KR20200088326A - 특히 생 약독화 재조합 플라비바이러스를 포함하는 안정한 백신 조성물 및 그의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
특히, 생 약독화된 재조합 플라비바이러스, 보다 바람직하게는 생 약독화된 재조합 뎅기 바이러스, 적어도 하나의 탄수화물, 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 안정한 동결건조된 면역원성 조성물은 특히 급속한 냉동-건조 처리를 받을 수 있고, 조성물은 바이러스 생존능, 면역원성 및 안정성을 포함하여 바이러스의 요망되는 특징을 보존한다. 상기 면역원성 조성물은 보존제, 중합체 및 계면활성제가 없다. 상기 안정한 동결건조된 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
Description
본 개시는 생물공학 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로, 본 발명은 생 약독화된 플라비바이러스 백신 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 개시는 생 약독화된 플라비바이러스 백신 생산 분야에서의 향상된 방법에 관한 것이다.
플라비바이러스 게놈은 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유하는 11 킬로베이스(kilobase)의 단일 가닥, 포지티브 센스, RNA 분자로 구성된다. RNA는 폴리단백질로 번역되고, 이 폴리단백질은 적어도 10개의 유전자 생성물로 가공된다: 3개의 구조 단백질 - 뉴클레오캡시드 또는 코어(C), 프리막(prM; Premembrane), 및 피막(E) 및 7개의 비-구조(NS) 단백질 - NS 1, 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 및 5(Lindenbach BD, et al., In: Fields Virology. Edited by Knipe DM, Howley PM, Griffin PE, et al. Philadelphia: Wolters Kluwer, Lippencott Williams and Wilkins; 2007. pp. 1101-1152). 다수의 이러한 플라비바이러스는 바이러스 수혜자로의 전달을 위한 수단으로서 절지동물(예를 들어, 무는 진드기(biting tick) 및/또는 모기)을 사용한다. 이러한 절지동물-매개 바이러스(즉, 아르보바이러스)는 인간에서 이들의 고 병원성 성질로 인해 세계적으로 주요한 건강 문제를 이룬다(Fernandez-Garcia MD, et al., Cell Host Microbe, 2009, 5:318-328). 보다 구체적으로, 인간 아르보바이러스 병원체는 자연상에서 모기 또는 진드기 벡터 및 조류 및/또는 포유류 적격(competent) 보유 숙주를 수반하는 생명 주기에서 존재하는 황열(YF), 일본 뇌염(JE), 뎅기(DEN), 웨스트 나일(WN) 및 진드기-매개 뇌염(TBE) 바이러스를 포함한다(Gubler D, et al., In: Fields Virology. Edited by Knipe DM, Howley PM, Griffin PE, et al. 5th ed. Philadelphia: Wolters Kluwer, Lippencott Williams and Wilkins; 2007. pp. 1153-1252).
현재, 뎅기 바이러스(DENV)는, 추정컨대 무려 5억 건이나 되는 뎅기 감염이 매해 발생하여 뎅기 출혈열/뎅기 쇼크 증후군으로 알려진 2백만 건 초과의 중증 질병 사례 및 21000명의 사망을 초래하는 세계적으로 가장 중요한 인간 아르보바이러스가 되었다. 4개 혈청형의 뎅기 바이러스 DENV1 DENV2, DENV3 및 DENV4가 존재한다.
백신 및 다른 목적을 위한 생 약독화된 재조합 플라비바이러스 조제물을 생성하는 많은 방법이 알려져 있다. 실험실 또는 백신 용도를 위한 생존성(viable) 바이러스 조제물을 이들의 활성을 보존하기 위해 냉동, 동결건조 또는 다른 방법으로 저장하는 데 유용한 조성물 및 방법 또한, 알려져 있다.
플라비바이러스의 수성 조성물은 장기간 동안 5℃ 초과의 온도에서 양호한 바이러스 안정성을 허용하지 않는다. 예를 들어, YF-DEN(황열-뎅기) 키메라의 벌크 수성 조성물은 37℃에서 1일 동안 저장 후 4 log 초과를 상실하며 액체 내에서 안정화되었다. 현재, 열안정성은, 저온-유통 조건 하에서의 수송이 어려운 아열대 뎅기-풍토성 국가에서 심각한 문제점을 나타낸다.
동결건조는 백신의 안정화의 흔한 모드이다. 그러나, 동결건조는 바이러스 역가에서 손실을 유발한다. 백신은 시간이 경과함에 따라 역가를 상실하고, 역가 손실률은 온도-의존적이다. 생 바이러스는 삼투성, 열 및 진공 쇼크를 받기 쉽다. 피막화된 바이러스는 지질 이중층을 가지며, 이러한 지질 이중층은 이의 높은 취약성(fragility)때문에 덜 안정한 바이러스 구성성분으로 여겨진다. 생 바이러스는, 바이러스의 물리-화학적 안정성에 영향을 줄 수 있는 냉동, 1차 건조, 2차 건조와 같은 동결건조 단계 동안 다양한 스트레스를 받기 쉽다. 이들의 구조로 인해, 냉동-건조 동안 역가의 손실은 단백질 불안정화(예를 들어 풀림(unfolding), 분해 및 응집(aggregation)), 핵산 분해, 지질층 변경(예를 들어 상 전이, 기계적 손상) 및 내부적(얼음 형성) 및 외부적(pH 및 삼투성 변화) 바이러스 환경에서의 변화와 관련된 스트레스로 인한 것일 수 있다. 동결건조의 탈수 단계는 바이러스 에피토프의 증가된 아미노산 구성성분의 이동성이 동반되는 단백질의 수소 결합 구조의 붕괴를 초래한다. 일부 경우, 동결건조는 바이러스 역가에서 40% 이하의 손실을 유발하는 것으로 보고되었다.
동결건조 동안 약학적 펩타이드, 단백질 및 DNA의 스트레스 기전 및 안정화 전략에 대한 많은 정보가 이용 가능하더라도, 바이러스의 분자적 복합성으로 인해, 동결건조 동안 및 그 후에 상이한 불안정화 경로, 및 항원 구조에서의 물리-화학적 변화를 측정할 수 있는 분석 기법의 결여는, 바이러스가 특정 동결건조 챌린지(challenge)를 이룬다는 것을 의미한다. 동결건조 동안 생 약독화된 바이러스 백신에 대한 불안정화 기전뿐만 아니라 보호 기전은 잘 알려져 있지 않다.
Hansen 등(2015)(Freeze-drying of live virus vaccines: A review, Hansen et al., Vaccine 33 (2015) 5507-5519)은 몇몇 냉동 건조된 바이러스 백신 제제(들)의 컴필레이션(compilation)을 개시하고 있으며, 여기서, 대부분의 제제는 동결건조된 바이러스 백신을 수득하기 위한 당 알코올/단백질 첨가제(즉, 수크로스 + 트레할로스, 소르비톨, 가수분해된 젤라틴, 락트알부민 가수분해물)의 바람직한 용도에 관해 언급하고 있다.
다음의, 플라비바이러스 백신 제제가 이전에 보고되었다 - 1) 소르비톨, 트레할로스, 우레아; 2) 락토스, 소르비톨, HSA; 3) 락토스, 만니톨, HSA; 4) 폴록사머, 인간 알부민, 트레할로스, PBS; 5) 트레할로스, 재조합 HSA, F127(폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체).
HSA의 사례에서, 이들 물질의 포함은, 이들 물질이 위험에 처한 인간 또는 동물 소스로부터 유래된다면, 잠재적인 안전성 염려를 야기할 수 있다. 이러한 첨가된 단백질은 2가지 주요 이유에서 염려가 된다. 제1 염려는 동물-유래 및 인간-유래 단백질이 하나 이상의 외래성 물질을 함유하는 잠재성으로 인한 것이다. 제2 염려는 동물-유래 또는 인간-유래 단백질이 민감한(susceptible) 개체에서 알레르기 반응을 유발하는 잠재성으로 인한 것이다. 또한, 이전에 보고된 동결건조된 백신 제제는, 심지어 고수율을 지지하는 과정을 사용하여 생성되더라도 제제에 대해 비용적 영향(cost implication)을 미치는 단백질을 사용한다. 저소득 지역에서 광범위하게 채택되는 백신의 경우, 백신 및 이의 구성성분, 예컨대 안정화제의 비용을 낮게 유지시키는 것이 중요하다. 또한, 규제 및 안전성의 관점에서, 사용되는 부형제 및 안정화제는 동물 기원의 물질을 함유해서도 안되고 동물 구성성분을 함유해서도 안되는 것이 중요하다. 동물-유래 화합물은 스크래피-프리온-단백질(PrPSC; scarpie-prion-protein) 및 크로이츠펠트-야곱병(vCJD; Creutzfeldt-Jakob disease)의 새로운 변종에 의해 가능한 오염으로 인한 잠재적인 위험을 나타낸다.
약학적 제제에서 사용되는 비이온성 계면활성제는 Triton™ X-100, Pluronic® F-68, F-88 및 F-127(폴록사머), Brij 35(폴리옥시-에틸렌 알킬 에테르), 폴리옥실 스테아레이트 40, Cremophor® EL, 및 알파-토코페롤 TPGS를 포함한다. 이들 계면활성제의 각각은, 이들이 모두 폴리옥시에틸렌 모이어티를 함유하므로 다소 정도의 차이는 있을지라도, 폴리옥시에틸렌 모이어티가 자가 산화하여 반응성 퍼옥사이드를 생성하고, 이러한 반응성 퍼옥사이드는 원치 않는 단백질 면역원성에서의 증가를 유발하는 유사한 문제점을 나타낸다는 사실을 공통적으로 가진다(문헌[Edward T. Maggio et al; Polysorbates, peroxides, protein aggregation, immunogenicity - a growing concern; Journal of Excipients and Food Chemicals 3(2):46-53; 2012] 참조).
PVP는 생 약독화된 바이러스 제제를 불안정화시키는 것으로 보고되었다(문헌[JA White et al; Development of a stable liquid formulation of live attenuated influenza vaccine; Vaccine Volume 34, Issue 32, 12 July 2016, Pages 3676-3683; 2016] 참조).
트레할로스는 비용이 많이 들며; 트레할로스는 안정성을 달성하기 위해 다른 당 및 단백질 첨가제(젤라틴)와 조합되어야 한다. 또한, 다른 안정화제는 동결건조된 백신의 유통 기한(shelf life) 안정성을 증강시키는 데 있어서 트레할로스보다 양호하다.
소르비톨은 낮은 유리 전이 온도(Tg)(-1.6℃)를 가지며, 따라서, 주요 제제 구성성분으로서 사용될 수 없다. 소르비톨의 낮은 Tg는 이의 용도를 제한한다. 소르비톨은 안정성을 달성하기 위해 다른 당 및 단백질 첨가제(젤라틴)와 조합되어야 한다.
