JP2020537691A - 弱毒生組換えフラビウイルスなどから成る安定したワクチン組成物およびその調製方法 - Google Patents

弱毒生組換えフラビウイルスなどから成る安定したワクチン組成物およびその調製方法 Download PDF

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Abstract

弱毒生組み換フラビウイルス（好ましくは弱毒生組み換えデング熱ウイルス）、少なくとも1つの炭水化物、少なくとも1つのアミノ酸を含む安定した凍結乾燥免疫原性組成物は、急速凍結乾燥処理に特に適しており、処理後の組成物は、ウイルスの生存能力、免疫原性および安定性を含む所望のウイルス特性を維持する。前記免疫原性組成物は、防腐剤、ポリマーおよび界面活性剤を含んでいない。前記安定した凍結乾燥免疫原性組成物の製造方法。

Description

発明の分野
本開示は、バイオテクノロジー分野、より具体的には、弱毒生フラビウイルスワクチン組成物およびその調製方法に関する。本開示はさらに、弱毒生フラビウイルスワクチンの生産分野における改善された方法論に関する。
フラビウイルスゲノムは、1つのオープンリーディングフレームを含む11キロベースの、1本鎖、プラスセンス、RNA（リボ核酸）分子で構成さている。RNAは、次のような10以上の遺伝子産物に加工されるポリタンパク質に翻訳される：3つの構造タンパク質（ヌクレオカプシドまたはコア（C）、前膜（prM）、エンベロープ（E））と7つの非構造（NS）タンパク質（NS 1、2A、2B、3、4A、4B、5）。(執筆者：Lindenbach BDおよびその他の人々、分野：ウイルス学、編集者：Knipe DM, Howley PM, Griffin PEおよびその他の人々、フィラデルフィア：Wolters Kluwer、およびLippencott Williams、Wilkins；2007年、1101-1152ページ）。これらのフラビウイルス中の多数は、受容者へのウイルス感染手段として節足動物（蚊、ダニなど）を使用する。それらの節足動物媒介ウイルス（すなわち、アルボウイルス）は、ヒトに対する高い病原性に起因して、主要な世界的健康問題を構成している。（執筆者：Fernandez-Garcia MDおよびその他の人々、題名：細胞宿主病原菌、2009年、5:318-328）。より具体的には、ヒトのアルボウイルス病原体には、黄熱病（YF）、日本脳炎（JE）、デング熱（DEN）、西ナイル（WN）、および蚊や媒介ダニ、鳥類および/または哺乳類の保菌宿主などの自然界のライフサイクルに存在するダニ媒介脳炎（TBE）ウイルスが含まれる。（執筆者：Gubler Dおよびその他の人々、分野：ウイルス学、編集者：Knipe DM, Howley PM, Griffin PEおよびその他の人々、第5版、フィラデルフィア：Wolters Kluwer、およびLippencott Williams、Wilkins；2007年、1153-1252ページ）。
更に、デング熱ウイルス（DENV）は世界的に最も重要なヒトアルボウイルスになり、毎年5億件のデング熱が発生すると推定されており、デング出血熱/デング熱ショック症候群と呼ばれる重篤な疾患が200万件以上発生し、21000人が死亡している。デング熱ウイルスには4つの血清型（DENV1、DENV2、DENV3、およびDENV4）がある。
ワクチンおよび他の目的のための弱毒生組み換えフラビウイルス調合剤を製造するための多くの方法が知られている。実験室用の生存ウイルスの凍結、凍結乾燥、または保存に有用な組成物および方法と、それらの活性を維持するために使用するワクチンも、知られている。
フラビウイルスの水性組成物は、5℃以上の温度で長期間良好なウイルス安定性を維持できない。例えば、YF-DEN（黄熱デング熱）キメラを37°Cで1日間保存した後、液体では安定するが、バルク水性組成物は、4 log以上喪失する。今日、熱安定性は亜熱帯デング熱流行国で深刻な問題になっており、これらの諸国でのコールドチェーン条件での輸送が困難になっている。
凍結乾燥はワクチン安定化の一般的な方法である。しかし、凍結乾燥はウイルスの効能を低下させる。効能の損失率は温度に依存する。生ウイルスは、浸透圧、熱、真空の衝撃を受けやすい。エンベロープウイルスは脂質2重層を持っており、この層の脆弱性が高いので、ウイルス成分の安定性が低いと考えられている。生ウイルスは、凍結、1次乾燥、2次乾燥などの凍結乾燥段階で、ウイルスの物理化学的安定性に影響を与える可能性のある多様のなストレスの影響を受ける。それらの構造による、凍結乾燥中の効能の喪失は、タンパク質の不安定化（例：展開、分解、および凝集）、核酸の分解、脂質層の変化（例：相転移、機械的損傷）、および内部の変化（氷生成）に関連するストレス、および外部（pHおよび浸透圧の変化）ウイルス環境に起因する可能性がある。凍結乾燥の脱水段階で、タンパク質の水素結合構造が崩壊し、ウイルスエピトープのアミノ酸成分の移動度が増加する。1部の例では、凍結乾燥によりウイルスの効能が最大40％喪失されると報告されている。
ウイルス分子の複雑さと、多様な不安定化経路に起因する、凍結乾燥中の医薬ペプチド、タンパク質およびDNAのストレス機構と安定化戦略については多くの情報を利用できるのであるが、凍結乾燥中及びその後の抗原構造の物理化学的変化の測定を可能にする分析技術の欠如は、ウイルスが特別な凍結乾燥の課題を引き起すことを意味する。凍結乾燥中の弱毒生ウイルスワクチンの不安定化メカニズムと保護メカニズムはよく知られていない。
2015年にHansenおよびその他の人々は、生ウイルスワクチンの凍結乾燥：レビュー（Hansenおよびその他の人々、ワクチン33、2015年、5507-5519ページ）において、いくつかの凍結乾燥ウイルスワクチン製剤のコンパイルを開示した。その主要製剤法は、凍結乾燥ウイルスワクチンを得るための糖アルコール/タンパク質添加剤（すなわち、スクロース+トレハロース、ソルビトール、加水分解ゼラチン、ラクトアルブミン加水分解物）の優先的使用を述べている。
以下のフラビウイルスワクチン製剤が既に報告されている。1）ソルビトール、トレハロース、尿素、2）ラクトース、ソルビトール、HAS；3）ラクトース、マンニトール、HAS；4）ポロキサマー、ヒトアルブミン、トレハロース、PBS；5）トレハロース、組み換えHSA、F127（ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロック共重合体）。
HSAの場合、これらの材料が危険にさらされているヒトまたは動物の供給源に由来する場合、これらの材料を含めると潜在的な安全上の懸念が生じる可能性がある。このような追加されたタンパク質は、主に2つの理由で懸念されている。最初の懸念は、動物およびヒト由来のタンパク質が1つ以上の外来性物質を含む可能性から生じている。2番目の懸念は、動物またはヒト由来のタンパク質が感受性の高い個人にアレルギー反応を引き起こす可能性から生じている。また、概に報告された凍結乾燥ワクチン製剤法はタンパク質を使用しており、これは、高収量をサポートするプロセスを使用して生産されたとしても、製剤コストの関連事項に影響を及ぼす。「ワクチンが低所得地域で広く採用されるためには、ワクチンとその安定剤などの成分のコストを低く保つことが重要です。また、規制および安全性の観点から、使用される賦形剤および安定剤が動物由来の物質も動物成分も含まないことも重要です。動物由来の化合物は、スカーピー・プリオン・タンパク質（PrPSC）とクロイツェフェルト・ヤコブ病（vCJD）の新しい変異による汚染の可能性があるため、潜在的な危険を表している。
製剤に使用される非イオン性界面活性剤には、TritonTMX-100、Pluronic(R)F-68、F-88、およびF-127（ポロキサマー）、Brij 35（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）、ステアリン酸ポリオキシル40、Cremophor(R)EL、α-トコフェロールTPGSが含まれる。上記の界面活性剤は、すべてがポリオキシエチレン部分を含んでいるため、程度の差はあるが、ポリオキシエチレン部分が自動酸化して反応性過酸化物を生成し、これが不必要なタンパク質免疫原性の増加を引き起こすという事実上の共通点を持っている。（参考資料：Edward T. Maggioおよびその他の人々；ポリソルベート、過酸化物、タンパク質凝集、免疫原性−高まる懸念；賦形剤と食品化学剤学会誌 3(2):46-53；2012）。
PVPは、弱毒生ウイルス製剤を不安定にすることが報告されている。（参考資料：JA Whiteおよびその他の人々；弱毒生インフルエンザワクチンの安定した液体製剤の開発；ワクチン第34巻、第32号、2016年7月12日、3676〜3683ページ）。
トレハロースは高価であり、安定性を得るためには、他の糖やタンパク質添加物（ゼラチン）と組み合わせる必要がある。また、凍結乾燥ワクチンの保存期間の安定性を高める目的において、他の安定剤がトレハロースよりも優れている。
ソルビトールはガラス転移温度（Tg）（-1.6℃）が低いため、主な製剤成分として使用できない。ソルビトールの低いTgは、その用途を制限している。ソルビトールが、安定性を実現するためには、他の糖やタンパク質添加物（ゼラチン）と組み合わせる必要がある。
典型的に、組み換えウイルスは、カゼインおよび/またはコラーゲンの加水分解物を含む凍結乾燥ペレットとして、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に保存されている。次に、これらのペレットは、0.4〜0.9％NaClなどの薬学的に許容される溶液で再水和される。しかしながら、当技術分野で周知の通り、それらの製剤に関連する重大な欠点がある。これらの欠点の中には、不完全に定義された化学成分、複雑な準備手順、高コスト、およびウイルス特定の所望の特性を維持できないことなどがある。
以前に開発されたフラビウイルスワクチン製剤は、2〜8℃で6か月間、25℃で7日間、37℃で1〜2日間安定していた。最小数の賦形剤を含み、フラビウイルスワクチン、特に弱毒生組み換え/キメラデング熱ウイルスに長期熱安定性を付与する製剤を開発する必要性が依然として存在する。
そのような組成物/製剤およびそれを調製するためのプロセスは、本明細書に記載されている。
概要
本開示は、少なくとも1つの弱毒生フラビウイルス、少なくとも1つの炭水化物、および少なくとも1つのアミノ酸を含む免疫原性組成物を提供し、ここで組成物は急速凍結乾燥処理を受けやすく、再構成された組成物はウイルス生存率、免疫原性および安定性を含むウイルスの所望の特性を保存する。
本開示は、より具体的に、以下を含む凍結乾燥免疫原性組成物に関する：
a)弱毒生組み換え/キメラデング熱ウイルス、ここで使用される弱毒生デング熱ウイルス株は、rDEN1Δ30-1545； rDEN2 /4Δ30（ME）-1495、7163；米国国立衛生研究所（NIH）で入手したrDEN3Δ30/31-7164、rDEN4Δ30-7132、7143、8308である。
b)スクロースは、約3〜約6％w/v
c)グリシンは、約3〜約6％w/v
本開示はさらに、それらのワクチン組成物/製剤を調製するための方法を提供する。
目的
本明細書の少なくとも1つの実施形態が満たす本開示の各目的は、以下の通りである：
本開示の目的は、先行技術の１つ以上の問題を改善すること、または少なくとも有用な代替物を提供することである。
本開示の別の目的は、少なくとも１つのフラビウイルス、少なくとも1つの炭水化物、少なくとも1つのアミノ酸、および必要に応じて塩基を含む、安定化凍結乾燥ワクチン組成物/製剤を提供することである。ここで、組成物は、ウイルスの生存能力、免疫原性および安定性を含むウイルスの所望の特性を保存する。
本開示のさらに別の目的は、デング熱感染の治療または予防に特に適した、1つの弱毒生組み換え/キメラデング熱ウイルス血清型（DEN 1、DEN 2、DEN 3、DEN 4）を含む安定化凍結乾燥ワクチン組成物/製剤を提供すること、または、その臨床症状の発症または進行を予防、改善、または遅延させることである。
本開示のさらにもう1つの目的は、そのようなワクチン組成物/製剤を製造するための方法を提供することである。
本開示の他の目的および利点は、本開示の範囲を限定することを意図しない以下の説明からより明らかになるであろう。
詳細な説明
本開示は異なる実施形態の影響を受けやすい場合もあるので、図示された特定の実施形態と次の詳細な説明は、本開示は原理の例示と見なすことができること、および本明細書で説明および開示された範囲を制限する意図がないことを理解するものとする。
デング熱ウイルス株のRNA配列 デング熱ウイルスビリオンの構造 デング熱ビリオン株の構造 DEN1ウイルスLog収量力価(CCID50/ml)（多回採集と単回採集） DEN2、3、4ウイルスLog収量力価(CCID50/ml)（多回採集と単回採集） ベンゾナーゼ濃度がDNA含有量に与える影響 温度が細胞DNA含有量およびウイルス力価に与える影響 DEN-1力価CCID50/ml（液体と冷凍乾燥） DEN-2力価CCID50/ml（液体と冷凍乾燥） DEN-3力価CCID50/ml（液体と冷凍乾燥） DEN-4力価CCID50/ml（液体と冷凍乾燥） 冷凍乾燥サイクル 冷凍乾燥後のDEN1力価Log10 pfu/ml 冷凍乾燥後のDEN-2力価Log10 pfu/ml 冷凍乾燥後のDEN-3力価Log10 pfu/ml 冷凍乾燥後のDEN-4力価Log10 pfu/ml 冷凍乾燥後2〜8℃で12か月間保管したDEN-1力価Log10 pfu/0.5 mlのデータ 冷凍乾燥後2〜8℃で12か月間保管したDEN-2力価Log10 pfu/0.5 mlのデータ 冷凍乾燥後2〜8℃で12か月間保管したDEN-3力価Log10 pfu/0.5 mlのデータ 冷凍乾燥後2〜8℃で12か月間保管したDEN-4力価Log10 pfu/0.5 mlのデータ 冷凍乾燥後2〜8℃で12か月間保管したデング熱4価ワクチンのpHデータ 冷凍乾燥後2〜8℃で12か月間保管したデング熱4価ワクチンの残留水分データ 冷凍乾燥後250Cア2で6か月間保管したDEN-1力価Log10 pfu/0.5 mlのデータ 冷凍乾燥後25ア2で6か月間保管したDEN-2力価Log10 pfu/0.5 mlのデータ 冷凍乾燥後25ア2で6か月間保管したDEN-3力価Log10 pfu/0.5 mlのデータ 冷凍乾燥後25ア2で6か月間保管したDEN-4力価Log10 pfu/0.5 mlのデータ 冷凍乾燥後25ア2で6か月間保管したデング熱4価ワクチンのpHデータ 冷凍乾燥後25ア2で6か月間保管したデング熱4価ワクチンの残留水分データ 冷凍乾燥後37ア1で7日保管したデング熱4価ワクチンの安定性データ 冷凍乾燥後42ア1で7日保管したデング熱4価ワクチンの安定性データ
