BR112021016059A2 - Composição de vacina de vírus de influenza atenuada viva e processo para a preparação da mesma - Google Patents

Abstract

composição de vacina de vírus de influenza atenuada viva e processo para a preparação da mesma. a presente invenção refere-se a composições e métodos para a fabricação e a obtenção de uma composição de vacina para influenza atenuada viva (laiv) que pode ser aplicada intranasalmente para conferir proteção contra a infecção do vírus de influenza. as ditas cepas de laiv são baseadas em fenótipos adaptados ao frio, sensíveis à temperatura e atenuados de vírus doadores mestres (mdvs) que contêm os genes de glicoproteína de superfície das cepas de influenza pandêmicas ou sazonais do tipo selvagem. além disso, as ditas de laiv também são adaptadas para crescer em células mdck (células dos rins de cães madin darby). o uso dos ovos é evitado na fabricação de vacinas em larga escala. o processo de purificação é destituído de etapas de cromatografia. a dita composição de laiv inclui um ou mais vírus de vacina de influenza atenuada viva e é destituída de polímeros e tensoativos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO DE VACINA DE VÍRUS DE INFLUENZA ATENUADA VIVA E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DA MESMA".

CAMPO

[0001] A presente invenção refere-se ao campo de fabricação de vacina viral, e mais particularmente ela se refere a uma composição de vacina de influenza atenuada viva e ao método de preparação da mesma. A presente invenção refere-se a um método para a produção de vírus, ou antígenos virais, produzidos pela cultura de células, aos vírus ou aos antígenos viral que podem ser obtidos por esse método, e às vacinas que contêm tais vírus ou antígenos virais.

ANTECEDENTES

[0002] As informações antecedentes no presente documento a seguir referem-se à presente invenção, mas não consistem necessariamente na técnica anterior.

[0003] As epidemias e as pandemias causadas por agentes infecciosos vêm ocorrendo há séculos, causando grandes rupturas, com morbidez e mortalidade variadas. O vírus de influenza é um dos principais elementos no histórico das pandemias. Quatro pandemias de influenza ocorreram no último século e pelo menos 15 pandemias de influenza foram registradas até agora, com uma mortalidade estimada de 50 milhões de pessoas só em 1918-19.

[0004] As vacinas desempenham um papel importante no controle da propagação de vírus, e a vacina de influenza inativada (IIV), assim como as vacinas de influenza atenuadas vivas (LAIV), vêm sendo utilizadas há muitos anos. As vacinas de influenza inativadas administradas parenteralmente amplamente usadas induzem respostas de anticorpos de soro que previnem eficazmente a doença de influenza quando as cepas circulantes são combinadas antigenicamente à vacina.

Por outro lado, as vacinas de influenza atenuadas vivas (LAIVs) são administradas intranasalmente, imitando a infecção natural, e induzem imunorespostas jumorais e celulares tanto locais quanto sistêmicas, conferindo proteção conferenciando contra as cepas tanto combinadas quanto alteradas. Além disso, a aplicação sem agulha de LAIVs pode reduzir o limite para a aceitação e desse modo aumentar a cobertura da vacina de influenza.

[0005] Até a presente data, as LAIVs estão licenciadas nos Estados Unidos (desde 2003), na Europa (desde 2010), na Rússia (desde os anos 80) e na Índia (desde 2010). As LAIVs são baseadas nos vírus doadores mestres de influenza A e B atenuado (MDVs) desenvolvidos independentemente, mas essencialmente da mesma maneira, nos Estados Unidos e na Rússia nos anos 60. Os vírus de LAIV sazonais e pandêmicos MedImmune são produzidos atualmente por meio de genéticas reversa (RG). Por outro lado, as LAIVs russas estão sendo produzidas pela independência genética clássica em ovos embrionados. A LAIV russa foi registrada recentemente para o uso na China e na Tailândia.

[0005] A LAIV russa consiste no vírus independente, o qual contém hemaglutinina (HA) e na maioria dos casos os segmentos de genes de neuraminidase (NA) dos vírus do tipo selvagem (WT) circulantes de interesse em uma cadeia principal dos seis genes de proteína interna restantes (PB1, PB2, PA, NP, M e NS) derivados de (MDVs). Os MDVs A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) (Len-MDV) e B/USSR/60/69 são usados atualmente na Rússia como MDVs para LAIV. Os MDVs contêm mutações em múltiplos segmentos de genes, o que torna os mesmos adaptados ao frio (ca), sensíveis à temperatura (ts) e atenuados (att). As glicoproteínas de superfície hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) de cepas contemporâneas são incorporadas nesses MDVs pela independência. Os seus fenótipos de ca, ts e att indicam que as LAIVs replicam a baixas temperaturas, e param de replicar a temperaturas mais altas (> 38°C), limitando a replicação ao trato respiratório superior. Em comparação aos MDVs usados nos Estados Unidos, os MDVs russos contêm menos mutações que estão presentes em sítios diferentes dos segmentos de genes, sugerindo que eles podem ser distintamente atenuados. A comparação direta nos animais e no homem sugeriu que os MDVs russos e um único derivado independente de cepa dos mesmos era mais imunogênico do que os equivalentes.

[0006] Com o passar dos anos, as LAIVs russas têm sido administradas com segurança a mais de 75 milhões de pessoas e mostraram ser seguras com respeito à atenuação (estabilidade genética) e à transmissão. A reversão à virulência (perda de fenótipo atenuado) nunca foi observada e é altamente improvável de ocorrer porque deve requerer a reversão de múltiplas mutações em mais de um segmento de gene. A neurovirulencia dos vírus de LAIV russos nunca foi relatada e tanto os MDVs quanto as independências derivadas dos mesmos mostraram não ter propriedades neurovirulentas. Depois da administração de uma LAIV, não há nenhum relatório de eventos adversos graves associados com a imunização, com exceção dos sintomas do tipo gripe autolimitadores (nariz escorrendo, congestão nasal, dor de garganta, tosse, dor de cabeça e febre de grau baixo) relatados em casos raros. Além de ser seguras, as LAIVs mostraram ser eficazes na proteção contra a doença causada pela infecção do vírus de influenza. A imunidade induzida pelas LAIVs é ampla e mostrou que para protege contra as cepas alteradas. Nas crianças em particular, as LAIVs mostraram ser mais eficazes na proteção clínica e/ou na proteção contra a influenza confirmada em cultura do que a vacina de influenza inativada, e também mostraram que conferem imunidade de rebanho.

[0007] Tal como as vacinas de influenza inativadas, as LAIVs russas são produzidas ao usar ovos embrionados de galinha, com suas próprias desvantagens inerentes limitadas os doadores de ovos sem patógenos de qualidade de vacina e específicos precisam pedir com um mínimo de 4 meses de antecedência antes que os ovos se tornem disponíveis para a produção de vacina em larga escala. A facilidade especializada para a incubação de ovos, a colheita, etc., limita por sua vez a capacidade de escalonamento rápido. O longo tempo requerido para produzir vacinas dependentes de ovos pode resultar em muito poucas doses disponíveis para conter uma situação pandêmica, tal como ocorrido em 2009, ou para parar uma pandemia que originou de um vírus de influenza altamente patogênico. Portanto, o sistema de produção de vacina atual deve ser inadequado para responder a uma pandemia de influenza, para a qual um novo processo de fabricação de vacina de emergência rápido é requerido. Teoricamente, a produção de vacinas de influenza na cultura de células oferece vantagens importantes no caso de pandemia. A fabricação de vacinas em larga escala pode ser facilmente realizada ao usar unidades de fabricação de cultura de tecidos pré-existentes de outras vacinas virais.

[0008] O controle na disponibilidade da consistência do substrato e flexibilidade na produção, o escalonamento rápido, que é especialmente importante no caso de uma pandemia, a independência do suprimento de ovos e a manutenção de bandos de galinha são as vantagens principais do método da cultura de tecidos. A casca do ovo é uma estrutura porosa e os ovos são não estéreis no lado de fora. O processo de fabricação para desenvolver o vírus de influenza nos ovos requer a perfuração da casca do ovo para a inoculação e a manipulação aberta para a colheita com um risco inerente de contaminação. Além disso, a cultura de células é um sistema mais controlado com meios de cultura de células definidos e bancos de células validados de acordo com a Boa Prática de Fabricação (GMP). Portanto, tentativas vêm sendo feitas para transferir a produção de ovos à cultura de células.

[0009] Várias linhagens de células estão atualmente sob investigação para a produção de influenza baseada na cultura de células, e o uso de células MRC-5 (Vide: de Ona et al. (1995) J Clin Microbiol 33: 1948-49, células HepG2 (Vide: Ollier et al. (2004) J Clin Microbiol 42(12): 5861-5), células LLC-MK2 (Vide: Schepetiuk & Kok (1993) J Virol Methods 42(2-3): 241-50), células de rins de cães Madin- Darby (MDCK) (Vide: Tobita et al. (1975) Med Microbiol Immunol (Berl).162(1): 9-14 e 23-27), células Vero de macaco verde africano (Vide: Monto et al. (1981) J Clin Microbiol 13(1): 233-235 e Govorkova et al. (1995) J Infect Dis. 172(1): 250-3), e células PER.C6 (Vide: Cox, R.

J. et al.; Vaccine 2009, 27, 1889-1897) foram relatados.

Previamente para células MRC-5, WI-38 e FRhL, títulos baixos a moderados de vírus com títulos iguais ou menores do que 5,0 log10 TCID50/ml foram relatados, ao passo que para títulos de células MDCK de até 6,7 log10 TCID50/ml foram relatados.

Embora as vacinas de influenza derivadas de culturas de células (vírus de influenza isolados de ovos adaptados/otimizados para o crescimento em cultura de células) sejam licenciadas na Europa (Optaflu Novartis; 2007) e nos Estados Unidos (Flucelvax Novartis; 2012), somente uma fração muito pequena das vacinas de influenza no mercado é derivada de cultura de células.

Isto pode ser devido ao rendimento inconsistente da vacina de influenza ao usar sistemas de produção de cultura de células em combinação com métodos clássicos de purificação e a prática de estabilização.

Foram levantadas questões teóricas de segurança relacionadas ao uso de linhagens de células contínuas tais como células MDCK relacionadas ao seu uso na fabricação de vacina (VRBPAC, 2008). Essas questões são principalmente associadas com os componentes celulares residuais (DNA e proteína) no produto fármaco de vacina e são particularmente relevantes para os produtos de vacina de influenza atenuada viva (LAIV) que não são inativados nem passam por uma purificação bioquímica extensiva tal como é o caso das vacinas de influenza inativadas tradicionais. Duas estratégias foram empregadas para minimizar estes riscos: as etapas de caracterização de linhagem de células e de processamento de purificação da vacina. Um aspecto específico do processo de purificação consiste em reduzir a quantidade e o tamanho do DNA residual da célula hospedeira no produto de vacina. A fabricação de Optaflu Novartis (2007) inclui várias etapas para eliminar o DNA residual da célula hospedeira. Estas incluem a cromatografia de troca de íons de sulfato de celulose que liga o vírus de influenza e permite que o DNA passe através, e uma etapa subsequente de precipitação de CTAB que, entre outras coisas, precipita o DNA.

[0010] Os processos de purificação previamente relatados são caros e demorados, uma vez que empregam uma ou mais cromatografias de hidróxi apatita, afinidade, troca de ânions e exclusão de tamanho. A recuperação total do vírus foi relatada como sub ideal para a produção de vacina de rotina ao empregar métodos cromatográficos. Além disso, os vírus de influenza circulantes passam por mudanças nas propriedades antigênicas das partículas de vírus devido alteração e mudança antigênicas observadas nesse vírus. Estas mudanças têm um impacto nas propriedades físico-químicas do vírus e por sua vez na capacidade de ligação do vírus à matriz cromatográfica. Isto pode conduzir a um alto nível de variação nos rendimentos das cepas alteradas ou mudadas que tornam a cromatografia inadequada para a produção de rotina. Um outro método usado para a remoção/redução do DNA da célula hospedeira.

[0011] A utilização de uma concentração maior de benzonase (por exemplo, 50 U/ml, 100 U/ml), que é cara.

[0012] Os tensoativos não iônicos típicos usados em formulações farmacêuticas incluem Triton™ X-100, Pluronic® F-68, F-88 e F-127 (poloxâmeros), Brij 35 (éter alquílicos de polioxi-etileno), polióxi estearato 40, Cremophor® EL e alfa-tocoferol TPGS. Cada um destes tensoativos têm um ponto em comum, uma vez que todos eles contêm porções de polioxietileno e desse modo, até uma extensão maior ou menor, exibem um problema similar, uma vez que a porção de poloixoetileno se auto-oxida para produzir peróxidos reativos, o que causa um aumento na imunogenicidade de proteína indesejado. (Vide Edward T. Maggio et al; Polysorbates, peroxides, protein aggregation, immunogenicity – a growing concern; Journal of Excipients and Food Chemicals 3(2): 46-53;2012).

[0013] Vários estabilizantes são usados para estabilizar a preparação de vacina para obter uma vida sob armazenagem desejada. Estabilizantes tais como a polivinil pirrolidona (PVP), a trehalose e o sorbitol também são usados em formulações de vírus. No entanto, foi relatado que a PVP desestabiliza as formulações de vírus atenuados vivos. (Vide: J. A. White et al.; Development of a stable liquid formulation of live attenuated influenza vaccine; Vaccine Volume 34, Edição 32, 12 de julho de 2016, Páginas 3676-3683;2016).

[0014] A trehalose é cara; ela tem que ser combinada com outros açúcares e aditivos de proteína (gelatina) para atingir a estabilidade. Além disso, outros estabilizantes são melhores do que a trehalose para realçar a estabilidade da vida sob armazenagem de uma vacina liofilizada.

[0015] O sorbitol tem uma baixa temperatura de transição vítrea (Tg) (-1,6°C), portanto, ele não pode ser usado como um componente principal da formulação. A baixa Tg do sorbitol limita o seu uso. O sorbitol tem que ser combinado com outros açúcares e aditivos de proteína (gelatina) para atingir a estabilidade.

[0016] Foi sugerido que o impacto teórico do DNA residual hospedeiro na segurança do produto deve ser considerado para a rota de administração da vacina, uma vez que a distribuição do tecido e a taxa de depuração podem variar com base na modalidade de administração. Os estudos demonstram que a absorção e a depuração do MDCK DNA dos tecidos variam dependendo da rota de administração. Quando o DNA foi administrado intranasalmente, em comparação à administração intramuscular, os níveis detectáveis de DNA eram mais baixos em todos os pontos no tempo. Desse modo, a rota de administração intranasal da vacina parece reduzir o risco potencial associado com o DNA residual da célula hospedeira que pode estar presente em produtos de vacina finais produzidos em cultura de células. (Vide: D. E. Tabor et al.; Biologicals 41 (2013) 247-253).