전형적으로, 재조합 바이러스는 포스페이트-완충 생리 식염수(PBS) 내에 카제인 및/또는 콜라겐의 가수분해물을 함유하는 냉동-건조된 펠렛으로서 저장되었다. 그 후에, 이들 펠렛은 약학적으로 허용 가능한 용액, 예컨대 0.4% 내지 0.9% NaCl에서 재수화된다. 그러나, 이러한 제제와 연관된 유의한 단점이 있으며 당업계에 알려져 있다. 이들 중에는 불안정하게 정의된(defined) 구성성분, 복잡한 제조 절차, 고비용, 및 바이러스의 소정의 요망되는 특징을 유지할 능력이 없다(inability).
이전에 개발된 플라비바이러스 백신 제제는 2℃ 내지 8℃에서 6개월 동안, 25℃에서 7일 동안 그리고 37℃에서 1일 내지 2일 동안 안정적이었다. 최소 수의 부형제를 포함하고 플라비바이러스 백신, 특히 생 약독화된 재조합/키메라 뎅기 바이러스에 대해 장기간 열안정성을 부여하는 제제를 개발할 필요성이 남아 있다.
이러한 조성물/제제 및 이를 제조하는 방법은 본원에 기재되어 있다.
본 개시는 적어도 하나의 생 약독화된 플라비바이러스, 적어도 하나의 탄수화물, 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하고, 여기서, 조성물은 급속한 냉동-건조 처리를 받을 수 있고, 재구성된 조성물은 바이러스 생존능, 면역원성 및 안정성을 포함하여 바이러스의 요망되는 특징을 보존한다.
본 개시는 보다 구체적으로, 하기를 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물에 관한 것이다:
a)
생 약독화된 재조합/키메라 뎅기 바이러스로서, 여기서, 사용되는 생 약독화된 뎅기 바이러스 균주는 미국 국립보건원(NIH)으로부터 입수되는 rDEN1△30-1545; rDEN2/4△30(ME)-1495, 7163; rDEN3△30/31-7164 및 rDEN4△30-7132, 7163, 8308인, 생 약독화된 재조합/키메라 뎅기 바이러스
b)
수크로스 약 3% w/v 내지 약 6% w/v
c)
글리신 약 3% w/v 내지 약 6% w/v.
나아가, 본 개시는 이러한 백신 조성물/제제를 제조하는 방법을 제공한다.
본원에서 적어도 하나의 구현예가 충족시키는 본 개시의 목적 중 일부는 하기와 같다:
본 개시의 일 목적은 선행 기술의 하나 이상의 문제점을 개선하거나 적어도 유용한 대안을 제공하는 것이다.
본 개시의 또 다른 목적은 적어도 하나의 플라비바이러스, 적어도 하나의 탄수화물, 적어도 하나의 아미노산, 및 선택적으로 염기를 포함하는 안정화성(stabilizing) 동결건조된 백신 조성물/제제를 제공하는 것이다. 여기서, 조성물은 바이러스 생존능, 면역원성 및 안정성을 포함하여 바이러스의 요망되는 특징을 보존한다.
본 개시의 더욱 또 다른 목적은 특히 뎅기 감염을 치료하거나 예방하기에 적합한 생 약독화된 재조합/키메라 뎅기 바이러스 혈청형(DEN 1, DEN 2, DEN 3, DEN 4)을 포함하는 안정화성 동결건조된 백신 조성물/제제를 제공하거나 이의 임상 증상의 발병 또는 진행을 예방, 개선 또는 지연시키는 것이다.
본 개시의 더욱 또 다른 목적은 이러한 백신 조성물/제제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 개시의 다른 목적 및 이점은 본 개시의 범위를 제한하지 않고자 하는 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명확해질 것이다.
본 개시가 상이한 구현예를 받을 수 있더라도, 소정의 구현예는 도면 및 하기 상세한 고찰에 제시되어 있고, 본 개시는 이러한 개시의 원리의 예시인 것으로 여겨질 수 있고, 본 개시의 범위를 이러한 상세한 설명에서 예시되고 개시된 것으로 제한하지 않고자 함을 이해한다.
본 개시의 제1 구현예에 따르면, 하나 이상의 생 약독화된 플라비바이러스, 하나 이상의 탄수화물 및 하나 이상의 아미노산을 포함하는 면역원성 조성물이며, 여기서, 조성물은 급속한 냉동-건조 처리를 받을 수 있고, 재구성된 조성물은 바이러스 생존능, 면역원성 및 안정성을 포함하여 바이러스의 요망되는 특징을 보존한다.
용어 "생(live)"은 이의 통상적인 의미로 사용되며, 생 바이러스는 불활성화되지 않은 바이러스, 즉, 허용(permissive) 세포 상에서 복제를 할 수 있는 바이러스이다. 생 약독화된 플라비바이러스는 동물 또는 인간에서 상응하는 야생형 바이러스에 의해 유발되는 질병을 유도하지 않고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스이다.
본 개시의 제2 구현예에 따르면, 하나 이상의 생 약독화된 플라비바이러스는 재조합 플라비바이러스 및/또는 키메라 플라비바이러스이다.
본 개시의 제3 구현예에 따르면, 하나 이상의 생 약독화된 플라비바이러스는 뎅기(DEN) 바이러스, 황열(YF) 바이러스, 일본 뇌염(JE) 바이러스, 쿤진 바이러스, 웨스트 나일(WN) 바이러스, 진드기-매개 뇌염(TBE) 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 지카 바이러스, 또는 이들의 임의의 관련된 플라비바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 제3 구현예의 바람직한 양태에 따르면, 하나 이상의 생 약독화된 플라비바이러스는 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4의 군으로부터 선택되는 상이한 혈청형의 뎅기(DEN) 바이러스, 선택적으로 복수의 생 약독화된 뎅기(DEN) 바이러스이다.
본 개시의 제4 구현예에 따르면, 하나 이상의 생 약독화된 플라비바이러스는 생 약독화된 키메라/재조합 황열(YF) 바이러스 및/또는 생 약독화된 키메라/재조합 일본 뇌염(JE) 바이러스, 및/또는 생 약독화된 키메라/재조합 뎅기(DEN) 바이러스, 및/또는 생 약독화된 키메라/재조합 웨스트 나일(WN) 바이러스 및/또는 생 약독화된 키메라/재조합 진드기-매개 뇌염(TBE) 바이러스 및/또는 키메라 뎅기 바이러스(황열-뎅기) 바이러스, 및/또는 키메라 YF-WN(황열-웨스트 나일 바이러스) 바이러스 및/또는 키메라 YF-JE(황열-일본 뇌염) 바이러스 또는 이들의 임의의 관련된 플라비바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 제4 구현예의 바람직한 양태에 따르면, 하나 이상의 생 약독화된 플라비바이러스는 생 약독화된 키메라/재조합 뎅기(DEN) 바이러스이다.
본 개시의 제5 구현예에 따르면, 면역원성 조성물에 사용되는 생 약독화된 재조합/키메라 뎅기 바이러스는 하기에 기재되어 있다:
A)
NIH 재조합 균주/이의 작제의 간단한 설명:
하기 설명된 모두 4개의 뎅기 바이러스 혈청형(DEN 1, DEN 2, DEN 3 및 DEN 4)의 약독화된 백신 균주의 발생과 관련된 모든 활성은 미국 NIH에서 수행되었다. WO2002095075 및 WO2008022196의 내용은 전문이 본 명세서에 포함된다.
유전자의 기원
1.
뎅기 바이러스 혈청형 1 내지 4의 약독화된 균주의 각각(rDEN1△30, rDEN2/4△30(ME), rDEN3△30/31 및 rDEN4△30)은 야생형 균주의 비-번역 3' 말단으로부터 약 30 뉴클레오타이드의 결실(△30)(DEN-3의 사례에서 부가적인 31 뉴클레오타이드(△31))에 의해 개발되었다. △31 돌연변이는 또한, 조합된 △30/31 결실 돌연변이에서 △30 또는 △31의 기여를 분간하기 위해 단독으로 발생될 수 있다.
2.
DEN 2 바이러스 혈청형은 약독화된 DEN 4 혈청형의 M 및 E 단백질을 DEN 2 M 및 E 단백질의 것으로 대체함으로써 개발되었다.
3.
구조적으로 모두 4개의 균주는 35 나노미터 내지 50 나노미터 크기의 피막화된 포지티브 센스 RNA 바이러스이다.
4.
본원에서 사용되는 rDEN1△30-1545 균주는 바이러스 폴리단백질 내 아미노산 잔기 번호 484에서 단일 Lys→Arg 돌연변이(A1545G 돌연변이)를 인코딩한다.
5.
본원에서 사용되는 rDEN2/4△30(ME)-1495, 7163 균주는 바이러스 폴리단백질 내 아미노산 잔기 번호 186에서 Ser→Phe 돌연변이(C1495T 돌연변이) 및 아미노산 잔기 번호 112에서 Leu→Phe 돌연변이(A7163C 돌연변이)를 인코딩한다.
6.
rDEN3△30/31은 원래의 △30 결실, 및 원래의 TL-2 구조와 TL-3 구조 둘 모두를 제거하는 비-연속(non-contiguous) 31 뉴클레오타이드 결실을 포함한다. 본원에서 사용되는 생성된 rDEN3△30/31-7164 균주는 바이러스 폴리단백질 내 아미노산 잔기 번호 115에서 Val→Ala 돌연변이(T7164C 돌연변이)를 인코딩한다.
7.
본원에서 사용되는 rDEN4△30-7132, 7163, 8308 균주는 바이러스 폴리단백질 내 아미노산 잔기 번호 102에서 Thr→Ile 돌연변이(C7132T 돌연변이), 아미노산 잔기 번호 112에서 Leu→Phe 돌연변이(A7163C 돌연변이) 및 아미노산 잔기 번호 249에서 Lys→Arg 돌연변이(A8308G 돌연변이)를 인코딩한다.
DEN 백신 균주의 RNA 서열 및 바이러스 구조를 도시하는 도면:
도 1, 도 2 및 도 3을 참조한다.
백신 균주의 발생에 사용되는 야생형 균주는 하기 표에 제공된다:
[표 1]
B)
형질전환 절차:
뎅기 바이러스 백신 균주의 발생을 위해, 본질적으로 하기 단계가 이어졌다-
1.
역전사효소 및 PCR을 사용하여 짧은 DNA 분절의 발생에 의해 야생형 DEN 바이러스의 전장 cDNA 복사체(copy)를 함유하는 플라스미드를 생성하였다. 이렇게 수득된 단편을 적절하게 연결(ligate)하여, 플라스미드에 클로닝된 야생형 DEN의 전장 게놈 cDNA 가닥을 포함하는 온전한 이중 가닥 DNA를 발생시켰다.
2.
3'UTR의 하위(sub) 단편을 돌연변이화시키고 야생형 DEN의 3'UTR을 △30 영역을 함유하는 하위 단편으로 대체함으로써 △30 돌연변이를 삽입하였다. 특이적인 돌연변이를 부위 특이적 PCR 돌연변이유발(mutagenesis)에 의해 도입하였다.
3.
DEN 2 백신 균주의 발생을 위해, DEN 2의 구조 유전자 M 및 E를 플라스미드에 클로닝하고, △30 돌연변이를 함유하는 DEN 4 클로닝된 플라스미드 내의 구조 유전자를 대체하는 데 사용하였다. DEN 3 백신 균주의 발생을 위해, 30 및 31 뉴클레오타이드의 2개의 결실을 야생형 클론에 도입하였다.