本開示の第1の実施形態によれば、免疫原性組成物は1つまたは複数の弱毒生フラビウイルス、1つまたは複数の炭水化物、1つまたは複数のアミノ酸を含み、ここで本組成物は急速凍結乾燥処理を受けやすく、再構成された組成物はウイルス生存率、免疫原性および安定性を含むウイルスの所望の特性を保存する。
「生きている」という用語は、その従来の意味で使用され、生ウイルスは、不活化されていないウイルス、すなわち、許容細胞上で複製することができるウイルスである。弱毒生フラビウイルスは、動物またはヒトにおいて類似する野生型ウイルスに起因する疾患を誘発せず、特定の免疫反応を誘発することができるウイルスである。
本開示の第2の実施形態によれば、1つまたは複数の弱毒生フラビウイルスは、組み換えフラビウイルスおよび/またはキメラフラビウイルスである。
本開示の第3の実施形態によれば、1つまたは複数の弱毒生フラビウイルスは、デング熱（DEN）ウイルス、黄熱病（YF）ウイルス、日本脳炎（JE）ウイルス、クンジンウイルス、西ナイル（WN）ウイルス、ダニ媒介性脳炎（TBE）ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、ジカウイルス、またはそれらに関連するフラビウイルスからなる群から選択される。
さらに、第3の実施形態の好ましい態様によれば、1つまたは複数の弱毒生フラビウイルスはデング熱（DEN）ウイルスであって、DEN-1、DEN-2、DEN-3およびDEN-4の群から選択される異なる血清型の随意の数の弱毒生デング熱（DEN）ウイルスである。
本開示の第4の実施形態によれば、1つまたは複数の弱毒生フラビウイルスは、弱毒生キメラ/組み換え黄熱病（YF）ウイルスおよび/または弱毒生キメラ/組み換え生日本脳炎（JE）ウイルスおよび/または弱毒生キメラ/組み換えデング熱（DEN）ウイルス、および/または弱毒生キメラ/組み換え西ナイル（WN）ウイルスおよび/または弱毒生キメラ/組み換えダニ媒介脳炎（TBE）ウイルスおよび/またはキメラデング熱ウイルス（黄熱デング熱）ウイルス、および/またはキメラYF-WN（黄熱−西ナイル）ウイルスおよび/またはキメラYF-JE（黄熱−日本脳炎） ウイルスまたはその関連フラビウイルスからなる群から選択される。
さらに第4の実施形態の好ましい態様によれば、1つまたは複数の弱毒生フラビウイルスは、弱毒生キメラ/組み換えデング熱（DEN）ウイルスである。
本開示の第5の実施形態によれば、免疫原性組成物で使用される弱毒生組み換えデング熱ウイルス/キメラデング熱ウイルスを以下に記載する：
A)NIH組み換え株の簡単な説明/その構成：
以下に説明する4つのデング熱ウイルス血清型（DEN 1、DEN 2、DEN 3、およびDEN 4）のすべての弱毒ワクチン株の生成に関連するすべての活動は、米国NIHで実施された。WO2002095075およびWO2008022196の内容は、全体として本明細書に組み込まれている。
遺伝子の起源
1.デング熱ウイルス血清型1〜4の各弱毒株（rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30（ME）、rDEN3Δ30/31およびrDEN4Δ30）は、野生型株の非翻訳3'末端から、約30ヌクレオチド（Δ30）（DEN-3の場合、31ヌクレオチド（Δ31）を追加）を削除することにより開発された。また、Δ31変異は、Δ30/31欠失変異の組み合わせにおけるΔ30またはΔ31の寄与を識別するために、単独で生成することもできる。
2.DEN 2ウイルス血清型は、弱毒化されたDEN 4血清型のMおよびEタンパク質をDEN 2 MおよびEタンパク質の血清型と置換して開発された。
3.4つの株はすべて、構造的に35〜50ナノメートルサイズのプラスセンスRNAウイルスで覆われている。
4.本明細書で使用するrDEN1Δ30-1545株は、ウイルスポリタンパク質中のアミノ酸残基番号484（A1545G変異）で単一のLys→Arg変異をコード化するために使用される。
5.本明細書で使用するrDEN2/4Δ30（ME）-1495、7163株は、ウイルスポリタンパク質中のアミノ酸残基番号186（C1495T変異）でのSer→Phe変異、およびウイルス性ポリタンパク質中のアミノ酸残基番号112でのLeu→Phe変異（A7163C変異）をコード化するために使用される。
6.rDEN3Δ30/31には、元のΔ30の欠失と、元のTL-2およびTL-3構造の両方を削除する非連続の31ヌクレオチドの欠失が含まれる。本明細書で使用する結果として得られたrDEN3Δ30/31-7164株は、ウイルスポリタンパク質中のウイルスポリタンパク質中のアミノ酸残基番号115でのVal→Ala変異（T7164C変異）をコード化するために使用される。
7.本明細書で使用するrDEN4Δ30-7132、7143、8308株は、ウイルス性ポリタンパク質中の、アミノ酸残基番号102（C7132T変異）でのThr→Ile変異、アミノ酸残基番号112（A7163C変異）でのLeu→Phe変異、およびアミノ酸残基番号249（A8308G変異）でのLys→Arg変異をコード化するために使用される。
1連の図は、DENワクチン株のRNA配列とウイルス構造を示している：
図1、2、3を参照
ワクチン株の生成に使用された野生型株を以下の表に示す。
B)変換手順：
デング熱ウイルスワクチン株の生成のために、本質上以下の段階が続行された：
1.野生型DENウイルスの完全長cDNAコピーを含むプラスミドは、逆転写酵素とPCRを使用して短いDNAセグメントを生成することにより開発された。このようにして得た断片を適切に連結反応させ、プラスミドにクローニングされた野生型DENの完全長ゲノムcDNA鎖からなる無傷の二本鎖DNAを生成した。
2.Δ30変異は、3'UTRのサブフラグメントを変異させ、野生型DENの3'UTRをΔ30領域を含むサブフラグメントと置換して挿入された。特定の突然変異は部位特異性PCR突然変異の誘発によって導入された。
3.DEN 2ワクチン株を生成するため、DEN 2の構造遺伝子MおよびEをプラスミドにクローニングした後、それをΔ30変異を含むDEN 4クローンプラスミドの構造遺伝子と置換するために使用した。DEN 3ワクチン株の生成のために、30および31ヌクレオチドの2つの欠失が野生型クローンに導入された。
4.AmpliCap SP6 Message Maker Kit（EpiCentre Technologies、Madison）を使用して線形化プラスミドからゲノム長のキャップ付きRNA転写産物を合成し、RNeasy Miniキット（Qiagen、Valencia、CA）を使用してRNAを精製した。ベロ細胞（デング3の場合はC6 / 36）に、DOTAPリポソームトランスフェクション試薬（Roche, Indianapolis, IN）を使用して精製RNA転写物をトランスフェクションし、所望のウイルスを回収した。救出されたウイルスは、ベロ細胞での種ウイルスの生成のために、増幅、最終希釈クローニング、および最終増幅された。各株について行われた増幅および最終希釈のサイクル数の詳細は、以下の表2に示されている。
*さらなる増幅および最終希釈クローニングのすべての操作はベロ細胞で行われた。
第5の実施形態の第1の態様によれば、キメラウイルスは、上記で定義された弱毒生ウイルスの特徴を示すという特殊性を持っている。したがって、本開示の文脈において、エンベロープタンパク質または1つ以上のフラビウイルスの1つ以上のエンベロープタンパク質の1つ以上のエピトープを発現し、その株または上記エンベロープタンパク質または上記エピトープ中の少なくとも1つの株を中和する抗体を含む特定の免疫応答を誘導するために任意のキメラウイルスを使用することが可能である。
第5の実施形態の第2の態様によれば、弱毒生組み換えデング熱ウイルス核酸は、ベロ細胞またはヒト肝細胞株HuH-7における温度感受性、蚊細胞またはヒト肝細胞株HuH-7における宿主細胞制限、ベロ細胞における複製の改善のための宿主細胞適応、またはマウスまたはサルにおける弱毒化からなる群から選択される表現型を有する変異体を生成する変異をさらに含む。ここで、組成物は以下の群から選択されるウイルス株を含む：
(1) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(2) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(3) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(4) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(5) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(6) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(7) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(8) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(9) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(10) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(11) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(12) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(13) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(14) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(15) rDEMΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(16) rDENlΔ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(17) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(18) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(19) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(20) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(21) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(22) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(23) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(24) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(25) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(26) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(27) rDEMΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(28) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(29) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(30) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(31) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(32) rDENlΔ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(33) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(34) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(35) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(36) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(37) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(38) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(39) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(40) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(41) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(42) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(43) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(44) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(45) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(46) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(47) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(48) rDENlΔ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(49) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(50) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(51) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(52) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(53) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(54) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(55) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(56) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(57) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(58) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(59) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(60) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(61) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(62) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(63) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(64) rDENlΔ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(65) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(66) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(67) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(68) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(69) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(70) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(71) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(72) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(73) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(74) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(75) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(76) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(77) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(78) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(79) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30, i
(80) rDENl/2Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(81) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(82) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(83) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(84) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(85) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(86) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(87) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(88) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(89) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30, ι
(90) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(91) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(92) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ305 rDEN4/3Δ30,
(93) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(94) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(95) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(96) rDENl/2Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(97) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(98) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(99) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30, ι
(100) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(101) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(102) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(103) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(104) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(105) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(106) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(107) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(108) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(109) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(110) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(111) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(112) rDENl/2Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(113) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(114) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(115) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(116) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(117) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(118) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(119) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(120) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(121) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ305 rDEN4Δ30,
(122) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(123) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(124) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(125) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(126) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(127) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(128) rDENl/2Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(129) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(130) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(131) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(132) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(133) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(134) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(135) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(136) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(137) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(138) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(139) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(140) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(141) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(142) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(143) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(144) rDENl/3Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(145) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(146) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(147) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(148) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(149) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