPF 부화란에 계대접종하는 단계,

b) 유정란 기반 마스터 시드 바이러스를 세포 배양 숙주에서 성장하도록 적합화시켜 세포 기반 워킹 시드 바이러스 (WSV)를 제조하는 단계. 상이한 세포 배양 베쓸/시스템, 예컨대, 표면적이 175 ㎠인 조직 배양 플라스크 (TCF), 표면적이 850 ㎠인 롤러 병 (RB), 표면적이 6320 ㎠인 셀 팩토리스(Cell Factories: CF) 및 고정상 생물반응기 (예컨대, 팔® 라이프 사이언시스즈(Pall® Life Sciences: 미국 뉴욕주 포트 워싱턴)로부터의 iCELLis® 생물반응기(iCELLis® Bioreactor), 예컨대, 나노(Nano) 및 500/100 생물반응기)를 사용하여 상기 세포 기반 WSV를 숙주 세포에서 계대배양하고, 증식시키는 단계,

c) 배양된 바이러스를 수확하는 단계,

d) 바이러스 수확물을 적어도 하나의 정화 필터를 통한 직접 유동 여과 (DFF)에 의해 여과하여 정화된 바이러스 풀 (CVP)을 수득하는 단계,

e) CVP를 비특이적 엔도뉴클레아제로 처리하여 세포 DNA를 분해시키는 단계,

f) 처리된 엔도뉴클레아제 처리 CVP에 대해 접선 유동 여과를 수행하는 단계,

g) 하나 이상의 탄수화물, 하나 이상의 아미노산 및 젤라틴을 포함하는 안정화제 조성물로 TFF 농축물을 안정화시켜 안정화된 바이러스 수확물을 형성하는 단계,

h) 안정화된 TFF 농축물을 적어도 하나의 멸균 등급 필터를 통해 DFF에 의해 멸균시켜 멸균된 정화된 1가 바이러스 풀 (CMVP)를 수득하는 단계,

i) 멸균된 CMVP를 폴리카르보네이트 병 중에서 -60℃ 이하에서 보관하는 단계,

j) 멸균된 제제를 바이알에 충전시키고, 2-8℃에서 보관하는 단계.

제11 실시양태의 제1 측면에 따라, 세포 배양 숙주에서 성장하도록 적합화된 유정란 기반 LAIV 바이러스 후보는 임의의 진핵성 세포일 수 있다. 추가로, 바람직하게, 세포 배양 숙주는 포유동물 또는 조류 세포일 수 있다. 적합한 포유동물 세포는 햄스터, 소, 영장류 (인간 및 원숭이 포함) 및 개 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다양한 세포 유형은 신장 세포, 섬유모세포, 망막 세포 및 폐 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 햄스터 세포의 예로는 명칭이 BHK21 또는 HKCC인 세포주가 있다. 적합한 원숭이 세포로는 예컨대, 아프리카 녹색 원숭이 세포, 예컨대, Vero 세포주에서와 같은 신장 세포가 있다. 적합한 개 세포는 예컨대, CLDK 및 MDCK 세포주에서와 같은 신장 세포가 있다.

추가의 적합한 세포로는 CHO; 293T; BHK; MRC 5; PER.C6; FRhl.2; WI-38 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 세포는 예컨대, 아메리칸 타입 셀 컬쳐(American Type Cell Culture: ATCC) 콜렉션으로부터, 코리엘 셀 리포지토리(Coriell Cell Repositories)로부터, 또는 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐즈(European Collection of Cell Cultures: ECACC)로부터 널리 이용가능하다. 예를 들어, ATCC는 카탈로그 번호 CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 및 CRL-1587하에 각종의 상이한 Vero 세포를 공급하고, 이는 카탈로그 번호 CCL 34하에 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁 번호 96022940하에 ECACC로부터 이용가능하다.

추가로, 바람직하게, 세포 배양 숙주는 비제한적으로 ATCC CCL-34, 마딘 다르비 개 신장 (MDCK) 33016 세포주 (DSM ACC 2219), MDCK (ATCC CCL34 MDCK(NBL2)), MDCK 33016 (DSM ACC 2219), DSM ACC3309, ATCC CRL-12042, ATCC PTA-7909, ATCC PTA-7910, ATCC PTA-6500, ATCC PTA-6501, ATCC PTA-6502, ATCC PTA-6503, 'MDCK-S', 'MDCK-SF101', 'MDCK-SF102', 'MDCK-SF103' 및 FERM BP-7449로부터 선택되는 MDCK 세포일 수 있다.

추가로, 바람직하게, 세포 배양 숙주는 마딘 다르비 개 신장 (MDCK) 세포 ATCC CCL 34 (NBL2)일 수 있다.

제11 실시양태의 제2 측면에 따라, MDCK 세포는 10% 우태아 혈청 (FBS)을 포함하는 최소 필수 배지 (MEM) 중에서 배양될 수 있다. 세포 배양은 37℃±1℃에서 이루어질 수 있다. 감염 전 세포 증식 동안 배지의 pH 값은 pH 6.8 내지 pH 7.6 범위, 및 더욱 바람직하게, pH 7.0 내지 pH 7.4의 값일 수 있다.

추가로, MDCK 세포는 무혈청 또는 단백질 무함유 배지 중에서 배양될 수 있다.

제11 실시양태의 제3 측면에 따라, 감염 이전에 MDCK 세포를 MEM, 및 이어서, 5 내지 25 U/ml 범위의 프로테아제를 함유하는 MEM으로 세척시킬 수 있다.

프로테아제는 비제한적으로 트립신, 키모트립신, 진균 프로테아제, 펩신, 파파인, 브로멜라인, 및 섭틸리신으로부터 선택될 수 있다.

추가로, 바람직하게, 프로테아제는 돼지 기원 또는 소 기원 또는 진균 기원 또는 박테리아 기원으로부터 수득된 트립신일 수 있다.

추가로, 바람직하게, 프로테아제는 비제한적으로 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 옥수수, E. 콜라이(E. coli), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터 선택되는 효모 또는 식물 또는 박테리아의 숙주 세포에서 발현된 재조합 트립신일 수 있다. 바람직하게, 상기 재조합 트립신은 바이오게노믹스(Biogenomics) (숙주로서 E. 콜라이), D.K. 바이오 파마 Pvt. 리미티드(D.K. Bio Pharma Pvt. Ltd.) (숙주로서 E. 콜라이), 리치코어(Richcore) (숙주로서 피치아 파스토리스) 및 기브코(Gibco) (진균)로부터 선택된다.

추가로, 바람직한 트립신 농도는 12.5 U/ml이다.

제11 실시양태의 제4 측면에 따라, 감염 이전에, 바이러스를 5 내지 25 U/ml 범위로 프로테아제를 함유하는 MEM로 희석시키고, 31℃ 내지 33℃의 온도에서 10 내지 60분 동안 인큐베이션시킴으로써 감염 이전에 워킹 시드 바이러스를 활성화시킬 수 있다.

프로테아제는 비제한적으로 트립신, 키모트립신, 진균 프로테아제, 펩신, 파파인, 브로멜라인, 및 섭틸리신으로부터 선택될 수 있다.

추가로, 바람직하게, 프로테아제는 돼지 기원 또는 소 기원 또는 진균 기원 또는 박테리아 기원으로부터 수득된 트립신일 수 있다.

추가로, 바람직하게, 프로테아제는 비제한적으로 아스퍼질러스 종, 스트렙토마이세스 그리세우스, 옥수수, E. 콜라이, 피치아 파스토리스로부터 선택되는 효모 또는 식물 또는 박테리아의 숙주 세포에서 발현된 재조합 트립신일 수 있다. 바람직하게, 상기 재조합 트립신은 바이오게노믹스 (숙주로서 E. 콜라이), D.K. 바이오 파마 Pvt. 리미티드 (숙주로서 E. 콜라이), 리치코어 (숙주로서 피치아 파스토리스) 및 기브코 (진균)로부터 선택된다.

추가로, 바람직한 트립신 농도는 12.5 U/ml이다.

추가로, 바람직한 트립신 농도는 롤러 병당 2000 내지 3000 단위의 트립신이다.

제11 실시양태의 제5 측면에 따라, MDCK 세포를 LAIV 바이러스 후보로 감염시키는 것은 바람직하게, TCF의 경우, 약 40X10⁶-60X10⁶/TCF, RB의 경우, 150X10⁶-180X10⁶/RB, 및 생물반응기 (4 ㎡)의 경우, 7000X10⁶-10000X10⁶/BR(4 ㎡)인 MDCK 세포 밀도로 이루어질 수 있다.