4.
게놈 길이 캡핑된(capped) RNA 전사체를 선형화된 플라스미드로부터 AmpliCap SP6 Message Maker 키트(EpiCentre Technologies, 미국 매디슨 소재)를 사용하여 합성하고, RNA를 RNeasy Mini 키트(Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 정제하였다. 베로(Vero) 세포(뎅기 3의 경우 C6/36)를 DOTAP 리포솜 형질감염 시약(Roche, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)을 사용하여, 정제된 RNA 전사체로 형질감염시켜, 요망되는 바이러스를 회수하였다. 구제된(rescued) 바이러스는 베로 세포에서 시드(seed) 바이러스의 발생을 위해 증폭, 종말 희석 클로닝 및 최종 증폭을 받았다. 각각의 균주에 대해 취해진 증폭 및 종말 희석의 주기 수에 대한 세부사항은 하기 표 2에 표로 나타나 있다.
[표 2]
제5 구현예의 제1 양태에 따르면, 키메라 바이러스는 상기 정의된 바와 같은 생 약독화된 바이러스의 특징을 나타내는 특수성(particularity)을 가진다. 따라서, 본 개시의 맥락에서, 하나 이상의 플라비바이러스의 피막 단백질 또는 하나 이상의 피막 단백질(들)의 하나 이상의 에피토프를 발현하고, 피막 단백질 또는 상기 에피토프가 유래되는 균주 또는 적어도 하나의 균주를 중화시키는 항체를 포함하는 특이적인 면역 반응을 유도하는 임의의 키메라 바이러스를 사용하는 것이 가능하다.
제5 구현예의 제2 양태에 따르면, 생 약독화된 재조합 뎅기 바이러스 핵산은 베로 세포 또는 인간 간 세포주 HuH-7에서의 온도 민감성, 모기 세포 또는 인간 간 세포주 HuH-7에서의 숙주-세포 제약, 베로 세포에서의 향상된 복제를 위한 숙주-세포 적응, 또는 마우스 또는 원숭이에서의 약독화로 이루어진 군으로부터 선택되는 표현형을 갖는 돌연변이체를 발생시키는 돌연변이를 추가로 포함하며, 여기서, 조성물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원(member)을 포함한다:
본 개시의 제6 구현예에 따르면, 하나 이상의 탄수화물은 천연 탄수화물, 합성 탄수화물, 폴리올, 유리 전이 촉진제 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류 및 이들의 상응하는 당 알코올, 폴리하이드록실 화합물, 예컨대 탄수화물 유도체 및 화학적으로 변형된 탄수화물, 하이드록시에틸 전분 및 당 공중합체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 천연 탄수화물과 합성 탄수화물 둘 모두가 사용에 적합하다. 합성 탄수화물은 티올 또는 탄소 결합에 의해 대체된 글리코시드 결합을 갖는 것을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 탄수화물의 D 형태와 L 형태 둘 모두가 사용될 수 있다. 탄수화물은 비-환원성 또는 환원성일 수 있다. 환원성 탄수화물이 사용되는 경우, 마이야르(Maillard) 반응의 저해제 첨가가 바람직하다. 조성물에 사용하기에 적합한 환원성 탄수화물은 당업계에 알려진 것이고, 글루코스, 수크로스, 말토스, 락토스, 프룩토스, 갈락토스, 만노스, 말툴로스 및 락툴로스를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 비-환원성 탄수화물은 당 알코올 및 다른 직쇄 폴리알코올로부터 선택되는 폴리하이드록실 화합물의 비-환원성 글리코시드를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 유용한 탄수화물은 라피노스, 스타키오스(stachyose), 멜레지토스(melezitose), 덱스트란, 셀리비오스, 만노비오스 및 당 알코올을 포함한다. 당 알코올 글리코시드는 바람직하게는 모노글리코시드, 특히 이당류, 예컨대 락토스, 말토스, 락툴로스 및 말툴로스의 환원에 의해 수득되는 화합물이다. 유리 형성제(glass forming agent)는 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 만노스, 라피노스, 락티톨, 락토비온산, 글루코스, 말툴로스, 이소-말툴로스, 말토스, 락토스 소르비톨, 덱스트로스, 푸코스 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 제6 구현예의 바람직한 양태에 따르면, 면역원성 조성물은 1% 내지 20% 중량/부피, 바람직하게는 1% 내지 10%, 보다 바람직하게는 3% 내지 6%, 가장 바람직하게는 5% (w/v) 이하 범위의 수크로스를 적합한 탄수화물 안정화제로서 포함한다.
본 개시의 제7 구현예에 따르면, 하나 이상의 아미노산은 류신, 이소-류신, 히스티딘, 글리신, 글루타민, 아르기닌, 라이신, 알라닌 또는 아미노산, 펩타이드, 가수분해된 단백질 또는 혈청 알부민과 같은 단백질의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
또한, 제7 구현예의 바람직한 양태에 따르면, 면역원성 조성물은 1% 내지 20% 중량/부피, 바람직하게는 1% 내지 10%, 보다 바람직하게는 3% 내지 6%, 가장 바람직하게는 5% (w/v) 이하 범위의 글리신을 적합한 아미노산 안정화제로서 포함한다.
본 개시의 제8 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 카보네이트, 포스페이트, 시트레이트, 락테이트, 글루코네이트 및 타르트레이트 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충제, 뿐만 아니라 요망되는 pH를 달성하기 위해 선택되는 비율의 소듐 포스페이트 및/또는 포타슘 포스페이트를 함유하는 포스페이트 완충제를 포함하여 보다 복잡한 유기 완충제를 부가적으로 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 완충제는 요망되는 pH를 달성하기 위해 제제화되는 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄, 또는 "트리스(Tris)"를 포함한다. 또 다른 예에서, 완충제는 Hanks 염을 갖는 최소 필수 배지일 수 있다.
본 개시의 제9 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 2-페녹시에탄올, 벤제토늄 클로라이드(페메롤(Phemerol)), 페놀, m-크레졸, 티오메르살(Thiomersal), 포름알데하이드, 메틸 및 프로필 파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤질 알코올, 클로로부탄올, p-클로르-m-크레졸, 또는 벤질 알코올 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 보존제를 부가적으로 포함할 수 있다.
본 개시의 제10 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 계면활성제, 중합체 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 부가적으로 포함할 수 있다. 계면활성제의 예는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 등을 포함할 수 있다. 중합체의 예는 덱스트란, 카르복시메틸셀룰로스, 히알루론산, 사이클로덱스트린 등을 포함할 수 있다. 염의 예는 NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2 등을 포함할 수 있다.
본 개시의 제11 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 알루미늄 염, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록시포스페이트 및 포타슘 알루미늄 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 보조제를 부가적으로 포함할 수 있다.
본 개시의 제12 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 오일 및 물 에멀젼, MF-59, 리포솜, 리포다당류, 사포닌, 지질 A, 지질 A 유도체, 모노포스포릴 지질 A, 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A, AS01, AS03, 올리고뉴클레오타이드, 적어도 하나의 비메틸화된 CpG 및/또는 리포솜을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 프로인트(Freund's) 보조제, 프로인트 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제, 중합체, 공중합체, 예컨대 블록 공중합체를 포함하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 중합체 p 1005, CRL-8300 보조제, 무라밀 디펩타이드, TLR-4 효능제, 플라젤린, 그람 음성 박테리아로부터 유래되는 플라젤린, TLR-5 효능제, TLR-5 수용체에 결합할 수 있는 플라젤린의 단편, QS-21, ISCOMS, 스테롤 및 지질과의 사포닌 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역자극성 구성성분을 부가적으로 포함할 수 있다.
본 개시의 제13 구현예에 따르면, 상기 면역원성 조성물은 동결건조(냉동-건조)된다.
본 개시의 제14 구현예에 따르면, 동결건조된 면역원성 조성물은 2℃ 내지 8℃에서 12개월 내지 36개월 동안; 25℃에서 2개월 내지 6개월 동안; 37℃에서 1주 내지 4주 동안, 42℃에서 2일 내지 7일 동안, 55℃에서 2일 내지 7일 동안 안정하다.
본 개시의 제15 구현예에 따르면, 동결건조된 면역원성 조성물을 수용액, 선택적으로 식염수 또는 주사용수(WFI)로 재구성하는 단계를 포함하는, 동결건조된 면역원성 조성물을 재구성하는 방법.
본 개시의 제16 구현예에 따르면, 재구성 후 면역원성 조성물의 최종 pH는 pH 6.0 내지 pH 8.0 범위; 보다 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 8.0 범위; 보다 바람직하게는 pH 7.2 내지 pH 7.9 범위; 가장 바람직하게는 pH 7.5 내지 pH 7.9 범위이다.
본 개시의 제17 구현예에 따르면, 생 약독화된 키메라/재조합 4가 뎅기(DEN) 백신 조성물을 제조하는 방법은 하기 단계 중 임의의 하위세트(subset) 또는 모두를 포함한다:
a)
베로 세포를 회복시키고, Hank's 염 용액 및 10% 소 태아 혈청을 갖는 최소 필수 배지(MEM)에서 성장하도록 적응시켰다.
b)
베로 세포를 처음에 조직 배양 플라스크(세포 성장에 이용 가능한 175 cm2 표면적을 갖는 TCF)에서 증폭시켜, 베로 세포의 마스터 은행(Master bank) 및 작업용 은행(Working bank)을 생성하였다.
c)
작업용 세포 은행으로부터의 저온 보존된 세포를 회복시키고, 증폭시키고, 회전병(roller bottle)(세포 성장에 이용 가능한 850 cm2 표면적)에서 추가로 계대배양하고, 37±1℃에서 인큐베이션하여, 단일층(monolayer)을 수득하였다.
d)
회전병 내의 베로 세포 단일층을 뎅기 바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4의 작업용 시드로 감염시켰다.
e)
모든 회전병을 34±1℃에서 20분 동안; 그리고 Hanks 염 용액 및 2% 소 태아 혈청을 갖는 최소 필수 배지(MEM)를 사용하여 1 RB 당 최대 120 ml 이하의 부피로 인큐베이션하였다. 추가의 모든 회전병을 34±1℃에서 2일 동안 그리고 0.7 RPM 회전 속도로 인큐베이션하였다.
f)
2일째에, 회전병 내 단일층을 소 태아 혈청이 없는 신선한 바이러스 배지로 세척하고, RB를 34±1℃에서 3일 동안 각각 0.7 RPM 회전 속도로 인큐베이션하였다.
g)
감염 후 5일째에, 모든 감염된 회전병으로부터의 세포 상층액을 수합하고, 병에 소 태아 혈청이 없는 신선한 바이러스 배지를 재-공급하였다.
h)
다중 수합물을 채취하고, 별도로 가공하여, 정화된 1가 바이러스 풀(CMVP)을 수득하였다.
i)
바이러스 수합물을 적어도 하나의 정화 필터를 통한 직접 유동 여과(DFF)에 의해 여과하였다.
j)
바이러스 수합물을 비-특이적 엔도뉴클레아제로 처리하여, 세포성 DNA를 분해시켰다.
k)
처리된 바이러스 수합물을 접선 유동 여과를 받게 하였다.
l)
바이러스 수합물을 적어도 하나의 아미노산 및 적어도 하나의 탄수화물을 포함하는 안정화제로 안정화시켜, 안정화된 바이러스 수합물을 형성하였다.
m)
안정화된 바이러스 수합물을 적어도 하나의 멸균 등급 필터를 통한 DFF에 의해 멸균시켰다.
n)
각각의 뎅기 바이러스 혈청형의 정화된 1가 바이러스 풀(CMVP)을 폴리카보네이트 병에 -60℃ 이하에서 저장하였다.
o)
모두 4개의 바이러스 혈청형의 정화된 1가 바이러스 풀(CMVP)을 함께 혼합하여, 최종 벌크를 수득하였으며, 이 벌크를 바이알에 충전시키고 동결건조하여, 약물 생성물, 즉, 재조합 뎅기 4가 백신(생 약독화됨)을 수득한다.
