TWI812650B - 包含特別是減毒活重組黃病毒的穩定疫苗組成物以及製備其的製程 - Google Patents
包含特別是減毒活重組黃病毒的穩定疫苗組成物以及製備其的製程 Download PDFInfo
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Abstract
本揭示內容係關於穩定的凍乾免疫原性組成物，其包含特別是減毒活重組黃病毒、更佳減毒活重組登革熱病毒(dengue virus)、至少一種碳水化合物、至少一種胺基酸，該免疫原性組成物尤其適於快速冷凍-乾燥處理，其中該組成物保留病毒之期望特徵，包括病毒活力、免疫原性及穩定性。該免疫原性組成物不含防腐劑、聚合物及表面活性劑。本揭示內容係關於製造該穩定的凍乾免疫原性組成物之方法。
Description
本揭示內容係關於生物技術領域，更特定而言其係關於減毒活黃病毒疫苗組成物及製備其之方法。本揭示內容進一步係關於減毒活黃病毒疫苗製造領域之改良方法。
黃病毒基因組係由含有單個開放閱讀框之11千鹼基之單鏈、有義RNA分子組成。RNA轉譯成多蛋白，該多蛋白被加工成至少10種基因產物：3種結構蛋白(核衣殼或核心(C)、前膜蛋白(prM)及包膜(E))及7種非結構(non-structural; NS)蛋白(NS 1、2A、2B、3、4A、4B及5)。(Lindenbach BD等人，Fields Virology. Knipe DM、Howley PM、Griffin PE等人編輯，Philadelphia: Wolters Kluwer, Lippencott Williams and Wilkins; 2007. 第1101-1152頁)。該等黃病毒中之多種利用節肢動物(例如叮咬蜱蟲及/或蚊子)作為傳播至病毒接受者中之方式。該等節肢動物攜帶性病毒(即蟲媒病毒)因其在人類中之高致病性而構成主要的世界健康問題。(Fernandez-Garcia MD等人，Cell Host Microbe, 2009, 5:318-328)。更具體而言，人類蟲媒病毒病原體包括黃熱病(yellow fever; YF)病毒、日本腦炎(Japanese encephalitis; JE)病毒、登革熱(dengue，DEN)病毒、西尼羅(West Nile，WN)病毒及蜱蟲攜帶性腦炎(tick-borne encephalitis; TBE)病毒，該等病毒以涉及蚊子或蜱蟲載體及禽類及/或哺乳動物勝任儲存宿主之生命週期存在於自然界中。(Gubler D等人，Fields Virology. Knipe DM、Howley PM、Griffin PE等人編輯，第5版，Philadelphia: Wolters Kluwer, Lippencott Williams and Wilkins; 2007. 第1153-1252頁)。
目前，登革熱病毒(Dengue virus; DENV)已變成世界上最重要的人類蟲媒病毒，估計每年發生多達5億起登革熱感染，導致200多萬起稱為登革出血熱/登革熱休克症候群之嚴重疾病病例及21000人死亡。登革熱病毒有四種血清型DENV1 DENV2、DENV3及DENV4)。
已知多種製造用於疫苗及其他目的之減毒活重組黃病毒製劑之方法。亦已知可用於冷凍、凍乾或以其他方式儲存用於實驗室或疫苗用途之活病毒製劑以保持其活性之組成物及方法。
黃病毒之水性組成物不允許長期及在高於5℃之溫度下保持良好的病毒穩定性。舉例而言，YF-DEN (黃熱病-登革熱)嵌合體之整體水性組成物損失超過4 log，在37℃下儲存1天後穩定在液體中。現在，在亞熱帶登革熱流行國家，熱穩定性係一個嚴重問題，在這些國家，在冷鏈條件下運輸很困難。
凍乾係疫苗穩定化之常見形式。然而，凍乾會引起病毒功效損失。隨著時間之推移，疫苗失去功效，且功效損失之速率具有溫度依賴性。活病毒易受滲透、熱和真空衝擊之影響。包膜病毒具有脂質雙層，該脂質雙層因其高度脆弱性而視為不太穩定的病毒組分。活病毒在凍乾步驟(如冷凍、初級乾燥、二級乾燥)期間易受各種應力之影響，該等凍乾步驟可能會影響病毒之物理化學穩定性。由於病毒之結構，冷凍-乾燥期間功效之損失可歸因於蛋白質去穩定(例如解折疊、降解及聚集)、核酸降解、脂質層改變(例如相變、機械損傷)以及與內部(結冰)及外部(pH和滲透壓變化)病毒環境之變化相關之應力。凍乾之脫水步驟導致蛋白質氫鍵結構之崩潰，伴隨著病毒表位之胺基酸組分之流動性增加。據報導，在一些情形下，凍乾會導致高達40%的病毒功效損失。
儘管在凍乾期間有大量關於醫藥肽、蛋白質及DNA之應力機制及穩定化策略之資訊，但由於病毒之分子複雜性，不同的去穩定路徑及缺乏量測凍乾期間及之後抗原結構之物理化學變化之分析技術，此意味著病毒構成了特殊的凍乾挑戰。在凍乾期間減毒活病毒疫苗之去穩定機制及保護機制尚不清楚。
Hansen等人2015 (Freeze-drying of live virus vaccines: A review, Hansen等人，Vaccine 33 (2015) 5507-5519)揭示了若干冷凍乾燥病毒疫苗調配物之彙編，其中大多數調配物提及優先使用糖醇/蛋白質添加劑(即蔗糖+海藻糖、山梨醇、水解明膠、乳白蛋白水解物)來獲得凍乾的病毒疫苗。
先前已報導以下黃病毒疫苗調配物：1)山梨醇、海藻糖、尿素，2)乳糖、山梨醇、HSA；3)乳糖、甘露醇、HSA；4)泊洛沙姆(Poloxamer)、人類白蛋白、海藻糖、PBS；5)海藻糖、重組HSA、F127 (聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)。
在HSA之情形下，若該等材料係衍生自有風險之人類或動物來源，則納入該等材料可引起潛在安全性問題。該等添加的蛋白質引起關注之主要原因有兩個。第一個問題源自動物及人類衍生之蛋白質可能含有一或多種外來物質。第二個問題源自動物或人類衍生之蛋白質可能誘發易感個體之過敏反應。另外，先前報導之凍乾疫苗調配物使用多種蛋白質，該等蛋白質即使係使用支持高產率之製程製造仍對調配物有成本影響。「為使疫苗在低收入區域得到廣泛採用，保持疫苗及其組分(例如穩定劑)之低成本至關重要。自監管及安全之角度來看，所用賦形劑及穩定劑不應含有動物來源之物質、也不應含有動物組分亦至關重要。動物衍生之化合物因可能會經羊瘙癢病朊蛋白(PrPSC)及庫賈氏病(Creutzefeld-Jakob disease)之新變體(vCJD)污染而代表潛在危險。
醫藥調配物中所用之非離子表面活性劑包括Triton™ X-100、Pluronic® F-68、F-88及F-127 (泊洛沙姆)、Brij 35 (聚氧乙烯烷基醚)、聚乙二醇硬脂酸酯40、Cremophor® EL及α-生育酚TPGS。該等表面活性劑中之每一者共同具有以下事實：其皆含有聚氧乙烯部分且因此或多或少地展現相似問題，即聚氧乙烯部分自動氧化產生反應性過氧化物，此會增加不期望的蛋白質免疫原性。(參見Edward T. Maggio等人; Polysorbates, peroxides, protein aggregation, immunogenicity - a growing concern; Journal of Excipients and Food Chemicals 3(2):46-53; 2012)。
已報導PVP使減毒活病毒調配物去穩定。(參見：JA White等人; Development of a stable liquid formulation of live attenuated influenza vaccine; Vaccine第34卷，第32期，2016年7月12日，第3676-3683頁; 2016)。
海藻糖係昂貴的；海藻糖必須與其他糖及蛋白質添加劑(明膠)組合來達成穩定性。另外，其他穩定劑在增強凍乾疫苗之儲存壽命穩定性方面優於海藻糖。
山梨醇具有低玻璃轉變溫度(Tg)(-1.6℃)，因此無法用作主要的調配物組分。山梨醇之低Tg限制了其使用。山梨醇必須與其他糖及蛋白質添加劑(明膠)組合來達成穩定性。
通常，重組病毒儲存為含有酪蛋白及/或膠原於磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate-buffered physiological saline; PBS)中之水解物之冷凍-乾燥小丸。然後將該等小丸再水合於醫藥上可接受之溶液(例如0.4-0.9% NaCl)中。然而，該等調配物存在顯著缺點且為業內已知。其中包括未完全定義之組分、複雜的製備程序、高成本及不能維持病毒之某些期望特徵。
先前開發之黃病毒疫苗調配物在28℃下穩定6個月、在25℃下穩定7天且在37℃下穩定1-2天。業內仍需要開發出包含最小量之賦形劑且賦予黃病毒疫苗、尤其減毒活重組/嵌合登革熱病毒長期熱穩定性之調配物。
該等組成物/調配物及製備其之製程闡述於本文中。
本揭示內容提供免疫原性組成物，該免疫原性組成物包含至少一種減毒活黃病毒、至少一種碳水化合物及至少一種胺基酸，其中該組成物適於快速冷凍-乾燥處理且經復水(reconstituted)組成物保留病毒之期望特徵，包括病毒活力、免疫原性及穩定性。
更特定而言，本揭示內容係關於凍乾的免疫原性組成物，該凍乾的免疫原性組成物包含： a) 減毒活重組/嵌合登革熱病毒，其中所用減毒活登革熱病毒株係自美國國立衛生研究院(United States National Institutes of Health，NIH)獲得之rDEN1Δ30-1545；rDEN2/4Δ30(ME)-1495、7163；rDEN3Δ30/31-7164及rDEN4Δ30-7132、7163、8308。 b) 蔗糖，約3% w/v至約6% w/v c) 甘胺酸，約3% w/v至約6% w/v
本揭示內容進一步提供製造該疫苗組成物/調配物之方法。目標
本文之至少一個實施例滿足之本揭示內容目標中之一些如下：
本揭示內容之一個目標係改善先前技術之一或多個問題或至少提供有用的替代。
本揭示內容之另一目標係提供穩定的凍乾疫苗組成物/調配物，該等凍乾疫苗組成物/調配物包含至少一種黃病毒、至少一種碳水化合物、至少一種胺基酸及視情況鹼。其中，組成物保留病毒之期望特徵，包括病毒活力、免疫原性及穩定性。
本揭示內容之另一目標係提供穩定的凍乾疫苗組成物/調配物，該等凍乾疫苗組成物/調配物包含特別是減毒活重組/嵌合登革熱病毒血清型(DEN 1、DEN 2、DEN 3、DEN 4)，該等血清型適於治療或預防登革熱感染或預防、改善或延遲其臨床表現之發作或進展。
本揭示內容之另一目標係提供製造該疫苗組成物/調配物之方法。
自下文描述將更明瞭本揭示內容之其他目標及優點，此不欲限制本揭示內容之範圍。
第1圖顯示登革熱病毒的RNA序列。
第2圖顯示登革熱病毒的病毒體結構。
第3圖顯示登革熱病毒體株結構。
第4圖顯示DEN-1病毒Log產率效價。
第5圖顯示DEN-2病毒、DEN-3病毒及DEN-4病毒的Log產率效價。
第6圖顯示全能核酸酶濃度對DNA含量之效應。
第7圖顯示溫度對細胞DNA含量及病毒效價之效應。
第8圖顯示DEN-1效價CCID50/ml(液體對凍乾)。
第9圖顯示DEN-2效價CCID50/ml(液體對凍乾)。
第10圖顯示DEN-3效價CCID50/ml(液體對凍乾)。
第11圖顯示DEN-4效價CCID50/ml(液體對凍乾)。
第12圖顯示凍乾週期。
第13圖顯示凍乾後之DEN-1效價Log10 pfu/ml。
第14圖顯示凍乾後之DEN-2效價Log10 pfu/ml。
第15圖顯示凍乾後之DEN-3效價Log10 pfu/ml。
第16圖顯示凍乾後之DEN-4效價Log10 pfu/ml。