[0017] O objetivo da presente invenção consiste na superação das limitações acima mencionadas e analogamente na provisão de composições e métodos para a fabricação de uma vacina de influenza atenuada viva (LAIV) aplicada intranasalmente à base de células MDCK (rins de cães Madin Darby) para proteger contra o vírus de influenza. A presente invenção também apresenta um processo de fabricação melhorado que utiliza uma baixa concentração de endonuclease, mais particularmente a benzonase, e é destituído das etapas de cromatografia sensíveis à produção de cultura de células em larga escala. Além disso, a presente invenção apresenta uma formulação de LAIV destituída de polímeros e tensoativos, a qual compreende um ou mais vírus de vacina de influenza atenuada viva.

SUMÁRIO

[0018] A presente invenção apresenta uma composição de vacina de influenza atenuada viva (LAIV) aplicada intranasalmente à base de células MDCK (LAIV) que compreende: a) um ou mais vírus de vacina de influenza atenuada viva; em que as cepas de vírus de influenza atenuada viva são derivadas por um método "clássico" ou "de genética reversa" independente que consiste essencialmente em gene de hemaglutinina

(HA) e/ou gene de neuraminidase (NA) de vírus de influenza pandêmico ou sazonal do tipo selvagem e genes que expressam as proteínas PB1, PB2, PA, NP, M e NS, e em alguns casos a proteína NA derivada do vírus doador mestre (MDV), as cepas A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) e/ou B/USSR/60/69, b) um ou mais aminoácidos, c) um ou mais carboidratos, e d) gelatina.

[0019] A presente invenção também apresenta um método para a fabricação de tal composição/formulação de vacina.

OBJETIVOS

[0020] Alguns dos objetivos da presente invenção, que pelo menos uma modalidade no presente documento satisfaz, são tal como segue:

[0021] Um objetivo da presente invenção consiste no melhoramento de um ou mais problemas da técnica anterior ou na provisão de pelo menos uma alternativa útil.

[0022] Um outro objetivo da presente invenção consiste na provisão de composições de vacina e métodos para a fabricação de uma vacina de influenza atenuada viva (LAIV) que pode ser aplicada intranasalmente.

[0023] Ainda um outro objetivo da presente invenção consiste na provisão de uma composição de vacina de influenza atenuada viva (LAIV) à base de células dos rins de cães Madin Darby (MDCK) em que o uso de ovos é evitado por completo.

[0024] Ainda um outro objetivo da presente invenção consiste na provisão de uma composição de LAIV que compreende um ou mais vírus de vacina de influenza atenuada viva e é destituída de polímeros e tensoativos.

[0025] Ainda um outro objetivo da presente invenção consiste na provisão de uma composição de LAIV que compreende um ou mais vírus de vacina de influenza atenuada viva em que as cepas de LAIV são baseadas em fenótipos adaptados ao frio, sensíveis à temperatura e atenuados de vírus doadores mestres (MDVs) que contêm uma ou duas das glicoproteínas de superfície das cepas de influenza pandêmicas ou sazonais do tipo selvagem.

[0026] Ainda um outro objetivo da presente invenção consiste na provisão de uma composição de vacina de influenza atenuada viva (LAIV) aplicada intranasalmente à base de células MDCK em que a composição preserva as características desejadas de um vírus, incluindo a imunogenicidade e a estabilidade.

[0027] Ainda um outro objetivo da presente invenção consiste na provisão de uma composição/formulação de vacina de influenza atenuada viva (LAIV) aplicada intranasalmente à base de células MDCK apropriada para o tratamento ou a prevenção da infecção por vírus de influenza, ou para prevenir, melhorar, ou retardar o surgimento ou a progressão das suas manifestações clínicas.

[0028] Ainda um outro objetivo da presente invenção consiste na provisão de uma metodologia melhorada no campo da produção de vacina de influenza atenuada viva à base de células MDCK sensível à produção de cultura de células em larga escala.

[0029] Outros objetivos e vantagens da presente invenção serão mais aparentes a partir da descrição a seguir, que não se presta a limitar o âmbito da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0030] A presente invenção será descrita agora com a ajuda dos desenhos anexos listados a seguir:

[0031] A Figura 1 ilustra uma representação esquemática da independência do vírus de influenza pandêmico ou sazonal do tipo selvagem e MDV atenuado que gera a cepa de vacina reordenada, em que (A) representa o vírus do tipo selvagem patogênico infeccioso, (B)

representa o vírus doador mestre que compreende segmentos de genes de fenótipos sensíveis à temperatura (ts), adaptados ao frio (ca) e atenuados (at), e (C) representa a cepa da vacina reordenada.

[0032] Figura 2: O gráfico ilustra a estabilidade a 37°C dos títulos de Rendimento Log de Vírus da Cepa de Influenza A (A/17/turkey/Turkey/05/133 - A/H5N2) (EID50/0,5 ml) com a Composição de estabilizantes 1 tal como divulgado na Tabela 3B.

[0033] Figura 3: O gráfico ilustra a estabilidade a 2 a 8°C dos títulos de Rendimento Log de Vírus da Cepa de Influenza A (A/17/turkey/Turkey/05/133 - A/H5N2 e A/17/Anhui/2013/61 - A/H7N9) (EID50/0,5 ml) com a Composição de estabilizantes 1 tal como divulgado na Tabela 3A.

[0034] Figura 4: O gráfico ilustra a estabilidade a 37°C dos títulos de Rendimento Log de Vírus da Cepa de Influenza A (A/17/California/2009/38 - A/H1N1) e da Cepa de Influenza B (B/Texas/02/13-CDC) (EID50/0,5 ml) com a Composição de estabilizantes 3 tal como divulgado na Tabela 3B.

[0035] Figura 5: O gráfico ilustra a estabilidade a 2 a 8°C dos títulos de Rendimento Log de Vírus da Cepa de Influenza A (A/17/California/2009/38 - A/H1N1) e da Cepa de Influenza B (B/Texas/02/13-CDC) (EID50/0,5 ml) com a Composição de estabilizantes 3 tal como divulgado na Tabela 3A.

[0036] Figura 6: O gráfico ilustra a estabilidade a 37°C dos títulos de Rendimento Log de Vírus da Cepa de Influenza A (A/17/California/2009/38 - A/H1N1) e da Cepa de Influenza B (B/Texas/02/13-CDC) (EID50/0,5 ml) com a Composição de estabilizantes 4 tal como divulgado na Tabela 3B.

[0037] Figura 7: O gráfico ilustra a estabilidade a 2 a 8°C dos títulos de Rendimento Log de Vírus da Cepa de Influenza A (A/17/California/2009/38 - A/H1N1) e Cepa de Influenza B (B/Texas/02/13-CDC) (EID50/0,5 ml) com a Composição de estabilizantes 4 tal como divulgado na Tabela 3A.

[0038] Figura 8: O gráfico ilustra a estabilidade a 37°C dos títulos de Rendimento Log de Vírus da Cepa de Influenza A (A/SouthAfrica/3626/13 - H1N1) e da Cepa de Influenza B (B/Texas/02/13-CDC) (EID50/0,5 ml) com a Composição de estabilizantes 2 tal como divulgado na Tabela 3B.

[0039] Figura 9: O gráfico ilustra a estabilidade a 2 a 8°C dos títulos de Rendimento Log de Vírus da Cepa de Influenza A (A/SouthAfrica/3626/13 - H1N1) e da Cepa de Influenza B (B/Texas/02/13-CDC) (EID50/0,5 ml) com a Composição de estabilizantes 2 tal como divulgado na Tabela 3A.

[0040] Figura 10: O gráfico ilustra a estabilidade a 37°C dos títulos de Rendimento Log de Vírus da Cepa de Influenza A (A/SouthAfrica/3626/13 - H1N1) e da Cepa de Influenza B (B/Texas/02/13-CDC) (EID50/0,5 ml) com a Composição de estabilizantes 1 tal como divulgado na Tabela 3B.

[0041] Figura 11: O gráfico ilustra a estabilidade a 2 a 8°C dos títulos de Rendimento Log de Vírus da Cepa de influenza A (A/SouthAfrica/3626/13 - H1N1) e da Cepa de Influenza B (B/Texas/02/13-CDC) (EID50/0.5 ml) com a Composição de estabilizantes 1 tal como divulgado na Tabela 3A.

[0042] Figura 12: Teste de vírus infeccioso nas amostras de turbinado nasal e do pulmão. Os animais foram vacinados com uma ou duas doses de H5 LAIV, H7 LAIV ou placebo. Os Grupos 1 a 4 foram estimulados com H5/tk/Tk, os Grupos 5 e 6 foram estimulados com H5/Vt e os Grupos 7 a 10 foram estimulados com H7/An. As amostras de turbinado nasal (a) e as amostras do pulmão (b) coletadas no 4º dia após a infecção foram tituladas quanto à presença de partículas de vírus competentes de replicação. Os títulos individuais são mostrados com a média dos grupos indicada por uma linha preta sólida.

[0043] Figura 13: Resposta dos anticorpos HI e VN após a imunização. As respostas dos anticorpos em média geométrica no 28º dia após a imunização (dia 28 do estudo para um regime de uma dose e no dia 56 do estudo para o regime de duas doses) contra vírus de estimulação homologa H5/tk/Tk para animais imunizados com H5 LAIV e H7/An para animais imunizados com H7 LAIV. (a) títulos de anticorpo HI (b) títulos de anticorpo VN. N = 6 por grupo, a barra de erro representa o erro padrão da média. O significado estatístico foi determinado pelo teste U de Mann-Mann-Whitney. * p < 0,05 e ** p < 0,01.

DESCRIÇÃO

[0044] Embora a presente invenção possa ser suscetível a modalidades diferentes, determinadas modalidades são mostradas nos desenhos e depois da discussão detalhada, devendo ficar compreendido que a presente invenção pode ser considerada como uma exemplificação dos princípios da invenção e não se prestam a limitar o âmbito da invenção àquele que é ilustrado e divulgado nesta descrição.

[0045] As modalidades da presente invenção serão descritas agora com referência aos desenhos anexos.

[0046] As modalidades são fornecidas de modo a levar integral e completamente o âmbito da presente invenção a um elemento versado no estado da técnica. Numerosos detalhes são apresentados, relacionados a componentes e métodos específicos, para conferir uma compreensão completa das modalidades da presente invenção. Será aparente ao elemento versado no estado da técnica que os detalhes fornecidos nas modalidades não devem ser interpretados como limitadores do âmbito da presente invenção. Em algumas modalidades, processos bem conhecidos, estruturas de aparelhos bem conhecidas e técnicas bem conhecidas não são descritos em detalhes.

[0047] A terminologia usada na presente invenção é somente para a finalidade de explicar uma modalidade particular e tal terminologia não será considerada como limitadora do âmbito da presente invenção. Tal como usadas na presente invenção, as forma "um", "uma" e "o/a" podem ser destinadas a incluir também as formas no plural, a menos que o contexto sugira claramente de alguma outra maneira.

[0048] Os termos primeiro, segundo, terceiro, etc., não devem ser interpretados como limitadores do âmbito da presente invenção, uma vez que os termos acima mencionados só podem ser usados para distinguir um elemento, um componente, uma região, uma camada ou uma seção de um outro componente, região, camada ou seção. Os termos tais como primeiro, segundo, terceiro, etc., quando usados no presente documento não implicam uma sequência ou ordem específica, a menos que seja sugerido claramente pela presente invenção.

[0049] Tal como usado no presente documento, o termo "vírus de influenza" se refere ao vírus de RNA que compreende os vírus de influenza A, B, C e D que representam a família Orthomyxoviridae. Um vírus de influenza pode ser um vírus de influenza pandêmico ou sazonal do tipo selvagem vivo, um vírus de vacina de influenza atenuado vivo, um vírus de influenza inativado, um vírus de influenza quimérico, ou um vírus de influenza recombinante.

[0050] A presente invenção provê composições que compreendem o vírus de vacina de influenza atenuado vivo (LAIV) para a proteção contra a infecção pelo vírus de influenza. A presente invenção também provê métodos para a fabricação de composições que compreendem um ou mais vírus de vacina de influenza.

[0051] De acordo com uma primeira modalidade da presente invenção, a composição de LAIV pode compreender um ou mais vírus de vacina de influenza atenuada viva, um ou mais aminoácidos, um ou mais carboidratos e gelatina.

[0052] O termo "vivo" é usado em seu significado convencional, um vírus vivo é um vírus que não está inativado, isto é, um vírus com capacidade de replicar em células permissivas. Um vírus de vacina de influenza atenuado vivo é um vírus que não induz a doença causada pelo vírus do tipo selvagem correspondente nos animais ou nos seres humanos e que tem capacidade de induzir uma imunoresposta específica.

[0053] De acordo com uma segunda modalidade da presente invenção, um ou mais vírus de vacina de influenza atenuada viva podem ser derivados pelo método de independência "clássico" ou de "genética reversa" que compreende segmentos de genes de uma ou mais cepas de vírus de influenza.

[0054] De acordo com o primeiro aspecto da segunda modalidade, o vírus de vacina de influenza atenuada viva independente é o vírus de LAIV independente que compreende segmentos de genes de fenótipos adaptados ao frio, sensíveis à temperatura e/ou atenuados (proteínas PB1, PB2, PA, NP, M e/ou NS) de vírus doadores mestres (MDVs) de segmentos de genes de hemaglutinina (HA) e/ou neuraminidase (NA) das cepas de vírus de influenza pandêmico ou sazonal do tipo A ou B ou C em uma razão de 1:7, 2:6, 3:5, 4:4, 5:3, 6:2 ou 7:1.

[0055] Ainda de preferência, o vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode incluir segmentos de genes da cepa de vírus doador mestre (MDV) e da cepa de vírus de influenza pandêmico ou sazonal do tipo selvagem em uma razão de 6:2 (tal como ilustrado na Figura 1).

[0056] De acordo com um segundo aspecto da segunda modalidade, o vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) derivados do vírus de influenza A de qualquer subtipo, ou pode ser derivado do vírus de influenza B de qualquer subtipo.

[0057] O vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) selecionado do grupo que compreende a cepa de influenza A (H2N2) A/Leningrad/134/17/57 A, e a cepa de influenza B B/USSR/60/69.

[0058] Ainda de preferência, o vírus de vacina de influenza do tipo A atenuado vivo independente pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) que compreendem a cepa de influenza A/Leningrad/134/17/57 A (H2N2).

[0059] Ainda de preferência, a cepa do vírus de vacina de influenza do tipo A atenuado vivo independente - A/17/California/2009/38 pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) que compreendem a cepa de influenza A A/Leningrad/134/17/57 (H2N2).

[0060] Ainda de preferência, a cepa do vírus de vacina de influenza do tipo A atenuado vivo independente - A/17/turkey/Turkey/05/133 pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) que compreendem a cepa de influenza A A/Leningrad/134/17/57 (H2N2).

[0061] Ainda de preferência, a cepa do vírus de vacina de influenza do tipo A atenuado vivo independente - A/17/Anhui/2013/61 pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) que compreendem a cepa de influenza A A/Leningrad/134/17/57 (H2N2).

[0062] Ainda de preferência, a cepa do vírus de vacina de influenza do tipo A atenuado vivo independente - A/17/New York/15/5364 pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) que compreendem a cepa de influenza A A/Leningrad/134/17/57 (H2N2).

[0063] Ainda de preferência, a cepa do vírus de vacina de influenza do tipo A atenuado vivo independente - A/17/Hong-Kong/2014/8296 pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) que compreendem a cepa de influenza A A/Leningrad/134/17/57 (H2N2).