제17 구현예의 제1 양태에 따르면, 사용된 베로 세포주는 ATCC CCL-81(cGMPVero, 아프리카 그린 원숭이(African Green Monkey)(세르코피테쿠스 애오티옵스(Cercopithecus aeothiops)로부터 유래된 신장 세포; 미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC로부터 입수 가능함)이었다.
제17 구현예의 제2 양태에 따르면, 다중 수합물을 적절한 시간 간격에서 약 4회 내지 5회 - 보다 바람직하게는 제5일, 제7일, 제9일 및 제11일에 4회 수행한 후, 유입 물질을 폐기하고 별도로 가공하여, 정화된 1가 바이러스 풀(CMVP)을 수득하였다. 다중 수합물의 경우, 동일한 양의 유입 물질은 종래의 단일 수합 방법과 비교하여 더 높은 수율에 기여한다. 이는 또한, 업스트림 가공, 즉, 감염을 위한 세포의 증폭을 위한 시간 및 총 생산 비용을 절감시킨다.
제17 구현예의 제3 양태에 따르면, 바이러스 배지는 덱스트로스, L-글루타민 및 소듐 비카보네이트를 부가적으로 함유하는 Hanks 염 용액을 갖는 최소 필수 배지(MEM)를 포함한다.
제17 구현예의 제4 양태에 따르면, 바이러스를 함유하는 배지는 전형적으로 저하되는 공극 크기(예를 들어, 6 μ 0.8 μ, 0.45 μ, 0.2 μ)의 필터를 통해 정화된다. 적합한 시판되는 필터 및 여과 장치는 당업계에 잘 알려져 있고, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예시적인 여과 장치는 예를 들어, Millipak(Millipore), Kleenpak(Pall) 및 Sartobran™ P 여과 장치를 포함한다.
제17 구현예의 제5 양태에 따르면, 여과된 수합물을 4℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 2시간 내지 12시간 범위의 간격 동안 1 단위/ml 내지 10 단위/ml로 다양한 농도의 비-특이적 엔도뉴클레아제, 가장 바람직하게는 벤조나제로 처리하였다.
제17 구현예의 제6 양태에 따르면, 벤조나제 처리된 수합물을 전형적으로 500 KD, 보다 바람직하게는 300 KD, 가장 바람직하게는 100 KD의 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 필터를 통한 접선 유동 여과(TFF)를 추가로 받게 하였다.
제17 구현예의 제7 양태에 따르면, 바이러스 수합물을 접선 유동 여과(TFF)를 받게 하여, 적어도 10배 농도의 바이러스 수합물을 생성하였으며, 추가로 잔류 불순물을 제거한다.
더 바람직하게는, 잔류 불순물은 잔여 DNA, 잔여 소 혈청 알부민(BSA) 및 잔여 숙주 세포 단백질을 포함한다.
제17 구현예의 제8 양태에 따르면, 상기 기재된 방법은 정제되고 농축된 플라비바이러스 조제물, 보다 바람직하게는 뎅기 바이러스 조제물을 생성하고, 여기서, 조제물은 농축된 생 약독화된 뎅기 바이러스 입자, 미량의 잔여 세포성 DNA(10 ng/용량 미만), 잔여 BSA(50 ng/용량 미만) 및 잔여 세포성 단백질을 포함한다. 또한, 상기 기재된 방법에 따르면, 정제된 바이러스의 총 회수율은 적어도 50%이다.
제17 구현예의 제9 양태에 따르면, 하나 이상의 아미노산과 하나 이상의 탄수화물의 용액을 포함하는 안정화제를 농축된 바이러스 스톡(TFF 농축물)과, 60:40, 50:50 또는 40:60 비율의 바이러스 스톡:안정화제로 혼합하여, 최종 제제를 수득하였다.
더 바람직하게는, 7.5 % (w/v) 내지 15% (w/v) 농도의 수크로스와 7.5 % (w/v) 내지 15% (w/v) 농도의 글리신의 용액을 포함하는 안정화제를 농축된 바이러스 스톡(TFF 농축물)과, 60:40, 50:50 또는 40:60 비율의 바이러스 스톡:안정화제로 혼합하여, 3 % (w/v) 내지 6% (w/v) 농도의 수크로스와 3 % (w/v) 내지 6% (w/v) 농도의 글리신을 포함하는 최종 제제를 수득하였다.
더 바람직하게는, 12.5% (w/v) 농도의 수크로스와 12.5% (w/v) 농도의 글리신의 용액을 포함하는 안정화제를 농축된 바이러스 스톡(TFF 농축물)과, 60:40 비율의 바이러스 스톡:안정화제로 혼합하여, 5% (w/v) 농도의 수크로스와 5% (w/v) 농도의 글리신을 포함하는 최종 제제를 수득하였다.
더 바람직하게는, 11.25% (w/v) 농도의 수크로스와 12.5% (w/v) 농도의 글리신의 용액을 포함하는 안정화제를 농축된 바이러스 스톡(TFF 농축물)과, 60:40 비율의 바이러스 스톡:안정화제로 혼합하여, 4.5% (w/v) 농도의 수크로스와 5% (w/v) 농도의 글리신을 포함하는 최종 제제를 수득하였다.
더 바람직하게는, 15% (w/v) 농도의 수크로스와 15% (w/v) 농도의 글리신의 용액을 포함하는 안정화제를 농축된 바이러스 스톡(TFF 농축물)과, 60:40 비율의 바이러스 스톡:안정화제로 혼합하여, 6% (w/v) 농도의 수크로스와 6% (w/v) 농도의 글리신을 포함하는 최종 제제를 수득하였다.
제17 구현예의 제10 양태에 따르면, 마스터 시드 및 작업용 시드를 수득하기 위한 플라비바이러스, 보다 바람직하게는 뎅기 바이러스의 감염 다중도(MOI; multiplicity of infection)는 각각의 뎅기 혈청형에 대해 0.01 내지 0.1의 범위이다.
더 바람직하게는, 마스터 시드 및 작업용 시드를 수득하기 위한 뎅기 바이러스의 감염 다중도(MOI)는 0.01이다.
제17 구현예의 제11 양태에 따르면, 면역원성 조성물은 뎅기 바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각의 0.5 ml 당 2.5 log10 PFU 초과의 용량에서 플라비바이러스, 보다 바람직하게는 뎅기 바이러스를 포함한다.
제17 구현예의 제12 양태에 따르면, 면역원성 조성물은 뎅기 바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각의 0.5 ml 당 log103 내지 log105 PFU, 보다 바람직하게는 0.5 ml 당 log103 내지 log104 PFU, 가장 바람직하게는 0.5 ml 당 log103 PFU의 용량에서 뎅기 바이러스를 포함한다.
본 개시의 제18 구현예에 따르면, 면역원성 조성물을 동결건조(냉동-건조)하는 방법은 냉동, 1차 건조 및 2차 건조 단계를 포함한다.
더 바람직하게는, 생 약독화된 키메라/재조합 4가 뎅기(DEN) 백신 조성물을 동결건조(냉동-건조)하는 방법은 하기 단계 중 임의의 하위세트 또는 모두를 포함한다:
a) 20℃ 내지 5℃의 온도에서 생성물을 로딩(loading)하는 단계
b) 각각의 온도에서 시간을 두고 단계별로 냉동시키는 단계로서, 여기서, 냉동 단계는 0.5℃/분 내지 1℃/분의 냉동 속도로 약 60분 내지 930분 동안 약 -30℃ 내지 -45℃에서 냉동시키는 것을 포함하는 단계
c) -20℃에서 5시간 동안 어닐링한 후, -45℃에서 냉동시키는 단계
d) 1차 건조 단계는 약 0.5℃/분 내지 1.0℃/분에서 온도를 단계별로 경사화(ramp)하여, 약 -25℃ 내지 -32℃의 유통 온도(shelf temperature)를 달성하고, 약 55 μbar의 압력 하에 약 600분 내지 1980분 동안 유지시키는 단계를 포함한다;
e) 2차 건조 단계는 0.5℃/분 내지 1.0℃/분의 속도로 생성물을 가열하여, 약 25℃ 내지 30℃의 유통 온도를 달성하고, 55 μbar의 압력 하에 약 360분 내지 600분 동안 유지시키는 단계를 포함한다.
동결건조 주기의 총 기간은 약 48시간 내지 56시간을 포함한다. 바이알 규격 및 동결건조기 설계에 따른 온도 및 주기 기간에서의 변화가 고려된다. 생성물은 사전-결정된 주기를 기준으로 동결건조되어, 약 2.0% w/w 내지 3.5% w/w의 표적 수분 함량을 달성한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "냉동-건조" 또는 "동결건조하다" 또는 "동결건조"는 동결건조를 포함하고, 현탁액이 냉동되고 그 후에 물이 저압에서 승화에 의해 제거되는 과정을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "승화"는 조성물의 물리적 특성의 변화를 지칭하고, 여기서, 조성물은 액체로 되는 단계 없이 고체 상태에서 기체 상태로 바로 변한다.
본 개시의 제19 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 유효량의 면역원성 조성물을 인간 대상체에 근육내, 정맥내, 피하, 경피 또는 피내를 통해 투여하는 단계를 포함하는, 건강 질환의 발병을 감소시키거나 예방하는 방법에 사용하기 위해 제제화된다.
본 개시의 제20 구현예에 따르면, 건강 질환은 뎅기 바이러스 감염, 지카 바이러스 감염, 웨스트 나일 감염, 일본 뇌염 감염, 쿤진 바이러스 감염, 진드기-매개 뇌염 감염, 세인트 루이스 뇌염 바이러스 감염, 머레이 밸리 뇌염 바이러스 감염, 황열 바이러스 감염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시의 제21 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 중화 항체의 생성 및 보호에 효과적인 용량으로 피하, 피내 또는 근육내 투여될 수 있다. 백신은 투약 제제와 융화성인 방식으로, 그리고 예방적 및/또는 치료적으로 효과적이게 될 이러한 양으로 투여된다. 본 개시의 면역원성 조성물은 감염 위험이 있는 성인 또는 어린이의 1차 예방제로서 투여될 수 있거나, 감염된 환자를 치료하기 위한 2차 작용제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 생 약독화된 뎅기(DEN) 4가 백신 조성물은 뎅기 바이러스 감염의 위험이 있는 성인 또는 어린이에게서 사용될 수 있거나, DEN 바이러스 감염된 환자를 치료하기 위한 2차 작용제로서 사용될 수 있다.