제11 실시양태의 제6 측면에 따라, LAIV 바이러스 후보를 부착 배양 또는 현탁 배양 모드로 MDCK 세포 상에서 성장시킬 수 있다.

제11 실시양태의 제7 측면에 따라, MDCK 세포를 유정란 기반 LAIV 바이러스 후보로 감염시키는 것은 1:100 내지 1:10000의 MOI로 이루어질 수 있다.

제11 실시양태의 제8 측면에 따라, 감염 후, MDCK 세포를 5 내지 25 U/ml 범위로 트립신을 함유하는 최소 필수 배지 (MEM) 중에서 및 32℃±1℃ 온도에서 배양할 수 있다. 감염 후 배지의 pH 값은 pH 6.8 내지 pH 7.6 범위, 및 가장 바람직하게, 7.2 - 7.6 범위일 수 있다.

제11 실시양태의 제9 측면에 따라, 감염 후, 세포 상청액을 40 내지 70 hr의 인큐베이션 기간 후에 수확할 수 있고; 더욱 바람직하게, 인큐베이션 기간은 54±8 hr일 수 있다.

추가로 대안적으로, 투입된 물질을 폐기하기 전 약 4-5회 동안 적절한 시간 간격을 두고 수회에 걸쳐 수확을 수행할 수 있고, 이를 별개로 프로세싱하여 정화된 1가 바이러스 풀 (CMVP)을 수득할 수 있다.

수확시, 적어도 7.0-9.2 Log EID₅₀/0.5 ml의 바이러스 수율을 얻을 수 있다.

제11 실시양태의 제10 측면에 따라, 바이러스를 함유하는 배지를 전형적으로 공극 크기를 축소시키면서 (예컨대, 6 μ, 5 μ, 0.8 μ, 0.65μ, 0.45 μ, 0.2 μ) 필터를 통해 정화시킬 수 있다. 적합한 상업적으로 이용가능한 필터 및 여과 장치는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예시적인 여과 장치는 폴리프로필렌 또는 셀룰로스 아세테이트 또는 폴리에테르술폰으로 제조될 수 있고, 상업적으로 이용가능한 필터는 밀리팩(Millipak) (밀리포어(Millipore)), 클린팩(Kleenpak) (팔(Pall)) 및 사르토브란(Sartobran)™ (사르토리우스(Sartorius)) 여과 장치일 수 있다.

제11 실시양태의 제11 측면에 따라, 여과된 수확물을 30-34℃ 범위의 온도에서 2 내지 6시간 동안, 및 이어서, 2 내지 8℃의 온도에서 5 내지 15시간 동안 0.5 유닛/ml 내지 2 유닛/ml로 다양한 농도의 비특이적 엔도뉴클레아제, 가장 바람직하게, 벤조나제로 처리할 수 있다.

추가로 대안적으로, 여과된 수확물을 0.1 mM 내지 100 mM 양의 Ca2+, Mg2+, Mn2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가 양이온의 존재하에서 비특이적 엔도뉴클레아제, 가장 바람직하게, 벤조나제로 처리할 수 있다.

추가로 대안적으로, 여과된 수확물을 1 내지 3 mM 농도의 2가 양이온 Mg^{2 +} 염의 존재하에서 비특이적 엔도뉴클레아제, 가장 바람직하게, 벤조나제로 처리할 수 있다.

제11 실시양태의 제12 측면에 따라, 벤조나제 처리된 수확물에 대해 전형적으로는 분자량 컷 오프 (MWCO) 범위가 100 KDa-500 KDa인 필터를 통해 접선 유동 여과 (TFF)를 추가로 수행함으로써 바이러스 수확물을 2X 내지 10X 농축시킬 수 있고, 추가로 잔류 불순물을 제거한다.

추가로 바람직하게, 잔류 불순물은 잔류 DNA, 잔류 소 혈청 알부민 (BSA) 및 잔류 숙주 세포 단백질로 구성될 수 있다.

제11 실시양태의 제13 측면에 따라, 상기 기술된 프로세스를 통해 미량의 잔류 세포 DNA (<10 ng/용량), 잔류 BSA (<50 ng/용량) 및 잔류 세포 단백질을 포함하는 정제 및 농축된 LAIV 바이러스 수확물을 수득할 수 있다. 추가로, 상기 기술된 프로세스에 따라, 정제된 바이러스의 전회수율은 적어도 40%일 수 있다.

제11 실시양태의 제14 측면에 따라, 농축된 1가 바이러스 스톡 (TFF 농축물)을 안정화제 조성물로 안정화시켜 하나 이상의 탄수화물, 하나 이상의 아미노산 및 젤라틴을 포함하는 최종 LAIV 조성물을 수득할 수 있다.

추가로, 바람직하게, 농축된 바이러스 스톡 (TFF 농축물)을 수크로스, 히스티딘, 알라닌, 트리신, 아르기닌 및 젤라틴을 그의 임의의 조합으로 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시킬 수 있다.

추가로, 바람직하게, 농축된 바이러스 스톡 (TFF 농축물)을, 수크로스를 1% (w/v) 내지 10% (w/v)의 농도로, 히스티딘을 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v)의 농도로, 알라닌을 0.01% (w/v) 내지 1% (w/v)의 농도로, 트리신을 0.1% (w/v) 내지 1% (w/v)의 농도로, 아르기닌을 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v)의 농도로, 및 젤라틴을 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v)의 농도로 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시킬 수 있다.

추가로, 바람직하게, 농축된 바이러스 스톡 (TFF 농축물)을, 수크로스를 3% (w/v) 내지 6% (w/v)의 농도로, 히스티딘을 0.1% (w/v) 내지 1% (w/v)의 농도로, 알라닌을 0.05% (w/v) 내지 0.5% (w/v)의 농도로, 트리신을 0.1% (w/v) 내지 0.5% (w/v)의 농도로, 아르기닌을 0.1% (w/v) 내지 3% (w/v)의 농도로, 및 젤라틴을 0.1% (w/v) 내지 3% (w/v)의 농도로 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시킬 수 있다.

추가로, 바람직하게, 농축된 바이러스 스톡 (TFF 농축물)을, 수크로스 4% (w/v), 히스티딘 0.21% (w/v), 알라닌 0.1% (w/v), 트리신 0.3% (w/v), 아르기닌 2.1% (w/v) 및 젤라틴 0.85% (w/v)를 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시킬 수 있다.

제11 실시양태의 제15 측면에 따라, 안정화된 바이러스 수확물을 적어도 하나의 멸균 등급 필터, 바람직하게, 0.2 μ를 통해 직접 유동 여과 (DFF)에 의해 멸균시킬 수 있다. 적합한 상업적으로 이용가능한 필터 및 여과 장치는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예시적인 여과 장치는 폴리프로필렌 또는 셀룰로스 아세테이트 또는 폴리에테르술폰으로 제조될 수 있고, 상업적으로 이용가능한 필터는 밀리팩 (밀리포어), 클린팩 (팔) 및 사르토브란™ P (사르토리우스) 여과 장치일 수 있다.

제11 실시양태의 제16 측면에 따라, LAIV 조성물은 이전 실시양태에서 개시된 바와 같은 1개 초과의 LAIV 바이러스 균주 또는 서브타입을 포함하는 다가일 수 있다. LAIV 조성물은 2가 또는 3가 또는 4가일 수 있다.

추가로 대안적으로, LAIV 조성물은 이전 실시양태에서 개시된 바와 같은 LAIV 바이러스 균주 또는 서브타입 중 어느 하나를 포함하는 1가일 수 있다.

제11 실시양태의 제17 측면에 따라, LAIV 조성물은 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀의 용량의 인플루엔자 바이러스로 구성될 수 있다.

추가로, 바람직하게, LAIV 조성물은 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀; 더욱 바람직하게, 0.5 ml당 NLT 7 Log EID₅₀의 용량의 인플루엔자 타입 A 바이러스 또는 임의의 서브타입으로 구성될 수 있다.

추가로, 바람직하게, LAIV 조성물은 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀; 더욱 바람직하게, 0.5 ml당 NLT 6.5 Log EID₅₀의 용량의 인플루엔자 타입 B 바이러스 또는 임의의 서브타입으로 구성될 수 있다.