[0064] Ainda de preferência, a cepa do vírus de vacina de influenza do tipo A atenuado vivo independente - A/South-Africa/3626/2013-CDC- LV14A pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) que compreendem a cepa de influenza A A/Leningrad/134/17/57 (H2N2).

[0065] Ainda de preferência, a cepa do vírus de vacina de influenza do tipo B atenuado vivo independente pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) que compreendem a cepa de influenza B B/USSR/60/69.

[0066] Ainda de preferência, a cepa do vírus de vacina de influenza do tipo B atenuado vivo independente - B/Texas/02/2013-CDC- LV8B pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) que compreendem a cepa de influenza B B/USSR/60/69.

[0067] Ainda de preferência, a cepa do vírus de vacina de influenza do tipo B atenuado vivo independente - B/Phuket/3073/2013 pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) que compreendem a cepa de influenza B B/USSR/60/69.

[0068] Ainda de preferência, a cepa do vírus de vacina de influenza do tipo B atenuado vivo independente - B/56/Brisbane/60/08 pode incluir segmentos de genes de vírus doador mestre (MDV) que compreendem a cepa de influenza B B/USSR/60/69.

[0069] De acordo com o terceiro aspecto da segunda modalidade, o vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode incluir o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) do vírus de influenza A ou do vírus de influenza B ou do vírus de influenza C.

[0070] Ainda de preferência, a cepa de vírus de vacina de influenza A atenuado vivo independente pode incluir o gene de hemaglutinina (HA) dos subtipos HA de vírus de influenza H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 ou H18 ou qualquer outro gene de subtipo HA e/ou de neuraminidase (NA) relatado dos subtipos NA do vírus de influenza A, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N10 ou N11 ou qualquer outro subtipo NA relatado.

[0071] Ainda de preferência, o vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode incluir o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) das cepas de vírus de influenza pandêmicas ou das cepas de vírus de influenza potencialmente pandêmicas.

[0072] Ainda de preferência, o vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode incluir o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) das cepas de vírus de influenza sazonais.

[0073] Ainda de preferência, a cepa de vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode conter o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) dos subtipos de vírus de influenza H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H5N2, H9N2, H7N1, H7N3, H7N7, H6N1, H7N9 e H10N8 ou qualquer outra cepa de vírus previamente relatada ou recentemente detectada.

[0074] Ainda de preferência, a cepa de vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode conter o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) da cepa pdmH1N1 do vírus de influenza A.

[0075] inda de preferência, a cepa de vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode conter o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) da cepa do vírus de influenza A A/California/07/2009 (indicada como cepa do tipo A/Cal).

[0076] Ainda de preferência, a cepa de vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode conter o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) da cepa do vírus de influenza A do tipo A/Michigan/45/2015.

[0077] Ainda de preferência, a cepa de vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode conter o gene de hemaglutinina (HA) e/ou do gene de neuraminidase (NA) da cepa do vírus de influenza A do tipo A/South-Africa/3626/2013.

[0078] Ainda de preferência, a cepa de vírus de vacina de influenza atenuado vivo independente pode conter o gene de hemaglutinina (HA)

e/ou o gene de neuraminidase (NA) da cepa do vírus de influenza A do tipo H3N2-A/HongKong/4801/2014.

[0079] Ainda de preferência, as cepas de vírus de vacina de influenza atenuados vivos independentes podem conter o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) de vírus de influenza B que pertencem a duas linhagens diferentes tanto do tipo Yamagata quanto do tipo Victoria.

[0080] Ainda de preferência, as cepas de vírus de vacina de influenza atenuados vivos independentes podem conter o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) da cepa do vírus de influenza do tipo B/Brisbane/60/2008 da linhagem Victoria.

[0081] Ainda de preferência, as cepas de vírus de vacina de influenza atenuados vivos independentes podem conter o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) da cepa do vírus de influenza do tipo -B/Phuket/3073/2013 da linhagem Yamagata.

[0082] Há dois métodos para a geração de vírus independentes

1. Método Clássico de Independência

[0083] O processo de independência do vírus de vacina de influenza pandêmico ou sazonal do tipo selvagem e de MDV atenuado que gera a cepa reordenada inclui a coinfecção de um hospedeiro da cultura, normalmente ovos, com uma cepa de MDV e uma cepa de vírus do tipo selvagem. Os vírus independentes são selecionados mediante a adição de anticorpos com especificidade para as proteínas HA e/ou NA do MDV a fim de selecionar os vírus independentes que contêm as proteínas HA e/ou NA das cepas de vírus do tipo selvagem. Em várias passagens deste tratamento é possível selecionar os vírus independentes de crescimento rápido que contêm as cepas de vírus de vacina de influenza pandêmicos ou sazonais do tipo selvagem e/ou os segmentos de HA e/ou NA e os genes internos do MDV.

2. Método de genética reversa de independência

[0084] A genética reversa é um método de geração de partículas de vírus infeccioso a partir de cópias do DNA. Os seis genes internos do MDV e dos genes de HA e de NA da cepa do tipo selvagem recomendados para a inclusão na vacina são clonados em plasmídeos que podem gerar o RNA viral de comprimento total quando transfectados em células de cultura. Estes plasmídeos, junto com quatro plasmídeos que expressam a subunidade de polimerase viral, são transfectados em células de cultura. A expressão da subunidade de polimerase e a geração de RNA viral de comprimento total conduzem ao conjunto do vírus e à liberação de partículas de vírus infecciosos no sobrenadante. Este vírus resgatado exibe as características antigênicas das cepas recomendadas e os fenótipos de ca, ts e att do MDV.

[0085] A cepa de LAIV reordenada é obtida junto ao Institute of Experimental Medicine (IEM) São Petersburgo, Rússia ou de centros de colaboração WHO tais como o Centre for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta.

[0086] De acordo com uma terceira modalidade da presente invenção, a composição de LAIV pode compreender um ou mais carboidratos, selecionado do grupo, mas sem ficar a eles limitados, de carboidratos naturais, carboidratos sintéticos, polióis, agentes facilitadores da transição vítrea, monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, oligossacarídeos e seus álcoois de açúcar correspondentes, compostos de poli-hidroxila tais como derivados de carboidrato e carboidratos quimicamente modificados, hidróxi etil amido e copolímeros de açúcar. Os carboidratos tanto naturais quanto sintéticos são apropriados para o uso. Os carboidratos sintéticos incluem, mas sem ficar a eles limitados, aqueles que têm a ligação glicosídica substituída por uma ligação de tiol ou carbono. Ambas as formas D e L de carboidratos podem ser usadas. O carboidrato pode ser não redutor ou redutor. Onde um carboidrato redutor é usado, a adição de inibidores de reação de Maillard é preferida. Os carboidratos redutores apropriados para o uso na composição são aqueles conhecidos no estado da técnica e incluem, mas sem ficar a eles limitados, a glicose, a sacarose, a maltose, a lactose, a frutose, a galactose, a manose, a maltulose e a lactulose. Os carboidratos não redutores incluem, mas sem ficar a eles limitados, glicosídeos não redutores de compostos de poli-hidroxila selecionados de álcoois de açúcar e outros poliálcoois de cadeia linear. Outros carboidratos úteis incluem a rafinose, a estaquiose, a melezitose, a dextrana, a celibiose, a manobiose e álcoois de açúcar. Os glicosídeos de álcoois de açúcar são de preferência monoglicosídeos, em particular os compostos obtidos através da redução de dissacarídeos tais como a lactose, a maltose, a lactulose e a maltulose. O agente formador de vidro é selecionado do grupo que consiste em sacarose, manitol, trehalose, manose, rafinose, lactitol, ácido lactobiônico, glicose, maltulose, isso- maltulose, maltose, lactose, sorbitol, dextrose, frutose, glicerol, ou uma combinação destes.

[0087] Ainda de acordo com o aspecto preferido da terceira modalidade, a composição de LAIV pode incluir a sacarose como estabilizante apropriado de carboidrato que varia entre 1% e 20% em peso/volume, de preferência entre 1 e 10%, com mais preferência entre 3 e 6%, e com maior preferência igual a 4% (em peso/volume).

[0088] De acordo com a quarta modalidade da presente invenção, a composição de LAIV pode compreender um ou mais aminoácidos selecionados do grupo de, mas sem ficar a eles limitados, tricina, arginina, leucina, iso-leucina, histidina, glicina, glutamina, lisina, alanina, peptídeo, proteína hidrolisada ou uma proteína tal como a albumina do soro.

[0089] Ainda de acordo com o aspecto preferido da quarta modalidade, a composição de LAIV pode compreender a tricina, a arginina, a histidina e a alanina como aminoácidos apropriados tanto individualmente quanto em combinação.

[0090] Ainda de acordo com o aspecto preferido da quarta modalidade, um ou mais aminoácidos podem incluir a tricina variando entre 0,1% e 2% em peso/volume (p/v), de preferência entre 0,1 e 1%, com mais preferência entre 0,1 e 0,5%, e com maior preferência igual a 0,3% (em peso/volume).

[0091] Ainda de acordo com o aspecto preferido da quarta modalidade, um ou mais aminoácidos podem incluir a histidina variando entre 0,1% e 2% (em peso/volume), de preferência entre 0,1 e 1%, com mais preferência entre 0,1 e 0,5%, e com maior preferência igual a 0,21% (em peso/volume).

[0092] Ainda de acordo com o aspecto preferido da quarta modalidade, um ou mais aminoácidos podem incluir a alanina variando entre 0,01% e 1% em peso/volume, de preferência entre 0,05 e 0,5%, com mais preferência entre 0,08 e 0,2%, e com maior preferência igual a 0,1% (em peso/volume).

[0093] Ainda de acordo com o aspecto preferido da quarta modalidade, um ou mais aminoácidos podem incluir a arginina variando entre 0,1% e 10% em peso/volume, de preferência entre 0,1 e 5%, com mais preferência entre 0,1 e 3%, e com maior preferência igual a 2,1% (em peso/volume).

[0094] De acordo com a quinta modalidade da presente invenção, a composição de LAIV pode compreender a gelatina variando entre 0,1% e 10% em peso/volume, de preferência entre 0,1 e 5%, com mais preferência entre 0,1 e 3%, e com maior preferência igual a 0,85% (em peso/volume).

[0095] Tal como usado no presente documento, o termo "gelatina" se refere a uma preparação de proteína não pirogênica estéril (por exemplo, frações) produzido pela hidrólise ácida parcial (gelatina do tipo A) ou pela hidrólise alcalina parcial (gelatina do tipo B) de colágeno animal, mais comumente derivado de fontes de bovinos, suínos e peixes. A gelatina pode ser obtida em faixas variadas de peso molecular. As fontes recombinantes de gelatina também podem ser usadas.

[0096] De acordo com uma sexta modalidade da presente invenção, a composição de LAIV também pode compreender um agente tampão selecionado do grupo que consiste em agentes tampão de HEPES, Citrato-fosfato, carbonato, fosfato, citrato, lactato, gluconato e tartrato, bem como agentes tampão orgânicos mais complexos incluindo um agente tampão de fosfato que contém fosfato de sódio e/ou fosfato de potássio a uma razão selecionada para obter o pH desejado. Em um outro exemplo, o agente tampão contém tris (hidroximetil) aminometano, ou "Tris", formulado para obter o pH desejado. Ainda em um outro exemplo, o agente tampão pode ser o meio essencial mínimo com sais de Hanks.

[0097] De acordo com uma sétima modalidade da presente invenção, em que a composição de uma só dose é livre de conservantes e a composição de múltiplas doses também pode compreender um conservante selecionado do grupo que compreende 2-fenóxi etanol, cloreto de benzetônio (Phemerol), fenol, m-cresol, Thiomersal, formaldeído, ésteres de parabeno (por exemplo, metil, etil, propil ou butil parabeno), cloreto de benzalcônio, álcool benzílico, clorobutanol, p- cloro-m-cresol, ou álcool benzílico, ou uma combinação destes. Uma composição de vacina pode incluir o material para uma única imunização, ou pode incluir o material para múltiplas imunizações (isto é, um kit 'de múltiplas doses'). A inclusão de um conservante é preferida em arranjos de múltiplas doses. Como uma alternativa (ou além de) à inclusão de um conservante em composições de múltiplas doses, as composições podem ser contidas em um recipiente que tem um adaptador asséptico para a remoção do material.

[0098] De acordo com uma oitava modalidade da presente invenção, a composição de LAIV também pode compreender um transportador, excipiente, aglutinante, veículo, agente isotônico, ou umectante farmaceuticamente aceitáveis em que os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados do grupo que consiste em tensoativos, polímeros e sais. Os exemplos dos tensoativos podem incluir tensoativos não iônicos tais como o polissorbato 20, o polissorbato 80, etc. Os exemplos dos polímeros podem incluir a dextrana, a carbóxi metil celulose, o ácido hialurônico, a ciclodextrina, etc. Os exemplos dos sais podem incluir NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4.2H2O, CaCl2, MgCl2, etc.

[0099] De acordo com uma nona modalidade da presente invenção, a composição de LAIV também pode compreender um adjuvante selecionado do grupo de hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, hidróxi fosfato de alumínio e sulfato de alumínio e potássio, ou uma mistura destes.

[0100] De acordo com uma décima modalidade da presente invenção, a composição de LAIV também pode compreender um componente imunoestimulador selecionado do grupo que consiste em uma emulsão de óleo e água, MF-59, um lipossoma, um lipopolissacarídeo, uma saponina, lipídio A, derivados de lipídio A, lipídio A de monofosforila, lipídio A de monofosforila 3-deacilado, AS01, AS03, um oligonucleotídeo, um oligonucleotídeo que compreende pelo menos um CpG não metilado e/ou um lipossoma, adjuvante de Freund, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, polímeros, copolímeros tais como copolímeros de polioxietileno- polioxipropileno, incluindo copolímeros de bloco, polímero p 1005, adjuvante CRL-8300, dipeptídeo de muramil, agonistas de TLR-4,

flagelina, flagelinas derivadas de bactérias gram-negativas, agonistas de TLR-5, fragmentos de flagelinas que podem se ligar aos receptores de TLR-5, Alfa-C-galactosil ceramida, quitosana, Interleucin-2, QS-21, ISCOMS, combinação de saponina com esteróis e lipídios.