第17A圖顯示在凍乾後在2-8℃下高達12個月之DEN-1效價Log10 pfu/0.5ml數據。
第17B圖顯示在凍乾後在2-8℃下高達12個月之DEN-2效價Log10 pfu/0.5ml數據。
第17C圖顯示在凍乾後在2-8℃下高達12個月之DEN-3效價Log10 pfu/0.5ml數據。
第17D圖顯示在凍乾後在2-8℃下高達12個月之DEN-4效價Log10 pfu/0.5ml數據。
第18圖顯示在凍乾後在2-8℃下高達12個月之登革熱四價疫苗pH數據。
第19圖顯示在凍乾後在2-8℃下高達12個月之登革熱四價疫苗殘餘水分數據。
第20A圖顯示在凍乾後在25℃±2℃下高達6個月之DEN-1效價Log10 pfu/0.5ml數據。
第20B圖顯示在凍乾後在25℃±2℃下高達6個月之DEN-2效價Log10 pfu/0.5ml數據。
第20C圖顯示在凍乾後在25℃±2℃下高達6個月之DEN-3效價Log10 pfu/0.5ml數據。
第20D圖顯示在凍乾後在25℃±2℃下高達6個月之DEN-4效價Log10 pfu/0.5ml數據。
第21圖顯示在凍乾後在25℃±2℃下高達6個月之登革熱四價疫苗pH數據。
第22圖顯示在凍乾後在25℃±2℃下高達6個月之登革熱四價疫苗殘餘水分數據。
第23圖顯示在凍乾後在37℃±1℃下高達7天之登革熱四價疫苗穩定性數據。
第24圖顯示在凍乾後在42℃±1℃下高達7天之登革熱四價疫苗穩定性數據。
儘管本揭示內容可能易受不同實施例之影響，但在圖式及下文詳細論述中示出了某些實施例，應理解，本揭示內容可視為本揭示內容原理之示例，並且不欲將本揭示內容之範圍限制於在本說明書中說明及揭示之範圍。
根據本揭示內容之第一實施例，免疫原性組成物包含一或多種減毒活黃病毒、一或多種碳水化合物及一或多種胺基酸，其中組成物適於快速冷凍-乾燥處理且經復水組成物保留病毒之期望特徵，包括病毒活力、免疫原性及穩定性。
術語「活」係以其習用含義使用，活病毒係尚未失活之病毒，即能夠在容許細胞上複製之病毒。減毒活黃病毒係不會在動物或人類中誘導由相應野生型病毒引起之疾病且能夠誘導特異性免疫反應的病毒。
根據本揭示內容之第二實施例，一或多種減毒活黃病毒係重組黃病毒及/或嵌合黃病毒。
根據本揭示內容之第三實施例，一或多種減毒活黃病毒係選自由以下組成之群：登革熱(DEN)病毒、黃熱病(yellow fever；YF)病毒、日本腦炎(Japanese encephalitis；JE)病毒、昆金病毒、西尼羅(West Nile；WN)病毒、蜱蟲攜帶性腦炎(tick-borne encephalitis；TBE)病毒、聖路易腦炎病毒、莫累谷腦炎病毒、茲卡病毒或其任何相關黃病毒。
又根據第三實施例之較佳態樣，一或多種減毒活黃病毒係登革熱(DEN)病毒，視情況複數種選自DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4之群之不同血清型之減毒活登革熱(DEN)病毒。
根據本揭示內容之第四實施例，一或多種減毒活黃病毒係選自由以下組成之群：減毒活嵌合/重組黃熱病(yellow fever；YF)病毒及/或減毒活嵌合/重組日本腦炎(Japanese encephalitis；JE)病毒、及/或減毒活嵌合/重組登革熱(DEN)病毒、及/或減毒活嵌合/重組西尼羅(West Nile；WN)病毒及/或減毒活嵌合/重組蜱蟲攜帶性腦炎(tick-borne encephalitis；TBE)病毒及/或嵌合登革熱病毒(黃熱病-登革熱)病毒、及/或嵌合YF-WN(黃熱病-西尼羅病毒)病毒及/或嵌合YF-JE(黃熱病-日本腦炎)病毒或其任何相關黃病毒。
又根據第四實施例之較佳態樣，一或多種減毒活黃病毒係減毒活嵌合/重組登革熱(DEN)病毒。
根據本揭示內容之第五實施例，免疫原性組成物中所用之減毒活重組/嵌合登革熱病毒闡述於下文中：
與下文所解釋所有四種登革熱病毒血清型(DEN 1、DEN 2、DEN 3及DEN 4)之減毒疫苗株之生成相關之所有活動皆係在美國NIH進行。
WO2002095075及WO2008022196之內容之全文併入本文中。
1.藉由自野生型株之非轉譯3'端缺失約30個核苷酸(Δ30)(在DEN-3之情形下缺失額外31個核苷酸(Δ31))開發出登革熱病毒血清型1-4之每一減毒株(rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30(ME)、rDEN3Δ30/31及rDEN4Δ30)。亦可單獨生成Δ31突變以辨別Δ30或Δ31在組合Δ30/31缺失突變中之貢獻。
2.藉由用DEN 2 M及E蛋白替代減毒DEN 4血清型之M及E蛋白開發出DEN 2病毒血清型。
3.在結構上，所有四種株皆為35-50奈米大小之包膜有義RNA病毒。
4.本文所用之rDEN1Δ30-1545株編碼病毒多蛋白中胺基酸殘基第484號之單一Lys→Arg突變(A1545G突變)。
5.本文所用之rDEN2/4Δ30(ME)-1495、7163株編碼病毒多蛋白中胺基酸殘基第186號之Ser→Phe突變(C1495T突變)及胺基酸殘基第112號之Leu→Phe突變(A7163C突變)。
6.rDEN3Δ30/31包括原始Δ30缺失及不連續第31核苷酸缺失，該兩種缺失去除了原始TL-2及TL-3結構二者。本文所用之所得rDEN3Δ
30/31-7164株編碼病毒多蛋白中胺基酸殘基第115號之Val→Ala突變(T7164C突變)。
7.本文所用之rDEN4Δ30-7132、7163、8308株編碼病毒多蛋白中胺基酸殘基第102號之Thr→Ile突變(C7132T突變)、胺基酸殘基第112號之Leu→Phe突變(A7163C突變)及胺基酸殘基第249號之Lys→Arg突變(A8308G突變)。
用於生成疫苗株之野生型株於下表中給出：
登革熱病毒疫苗株之生成基本上遵循以下步驟：
1.藉由使用反轉錄酶及PCR生成短DNA區段來產生含有野生型DEN病毒之全長cDNA拷貝之質體。適當地連結如此獲得之片段以生成完整雙鏈DNA，該完整雙鏈DNA包含選殖於質體中之野生型DEN之全長基因組cDNA鏈。
2.藉由突變3’UTR之子片段並用含有Δ30區之子片段替代野生型DEN之3’UTR插入Δ30突變。藉由位點特異性PCR誘變引入特異性突變。
3.為生成DEN 2疫苗株，將DEN 2之結構基因M及E選殖於質體中且用於替代含有Δ30突變之DEN 4選殖質體中之結構基因。為生成DEN 3疫苗株，在野生型純系中引入兩種30個及31個核苷酸缺失。
4.使用AmpliCap SP6 Message Maker套組(EpiCentre Technologies,Madison)自線性化質體合成基因組長度封端之RNA轉錄本，且使用RNeasy Mini套組(Qiagen,Valencia,CA)來純化RNA。使用DOTAP脂質體轉染試劑(Roche,Indianapolis,IN)用經純化之RNA轉錄本轉染Vero細胞(C6/36用於登革熱3)以回收期望病毒。使經拯救的病毒經受擴增、終末稀釋選殖及最終擴增以生成Vero細胞中之種子病毒。關於每一株所經歷之擴增及終末稀釋之週期數的細節列表於下表2中。
根據第五實施例之第一態樣，嵌合病毒具有展現如上文所定義減毒活病毒之特徵之特殊性。因此，在本
揭示內容之上下文中，可使用表現一或多種黃病毒之包膜蛋白或一或多種包膜蛋白之一或多個表位並誘導特異性免疫反應的任何嵌合病毒，該特異性免疫反應包含中和株或至少一種株之抗體，包膜蛋白或該表位衍生自該株。
根據第五實施例之第二態樣，減毒活重組登革熱病毒核酸進一步包含生成突變體之突變，該突變體具有選自由以下組成之群之表型：Vero細胞或人類肝細胞系HuH-7中之溫度敏感性、蚊子細胞或人類肝細胞系HuH-7中之宿主細胞限制性、Vero細胞中對改良複製之宿主細胞適應性或小鼠或猴中之減毒，其中組成物包含選自由以下組成之群之成員：
(1)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(2)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(3)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(4)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(5)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(6)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(7)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(8)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(9)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(10)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(11)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(12)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(13)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(14)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(15)rDEMΔ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(16)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(17)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(18)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(19)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(20)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(21)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(22)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(23)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(24)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(25)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(26)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(27)rDEMΔ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(28)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(29)