본 개시의 제22 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 단일 용량 바이알, 다중 용량 바이알로서 또는 사전-충전된 주사기로서 제제화될 수 있으며, 여기서, 상기 면역원성 조성물은 단일 용량 스케줄, 또는 바람직하게는 다중 용량 스케줄로 제공될 수 있으며, 이러한 다중 용량 스케줄에서, 백신 접종의 1차 코스는 1회 내지 2회의 개별 용량, 이어서 면역 반응을 유지시키고/시키거나 강화하는 데 필요한 후속 시간 간격에서 제공되는 다른 용량, 예를 들어, 제2 용량에 대해 1개월 내지 4개월, 및 필요하다면 수개월 또는 수년 후에 후속 용량(들)으로 이루어질 수 있다. 투약 요법은 또한, 적어도 부분적으로, 보호 면역력을 부여하는 데 필요한 추가(booster) 용량의 필요성에 따라 결정될 것이다.
본원에 개시된 다른 구현예는 또한, 동결건조된(냉동-건조된) 면역원성 조성물을 함유하는 제1 용기, 및 동결건조된(냉동-건조된) 면역원성 조성물의 재구성을 위해 수용액, 선택적으로 식염수 또는 WFI(주사용수)를 함유하는 제2 용기를 포함하는 백신 키트를 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐서, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 변형, 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않으면서, 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 내포하는 것으로 이해될 것이고, "포함한다(includes)", "포함하는" 등을 의미할 수 있으며; 마찬가지로, "~로 본질적으로 구성되는" 또는 "~로 본질적으로 구성된다"는 미국 특허법에 속하는 의미를 가지며, 이러한 용어는 개방형(open-ended)이어서, 인용되는 것의 기본적인 또는 신규 특징이 인용되는 것 이외의 것의 존재에 의해 변화되지 않지만 선행 기술의 구현예를 배제하는 한, 인용되는 것 이외의 존재를 허용한다.
본 명세서 전반에 걸쳐서, 단어 "면역원성 조성물"은 벡터로부터 발현되는 관심 항원 또는 면역원에 대한 면역 반응을 이끌어 내는; 예를 들어, 대상체 내로 투여 후, 표적화된 관심 면역원 또는 항원에 대한 면역 반응을 이끌어 내는 임의의 조성물을 포함한다. 용어 "백신 조성물" 및 "백신"은 관심 항원에 대한 보호적 면역 반응을 유도하거나 항원에 대해 효과적으로 보호하는; 예를 들어, 대상체 내로 투여 또는 주사 후, 표적화된 항원 또는 면역원에 대한 보호적 면역 반응을 이끌어 내거나 벡터로부터 발현되는 항원 또는 면역원에 대한 효과적인 보호를 제공하는 임의의 조성물을 포함한다.
표현 "적어도" 또는 "적어도 하나의"의 사용은, 하나 이상의 요소, 성분 또는 양의 사용이 본 발명의 구현예에서 요망되는 목적 또는 결과 중 하나 이상을 달성할 수 있으므로 이러한 요소, 성분 또는 양의 사용을 시사한다. 본 발명의 소정의 구현예가 기재되긴 하였지만, 이들 구현예는 단지 예로서 제시되었고, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위 내에서 본 발명의 제제에 대한 변화 또는 변형은 당업자가 본원의 개시를 검토할 때 발생할 수 있다. 이러한 변화 또는 변형은 본 발명의 사상 내에 잘 포함된다.
다양한 물리적 매개변수, 치수 및 양에 대해 제공된 수치는 단지 근사값이고, 물리적 매개변수, 치수 및 양에 지정된 수치보다 높은 값은 본 명세서에서 다르게 언급되지 않는 한 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 예상된다.
유사하게는, 정제에 사용되는 구성성분, 예를 들어, 필터, 컬럼은 임의의 방식으로 제한하거나 배제적인 것으로 의도되지 않고, 의사의 재량 하에 동일한 목적을 달성하기 위해 다른 구성성분으로 치환될 수 있다.
본원에서 바람직한 구현예의 특이적인 특징에 대해 상당히 강조되긴 했지만, 많은 부가적인 특징이 첨가될 수 있고, 많은 변화가 개시의 원리로부터 벗어나지 않으면서 바람직한 구현예에서 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 본 개시의 바람직한 구현예에서의 이들 변화 및 다른 변화는 본원의 개시로부터 당업자에게 명확할 것이며, 이로써, 앞서 설명한 내용은 단지 본 개시의 예시로서 해석되고 제한으로서 해석되어서는 안 되는 것으로 분명하게 이해될 것이다.
이점
상기 본원에 기재된 본 개시는 비제한적으로, 생 약독화된 재조합 뎅기 바이러스, 적어도 하나의 탄수화물, 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 안정한 동결건조된 면역원성 조성물 및 이를 제조하는 방법의 실현을 포함하는 몇몇 기술적 진전 및 이점을 가진다. 다른 동결건조된 면역원성 조성물과 비교한 경우, 본 개시는 하기의 이점을 제공한다:
1. 백신 조성물에 관련된 최소 구성성분.
2. 재구성된 백신은 바이러스 생존능, 면역원성 및 안정성을 포함하여 바이러스의 요망되는 특징을 보존함.
3. 2℃ 내지 8℃, 25℃, 37℃, 42℃ 및 55℃에서 연장된 기간 동안 향상된 안정성.
4. 보존제, 중합체 및 계면활성제가 없음.
5. 수율을 향상시키는 이러한 안정한 조성물/제제를 제조하는 향상된 방법.
실시예:
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 실증하기 위해 포함된다. 당업자는, 후속하는 실시예에 개시된 조성물 및 기법이 본원에 개시된 실행에서 양호하게 작용하기 위해 본 발명자에 의해 개발된 기법을 나타내므로, 이의 실행에 바람직한 모드를 구성하는 것으로 여겨질 수 있음을 이해해야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시의 측면에서, 많은 변화가 개시된 특이적인 구현예에서 이루어지고 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 비슷한(like) 또는 유사한 결과를 여전히 수득할 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1
다중 수합 대 단일 수합
소정의 실험을 수행하여, 전임상 및 임상 시험에 적합한 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 처음에 확인하였고, 플라비바이러스 면역원성 조성물 또는 백신의 용도를 확인하였다. 일부 예시적인 방법에서, 생 약독화된 재조합/키메라 뎅기 바이러스를 전임상 및 임상 시험용 다양한 조성물에서 예시적인 플라비바이러스로서 사용하였다. 후보 뎅기 백신 균주를 미국 국립보건원(NIH)에 의해 공급받았다.
생 약독화된 키메라/재조합 4가 뎅기(DEN) 백신 조성물을 제조하는 방법은 하기 단계 중 임의의 하위세트 또는 모두를 포함한다:
1.
베로 세포를 회복시키고, Hank's 염 용액 및 10% 소 태아 혈청(FBS)을 갖는 최소 필수 배지(MEM)에서 성장하도록 적응시켰다;
2.
베로 세포를 처음에 조직 배양 플라스크(세포 성장에 이용 가능한 175 cm2 표면적을 갖는 TCF)에서 증폭시켜, 베로 세포의 마스터 은행 및 작업용 은행을 생성하였다.
3.
작업용 세포 은행으로부터의 저온 보존된 세포를 회복시키고, 증폭시키고, 회전병(RB)(세포 성장에 이용 가능한 850 cm2 표면적)에서 추가로 계대배양하고, 37±1℃ 및 0.7 RPM 회전 속도로 인큐베이션하여, 단일층을 수득하였다.
4.
회전병 내의 베로 세포 단일층을 뎅기 바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4의 작업용 시드로 0.01 MOI에서 감염시켰다.
5.
모든 회전병을 34±1℃에서 20분 동안; 그리고 Hanks 염 용액 및 2% 소 태아 혈청을 갖는 최소 필수 배지(MEM)를 사용하여 1 RB 당 최대 120 ml 이하의 부피로 인큐베이션하였다. 추가의 모든 회전병을 34±1℃에서 2일 동안 그리고 0.7 RPM 회전 속도로 인큐베이션하였다.
6.
2일째에, 회전병 내 단일층을 소 태아 혈청이 없는 신선한 바이러스 배지로 세척하여, 미량의 FBS를 제거하고, 34±1℃ 및 0.7 RPM 회전 속도로 3일 동안 인큐베이션하였다.
7.
감염 후 5일째에, 모든 감염된 회전병으로부터의 세포 상층액을 수합하고, 병에, Hanks 염 용액을 갖는 MEM을 포함하고 덱스트로스, L-글루타민 및 소듐 비카보네이트를 부가적으로 함유하며 소 태아 혈청이 없는 신선한 바이러스 배지를 재-공급한다;
[표 3]
뎅기 바이러스를 수합하기 위한 다양한 접근법을 다양한 시점에서(감염 후 제4일 내지 제12일) 매일, 홀수일, 짝수일 등에, 단일 수합 및 다중 수합으로 수행하였다. 단일 수합 대 다중 수합에 의한 수율에 관한 바이러스 역가의 비교를 수행하였다.
[표 4]
제4일에, 감염된 RB를 각각의 일(day)에 세트별로(세트 1 내지 4) 수합하였다. 수합 후, RB에 신선한 바이러스 배지-VM을 재-공급하고, 다음 수합때까지 34℃에서 인큐베이션하였다. 또한, 상층액의 단일 수합을 각각 제6일(세트 5) 및 제7일(세트 6)에 수집하였다.
이들 시료를 스피어만 카르버(Spearman Karber) 방법에 의해 바이러스 역가(CCID50)에 대해 시험하였다.
[표 5]
뎅기 바이러스 혈청형 1(DEN 1)로 수득된 성장 곡선은, 제5일, 제7일, 제9일 및 제11일에서의 다중 수합이 양호한 바이러스 역가를 제공하였으므로, 추가의 배치를 위한 선택이 될 것임을 보여주었다(도 4 참조).
다중 수합 대 단일 수합에서 1회 이상의 시행을 Den 2, 3 및 4에 대해 18 RB를 사용하여 수행하였다.
[표 6]
도 5 참조: 90개의 회전병(다중 수합 대 단일 수합)을 사용하는 DEN 2, 3, 4 바이러스의 Log 수율 역가.
단일 배치로부터의 다중 수합의 누적 수율은 단일 수합에 의해 수득되는 수율보다 훨씬 더 높았다(약 0.4 log 내지 0.6 log). 0.3 log가 절대값의 2배에 해당하므로; 이러한 차이는 더 유의성이 있다. 따라서, 다중 수합의 접근법은 단일 수합보다 더 유익하고 바람직하다.
실시예 2:
뎅기 바이러스를 베로 세포 상에서 성장시킨다. 따라서, 수합물로부터 불순물을 제거하는 것이 필요하다. 불순물, 예컨대 숙주 세포 DNA를 벤조나제로 처리한다.
세포성 DNA 함량 및 바이러스 역가에 대한 벤조나제 농도 및 온도의 효과
1.