[0101] De acordo com uma décima primeira modalidade da presente invenção, o método de preparação da composição de LAIV à base de cultura de células MDCK pode compreender qualquer subconjunto ou todas as etapas a seguir: a) O vírus de vacina LAIV candidato é passado inicialmente em ovos de galinha embrionados SPF, produzindo o vírus semente mestre à base de ovo (MSV). b) O vírus semente mestre à base de ovo é adaptado para crescer no hospedeiro da cultura de células para preparar o vírus semente de trabalho (WSV) à base de células. Este WSV à base de células é subcultivado e propagado em células hospedeiras ao usar diferentes casos de cultura de célula tais como os Tissue Culture Flasks (TCFs) com uma área de superfície de 175 cm2, Roller Bottles (RBs) com uma área de superfície de 850 cm2, Cell Factories (CFs) com uma área de superfície de 6.320 cm2 e Bioreactor de leito fixo (por exemplo, os biorreatores iCELLis® da Pall® Life Sciences, Port Washington, N.Y., tais como os biorreatores Nano e 500/100). c) O vírus cultivado é colhido. d) A colheita viral é filtrada por meio de filtração de fluxo direto (DFF) através de pelo menos um filtro de clarificação para obter os aglomerados de vírus clarificados (CVPs). e) Os CVPs são tratados com uma endonuclease não específica para degradar o DNA celular. f) O CVP tratado com endonuclease tratado é sujeitado à filtração de fluxo tangencial. g) O concentrado de TFF é estabilizado com uma composição de estabilizantes que compreende um ou mais carboidratos, um ou mais aminoácidos e gelatina para formar uma colheita viral estabilizada. h) O concentrado de TFF estabilizado é esterilizado por DFF através de pelo menos um filtro de grau de esterilização para obter um aglomerado de vírus monovalente clarificado esterilizado (CMVP). i) Os CMVPs esterilizados são armazenados em frascos de policarbonato a -60°C ou menos. j) As formulações esterilizadas são colocadas em frascos e armazenadas a 2 a 8°C.

[0102] De acordo com um primeiro aspecto da décima primeira modalidade, o vírus de LAIV candidato à base de ovo adaptado para crescer no hospedeiro de cultura de células pode ser qualquer célula eucariótica. Ainda de preferência, o hospedeiro de cultura de células pode consistir em células de mamíferos ou aves. As células de mamíferos apropriadas incluem, mas sem ficar a elas limitadas, células de hamsters, bovinos, primatas (incluindo seres humanos e macacos) e cães. Os vários tipos de células incluem, mas sem ficar a elas limitados, células dos rins, fibroblastos, células da retina e células do pulmão. Os exemplos de células de hamster apropriadas são as linhagens de células que têm os nomes BHK21 ou HKCC. As células de macacos apropriadas são, por exemplo, as células de macaco verde africano, tais como as células dos rins como na linhagem de células Vero. As células de cães apropriadas são, por exemplo, as células dos rins, tal como nas linhagens de células CLDK e MDCK.

[0103] Outras células apropriadas incluem, mas sem ficar a elas limitadas: CHO; 293T; BHK; MRC 5; PER.C6; FRhl.2; WI-38; etc. As células apropriadas estão amplamente disponíveis, por exemplo, junto à coleção da American Type Cell Culture (ATCC), aos Coriell Cell Repositories, ou à European Collection of Cell Cultures (ECACC). Por exemplo, a ATCC fornece várias células Vero diferentes sob os números de catálogo CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 e CRL-1587, e fornece células MDCK sob o número de catálogo CCL 34. PER.C6 está disponível junto à ECACC sob o número de depósito 96022940.

[0104] Ainda de preferência, o hospedeiro de cultura de células pode consistir em células dos rins de cães Madin Darby (MDCK), selecionadas de, mas sem ficar a elas limitadas, ATCC CCL-34, linhagem de células MDCK 33016 (DSM ACC 2219), MDCK (ATCC CCL34 MDCK(NBL2)), MDCK 33016 (DSM ACC 2219), DSM ACC3309, ATCC CRL-12042, ATCC PTA-7909, ATCC PTA-7910, ATCC PTA-6500, ATCC PTA-6501, ATCC PTA-6502, ATCC PTA-6503, 'MDCK-S', 'MDCK- SF101', 'MDCK-SF102', 'MDCK-SF103' e FERM BP-7449.

[0105] Ainda de preferência, o hospedeiro de cultura de células pode consistir em células dos rins de cães Madin Darby (MDCK) ATCC CCL 34 (NBL2).

[0106] De acordo com um segundo aspecto da décima primeira modalidade, as células MDCK podem ser cultivadas em um meio essencial mínimo (MEM) que compreende 10% de soro bovino fetal (FBS). A cultura das células pode ocorrer a 37°C ± 1°C. O valor do pH do meio durante a multiplicação das células antes da infecção pode ficar na faixa de pH de 6,8 e de pH 7,6, e com mais de preferência entre um valor de pH 7,0 e de pH 7,4.

[0107] Além disso, as células MDCK podem ser cultivadas em meios livres de soro ou livres de proteína.

[0108] De acordo com um terceiro aspecto da décima primeira modalidade, antes da infecção as células MDCK podem ser lavadas com MEM e subsequentemente com MEM contendo tripsina na faixa de 5 a 25 U/ml.

[0109] A protease pode ser selecionada de, no entanto sem ficar a elas limitada, a tripsina, a quimotripsina, a protease fúngica, a pepsina, a papaina, a bromelina e a subtilisina.

[0110] Ainda de preferência, a protease podia ser a tripsina obtida de origem suína ou de origem bovina, ou de origem fúngica, ou de origem bacteriana.

[0111] Ainda de preferência, a protease pode ser uma tripsina recombinante expressa em células hospedeiras de levedura ou de plantas ou de bactérias selecionadas de, mas sem ficar a elas limitadas, Aspergillus spp, Streptomyces griseus, milho, E. coli, Pichia pastoris. De preferência, a dita tripsina recombinante é selecionada de Biogenomics (E. coli como hospedeiro), D. K. Bio Pharma Pvt. Ltd (E. coli como hospedeiro), Richcore (Pichia pastoris como hospedeiro) e Gibco (fungos).

[0112] Além disso, a concentração preferida de tripsina é de 12,5 U/ml.

[0113] De acordo com um quarto aspecto da décima primeira modalidade, antes da infecção o vírus da semente de trabalho pode ser ativado mediante a diluição do vírus com MEM contendo tripsina na faixa de 5 a 25 U/ml e a incubação à temperatura de 31°C a 33°C por 10 a 60 minutos.

[0114] A protease pode ser selecionada de, no entanto não fica a elas limitada, a tripsina, a quimotripsina, a protease fúngica, a pepsina, a papaina, a bromelina e a subtilisina.

[0115] Ainda de preferência, a protease podia ser uma tripsina obtida de origem suína, ou de origem bovina. ou de origem fúngica, ou de origem bacteriana.

[0116] Ainda de preferência, a protease pode ser uma tripsina recombinante expressa em células hospedeiras de levedura ou de plantas ou de bactérias selecionadas de, mas sem ficar a elas limitadas, Aspergillus spp, Streptomyces griseus, milho, E. coli, Pichia pastoris. A dita tripsina recombinante é de preferência selecionada de Biogenomics (E. coli como hospedeiro), D. K. Bio Pharma Pvt. Ltd (E. coli como hospedeiro), Richcore (Pichia pastoris como hospedeiro) e Gibco (fungos).

[0117] Além disso, a concentração preferida de tripsina é de 12,5 U/ml.

[0118] Além disso, a concentração preferida de tripsina é de 2.000 a 3.000 unidades de tripsina por frasco de cilindro.

[0119] De acordo com um quinto aspecto da décima primeira modalidade, a infecção de células MDCK com o vírus de LAIV candidato pode ocorrer a uma densidade de células MDCK de preferência de cerca de 40 a 60 x 106/TCF para TCF, de 150 a 180 x 106/RB para RB, e de 7.000 a 10.000 x 106/BR (4 m2) para o biorreator (4 m2).

[0120] De acordo com um sexto aspecto da décima primeira modalidade, o vírus de LAIV candidato pode ser desenvolvido em células MDCK no modo de cultura aderente ou de cultura em suspensão.

[0121] De acordo com um sétimo aspecto da décima primeira modalidade, a infecção de células MDCK com o vírus de LAIV candidato à base de ovo pode ocorrer a um MOI entre 1:100 e 1:10.000.

[0122] De acordo com um oitavo aspecto da décima primeira modalidade, após a infecção as células MDCK podem ser cultivadas em um meio essencial mínimo (MEM) que contém tripsina na faixa de 5 a 25 U/ml e à temperatura de 32°C ± 1°C. O valor de pH do meio após a infecção pode ficar na faixa de pH 6,8 e pH 7,6 e com mais preferência na faixa de 7,2 a 7,6.

[0123] De acordo com um nono aspecto da décima primeira modalidade, após a infecção o sobrenadante da célula pode ser colhido após um período de incubação de 40 a 70 horas; com mais preferência, pode ser de 54 ± 8 horas.

[0124] Além disso, a colheita alternativamente múltipla pode ser realizada a um intervalo de tempo apropriado cerca de 4 a 5 vezes antes de rejeitar o material de entrada, e processada separadamente para obter os aglomerados de vírus monovalentes clarificados (CMVPs).

[0125] Com a colheita, pode ser obtido um rendimento de vírus de pelo menos 7,0 a 9,2 EID50/0,5 ml.

[0126] De acordo com um décimo aspecto da décima primeira modalidade, o meio que contém o vírus pode ser clarificado, tipicamente através de filtros com tamanhos de poros decrescentes (por exemplo, 6 µ, 5 µ, 0,8 µ, 0,65 µ, 0,45 µ, 0,2 µ). Os filtros e dispositivos de filtração comercialmente disponíveis apropriados são bem conhecidos no estado da técnica e podem ser selecionados pelos elementos versados na técnica. Os dispositivos de filtração exemplificadores podem ser feitos de polipropileno ou acetato de celulose ou poliéter sulfona, e os filtros comercialmente disponíveis podem ser dispositivos de filtração Millipak (Millipore), Kleenpak (Pall) e Sartobran™ (Sartorius).

[0127] De acordo com um décimo primeiro aspecto da décima primeira modalidade, a colheita filtrada pode ser tratada com uma endonuclease não específica, com mais preferência a benzonase com uma concentração que varia entre 0,5 Unidade/ml e duas Unidades/ml, a uma temperatura que varia entre 30 e 34°C, por duas a 6 horas, e subsequentemente a uma temperatura de 2 a 8°C por 5 a 15 horas.

[0128] Além disso, alternativamente, a colheita filtrada pode ser tratada com uma endonuclease não específica, com mais preferência a benzonase, na presença de um cátion divalente selecionado do grupo que consiste em Ca2+, Mg2+, Mn2+ e Cu2+ em uma quantidade entre 0,1 mM e 100 mM.

[0129] Além disso, alternativamente, a colheita filtrada pode ser tratada com uma endonuclease não específica, com mais preferência a benzonase, na presença de um sal de Mg2+ de cátion divalente a uma concentração de 1 a 3 mM.

[0130] De acordo com um décimo segundo aspecto da décima primeira modalidade, a colheita tratada com benzonase também pode ser sujeitada a uma filtração de fluxo tangencial (TFF), tipicamente através de filtros com um peso molecular de corte (MWCO) que variar entre 100 KDa e 500 KDa, resultando em uma concentração de 2X a 10X da colheita viral e outros resultados na remoção de impurezas residuais.

[0131] Também é preferível que as impurezas residuais possam compreender DNA residual, albumina de soro de bovino residual (BSA) e proteína de célula hospedeira residual.

[0132] De acordo com um décimo terceiro aspecto da décima primeira modalidade, o processo descrito acima pode resultar em uma colheita de vírus de LAIV purificada e concentrada que compreende traços do DNA celular residual (< 10 ng/dose), BSA residual (< 50 ng/dose) e proteínas celulares residuais. Além disso, de acordo com o processo descrito acima, a recuperação total de vírus purificado pode ser de pelo menos 40%.

[0133] De acordo com um décimo quarto aspecto da décima primeira modalidade, o estoque de vírus monovalente concentrado (concentrado de TFF) pode ser estabilizado com uma composição de estabilizantes para obter a composição final de LAIV que compreende um ou mais carboidratos, um ou mais aminoácidos e gelatina.

[0134] Ainda de preferência, o estoque de vírus concentrado (concentrado de TFF) pode ser estabilizado com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose, a histidina, a alanina, a tricina, a arginina e a gelatina em qualquer combinação das mesmas.

[0135] Ainda de preferência, o estoque de vírus concentrado (concentrado de TFF) pode ser estabilizado com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a uma concentração de 1 a de 10% (em peso/volume), a histidina em uma concentração de 0,1% a 2% (em peso/volume), a alanina a uma concentração de 0,01% a 1%

(em peso/volume), a tricina em uma concentração de 0,1% a 1% (em peso/volume), a arginina a uma concentração de 0,1 a 5% (em peso/volume) e a gelatina a uma concentração de 0,1 a 5% (em peso/volume).

[0136] Ainda de preferência, o estoque de vírus concentrado (concentrado de TFF) pode ser estabilizado com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a uma concentração de 3 a de 6% (em peso/volume), a histidina a uma concentração de 0,1% a 1% (em peso/volume), a alanina a uma concentração de 0,05% a 0,5% (em peso/volume), a tricina a uma concentração de 0,1% a 0,5% (em peso/volume), a arginina a uma concentração de 0,1 a 3% (em peso/volume) e a gelatina a uma concentração de 0,1 a 3% (em peso/volume).

[0137] Ainda de preferência, o estoque de vírus concentrado (concentrado de TFF) pode ser estabilizado com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a 4% (em peso/volume), a histidina a 0,21% (em peso/volume), a alanina a 0,1% (em peso/volume), a tricina a 0,3% (em peso/volume), a arginina a 2,1% (em peso/volume) e a gelatina a 0,85% (em peso/volume).

[0138] De acordo com um décimo quinto aspecto da décima primeira modalidade, a colheita viral estabilizada pode ser esterilizada por meio de filtração de fluxo direto (DFF) através de pelo menos um filtro de grau de esterilização de preferência de 0,2 µ. Os filtros e dispositivos de filtração comercialmente disponíveis apropriados são bem conhecidos no estado da técnica e podem ser selecionados pelos elementos versados na técnica. Os dispositivos de filtração exemplificadores podem ser feitos de polipropileno ou acetato de celulose ou poliéter sulfona ou difluoreto de polivinilideno, e os filtros comercialmente disponíveis podem ser dispositivos de filtração Millipak (Millipore), Kleenpak (Pall) e Sartobran™ P (Sartorius).

[0139] De acordo com um décimo sexto aspecto da décima primeira modalidade, a composição de LAIV pode ser multivalente, compreendendo mais de um cepa ou subtipo de vírus de LAIV tal como divulgado nas modalidades anteriores. A composição de LAIV pode ser bivalente, ou trivalente ou tetravalente.

[0140] Além disso, alternativamente, a composição de LAIV pode ser monovalente, compreendendo qualquer um de cepa ou subtipo de vírus de LAIV tal como divulgado nas modalidades anteriores.

[0141] De acordo com um décimo sétimo aspecto da décima primeira modalidade, a composição de LAIV pode compreender o vírus de influenza a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml.

[0142] Ainda de preferência, a composição de LAIV pode compreender o vírus de influenza do tipo A ou de qualquer subtipo a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; com mais preferência NLT 7 Log EID50 por 0,5 ml.

[0143] Ainda de preferência, a composição de LAIV pode compreender o vírus de influenza do tipo B ou de qualquer subtipo a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; com mais preferência NLT 6,5 Log EID50 por 0,5 ml.

