CN111655844A - 包含特别是减毒活重组黄病毒的稳定的疫苗组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种稳定的冻干免疫原性组合物，其尤其包含减毒活重组黄病毒，更优选地减毒活重组登革热病毒、至少一个碳水化合物、和至少一个氨基酸，并且其特别适于快速冷冻干燥处理，其中，该组合物保留了病毒的期望特性，期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性。所述免疫原性组合物不含防腐剂、聚合物和表面活性剂。一种用于制造所述稳定的冻干免疫原性组合物的方法。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域，更具体地涉及减毒活黄病毒疫苗组合物及其制备方法。本公开还涉及减毒活黄病毒疫苗生产领域中的改进方法。
背景技术
黄病毒基因组由11个千碱基的单链正向RNA分子组成，其包含单个开放阅读框。RNA被转化成多蛋白，该多蛋白被加工成至少10种基因产物：3种结构蛋白——核衣壳或核心(C)、前膜(prM)和包膜(E)——和7种非结构(NS)蛋白——NS 1、NS 2A、NS 2B、NS 3、NS4A、NS 4B和NS 5。(Lindenbach BD等人，在由Knipe DM、Howley PM、Griffin PE等人编辑的《病毒学》中，费城：Wolters Kluwer，Lippencott Williams和Wilkins；2007年，第1101页-1152页)。许多这些黄病毒使用节肢动物(例如，叮咬蜱和/或蚊子)作为向病毒受体传播的手段。这种节肢动物传播的病毒(即，虫媒病毒)由于其在人类中的高致病性性质而构成了世界范围内主要的健康问题。(Fernandez-Garcia MD等人，Cell Host Microbe，2009年，5：第318页-328页)。更具体地，人类虫媒病毒病原体包括黄热病(YF)病毒、日本脑炎(JE)病毒、登革热(DEN)病毒、西尼罗河(WN)病毒和蜱传脑炎(TBE)病毒，这些病毒在自然界中存在于涉及蚊子或蜱载体以及鸟类和/或哺乳动物感受态储库宿主的生命周期中(Gubler D等人，在由Knipe DM、Howley PM、Griffin PE等人编辑的《病毒学》中，第5版，费城：WoltersKluwer、Lippencott Williams和Wilkins；2007年，第1153-1252页)。
然而，登革热病毒(DENV)已成为全世界最重要的人类虫媒病毒，其中，估计每年发生多达500百万例登革热感染，导致超过2百万例称为登革热出血热/登革热休克综合征的严重疾病并导致21000例死亡。有四种血清型登革热病毒，即，DENV1、DENV2、DENV3和DENV4。
已知有许多方法用于生产用于疫苗和其他目的的减毒活重组黄病毒制剂。用于冷冻、冻干或以其他方式储存活病毒制剂以供实验室或疫苗使用以便保持其活性的组合物和方法也是已知的。
黄病毒的水性组合物在高于5℃的温度下不允许长期具有良好的病毒稳定性。作为示例，YF-DEN(黄热病-登革热)嵌合体的大部分水性组合物在37℃下储存1天之后在液体中稳定后损失超过4个对数。现在，热稳定性是亚热带登革热流行国家中的严重问题，在亚热带登革热流行国家中，在冷链条件下运输是困难的。
冻干是稳定疫苗的常见方式。然而，冻干引起病毒效力的损失。疫苗随时间而失去效力，并且效力丧失的速率取决于温度。活病毒易受渗透冲击、热冲击和真空冲击的影响。包膜病毒具有脂双层，该脂双层因其高脆性而被认为是较不稳定的病毒组分。活病毒在冻干步骤例如冷冻、初步干燥、二次干燥中易受各种压力的影响，这些压力可能会影响病毒的理化稳定性。由于其结构，在冷冻干燥期间效力的损失可能是由于蛋白质去稳定(例如，解折叠、降解和聚集)、核酸降解、脂质层改变(例如，相变、机械损伤)、和与内部病毒环境(冰的形成)和外部病毒环境(pH和渗透压变化)的变化相关的压力引起的。冻干的脱水步骤导致蛋白质的氢键结构瓦解，这伴随着病毒表位的氨基酸组分的迁移率增加。据报道，在一些情况下，冻干导致病毒效力损失高达40％。
尽管可获得许多有关冻干期间药物肽、蛋白质和DNA的应激机制和稳定策略的信息，但由于病毒的分子复杂性、不同的去稳定途径、和缺乏允许在冻干期间和之后对抗原结构的物理-化学变化进行测量的分析技术，意味着病毒构成了特定的冻干挑战。冻干期间减毒活病毒疫苗的去稳定机制和保护机制还不是众所周知的。
Hansen等人于2015年(活病毒疫苗的冷冻干燥：A评论，Hansen等人，Vaccine 33(2015年)第5507页5519页)公开了几种冷冻干燥的病毒疫苗制剂的汇编，其中，大多数制剂提到优先使用糖醇/蛋白质添加剂(即，蔗糖+海藻糖、山梨糖醇、水解明胶、乳清蛋白水解产物)以获得冻干的病毒疫苗。