제12 실시양태에 따라, 면역원성 조성물을 제조하는 방법은 하기 단계로 구성될 수 있다:

a) MDCK 세포 배양 숙주를 인플루엔자 바이러스로 1:100 내지 1:10000의 MOI로 감염시키는 단계

b) 5 내지 25 U/ml 범위의 트립신을 함유하는 MEM 중에서의 40 내지 70 hr의 인큐베이션 기간 후에 인플루엔자 바이러스를 포함하는 상청액을 수확하는 단계;

c) 공극 크기가 약 6 ㎛ 내지 약 0.45 ㎛인 적어도 하나의 정화 필터를 통해 직접 유동 여과 (DFF)에 의해 바이러스 수확물을 여과하는 단계;

d) 30-34℃ 범위의 온도에서 2 내지 6시간 동안, 및 이어서, 2 내지 8℃의 온도에서 5 내지 15시간 동안 CVP를 비특이적 엔도뉴클레아제로 처리하는 단계;

e) 엔도뉴클레아제로 처리된 CVP를 분자량 컷 오프 (MWCO)가 100 KDa-500 KDa인 막을 이용하여 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 농축시키는 단계;

f) 하나 이상의 탄수화물, 하나 이상의 아미노산 및 젤라틴을 포함하는 안정화제 조성물로 TFF 농축물을 안정화시켜 안정화된 바이러스 수확물을 형성하는 단계;

g) 안정화된 TFF 농축물을 공극 크기가 약 0.8 ㎛ 내지 약 0.2 ㎛인 적어도 하나의 멸균 등급 필터를 통해 DFF에 의해 멸균시켜 멸균된 CMVP를 형성하는 단계;

여기서, 정제된 바이러스의 전회수율은 40% 이상이다.

제12 실시양태의 제1 측면에 따라, 단계 (d)가 바이러스 수확물을 0.1 mM 내지 100 mM 양의 Ca2+, Mg2+, Mn2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가 양이온의 존재하에서 0.5 단위/ml 내지 5 단위/ml 범위 농도의 비특이적 엔도뉴클레아제, 더욱 특히 벤조나제로 처리하는 것으로 구성될 수 있는 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.

제12 실시양태의 제2 측면에 따라, 단계 (d)가 바이러스 수확물을 1 내지 3 mM 농도의 2가 양이온 Mg^{2 +} 염의 존재하에서 0.5 단위/ml 내지 5 단위/ml 범위 농도의 비특이적 엔도뉴클레아제, 더욱 특히 벤조나제로 처리하는 것으로 구성될 수 있는 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.

제12 실시양태의 제3 측면에 따라, 단계 (e)가 바이러스 수확물을 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 농축시켜 바이러스 수확물을 적어도 4X 농축시키는 것으로 구성될 수 있는 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.

제12 실시양태의 제4 측면에 따라, 단계 (f)가 바이러스 수확물을, 수크로스를 1% (w/v) 내지 10% (w/v)의 농도로, 히스티딘을 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v)의 농도로, 알라닌을 0.01% (w/v) 내지 1% (w/v)의 농도로, 트리신을 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v)의 농도로, 아르기닌을 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v)의 농도로, 및 젤라틴을 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v)의 농도로 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시키는 것으로 구성될 수 있는 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.

제12 실시양태의 제5 측면에 따라, 단계 (f)가 바이러스 수확물을, 수크로스를 3% (w/v) 내지 6% (w/v)의 농도로, 히스티딘을 0.1% (w/v) 내지 1% (w/v)의 농도로, 알라닌을 0.05% (w/v) 내지 0.5% (w/v)의 농도로, 트리신을 0.1% (w/v) 내지 0.5% (w/v)의 농도로, 아르기닌을 0.1% (w/v) 내지 3% (w/v)의 농도로, 및 젤라틴을 0.1% (w/v) 내지 3% (w/v)의 농도로 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시키는 것으로 구성될 수 있는 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.

제12 실시양태의 제6 측면에 따라, 단계 (f)가 바이러스 수확물을, 수크로스 4% (w/v), 히스티딘 0.21% (w/v), 알라닌 0.1% (w/v), 트리신 0.3% (w/v), 아르기닌 2.1% (w/v) 및 젤라틴 0.85% (w/v)를 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시키는 것으로 구성될 수 있는 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.

제12 실시양태의 제6 측면에 따라, 단계 (f)가 바이러스 수확물을, 수크로스 4% (w/v), 히스티딘 0.21% (w/v), 알라닌 0.1% (w/v), 트리신 0.3% (w/v), 아르기닌 2.1% (w/v) 및 젤라틴 1.0% (w/v)를 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시키는 것으로 구성될 수 있는 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.

제12 실시양태의 제7 측면에 따라, 단계 (f)가 바이러스 수확물을, 수크로스 4% (w/v), 히스티딘 0.21% (w/v), 알라닌 0.1% (w/v), 트리신 0.3% (w/v), 아르기닌 1.6% (w/v) 및 젤라틴 1.0% (w/v)를 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시키는 것으로 구성될 수 있는 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.

본 개시내용의 제13 실시양태에 따라, 면역원성 조성물은 a) 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀의 용량의 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스; b) 수크로스 1% (w/v) 내지 10% (w/v); c) 히스티딘 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v); d) 알라닌 0.01% (w/v) 내지 1% (w/v); e) 트리신 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v); f) 아르기닌 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v); g) 젤라틴 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v)로 구성될 수 있다.

추가로, 바람직하게, 면역원성 조성물은 a) 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀의 용량의 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스; b) 수크로스 3% (w/v) 내지 6% (w/v); c) 히스티딘 0.1% (w/v) 내지 1% (w/v); d) 알라닌 0.05% (w/v) 내지 0.5% (w/v); e) 트리신 0.1% (w/v) 내지 0.5% (w/v); f) 아르기닌 0.1% (w/v) 내지 3% (w/v); g) 젤라틴 0.1% (w/v) 내지 3% (w/v)로 구성될 수 있다.

추가로, 바람직하게, 면역원성 조성물은 a) 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀의 용량의 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스; b) 수크로스 4% (w/v); c) 히스티딘 0.21% (w/v); d) 알라닌 0.1% (w/v); e) 트리신 0.3% (w/v); f) 아르기닌 2.1% (w/v); g) 젤라틴 0.85% (w/v)로 구성될 수 있다.

추가로, 바람직하게, 면역원성 조성물은 a) 0.5 ml당 NLT 6 내지 7 Log EID₅₀의 용량의 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스; b) 수크로스 4% (w/v); c) 히스티딘 0.21% (w/v); d) 알라닌 0.1% (w/v); e) 트리신 0.3% (w/v); f) 아르기닌 2.1% (w/v); g) 젤라틴 1% (w/v)로 구성될 수 있다.

추가로, 바람직하게, 면역원성 조성물은 a) 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀의 용량의 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스; b) 수크로스 4% (w/v); c) 히스티딘 0.21% (w/v); d) 알라닌 0.1% (w/v); e) 트리신 0.3% (w/v); f) 아르기닌 1.6% (w/v); g) 젤라틴 1% (w/v)로 구성될 수 있다.

본 개시내용의 제14 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 완전히 액체일 수 있다.

추가로 대안적으로, LAIV 조성물은 동결건조된 또는 냉동 건조된 조성물일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "냉동 건조시키는" 또는 "동결건조시키다" 또는 "동결건조"라는 용어는 동결건조를 포함하고, 현탁액을 냉동시킨 후, 저압에서 승화에 의해 물을 제거하는 프로세스를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "승화"라는 용어는 조성물이 액체가 되지 않고, 고체 상태에서 기체 상태로 직접 변화하는 것인 조성물의 물리적 특성의 변화를 지칭한다.

본 개시내용의 제15 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 인간 대상체에게 유효량의 LAIV 조성물을 비강내 또는 다른 면역화 경로를 통해 투여하는 단계를 포함하는, 건강 병태의 발병을 감소시키거나, 또는 그를 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것으로 제제화될 수 있다.