[0144] De acordo com uma décima segunda modalidade, o método de preparação de uma composição imunogênica pode compreender as etapas a seguir: a) infecção do hospedeiro da cultura de células MDCK com vírus de influenza a um MOI entre 1:100 e 1:10.000; b) colheita do sobrenadante que compreende o vírus de influenza por um período após a incubação de 40 a 70 horas em MEM contendo tripsina na faixa de 5 a 25 U/ml; c) filtração da colheita viral por meio de filtração de fluxo direto (DFF) através de pelo menos um filtro de clarificação que tem um tamanho de poro entre cerca de 6 micrômetros cerca de 0,45 micrômetro;

d) tratamento de CVP com uma endonuclease não específica a uma temperatura que varia entre 30 e 34°C por 2 a 6 horas e subsequentemente a uma temperatura de 2 a 8°C por 5 a 15 horas; e) concentração de CVP tratado com endonuclease por meio de filtração de fluxo tangencial (TFF) ao usar uma membrana com um peso molecular de corte (MWCO) de 100 KDa a 500 KDa; f) estabilização do concentrado de TFF com uma composição de estabilizantes que compreende um ou mais carboidratos, um ou mais aminoácidos e gelatina para formar uma colheita viral estabilizada; g) esterilização do concentrado de TFF estabilizado por meio de DFF através de pelo menos um filtro de grau de esterilização que tem um tamanho de poro entre cerca de 0,8 micrômetro e cerca de 0,2 micrômetro para formar um CMVP esterilizado; em que a recuperação total dos vírus purificados é maior do que ou igual a 40%.

[0145] De acordo com um primeiro aspecto da décima segunda modalidade, o método de fabricação da a composição imunogênica em que a etapa (d) pode compreender o tratamento da colheita viral com endonuclease não específica e mais particularmente a benzonase que tem uma concentração na faixa de 0,5 unidade/ml a 5 unidades/ml na presença de um cátion divalente selecionado do grupo que consiste em Ca2+, Mg2+, Mn2+ e Cu2+ em uma quantidade entre 0,1 mM e 100 mM.

[0146] De acordo com um segundo aspecto da décima segunda modalidade, o método de fabricação da composição imunogênica em que que a etapa (d) pode compreender o tratamento da colheita viral com endonuclease não específica e mais particularmente a benzonase que tem uma concentração na faixa de 0,5 unidade/ml a 5 unidades/ml na presença de um sal de Mg2+ de cátion divalente a uma concentração de 1 a 3 mM.

[0147] De acordo com um terceiro aspecto da décima segunda modalidade, o método de fabricação da composição imunogênica em que que a etapa (e) pode compreender a concentração da colheita viral por meio de filtração de fluxo tangencial (TFF) que resulta em uma concentração de pelo menos 4X da colheita viral.

[0148] De acordo com um quarto aspecto da décima segunda modalidade, o método de fabricação da composição imunogênica em que que a etapa (f) pode compreender a estabilização da colheita viral com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a uma concentração de 1 a 10% (em peso/volume), a histidina a uma concentração de 0,1% a 2% (em peso/volume), a alanina a uma concentração de 0,01% a 1% (em peso/volume), a tricina a uma concentração de 0,1% a 2% (em peso/volume), a arginina a uma concentração de 0,1 a 5% (em peso/volume) e a gelatina a uma concentração de 0,1 a 5% (em peso/volume).

[0149] De acordo com um quinto aspecto da décima segunda modalidade, o método de fabricação da composição imunogênica, em que a etapa (f) pode compreender a estabilização da colheita viral com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a uma concentração de 3 a de 6% (em peso/volume), a histidina a uma concentração de 0,1% a 1% (em peso/volume), a alanina a uma concentração de 0,05% a 0,5% (em peso/volume), a tricina a uma concentração de 0,1% a 0,5% (em peso/volume), a arginina a uma concentração de 0,1 a 3% (em peso/volume) e a gelatina a uma concentração de 0,1 a 3% (em peso/volume).

[0150] De acordo com um sexto aspecto da décima segunda modalidade, o método de fabricação da composição imunogênica, em que a etapa (f) pode compreender de estabilização da colheita viral com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a 4% (em peso/volume), a histidina a 0,21% (em peso/volume), a alanina a

0,1% (em peso/volume), a tricina a 0,3% (em peso/volume), a arginina a 2,1% (em peso/volume) e a gelatina 0,85% (em peso/volume).

[0151] De acordo com um sexto aspecto da décima segunda modalidade, o método de fabricação da composição imunogênica, em que a etapa (f) pode compreender a estabilização da colheita viral com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a 4% (em peso/volume), a histidina a 0,21% (em peso/volume), a alanina a 0,1% (em peso/volume), a tricina a 0,3% (em peso/volume), a arginina a 2,1% (em peso/volume) e a gelatina a 1,0% (em peso/volume).

[0152] De acordo com um sétimo aspecto da décima segunda modalidade, o método de fabricação da composição imunogênica, em que a etapa (f) pode compreender de estabilização da colheita viral com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a 4% (em peso/volume), a histidina a 0,21% (em peso/volume), a alanina a 0,1% (em peso/volume), a tricina a 0,3% (em peso/volume), a arginina a 1,6% (em peso/volume) e a gelatina a 1,0% (em peso/volume).

[0153] De acordo com um décimo terceira modalidade da presente invenção, a composição imunogênica pode compreender a) um ou mais vírus de vacina de influenza atenuado vivo (LAIV) a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; b) sacarose de 1 a 10% (em peso/volume); c) histidina de 0,1% a 2% (em peso/volume); d) alanina de 0,01% a 1% (em peso/volume); e) tricina de 0,1% a 2% (em peso/volume); f) arginina de 0,1 a 5% (em peso/volume); g) gelatina de 0,1 a 5% (em peso/volume).

[0154] Ainda de preferência, a composição imunogênica pode compreender a) um ou mais vírus de vacina de influenza atenuado vivo (LAIV) a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; b) sacarose de 3 a 6% (em peso/volume); c) histidina de 0,1% a 1% (em peso/volume); d) alanina de 0,05% a 0,5% (em peso/volume); e) tricina de 0,1% a 0,5% (em peso/volume); f) arginina de 0,1 a 3% (em peso/volume); g) gelatina de 0,1 a 3% (em peso/volume).

[0155] Ainda de preferência, a composição imunogênica pode compreender a) um ou mais vírus de vacina de influenza atenuado vivo (LAIV) a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; b) sacarose a 4% (em peso/volume); c) histidine a 0,21% (em peso/volume); d) alanina a 0,1% (em peso/volume); e) tricina a 0,3% (em peso/volume); f) arginina a 2,1% (em peso/volume); g) gelatina a 0,85% (em peso/volume).

[0156] Ainda de preferência, a composição imunogênica pode compreender a) um ou mais vírus de vacina de influenza atenuado vivo (LAIV) NLT a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; b) sacarose a 4% (em peso/volume);c) histidina a 0,21% (em peso/volume); d) alanina a 0,1% (em peso/volume); e) tricina a 0,3% (em peso/volume); f) arginina a 2,1% (em peso/volume); g) gelatina a 1% (em peso/volume).

[0157] Ainda de preferência, a composição imunogênica pode compreender a) um ou mais vírus de vacina de influenza atenuado vivo (LAIV) a um dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; b) sacarose a 4% (em peso/volume); c) histidina a 0,21% (em peso/volume); d) alanina a 0,1% (em peso/volume); e) tricina a 0,3% (em peso/volume); f) arginina a 1,6% (em peso/volume); g) gelatina a 1% (em peso/volume).

[0158] De acordo com uma décima quarta modalidade da presente invenção, a composição de LAIV pode ser completamente líquida.

[0159] Além disso, alternativamente, a composição de LAIV pode ser uma composição liofilizada ou secada por congelamento.

[0160] Tal como usado no presente documento os termos "secada por congelamento" ou "liofilizar" ou "liofilização" envolvem a liofilização e se referem ao processo por meio do qual uma suspensão é congelada, depois do que a água é removida através de sublimação a baixa pressão. Tal como usado no presente documento, o termo "sublimação" se refere a uma mudança nas propriedades físicas de uma composição, em que a composição muda diretamente de um estado sólido a um estado gasoso sem de transformar em um líquido.

[0161] De acordo com uma décima quinta modalidade da presente invenção, a composição de LAIV pode ser formulada para o uso em um método para reduzir o surgimento de ou prevenir uma condição da saúde que envolve a administração de uma quantidade eficaz da composição de LAIV a um indivíduo humano através da rota intranasal ou outras rotas de imunização.

[0162] De acordo com o aspecto preferido da modalidade, a composição de LAIV pode ser administrada a um indivíduo humano através da rota intranasal. Em uma modalidade, é um dispositivo de aplicação intranasal, tal como um dispositivo na forma de um aerossol (spray intranasal) ou um sistema de aplicação em gotas. As formulações nasais líquidas podem ser aplicadas através de spray nasal, cateter de instilação e rinil, nebulizadores de ar comprimido, frasco espremido, sprays de bomba com doses medidas, tais como bombas de aspersão de doses medidas de múltiplas doses ou bomba de aspersão de dose única/dual, dispositivo de aspersão unido a uma seringa. Outras formas de dosagem podem ser selecionadas de pós nasais (insufladores, inalador de pó seco), géis nasais, gotas nasais, soluções, suspensões, sistema de cossolvente, microesferas, nanopartículas, microemulsões, inserção nasal.

[0163] Os dispositivos de aplicação intranasal podem ser selecionados de, mas sem ficar a eles limitados, o dispositivo de aplicação Becton Dickinson (BD) Accuspray™, o dispositivo nasal Bi- Directional™ Optinose, o dispositivo de atomização mucosal intranasal MAD da Teleflex, AeroLife™ e AeroVax™ (AerovectRx, Inc., Atlanta, GA), o injetor de jato - PharmaJet® Stratis®Needle-Free Injector, os injetores de jato de bocal de múltiplos usos MUNJIs; Dispositivo Aquapuncture, Hypospray®, MadaJet®, GentleJet®, injetores de jato de seringa descartável: Medi-Jector®, J-Tip®, Injex®, Vitajet™, LectraJet HS, LectraJet® M3, ZetaJet™, PharmaJet®, Aktiv-Dry PuffHaler™, e dispositivo de disparo de influenza de spray nasal.

[0164] De acordo com uma décima sexta modalidade da presente invenção, a composição de LAIV pode ser formulada para o uso em um método para reduzir o surgimento de ou prevenir uma condição da saúde que compreende a infecção por vírus de influenza A ou seus subtipos tal como divulgado em uma modalidade anterior da invenção, ou a infecção por vírus de influenza B ou seus subtipos tal como divulgado em um modalidade anterior da invenção, ou a infecção do vírus de influenza C ou seus subtipos tal como divulgado em um modalidade anterior da invenção.

[0165] De acordo com uma décima sétima modalidade da presente invenção, a composição de LAIV pode ser administrada intranasalmente a uma dose eficaz para a proteção. As vacinas são administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e em uma quantidade que vão ser profilaticamente eficazes. A composição imunogênica da presente invenção pode ser administrada como agente profilático primário em adultos ou crianças em risco de infecção. Por exemplo, a composição de vacina de influenza atenuada viva tal como divulgada no presente documento pode ser usada em adultos ou em crianças em risco de infecção do vírus de influenza.

[0166] Com mais preferência, a composição de LAIV pode ser administrada intranasalmente a um volume de dosagem de cerca de 0,1 a 0,5 ml.

[0167] De acordo com uma décima oitava modalidade da presente invenção, a composição de LAIV pode ser formulada como frascos de uma só dose ou frascos de múltiplas doses ou kit de múltiplas doses, ou como seringa previamente carregadas ou sprays nasais em que a dita composição de LAIV pode ser aplicada em uma programação de uma só dose, ou de preferência em uma programação de múltiplas doses em que um curso primário de vacinação é seguido por uma a duas doses separadas aplicadas a intervalos de tempo subsequentes requeridas para manter e/ou reforçar a imunoresposta, por exemplo, em 1 a 4 meses para uma segundo dose e, se for necessário, uma dose(s) subsequente(s) depois de vários meses ou anos, ou vacinação anual. O regime de dosagem, pelo menos em parte, também vai ser determinado segundo a necessidade de uma dose de reforço requerida para conferir imunidade de proteção.

[0168] De acordo com uma décima nona modalidade da presente invenção, o pH final da composição imunogênica pode compreender de 6,5 a 8.

[0169] Outras modalidades divulgadas no presente documento também englobam o kit de vacina que compreende um primeiro recipiente que contém uma composição imunogênica liofilizada (secada por congelamento) e um segundo recipiente que contém uma solução aquosa opcionalmente salina ou WFI (água para injeção) para a reconstituição da composição de LAIV liofilizada (secada por congelamento).

[0170] Por todo este relatório descritivo, a palavra "compreende", ou variações tais como "compreendem" ou "que compreende", serão compreendidas como implicando a inclusão de um elemento, uma integralidade ou uma etapa, ou um grupo indicado de elementos, integralidades ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, integralidade ou etapa, ou grupo de elementos, integralidades ou etapas, e podem significar "inclui", "que inclui", o termo é de sentido aberto, permitindo a presença de mais do que é recitado, contanto que as características básicas ou novas do que é recitado não sejam alteradas pela presença de mais do que é recitado, mas exclui modalidades da técnica anterior.

[0171] Por todo este relatório descritivo, a expressão "composição imunogênica" cobre qualquer composição que acarreta uma imunoresposta contra o antígeno ou o imunogênio de interesse expresso dos vetores; por exemplo, após a administração em um indivíduo, acarreta uma imunoresposta contra o imunogênio ou o antígeno alvo de interesse. Os termos "composição de vacina" e "vacina" cobrem qualquer composição que induz uma imunoresposta de proteção contra o antígeno de interesse, ou que protege eficazmente contra o antígeno; por exemplo, após a administração ou a injeção no indivíduo, acarreta uma imunoresposta de proteção contra o antígeno ou o imunogênio alvo, ou confere uma proteção eficaz contra o antígeno ou o imunogênio expresso de vetores.

[0172] O uso da expressão "um ou mais" ou "pelo menos um" sugere o uso de um ou mais elementos ou ingredientes ou quantidades, uma vez que o uso pode estar na modalidade da invenção para atingir um ou mais dos objetivos ou resultados desejados. Embora determinadas modalidades da invenção tenham sido descritas, essas modalidades foram apresentadas apenas a título de exemplo, e não se prestam a limitar o âmbito da invenção. Variações ou modificações da composição da presente invenção, dentro do âmbito da invenção, podem ocorrer aos elementos versados na técnica com a revisão da divulgação no presente documento. Tais variações ou modificações estão bem dentro do caráter da presente invenção.

[0173] Os valores numéricos fornecidos para vários parâmetros físicos, dimensões e quantidades são somente valores aproximados e deve ser entendido que os valores mais altos do que o valor numérico atribuído aos parâmetros físicos, às dimensões e às quantidades se enquadram dentro do âmbito da invenção a menos que haja uma indicação contrária no relatório descritivo.

[0174] Similarmente, os componentes usados na purificação, por exemplo, filtros, colunas, não devem ser de nenhuma maneira limita- dores ou exclusivistas, e podem ser substituídos por outros componen- tes para atingir a mesma finalidade a critério do praticante.