(150) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(151) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(152) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(153) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(154) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(155) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(156) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(157) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(158) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(159) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(160) rDENl/3Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(161) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(162) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(163) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(164) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(165) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(166) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(167) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(168) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(169) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(170) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(171) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(172) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(173) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(174) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(175) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(176) rDENl/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(177) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(178) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(179) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(180) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(181) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(182) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(183) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(184) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(185) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(186) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(187) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(188) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(189) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(190) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(191) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(192) rDENl/3Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(193) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(194) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(195) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(196) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(197) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(198) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(199) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(200) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(201) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(202) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(203) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(204) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(205) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(206) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(207) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(208) rDENl/4Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(209) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(210) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(211) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(212) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(213) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(214) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(215) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(216) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(217) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(218) rDENl/4Δ305rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(219) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(220) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(221) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(222) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(223) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ305 rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(224) rDENl/4Δ30, rDEN2/lΔ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(225) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(226) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(227) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(228) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(229) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(230) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(231) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(232) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(233) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(234) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(235) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(236) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(237) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(238) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(239) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(240) rDENl/4Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30,
(241) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4Δ30,
(242) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/lΔ30,
(243) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/2Δ30,
(244) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30, rDEN4/3Δ30,
(245) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4Δ30,
(246) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/lΔ30,
(247) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/2Δ30,
(248) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/lΔ30, rDEN4/3Δ30,
(249) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4Δ30,
(250) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/lΔ30,
(251) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30,
(252) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/3Δ30,
(253) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30,