본 실시양태의 바람직한 측면에 따라, LAIV 조성물은 인간 대상체에게 비강내 경로를 통해 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 이는 비강내 분배 장치, 예컨대, 에어로졸 (비강내 스프레이) 또는 소적 전달 시스템 형태의 장치이다. 액체 비강용 제제는 비강용 스프레이, 점적 및 리닐(rhinyle) 카테터, 압축 공기 분무기, 압착 병, 정량식 펌프 스프레이, 예컨대, 다중 용량 정량식 스프레이 펌프 또는 단일/이중 용량 스프레이 펌프, 주사기에 부착된 스프레이 장치를 통해 전달될 수 있다. 다른 투여 형태는 비강용 산제 (취입기, 건조 분말 흡입기), 비강용 젤, 비강용 점적제, 액제, 현탁제, 공용매 시스템, 마이크로스피어, 나노입자, 마이크로에멀젼, 비강용 삽입물로부터 선택될 수 있다.

비강내 전달 장치는 비제한적으로 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson: BD) 아큐스프레이(Accuspray)™ 전달 장치, 바이-디렉셔널™ 옵티노즈(Bi-Directional™ Optinose) 비강용 장치, 텔레플렉스(Teleflex)에 의한 MAD 비강내 점막 분무 장치(MAD Intranasal Mucosal Atomization), 아에로라이프(AeroLife)™ 및 아에로박스(AeroVax)™ (아에로벡트Rx, 인크.(AerovectRx, Inc.: 미국 조지아주 애틀랜타)), 제트 인젝터 - 파마제트® 스트라티스®니들-프리 인젝터(PharmaJet® Stratis®Needle-Free Injector), MUNJI 다용도 노즐 제트 인젝터(Multi-use-nozzle jet injector): 아쿠아펑쳐(Aquapuncture) 장치, 히포스프레이(Hypospray)®, 마다제트(MadaJet)®, 젠틀제트(GentleJet)®, 일회용 주사기 제트 인젝터: 메디-젝터(Medi-Jector)®, J-팁(J-Tip)®, 인젝스(Injex)®, 비타제트(Vitajet)™, 렉트라제트 HS(LectraJet HS), 렉트라제트® M3, 제타제트(ZetaJet)™, 파마제트®, 액티브-드라이 퍼프할레르(Aktiv-Dry PuffHaler)™ 및 비강용 스프레이 독감 예방 주사 장치로부터 선택될 수 있다.

본 개시내용의 제16 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 본 개시내용의 이전 실시양태에서 개시된 바와 같은 인플루엔자 A 바이러스 감염 또는 그의 서브타입, 본 개시내용의 이전 실시양태에서 개시된 바와 같은 인플루엔자 B 바이러스 감염 또는 그의 서브타입, 또는 본 개시내용의 이전 실시양태에서 개시된 바와 같은 인플루엔자 C 바이러스 감염 또는 그의 서브타입을 포함하는 것으로, 건강 병태의 발병을 감소시키거나, 또는 그를 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것으로 제제화될 수 있다.

본 개시내용의 제17 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 방어에 효과적인 용량으로 비강내로 투여될 수 있다. 백신은 투여 제제와 양립할 수 있는 방식으로 및 예방적으로 효과적인 양으로 투여된다. 본 개시내용의 면역원성 조성물은 감염의 위험이 있는 성인 또는 아동에게 1차 예방제로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 생 약독화된 인플루엔자 백신 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염의 위험이 있는 성인 또는 아동에게 사용될 수 있다.

더욱 바람직하게, LAIV 조성물은 약 0.1 내지 0.5 ml의 투여 용량으로 비강내로 투여될 수 있다.

본 개시내용의 제18 실시양태에 따라, LAIV 조성물은 단일 용량 바이알 또는 다중 용량 바이알 또는 다중 용량 키트로서 또는 미리 충전된 주사기 또는 비강용 스프레이로서 제제화될 수 있고, 여기서, 상기 LAIV 조성물은 단일 투약 스케줄로 제공될 수 있거나, 또는 바람직하게는 1차 백신접종 과정 후, 면역 반응을 유지 및 또는 강화시키는 데 필요한 후속 시간 간격을 두고, 예컨대, 2차 투약을 위해 1-4개월째에 1-2회의 별개의 투약이 제공되고, 필요한 경우, 수개월 또는 수년 후에 후속 투약(들) 또는 매년 백신접종이 이루어지는 다중 투약 스케줄로 제공될 수 있다. 투여 요법은 또한 적어도 부분적으로는 방어 면역을 부여하는 데 필요한 부스터 용량의 필요성에 따라 결정될 것이다.

본 개시내용의 제19 실시양태에 따라, 면역원성 조성물의 최종 pH는 6.5 내지 8로 구성될 수 있다.

본원에 개시된 다른 실시양태는 또한 동결건조된 (냉동-건조된) 면역원성 조성물을 함유하는 제1 용액, 및 동결건조된 (냉동-건조된) LAIV 조성물의 재구성을 위한 수용액 임의적으로 염수 또는 WFI (주사용수)를 함유하는 제2 용기를 포함하는 백신 키트를 포함한다.

본 명세서 전역에 걸쳐, "포함하다(comprise)"라는 단어, 또는 예컨대, "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 어미 변화는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하는 것이지, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제하는 것은 아님을 의미하는 것으로 이해될 것이며, "포함하다(includes)," "포함하는(including)"을 의미할 수 있고, 상기 용어는 언급된 것의 기본 또는 신규한 특징이 언급된 것 이상의 것이 존재함으로 인해 변하지 않는 한, 언급된 것 이상의 것의 존재를 허용하는 개방형이지만, 선행 기술 실시양태는 배제한다.

본 명세서 전역에 걸쳐, "면역원성 조성물"이라는 단어는 벡터로부터 발현된 관심 항원 또는 면역원에 대한 면역 반응을 유도하는; 예를 들어, 대상체에 투여한 후, 관심의 대상이 되는 표적화된 면역원 또는 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 임의의 조성물을 포함한다. "백신 조성물" 및 "백신"이라는 용어는 관심 항원에 대해 방어 면역 반응을 유도하거나, 항원에 대해 효과적으로 방어하는; 예를 들어, 대상체에 투여 또는 주사 후, 표적화된 항원 또는 면역원에 대해 방어 면역 반응을 유도하거나, 또는 벡터로부터 발현된 항원 또는 면역원에 대한 효과적인 방어를 제공하는 임의의 조성물을 포함한다.

"하나 이상의" 또는 "적어도 하나의"라는 표현의 사용은 그러한 사용이 원하는 목적 또는 결과 중 하나 이상의 것을 달성하고자 하는 본 발명의 실시양태에서 이루어질 수 있는 바, 하나 이상의 요소 또는 성분 또는 정량의 사용을 제안한다. 본 발명의 특정 실시양태가 기술되었지만, 이들 실시양태는 단지 예로서 제공된 것이며, 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원 개시내용 리뷰시 본 발명의 범주 내에서 본 발명의 조성물에 대한 변형 또는 수정을 착안해 낼 수 있다. 상기 변형 또는 수정은 본 개시내용의 정신 범위 내에 충분히 존재한다.

다양한 물리적 파라미터, 치수 및 정량에 대해 제공된 수치는 단지 대략적인 값일 뿐이며, 물리적 파라미터, 치수 및 수량에 지정된 수치보다 높은 값은 본 명세서에서 그 반대로 언급되지 않는 한, 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 구상된다.

유사하게, 정제에 사용된 성분, 예컨대, 필터, 칼럼은 어느 방식으로든 제한하거나 배제하는 것으로 의도되지 않으며, 의사의 재량에 따라 동일한 목적을 달성하기 위해 다른 성분 대신으로 치환될 수 있다.

본원에서는 바람직한 실시양태의 구체적인 특징에 대해 상당히 강조하였지만, 본 개시내용의 원리를 벗어나지 않으면서, 바람직한 실시양태에서 다수의 추가 특징이 부가될 수 있고, 다수의 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 본 개시내용의 바람직한 실시양태에서의 이러한 변경 및 다른 변경은 본원의 개시내용으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이며, 이에 의해 상기 설명 사항은 제한으로서가 아니라, 단지 본 개시내용의 예시로서 해석되어야 함을 분명하게 이해하여야 한다.

기술적 이점:

1. 현재 제조되는 거의 모든 인플루엔자 백신은 바이러스 풀 제조를 위한 숙주로 유정란을 사용한다. LAIV의 제조를 위해 유정란을 사용하는 것에 특정의 단점들이 존재하며, 이는 세포 배양물을 기질로 사용함으로써 극복될 수 있다. 유정란을 기질로 사용할 때의 한계는 하기와 같다:

· 백신 품질의 유정란 및 특정 병원균이 없는 유정란의 공급업체가 제한되어 있다는 점

· 유정란이 이용가능해지기 전에 최소 4개월로 사전 주문해야 한다는 점.