[0175] Embora uma ênfase considerável tenha sido conferida no presente documento às características específicas da modalidade preferida, deve ser apreciado que muitas características adicionais podem ser adicionadas e que muitas mudanças podem ser feitas na modalidade preferida sem desviar dos princípios da invenção. Estas e outras mudanças na modalidade preferida da invenção serão aparentes aos elementos versados na técnica a partir da divulgação no presente documento, por meio do que deve ser compreendido distintamente que a matéria descritiva acima deve ser interpretada meramente como uma ilustração da invenção e não como uma limitação. VANTAGENS TÉCNICAS:

1. Atualmente quase todas as vacinas de influenza fabricadas usam ovos como hospedeiro para a preparação do aglomerado de vírus. Há certas desvantagens no uso de ovos para a fabricação de LAIV que podem ser superadas ao usar a cultura de células como substrato. As limitações do uso de ovo como substrato são: • Fornecedores limitados de ovos de qualidade de vacina e ovos livres de patógenos específicos. • Um pedido adiantado com um mínimo de 4 meses é requerido antes que os ovos se tornem disponíveis. • Algumas das cepas pandêmicas candidatas causam infecção fatal nas aves domésticas, resultando na indisponibilidade do substrato (ovos) para a fabricação de vacina. • A fabricação baseada em ovos requer uma instalação especializada para a incubação dos ovos, a colheita, etc., o que por sua vez limita a capacidade para de escalonamento rápido.

2. A fabricação baseada na cultura de tecido tem a vantagem de um sistema completamente controlado com facilidade de escalonamento.

3. No caso de pandemia, a fabricação da vacina em larga escala pode ser facilmente realizada ao usar unidades de fabricação de cultura de tecido pré-existentes de outras vacinas virais.

4. O vírus obtido em culturas de células tem uma similaridade maior com as cepas circulantes, ao contrário do vírus produzido em ovos, que pode ter modificações antigênicas.

5. Componentes mínimos envolvidos na composição da vacina.

6. Destituídas de conservante, polímeros e tensoativos.

7. O processo de purificação utiliza uma baixa concentração de endonuclease (benzonase).

8. O processo de purificação é destituído de etapas de cromatografia caras e incômodas.

9. Método melhorado de fabricação de tal composição/formulação estável que resulta em um rendimento melhorado.

10. A aplicação intranasal é a rota mais fácil de imunização, uma vez que não requer um nível elevado de perícia, é sensível à apresentação de múltiplas doses.

11. Não relatado como estando associado com a síndrome de Guillain Barre e confere uma melhor proteção devido à aplicação no sítio da infecção.

12. A apresentação líquida de uma vacina que é difícil de conseguir ajuda a superar o problema de capacidade limitada de liofilização, necessidade de suprimento de diluentes para a reconstituição e etapas adicionadas de reconstituição requeridas antes da aplicação da vacina.

13. A cadeia principal de MDV usada para a geração de LAIV independente tem um perfil bem estabelecido de segurança e é relatada como propiciadora de níveis elevados de proteção.

EXEMPLOS

[0176] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado pelos elementos versados no estado da técnica que as composições e as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam as técnicas descobertas pelo autor da presente invenção para funcionar bem na prática da invenção, e desse modo podem ser considerados como constituindo modos preferidos para a sua prática. No entanto, os elementos versados no estado da técnica, à luz da presente invenção, devem apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado idêntico ou similar sem desviar do caráter e do âmbito da invenção.

[0177] A cepa de LAIV independente é obtida junto ao Institute of Experimental Medicine (IEM), São Petersburgo, Rússia ou centros de colaboração WHO tais como o Centre for Disease Controle and Prevention (CDC), Atlanta. Exemplo 1: Dados da Estabilidade da Composição Imunogênica de Vírus de LAIV Independente Componente 1 - Vírus da Vacina de Influenza Atenuada Viva (LAIV)

[0178] O vírus de vacina de influenza é o vírus de LAIV independente derivado pelo método clássico de independência que compreende segmentos de genes de fenótipos adaptados ao frio, sensíveis à temperatura e/ou atenuados de vírus doadores mestres (MDVs) e segmentos de genes de hemaglutinina (HA) e/ou de neuraminidase (NA) de cepas de vírus de influenza do tipo A ou B ou C pandêmicas ou sazonais do tipo selvagem em uma razão de 6:2 ou de 7:1.

Tabela 1: Cepa de vírus de LAIV independente usada na composição imunogênica Nº. de Subtipo de Influenza Cepa de LAIV

MDV Série Subtipo Independente 1 Tipo A-H5N2 A/17/turkey/Turkey/05/133 A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) 2 Tipo A-H7N9 A/17/Anhui/2013/61 A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) 3 Tipo A-H1N1 A/17/California/2009/38 A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) 4 Tipo A-H1N1 A/17/New York/15/5364 A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) A/South-Africa/3626/2013- 5 Tipo A-H1N1 CDC- LV14A A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) 6 Tipo A-H3N2 A/17/Hong-Kong/2014/8296 Linhagem Victoria doTipo B 7 B/Texas/02/2013-CDC- LV8B B/USSR/60/69 Victoria linaage Linhagem Yamagata do Tipo 8 B/Phuket/3073/2013 B/USSR/60/69 B linaage 9 Linhagem Victoria do Tipo B B/56/Brisbane/60/08 B/USSR/60/69

[0179] Para a composição imunogênica de LAIV:

[0180] Vírus do tipo A na faixa de 6 a 7 Log EID50/dose de 0,5 ml; com mais preferência 7 Log EID50/dose de 0,5 ml

[0181] Vírus do tipo B na faixa de 6 a 7 Log EID50/dose de 0,5 ml; com mais preferência 6,5 Log EID50/dose de 0,5 ml

[0182] A composição de LAIV é monovalente ou multivalente (bivalente; trivalente; quadrivalente) em termos da cepa de vírus de LAIV independente usada na composição imunogênica tal como divulgado na Tabela 1 em qualquer combinação da mesma.

Tabela 2A: Composição de estabilizantes de acordo com a presente invenção

[% em peso/volume por dose de 0,5 ml] Componentes da Nº.

Formulação 1 2 3 4

1 Gelatina 0,85 0,85 1,0 1,0

2 Sacarose 4,0 - - -

3 L-Histidina 0,21 0,21 0,21 0,21

4 L-Alanina 0,1 0,1 0,1 0,1

5 Tricina 0,3 0,3 0,3 0,9

6 Cloridrato de L-Arginina 2,1 2,1 1,6 1,6

8 Sorbitol - 5,0 5,0 5,0

9 SAF - -

Tabela 2B: Composição de excipientes de acordo com a presente invenção

Nº. de % em peso/volume Excipiente Série por0,5 ml de dose

1 Cloreto de Sódio 0,8

2 Cloreto de Potássio 0,02

3 Fosfato de Potássio Diidratado 0,02

Fosfato de Dissódio Hidrogenado 4 0,14 Diidratado

Tabela 3A: Dados da estabilidade em tempo real a 2 a 8°C por 6 Meses (M) Nº. de Log EID50/0,5 ml Taxa de Cepa Série 0 Dia 1M 2M 3M 6M degradação Composição de Estabilizantes 3 1 A/17/California/2009/38 (H1N1) 7,92 8,245 7,89 7,69 6,72 -0,47 2 B/Texas/02/13-CDC (Tipo B) 7,39 6,82 6,99 6,92 5,93 -0,51

Composição de Estabilizantes 4 1 A/17/California/2009/38 (H1N1) 8,2 7,99 7,87 7,89 6,95 -0,45 2 B/Texas/02/13-CDC (Tipo B) 7,25 6,75 6,65 6,92 5,93 -0,46

Composição de Estabilizantes 2 1 A/SouthAfrica/3626/13 (H1N1) 7,88 7,82 7,65 7,06 7 -0,4 2 B/Texas/02/13-CDC (Tipo B) 8,2 7,04 6,72 6,78 6,39 -0,73

Composição de Estabilizantes 1 1 A/SouthAfrica/3626/13 (H1N1) 7,96 7,86 7,75 7,56 7,3 -0,27 2 B/Texas/02/13-CDC-LV8B (Tipo B) 7,56 7,21 7,15 7,14 6,87 -0,26 3 A/17/turkey/Turkey/05/133(H5N2) 7,96 7,93 7,76 7,52 7,12 -0,34 4 A/17/Anhui/2013/61(H7N9) 7,89 7,68 7,78 7,43 7,2 -0,27

Tabela 3B: Dados da Estabilidade sob Stress a 37°C por 7 Dias (D) Nº. de Log EID50/0,5 ml Taxa de Cepa Série 0 Dia 1D 2D 3D 5D 7D degradação Composição de Estabilizantes 3 1 A/17/California/2009/38 (H1N1) 7,92 7,79 7,48 7,03 6,39 4,76 -1,095 2 B/Texas/02/13-CDC (Tipo B) 7,39 6,96 6,76 6,64 5,47 4,88 -0,952

Composição de Estabilizantes 4 1 A/17/California/2009/38 (H1N1) 8,2 7,76 7,33 7,35 6,56 5,39 -0,98 2 B/Texas/02/13-CDC (Tipo B) 7,25 6,99 6,93 6,49 5,85 4,92 -0,84

Composição de Estabilizantes 2 1 A/SouthAfrica/3626/13 (H1N1) 8,03 7,77 7,26 6,8 6,2 4,44 -1,25 2 B/Texas/02/13-CDC (Tipo B) 8,25 7,18 6,05 5,43 5,06 3,98 -1,62

Composição de Estabilizantes 1 1 A/SouthAfrica/3626/13 (H1N1) 8,31 7,82 7,06 7,16 6,73 6,02 -0,83 2 B/Texas/02/13-CDC (Tipo B) 7,03 6,98 6,56 6,18 5,72 5,05 -0,76 3 A/17/turkey/Turkey/05/133(H5N2) 7,96 7,62 7,24 6,83 6,15 5,43 -0,96

Interpretação: Composição de estabilizantes 3 (1% em peso/volume de gelatina + 5% em peso/volume de sorbitol + 0,1% em peso/volume de L-alanina + 0,21% em peso/volume de L-histidina + 0,3% em peso/volume de tricina + 1,6% em peso/volume de cloridrato de L-arginina):

[0183] Uma taxa inaceitável de degradação foi observada para a estabilidade sob stress a 37°C e a estabilidade em tempo real a temperaturas de 2 a 8°C para as cepas de vacina de influenza do tipo A/H1N1 e do B. (Vide as Figuras 4 e 5). Composição de estabilizantes 4 (1% em peso/volume de gelatina + 5% em peso/volume de sorbitol + 0,1% em peso/volume de L- alanina + 0,21% em peso/volume de L-histidina + 0,9% em peso/volume de tricina + 1,6% em peso/volume de cloridrato de L-arginina):

[0184] Uma taxa inaceitável de degradação foi observada para a estabilidade sob stress a 37°C e a estabilidade em tempo real a temperaturas de 2 a 8°C para as cepas de vacina de influenza do tipo A/H1N1 e do tipo B. (Vide as Figuras 6 e 7). Composição de estabilizantes 2 (0,85% em peso/volume de gelatina + 3% peso/volume de sacarose + 0,1% em peso/volume de L-alanina + 0,21% em peso/volume de L-histidina + 0,3% em peso/volume de tricina + 2,1% em peso/volume de cloridrato de L-arginina):

[0185] Uma taxa inaceitável de degradação foi observada para a estabilidade sob stress a 37°C e a estabilidade em tempo real a temperaturas de 2 a 8°C. (Vide as Figuras 8 e 9). Composição de estabilizantes 1 (0,85% em peso/volume de gelatina + 4% peso/volume de sacarose + 0,1% peso/volume de L-alanina + 0,21% em peso/volume de L-histidina + 0,3% em peso/volume de tricina + 2,1% em peso/volume de cloridrato de L-arginina):

[0186] Uma taxa aceitável de degradação (os valores estão dentro da faixa aceitável) foi observada para a estabilidade sob stress a 37°C e a estabilidade em tempo real a temperaturas de 2 a 8°C. (Vide as Figuras 2, 3, 10 e 11). Exemplo 2: Processo de fabricação de vírus de LAIV baseado em células MDCK

[0187] O processo para a preparação da composição de LAIV baseado na cultura de células MDCK pode compreender qualquer subconjunto ou todas as etapas a seguir: k) O vírus de vacina de LAIV candidato é inicialmente passado em ovos de galinha embrionados por SPF, produzindo o vírus de semente mestre (MSV) à base de ovo. l) O vírus de semente mestre à base de ovo é adaptado para se desenvolver no hospedeiro de cultura de células MDCK (ATCC CCL-34) para preparar o vírus de semente de trabalho à base de células (WSV). Este WSV à base de células é usado para infectar a cultura de células MDCK a um MOI entre 1:100 e 1:10.000 em vasos de cultura de células diferentes tais como os Frascos de Cultura de Tecido (TCFs) com uma área de superfície de 175 cm2, os frascos de cilindro (RBs) com uma área de superfície de 850 cm2, Cell Factories (CFs) com uma área de superfície de 6.320 cm2 e biorreator de leito fixo (por exemplo, os biorreatores iCELLis® da Pall® Life Sciences, Port Washington, N.Y., tais como os biorreatores Nano e 500/100). (As células MDCK foram cultivadas ao usar MEM contendo FBS; lavadas com MEM contendo tripsina de 5 a 25 U/ml antes da inoculação; WSV inoculado em células a MOI entre 1:10 e 1:10.000 e incubados a 31 a 33°C por 48 a 72 horas). m) O vírus cultivado é colhido. n) A colheita viral é filtrada através de filtração de fluxo direto (DFF) através de pelo menos um filtro de clarificação para obter os aglomerados de vírus clarificados (CVPs). o) O CVP é tratado com uma endonuclease não específica (para por exemplo, a benzonase) a uma temperatura que varia entre 30 e 34°C por duas a 6 horas e subsequentemente a uma temperatura de 2 a 8°C por 5 a 15 horas. p) O CVP tratado com endonuclease é concentrado através de filtração de fluxo tangencial (TFF) ao usar uma membrana com um peso molecular de corte (MWCO) de 100 KDa a 500 KDa; q) O concentrado de TFF é estabilizado com uma composição de estabilizantes que compreende um ou mais carboidratos, um ou mais aminoácidos e gelatina para formar uma colheita viral estabilizada. r) O concentrado de TFF estabilizado é esterilizado por meio de DFF através de pelo menos um filtro de grau de esterilização que tem um tamanho de poro de cerca de 0,2 micrômetro para formar e obter um CMVP esterilizado (aglomerado de vírus monovalente clarificado). s) Os CMVPs esterilizados são armazenados em frascos de policarbonato a -60°C ou menos. t) As formulações esterilizadas são carregadas em frascos e armazenadas a 2 a 8°C.