(254) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/lΔ30,
(255) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/2Δ30,
(256) rDENl/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4/3Δ30.
本開示の第6の実施形態によれば、1つまたは複数の炭水化物は、天然炭水化物、合成炭水化物、ポリオール、ガラス転移促進剤単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、およびこれらに対応する炭水化物誘導体、および化学的に修飾された炭水化物、ヒドロキシエチル澱粉および糖コポリマーなどの糖アルコール、ポリヒドロキシル化合物などを含むが、これらに限定されない。天然炭水化物と合成炭水化物の両方が使用に適している。合成炭水化物には、グリコシド結合がチオールまたは炭素結合で置換されたものが含まれるが、これらに限定されない。D型とL型炭水化物の両方を使用してもよい。炭水化物は非還元性でも還元性でもよい。還元性炭水化物が使用される場合、メイラード反応の阻害剤の添加が好ましい。組成物での使用に適した還元性炭水化物は、当技術分野で周知のものであって、グルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、マルツロースおよびラクツロースが含むが、これに限定されない。非還元性炭水化物は、糖アルコールおよび他の直鎖ポリアルコールから選択されるポリヒドロキシル化合物の非還元グリコシドを含むが、これらに限定されない。他の有用な炭水化物には、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、セリビオース、マンノビオースおよび糖アルコールが含まれる。糖アルコールグリコシドは、好ましくはモノグリコシド、特に二糖、例えばラクトース、マルトース、ラクツロースなどのジサッカリダーゼの還元により得られる化合物である。ガラス形成剤は、スクロース、マンニトール、トレハロース、マンノース、ラフィノース、ラクチトール、ラクトビオン酸、グルコース、マルツロース、イソマルツロース、マルトース、ラクトースソルビトール、デキストロース、フコースまたはそれらの組合わせからなる群から選択される。
さらに、第6の実施形態の好ましい態様によれば、免疫原性組成物は、1〜20％重量/容量、好ましくは1〜10％、より好ましくは3〜6％範囲の適切な炭水化物安定剤としてのスクロースを含むものであって。最も好ましくは5％（w/v）以下である。
本開示の第7の実施形態によれば、1つまたは複数のアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、グリシン、グルタミン、アルギニン、リジン、アラニン、またはアミノ酸の組合わせ、ペプチド、加水分解タンパク質、または血清アルブミンなどのタンパク質を含むが、これらに限定されない。
さらに、第7の実施形態の好ましい態様によれば、免疫原性組成物は、1〜20％重量/容量、好ましくは1〜10％、より好ましくは3〜6％の範囲、最も好ましくは5％（w/v）以下の適切なアミノ酸安定剤としてのグリシンを含む。
本開示の第8の実施形態によれば、免疫原性組成物は、炭酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩および酒石酸塩緩衝剤、ならびに所望のpHを達成するために選択された比率で、リン酸ナトリウムおよび/またはリン酸カリウムを含むリン酸緩衝剤などのより複雑な有機緩衝剤からなる群から選択される緩衝剤をさらに含んでもよい。別の例では、緩衝剤は、所望のpHを達成するために配合されたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、つまり「トリス」を含む。さらに別の例では、緩衝剤はハンク塩を含む最小限の必須培養基であってもよい。
本開示の第9の実施形態によれば、免疫原性組成物は、2-フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム（フェメロール）、フェノール、m-クレゾール、チオメルサール、ホルムアルデヒド、メチルおよびプロピルパラベン、ベンザルコニウムクロライド、ベンジルアルコール、クロロブタノール、p-クロル-m-クレゾール、またはベンジルアルコールまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される保存剤をさらに含んでもよい。
本開示の第10の実施形態によれば、免疫原性組成物は、界面活性剤、ポリマーおよび塩からなる群から選択される薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。界面活性剤の例には、ポリソルベート20、ポリソルベート80などの非イオン性界面活性剤が含まれてもよい。ポリマーの例には、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、シクロデキストリンなどが含まれてもよい。塩の例には、NaCl、MgCl2、KCl、CaCl2などが含まれてもよい。
本開示の第11の実施形態によれば、免疫原性組成物は、アルミニウム塩、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム、および硫酸アルミニウムカリウムからなる群から選択されるアジュバントをさらに含んでもよい。
本開示の第12の実施形態によれば、免疫原性組成物は、油と水の乳濁液、MF-59、リポソーム、リポ多糖、サポニン、リピドA、リピドA誘導体、モノホスホリルリピドA、3-脱アシル化モノホスホリルリピドA、AS01、AS03、オリゴヌクレオチド、少なくとも1つの非メチル化CpGおよび/またはリポソームを含むオリゴヌクレオチド、フロイントアジュバント、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ポリマー、ブロック共重合体を含むポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリマーp 1005、CRL-8300アジュバント、ムラミルジペプチド、TLR-4アゴニスト、フラジェリン、グラム陰性菌由来のフラジェリン、TLR-5アゴニスト、TLR-5受容体に結合可能なフラジェリンの断片、QS-21、ISCOMS、サポニンとステロールおよび脂質との組合わせからなる群から選択される免疫刺激成分をさらに含んでもよい。
本開示の第13の実施形態によれば、前記免疫原性組成物は凍結乾燥（フリーズドライ）される。
本開示の第14の実施形態によれば、凍結乾燥免疫原性組成物は、2〜8℃で12〜36か月間； 25℃で2〜6か月間；37℃で、1〜4週間；42℃で、2〜7日間；55℃で、2〜7日間安全である。
本開示の第15の実施形態によれば、凍結乾燥免疫原性組成物を再構成する方法は、場合によっては生理食塩水または注射用（WFI）水溶液を使用する凍結乾燥免疫原性組成物の再構成段階を含むことができる。
本開示の第16の実施形態によれば、再構成後の免疫原性組成物の最終pHは、pH6.0〜pH8.0の範囲であり；より好ましくは、pH7.0〜pH8.0の範囲であり；より好ましくは、pH7.0〜pH7.9の範囲であり；そして最も好ましくは、pH7.5〜pH7.9の範囲である。
本開示の第17の実施形態によれば、弱毒生キメラ/組み換え4価デング熱（DEN）ワクチン組成物を調製するためのプロセスは、以下の段階の任意のサブセット、または以下のすべての段階を含む：
a)ベロ細胞が復活した後、ハンク塩溶液と10％ウシ胎児血清を含む最小必須培養基（MEM）で成長するように調整した
b)ベロ細胞は、最初に組織培養フラスコ（細胞増殖に利用可能な表面積175cm2を持つTCF）で増幅され、ベロ細胞のマスターバンクとワーキングバンクを作成した
c) ワーキング細胞バンクからの凍結保存細胞を復活させ、増幅し、ローラーボトル（細胞の成長に利用できる850cm2の表面積）でさらに継代し、37±1℃で培養して単層を得た
d) ローラーボトル内のベロ細胞単層に、デング熱ウイルス血清型1、2、3、および4のワーキングシードを感染させた
e) すべてのローラーボトルを34±1℃で20分間培養した後、ハンク塩溶液と2％ウシ胎児血清を含む最小必須培養基（MEM）を使用して、RBあたり最大120mlの容量を追加した。さらに、すべてのローラーボトルを34±1℃で2日間、0.7RPMの回転速度で培養した。
f) 2日目に、ローラーボトル内の単層をウシ胎児血清を含まない新鮮なウイルス培養基で洗浄し、RBを34±1℃で3日間、それぞれ0.7RPMの回転速度で培養した
g) 感染後5日目に、感染したすべてのローラーボトルの細胞上清を採集し、ウシ胎児血清を含まない新鮮なウイルス培養基をボトルに再供給した；
h) 浄化された1価ウイルスプール（CMVP）を得るために、複数の採集物が個別に処理された。
i) 少なくとも1つの清澄化フィルターを介した直線流濾過（DFF）によるウイルス回収の濾過を実施した
j) ウイルスDNAを非特異性エンドヌクレアーゼで処理して細胞DNAを分解した
k) 処理されたウイルス採集物を接線流濾過した
l) 安定したウイルス採集物を形成するために、少なくとも1つのアミノ酸と少なくとも1つの炭水化物からなる安定剤でウイルス採集物を安定化した
m) 少なくとも1つの滅菌グレードのフィルターを介したDFFによる安定したウイルス回収の滅菌消毒をした
n) デング熱ウイルスの各血清型の浄化された1価ウイルスプール（CMVP）は、-60℃以下のポリカーボネートボトルに保存された
o) 4つすべてのウイルス血清型の浄化された1価ウイルスプール（CMVP）を一緒に混合してバイアルに充填し、凍結乾燥して製剤、すなわち、組み換えデング熱四価ワクチン（弱毒生）を得た。
第17の実施形態の第１の態様によれば、使用されたベロ細胞株は、ATCC CCL-81（cGMPVero、アフリカミドリザル由来の腎臓細胞（セルコピテクスエオチオプス；ATCC、バージニア州マナッサスから入手可能）であった。
第17の実施形態の第2の態様によれば、投入材料を廃棄して別々に処理する前に、適切な時間間隔で約4〜5回、より好ましくは5日目、7日目、9日目および11日目に4回、複数の採集を実施して浄化された1価ウイルスプール（CMVP）を得た。多回採集の場合、同量の投入材料が従来の単回採集方法と比較してより高い収量に貢献する。これはまた、上流処理、すなわち感染に対する細胞の増幅のための時間と総生産コストを節約する。
第17の実施形態の第3の態様によれば、ウイルス培養基は、デキストロース、L-グルタミンおよび重炭酸ナトリウムをさらに含むハンク塩溶液を含む最小必須培養基（MEM）からなっている。
第17の実施形態の第4の態様によれば、ウイルスを含有する培養基は、典型的には孔径が減少する（例えば、6 μ, 0.8μ, 0.45 μ, 0.2 μ）フィルターを通して浄化される。適切な市販のフィルターおよび濾過装置は、当技術分野でよく知られており、当業者が選択することができる。例示的な濾過装置としては、例えば、Millipak (Millipore)、Kleenpak (Pall)、およびSartobranTM P濾過装置が挙げられる。
第17の実施形態の第5の態様によれば、濾過された採集物は非特異性エンドヌクレアーゼで処理されているが、最も好ましいのは、ベンゾナーデ濃度を1〜10単位/mlの範囲内で4〜37℃範囲の温度で、2〜12時間間隔で変化させることです。
第17の実施形態の第6の態様によれば、ベンゾナーゼ処理された採集物は、典型的には500KD、より好ましくは300KD、最も好ましくは100KDの分子量カットオフ（MWCO）を持つフィルターを通して、さらに接線流濾過（TFF）される。
第17の実施形態の第7の態様によれば、ウイルス採集物を接線流濾過（TFF）すると、少なくとも10倍以上の濃度のウイルス収集物を得て、さらに残留不純物を除去する。
さらに好ましい残留不純物は、残留DNA、残留ウシ血清アルブミン（BSA）および残留宿主細胞タンパク質を含む。
第17の実施形態の第8の態様によれば、上記のプロセスは、精製および濃縮されたフラビウイルス調製物、より好ましくはデング熱ウイルス調製物を得ることであり、この調製物は濃縮弱毒性デング熱ウイルス粒子、残存細胞DNAの痕跡量（10ng/用量以上）、残留BSA（50ng/用量以上）および残留細胞タンパク質を含む。さらに、上記のプロセスによれば、精製されたウイルスの総回収率は少なくとも50％である。
第17の実施形態の第9の態様によれば、1つまたは複数のアミノ酸および1つまたは複数の炭水化物の溶液を含む安定剤を、60：40または50：50または40：60の比率で濃縮ウイルス株（TFF濃縮物）と混合して、最終製剤を得た。
さらに好ましくは、7.5〜15％（w/v）濃度のスクロース溶液と7.5〜15％（w/v）濃度のグリシンを含む安定剤を、60：40、50：50または40：60の比率で濃縮ウイルス株（TFF濃縮液）と混合して、3〜6％（w/v）濃度のクロースと、3〜6％（w/v）濃度のグリシンを含む最終製剤を得た。
さらに好ましくは、12.5％（w/v）の濃度のスクロース溶液と12.5％（w/v）の濃度のグリシンを含む安定剤を、60：40の比率で濃縮ウイルス株（TFF濃縮液）と混合して、5％（w/v）濃度のスクロースと5％（w/v）濃度のグリシンを含む最終製剤を得た。
さらに好ましくは、11.25％（w/v）の濃度のスクロース溶液と12.5％（w/v）の濃度のグリシンを含む安定剤を、60：40の比率で濃縮ウイルスストック（TFF濃縮液）と混合して、4.5％（w/v）濃度のスクロースと5％（w/v）濃度のグリシンを含む最終製剤を得た。
さらに好ましくは、15%（w/v）の濃度のスクロース溶液と15%（w/v）の濃度のグリシンを含む安定剤を、60：40の比率で濃縮ウイルスストック（TFF濃縮液）と混合して、6%（w/v）濃度のスクロースと6%（w/v）濃度のグリシンを含む最終製剤を得た。