· 일부 후보 범유행성 균주는 가금류에 치명적인 감염을 일으켜 백신 제조를 위한 기질 (유정란)을 사용할 수 없게 만든다는 점.

· 유정란 기반 제조는 난부화, 수확 등을 위한 전문 시설을 필요로 하며, 이는 결국에는 빠른 규모 확장 능력을 제한한다는 점.

2. 조직 배양 기반 제조는 확장이 용이하고, 완전히 제어되는 시스템의 장점이 있다.

3. 범유행인 경우, 다른 바이러스 백신의 기존 조직 배양 제조 장치를 사용하여 대규모 백신 제조를 쉽게 달성할 수 있다.

4. 세포 배양에서 수득한 바이러스는 항원 변형을 가질 수 있는 유정란에서 생산된 바이러스와 달리, 순환 균주와 더 높은 유사성을 갖는다.

5. 최소 성분이 백신 조성물에 포함.

6. 보존제, 중합체 및 계면활성제를 포함하지 않음.

7. 정제 프로세스는 저농도의 엔도뉴클레아제 (벤조나제)를 이용한다.

8. 정제 프로세스는 고가이고, 번거로운 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는다.

9. 수율을 향상시키는 상기 안정한 조성물/제제를 제조하는 개선된 방법.

10. 비강내 전달은 높은 수준의 전문 지식을 필요로 하지 않기 때문에 가장 용이한 면역화 경로이고, 이는 다중 용량 제공에 적합화될 수 있다.

11. 길랭 바레 증후군과의 연관성에 대해서는 보고된 바 없으며, 감염 부위에서 전달되기 때문에 더 우수한 방어를 제공한다.

12. 달성하기 어려운 액체 백신 제공은 제한된 동결건조 능력, 재구성을 위한 희석제의 공급 필요성 및 백신 전달 전에 필요한 추가 재구성 단계의 문제를 극복하는 데 도움이 된다.

13. LAIV 재편성체 생성에 사용되는 MDV 백본은 잘 확립된 안전성 프로파일을 갖고, 높은 수준의 방어를 제공하는 것으로 보고되어 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하기 실시예에 개시된 조성물 및 기술이 본 발명의 실시에서 잘 작용하는, 본 발명자들에 의해 발견한 기술을 나타내고, 따라서, 본 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 이해하여야 한다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용에 비추어, 개시되는 특정 실시양태에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 본 발명의 정신 및 범주를 벗어남 없이, 개시된 구체적인 실시양태에 대하여 다수의 변형이 이루어질 수 있고, 이는 여전히 비슷하거나, 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인식해야 한다.

재편성 LAIV 균주는 실험 의학 연구소 (IEM: 러시아 상트페테르부르크) 또는 WHO 협력 센터, 예컨대, 질병 통제 예방 센터 (CDC: 미국 애틀랜타)로부터 조달된 것이다.

실시예 1: 재편성 LAIV 바이러스 면역원성 조성물 안정성 데이터

성분 1- 생 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스 ( LAIV )

인플루엔자 백신 바이러스는 고전 재편성 방법에 의해 유래된, 마스터 공여자 바이러스 (MDV)의 저온 적응, 온도 민감성 및/또는 약독화된 표현형 유전자 분절, 및 야생형 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 타입 A 또는 B 또는 C 바이러스 균주의 헤마글루티닌 (HA) 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자 분절을 6:2 또는 7:1의 비로 포함하는 재편성 LAIV 바이러스이다.

<표 1>

LAIV 면역원성 조성물의 경우:

6 내지 7 log EID50/0.5 ml 용량 범위; 더욱 바람직하게, 7 log EID50/0.5 ml 용량의 타입 A 바이러스

6 내지 7 log EID50/0.5 ml 용량; 더욱 바람직하게, 6.5 log EID50/0.5 ml 용량 범위의 타입 B 바이러스.

LAIV 조성물은 그의 임의의 조합으로 표 1에 개시된 바와 같은 면역원성 조성물에서 사용되는 재편성 LAIV 바이러스 균주 측면에서 1가 또는 다가 (2가; 3가; 4가)이다.

<표 2A>

<표 2B>

<표 3A>

<표 3B>

해석:

안정화제 조성물 3 (1% w/v 젤라틴 + 5% w/v 소르비톨 + 0.1% w/v L-알라닌 + 0.21% w/v L-히스티딘 + 0.3% w/v 트리신 +1.6% w/v L-아르기닌 히드로클로라이드):

타입 A/H1N1 및 타입 B 인플루엔자 백신 균주의 경우, 37℃에서의 가혹 안정성 및 2 내지 8℃ 온도에서의 실시간 안정성, 둘 모두에 대해 허용되지 않는 분해율이 관찰되었다. (도 4 & 5 참조)

안정화제 조성물 4 (1% w/v 젤라틴 + 5% w/v 소르비톨 +0.1% w/v L-알라닌 + 0.21% w/v L-히스티딘 + 0.9% w/v 트리신 +1.6% w/v L-아르기닌 히드로클로라이드):

타입 A /H1N1 및 타입 B 인플루엔자 백신 균주의 경우, 37℃에서의 가혹 안정성 및 2 내지 8℃ 온도에서의 실시간 안정성, 둘 모두에 대해 허용되지 않는 분해율이 관찰되었다. (도 6 & 7 참조).

안정화제 조성물 2 (0.85% w/v 젤라틴 + 3% w/v 수크로스 +0.1% w/v L-알라닌 + 0.21% w/v L-히스티딘 + 0.3% w/v 트리신 +2.1% w/v L-아르기닌 히드로클로라이드):

37℃에서의 가혹 안정성 및 2 내지 8℃ 온도에서의 실시간 안정성, 둘 모두에 대해 허용되지 않는 분해율이 관찰되었다. (도 8 & 9 참조).

안정화제 조성물 1 (0.85% w/v 젤라틴 + 4% w/v 수크로스 +0.1% w/v L-알라닌 + 0.21% w/v L-히스티딘 + 0.3% w/v 트리신 +2.1% w/v L-아르기닌 히드로클로라이드):

37℃에서의 가혹 안정성 및 2 내지 8℃ 온도에서의 실시간 안정성, 둘 모두에 대해 허용되는 분해율 (값이 허용 범위 내에 존재)이 관찰되었다. (도 2, 3, 10 & 11 참조).

실시예 2: MDCK 세포 기반 LAIV 바이러스 제조 프로세스

MDCK 세포 배양 기반 LAIV 조성물을 제조하는 프로세스는 하기 단계의 임의의 서브세트 또는 그들 모두를 포함할 수 있다:

k) LAIV 후보 백신 바이러스를 먼저 유정란 기반 마스터 시드 바이러스 (MSV)를 생산하는 SPF 부화란에 계대접종하는 단계,

l) 유정란 기반 마스터 시드 바이러스를 MDCK 세포 배양 (ATCC CCL-34) 숙주 에서 성장할 수 있도록 적합화시켜 세포 기반 워킹 시드 바이러스 (WSV)를 제조한다. 상이한 세포 배양 베쓸/시스템, 예컨대, 표면적이 175 ㎠인 조직 배양 플라스크 (TCF), 표면적이 850 ㎠인 롤러 병 (RB), 표면적이 6320 ㎠인 셀 팩토리 (CF) 및 고정상 생물반응기 (예컨대, 팔® 라이프 사이언시스즈 (미국 뉴욕주 포트 워싱턴)로부터의 iCELLis® 생물반응기, 예컨대, 나노 및 500/100 생물반응기)에서 상기 세포 기반 WSV로 1:100 내지 1:10000의 MOI로 MDCK 세포 배양물을 감염시키는 단계 (MDCK 세포를 FBS를 함유하는 MEM을 이용하여 성장시키고; 접종 전 트립신 5 내지 25 U/ml를 함유하는 MEM으로 세척하고; WSV를 세포에 1:10 내지 1:10000의 MOI로 접종하고, 31-33℃에서 48-72시간 동안 인큐베이션시켰다)

m) 배양된 바이러스를 수확하는 단계.

n) 바이러스 수확물을 적어도 하나의 정화 필터를 통한 직접 유동 여과 (DFF)에 의해 여과하여 정화된 바이러스 풀 (CVP)을 수득하는 단계.

o) 30-34℃ 범위의 온도에서 2 내지 6시간 동안, 및 이어서, 2 내지 8℃의 온도에서 5 내지 15시간 동안 CVP를 비특이적 엔도뉴클레아제 (예컨대, 벤조나제)로 처리하는 단계.

p) 엔도뉴클레아제로 처리된 CVP를 분자량 컷 오프 (MWCO)가 100 KDa-500 KDa인 막을 이용하여 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 농축시키는 단계.

q) 하나 이상의 탄수화물, 하나 이상의 아미노산 및 젤라틴을 포함하는 안정화제 조성물로 TFF 농축물을 안정화시켜 안정화된 바이러스 수확물을 형성하는 단계.

r) 안정화된 TFF 농축물을 공극 크기가 약 0.2 ㎛인 적어도 하나의 멸균 등급 필터를 통해 DFF에 의해 멸균시켜 멸균된 CMVP (정화된 1가 바이러스 풀)를 수득하는 단계.

s) 멸균된 CMVP를 폴리카르보네이트 병 중에서 -60℃ 이하에서 보관하는 단계.

t) 멸균된 제제를 바이알에 충전시키고, 2-8℃에서 보관하는 단계.