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(30)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(31)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(32)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(33)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(34)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(35)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(36)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(37)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(38)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(39)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(40)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(41)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(42)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(43)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(44)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(45)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(46)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(47)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(48)rDEN1Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(49)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(50)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(51)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(52)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(53)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(54)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(55)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(56)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(57)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(58)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(59)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(60)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(61)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(62)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(63)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(64)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(65)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(66)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(67)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(68)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(69)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(70)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(71)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(72)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(73)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(74)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(75)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(76)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(77)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(78)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(79)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30、i
(80)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(81)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(82)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
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(84)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
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(88)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
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(90)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
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(98)rDEN1/2Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
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(100)rDEN1/2Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
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(105)rDEN1/2Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(106)rDEN1/2Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(107)rDEN1/2Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(108)rDEN1/2Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(109)rDEN1/2Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(110)rDEN1/2Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(111)rDEN1/2Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(112)rDEN1/2Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(113)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(114)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(115)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(116)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(117)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(118)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(119)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(120)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(121)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30srDEN4Δ30，
(122)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(123)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(124)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(125)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(126)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(127)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(128)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(129)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(130)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(131)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(132)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(133)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(134)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(135)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(136)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(137)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(138)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(139)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(140)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(141)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(142)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(143)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(144)rDEN1/3Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(145)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(146)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(147)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(148)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(149)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(150)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(151)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(152)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(153)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(154)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(155)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(156)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(157)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(158)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(159)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(160)rDEN1/3Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(161)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(162)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(163)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(164)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(165)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(166)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(167)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(168)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(169)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(170)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(171)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(172)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(173)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(174)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(175)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(176)rDEN1/3Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(177)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(178)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(179)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(180)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(181)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(182)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(183)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(184)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(185)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(186)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(187)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(188)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(189)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(190)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(191)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(192)rDEN1/3Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(193)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(194)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(195)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(196)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(197)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(198)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(199)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(200)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(201)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(202)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(203)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(204)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(205)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(206)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(207)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(208)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(209)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(210)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(211)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