第17の実施形態の第10の態様によれば、マスターシードおよびワーキングシードを得るための、フラビウイルスと、より好ましいデング熱ウイルスの感染多重度（MOI）は、各デング熱血清型に対し0.01〜0.1の範囲である。
さらに好ましい、マスターシードおよびワーキングシードを得るためのデング熱ウイルスの感染多重度（MOI）は0.01である。
第17の実施形態の第11の態様によれば、免疫原性組成物は、フラビウイルス、より好ましくは、デング熱ウイルス血清型1、2、3、4のそれぞれを、0.5 mlあたり2.5 10 PFU以上のデング熱ウイルスを含むことである。
第17の実施形態の第12の態様によれば、免疫原性組成物は、0.5mlあたりlog103〜log105PFU、より好ましくは、デング熱ウイルス血清型1、2、3、4のそれぞれを0.5mlあたりlog103〜log104PFU、最も好ましくは、0.5mlあたりlog103PFUのデング熱ウイルスを含むことである。
本開示の第18の実施形態によれば、免疫原性組成物の凍結乾燥（フリーズドライ）方法は、凍結、1次乾燥と2次乾燥の段階を含む。
さらに好ましくは、弱毒生キメラ/組み換え4価デング熱（DEN）ワクチン組成物の凍結乾燥（フリーズドライ）方法は、以下の段階のサブセットまたはすべての段階を含む。
a) 20〜5℃の温度で製品を投入する
b) 各温度での保持時間を伴う段階的凍結、ここで、凍結段階は、約-30〜-45℃で、0.5〜1℃/分の凍結速度で、約60〜930分で凍結することを含む。
c) ‐20℃で5時間アニーリングした後、‐45℃で凍結する
d) 1次乾燥は、約55μバールの圧力下で約600〜1980分間保持する約-25〜-32℃の棚温度を達成するために、約0.5〜1.0℃/分の速度で段階的に温度を上げることを含む；
e) 2次乾燥は、製品を0.5〜1.0℃/分の速度で加熱して、55μバールの圧力下で約360〜600分間保持する約25〜30℃の棚温度を達成することを含む。
凍結乾燥サイクルの総持続時間は、約48〜56時間である。バイアルの仕様と凍結乾燥機の設計に応じて、温度とサイクル時間の変動が想定される。製品は、所定のサイクルに基づいて凍結乾燥され、約2.0〜3.5％w/wの目標含水率を達成する。
本明細書で使用する用語、「フリーズドライ」または「凍結乾燥」または「凍結乾燥化」は、凍結乾燥を意味し、懸濁液が凍結した後、低圧での昇華によって水が除去されるプロセスを指す。本明細書で使用する「昇華」とは、組成物が液体にならず固体状態から気体状態に直接変化する、組成物の物理的性質の変化を指す。
本開示の第19の実施形態によれば、免疫原性組成物は、筋肉内または静脈内、皮下、または経皮または皮内を介した有効量の免疫原性組成物のヒト対象への投与を含む健康状態の発症を軽減または予防する方法で使用するために処方される。
本開示の第20の実施形態によれば、健康状態は、デング熱ウイルス感染、ジカウイルス感染、西ナイル感染、日本脳炎感染、クンジンウイルス感染、ダニ媒介脳炎感染、セントルイス脳炎ウイルス感染、マレーバレー脳炎ウイルス感染、黄熱ウイルス感染からなる群から選択される。
本開示の第21の実施形態によれば、免疫原性組成物は、中和抗体の産生および防御に有効な用量で皮下、皮内、または筋肉内に投与することができる。ワクチンは、剤形に適合する方法で、予防および/または治療に有効な量で投与される。本開示の免疫原性組成物は、感染のリスクがある成人または小児において1次予防剤として投与することができ、または感染した患者を治療するための2次剤として使用することができる。例えば、本明細書に開示される生弱毒化デング熱（DEN）4価ワクチン組成物は、デング熱ウイルス感染のリスクがある成人または子供に使用でき、またはDEN ウイルス感染患者を治療するための2次剤として使用できる。
本開示の第22の実施形態によれば、免疫原性組成物は、単回用量バイアル、多回用量バイアル、または事前充填注射器として処方することができ、前記免疫原性組成物は、単回用量スケジュール、または好ましくは多回用量スケジュールで与えることができる。ワクチン接種の主な過程は、1〜2回の別々の投与、その後の免疫反応の維持および/または強化に必要な後続の時間間隔で与えられる他の投与、例えば2回目の投与では1〜4か月、必要に応じて、数か月または数年に持続する投与がある。また、投与計画は少なくとも部分的に、防御免疫を付与するために必要な追加免疫投与の必要性に応じて決定される。
また、本明細書に開示される他の実施形態は、凍結乾燥（フリーズドライ）免疫原性組成物が入った第1の容器と、凍結乾燥（フリーズドライ）免疫原性組成物の再構成のため、場合により生理食塩水またはWFA（注射用水）水溶液が入った第2の容器とを含むワクチンキットを包含する。
本明細書全体を通して、「含む」という用語、または「多数を含む」または「含んでいる」などの変形は、述べられた要素、整数または段階、または要素、整数または段階の群を含むが、他のすべての要素、整数または段階、または要素、整数または段階の群の除外を含まず、「含む」、「含んでいる」などを意味する場合があることを理解されるであろう。 「から本質的になる」または「本質的に含む」は同様に米国特許法に帰する意味を有し、その用語は制限がなく、記載事項の基本的または新規の特徴である限り、記載事項以上の存在を可能にするものであり、先行技術の実施形態を除き、記載事項以上の存在によって変化しない。
この明細書全体を通して、「免疫原性組成物」という用語は、ベクターから発現される目的の抗原または免疫原に対する免疫応答を誘発するすべての組成物を保護する。例えば、対象への投与後、対象となる標的免疫原または抗原に対する免疫応答を誘発する。「ワクチン組成物」および「ワクチン」という用語は、目的の抗原に対する防御免疫応答を誘発するか、または抗原に対して効果的に保護するすべての組成物を保護する。例えば、対象への投与または注射後、標的抗原または免疫原に対する防御免疫応答を誘発するか、またはベクターから発現される抗原または免疫原に対する効果的な防御を提供する。
「少なくとも」または「少なくとも１つの」という表現の使用は、１つまたは複数の所望の目的または結果を達成するための本発明の実施形態で使用されており、１つまたは複数の要素または成分または量の使用を示唆する。本発明の特定の実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例としてのみ提示されており、本発明の範囲を限定することを意図していない。本発明の範囲内での本発明の製剤への変更または改変は、本明細書記載の開示を検討する当業者が着想することがある。これらの変更または修正は、本発明の精神の範囲内である。
多様な物理パラメータ、寸法、および数量に与えられた数値は概算値に過ぎず、物理パラメータ、寸法、および数量に割り当てられた数値よりも高い値は、反対の仕様の記述がない限り、本発明の範囲内にあることが想定される。
同様に、精製に使用される構成要素、例えば、フィルター、カラムは、決して限定または除外することを意図しておらず、実施者の裁量で同じ目的を達成するために他の構成要素と置き換えることができる。
本明細書は好ましい実施形態の特定の特徴にかなりの重点を置いているが、本開示の原理から逸脱することなく、多くの追加の特徴を追加して、好ましい実施形態に多くの変更を加えることができる。本開示の好ましい実施形態におけるこれらの変更とその他の変更は、本明細書の開示によって当業者には明らかになる。従って、前述の説明事項は、単に本開示の例示として明確に解釈されるべきであり、変更を制限するものではない。
利点
上記の本開示は、弱毒生組み換えデング熱ウイルス、少なくとも1つの炭水化物、少なくとも1つのアミノ酸およびその製造方法を含む安定した凍結乾燥免疫原性組成物の実現を含むがこれらに限定されないいくつかの技術的進歩と利点を有する。他の凍結乾燥免疫原性組成物と比較すると、本開示は以下の利点を提供する：
1.ワクチン組成に含まれる最小限の成分。
2.再構成されたワクチンは、ウイルスの生存能力、免疫原性、安定性など、所望のウイルス特性を維持する。
3.2〜8℃、25℃、37℃、42℃、55℃での長期間にわたる安定性の向上。
4.防腐剤、ポリマー、界面活性剤を含まない。
5.そのような安定した組成物/製剤の改善された製造法は、収率の向上をもたらす。
例：
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例で開示される組成物および技術は、本明細書で開示された実施例において良好に機能するために発明者が発見した技術を表す。従って、その実施のための好ましい形態を構成すると見なされ得ることを当業者が理解するべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らし合わせて、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、なおかつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
例1
多回採集と単回採集
特定の実験を行って、前臨床および臨床試験に適した免疫原性組成物の製造方法を最初に確認し、フラビウイルス免疫原性組成物またはワクチンの用途を特定した。いくつかの例示的な方法では、弱毒生組み換え/キメラデング熱ウイルスを、前臨床および臨床試験のための様々な組成物に例示的なフラビウイルスとして使用した。デング熱ワクチンの候補株は、米国国立衛生研究所（NIH）が提供した。
弱毒生キメラ/組み換え4価デング熱（DEN）ワクチン組成物を製造するプロセスは、以下の段階のサブセットまたはすべての段階を含む。
1. ベロ細胞が復活した後、ハンク塩溶液と10％ウシ胎児血清(FBS)を含む最小必須培養基（MEM）で成長するように調整した；
2. ベロ細胞は、最初に組織培養フラスコ（細胞増殖に利用可能な表面積175cm2を持つTCF）で増幅され、ベロ細胞のマスターバンクとワーキングバンクを作成した。
3. ワーキング細胞バンクからの凍結保存細胞を復活させ、増幅し、ローラーボトル（細胞の成長に利用できる850cm2の表面積）でさらに継代し、37±1℃で0.7RPMのローリング速度で培養して単層を得た。
4. ローラーボトル内のベロ細胞単層に、デング熱ウイルス血清型1、2、3、4のワーキングシードで感染させた
5. すべてのローラーボトルを34±1℃で20分間培養した後、ハンク塩溶液と2％ウシ胎児血清を含む最小必須培養基（MEM）を使用して、RBあたり最大120mlの容量を追加した。さらに、すべてのローラーボトルを34±1℃で2日間、0.7RPMの回転速度で培養した。
6. 2日目に、ローラーボトル内の単層をウシ胎児血清を含まない新鮮なウイルス培養基で洗浄して、微量のFBSを除去し、34±1℃で0.7RPMの回転速度で3日間培養した
7. 感染後5日目に、感染したすべてのローラーボトルから細胞上清を採取し、デキストロース、L-グルタミン、および重炭酸ナトリウムをさらに含むハンク塩溶液を含み、ウシ胎児血清を含まないMEMを含む新鮮なウイルス培養基をボトルに再供給した；
デング熱ウイルスの採集のため、種々のアプローチがさまざまな時点（感染後4〜12日目）で、毎日、奇数日、偶数日ごとに、単回採集と多回採集が実施された。単回採集と単回採集の収量に関するウイルス力価が比較された。
4日目以後に感染したRBswereは、各当日のセットごと（セット1〜4）に採集された。採集後、RBに新鮮なウイルス培養基VMを再供給し、次の採集まで34℃で培養した。また、6日目（セット5）および7日目（セット6）に、それぞれ1回の上清を収集した。
これらのサンプルのウイルス力価（CCID50）はSpearman Karber法でテストした。
5、7、9、11日目に多回採集したデング熱ウイルス血清型1（DEN 1）で得られた成長曲線は、良好なウイルス力価を示したので、より多くのバッチを選択することにした（図4を参照）。
Den 2、3、4に対し18RBを使用して、多回採集と単回採集もう1度行った。
90個のローラーボトルを使用したDEN 2、3、4ウイルスのLog収量力価を図5に提示した（多回採集と単回採集）
1つのバッチからの多回採集の累積収量は、単回採集で得た収量よりもはるかに高かった（約0.4〜0.6 log）。0.3logは絶対値の2倍に相当するので、log単位の差はより重要である。したがって、多回採集アプローチは、単回採集アプローチよりもより有益で好ましい。
例2：
デング熱ウイルスはベロ細胞で増殖する。したがって、採集物から不純物を除去する必要がある。宿主細胞DNAなどの不純物は、ベンゾナーゼで処理する。
温度とベンゾナーゼ濃度が、細胞DNA含有量とウイルス力価に与える影響
1.浄化された1価ウイルスプール（CMVP）を得るために、複数の採集物を個別に処理した。
2.これらの複数の採集物を6 μ +0.45 μフィルターで浄化した後、細胞DNAを分解するためにベンゾナーゼで処理した。
3.採集物を処理するための理想的なベンゾナーゼ濃度と温度を特定するため、さまざまな実験が行われた。
この実験では、500単位/リットル、1250単位/リットル、2500単位/リットル、および5000単位/リットルの4つの異なる濃度のベンゾナーゼを、34±1℃で2時間添加した。1250、2500、および5000単位/リットルの濃度のベンゾナーゼで、DNAの最適な分解が観察された。結果に基づき、1250単位/リットルが使用濃度として選択された。
図6：ベンゾナーゼ濃度がDNA含有量に与える影響を参照
図7：温度が細胞DNA含有量とウイルス力価に与える影響を参照
デング熱ウイルスは長時間の温度暴露に敏感であるので、実験では短時間、つまり2時間、異なる温度で暴露した。DNA含有量が少ない場合、37℃で力価の低下が観察された。34℃ではウイルス力価の低下はなく、DNA含有量は低かった。25℃と2〜8℃ではウイルス力価の低下はなく、DNA分解も少なかった。したがって、プロセス温度を34℃に選択した。
例3：濾過と濃縮
1.デング熱ウイルスはベロ細胞で増殖する。したがって、採集物から不純物を除去する必要がある。
2.不純物は、宿主細胞DNA、宿主細胞タンパク質、残留BSA、残留ベンゾナーゼなどである。
3.接線流濾過（TFF）は、これらの不純物を除去するために使用したプロセスである。
4.ベンゾナーゼ処理した採集物は、不純物の除去のためにTFFした。