<표 4>

<표 5>

· 세포 배양 배지: 10% FBS를 포함하는 MEM (1 N HCl을 이용하여 pH 7.0 내지 7.4로 조정).

(추가 글루타민 350 mg/L).

· 바이러스 배지: FBS를 포함하지 않는 MEM (1 N HCl을 이용하여 pH 7.2 내지 7.6으로 조정).

(추가 글루코스 - 500 mg/L, 글루타민 - 350 mg/L).

추가 0.4%의 글루코스를 생물반응기 시스템에 사용되는 CM 및 VM에 첨가한다.

<표 6>

<표 7>

<표 8>

<표 9>

<표 10>

실시예 3: 바이러스 투입량 ( MOI ) 및 접종 후 인큐베이션 기간이 수율에 미치는 효과

<표 11>

추론:

A. 감염 시점:

MDCK 세포 유래 인플루엔자 워킹 시드 바이러스의 감염을 위해, 최적화 연구에 기초하여, 세포 계수에 대한 특정 제한을 롤러 병당 120 x 10⁶ 내지 180 x 10⁶개의 세포, 및 생물반응기 시스템의 경우, 7000 x 10⁶ 내지 10000 x 10⁶개의 세포로 선택하였다. 감염 절차 전 단일층 전면생장에 대해서 MDCK 세포를 포함하는 롤러 병에 대해 현미경 관찰을 수행하였다.

B. MOI 및 접종 후 인큐베이션 기간:

MOI 최적화 연구의 모든 관찰결과에 기초하여, 타입 A (H1N1), 타입 A (H3N2) 및 타입 B 인플루엔자 바이러스에 대해 선택된 MOI 범위는 1:100 내지 1:10000이었고, 접종 후 인큐베이션 기간의 범위는 48 hr 내지 72 hr이었다.

실시예 4: 상이한 농도의 트립신이 수율에 미치는 효과

<표 12>

추론:

트립신은 MDCK 세포의 접종을 위해 인플루엔자 바이러스를 활성화시키는 데 요구된다. 상기 결과로부터, 롤러 병당 2000 내지 3000 단위의 트립신이 최대 바이러스 효력을 나타낸 것으로 관찰되었다.

실시예 5: 벤조나제 농도 및 온도가 세포 DNA 함량 및 바이러스 역가에 미치는 효과

상이한 농도의 벤조나제를 시험하여 상이한 온도에서 숙주 세포 DNA를 분해시켰다. 정화된 바이러스 풀 (CVP)을 500 U/L (2 mM MgCl₂ 포함), 500 U/L, 1000 U/L, 2500 U/L 및 5000 U/L 농도의 벤조나제로 처리하고, 처리된 CVP를 32℃에서 3 hr 동안 유지시키고, 추가로 계속해서 2-8℃에서 밤새도록 유지시켰다. 각 단계에서 샘플링을 수행하였고, 하기는 각 단계에서의 DNA 함량 결과이다.

<표 13>

<표 14>

추론:

상기 결과로부터, 2 mM MgCl₂ 존재하에 500 U/L 농도의 벤조나제로 처리된 CVP가 2 mM MgCl₂ 부재하의 500 U/L 농도의 벤조나제로 처리된 CVP보다 DNA 분해가 더 높게 나타난 것으로 관찰되었다. 또한, 더 높은 벤조나제 농도 1000 U/L, 2500 U/L 및 5000 U/L은 벤조나제 농도 500 U/L (2mM MgCl₂ 포함)과 유사한 DNA 분해를 보인 것으로 관찰된다.

실시예 6: 다양한 제조 단계에서의 바이러스 수율

<표 15>

1. CVP: 정화된 바이러스 풀 (여과 후 수확),

2. BCVP: 벤조나제로 처리된 CVP,

3. CMVP: 정화된 1가 바이러스 풀 (TFF 후, 안정화제 첨가 및 0.2 μ 여과)

추론:

각 타입 A (H1N1), 타입 A (H3N2) 및 타입 B 계절성 인플루엔자 바이러스에 대해 단계별 바이러스 농도를 체크하였고, 수확 수준에서의 초기 바이러스 농도는 마지막 단계, 즉, 백신 벌크 제조 (CMVP)까지 프로세스 전 기간 동안에 걸쳐 유지된 것으로 관찰되었다.

<표 16>

추론: 바이러스 회수를 수확이 시작점이고, CMVP가 제조의 종점인 제조 동안의 바이러스 보유율(%)로 산출될 수 있다. 상기 결과로부터, 평균 바이러스 회수율은 0.34 Log EID₅₀/0.5 ml의 역가 손실과 등가인 44.67%라는 결론에 도달할 수 있다. 또한, CMVP 수준에서 최종 바이러스 회수 (바이러스 역가)는 허용 한계 내에 포함되어 있고, CMVP는 MDCK 기반 LAIV 바이러스의 최종 제품 배치를 제조하는 데 사용될 수 있다는 것이 관찰된다.

실시예 7: CMVP 제조 동안 단계별 숙주 세포 DNA 농도의 비교 데이터

상이한 균주의 정화된 바이러스 풀 (CVP)을 벤조나제 처리하고, DNA 함량에 대해 단계별로 샘플링을 수행하였다. 하기는 각 단계에서의 DNA 함량 결과이다.

<표 17>

추론:

상기 결과로부터, 벤조나제로 처리되었을 때 CVP는 DNA의 유의적인 감소를 보인 것으로 관찰되었다. 추가로, TFF 프로세스 (투석여과/농축) 및 CMVP 제조 프로세스 동안 잔류 DNA는 다시 효율적으로 제거되는 것으로 관찰되었다. 최종 CMVP 수준에서 DNA 함량 범위는 원하는 허용 한계 내에 포함되어 있다.

실시예 8: TFF 실험의 다양한 시도

TFF 프로세스를 위한 희석 배지 (바이러스 배지 및 PBS), 투석여과 및 농축 절차와 같은 파라미터들을 고려하여 다양한 TFF 실험을 수행하였다. 바이러스 농축을 위해 TFF 농축물 샘플을 시험하였다.

<표 18>

A/Cal: A/17/캘리포니아/2009/38;

B/Tex = B/텍사스/02/2013-CDC-LV8B;

A/HK = A/17/홍콩/2014/8296;

VM: 바이러스 배지

해석:

상기 실험 세트로부터, 최적의 바이러스 수율을 갖는 원하는 TFF 농축물을 얻기 위해 TFF 프로세스 진행 후, 이어서, 2X DF 및 4X 농축 단계를 수행하는 것을 선택하였다. VM과 비교하면, PBS가 바이러스에 더 우수한 안정성을 제공한다.

실시예 9: 면역원성 결과

흰 족제비 모델에서 백신의 면역 반응 및 효능에 대한 유정란 및 MDCK 세포 배양 기반 3가 및 4가 계절성 인플루엔자 백신의 성능을 평가하는 연구를 수행하였다. 0일째 A/미시간/45/2015 (H1N1), A/홍콩/4801/2015 (H3N2), B/ 브리즈번/60/2008 및 B/푸켓/3073/2013과 유사한 균주를 함유하는 유정란 및 MDCK 세포 배양 기반 3가 또는 4가 제제를 이용하여 비강내로 모든 동물을 면역화하고, 4주 후 (28일째) 챌린지하였다.