(212)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(213)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(214)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(215)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(216)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(217)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(218)rDEN1/4Δ30srDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(219)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(220)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(221)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(222)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(223)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30srDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(224)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(225)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(226)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(227)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(228)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(229)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(230)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(231)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(232)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(233)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(234)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(235)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(236)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(237)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(238)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(239)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，
(240)rDEN1/4Δ30、rDEN2/3Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30，
(241)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30，
(242)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/1Δ30，
(243)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/2Δ30，
(244)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4/3Δ30，
(245)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30，
(246)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30，
(247)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30，
(248)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/3Δ30，
(249)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30，
(250)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30，
(251)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30，
(252)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/3Δ30，
(253)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30，
(254)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30，
(255)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30，及
(256)rDEN1/4Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/3Δ30。
根據本揭示內容之第六實施例，一或多種碳水化合物包括(但不限於)天然碳水化合物、合成碳水化合物、多元醇、玻璃轉變促進劑單醣、二醣、三醣、寡醣及其相應糖醇、多羥基化合物(例如碳水化合物衍生物及經
化學修飾之碳水化合物)、羥乙基澱粉及糖共聚物。天然及合成碳水化合物二者皆適用。合成碳水化合物包括(但不限於)醣苷鍵經硫醇或碳鍵替代之彼等。可使用碳水化合物之D及L兩種形式。碳水化合物可為非還原或還原的。倘若使用還原碳水化合物，則較佳添加梅納反應(Maillard reaction)之抑制劑。適用於組成物中之還原碳水化合物係業內已知之彼等且包括(但不限於)葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麥芽酮糖及乳果糖。非還原碳水化合物包括(但不限於)選自糖醇及其他直鏈多元醇之多羥基化合物之非還原醣苷。其他有用的碳水化合物包括棉子糖、水蘇糖、松三糖、右旋糖酐、纖維二糖、甘露二糖及糖醇。糖醇醣苷較佳係單醣苷，尤其藉由二醣(例如乳糖、麥芽糖、乳果糖及麥芽酮糖)之還原獲得之化合物。玻璃形成劑係選自由以下組成之群：蔗糖、甘露醇、海藻糖、甘露糖、棉子糖、乳糖醇、乳糖酸、葡萄糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖、麥芽糖、乳糖山梨醇、右旋糖、岩藻糖或其組合。
又根據第六實施例之較佳態樣，免疫原性組成物包含蔗糖作為適宜碳水化合物穩定劑，該蔗糖介於1重量/體積%與20重量/體積%之間，較佳1-10重量/體積%之間，更佳3-6重量/體積%之間，最佳小於或等於5重量/體積%(w/v)。
根據本揭示內容之第七實施例，一或多種胺基酸包括(但不限於)白胺酸、異白胺酸、組胺酸、甘胺酸、
麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸、丙胺酸或胺基酸、肽、水解蛋白或諸如血清白蛋白等蛋白質之組合。
又根據第七實施例之較佳態樣，免疫原性組成物包含甘胺酸作為適宜胺基酸穩定劑，該甘胺酸介於1重量/體積%與20重量/體積%之間，較佳1-10重量/體積%之間，更佳3-6%重量/體積之間，最佳小於或等於5重量/體積%(w/v)。
根據本揭示內容之第八實施例，免疫原性組成物可另外包含選自由以下組成之群之緩衝劑：碳酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、葡萄糖酸鹽及酒石酸鹽緩衝劑，以及更複雜之有機緩衝劑，該有機緩衝劑包括含有磷酸鈉及/或磷酸鉀之磷酸鹽緩衝劑，磷酸鈉及/或磷酸鉀之比率經選擇以達成期望pH。在另一實例中，緩衝劑含有Tris(羥甲基)胺基甲烷或經調配以達成期望pH之「Tris」。在另一實例中，緩衝劑可為含有漢克氏鹽(Hanks salt)之最低必需培養基。
根據本揭示內容之第九實施例，免疫原性組成物可另外包含選自由以下組成之群之防腐劑：2-苯氧基乙醇、氯化苯索寧(Phemerol)、苯酚、間甲酚、硫柳汞、甲醛、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、苯紮氯銨、苄醇、氯丁醇、對-氯-間甲酚或苄醇或其組合。
根據本揭示內容之第十實施例，免疫原性組成物可另外包含選自由以下組成之群之醫藥上可接受之賦形劑：表面活性劑、聚合物及鹽。表面活性劑之實例可包
括非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等。聚合物之實例可包括右旋糖酐、羧甲基纖維素、透明質酸、環糊精等。鹽之實例可包括NaCl、MgCl2、KCl、CaCl2等。
根據本揭示內容之第11實施例，免疫原性組成物可另外包含選自由以下組成之群之佐劑：鋁鹽、氫氧化鋁、磷酸鋁、羥基磷酸鋁及硫酸鋁鉀。
根據本揭示內容之第12實施例，免疫原性組成物可另外包含選自由以下組成之群之免疫刺激組分：油及水乳液、MF-59、脂質體、脂多醣、皂素、脂質A、脂質A衍生物、單磷醯基脂質A、3-去醯基化單磷醯基脂質A、AS01、AS03、寡核苷酸、包含至少一個未甲基化CpG及/或脂質體之寡核苷酸、弗氏佐劑(Freund’s adjuvant)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚合物、共聚物(例如聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，包括嵌段共聚物)、聚合物p1005、CRL-8300佐劑、胞壁醯二肽、TLR-4促效劑、鞭毛蛋白、衍生自革蘭氏陰性細菌(gram negative bacteria)之鞭毛蛋白、TLR-5促效劑、能夠結合至TLR-5受體之鞭毛蛋白片段、QS-21、ISCOMS、皂素與固醇及脂質之組合。
根據本揭示內容之第13實施例，該免疫原性組成物係凍乾的(冷凍-乾燥)。
根據本揭示內容之第14實施例，凍乾的免疫原性組成物在2-8℃下穩定12至36個月；在25℃下穩定
2至6個月；在37℃下穩定1週至4週，在42℃下穩定2-7天，在55℃下穩定2-7天。