最初の実験では、TFFは300 KDのMillipore VスクリーンカセットとPall Tシリーズ300 KDを使用して行われた。透過液中に3.5 log以上のウイルス損失があることが観察された。それ故に、カセットのサイズを100 KDに変更すること予定した。これらの実験中に、ミリポアカセットでは透過液中にウイルスが存在しないことが観察された。
結果に基づいてTFFのさまざまな試験を行ったところ、100KD VスクリーンのMerck Milliporeカセットは10倍の濃縮プロセスに限り望ましい製品が得られた。ウイルスが濃縮されるので、バルクワクチンの保管スペースと不純物の除去の要件が軽減した。以下の表に基づくと、ベンゾナーゼ処理およびTFF後に、ウイルス力価の有意な損失と宿主細胞DNAの有意な除去がなかったことは明らかである。
CVP：浄化されたウイルスプール（濾過後に採集）
BCVP：ベンゾナーゼ処理されたCVP
CMVP：浄化された1価ウイルスプール（TFF後、安定剤の追加、0.2μの濾過後）
例4：
様々な安定剤と安定剤配合の最適化の研究
弱毒生フラビウイルス免疫原性組成物の安定性を、様々な安定定式化（例えば、力価損失またはLog10PFU/用量）を使用して、効力損失の関数として試験した。
デング熱1価のバルクは、表11と12に示すように、さまざまな安定剤の組み合わせを使用して調製した。これらの安定剤の主成分は、ゼラチン、ソルビトール、スクロース、グリセリン、リン酸塩（KH2PO4、K2HPO4）、グルタミン、ラクトアルブミン加水分解物（LAH）、およびL-ヒスチジン、L-アルギニン塩酸塩、L-アラニン、トリシンなどのアミノ酸であった。
スタビライザー-IIには、L-ヒスチジン（2.1％）、L-アラニン1％、トリシン（3％）、L-アルギニン塩酸塩（16％）、ラクトアルブミン加水分解物（3.5％）が含まれている。
取得したTFFウイルス濃度の容積は、以下に説明するように、異なる安定剤の組み合わせを使用して安定化された：
これらすべての調製は、37℃で7日間の熱安定性試験に供された。サンプルは、0、1、3、5、および7日目に断続的にCCID50で感染力価をテストされた。
さまざまな液体調製の感染力価の結果は、各デング熱ウイルス力価の大幅な低下とそれに続く完全な喪失（1〜5日後）を示した。
安定性を維持するための液体調製のこの失敗は、凍結乾燥調製を試みることを促した。ゼラチン+ソルビトール+安定剤II（安定剤E）を含むデング熱1価バルクを凍結乾燥し、37℃で7日間の熱安定性試験に供した。0、1、3、5、および7日目に断続的にCCID50でサンプルの感染力価をテストした。感染力価の結果は、液体調製と比較してより良い安定性プロファイルを示し、ウイルス力価を有意に維持した。このようにして、デング熱1価調製の凍結乾燥アプローチは、安定性の問題を成果裏に克服し、ウイルス力価の損失が大幅に減少することを発見した。
また、スクロース+グリシンで構成される別の安定剤Gを試したところ、4つすべてのデング熱ウイルスに対して凍結乾燥調製の形態が優れていた。0、1、3、5、および7日目に断続的にCCID50でサンプルの感染力価をテストした。感染力価の結果は、ゼラチン+ソルビトール+安定剤IIなどの安定剤と比較してより良い安定性プロファイルを示した。また、非動物由来であるので、準備や使用も簡単であった。
図8：DEN-1力価 CCID50/ml（液体と冷凍乾燥）を参照
図9：DEN 2力価CCID50/ml（液体と冷凍乾燥）を参照
NT-テストされていない
図10：DEN-3力価 CCID50/ml（液体と冷凍乾燥）を参照
図11：DEN 4力価CCID50/ml（冷凍乾燥）を参照
上記の安定性研究のすべての結果を参照すると、LYO 2（スクロースおよびグリシン）を使用した場合により優れた安定性プロファイルがで得られた。それ故に、スクロースとグリシンの安定剤組成は、より安定した調製を得るためにさらに最適化された。
例5：
凍結乾燥条件
デング熱ワクチンの開発では、初期に液体ワクチン用にさまざまな安定調製を試したところ、ウイルスは液体調製で安定したままではなく、37℃で5日以内に液体調製の力価が大幅に低下したことが明らかになった液体調製はデング熱ワクチンに効能がない。そこで、凍結乾燥を利用したデング熱ワクチンバルクの次の試験をさらに実施することを決定した。
異なる凍結乾燥試験が計画され、デング熱1価および4価バルクで実施され、ワクチン調製に対する安定剤の適合性と、低温保存中の4価混合物中のすべての4つのウイルス血清型の安定性を研究した。
この研究試験では、実施例4に示すように、ウイルスは液体形態よりも凍結乾燥形態の方が安定しており、凍結乾燥後にウイルス力価の損失は観察されなかった。
製品の安定性を高めるために、凍結乾燥形態のデング熱ワクチンを選択した。凍結乾燥試験は、実施例4に示すように、安定剤としてゼラチン-ソルビトールまたはスクロー-グリシンを含むデング熱CMVPバルクを使用して行われた。ゼラチンはブタ由来であるので、今日、ワクチンへの使用にいくつかの倫理的問題がある。また、その調製の複雑さは、高温でのゼラチンの加水分解を必要とする。ゼラチン+ソルビトール+安定剤を使用すると、4つの血清型すべての感染力価に一貫性がなく、解凍から凍結乾燥段階までかなりのウイルス損失が観察された。
ゼラチン+ソルビトール+安定剤IIを使用したデング熱バルクのいくつかの凍結乾燥試験の後、実施例4に示すように、発目者はスクロース+グリシンに移行したところ、凍結乾燥試験では、LYO 1調製と比較してLYO 2調製の方がウイルスの安定性が優れていた。
試験番号1〜7では、凍結乾燥サイクルのサイクルタイムが56時間の標準サイクルから変更された。凍結乾燥サイクルのサイクルタイムの短縮は、力価損失と水分含有量に影響を与えた。ウイルス力価に大きな損失はなかったが、サイクルタイムが短縮されたため、含水率は2.50％から3.34％w/wに増加した。したがって、凍結乾燥サイクルのサイクルタイムは約56時間に設定された。
図12：凍結乾燥サイクルを参照
例6：デング熱ウイルス1価バルクを凍結乾燥後37±1℃で14日間保管した安定性データ
デング熱ウイルス1価バルク（DEN 1、2、3、4）をスクロースとグリシンの濃度を変えて調製し、表19（SG1、SG2、SG3、SG4、SG5、SG6）に提示した、スクロースとグリシンの濃度を含む最終調製を得た。安定化された1価調製は、標準的な凍結乾燥プロトコルを使用して凍結乾燥した。以下の表に含まれるすべての凍結乾燥された1価および4価のデング熱ウイルス調製を、37±1℃で14日間熱安定性試験に供した。サンプルをそれぞれの時点で採集して、感染力価をテストした。
図13：冷凍乾燥後のDEN-1力価Log10 pfu/mlを参照
図14：冷凍乾燥後のDEN-2力価Log10 pfu/mlを参照
図15：冷凍乾燥後のDEN-3力価Log10 pfu/mlを参照
図16：冷凍乾燥後のDEN-4力価Log10 pfu/mlを参照
前述のさまざまな濃度のスクロースとグリシン安定剤を含む凍結乾燥1価調製の熱安定性の結果は、スクロースとグリシンの両方の濃度がウイルス感染力価の維持に主要な役割を果たすことを示した。
SG1とSG2調製では、ウイルス力価の変動が比較的大きいことが観察された。4つすべての血清型の、SG3、SG4、SG 5、SG 6調製では有意差は観察されなかった。しかしながら、SG3、すなわち5％スクロースおよび5％グリシン調製は、より多いバッチ用の安定剤組成物の選択であった。
例7：
デング熱4価ワクチン、弱毒生（組み換え、凍結乾燥）の安定性データ、
血清型（DEN-1、DEN2、DEN-3、DEN-4）の組み合わせを持つデング熱四価ワクチン（DTV）（弱毒生、組み換え）は、実施例6で要約したようにスクロース-グリシン（SG）組成物を使用して安定化した後、3mlの管状USPタイプ1ガラスバイアル封入して実施例5に従って凍結乾燥した。コンテナ閉鎖システムは、ブロモブチルゴムストッパーとフリップオフアルミニウムおよびプラスチックキャップシールで構成されている。SG安定化ワクチンの安定性と品質は、DPの有効期限をサポートするためのICH要件に沿った以下の研究のために、上記のコンテナ閉鎖システムで評価された。
長期/リアルタイム安定性の研究のための安定性指標パラメータは次のとおりである：
1.各血清型のウイルス力価
2. pH
3.水分含有量
1.凍結乾燥後、2〜8℃で12か月間保管したデング熱4価ワクチンの安定性データ：
図17A：冷凍乾燥後2〜8℃で12か月間保管したDEN-1力価Log10pfu/0.5 mlのデータを参照
図17B：冷凍乾燥後2〜8℃で12か月間保管したDEN-2力価Log10pfu/0.5 mlのデータを参照
図17C：冷凍乾燥後2〜8℃で12か月間保管したDEN-3力価Log10pfu/0.5 mlのデータを参照
図17D：凍結乾燥後2〜8℃で12か月間保管したDEN-4力価Log10 pfu/0.5 mlのデータを参照
pHと水分含有量は、2〜8℃で12か月までpHは7.6〜7.8の範囲内にあると推定された（図18）。残留水分量は12か月間の保管後、3.0％w/w以下のままであった。
2.凍結乾燥後、25℃±2℃と60％±5％相対湿度で6か月間保管したデング熱4価ワクチンの安定性データ：
図20A：冷凍乾燥後25℃±2℃で6か月間保管したDEN-1力価Log10pfu/0.5 mlのデータを参照
図20B：冷凍乾燥後25℃±2℃で6か月間保管したDEN-2力価Log10pfu/0.5 mlのデータを参照
図20C：冷凍乾燥後25℃±2℃で6か月間保管したDEN-3力価Log10pfu/0.5 mlのデータを参照
図20D：冷凍乾燥後25℃±2℃で6か月間保管したDEN-4力価Log10pfu/0.5 mlのデータを参照
pHと水分含有量は、25℃±2℃で6か月の初期と最終時点（曝露後6か月）で推定された。初期値（p<0.001）と、6か月間加速条件で保存した値を比較すると、pHの変化はなく、平均値±3標準偏差は7.60〜7.79から7.54〜7.71に移行した（図21）。残留水分は3％w/wの上限内に留まり、保存後6か月後に平均値±3標準偏差は1.845〜2.774％w/wであった（図22）。
3.冷凍乾燥後37℃±1℃で7日間保管したデング熱4価ワクチンの安定性データ：
バッチを37℃±1℃に7日間曝露した。ウイルス血清型（DEN1-4）を滴定し、力価損失を計算した。力価の低下はすべてのバッチで一貫していた。凍結乾燥したDTVにおけるウイルス力価の平均Log10損失および血清型デング熱1からデング熱4の標準偏差は、それぞれ0.604±0.117、0.607±0.066、0.548±0.130、0.684±0.109であった（図23）。
図23：冷凍乾燥後37℃±1℃で7日間保管したデング熱4価ワクチンの安定性データを参照
4.冷凍乾燥後42℃±1℃で7日間保管したデング熱4価ワクチンの安定性データ：
デング熱4価ワクチン（DTV）（弱毒生）の安定性を代表的なバッチで評価した。凍結乾燥した最終製品のバイアルを、42℃で7日間熱ストレス条件に曝露した。各ウイルス血清型（DEN1-4）は、曝露期間の最後に滴定して、最初の力価と比較して、力価損失を計算した。
（図24を参照）
5.冷凍乾燥後55℃±1℃で2日間保管したデング熱4価ワクチンの安定性データ：
デング熱4価ワクチン（DTV）（弱毒生）の安定性を代表的なバッチで評価した。凍結乾燥した最終製品のバイアルを、55℃で2日間熱ストレス条件に曝露した。各ウイルス血清型（DEN1-4）は、曝露期間の最後に滴定して、最初の力価と比較して、力価損失を計算した。
以上で、本発明を特定の好ましい実施形態に関して説明したが、次の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を行えることは当業者には明らかであろう。

Claims (52)

  1. 以下を含む免疫原性組成物：
    a） 1つまたは複数の弱毒生フラビウイルス；
    b） 1つまたは複数の濃度が約3〜6％（w/v）の炭水化物；
    c） 1つまたは複数の濃度が約3〜6％（w/v）のアミノ酸；
    ここで、組成物は凍結乾燥処理が可能であり、再構成された組成物は、ウイルスの生存能力、免疫原性および安定性を含む所望のウイルス特性を維持する。
  2. 1つまたは複数の弱毒生フラビウイルスが、組換えフラビウイルスまたはキメラフラビウイルスである、請求項1に記載の免疫原性組成物。
  3. 1つまたは複数の弱毒生フラビウイルスが、デング熱（DEN）ウイルス、黄熱病（YF）ウイルス、日本脳炎（JE）ウイルス、クンジンウイルス、西ナイル（WN）ウイルス、ダニ媒介性脳炎（TBE）ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、ジカウイルス、キメラデング熱ウイルス（黄熱デング熱）ウイルス、キメラYF-WN（黄熱病-西ナイル）ウイルス、キメラYF-JE（黄熱-日本脳炎）ウイルスまたはその関連フラビウイルス。からなる群から選択される、請求項1に記載の免疫原性組成物。
  4. 1つまたは複数の弱毒生フラビウイルスが、デング熱（DEN）ウイルスを含み、随意に、DEN-1、DEN-2、DEN-3およびDEN-4の群から選択される異なる血清型の複数の弱毒生デング熱（DEN）ウイルスを含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
  5. デング熱ウイルス血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3及びDEN-4を含む弱毒生デング熱（DEN）ウイルスが4価である、請求項4に記載の免疫原性組成物。
  6. 弱毒生デング熱（DEN）ウイルスが、第1のデング熱ウイルスから少なくとも1つの構造タンパク質をコード化する第1のヌクレオチド配列と、第2のデング熱ウイルスから非構造タンパク質をコード化する第2のヌクレオチド配列とを含む、組み換えデング熱ウイルスおよび/またはキメラデング熱ウイルスである、請求項5に記載の免疫原性組成物。