Tabela 4: Parâmetros do crescimento de Células MDCK Sistema de frasco de cilindro Sistema de biorreator iCELLis Densidade de célula Densidade de célula de 15X106/RB 1.000 X 106 de semeadura semeadura Densidade de célula Densidade de célula 150X106/RB 8.000 X 106 confluente confluente pH 7,2±0,2 pH 7,2 ± 0,2 DO NA DO 75% Temperatura 37°C±1°C Temperatura 37°C ± 1°C Duração da 3 a 5 dias Duração da incubação 3 a 5 dias incubação

Tabela 5: Parâmetros do crescimento de vírus de LAIV independente

Sistema de frasco de cilindro Sistema de biorreator iCELLis

1:100 a MOI MOI 1:100 a 1:10.000 1:10000

Densidade da célula no Densidade de célula no 150X106/RB 8,000 X 106 momento da infecção momento da infecção pH 7,4±0,2 pH 7,4 ± 0,2

DO NA DO 50%

Temperatura 32°C±1°C Temperatura 32°C ± 1°C

Duração da Duração da Colheita única Colheita única a incubação/Período da incubação/Período da a 54 ± 6 horas 54 ± 6 horas colheita colheita

. Meio de cultura de células: MEM com 10% de FBS (pH ajustado com 1N HCl para 7,0 a 7,4) (Glutamina adicional 350 mg/l) . Meio de vírus: MEM sem FBS (pH ajustado com 1N HCl para 7,2 a 7,6) (Glicose adicional 5 mg/l, Glutamina 350 mg/l) 0,4% adicional de glicose é adicionado em CM e VM usados para o sistema do biorreator.

Tabela 6: MEM (Meio Mínimo Essencial Nº. de Série COMPONENTES MEM HANK (mg/l) 1 Cloridrato de L-arginina 126 2 L-Cisteina 2HCl 31 3 L-Glutamina 292 4 L-Histidina HCl.H2O 42 5 L-Isoleucina 52 6 L-Leucina 52 7 Cloridrato de L-lisina 73 8 L-Metionina 15 9 L-Fenil alanine 32 10 L-Treonina 48 11 L-Triptofano 10 12 L-Valina 46 13 Sal de dissódio de L-tirosina 52 14 Cloreto de cálcio 140 15 Sulfato de magnésio 98 16 Cloreto de potássio 400 17 Cloreto de sódio 8.000 18 Fosfato de potássio monobásico (anidro) 60 19 Fosfato de sódio dibásico 48 20 Cloreto de colina 1 21 Pantotenato de D-Cálcio 1 22 Ácido fólico 1 23 I-Inositol 2 24 Niacinamida 1 25 Piridoxal HCl 1 26 Riboflavin 0,1 27 Tiamina HCl 1 28 D-Glicose 1.000 29 Vermelho fenol 10 30 NaHCO3 1,3 gm/l para o meio com FBS 31 NaHCO3 0,75 gm/l para o meio sem FBS

Tabela 7: Preparado de Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)

Componente Quantidade por Concentração litro (%)

Cloreto de sódio 8g 0,8

Cloreto de potássio 0,2 g 0,02

Fosfato de potássio diidratado 0,2 g 0,02

Fosfato de dissódio hidrogenado 1,4 g 0,14 diidratado

Tabela 8: Estabilizante I para LAIV à base de células MDCK

Componente Quantidade por litro Concentração (%)

Gelatina 42,5 g 4,25

Sacarose 200 g 20

Tabela 9: Estabilizante II para LAIV à base de células MDCK

Componente Quantidade por litro Concentração (%)

L-Histidina 23,1 g 2,31

L-Alanina 11,0 g 1,1

Tricina 33,0 g 3,3

L-Arginina 231 g 23,1

Gelatina 8,5 g 0,85

Sacarose 40 g 4,0

Tabela 10: Composição de Vacina Cega

Componente Quantidade por litro

PBS 0,8 l

Estabilizante I para LAIV líquida à base de cultura 0,2 l de células MDCK

Estabilizante II para LAIV líquida à base de cultura 0,1 l de células MDCK

Exemplo 3: Efeito da entrada de vírus (MOI) e do período de incubação após a inoculação no Rendimento

Tabela 11: Efeito da entrada de vírus (MOI) e do período de incubação após a inoculação no Rendimento

Tipo A (H1N1) - A/17/California/2009/38

MOI usado 1:100 1:1.000 1:10.000 1:100 1:1.000 1:10.000 1:100 1:1.000 1:10.000

Período de incubação 50 ± 2 50 ± 2 50 ± 2 60 ± 2 60 ± 2 60 ± 2 70 ± 2 70 ± 2 70 ± 2 (Horas)

Título (EID50/0,5 8,43 8,21 5,48 8,35 8,44 7,27 8,40 7,95 7,89 ml)

Tipo A (H3N2) - A/17/Hong Kong/2014/8296

MOI usado 1:100 1:1000 1:10000 1:100 1:1000 1:10000 1:100 1:1000 1:10000

Período de incubação 50 ± 2 50 ± 2 50 ± 2 60 ± 2 60 ± 2 60 ± 2 70 ± 2 70 ± 2 70 ± 2 (Horas)

Título (EID50/0,5 ml) 8,43 7,93 7,36 8,83 8,31 8,30 8,17 8,27 8,65

Tipo B - B/Texas/02/2013-CDC-LV8B

MOI usado 1:100 1:1000 1:10000 1:100 1:1000 1:10000 1:100 1:1000 1:10000

Período de incubação 50 ± 2 50 ± 2 50 ± 2 60 ± 2 60 ± 2 60 ± 2 70 ± 2 70 ± 2 70 ± 2 (Horas)

Título (EID50/0,5 ml) 7,69 8,03 7,92 8,01 8,15 8,15 7,72 8,14 8,10

Inferência: A. Tempo de infecção:

[0188] Com base nos estudos de otimização, o limite específico de contagem de células de 120 a 180 milhões de células por frasco de cilindro e de 7.000 a 10.000 milhões de células para o sistema do biorreator foi selecionado para a infecção do vírus de semente de trabalho de influenza derivado de células MDCK. A observação microscópica de frascos de cilindro com células MDCK foi feita para a confluência de monocamada antes do procedimento de infecção. B. MOI e período de incubação após a inoculação:

[0189] Com base em todas as observações de estudos de otimização de MOI, a faixa de MOI selecionada para o vírus de influenza do tipo A (H1N1), do tipo A (H3N2) e do tipo B ficou entre 1:100 a 1:10.000, e a faixa do período de incubação após a inoculação ficou entre 48 horas e 72 horas. Exemplo 4: Efeito de concentrações diferentes de tripsina no rendimento Tabela 12: Concentrações diferentes de tripsina Unidades de tripsina frasco Nº. de Série EID50/0,5 ml de cilindro 1 5,000 8,6 2 4,000 8,72 3 3,000 8,85 4 2,000 8,85 5 1,000 8,67 6 00 6,65

Inferência:

[0190] A tripsina é requerida para a ativação do vírus de influenza para a inoculação de células MDCK. A partir dos resultados acima é observado que de 2.000 a 3.000 unidades de tripsina por frasco de cilindro resultam na potência máxima do vírus. Exemplo 5: Efeito da concentração de benzonase e da temperatura no teor de DNA celular e título de vírus

[0191] Concentrações diferentes de benzonase foram testadas para a degradação do DNA de células hospedeirasa em temperaturas diferentes. O aglomerado de vírus clarificado (CVP) foi sujeitado ao tratamento de benzonase a concentrações de 500 (com 2 mM de MgCl2), 500, 1.000, 2.500 e 5.000 U/l e os CVPs tratados foram mantidos a 32°C por 3 horas e ainda continuado a 2 a 8°C durante toda a noite. A amostragem foi feita em cada estágio e os resultados do teor de DNA em cada estágio são indicados a seguir.

Tabela 13: Cepa de Influenza: B/60/Phuket/2013/16 (Tipo B) Teor de DNA (ng/ml) Concentração de benzonase (U/l) 3 Horas a 32°C Ativado a 2 a 8°C Não tratado 4,919 4,919 500 (2 mM de MgCl2) 13,75 7,6 Tabela 14: Cepa de Influenza: B/60/Phuket/2013/16 (Tipo B) Teor de DNA (ng/ml) Concentração de benzonase (U/l) 3 Horas a 32°C Ativado a 2 a 8°C Não tratado 4,919 4,919 500 353,6 22,45 1,000 56,45 9,45 2,500 11,3 9,15 5,000 6,2 8,8

Inferência:

[0192] A partir dos resultados, foi observado que o CVP tratado com uma concentração de 500 U/l de benzonase na presença de 2 mM de MgCl2 mostrou uma degradação maior de DNA do que o CVP tratado com uma concentração de 500 U/l de benzonase sem 2 mM de MgCl 2. Também é observado que concentrações mais elevadas de benzonase de 1.000 U/l, 2.500 U/l e 5.000 U/l exibiram uma degradação de DNA comparável com a concentração de 500 U/l de benzonase (com 2 mM de MgCl2). Exemplo 6: Rendimento do vírus em vários estágios de fabricação Tabela 15: Rendimento do vírus em vários estágios de fabricação Título (EID50/0,5 ml) Tipo A (H3N2) Tipo B Estágio do Tipo A (H1N1) A/17/Hong B/Texas/02/2013- Processo A/17/California/2009/38 Kong/2014/8296 CDC-LV8B Colheita 9,04 8,55 8,49 Aglomerado de virus clarificado 8,74 8,54 8,50 (CVP) CVP tratado com 8,63 8,42 8,22 benzonase Concentrado de 9,02 8,89 8,68 virus Vacina a granel 8,93 8,56 8,71 (CMVP)

1. CVP: Aglomerado de vírus clarificado (filtração após a colheita),

2. BCVP: CVP tratado com benzonase,

3. CMVP: Aglomerado de vírus clarificado monovalente (após a TFF, adição de estabilizante e após a filtração de 0,2 µ)

Inferência:

[0193] A concentração do vírus por estágios foi verificada para verificar cada vírus de influenza sazonal do tipo A (H1N1), do tipo A (H3N2) e do tipo B, e foi observado que a concentração inicial do vírus ao nível da colheita foi mantida durante todo o processo até o último estágio, ou seja, a preparação de vacina a granel (CMVP). Tabela 16: Recuperação Média de Vírus Colheita CMVP Nº. Porcentagem de Cepa Título do Vírus Título do Vírus de Recupe- Volume Volume (Log EID50 (Log EID50 ração (%) Série (ml) (ml) /0,5 ml) /0,5 ml) 1 A/17/Hongkong/2014/8296 (H3N2) 8,29 10.000 8,68 2.500 61,37 2 B/Texas/02/13-CDC-LV8B (Tipo B) 8,49 8.000 8,71 2.300 47,71 3 A/17/California/2009/38 (H1N1) 9,04 10.000 8,96 3.000 24,95 % de Recuperação Média de Vírus 44,67 Inferência:

[0194] A recuperação do vírus pode ser calculada como a porcentagem de retenção de vírus durante a fabricação onde a colheita é o ponto de partida e CMVP é o ponto final da fabricação. A partir dos resultados, pode ser concluído que a recuperação média de vírus é de 44,67%, que é equivalente a uma perda de título de 0,34 Log EID50/0,5 ml. Também é observado que a recuperação final de vírus (título do vírus) ao nível de CMVP fica dentro do limite aceitável e a CMVP pode ser usada para a fabricação de bateladas de produto final do vírus de LAIV à base de MDCK. Exemplo 7: Dados comparativos da concentração de DNA de células hospedeiras em estágios durante a fabricação de CMVP

[0195] O aglomerado de vírus clarificado (CVP) de cepas diferentes foi sujeitado ao tratamento de benzonase e a amostragem em estágios para o teor de DNA foi feita. Os resultados do teor de DNA em cada estágio são indicados a seguir.

Tabela 17: Concentração de DNA das células hospedeiras (ng/ml) Teor de DNA da célula hospedeira por estágio Nº. de Cepa (ng/ml) Série CVP Benz-CVP Conc. TFF CMVP 1 A/17/California/2009/38 (H1N1) 4.565 14,28 50,54 11,03 A/17/Hongkong/2014/8296 2 5.537 14,35 60,56 12,71 (A/H3N2) 3 B/60/Phuket/2013/16 (Tipo B) 6.467 10,45 31,12 3 Inferência:

[0196] A partir dos resultados, foi observado que o CVP quando tratado com benzonase mostrou uma redução significativa no DNA. E também foi observado que o DNA residual é removido outra vez eficientemente durante o processo de TFF (diafiltração/concentração) e o processo de preparação de CMVP. O teor de DNA ao nível final de CMVP varia dentro do limite desejado e aceitável. Exemplo 8: Várias experimentações de experimentos de TFF

[0197] Vários experimentos de TFF foram realizados levando em consideração parâmetros tais como o meio de diluição usado para o processo de TFF (meio do vírus e PBS), o procedimento de diafiltração e concentração. As amostras do concentrado de TFF foram testadas quanto à concentração do vírus.

Tabela 18: Experimentos de TFF Parâmetros do Processo de TFF Título do Vírus (EID50 / 0,5 ml) Título da Meio de Diafil- Título da Conc. Código do Conc. Sequência de DF e Colheita diluição tração de TFF Experimento (C) conc. (EID50 / 0,5 usado (DF) (EID50 / 0,5 ml) ml) Expt. 1 (A/Cal) VM 3X 4X Conc. seguida por DF 8,94 8,07 Expt. 2 (A/Cal) VM 3X 4X DF seguida por conc. 8,67 8,48 Expt. 3 (A/Cal) VM - 4X Apenas conc. 8,97 8,61 Expt. 4 (B/Tex) PBS 2X 4X DF seguida por conc. 8,49 8,79 Expt. 5 (A/HK) PBS 2X 4X DF seguida por conc. 8,79 8,83 A/Cal: A/17/California/2009/38;

B/Tex = B/Texas/02/2013-CDC-LV8B; A/HK = A/17/Hong Kong/2014/8296; VM: Meio de vírus Interpretação:

[0198] A partir do conjunto de experiências acima, o processo de TFF evoluiu e foi seguido por 2X de DF e 4X de estágio de concentração foram selecionados para obter o concentrado de TFF desejado com melhor rendimento do vírus. Em comparação com VM, PBS confere melhor estabilidade ao vírus. Exemplo 9: Resultados da Imunogenicidade

[0199] Um estudo foi realizado para avaliar o desempenho do ovo e da cultura de células MDCK com base em vacinas de influenza sazonais trivalentes e quadrivalentes para a imunoresposta e a eficácia das vacinas em um modelo de furão. Todos os animais foram imunizados intranasalmente no dia 0 com um preparado trivalente ou quadrivalente baseada em cultura de ovo e células MDCK contendo cepas A/Michigan/45/2015 (H1N1), A/Hong Kong/4801/2015 (H3N2), B/Brisbane/60/2008 e B/Phuket/3073/2013 similares e estimuladas quatro semanas mais tarde (dia 28). Tabela 19: Média geométrica da inibição de hemaglutinação (HAI) e títulos de neutralização (NT) de soros coletados no dia 28 A/Michigan/ A/Hongkong/4801/201 B/Brisbane/ B/Phuket/ 45/2015 4 60/2008 3073/2013 Preparação da

HAI NT HAI NT HAI NT HAI NT Vacina Trivalente à base 305 ± 76 222 ± 66 226 ± 84 323 ± 148 190 ± 69 150 ± 95 6±1 12 ± 1 de ovo Quadrivalente à 323 ± 288 ± 87 183 ± 137 312 ± 90 527 ± 214 125 ± 32 162 ± 39 133 ± 40 base de ovo 114 Trivalente à base 411 ± 114 415 ± 185 452 ± 71 725 ± 192 315 ± 74 333 ± 112 5±0 12 ± 0 de MDCK Quadrivalente à 234 ± 70 140 ± 72 214 ± 108 304 ± 236 152 ± 49 148 ± 77 134 ± 37 256 ± 78 base de MDCK Placebo 10 ± 2 13 ± 1 5±0 13 ± 1 5±0 12 ± 0 6±1 12 ± 1

Inferência: (Vide as Figuras 12 e 13)

[0200] A conclusão é que a vacinação com as vacinas trivalentes e quadrivalentes à base de ovo e à base de células MDCK contendo A- H1N1 pode proteger os animais contra a infecção por A-H1N1 quando estimulados com os vírus A-H1N1 homólogos.