根據本揭示內容之第15實施例，復水凍乾的免疫原性組成物之方法包含用水溶液、視情況鹽水或注射用水(WFI)復水凍乾的免疫原性組成物之步驟。
根據本揭示內容之第16實施例，復水後免疫原性組成物之最終pH在pH 6.0至pH 8.0範圍內；更佳在pH 7.0至pH 8.0範圍內；更佳在pH 7.2至pH 7.9範圍內；且最佳在pH 7.5至pH 7.9範圍內。
根據本揭示內容之第17實施例，製備減毒活嵌合/重組四價登革熱(DEN)疫苗組成物之製程包含以下步驟之任一亞組或全部：
a)使Vero細胞恢復並適於在含有漢克氏鹽溶液及10%胎牛血清之最低必需培養基(Minimum essential medium；MEM)中生長
b)首先在組織培養燒瓶(具有175cm2表面積可用於細胞生長之TCF)中擴增Vero細胞，產生Vero細胞之主庫及工作庫
c)使工作細胞庫之冷藏保存之細胞在滾瓶(850cm2表面積可用於細胞生長)中恢復、擴增並進一步傳代且在37±1℃下培育以獲得單層
d)用登革熱病毒血清型1、2、3及4之工作種子感染滾瓶中之Vero細胞單層
e)將所有滾瓶在34±1℃下培育20min.；且使用含有漢克氏鹽溶液及2%胎牛血清之最低必需培養基(Minimum essential medium；MEM)，每滾瓶(RB)體積最高達120ml。另外將所有滾瓶在34±1℃及0.7RPM滾動速度下培育2天。
f)在第2天，用不含胎牛血清之新鮮病毒培養基洗滌滾瓶中之單層且將RB在34±1℃下培育3天，各自在0.7RPM滾動速度下
g)在感染後第5天，收穫所有受感染滾瓶之細胞上清液且向瓶中再進給不含胎牛血清之新鮮病毒培養基；
h)進行多次收穫並單獨處理，以獲得澄清的單價病毒彙集物(clarified monovalent virus pool；CMVP)
i)藉由直流過濾(direct flow filtration；DFF)經由至少一個澄清過濾器過濾病毒收穫物
j)用非特異性核酸內切酶處理病毒收穫物以降解細胞DNA
k)使經處理之病毒收穫物經受切向流過濾
l)用包含至少一種胺基酸及至少一種碳水化合物之穩定劑穩定病毒收穫物，以形成經穩定之病毒收穫物
m)藉由DFF經由至少一個滅菌級過濾器對經穩定之病毒收穫物滅菌
n)將每一登革熱病毒血清型之澄清的單價病毒彙集物(clarified monovalent virus pool；CMVP)儲存在-60℃或以下之聚碳酸酯瓶中
o)將所有四種病毒血清型之澄清的單價病毒彙集物(clarified monovalent virus pool；CMVP)混合在一起以獲得最終原液，將其裝入小瓶中且凍乾以獲得藥品，即重組登革熱四價疫苗(減毒活)
根據第17實施例之第一態樣，所用Vero細胞系係ATCC CCL-81(cGMPVero，衍生自非洲綠猴(Cercopithecus aeothiops)之腎細胞；可自ATCC,Manassas,Va.,USA購得)
根據第17實施例之第二態樣，在丟棄輸入材料之前以適當時間間隔進行多次收穫，達約4-5次，更佳在第5天、第7天、第9天及第11天進行4次收穫，並單獨處理，以獲得澄清的單價病毒彙集物(clarified monovalent virus pool；CMVP)。在多次收穫之情形下，相同量之輸入材料貢獻高於習用單次收穫方法之產率。此亦節省上游處理(即擴增感染用細胞)之時間及總生產成本。
根據第17實施例之第三態樣，其中病毒培養基包含含有漢克氏鹽溶液之最低必需培養基(Minimum Essential Medium；MEM)，該MEM另外含有右旋糖、L-麩醯胺酸及碳酸氫鈉。
根據第17實施例之第四態樣，含有病毒之培養基通常係經由孔徑遞減(例如6μ、0.8μ、0.45μ、0.2μ)之過濾器來澄清。適宜市售過濾器及過濾裝置為業內所熟知且可由熟習此項技術者來選擇。實例性過濾裝
置包括例如Millipak(Millipore)、Kleenpak(Pall)及SartobranTM P過濾裝置。
根據第17實施例之第五態樣，用非特異性核酸內切酶、最佳全能核酸酶(Benzonase)處理經過濾之收穫物，該酶之濃度在1-10單位/ml之間變化，處理溫度在4-37℃之間且處理間隔介於2小時至12小時之間。
根據第17實施例之第六態樣，使經全能核酸酶處理之收穫物進一步經受切向流過濾(tangential flow filtration；TFF)，通常經由分子量截留(molecular weight cut off；MWCO)為500KD、更佳300KD且最佳100KD之過濾器。
根據第17實施例之第七態樣，使病毒收穫物經受切向流過濾(tangential flow filtration；TFF)，產生病毒收穫物之至少10×濃縮物，且進一步去除殘餘雜質。
較佳地，殘餘雜質包含殘餘DNA、殘餘牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA)及殘餘宿主細胞蛋白質。
根據第17實施例之第八態樣，上文所述之製程產生經純化及濃縮之黃病毒製劑、更佳登革熱病毒製劑，其中該等製劑包含濃縮之減毒活登革熱病毒顆粒、痕量殘餘細胞DNA(<10ng/劑量)、殘餘BSA(<50ng/劑量)及殘餘細胞蛋白質。另外，根據上文所述之製程，經純化病毒之總回收率為至少50%。
根據第17實施例之第九態樣，混合包含一或多種胺基酸及一或多種碳水化合物之溶液之穩定劑與濃縮之病毒原液(TFF濃縮物)，病毒原液與穩定劑之比例為60：40或50：50或40：60，以獲得最終調配物。
較佳地，混合包含濃度為7.5%至15%(w/v)之蔗糖及濃度為7.5%至15%(w/v)之甘胺酸之溶液之穩定劑與濃縮之病毒原液(TFF濃縮物)，病毒原液與穩定劑之比例為60：40或50：50或40：60，以獲得包含濃度為3%至6%(w/v)之蔗糖及濃度為3%至6%(w/v)之甘胺酸的最終調配物。
較佳地，混合包含濃度為12.5%(w/v)之蔗糖及濃度為12.5%(w/v)之甘胺酸之溶液之穩定劑與濃縮之病毒原液(TFF濃縮物)，病毒原液與穩定劑之比例為60：40，以獲得包含濃度為5%(w/v)之蔗糖及濃度為5%(w/v)之甘胺酸的最終調配物。
較佳地，混合包含濃度為11.25%(w/v)之蔗糖及濃度為12.5%(w/v)之甘胺酸之溶液之穩定劑與濃縮之病毒原液(TFF濃縮物)，病毒原液與穩定劑之比例為60：40，以獲得包含濃度為4.5%(w/v)之蔗糖及濃度為5%(w/v)之甘胺酸的最終調配物。
較佳地，混合包含濃度為15%(w/v)之蔗糖及濃度為15%(w/v)之甘胺酸之溶液之穩定劑與濃縮之病毒原液(TFF濃縮物)，病毒原液與穩定劑之比例為
60：40，以獲得包含濃度為6%(w/v)之蔗糖及濃度為6%(w/v)之甘胺酸的最終調配物。
根據第17實施例之第十態樣，對於每一登革熱血清型，用於獲得主種子及工作種子之黃病毒、更佳登革熱病毒之感染複數(multiplicity of infection；MOI)在0.01至0.1範圍內。
較佳地，用於獲得主種子及工作種子之登革熱病毒之感染複數(multiplicity of infection；MOI)為0.01。
根據第17實施例之第11態樣，免疫原性組成物包含黃病毒、更佳登革熱病毒，該病毒之劑量不小於2.5 log10 PFU/0.5ml登革熱病毒血清型1、2、3及4中之每一者
根據第17實施例之第12態樣，免疫原性組成物包含登革熱病毒，該病毒之劑量為log 103至log105 PFU/0.5ml、更佳log103至log104 PFU/0.5ml、最佳log103 PFU/0.5ml登革熱病毒血清型1、2、3及4中之每一者。
根據本揭示內容之第18實施例，凍乾(冷凍-乾燥)免疫原性組成物之方法包含冷凍、初級乾燥及二級乾燥之步驟。
較佳地，凍乾(冷凍-乾燥)減毒活嵌合/重組四價登革熱(DEN)疫苗組成物之方法包含以下步驟之任一亞組或全部：
a)在20℃至5℃之間之溫度下裝載產物
b)利用每一溫度下之保持時間逐步冷凍，其中冷凍步驟包含在約-30℃至-45℃下以0.5至1℃./min之冷凍速率冷凍約60分鐘至930分鐘
c)在-20℃下退火5hr，然後在-45℃下冷凍
d)初級乾燥包含在約55微巴之壓力下以約0.5℃/分鐘至1.0℃/分鐘逐步升高溫度以達成約-25℃至-32℃之儲存溫度，保持約600分鐘至1980分鐘；
e)二級乾燥涉及在55微巴之壓力下以0.5至1.0℃/min之速率加熱產物以達成約25℃至30℃之儲存溫度，保持約360分鐘至600分鐘。
凍乾週期之總持續時間包含約48小時至56小時。根據小瓶規格及凍乾機設計，考慮溫度及週期持續時間之變化。基於預定之週期凍乾產物，以達成約2.0% w/w至3.5% w/w之目標水分含量。
如本文所用術語「冷凍-乾燥」或「凍乾(lyophilize或lyophilization)」涉及凍乾且係指將懸浮液冷凍、然後藉由在低壓下昇華去除水之製程。如本文所用術語「昇華」係指組成物之物理性質發生變化，其中組成物直接自固態變成氣態而不變成液體。
根據本揭示內容之第19實施例，免疫原性組成物經調配用於減少健康病況發作或預防該健康病況之方法中，該方法涉及經由肌內或靜脈內、皮下或經皮或皮內向人類個體投與有效量之免疫原性組成物。
根據本揭示內容之第20實施例，健康病況係選自由以下組成之群：登革熱病毒感染、茲卡病毒感染、西尼羅感染、日本腦炎感染、昆金病毒感染、蜱蟲攜帶性腦炎感染、聖路易腦炎病毒感染、莫累谷腦炎病毒感染、黃熱病病毒感染。
根據本揭示內容之第21實施例，免疫原性組成物可以有效地產生中和抗體及保護之劑量經皮下、皮內或肌內投與。疫苗係以與劑量調配物相容之方式及以預防及/或治療上有效之量投與。本揭示內容之免疫原性組成物可作為初級預防劑投與具有感染風險之成人或兒童，或可用作治療受感染患者之二級藥劑。舉例而言，如本文所揭示之減毒活登革熱(DEN)四價疫苗組成物可用於具有登革熱病毒感染風險之成人或兒童，或可用作治療感染DEN病毒之患者之二級藥劑。
根據本揭示內容之第22實施例，免疫原性組成物可調配為單劑量小瓶、多劑量小瓶或預填充注射器，其中該免疫原性組成物可以單劑量時間表或較佳多劑量時間表來給予，在該多劑量時間表中，疫苗接種之初級進程可使用1-2個單獨劑量，然後在維持及或強化免疫反應所需之後續時間間隔給予其他劑量，例如在1-4個月給予第二劑量，且若需要，在幾個月或幾年後給予後續劑量。劑量方案亦將至少部分地根據賦予保護性免疫所需之加強劑量之需要來確定。
本文所揭示之其他實施例亦涵蓋疫苗套組，該疫苗套組包含含有凍乾(冷凍-乾燥)免疫原性組成物之第一容器及含有用於復水凍乾(冷凍-乾燥)免疫原性組成物之水溶液、視情況鹽水或WFI(注射用水)之第二容器。
在本說明書通篇中，詞語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」等變化形式應理解為暗指包括所述元件、整數或步驟或元件、整數或步驟之群，但並不排除任何其他元件、整數或步驟、或元件、整數或步驟之群，且可意指「包括(includes)」、「包括(including)」及諸如此類；「基本上由......組成」或「基本上含有」同樣具有美國專利法中所述之含義且該術語係開放式的，允許存在多於所列舉之特徵，只要所列舉特徵之基本或新穎特徵不會因多於所列舉特徵之存在而改變，但不包括先前技術之實施例。
在本說明書通篇中，詞語「免疫原性組成物」涵蓋誘發針對自載體表現之所關注抗原或免疫原之免疫反應的任何組成物；例如，在投與至個體中後，誘發針對所關注靶向免疫原或抗原之免疫反應。術語「疫苗組成物」及「疫苗」涵蓋誘導針對所關注抗原之保護性免疫反應或針對抗原提供有效保護之任何組成物；例如在投與或注射至個體中後，誘發針對靶向抗原或免疫原之保護性免疫反應或提供針對自載體表現之抗原或免疫原之有效保護。