  7. 前記弱毒生デング熱ウイルス血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3、およびDEN-4が、Δ30変異を示す30のヌクレオチド欠失および/またはΔ31変異を示す31のヌクレオチド欠失を、デング熱ウイルスゲノムの3'非翻訳領域において伝達する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  8. 前記弱毒生デング熱ウイルス血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3、おおびDEN-4が、ベロ細胞またはヒト肝細胞株HuH-7において温度感受性の表現型を持つ、請求項1〜7のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  9. 1つまたは複数の炭水化物が、天然炭水化物、合成炭水化物、単糖、2糖、3糖、オリゴ糖、還元糖、非還元糖、糖アルコール、ポリオール、、ポリヒドロキシル化合物、化学修飾炭水化物、糖共重合体、ガラス転移促進剤からなる群から選択されるものであって、ここでガラス転移促進剤は、スクロース、マンニトール、トレハロース、マンノース、ラフィノース、ラクチトール、ラクトビオン酸、グルコース、マルツロース、イソマルツロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、デキストロース、フコースまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  10. 炭水化物の少なくとも1つがスクロースである、請求項9に記載の免疫原性組成物。
  11. 1つまたは複数のアミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、グリシン、グルタミン、アルギニン、リジン、アラニンまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の免疫原性組成物。
  12. アミノ酸の少なくとも1つがグリシンである、請求項11に記載の免疫原性組成物。
  13. アジュバントをさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
  14. アジュバントがアルミニウム塩、場合により水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム、および硫酸カリウムアルミニウムの少なくとも1つを含む、請求項13に記載の免疫原性組成物。
  15. 油と水の乳濁液、MF-59、リポソーム、リポ多糖、サポニン、リピドA、リピドA誘導体、モノホスホリルリピドA、3-脱アシル化モノホスホリルリピドA、AS01、AS03、オリゴヌクレオチド、少なくとも1つの非メチル化CpGおよび/またはリポソームを含むオリゴヌクレオチド、フロイントアジュバント、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ポリマー、ブロック共重合体を含むポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリマーp 1005、CRL-8300アジュバント、ムラミルジペプチド、TLR-4アゴニスト、フラジェリン、グラム陰性菌由来のフラジェリン、TLR-5アゴニスト、TLR-5受容体に結合可能なフラジェリンの断片、QS-21、ISCOMS、サポニンとステロールおよび脂質との組合わせからなる群から選択される少なくとも1つの追加の免疫刺激成分をさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
  16. 前記組成物が凍結乾燥されている（フリーズドライ）、請求項1〜15のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  17. 凍結乾燥組成物が、場合により食塩水またはWFI（注射用水）の水溶液で再構成される、請求項16に記載の免疫原性組成物。
  18. 免疫原性組成物の最終pHが約7〜8である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  19. デング熱ウイルスがベロ細胞で増殖する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  20. ベロ細胞株が、ATCC CCL-81（cGMPVero、アフリカミドリザル由来の腎臓細胞−Cercopithecus aeothiops；米国バージニア州マナッサスのATCCから入手可能）である、請求項19に記載の免疫原性組成物。
  21. デング熱ウイルスが、0.5mlあたり2.5 log10 PFU以上の用量で存在する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  22. 以下を含む免疫原性組成物：
    a） デング熱ウイルス血清型1（rDEN1Δ30）、
    b） デング熱ウイルス血清型2（rDEN2/4Δ30）、
    c） デング熱ウイルス血清型3（rDEN3Δ30/31）、
    d） デング熱ウイルス血清型4（rDEN4Δ30）、
    e） スクロースは約3〜6％（w/v）
    f） グリシンは約3〜6％（w/v）
    ここで、組成物は凍結乾燥処理が可能であり、再構成された組成物は、ウイルスの生存能力、免疫原性および安定性を含む所望のウイルス特性を維持する。
  23. 以下を含む免疫原性組成物：
    a） デング熱ウイルス血清型1（rDEN1Δ30）、
    b） デング熱ウイルス血清型2（rDEN2/4Δ30）、
    c） デング熱ウイルス血清型3（rDEN3Δ30/31）、
    d） デング熱ウイルス血清型4（rDEN4Δ30）、
    e） スクロースは約4〜5%（w/v）
    f） グリシンは約4〜5%（w/v）
    ここで、組成物は凍結乾燥処理が可能であり、再構成された組成物は、ウイルスの生存能力、免疫原性および安定性を含む所望のウイルス特性を維持する。
  24. 以下を含む免疫原性組成物：
    a） デング熱ウイルス血清型1（rDEN1Δ30）、0.5 mlあたりNLT 2.5 log10 PFU
    b） デング熱ウイルス血清型2（rDEN 2/4Δ30）、0.5 mlあたりNLT 3.0 log10 PFU
    c） デング熱ウイルス血清型3（rDEN3Δ30/31）、0.5 mlあたりNLT 2.5 log10 PFU
    d) デング熱ウイルス血清型4（rDEN 4Δ30）、0.5 mlあたりNLT 2.5 log10 PFU
    e） スクロースは約5％（w/v）
    f） グリシンは約5％（w/v）
    ここで、組成物は凍結乾燥処理が可能であり、再構成された組成物は、ウイルスの生存能力、免疫原性および安定性を含む所望のウイルス特性を維持する。
  25. 以下を含む免疫原性組成物：
    a） デング熱ウイルス血清型1（rDEN1Δ30）、0.5 mlあたりNLT 2.5 log10 PFU
    b） デング熱ウイルス血清型2（rDEN 2/4Δ30）、0.5 mlあたりNLT 3.0 log10 PFU
    c） デング熱ウイルス血清型3（rDEN3Δ30/31）、0.5 mlあたりNLT 2.5 log10 PFU
    d) デング熱ウイルス血清型4（rDEN 4Δ30）、0.5 mlあたりNLT 2.5 log10 PFU
    e） スクロースは約4.5%（w/v）
    f） グリシンは約5％（w/v）
    ここで、組成物は凍結乾燥処理が可能であり、再構成された組成物は、ウイルスの生存能力、免疫原性および安定性を含む所望のウイルス特性を維持する。
  26. 以下を含む免疫原性組成物：
    a） デング熱ウイルス血清型1（rDEN1Δ30）、0.5 mlあたりNLT 2.5 log10 PFU
    b） デング熱ウイルス血清型2（rDEN 2/4Δ30）、0.5 mlあたりNLT 3.0 log10 PFU
    c） デング熱ウイルス血清型3（rDEN3Δ30/31）、0.5 mlあたりNLT 2.5 log10 PFU
    d) デング熱ウイルス血清型4（rDEN 4Δ30）、0.5 mlあたりNLT 2.5 log10 PFU
    e） スクロースは約6%（w/v）
    f） グリシンは約6%（w/v）
    ここで、組成物は凍結乾燥処理が可能であり、再構成された組成物は、ウイルスの生存能力、免疫原性および安定性を含む所望のウイルス特性を維持する。
  27. 防腐剤をさらに含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  28. 前記保存剤が、2−フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム（フェメロール）、フェノール、ｍ−クレゾール、チオメルサール、ホルムアルデヒド、メチルおよびプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、p-クロル-m-クレゾール、またはそれらの組み合わせの群から選択される、請求項27に記載の免疫原性組成物。
  29. 以下を含む免疫原性組成物の製造方法：
    a） ブドウ糖、L-グルタミン、重炭酸ナトリウム、ハンク塩溶液をさらに含む、MEM中のデング熱ウイルス血清型を少なくとも1つ含む上清の多回採集；
    b） 約6〜0.45マイクロメートルの孔径を持つ少なくとも1つの清澄化フィルターを通した直線流濾過（DFF）によるウイルス採集物の濾過；
    c） ウイルス採集物を非特異性エンドヌクレアーゼを用いて34±1℃で少なくとも2時間処理；
    d） 分子量カットオフ（MWCO）が100 kDaの膜を使用した接線流濾過（TFF）によるウイルス採集物の濃縮；
    e） スクロースおよびグリシンを含む安定剤でウイルス採集物を安定化させることによる、安定化ウイルス収集物の形成；
    f） 約0.8〜約0.2マイクロメートルの孔径を持つ少なくとも1つの清澄化フィルターを通してDFFによって安定化されたウイルス採集物を滅菌することによる、精製されたウイルスの滅菌ウイルス採集物の形成；
    ここで、精製されたウイルスの総回収率は少なくとも50％である
    g） 必要に応じて、滅菌したウイルス採集物を凍結乾燥する。
  30. 非特異性べンゾヌクレアーゼがベンゾナーゼである、請求項29に記載の方法。
  31. ウイルス収穫物が、0.5〜5単位/ミリリットル範囲の濃度を持つベンゾナーゼで処理される、請求項29に記載の方法。
  32. ウイルス収穫物が、1.25単位/ミリリットルの範囲の濃度を持つベンゾナーゼで処理される、請求項29に記載の方法。
  33. ウイルス採集物が接線流濾過（TFF）されるこにより、少なくとも10倍の濃度のウイルス採集物をもたらす、請求項29に記載の方法。
  34. 安定剤が、3〜6％（w/v）濃度のスクロースと3〜6％（w/v）濃度のグリシンを含む、請求項29に記載の方法。
  35. 安定剤が、4〜5%（w/v）濃度のスクロースと4〜5%（w/v）濃度のグリシンを含む、請求項29に記載の方法。
  36. 安定剤が5％（w/v）濃度のスクロースと5％（w/v）濃度のグリシンを含む、請求項29に記載の方法。
  37. 安定剤が、4.5％（w/v）濃度のスクロースと5％（w/v）濃度のグリシンを含む、請求項29に記載の方法。
  38. 安定剤が6%（w/v）濃度のスクロースと6%（w/v）濃度のグリシンを含む、請求項29に記載の方法。
  39. 免疫原性組成物の凍結乾燥または凍結乾燥が、凍結、1次乾燥と2次乾燥の段階を含む、請求項29に記載の方法。
  40. 凍結段階が、約−45℃で約690〜930分間凍結することを含む、請求項39に記載の方法。
  41. 1次乾燥段階が、約＋0.5〜1.0℃/分の温度傾斜で、約−25℃の棚温度に到達し、約1800〜1980分維持することを含む、請求項39に記載の方法。
  42. 2次乾燥段階が、約＋0.5〜1.0℃/分の温度傾斜で、約＋25℃の棚温度に到達し、約420〜540分維持することを含む、請求項39に記載の方法。
  43. 凍結段階が、約−45℃で約60分間凍結することを含む、請求項39に記載の方法。
  44. 1次乾燥段階が、約＋0.5〜1.0℃/分の温度傾斜で、約-32℃の棚温度に到達し、約600〜1800分維持することを含む、請求項39に記載の方法。
  45. 2次乾燥段階が、約＋0.5〜1.0℃/分の温度傾斜で、約＋25℃の棚温度に到達し、約360〜600分維持することを含む、請求項39に記載の方法。
  46. 凍結乾燥された免疫原性組成物が25℃で長期間保存される、請求項29〜45のいずれか一項に記載の方法。
  47. 凍結乾燥された免疫原性組成物が37℃で長期間保存される、請求項29〜45のいずれか一項に記載の方法。
  48. 凍結乾燥された免疫原性組成物が42℃で長期間保存される、請求項29〜45のいずれか一項に記載の方法。
  49. 凍結乾燥された免疫原性組成物が55℃で長期間保存される、請求項29〜45のいずれか一項に記載の方法。
  50. 請求項1〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物は、筋肉内または静脈内、皮下、または経皮または皮内を介した有効量の免疫原性組成物のヒト対象への投与を含む健康状態の発症を軽減または予防する方法で使用するために調製される。
  51. 健康状態が、デング熱ウイルス感染、ジカウイルス感染、西ナイル感染、日本脳炎感染、クンジンウイルス感染、ダニ媒介脳炎感染、セントルイス脳炎ウイルス感染、マレーバレー脳炎ウイルス感染、黄熱ウイルス感染からなる群から選択される請求項50に記載の免疫原性組成物
  52. キットは、請求項1〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を収容する第1の容器と、凍結乾燥（フリーズドライ）免疫原性組成物の再構成用の水溶液を収容する第2の容器とを含む。
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