표 19: 28일째 수집된 혈청의 혈구응집 억제 ( HAI ) 및 중화 역가 (NT) 기하 평균

<표 19>

추론: (도 12 & 13 참조)

상동성 A-H1N1 바이러스로 챌린지되었을 때, A-H1N1을 함유하는 유정란 기반 및 MDCK 기반 3가 및 4가 백신의 백신접종이 동물을 A-H1N1 감염에 대해 방어할 수 있다는 결론에 도달하게 되었다.

흰 족제비 모델에서 면역 반응 및 효능에 대한 유정란 및 MDCK 세포 기반 1가 LAIV (A-H5N2 및 A-H7N9), 둘 모두의 성능을 평가하는 또 다른 연구를 수행하였다. 다른 군의 동물을 유정란 및 MDCK 세포 배양 기반 A-H5N1 및 A-H7N9 1가 LAIV로 면역화하고, 각각 상동성 A-H5N1 및 A-H7N9 바이러스로 챌린지하였다. 1가 H5N2 LAIV로 면역화된 동물은 A-H5N1 바이러스의 상동성 챌린지에 대해 방어되었다. 1가 A-H7N9 LAIV로 면역화된 동물은 A-H7N9 바이러스의 상동성 챌린지에 대해 방어되었다.

Claims (41)