다중 수합물을 채취하고, 별도로 가공하여, 정화된 1가 바이러스 풀(CMVP)을 수득하였다.
2.
이들 다중 수합물을 6 μ + 0.45 μ 필터를 통해 정화하고, 벤조나제로 처리하여, 세포성 DNA를 분해시켰다.
3.
다양한 실험을 수행하여, 수합물을 처리하기 위한 이상적인 벤조나제 농도 및 온도를 확인하였다.
이 실험에서, 벤조나제를 34±1℃에서 2시간 동안 4개의 상이한 농도 500 단위/리터, 1250 단위/리터, 2500 단위/리터 및 5000 단위/리터로 첨가하였다. 1250, 2500 및 5000 단위/리터 농도의 벤조나제에서, DNA의 최적 분해가 존재한 것으로 관찰되었다. 결과에 기반하여, 1250 단위/리터를 작업 농도로서 선택하였다.
[표 7]
도 6 참조: DNA 함량에 대한 벤조나제 농도의 효과
도 7 참조: 세포성 DNA 함량 및 바이러스 역가에 대한 온도의 효과
뎅기 바이러스는 장기간의 온도 노출에 민감하므로, 짧은 노출 기간(즉, 상이한 온도에서 2시간)이 실험에 사용되었다. DNA 함량이 낮은 한편, 37℃에서 역가 손실이 존재한 것으로 관찰되었다. 34℃에서, 바이러스 역가의 손실은 없었고, DNA 함량은 낮았다. 25℃ 및 2℃ 내지 8℃에서, 바이러스 역가의 손실이 없었을 뿐만 아니라 DNA 분해 또한 거의 없었다. 따라서, 34℃가 이 과정에 선택되었다.
실시예 3: 여과 및 농축
1.
뎅기 바이러스를 베로 세포 상에서 성장시킨다. 따라서, 수합물로부터 불순물을 제거할 필요가 있다.
2.
숙주 세포 DNA, 숙주 세포 단백질, 잔여 BSA 및 잔여 벤조나제와 같은 불순물.
3.
접선 유동 여과(TFF)는 본 발명자들이 이들 불순물을 제거하는 데 사용한 과정이다.
4.
벤조나제 처리된 수합물은 불순물의 제거를 위해 TFF를 받는다.
초기 실험에서, 300 KD의 Millipore V 스크린 카세트 및 Pall T 시리즈 300 KD를 사용하여 TFF를 수행하였다. 침투물에서 3.5 log 이상의 바이러스 손실이 존재하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 카세트 크기를 100 KD로 변화시키는 것을 계획하였다. 이들 실험 동안, Millipore 카세트에서, 침투물에 바이러스가 존재하지 않은 것으로 관찰되었다.
결과를 기반으로 한 다양한 TFF 시행을 수행한 후, 단지 10배 농축 과정만으로 100 KD V 스크린 Merck Millipore 카세트는 본 발명자들에게 요망되는 생성물을 제공하였다. 바이러스를 농축시켜, 벌크 백신을 위한 저장 공간 및 불순물 제거의 요건을 감소시킨다. 하기 표를 기반으로, 벤조나제 처리 및 TFF 후, 바이러스 역가의 유의한 손실 및 숙주 세포 DNA의 유의한 제거가 없었음이 분명하다.
[표 8]
[표 9]
[표 10]
실시예 4:
다양한 안정화제의 연구 및 안정화제 제제의 최적화
생 약독화된 플라비바이러스 면역원성 조성물의 안정성을, 다양한 안정화성 제제(예를 들어, 역가 손실 또는 Log10PFU/용량)를 사용하여 역가 손실의 함수로서 시험하였다.
뎅기 1가 벌크를 표 11 및 표 12에 예시된 바와 같이 상이한 안정화제 조합을 사용하여 제제화하였다. 이들 안정화제의 주성분은 젤라틴, 소르비톨, 수크로스, 글리신, 포스페이트(KH2PO4, K2HPO4), 글루타메이트, 락트알부민 가수분해물(LAH) 및 아미노산, 예컨대 L-히스티딘, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-알라닌, 트리신(Tricine) 등이었다.
[표 11]
안정화제-II는 L-히스티딘(2.1%), L-알라닌 1%, 트리신(3%), L-아르기닌 하이드로클로라이드(16%), 락트알부민 가수분해물(3.5%)을 함유한다.
수득된 TFF 바이러스 농축물의 부피를 하기 기재된 바와 같이 상이한 안정화제 조합을 사용하여 안정화시켰다:
[표 12]
이들 모든 제제는 37℃에서 7일 동안 열 안정성 연구를 받았다. 시료를 CCID50에 의한 감염성 역가에 대해 0, 1, 3, 5 및 7일째에 간헐적으로 시험하였다.
다양한 액체 제제의 감염성 역가의 결과는 각각의 뎅기 바이러스 역가에서 유의한 하락, 이어서 완전한 손실(1일 내지 5일 후)을 보여주었다.
안정성을 유지하는 데 있어서 이러한 액체 제제의 실패는 동결건조된 제제에 대한 시도를 촉진하였다. 젤라틴 + 소르비톨 + 안정화제 II(안정화제 E)를 함유하는 뎅기 1가 벌크를 동결건조하고, 37℃에서 7일 동안 열 안정성 연구를 받게 하였다. 시료를 CCID50에 의한 감염성 역가에 대해 0, 1, 3, 5 및 7일째에 간헐적으로 시험하였다. 감염성 역가의 결과는 액체 제제와 비교하여 더 양호한 안정성 프로파일을 보여주었고, 바이러스 역가를 유의하게 유지하였다. 따라서, 뎅기 1가 제제의 동결건조 접근법은 불량한 안정성의 문제점을 성공적으로 극복하였고, 바이러스 역가의 유의한 손실 감소를 확인시켜 주었다.
또한, 수크로스 + 글리신을 포함하는 또 다른 안정화제 G가 시도되었고; 동결건조된 제제 형태에서 모두 4개의 뎅기 바이러스에 대해 우수하였다. 시료를 CCID50에 의한 감염성 역가에 대해 0, 1, 3, 5 및 7일째에 간헐적으로 시험하였다. 감염성 역가의 결과는 다른 안정화제, 예를 들어 젤라틴 + 소르비톨 + 안정화제 II와 비교하여 더 양호한 안정성 프로파일을 보여주었다. 또한, 이러한 안정화제를 제조하고 사용하는 것이 용이한데; 이 안정화제가 비-동물 기원으로부터 공급되기 때문이다.
[표 13]
도 8 참조: DEN-1 역가 CCID
50
/ml(액체 대 동결건조물)
[표 14]
도 9 참조: DEN 2 역가 CCID
50
/ml(액체 대 동결건조물)
[표 15]
도 10 참조: DEN-3 역가 CCID50/ml(액체 대 동결건조물)
[표 16]
도 11 참조: DEN 4 역가 CCID50/ml(동결건조물)
상기 모든 안정성 연구 결과를 참조하면, 더 양호한 안정성 프로파일을 동결건조물(LYO) 2(수크로스 및 글리신)로 수득하였다. 따라서, 수크로스 및 글리신의 안정화제 조성물을 추가로 최적화하여, 더 안정한 제제를 얻었다.
실시예 5:
동결건조 조건
뎅기 백신 개발을 위해, 처음에 본 발명자들은 액체 백신을 위한 다양하고 상이한 안정화제 제제를 시도하였으나, 바이러스는 액체 제제에서 안정한 채로 남아 있지 않고 37℃에서 저장된 5일 이내의 액체 제제에서 유의한 역가 손실이 있는 것으로 확인되었다. 액체 제제는 뎅기 백신에는 효과가 없었다. 따라서, 본 발명자들은 추가로, 동결건조를 사용하여 뎅기 백신 벌크의 다음 시행을 수행하기로 결정하였다.
상이한 동결건조 시행을 계획하였고, 뎅기 1가뿐만 아니라 4가 벌크에서 수행하여, 저온에서 저장 동안 4가 혼합물의 백신 제제에 대한 안정화제의 적합성 및 모두 4개의 바이러스 혈청형의 안정성을 연구하였다.
본 발명자들의 연구 시행은, 바이러스가 액체 형태에서보다는 동결건조된 형태에서 더 안정한 채로 남아 있고, 실시예 4에 예시된 바와 같이 동결건조 후 바이러스 역가 손실이 관찰되지 않았음을 보여주었다.
본 발명자들은 생성물의 더 양호한 안정성을 수득하기 위해 동결건조된 형태의 뎅기 백신을 선택하였다. 실시예 4에 예시된 바와 같이 젤라틴-소르비톨 또는 수크로스-글리신을 안정화제로서 함유하는 뎅기 CMVP-벌크를 사용함으로써 동결건조 시행을 수행하였다. 젤라틴은 돼지 기원의 것이므로, 현재 백신에서 이의 용도에 대해 일부 윤리적인 쟁점이 존재한다. 또한, 이의 제조에서의 복잡성은 고온에서 젤라틴의 가수분해를 필요로 한다. 젤라틴-소르비톨 안정화제의 사용에 의해, 해동으로부터 동결건조 단계까지 모두 4개의 혈청형의 감염성 역가 및 상당한 바이러스 손실에서 어떠한 일관성(consistency)도 관찰되지 않았다.
젤라틴 + 소르비톨+ 안정화제 II를 갖는 뎅기 벌크의 일부 동결건조 시행 후, 본 발명자들은 실시예 4에 예시된 바와 같이 수크로스 + 글리신으로 시프트하였고, 동결건조 시행은 동결건조물 1 제제와 비교하여 동결건조물 2 제제에 대해 더 양호한 바이러스 안정성을 보여주었다.
[표 17]
시행 번호 1 내지 7에서, 동결건조 주기 기간은 56시간의 표준 주기로부터 변경되었다. 동결건조 주기의 시간(hour)의 감소는 역가 손실 및 수분 함량에 영향을 미쳤다. 주기 시간이 감소함에 따라, 바이러스 역가에서는 주요한 손실이 없었으나; 수분 함량은 2.50% w/w로부터 3.34% w/w까지 증가하였다. 따라서, 동결건조 주기 기간은 약 56시간으로 설정되었다.
[표 18]
도 12 참조: 동결건조 주기
실시예 6: 37±1℃에서 14일 동안 뎅기 바이러스 1가 벌크의 동결건조 후 안정성 데이터
뎅기 바이러스 1가 벌크(DEN 1,2,3,4)를 다양한 농도의 수크로스 및 글리신으로 제제화하여, 표 19(SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6)에 첨부된 바와 같은 수크로스 및 글리신의 농도를 포함하는 최종 제제를 수득하였다. 안정화된 1가 제제를 표준 동결건조 프로토콜을 사용하여 동결건조하였다. 하기 표에 첨부된 바와 같은 모든 동결건조된 1가 및 4가 뎅기 바이러스 제제를 37±1℃에서 14일 동안 열 안정성 연구를 받게 하였다. 시료를 각각의 시점에서 수집하고, 감염성 역가에 대해 시험하였다.