使用表述「至少」或「至少一個」暗示使用一或多個元件或成分或量，正如可在本發明實施例中所用，
以達成一或多個期望目標或結果。儘管已闡述了本發明之某些實施例，但該等實施例僅僅係以舉例方式呈現，且不欲限制本發明之範圍。在本發明之範圍內，熟習此項技術者在閱讀本文之揭示內容後，可對本發明調配物作出改變或修改。該等改變或修改完全在本發明之精神內。
除非說明書中有相反陳述，否則對各種物理參數、尺寸及量給出之數值僅僅係近似值，且設想，高於指配給物理參數、尺寸及量之數值之數值在本發明之範圍內。
類似地，純化中所用之組件(例如過濾器、管柱)並不欲以任何方式限制或排除，且可取代其他組件，以達成由從業醫師自行決定之相同目的。
儘管在此相當強調較佳實施例之具體特徵，但應理解，可在不背離本揭示內容之原理的情況下添加許多其他特徵，且可在較佳實施例中進行許多改變。熟習此項技術者根據本文之揭示內容將明瞭本揭示內容之較佳實施例中之該等及其他變化，由此可以清楚地理解，前述描述性內容僅應理解為對本揭示內容之說明而非限制。
上文所述之揭示內容具有若干技術進步及優點，該優點包括(但不限於)實現穩定的凍乾免疫原性組成物及製造其之方法，該組成物包含減毒活重組登革熱病
毒、至少一種碳水化合物、至少一種胺基酸。與其他凍乾的免疫原性組成物相比，本揭示內容提供以下優點：
1.疫苗組成物中涉及最少組分。
2.經復水疫苗保留病毒之期望特徵，包括病毒活力、免疫原性及穩定性。
3.在2-8℃、25℃、37℃、42℃及55℃下改良之長期穩定性。
4.不含防腐劑、聚合物及表面活性劑。
5.改良之製造該等穩定組成物/調配物之方法，從而提高產率。
包括以下實例來展示本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應理解，以下實例中所揭示之組成物及技術代表本發明者發現之在本文所揭示實踐中發揮良好作用之技術，且因此可認為構成了其實踐之較佳模式。然而，熟習此項技術者根據本揭示內容應理解，可在不背離本發明之精神及範圍的情況下對所揭示之具體實施例作出許多改變，並且仍然獲得類似或相似的結果。
實施某些實驗以首先鑒別出製造適於臨床前及臨床測試之免疫原性組成物之方法，且鑒別出黃病毒免疫原性組成物或疫苗之用途。在一些實例性方法中，使用
減毒活重組/嵌合登革熱病毒作為用於臨床前及臨床測試之各種組成物中之實例性黃病毒。候選登革熱疫苗株係由美國國立衛生研究院(National Institute of Health；NIH)供應。
製造減毒活嵌合/重組四價登革熱(DEN)疫苗組成物之製程包含以下步驟之任一亞組或全部：
1.使Vero細胞恢復並適應在含有漢克氏鹽溶液及10%胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)之最低必需培養基(Minimum essential medium；MEM)中生長；
2.首先在組織培養燒瓶(具有175cm2表面積可用於細胞生長之TCF)中擴增Vero細胞，產生Vero細胞之主庫及工作庫。
3.使工作細胞庫之冷藏保存之細胞在滾瓶(roller bottle；RB)(850cm2表面積可用於細胞生長)中恢復、擴增並進一步傳代且在37±1℃及0.7RPM滾動速度下培育以獲得單層。
4.用登革熱病毒血清型1、2、3及4之工作種子以0.01 MOI感染滾瓶中之Vero細胞單層
5.將所有滾瓶在34±1℃下培育20min.；且使用含有漢克氏鹽溶液及2%胎牛血清之最低必需培養基(Minimum essential medium；MEM)，每RB體積最高達120ml。另外將所有滾瓶在34±1℃下及0.7RPM滾動速度下培育2天。
6.在第2天，用不含胎牛血清之新鮮病毒培養基洗滌滾瓶中之單層以去除痕量FBS且在34±1℃及0.7RPM滾動速度下培育3天。
7.在感染後第5天，收穫所有受感染滾瓶之細胞上清液且向瓶中再進給包含含有漢克氏鹽溶液之MEM之新鮮病毒培養基，該MEM另外含有右旋糖、L-麩醯胺酸及碳酸氫鈉且不含有胎牛血清；
登革熱病毒之各種收穫方法是在不同時間點(自感染後第4天至第12天)以單次收穫及多次收穫之方式進行，如每天、奇數天、偶數天等。根據單次收穫產量與多次收穫產量來比較病毒效價。
自第4天開始，在各別天分組(第1至4組)收穫受感染之RB。收穫後，向RB再進給新鮮的病毒培養基-VM，並在34℃下培育直至下一次收穫。另外，分別在第6天(第5組)及第7天(第6組)收集單次收穫物之上清液。藉由Spearman Karber方法測試該等樣品之病毒效價(CCID50)。
用登革熱病毒血清型1(DEN 1)獲得之生長曲線顯示，在第5、7、9及11天多次收穫給出良好的病毒效價，且因此將係其他批次之選擇(參見第4圖)。
對於Den 2、3及4，使用18RB進行多次收穫與單次收穫之另一次試驗。
參見第5圖，使用90個滾瓶之DEN 2、3、4病毒之對數產量效價(多次收穫與單次收穫)
單批多次收穫之累積產量比藉由單次收穫獲得之產量高得多(約0.4至0.6 log)。由於0.3 log相當於絕對值之兩倍，此差異更為顯著。因此，多次收穫之方法比單次收穫更有益且更佳。
登革熱病毒生長於Vero細胞上。因此需要自收穫物去除雜質。用全能核酸酶處理雜質，如宿主細胞DNA。
1.進行多次收穫並單獨處理，以獲得澄清的單價病毒彙集物(clarified monovalent virus pool；CMVP)。
2.經由6μ+0.45μ過濾器使該等多次收穫物澄清且用全能核酸酶處理以降解細胞DNA。
3.實施多次實驗以鑒別出用於處理收穫物之理想全能核酸酶濃度及溫度。
在此實驗中，在34±1℃下經2小時添加四種不同濃度(500單位/升、1250單位/升、2500單位/升及5000單位/升)之全能核酸酶。觀察到，在全能核酸酶之1250、2500及5000單位/升濃度下，DNA存在最佳降解。基於多個結果，選擇1250單位/升作為工作濃度。
登革熱病毒對長時間之溫度暴露較為敏感，因此在實驗中使用短時間暴露，即在不同溫度下暴露2小時。觀察到在37℃下，當DNA含量較低時，效價存在損失。在34℃下，病毒效價無損失且DNA含量較低。而在25℃及2至8℃下，病毒效價無損失且DNA降解亦較少。因此，選擇34℃用於製程。
1.登革熱病毒生長於Vero細胞上。因此需要自收穫物去除雜質。
2.雜質如宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白質、殘餘BSA及殘餘全能核酸酶。
3.切向流過濾(tangential flow filtration；TFF)係用於去除該等雜質之製程。
4.使經全能核酸酶處理之收穫物經受TFF以去除雜質。
在初始實驗中，使用300 KD之Millipore V篩盒及Pall T系列300 KD進行TFF。觀察到滲透物中病毒損失>3.5 log。因此，計劃將盒大小改為100 KD。
在該等實驗期間，觀察到在Millipore盒中在滲透物中沒有病毒。
基於結果對TFF進行各種試驗後，僅使用10×濃縮製程之100KD V screen Merck Millipore盒給出期望產物。將病毒濃縮以減少對散裝疫苗之儲存空間之需求，並去除雜質。基於下表，很明顯，在全能核酸酶處理及TFF後，沒有顯著的病毒效價損失及顯著的宿主細胞DNA去除。
CVP：澄清的病毒彙集物(過濾後之收穫物)
BCVP：經全能核酸酶處理之CVP
CMVP：澄清的單價病毒彙集物(TFF後、添加穩定劑及0.2μ過濾後)
使用各種穩定調配物測試減毒活黃病毒免疫原性組成物之穩定性作為功效損失(例如效價損失或Log10 PFU/劑量)之函數。
使用如表11及12中所說明之不同的穩定劑組合來調配登革熱單價原液。該等穩定劑之主要組分係明膠、山梨醇、蔗糖、甘胺酸、磷酸鹽(KH2PO4、K2HPO4)、麩胺酸鹽、乳白蛋白水解物(Lactalbumin hydrolysate；LAH)及胺基酸如L-組胺酸、L-精胺酸鹽酸鹽、L-丙胺酸、三甲基甘胺酸等。
穩定劑-II含有L-組胺酸(2.1%)、L-丙胺酸1%、三甲基甘胺酸(3%)、L-精胺酸鹽酸鹽(16%)、乳白蛋白水解物(3.5%)。
使用如下文所述之不同穩定劑組合來穩定所獲得TFF病毒濃縮物之體積：
使所有該等調配物經受37℃熱穩定性研究達7天。在0天、1天、3天、5天及7天間歇地測試樣品之感染效價，以CCID50表示。
各種液體調配物之感染效價之結果顯示各別登革熱病毒效價顯著降低，隨後完全喪失(在1至5天後)。
液體調配物無法保持穩定性促使嘗試凍乾調配物。將含有明膠+山梨醇+穩定劑II(穩定劑E)之登革熱單價原液凍乾且使該登革熱單價原液經受37℃熱穩定性研究達7天。在0天、1天、3天、5天及7天間歇地測試樣品之感染效價，以CCID50表示。感染效價之結果顯示
優於液體調配物之穩定性概況且顯著保持病毒效價。因此，凍乾登革熱單價調配物之方法成功地克服了較差穩定性之問題且發現病毒效價之損失顯著減小。
亦試驗了包含蔗糖+甘胺酸之另一穩定劑G；且對於所有四種登革熱病毒，凍乾調配物之形式係極好的。在0天、1天、3天、5天及7天間歇地測試樣品之感染效價，以CCID50表示。感染效價之結果顯示優於其他穩定劑(例如明膠+山梨醇+穩定劑II)之穩定性概況。另外，該穩定劑G易於製備及使用；此乃因其來源於非動物源。
NT-未測試
參考穩定性研究之所有上述結果，使用LYO 2(蔗糖及甘胺酸)獲得較佳穩定性概況。因此，將蔗糖及甘胺酸之穩定劑組成物進一步最佳化以得到更穩定之調配物。
對於登革熱疫苗開發，最初嘗試了各種不同的液體疫苗穩定劑調配物，但發現病毒在液體調配物中不穩定，且液體調配物在37℃下儲存5天內存在顯著的效價損
失。液體調配物不適用於登革熱疫苗。因此，進一步決定利用凍乾實施下一次登革熱疫苗原液試驗。
計劃對登革熱單價及四價原液實施不同的凍乾試驗，以研究穩定劑對疫苗調配物之適用性以及四價混合物中所有四種病毒血清型在低溫下儲存期間之穩定性。
研究試驗顯示，凍乾形式之病毒比液體形式之病毒更穩定，且如實例4中所說明，凍乾後未觀察到病毒效價損失。
選擇凍乾形式之登革熱疫苗，以獲得更佳之產品穩定性。凍乾試驗係藉由使用如實例4中所說明含有明膠-山梨醇或蔗糖-甘胺酸作為穩定劑之登革熱CMVP原液來實施。由於明膠來源於豬，現在疫苗中使用明膠存在一些倫理問題。其製備亦很複雜，需要在高溫下水解明膠。使用明膠-山梨醇穩定劑時，所有四種血清型之感染效價沒有一致性，且自解凍至凍乾步驟觀察到明顯病毒損失。
在用明膠+山梨醇+穩定劑II對登革熱原液進行一些凍乾試驗後，轉向如實例4中所說明之蔗糖+甘胺酸，且凍乾試驗顯示LYO 2調配物之病毒穩定性優於LYO 1調配物。
在試驗1至7中，凍乾週期持續時間自56小時之標準週期發生變化。凍乾週期小時數之減少對效價損失及水分含量具有效應。然而，病毒效價沒有重大損失；隨著週期時間之縮短，水分含量自2.50%增加至3.34%w/w。因此，凍乾週期持續時間設定在約56小時。
使用不同濃度之蔗糖及甘胺酸調配登革熱病毒單價原液(DEN 1、2、3、4)以獲得包含如表19中所附之蔗糖及甘胺酸濃度之最終調配物(SG1、SG2、SG3、SG4、SG5、SG6)。使用標準凍乾方案將經穩定之單價調配物凍乾。使如下表中所附之所有凍乾單價及四價登革熱病毒調配物經受37±1℃熱穩定性研究達14天。收集各別時間點之樣品且測試該等樣品之感染效價。
上文所提及之含有不同濃度之蔗糖及甘胺酸穩定劑之凍乾單價調配物之熱穩定性結果指示蔗糖及甘胺酸两者之濃度在維持病毒感染效價中起主要作用。
使用SG1及SG2調配物觀察到病毒效價差異相對較大。在所有四種血清型中，使用SG3、SG4、SG5、SG6調配物沒有觀察到顯著差異。然而，SG3(即5%蔗糖及5%甘胺酸調配物)係其他批次之穩定劑組成物之選擇。