1. a) 하나 이상의 인플루엔자 바이러스;
   b) 하나 이상의 탄수화물;
   c) 하나 이상의 아미노산; 및
   d) 젤라틴
   을 포함하는 면역원성 조성물.
2. 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 바이러스, 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스, 불활성화된 인플루엔자 바이러스, 키메라 인플루엔자 바이러스, 또는 재조합 인플루엔자 바이러스로 구성된 것인 면역원성 조성물.
3. 제1항에 있어서, 조성물이 인플루엔자 타입 A 또는 타입 B 또는 타입 C 또는 그의 서브타입으로부터 유래된 인플루엔자 바이러스 측면에서 1가인 면역원성 조성물.
4. 제1항에 있어서, 조성물이 인플루엔자 타입 A 또는 타입 B 또는 타입 C 또는 그의 서브타입으로부터 유래된 인플루엔자 바이러스 측면에서 다가인 면역원성 조성물.
5. 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 마스터 공여자 바이러스 (MDV)의 저온 적응, 온도 민감성 및/또는 약독화된 표현형 유전자 분절 및 야생형 범유행성 또는 계절성 인플루엔자 타입 A 또는 B 또는 C 바이러스 균주의 헤마글루티닌 (HA) 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자 분절을 1:7, 2:6, 3:5, 4:4, 5:3, 6:2 또는 7:1의 비로 포함하는 재편성 LAIV 바이러스인 면역원성 조성물.
6. 제5항에 있어서, 마스터 공여자 바이러스 (MDV)가 A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2) 인플루엔자 A 균주, B/USSR/60/69 인플루엔자 B 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
7. 제5항에 있어서, 재편성 LAIV 바이러스가 인플루엔자 A 바이러스 또는 H1 내지 H18 및 N1 내지 N11 및 그의 서브타입 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H5N3, H9N2, H7N1, H7N3, H7N7, H6N1, H7N9, 또는 H10N8로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자로 구성된 것인 면역원성 조성물.
8. 제5항에 있어서, 재편성 LAIV 바이러스가 인플루엔자 A 바이러스 균주 pdmH1N1 균주 - A/캘리포니아/07/2009 (A/Cal로 지칭)-유사 균주 또는 A/Cal, A/미시간/45/2015-유사 균주, A/남아프리카/3626/2013 유사 균주, 또는 H3N2-A/홍콩/4801/2014-유사 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자로 구성된 것인 면역원성 조성물.
9. 제5항에 있어서, 재편성 LAIV 바이러스가 인플루엔자 B 바이러스 균주 빅토리아 계통-B/브리즈번/60/2008-유사 균주 또는 야마가타 계통-B/푸켓/3073/2013-유사 균주로부터의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및/또는 뉴라미니다제 (NA) 유전자로 구성된 것인 면역원성 조성물.
10. 제1항에 있어서, 하나 이상의 탄수화물이 천연 탄수화물, 합성 탄수화물, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당, 환원성 당, 비-환원성 당, 당 알콜, 폴리올, 폴리히드록실 화합물, 화학적으로 변형된 탄수화물, 유리 전이 촉진제로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서, 유리 전이 촉진제는 수크로스, 만니톨, 만노스, 라피노스, 락티톨, 락토비온산, 글루코스, 말툴로스, 이소-말툴로스, 말토스, 락토스, 덱스트로스, 푸코스 또는 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
11. 제10항에 있어서, 하나 이상의 탄수화물이 1% (w/v) 내지 10% (w/v)의 양으로 존재하는 수크로스로 구성된 것인 면역원성 조성물.
12. 제1항에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 트리신, 류신, 이소-류신, 히스티딘, 글리신, 글루타민, 아르기닌, 리신, 알라닌 또는 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
13. 제10항에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v)의 양으로 존재하는 트리신, 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v)의 양으로 존재하는 히스티딘, 0.01% (w/v) 내지 1% (w/v)의 양으로 존재하는 알라닌 및 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v)의 양으로 존재하는 아르기닌으로 구성된 것인 면역원성 조성물.
14. 제1항에 있어서, 젤라틴이 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v)의 양으로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
15. 제1항에 있어서, 조성물이 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 알루미늄 히드록시포스페이트, 및 황산알루미늄칼륨 또는 그의 혼합물의 군으로부터 선택되는 애주번트를 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
16. 제1항에 있어서, 조성물이 유성 및 수성 에멀젼, MF-59, 리포솜, 지질다당류, 사포닌, 지질 A, 지질 A 유도체, 모노포스포릴 지질 A, 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A, AS01, AS03, 올리고뉴클레오티드, 적어도 하나의 비메틸화된 CpG 및/또는 리포솜을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 프로인트 애주번트, 프로인트 완전 애주번트, 프로인트 불완전 애주번트, CRL-8300 애주번트, 뮤라밀 디펩티드, TLR-4 효능제, 플라겔린, 그람 음성 박테리아 유래 플라겔린, TLR-5 효능제, TLR-5 수용체에 결합할 수 있는 플라겔린의 단편, QS-21, ISCOMS, 키토산, 스테롤 및 지질과 사포닌 조합의 군으로부터 선택되는 면역자극성 성분을 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
17. 제1항에 있어서, 단일 용량 조성물이 보존제를 함유하지 않고, 다중 용량 조성물이 2-페녹시에탄올, 염화벤제토늄 (페메롤), 페놀, 티오메르살, 포름알데히드, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤질 알콜 또는 그의 조합의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 보존제로 구성된 것인 면역원성 조성물.
18. 제1항에 있어서, 조성물이 염화나트륨, 카르보네이트, 시트레이트, 락테이트, 글루코네이트, 타르트레이트, 포스페이트 완충제 염수, HEPES, 시트레이트-포스페이트 또는 TRIS로부터 선택되는 완충제로 구성된 것인 면역원성 조성물.
19. 제1항에 있어서, 조성물이 제약상 허용되는 수송체, 부형제, 결합제, 담체, 등장화제, 유화제 또는 습윤제로 구성된 것인 면역원성 조성물.
20. 제19항에 있어서, 조성물이 당, 폴리올, NaCl, KCl, KH₂PO₄, Na₂HPO₄.2H₂O, CaCl₂, 또는 MgCl₂를 비롯한 염, 아미노산, 또는 pH 변형제의 군으로부터 선택되는 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
21. 제1항에 있어서, 조성물이 인플루엔자 A 바이러스 감염 또는 그의 서브타입, 인플루엔자 B 바이러스 감염 또는 그의 서브타입 또는 인플루엔자 C 바이러스 감염 또는 그의 서브타입을 포함하는, 건강 병태의 발병을 감소시키거나, 또는 그를 예방하는 방법에서 사용하기 위한 단일 용량 바이알 또는 다중 용량 바이알 또는 다중 용량 키트로서 또는 미리 충전된 주사기 또는 비강용 스프레이로서 제제화되는 것인 면역원성 조성물.
22. 제1항에 있어서, 면역원성 조성물의 최종 pH가 pH 6.5 내지 8로 구성된 것인 면역원성 조성물.
23. 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 비제한적으로 ATCC CCL-34, 마딘 다르비 개 신장(Madin Darby canine kidney: MDCK) 33016 세포주 (DSM ACC 2219), MDCK (ATCC CCL34 MDCK(NBL2)), MDCK 33016 (DSM ACC 2219), DSM ACC3309, ATCC CRL-12042, ATCC PTA-7909, ATCC PTA-7910, ATCC PTA-6500, ATCC PTA-6501, ATCC PTA-6502, ATCC PTA-6503, 'MDCK-S', 'MDCK-SF101', 'MDCK-SF102', 'MDCK-SF103' 및 FERM BP-7449로부터 선택되는 MDCK 세포에서 증식되는 것인 면역원성 조성물.
24. 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 마딘 다르비 개 신장 (MDCK) 세포 (ATCC CCL-34)에서 증식되는 것인 면역원성 조성물.
25. 제1항에 있어서, 인플루엔자 타입 B 바이러스가 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀; 더욱 바람직하게, 0.5 ml당 NLT 6.5 Log EID₅₀의 용량으로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
26. 제1항에 있어서, 인플루엔자 타입 A 바이러스가 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀; 더욱 바람직하게, 0.5 ml당 NLT 7 Log EID₅₀의 용량으로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
27. a) MDCK 세포 배양 숙주를 인플루엔자 바이러스로 1:100 내지 1:10000의 MOI로 감염시키는 단계;
    b) 5 내지 25 U/ml 범위의 트립신을 함유하는 MEM 중에서의 40 내지 70 hr의 인큐베이션 기간 후에 인플루엔자 바이러스를 포함하는 상청액을 수확하는 단계;
    c) 공극 크기가 약 6 ㎛ 내지 약 0.45 ㎛인 적어도 하나의 정화 필터를 통해 직접 유동 여과 (DFF)에 의해 바이러스 수확물을 여과하는 단계;
    d) 30-34℃ 범위의 온도에서 2 내지 6시간 동안, 및 이어서, 2 내지 8℃의 온도에서 5 내지 15시간 동안 CVP를 비특이적 엔도뉴클레아제로 처리하는 단계;
    e) 엔도뉴클레아제로 처리된 CVP를 분자량 컷 오프 (MWCO)가 100 KDa-500 KDa인 막을 이용하여 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 농축시키는 단계;
    f) 하나 이상의 탄수화물, 하나 이상의 아미노산 및 젤라틴을 포함하는 안정화제 조성물로 TFF 농축물을 안정화시켜 안정화된 바이러스 수확물을 형성하는 단계;
    g) 안정화된 TFF 농축물을 공극 크기가 약 0.8 ㎛ 내지 약 0.2 ㎛인 적어도 하나의 멸균 등급 필터를 통해 DFF에 의해 멸균시켜 멸균된 CMVP를 형성하는 단계로 구성되고,
    여기서 정제된 바이러스의 전회수율은 40% 이상인,
    면역원성 조성물을 제조하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 단계 (d)가 바이러스 수확물을 0.1 mM 내지 100 mM 양의 Ca2+, Mg2+, Mn2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가 양이온의 존재하에서 0.5 단위/ml 내지 5 단위/ml 범위 농도의 비특이적 엔도뉴클레아제, 더욱 특히 벤조나제로 처리하는 것으로 구성된 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
29. 제27항에 있어서, 단계 (d)가 바이러스 수확물을 1 내지 3 mM 농도의 2가 양이온 Mg^{2 +} 염의 존재하에서 0.5 단위/ml 내지 5 단위/ml 범위 농도의 비특이적 엔도뉴클레아제, 더욱 특히 벤조나제로 처리하는 것으로 구성된 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
30. 제27항에 있어서, 단계 (e)가 바이러스 수확물을 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 농축시켜 바이러스 수확물을 적어도 4X 농축시키는 것으로 구성된 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
31. 제27항에 있어서, 단계 (f)가 바이러스 수확물을, 수크로스를 1% (w/v) 내지 10% (w/v)의 농도로, 히스티딘을 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v)의 농도로, 알라닌을 0.01% (w/v) 내지 1% (w/v)의 농도로, 트리신을 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v)의 농도로, 아르기닌을 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v)의 농도로, 및 젤라틴을 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v)의 농도로 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시키는 것으로 구성된 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
32. 제27항에 있어서, 단계 (f)가 바이러스 수확물을, 수크로스를 3% (w/v) 내지 6% (w/v)의 농도로, 히스티딘을 0.1% (w/v) 내지 1% (w/v)의 농도로, 알라닌을 0.05% (w/v) 내지 0.5% (w/v)의 농도로, 트리신을 0.1% (w/v) 내지 0.5% (w/v)의 농도로, 아르기닌을 0.1% (w/v) 내지 3% (w/v)의 농도로, 및 젤라틴을 0.1% (w/v) 내지 3% (w/v)의 농도로 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시키는 것으로 구성된 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
33. 제27항에 있어서, 단계 (f)가 바이러스 수확물을, 수크로스 4% (w/v), 히스티딘 0.21% (w/v), 알라닌 0.1% (w/v), 트리신 0.3% (w/v), 아르기닌 2.1% (w/v) 및 젤라틴 0.85% (w/v)를 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시키는 것으로 구성된 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
34. 제27항에 있어서, 단계 (f)가 바이러스 수확물을, 수크로스 4% (w/v), 히스티딘 0.21% (w/v), 알라닌 0.1% (w/v), 트리신 0.3% (w/v), 아르기닌 2.1% (w/v) 및 젤라틴 1.0% (w/v)를 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시키는 것으로 구성된 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
35. 제27항에 있어서, 단계 (f)가 바이러스 수확물을, 수크로스 4% (w/v), 히스티딘 0.21% (w/v), 알라닌 0.1% (w/v), 트리신 0.3% (w/v), 아르기닌 1.6% (w/v) 및 젤라틴 1.0% (w/v)를 포함하는 안정화제 조성물로 안정화시키는 것으로 구성된 것인, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
36. 제1항에 있어서, 인간 대상체에게 면역원성 조성물을 투여하는 방법이 비강내, 근육내, 정맥내, 피하, 경피 또는 진피내 경로로 구성된 것인, 면역원성 조성물.
37. a) 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀의 용량의 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스;
    b) 수크로스 1% (w/v) 내지 10% (w/v);
    c) 히스티딘 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v);
    d) 알라닌 0.01% (w/v) 내지 1% (w/v);
    e) 트리신 0.1% (w/v) 내지 2% (w/v);
    f) 아르기닌 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v);
    g) 젤라틴 0.1% (w/v) 내지 5% (w/v)
    를 포함하는 면역원성 조성물.
38. 제37항에 있어서, 조성물이
    a) 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀의 용량의 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스;
    b) 수크로스 3% (w/v) 내지 6% (w/v);
    c) 히스티딘 0.1% (w/v) 내지 1% (w/v);
    d) 알라닌 0.05% (w/v) 내지 0.5% (w/v);
    e) 트리신 0.1% (w/v) 내지 0.5% (w/v);
    f) 아르기닌 0.1% (w/v) 내지 3% (w/v);
    g) 젤라틴 0.1% (w/v) 내지 3% (w/v)
    를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
39. 제37항에 있어서, 조성물이
    a) 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀의 용량의 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스;
    b) 수크로스 4% (w/v);
    c) 히스티딘 0.21% (w/v);
    d) 알라닌 0.1% (w/v);
    e) 트리신 0.3% (w/v);
    f) 아르기닌 2.1% (w/v);
    g) 젤라틴 0.85% (w/v)
    를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
40. 제37항에 있어서, 조성물이
    a) 0.5 ml당 NLT 6 내지 7 Log EID₅₀의 용량의 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스;
    b) 수크로스 4% (w/v);
    c) 히스티딘 0.21% (w/v);
    d) 알라닌 0.1% (w/v);
    e) 트리신 0.3% (w/v);
    f) 아르기닌 2.1% (w/v);
    g) 젤라틴 1% (w/v)
    를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
41. 제37항에 있어서, 조성물이
    a) 0.5 ml당 6 내지 7 Log EID₅₀의 용량의 하나 이상의 생 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV) 바이러스;
    b) 수크로스 4% (w/v);
    c) 히스티딘 0.21% (w/v);
    d) 알라닌 0.1% (w/v);
    e) 트리신 0.3% (w/v);
    f) 아르기닌 1.6% (w/v);
    g) 젤라틴 1% (w/v)
    를 포함하는 것인 면역원성 조성물.

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