[표 19]
[표 20A]
[표 20B]
[표 20C]
[표 20D]
[표 20E]
[표 20F]
[표 21A]
[표 21B]
[표 21C]
[표 21D]
[표 21E]
[표 21F]
[표 22A]
[표 22B]
[표 22C]
[표 22D]
[표 22E]
[표 22F]
[표 23A]
[표 23B]
[표 23C]
[표 23D]
[표 23E]
[표 23F]
[표 24]
[표 25]
[표 26]
[표 27]
[표 28]
[표 29]
[표 30]
도 13 참조: 동결건조 후 DEN-1 역가 Log
10
pfu/ml
[표 31]
도 14 참조: 동결건조 후 DEN-2 역가 Log
10
pfu/ml
[표 32]
도 15 참조: 동결건조 후 DEN-3 역가 Log
10
pfu/ml
[표 33]
도 16 참조: 동결건조 후 DEN-4 역가 Log
10
pfu/ml
다양한 농도의 수크로스 및 글리신 안정화제를 함유하는 동결건조된 1가 제제에 대한 상기 언급된 열 안정성 결과는; 수크로스와 글리신 둘 모두의 농도가 바이러스 감염성 역가를 유지시키는 데 있어서 주요한 역할을 함을 나타낸다.
바이러스 역가에서 비교적 더 큰 변화는 SG1 및 SG2 제제에서 관찰되었다. 모두 4개 혈청형의 SG3, SG4, SG5, SG6 제제에서 어떤 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 그러나, SG3, 즉, 5% 수크로스 및 5% 글리신 제제는 추가 배치를 위한 안정화제 조성물의 선택이었다.
실시예 7:
생 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 백신의 안정성 데이터
혈청형(DEN-1, DEN 2, DEN-3, DEN-4)의 조합을 갖는 (생 약독화된, 재조합) 뎅기 4가 백신(DTV)은 실시예 6에 첨부된 바와 같은 수크로스-글리신(SG) 조성물을 사용하여 안정화되었고, 3 ml 관형 USP 유형-1 유리 바이알에서 실시예 5에 따라 추가로 동결건조되었다. 용기 밀폐 시스템은 브로모부틸 고무 마개 및 플립-오프(flip-off) 알루미늄 및 플라스틱 캡 시일(seal)로 구성된다. SG-안정화된 백신의 안정성 및 품질을, DP의 만료 기간을 지지하기 위해 ICH 요건에 따른 하기 연구에 대해 상기 언급된 용기 밀폐 시스템에서 평가하였다.
장기간/실시간 안정성 연구에 대한 매개변수를 나타내는 안정성은 하기와 같았다:
1. 각각의 혈청형의 바이러스 역가
2. pH
3. 수분 함량
1. 동결건조 후 2℃ 내지 8℃에서 12개월 이하의 뎅기 4가 백신 안정성 데이터:
[표 34A]
도 17a 참조: 동결건조 후 2℃ 내지 8℃에서 12개월 이하의 DEN-1 역가 Log10 pfu/0.5 ml 데이터
[표 34B]
도 17b 참조: 동결건조 후 2℃ 내지 8℃에서 12개월 이하의 DEN-2 역가 Log10 pfu/0.5 ml 데이터
[표 34C]
도 17c 참조: 동결건조 후 2℃ 내지 8℃에서 12개월 이하의 DEN-3 역가 Log10 pfu/0.5 ml 데이터
[표 34D]
도 17d 참조: 동결건조 후 2C 내지 8C에서 12개월 이하의 DEN-4 역가 Log10 pfu/0.5 ml 데이터
pH 및 수분 함량을 2℃ 내지 8℃로 12개월 이하에서 추정하였다. pH는 7.6 내지 7.8 범위 내에서 유지되었다(도 18). 잔여 수분 함량은 12개월 이하의 저장 시 3.0% w/w 미만에서 유지되었다(도 19).
2. 동결건조 후 25℃±2℃ 및 60%±5% 상대 습도에서 6개월 이하의 뎅기 4가 백신 안정성 데이터:
[표 35A]
도 20a 참조: 동결건조 후 25℃±2℃에서 6개월 이하의 DEN-1 역가 Log10 pfu/0.5 ml 데이터
[표 35B]
도 20b 참조: 동결건조 후 25℃±2℃에서 6개월 이하의 DEN-2 역가 Log10 pfu/0.5 ml 데이터
[표 35C]
도 20c 참조: 동결건조 후 25℃±2℃에서 6개월 이하의 DEN-3 역가 Log10 pfu/0.5 ml 데이터
[표 35D]
도 20d 참조: 동결건조 후 25℃±2℃에서 6개월 이하의 DEN-4 역가 Log10 pfu/0.5 ml 데이터
pH 및 수분 함량을 25℃±2℃에서 6개월 이하의(노출 후 6개월째) 초기 시점 및 최종 시점에서 추정하였다. 초기값과 비교하여 가속화된 조건에서 6개월 동안 저장 시 pH 변화는 발생하지 않았으며(p<0.001); 평균±3SD는 7.60 내지 7.79로부터 7.54 내지 7.71까지 시프트하였다(도 21). 잔여 수분 함량은 저장 후 6개월 후에 3% w/w의 상한, 1.8454% w/w 내지 2.774% w/w의 평균±3SD 내에서 유지되었다(도 22).
3. 동결건조 후 37℃±1℃에서 7일 이하의 뎅기 4가 백신 안정성 데이터:
배치를 37℃±1℃에 7일 동안 노출시켰다. 바이러스 혈청형(DEN1 내지 4)을 적정하고, 역가 손실을 계산하였다. 역가 손실은 모든 배치에서 일관되었다. 동결건조된 DTV 중 뎅기 1 내지 뎅기 4 혈청형의 바이러스 역가에서 평균 Log10 손실 및 표준 편차는 각각 0.604±0.117, 0.607±0.066, 0.548±0.130, 0.684±0.109이었다(도 23).
[표 36]
도 23 참조: 동결건조 후 37℃±1℃에서 7일 이하의 뎅기 4가 백신 안정성 데이터.
4. 동결건조 후 42℃±1℃에서 7일 이하의 뎅기 4가 백신 안정성 데이터:
(생 약독화된) 뎅기 4가 백신(DTV)의 안정성을 대표적인 배치에서 평가하였다. 동결건조 완료된 생성물 바이알을 42℃에서의 열 스트레스 조건에 7일 동안 노출시켰다. 각각의 바이러스 혈청형(DEN1 내지 4)을 노출 기간의 종료 시 적정하고, 초기 역가와 비교하고 역가 손실을 계산하였다.
(도 24 참조)
[표 37]
5. 동결건조 후 55℃±1℃에서 2일 이하의 뎅기 4가 백신 안정성 데이터:
뎅기 4가 백신(DTV)(생 약독화된)의 안정성을 대표적인 배치에서 평가하였다. 동결건조 완료된 생성물 바이알을 55℃에서의 열 스트레스 조건에 2일 동안 노출시켰다. 각각의 바이러스 혈청형(DEN1 내지 4)을 노출 기간의 종료 시 적정하고, 초기 역가와 비교하고 역가 손실을 계산하였다.
본 발명이 소정의 바람직한 구현예에 관해 기재되긴 하였지만, 당업자는 다양한 변화 및 변형이 하기 청구항에서 정의된 바와 같은 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음을 알 것이다.
Claims (52)
- 면역원성 조성물로서,
a) 하나 이상의 생(live) 약독화된 플라비바이러스;
b) 하나 이상의 탄수화물 약 3% (w/v) 내지 6% (w/v);
c) 하나 이상의 아미노산 약 3% (w/v) 내지 6% (w/v)
를 포함하고, 조성물은 냉동-건조 처리를 받을 수 있고, 재구성된(reconstituted) 조성물은 바이러스 생존능, 면역원성 및 안정성을 포함하여 바이러스의 요망되는 특징을 보존하는, 면역원성 조성물. - 제1항에 있어서, 하나 이상의 생 약독화된 플라비바이러스는 재조합 플라비바이러스 또는 키메라(chimeric) 플라비바이러스인, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 생 약독화된 플라비바이러스는 뎅기(DEN) 바이러스, 황열(YF) 바이러스, 일본 뇌염(JE) 바이러스, 쿤진(Kunjin) 바이러스, 웨스트 나일(WN) 바이러스, 진드기-매개 뇌염(TBE) 바이러스, 세인트 루이스(St. Louis) 뇌염 바이러스, 머레이 밸리(Murray Valley) 뇌염 바이러스, 지카 바이러스, 키메라 뎅기 바이러스(황열-뎅기) 바이러스, 키메라 YF-WN(황열-웨스트 나일 바이러스) 바이러스, 키메라 YF-JE(황열-일본 뇌염) 바이러스 또는 이들의 임의의 관련된 플라비바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 생 약독화된 플라비바이러스는 뎅기(DEN) 바이러스를 포함하고, 선택적으로 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4의 군으로부터 선택되는 상이한 혈청형의 복수의 생 약독화된 뎅기(DEN) 바이러스를 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제4항에 있어서, 생 약독화된 뎅기(DEN) 바이러스는 뎅기 바이러스 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4를 포함하는 4가인, 면역원성 조성물.
- 제5항에 있어서, 생 약독화된 뎅기(DEN) 바이러스는, 제1 뎅기 바이러스로부터의 적어도 하나의 구조 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뎅기 바이러스로부터의 비-구조 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 뎅기 바이러스 및/또는 키메라 뎅기 바이러스인, 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생 약독화된 뎅기 바이러스 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4는 뎅기 바이러스 게놈의 3' 비번역 영역에 △30 돌연변이로 지칭되는 30 뉴클레오타이드 결실을 운반하고/하거나 △31 돌연변이로 지칭되는 31 뉴클레오타이드 결실을 운반하는, 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생 약독화된 뎅기 바이러스 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4는 베로(Vero) 세포 또는 인간 간 세포주 HuH-7에서 온도 민감성인 표현형을 갖는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 탄수화물은 천연 탄수화물, 합성 탄수화물, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 환원당, 비-환원당, 당 알코올, 폴리올, 폴리하이드록실 화합물, 화학적으로 변형된 탄수화물, 당 공중합체, 유리 전이 촉진제로 이루어진 군으로부터 선택되고, 유리 전이 촉진제는 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 만노스, 라피노스, 락티톨, 락토비온산, 글루코스, 말툴로스, 이소-말툴로스, 말토스, 락토스 소르비톨, 덱스트로스, 푸코스 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역원성 조성물.
- 제9항에 있어서, 탄수화물 중 적어도 하나는 수크로스인, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 류신, 이소-류신, 히스티딘, 글리신, 글루타민, 아르기닌, 라이신, 알라닌 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역원성 조성물.