使用如實例6中所附之蔗糖-甘胺酸(SG)組成物穩定具有血清型(DEN-1、DEN 2、DEN-3、DEN-4)組合之登革熱四價疫苗(DTV)(減毒活重組)，並根據實例5在3ml管狀USP 1型玻璃小瓶中進一步凍乾該疫苗。容器封閉系統係由溴丁基橡膠塞及可翻轉之鋁及塑膠蓋密封件組成。在上述容器封閉系統中評估SG穩定之疫苗之穩定性及品質，用於與支持DP之有效期之ICH要求一致之以下研究。
長期/實時穩定性研究之穩定性指示參數如下：
1.每一血清型之病毒效價
2.pH
3.水分含量
1.在凍乾後在2-8℃下高達12個月之登革熱四價疫苗穩定性數據：
估計在2-8℃下高達12個月之pH及水分含量。pH保持在7.6至7.8範圍內(第18圖)。儲存高達12個月後殘餘水分含量保持在3.0%w/w以下(第19圖)。
2.在凍乾後在25℃±2℃及60%±5%相對濕度下高達6個月之登革熱四價疫苗穩定性數據：
在25℃±2℃高達6個月(暴露後6個月)之初始及最終時間點估計pH及水分含量。與初始值相比，在加速條件下儲存6個月時pH值沒有變化(p<0.001)；平均值±3SD自7.60-7.79移動至7.54-7.71(第21圖)。儲存6個月後，殘餘水分含量保持在3% w/w之上限內，平均值±3SD為1.845-2.774%w/w(第22圖)。
3.在凍乾後在37℃±1℃下高達7天之登革熱四價疫苗穩定性數據：將各批次暴露於37℃±1℃達7天。滴定病毒血清型(DEN1-4)並計算效價損失。所有批次之效價損失係一致的。凍乾DTV中登革熱1至登革熱4血清型之病毒效價之平均Log10損失及標準偏差分別為0.604±0.117、0.607±0.066、0.548±0.130、0.684±0.109(第23圖)。
4.在凍乾後在42℃±1℃下高達7天之登革熱四價疫苗穩定性數據：
評估代表性批次之登革熱四價疫苗(DTV)(減毒活)之穩定性。使凍乾成品小瓶暴露於42℃熱應力條件下達7天。在暴露期結束時滴定每一病毒血清型(DEN1-4)，與初始效價進行比較，並計算效價損失。
5.在凍乾後在55℃±1℃下高達2天之登革熱四價疫苗穩定性數據：評估代表性批次之登革熱四價疫苗(Dengue Tetravalent Vaccine；DTV)(減毒活)之穩定性。使凍乾成品小瓶暴露於55℃熱應力條件下達2天。在暴露期結束時滴定每一病毒血清型(DEN1-4)，與初始效價進行比較，並計算效價損失。
儘管已就某些較佳實施例闡述了本發明，但熟習此項技術者應明瞭，可在不背離如所附申請專利範圍中所定義之本發明範圍的情況下作出各種改變及修改。
Claims (29)
- 一種免疫原性組成物，包含：a)一或多種減毒活登革熱(DEN)病毒；b)蔗糖，3至6%(w/v)；以及c)甘胺酸，3至6%(w/v)。
- 如請求項1所述之免疫原性組成物，其中該一或多種減毒活登革熱(DEN)病毒包含複數種選自DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4之群之不同血清型的減毒活登革熱(DEN)病毒。
- 如請求項1所述之免疫原性組成物，其中該減毒活登革熱(DEN)病毒為包含登革熱病毒血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4之四價。
- 如請求項1所述之免疫原性組成物，其中該減毒活登革熱(DEN)病毒係包含以下序列之重組登革熱病毒及/或嵌合登革熱病毒：編碼來自一第一登革熱病毒之至少一種結構蛋白之一第一核苷酸序列，以及編碼來自一第二登革熱病毒之非結構蛋白之一第二核苷酸序列。
- 如請求項3至4中任一項所述之免疫原性組成物，其中該等減毒活登革熱病毒血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4在登革熱病毒基因組之 3'非翻譯區中攜載30個核苷酸缺失，稱為Δ30突變，及/或攜載31個核苷酸缺失，稱為Δ31突變。
- 如請求項3至4中任一項所述之免疫原性組成物，其中該等減毒活登革熱病毒血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4具有一種表型，該表型在Vero細胞或人類肝細胞系HuH-7中是溫度敏感的。
- 如請求項1至4中任一項所述之免疫原性組成物，其中該組成物係凍乾的(冷凍-乾燥)。
- 如請求項7所述之免疫原性組成物，其中該凍乾組成物使用一水溶液復水，該水溶液選自鹽水或WFI(注射用水)，以及經復水的該免疫原性組成物之最終pH為7至8。
- 如請求項1至4中任一項所述之免疫原性組成物，其中該登革熱病毒係以不小於2.5 log10 PFU/0.5ml之一劑量存在。
- 一種免疫原性組成物，包含：a)登革熱病毒血清型1(rDEN 1Δ30)，b)登革熱病毒血清型2(rDEN 2/4Δ30)，c)登革熱病毒血清型3(rDEN 3Δ30/31)，d)登革熱病毒血清型4(rDEN 4Δ30)，e)蔗糖，3至6%(w/v)，以及 f)甘胺酸，3至6%(w/v)。
- 如請求項10所述之免疫原性組成物，包含：a)登革熱病毒血清型1(rDEN 1Δ30)，b)登革熱病毒血清型2(rDEN 2/4Δ30)，c)登革熱病毒血清型3(rDEN 3Δ30/31)，d)登革熱病毒血清型4(rDEN 4Δ30)，e)蔗糖，4至5%(w/v)，以及f)甘胺酸，4至5%(w/v)。
- 如請求項10所述之免疫原性組成物，包含：a)登革熱病毒血清型1(rDEN 1Δ30)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml，b)登革熱病毒血清型2(rDEN 2/4Δ30)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml，c)登革熱病毒血清型3(rDEN 3Δ30/31)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml，d)登革熱病毒血清型4(rDEN 4Δ30)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml，e)蔗糖，5%(w/v)，以及f)甘胺酸，5%(w/v)。
- 如請求項10所述之免疫原性組成物，包含：a)登革熱病毒血清型1(rDEN 1Δ30)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml，b)登革熱病毒血清型2(rDEN2/4Δ30)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml，c)登革熱病毒血清型3(rDEN 3Δ30/31)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml，d)登革熱病毒血清型4(rDEN 4Δ30)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml，e)蔗糖，4.5%(w/v)，以及f)甘胺酸，5%(w/v)。
- 如請求項10所述之免疫原性組成物，包含：a)登革熱病毒血清型1(rDEN 1Δ30)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml，b)登革熱病毒血清型2(rDEN 2/4Δ30)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml，c)登革熱病毒血清型3(rDEN 3Δ30/31)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml，d)登革熱病毒血清型4(rDEN 4Δ30)，NLT 2.5 log10 PFU/0.5ml， e)蔗糖，6%(w/v)，以及f)甘胺酸，6%(w/v)。
- 一種製造一免疫原性組成物之方法，該免疫原性組成物包含：a.一或多種減毒活登革熱(DEN)病毒；b.蔗糖，3至6%(w/v)；以及c.甘胺酸，3至6%(w/v)，該方法包含以下步驟：a)在含有漢克氏鹽溶液(Hanks salt solution)之MEM中多次收穫包含登革熱病毒之至少一種血清型之上清液，該MEM另外含有右旋糖、L-麩醯胺酸及碳酸氫鈉；b)藉由直流過濾(DFF)經由至少一個澄清過濾器過濾該病毒收穫物，該澄清過濾器具有6微米至0.45微米之間之一孔徑；c)在34±1℃下使用具有濃度介於0.5單位/ml至5單位/ml範圍內之全能核酸酶(Benzonase)將該病毒收穫物處理至少2小時；d)使用一分子量截留(MWCO)為100kDa之一膜藉由切向流過濾(TFF)來濃縮該病毒收穫物；e)使用包含一濃度為3至6%(w/v)之蔗糖及一濃度為3至6%(w/v)之甘胺酸之一穩定劑穩定該病 毒收穫物，以形成一經穩定的病毒收穫物；以及f)藉由DFF經由至少一個澄清過濾器對該經穩定的病毒收穫物滅菌，該澄清過濾器具有約0.8微米至約0.2微米之間之一孔徑，以形成經純化病毒之一經滅菌的病毒收穫物；其中經純化病毒之總回收率為至少50%。
- 如請求項15所述之方法，其中將步驟f)的該經滅菌的病毒收穫物進一步進行冷凍乾燥，該冷凍乾燥包含冷凍、初級乾燥以及二級乾燥之步驟，其中a.該冷凍步驟包含在-45℃下冷凍690分鐘至930分鐘，b.該初級乾燥步驟包含以+0.5℃/分鐘斜升至1.0℃/分鐘以達成-25℃之儲存溫度，保持1800分鐘至1980分鐘，以及c.該二級乾燥步驟包含以+0.5℃/分鐘斜升至1.0℃/分鐘以達成+25℃之儲存溫度，保持420分鐘至540分鐘。
- 如請求項15所述之方法，其中該病毒收穫物係用濃度為1.25單位/ml之全能核酸酶處理。
- 如請求項15所述之方法，其中使該病毒收穫物經受切向流過濾(TFF)，產生病毒收穫物之至少10×濃縮物。
- 如請求項15所述之方法，其中該穩定劑包含一濃度為4至5%(w/v)之蔗糖及一濃度為4至5%(w/v)之甘胺酸。
- 如請求項15所述之方法，其中該穩定劑包含一濃度為5%(w/v)之蔗糖及一濃度為5%(w/v)之甘胺酸。
- 如請求項15所述之方法，其中該穩定劑包含一濃度為4.5%(w/v)之蔗糖及一濃度為5%(w/v)之甘胺酸。
- 如請求項15所述之方法，其中該穩定劑包含一濃度為6%(w/v)之蔗糖及一濃度為6%(w/v)之甘胺酸。
- 如請求項15所述之方法，其中該冷凍步驟包含在-45℃下冷凍60分鐘。
- 如請求項15所述之方法，其中該初級乾燥步驟包含以+0.5℃/分鐘斜升至1.0℃/分鐘以達成-32℃之儲存溫度，保持600分鐘至1800分鐘。
- 如請求項15所述之方法，其中該二級乾燥步驟包含以+0.5℃/分鐘斜升至1.0℃/分鐘以達成+25℃之儲存溫度，保持360分鐘至600分鐘。
- 如請求項15至25中任一項所述之方法，其中該凍乾的免疫原性組成物在25℃下儲存6個月。
- 如請求項15至25中任一項所述之方法，其中該凍乾的免疫原性組成物在37℃下儲存14天。
- 如請求項15至25中任一項所述之方法，其中該凍乾的免疫原性組成物在42℃下儲存2天。
- 一種套組：a.包含一第一容器，該第一容器含有一免疫原性組成物，該免疫原性組成物包含：i.一或多種減毒活登革熱(DEN)病毒；ii.蔗糖，3至6%(w/v)；以及iii.甘胺酸，3至6%(w/v)，以及b.一第二容器，該第二容器含有用於復水該凍乾(冷凍-乾燥)免疫原性組成物之一水溶液，該溶液選自鹽水或WFI(注射用水)。
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