[0201] Um outro estudo foi realizado para avaliar o desempenho das LAIVs monovalentes à base de ovo e de células MDCK (A-H5N2 e A-H7N9) para a imunoresposta e a eficácia em um modelo de furão. Grupos diferentes de animais foram imunizados com LAIVs monovalentes A-H5N1 e A-H7N9 à base de cultura de ovo e células MDCK e estimulados com os vírus A-H5N1 e A-H7N9 homólogos, respectivamente. Os resultados tinham mostrado que os animais imunizados com LAIV H5N2 monovalente foram protegidos contra o estímulo homólogo com o vírus A-H5N1. Os animais imunizados com LAIV A-H7N9 monovalente foram protegidos contra o estímulo homólogo com o vírus A-H7N9.

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um ou mais vírus de influenza; b) um ou mais carboidratos; c) um ou mais aminoácidos; e d) gelatina.

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus de influenza compreende vírus de influenza pandêmico ou sazonal, um vírus de vacina de influenza atenuado vivo (LAIV), um vírus de influenza inativado, um vírus de influenza quimérico, ou um vírus de influenza recombinante.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que composição é monovalente em termos do vírus de influenza derivado de influenza do tipo A ou do tipo B ou do tipo C ou seus subtipos.

4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que composição é multivalente em termos do vírus de influenza derivado de influenza do tipo A ou do tipo B ou do tipo C ou seus subtipos.

5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus de influenza é vírus de LAIV independente que compreende segmentos de genes de fenótipo adaptados ao frio sensíveis à temperatura e/ou atenuados de vírus doadores mestres (MDVs) e segmentos de genes de hemaglutinina (HA) e/ou neuraminidase (NA) de cepas de vírus do tipo A ou b ou C de influenza pandêmico ou sazonal do tipo selvagem em uma razão de 1:7, 2:6, 3:5, 4:4, 5:3, 6:2 ou 7:1.

6. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que os vírus doadores mestres (MDVs) são selecionados do grupo que compreende (H2N2) a cepa A de influenza A/Leningrad/134/17/57 A, e a cepa B de influenza B/USSR/60/69.

7. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o vírus de LAIV independente compreende o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) do vírus de influenza A ou H1 a H18 e N1 a N11 e seus subtipos H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H5N3, H9N2, H7N1, H7N3, H7N7, H6N1, H7N9 ou H10N8.

8. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o vírus de LAIV independente compreende o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) da cepa de vírus de influenza A pdmH1N1 – cepa do tipo A/California/07/2009 (indicada como a cepa do tipo A/Cal) ou A/Cal, cepa do tipo A/Michigan/45/2015, cepa do tipo A/South- Africa/3626/2013 ou cepa do tipo H3N2-A/Hong Kong/4801/2014.

9. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o vírus de LAIV independente compreende o gene de hemaglutinina (HA) e/ou o gene de neuraminidase (NA) da cepa da cepa de vírus de influenza B, cepa do tipo linhagem Victoria-B/Brisbane/60/2008, ou cepa do tipo linhagem Yamagata- B/Phuket/3073/2013.

10. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que um ou mais carboidratos são selecionados do grupo que compreende carboidrato natural, carboidrato sintético, monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, oligossacarídeos, açúcar redutor, açúcar não redutor, álcoois de açúcar, poliol, compostos de poli-hidroxila, carboidratos quimicamente modificados, agentes facilitadores de transição vítrea em que os agentes facilitadores de transição vítrea são selecionados do grupo que compreende sacarose, manitol, manose, rafinose, lactitol, ácido lactobiônico, glicose, maltulose, isomaltulose, maltose, lactose, dextrose, fucose ou uma combinação destes.

11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que um ou mais carboidratos compreendem a sacarose presente em uma quantidade de 1 a 10% (em peso/volume).

12. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que um ou mais aminoácidos são selecionados do grupo que compreende tricina, leucina, isoleucina, histidina, glicina, glutamina, arginina, lisina, alanina ou uma combinação destas.

13. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que um ou mais aminoácidos compreendem a tricina presente em uma quantidade de 0,1% a 2% (em peso/volume), a histidina presente em uma quantidade de 0,1% a 2% (em peso/volume), a alanina presente em uma quantidade de 0,01% a 1% (em peso/volume) e a arginina presente em uma quantidade de 0,1% a 5% (em peso/volume).

14. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a gelatina está presente em uma quantidade de 0,1% a 5% (em peso/volume).

15. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição também compreende um adjuvante selecionado do grupo de hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, hidróxi fosfato de alumínio, e sulfato de alumínio e potássio ou uma mistura destes.

16. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição também compreende um componente imunoestimulador selecionado do grupo de uma emulsão de óleo e água, MF-59, um lipossoma, um lipopolissacarídeo,

uma saponina, lipídio A, derivados de lipídio A, lipídio A de monofosforila, lipídio A de monofosforila 3-deacilada, AS01, AS03, um oligonucleotídeo, um oligonucleotídeo que compreende pelo menos um CpG não metilado e/ou um lipossoma, adjuvante de Freund, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, adjuvante de CRL-8300, dipeptídeo de muramil, agonistas de TLR-4, flagelina, flagelinas derivadas de bactérias gram-negativas, agonistas de TLR-5, fragmentos de flagelinas que podem ligar TLR-5 a receptores, QS-21, ISCOMS, quitosana, combinação de saponina com esteróis e lipídios.

17. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de uma só dose é livre do conservante e a composição de múltiplas doses compreende de um ou mais conservantes selecionados do grupo de 2-fenóxi etanol, cloreto de benzetônio (Phemerol), fenol, Thiomersal, formaldeído, metil parabeno, propil parabeno, álcool benzílico ou uma combinação destes.

18. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um tampão selecionado de cloreto, carbonato, citrato, lactato, gluconato, tartrato de sódio, solução salina de tampão de fosfato, HEPES, citrato-fosfato ou TRIS.

19. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um transportador, excipiente, aglutinante, veículo, agente isotônico, emulsificante ou umectante farmaceuticamente aceitável.

20. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo de açúcares, polióis, sais incluindo NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4.2H2O, CaCl2, ou MgCl2, aminoácidos ou modificadores do pH.

21. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação

1, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada como frascos de uma só dose ou frascos de múltiplas doses ou kit de múltiplas doses, ou como seringas pré-carregadas ou sprays nasais para o uso em um método para reduzir o surgimento de ou impedir uma condição de saúde que compreende a infecção por vírus de influenza A ou seus subtipos, a infecção por vírus de influenza A ou seus subtipos ou a infecção por vírus de influenza C ou seus subtipos.

22. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pH final da composição imunogênica compreendem um pH de 6,5 a 8.

23. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus de influenza é propagado em células dos rins de cães Madin Darby (MDCK), selecionadas de, mas sem ficar a eles limitados, ATCC CCL-34, linhagem de células MDCK 33016 (DSM ACC 2219), MDCK (ATCC CCL34 MDCK (NBL2)), MDCK 33016 (DSM ACC 2219), DSM ACC3309, ATCC CRL-12042, ATCC PTA-7909, ATCC PTA-7910, ATCC PTA-6500, ATCC PtTA-6501, ATCC PTA-6502, ATCC PTA-6503, 'MDCK-S', 'MDCK-SF101', 'MDCK- SF102', 'MDCK-SF103' e FERM BP-7449.

24. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus de influenza é propagado nas células dos rins de cães Madin Darby (MDCK) (ATCC CCL-34).

25. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus de influenza do tipo B está presente em uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; com mais preferência NLT 6,5 Log EID50 por 0,5 ml.

26. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus de influenza do tipo A está presente em uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; com mais preferência NLT 7 Log EID50 por 0,5 ml.

27. Método de preparação de uma composição imunogênica, caracterizado pelo fato de que compreende: a) a infecção do hospedeiro da cultura de células MDCK com vírus de influenza a um MOI entre 1:100 e 1:10.000 b) a colheita do sobrenadante que compreende um período pós-incubação de vírus de influenza de 40 a 70 horas em MEM contendo tripsina na faixa de 5 a 25 U/ml; c) a filtração da colheita viral por meio de filtração de fluxo direto (DFF) através de pelo menos um filtro de clarificação que tem um tamanho de poro entre cerca de 6 micrômetros e cerca de 0,45 micrômetro; d) o tratamento de CVP com uma endonuclease não específica a uma temperatura que varia entre 30 e 34°C por duas a 6 horas e subsequentemente a uma temperatura de 2 a 8°C por 5 a 15 horas; e) a concentração de CVP tratado com endonuclease através de filtração de fluxo tangencial (TFF) ao usar uma membrana com um peso molecular de corte (MWCO) de 100 KDa a 500 KDa; f) a estabilização do concentrado de TFF com uma composição de estabilizantes que compreende um ou mais carboidratos, um ou mais aminoácidos e gelatina para formar uma colheita viral estabilizada; g) a esterilização do concentrado estabilizado de TFF por meio de DFF através de pelo menos um filtro do grau de esterilização que tem um tamanho de poro entre cerca de 0,8 micrômetro e cerca de 0,2 micrômetro para formar um CMVP esterilizado; em que a recuperação total de vírus purificado é maior do que ou igual a 40%.

28. Método de fabricação da composição imunogênica de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a etapa

(d) compreende o tratamento da colheita viral com endonuclease não específica, mais particularmente a benzonase que tem uma concentração na faixa de 0,5 unidade/ml a 5 unidades/ml na presença de um cátion divalente selecionado do grupo que consiste em Ca2+, Mg2+, Mn2+ e Cu2+ em uma quantidade entre 0,1 mM e 100 mM.

29. Método de fabricação da composição imunogênica de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) compreende o tratamento da colheita viral com endonuclease não específica, mais particularmente a benzonase que tem uma concentração na faixa de 0,5 unidade/ml a 5 unidades/ml na presença de um sal de Mg2+ de cátion divalente a uma concentração de 1 a 3 mM.

30. Método de fabricação da composição imunogênica de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a etapa (e) compreende a concentração da colheita viral por meio de filtração de fluxo tangencial (TFF) que resulta em pelo menos uma concentração 4X da colheita viral.

31. Método de fabricação da composição imunogênica de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a etapa (f) compreende a estabilização da colheita viral com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a uma concentração de 1 a 10% (em peso/volume), a histidina a uma concentração de 0,1% a 2% (em peso/volume), a alanina a uma concentração de 0,01% a 1% (em peso/volume), a tricina a uma concentração de 0,1% a 2% (em peso/volume), a arginina a uma concentração de 0,1 a 5% (em peso/volume) e a gelatina a uma concentração de 0,1 a 5% (em peso/volume).

32. Método de fabricação da composição imunogênica de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a etapa (f) compreende a estabilização da colheita viral com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a uma concentração de

3 a de 6% (em peso/volume), a histidina a uma concentração de 0,1% a 1% (em peso/volume), a alanina a uma concentração de 0,05% a 0,5% (em peso/volume), a tricina a uma concentração de 0,1% a 0,5% (em peso/volume), a arginina a uma concentração de 0,1 a 3% (em peso/volume) e a gelatina a uma concentração de 0,1 a 3% (em peso/volume).

33. Método de fabricação da composição imunogênica de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a etapa (f) compreende a estabilização da colheita viral com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a 4% (em peso/volume), a histidina a 0,21% (em peso/volume), a alanina a 0,1% (em peso/volume), a tricina a 0,3% (em peso/volume), a arginina a 2,1% (em peso/volume) e a gelatina a 0,85% (em peso/volume).

34. Método de fabricação da composição imunogênica de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a etapa (f) compreende a estabilização da colheita viral com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a 4% (em peso/volume), a histidina a 0,21% (em peso/volume), a alanina a 0,1% (em peso/volume), a tricina a 0,3% (em peso/volume), a arginina a 2,1% (em peso/volume) e a gelatina a 1,0% (em peso/volume).

35. Método de fabricação da composição imunogênica de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a etapa (f) compreende a estabilização da colheita viral com uma composição de estabilizantes que compreende a sacarose a 4% (em peso/volume), a histidina a 0,21% (em peso/volume), a alanina 0,1% (em peso/volume), a tricina a 0,3% (em peso/volume), a arginina a 1,6% (em peso/volume) e a gelatina a 1,0% (em peso/volume).

36. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o método de administração da composição imunogênica a um indivíduo humano compreende a rota intranasal, intramuscular, intravenosa, subcutânea, transcutânea ou intradermal.

37. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um ou mais vírus de vacina de influenza atenuados vivos (LAIV) a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; b) sacarose de 1 a 10% (em peso/volume); c) histidina de 0,1% a 2% (em peso/volume); d) alanina de 0,01% a 1% (em peso/volume); e) tricina de 0,1% a 2% (em peso/volume); f) arginina de 0,1 a 5% (em peso/volume); g) gelatina de 0,1 a 5% (em peso/volume).

38. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um ou mais vírus de vacina de influenza atenuados vivos (LAIV) a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; b) sacarose de 3 a 6% (em peso/volume); c) histidina de 0,1% a 1% (em peso/volume); d) alanina de 0,05% a 0,5% (em peso/volume); e) tricina de 0,1% a 0,5% (em peso/volume); f) arginina de 0,1 a 3% (em peso/volume); g) gelatina de 0,1 a 3% (em peso/volume).

39. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um ou mais vírus de vacina de influenza atenuados vivos (LAIV) a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; b) sacarose a 4% (em peso/volume); c) histidina a 0,21% (em peso/volume); d) alanina a 0,1% (em peso/volume); e) tricina a 0,3% (em peso/volume);

f) arginina a 2,1% (em peso/volume); g) gelatina a 0,85% (em peso/volume).

40. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um ou mais vírus NLT de vacina de influenza atenuados vivos (LAIV) a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; b) sacarose a 4% (em peso/volume); c) histidina a 0,21% (em peso/volume); d) alanina a 0,1% (em peso/volume); e) tricina a 0,3% (em peso/volume); f) arginina a 2,1% (em peso/volume); g) gelatina a 1% (em peso/volume).

41. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um ou mais vírus NLT de vacina de influenza atenuados vivos (LAIV) a uma dose de 6 a 7 Log EID50 por 0,5 ml; b) sacarose a 4% (em peso/volume); c) histidina a 0,21% (em peso/volume); d) alanina a 0,1% (em peso/volume); e) tricina a 0,3% (em peso/volume); f) arginina a 1,6% (em peso/volume); g) gelatina a 1% (em peso/volume).