- 제11항에 있어서, 아미노산 중 적어도 하나는 글리신인, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제13항에 있어서, 보조제는 알루미늄 염, 선택적으로 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록시포스페이트 및 포타슘 알루미늄 설페이트 중 적어도 하나를 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 오일 및 물 에멀젼, MF-59, 리포솜, 리포다당류, 사포닌, 지질 A, 지질 A 유도체, 모노포스포릴 지질 A, 3-탈아실화된(deacylated) 모노포스포릴 지질 A, AS01, AS03, 올리고뉴클레오타이드, 적어도 하나의 비메틸화된 CpG 및/또는 리포솜을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 프로인트(Freund's) 보조제, 프로인트 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제, 중합체, 공중합체, 예컨대 블록 공중합체를 포함하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 중합체 p 1005, CRL-8300 보조제, 무라밀 디펩타이드, TLR-4 효능제, 플라젤린, 그람 음성 박테리아로부터 유래되는 플라젤린, TLR-5 효능제, TLR-5 수용체에 결합할 수 있는 플라젤린의 단편, QS-21, ISCOMS, 스테롤 및 지질과의 사포닌 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적인 면역자극성 구성성분을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 동결건조(냉동-건조)되는, 면역원성 조성물.
- 제16항에 있어서, 동결건조된 조성물은 수용액, 선택적으로 식염수 또는 WFI(주사용수)로 재구성되는, 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물의 최종 pH는 약 7 내지 8인, 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 뎅기 바이러스는 베로 세포에서 전파되는, 면역원성 조성물.
- 제19항에 있어서, 베로 세포주는 ATCC CCL-81(cGMPVero, 신장 아프리카 그린 원숭이(Kidney African Green Monkey)-세르코피테쿠스 애오티옵스(Cercopithecus aeothiops); 미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC로부터 입수 가능함)인, 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 뎅기 바이러스는 0.5 ml 당 2.5 log10 PFU 초과의 용량으로 존재하는, 면역원성 조성물.
- 면역원성 조성물로서,
a) 뎅기 바이러스 혈청형 1(rDEN 1△30),
b) 뎅기 바이러스 혈청형 2(rDEN 2/4△30),
c) 뎅기 바이러스 혈청형 3(rDEN 3△30/31),
d) 뎅기 바이러스 혈청형 4(rDEN 4△30),
e) 수크로스 약 3% (w/v) 내지 6% (w/v)
f) 글리신 약 3% (w/v) 내지 6% (w/v)
를 포함하고, 조성물은 냉동-건조 처리를 받을 수 있고, 재구성된 조성물은 바이러스 생존능, 면역원성 및 안정성을 포함하여 바이러스의 요망되는 특징을 보존하는, 면역원성 조성물. - 면역원성 조성물로서,
a) 뎅기 바이러스 혈청형 1(rDEN 1△30),
b) 뎅기 바이러스 혈청형 2(rDEN 2/4△30),
c) 뎅기 바이러스 혈청형 3(rDEN 3△30/31),
d) 뎅기 바이러스 혈청형 4(rDEN 4△30),
e) 수크로스 약 4% (w/v) 내지 5% (w/v)
f) 글리신 약 4% (w/v) 내지 5% (w/v)
를 포함하고, 조성물은 냉동-건조 처리를 받을 수 있고, 재구성된 조성물은 바이러스 생존능, 면역원성 및 안정성을 포함하여 바이러스의 요망되는 특징을 보존하는, 면역원성 조성물. - 면역원성 조성물로서,
a) 뎅기 바이러스 혈청형 1(rDEN 1△30), 0.5 ml 당 NLT 2.5 log10 PFU
b) 뎅기 바이러스 혈청형 2(rDEN 2/4△30), 0.5 ml 당 NLT 3.0 log10 PFU
c) 뎅기 바이러스 혈청형 3(rDEN 3△30/31), 0.5 ml 당 NLT 2.5 log10 PFU
d) 뎅기 바이러스 혈청형 4(rDEN 4△30), 0.5 ml 당 NLT 2.5 log10 PFU
e) 수크로스 약 5% (w/v)
f) 글리신 약 5% (w/v)
를 포함하고, 조성물은 냉동-건조 처리를 받을 수 있고, 재구성된 조성물은 바이러스 생존능, 면역원성 및 안정성을 포함하여 바이러스의 요망되는 특징을 보존하는, 면역원성 조성물. - 면역원성 조성물로서,
a) 뎅기 바이러스 혈청형 1(rDEN 1△30), 0.5 ml 당 NLT 2.5 log10 PFU
b) 뎅기 바이러스 혈청형 2(rDEN 2/4△30), 0.5 ml 당 NLT 3.0 log10 PFU
c) 뎅기 바이러스 혈청형 3(rDEN 3△30/31), 0.5 ml 당 NLT 2.5 log10 PFU
d) 뎅기 바이러스 혈청형 4(rDEN 4△30), 0.5 ml 당 NLT 2.5 log10 PFU
e) 수크로스 약 4.5% (w/v)
f) 글리신 약 5% (w/v)
를 포함하고, 조성물은 냉동-건조 처리를 받을 수 있고, 재구성된 조성물은 바이러스 생존능, 면역원성 및 안정성을 포함하여 바이러스의 요망되는 특징을 보존하는, 면역원성 조성물. - 면역원성 조성물로서,
a) 뎅기 바이러스 혈청형 1(rDEN 1△30), 0.5 ml 당 NLT 2.5 log10 PFU
b) 뎅기 바이러스 혈청형 2(rDEN 2/4△30), 0.5 ml 당 NLT 3.0 log10 PFU
c) 뎅기 바이러스 혈청형 3(rDEN 3△30/31), 0.5 ml 당 NLT 2.5 log10 PFU
d) 뎅기 바이러스 혈청형 4(rDEN 4△30), 0.5 ml 당 NLT 2.5 log10 PFU
e) 수크로스 약 6% (w/v)
f) 글리신 약 6% (w/v)
를 포함하고, 조성물은 냉동-건조 처리를 받을 수 있고, 재구성된 조성물은 바이러스 생존능, 면역원성 및 안정성을 포함하여 바이러스의 요망되는 특징을 보존하는, 면역원성 조성물. - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 보존제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제27항에 있어서, 상기 보존제는 2-페녹시에탄올, 벤제토늄 클로라이드(페메롤(Phemerol)), 페놀, m-크레졸, 티오메르살(Thiomersal), 포름알데하이드, 메틸 및 프로필 파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤질 알코올, 클로로부탄올, p-클로르-m-크레졸, 또는 이들의 조합의 군으로부터 선택되는, 면역원성 조성물.
- 면역원성 조성물을 제조하는 방법으로서,
a) 덱스트로스, L-글루타민 및 소듐 비카보네이트(Bicarbonate)를 부가적으로 함유하는 Hanks 염 용액을 갖는 MEM에서 뎅기 바이러스의 적어도 하나의 혈청형을 포함하는 상층액을 다중(multiple) 수합하는 단계;
b) 약 6 마이크로미터 내지 약 0.45 마이크로미터의 공극 크기를 갖는 적어도 하나의 정화(clarification) 필터를 통한 직접 유동 여과(DFF; direct flow filtration)에 의해 바이러스 수합물을 여과하는 단계;
c) 바이러스 수합물을 34±1℃에서 적어도 2시간 동안 비-특이적 엔도뉴클레아제로 처리하는 단계;
d) 100 kDa의 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 막을 사용하는 접선 유동 여과(TFF; tangential flow filtration)에 의해 바이러스 수합물을 농축시키는 단계;
e) 수크로스 및 글리신을 포함하는 안정화제를 이용하여 바이러스 수합물을 안정화시켜, 안정화된 바이러스 수합물을 형성하는 단계;
f) 약 0.8 마이크로미터 내지 약 0.2 마이크로미터의 공극 크기를 갖는 적어도 하나의 정화 필터를 통한 DFF에 의해 안정화된 바이러스 수합물을 멸균시켜, 정제된 바이러스의 멸균된 바이러스 수합물을 형성하는 단계로서,
정제된 바이러스의 총 회수율은 적어도 50%인 단계;
g) 선택적으로, 멸균된 바이러스 수합물을 냉동 건조하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제29항에 있어서, 비-특이적 엔도뉴클레아제는 벤조나제인, 방법.
- 제29항에 있어서, 바이러스 수합물은 0.5 단위/ml 내지 5 단위/ml 범위의 농도를 갖는 벤조나제로 처리되는, 방법.
- 제29항에 있어서, 바이러스 수합물은 1.25 단위/ml의 농도를 갖는 벤조나제로 처리되는, 방법.
- 제29항에 있어서, 바이러스 수합물은 접선 유동 여과(TFF)를 받아, 바이러스 수합물의 적어도 10배 농도를 생성하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 안정화제는 3% (w/v) 내지 6% (w/v)의 농도에서 수크로스 및 3% (w/v) 내지 6% (w/v)의 농도에서 글리신을 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 안정화제는 4% (w/v) 내지 5% (w/v)의 농도에서 수크로스 및 4% (w/v) 내지 5% (w/v)의 농도에서 글리신을 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 안정화제는 5% (w/v)의 농도에서 수크로스 및 5% (w/v)의 농도에서 글리신을 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 안정화제는 4.5% (w/v)의 농도에서 수크로스 및 5% (w/v)의 농도에서 글리신을 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 안정화제는 6% (w/v)의 농도에서 수크로스 및 6% (w/v)의 농도에서 글리신을 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 면역원성 조성물의 동결건조 또는 냉동-건조는 냉동, 1차 건조 및 2차 건조 단계를 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, 냉동 단계는 약 -45℃에서 약 690분 내지 930분 동안 냉동하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, 1차 건조 단계는 약 +0.5℃/분 내지 1.0℃/분에서 경사화(ramp)하여, 약 -25℃의 유통 온도(shelf temperature)를 달성하고, 약 1800분 내지 1980분 동안 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, 2차 건조 단계는 약 +0.5℃/분 내지 1.0℃/분에서 경사화하여, 약 +25℃의 유통 온도를 달성하고, 약 420분 내지 540분 동안 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, 냉동 단계는 약 -45℃에서 약 60분 동안 냉동시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, 1차 건조 단계는 약 +0.5℃/분 내지 1.0℃/분에서 경사화하여, 약 -32℃의 유통 온도를 달성하고, 약 600분 내지 1800분 동안 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, 2차 건조 단계는 약 +0.5℃/분 내지 1.0℃/분에서 경사화하여, 약 +25℃의 유통 온도를 달성하고, 약 360분 내지 600분 동안 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 면역원성 조성물은 25℃에서 연장된 기간 동안 저장되는, 방법.
- 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 면역원성 조성물은 37℃에서 연장된 기간 동안 저장되는, 방법.
- 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 면역원성 조성물은 42℃에서 연장된 기간 동안 저장되는, 방법.
- 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 면역원성 조성물은 55℃에서 연장된 기간 동안 저장되는, 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물을 인간 대상체에 근육내, 정맥내, 피하, 경피 또는 피내 투여하는 단계를 포함하는, 건강 질환의 발병을 감소시키거나 이를 예방하는 방법에 사용하기 위해 제제화되는, 면역원성 조성물.
- 제50항에 있어서, 건강 질환은 뎅기 바이러스 감염, 지카 바이러스 감염, 웨스트 나일 감염, 일본 뇌염 감염, 쿤진 바이러스 감염, 진드기-매개 뇌염 감염, 세인트 루이스 뇌염 바이러스 감염, 머레이 밸리 뇌염 바이러스 감염, 황열 바이러스 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 함유하는 제1 용기 및 동결건조된(냉동-건조된) 면역원성 조성물의 재구성을 위한 수용액을 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트.
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