以下黄病毒疫苗制剂之前已有报道：1)山梨糖醇、海藻糖、尿素；2)乳糖、山梨糖醇、HSA；3)乳糖、甘露醇、HSA；4)泊洛沙姆、人白蛋白、海藻糖、PBS；5)海藻糖、重组HAS、F127(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)。
在HSA的情况下，如果这些材料来源于危险的人类或动物来源，则包含这些材料可能会引起潜在的安全隐患。这种添加的蛋白质由于两个主要原因而受到关注。第一个问题起因于动物和人类来源的蛋白质含有一个或更多个不定因子的可能性。第二个问题起因于动物或人类来源的蛋白质在易感个体中引发过敏反应的可能性。此外，先前报道的冻干疫苗制剂使用蛋白质，即使是使用支持高产量的方法生产的蛋白质，也对制剂具有成本影响。对于在低收入地区广泛采用的疫苗而言，至关重要的是保持疫苗及其组分比如稳定剂的成本低廉。从监管和安全的观点来看，所用的赋形剂和稳定剂应当既不包含动物来源的物质也不包含动物组分也是至关重要的。动物来源的化合物由于可能会染上甲基-朊病毒蛋白(PrPSc)以及克雅氏病的新变体(vCJD)而具有潜在的危险。
药物制剂中使用的非离子表面活性剂包括TritonTMX-100、F-68、F-88和F-127(泊洛沙姆)、Brij 35(聚氧乙烯烷基醚)、聚氧硬脂酸酯40、
EL和α-生育酚TPGS。这些表面活性剂中的每个表面活性剂共同的事实是它们都含有聚氧乙烯部分，并且因此或多或少地显示出相似的问题，这是因为聚氧乙烯部分自动氧化以产生反应性过氧化物，这导致不希望的蛋白质免疫原性的增加。(参见Edward T.Maggio等人；聚山梨酯、过氧化物、蛋白质聚集、免疫原性-日益增长的关注；《赋形剂和食品化学学报》3(2)：46-53；2012)。
据报道，PVPhas使减毒活病毒制剂不稳定。(参见JA White等人；开发减毒活流感疫苗的稳定液体制剂；《疫苗》，第34卷，第32期，2016年7月12日，第3676页-3683页；2016年)。
海藻糖价格昂贵；它必须与其他糖和蛋白质添加剂(明胶)结合使用以实现稳定性。此外，其他稳定剂在提高冻干疫苗的保质期稳定性方面比海藻糖更好。
山梨糖醇的玻璃化转变温度(Tg)(-1.6℃)低，因此不能用作主要的制剂组分。山梨糖醇的低Tg限制了其用途。山梨糖醇必须与其他糖和蛋白质添加剂(明胶)结合使用以实现稳定性。
通常，重组病毒以含有酪蛋白和/或胶原蛋白在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中的水解产物的冷冻干燥药丸的形式储存。这些药丸随后在药学上可接受的溶液比如0.4％-0.9％NaCl中再水合。然而，与这种制剂相关联的显著缺点在本领域中是已知的。这些缺点是组分不完全确定、制备程序复杂、成本高、以及无法保持病毒的某些期望特性。
先前开发的黄病毒疫苗制剂在2摄氏度-8摄氏度下稳定6个月，在25摄氏度下稳定7天，在37摄氏度下稳定1天-2天。仍然需要开发包含最少数量的赋形剂并赋予黄病毒疫苗，特别是减毒活重组/嵌合登革热病毒，以长期热稳定性的制剂。
本文中将对这种组合物/制剂及其制备方法进行描述。
发明内容
本公开提供了一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含至少一个减毒活黄病毒、至少一个碳水化合物和至少一个氨基酸，其中，该组合物适于快速冷冻干燥处理，并且重构的组合物保留了病毒的期望特性，所述期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性。
本公开更具体地涉及冻干的免疫原性组合物，该冻干的免疫原性组合物包含：
a)减毒活重组/嵌合登革热病毒，其中，所使用的减毒活登革热病毒菌株是从美国国立卫生研究院(NIH)获得的rDEN1Δ30-1545；rDEN2/4Δ30(ME)-1495、7163；rDEN3Δ30/31-7164和rDEN4Δ30-7132、7163、8308。
b)约3％w/v至约6％w/v的蔗糖
c)约3％w/v至约6％w/v的甘氨酸
本公开还提供了一种用于制造这种疫苗组合物/制剂的方法。
对象
本公开的目的中的一些目的——本文中的至少一个实施方式满足这些目的——如下：
本公开的目的是改善现有技术的一个或更多个问题或者至少提供有用的替代方案。
本公开的另一目的是提供一种稳定的冻干疫苗组合物/制剂，其包含至少一个黄病毒、至少一个碳水化合物、至少一个氨基酸、和可选的碱基。其中，该组合物保留了病毒的期望特性，所述期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性。
本公开的再一目的是提供一种稳定的冻干疫苗组合物/制剂，其尤其包含适于治疗或预防登革热感染或者预防、改善或延迟其临床表现的发作或进展的血清型(DEN 1、DEN2、DEN 3、DEN 4)的减毒活重组/嵌合登革热病毒。
本公开的再一目的是提供一种用于制造这种疫苗组合物/制剂的方法。
本公开的其他目的和优点将从以下描述中变得更加明显，而并非旨在限制本公开的范围。
具体实施方式
尽管本公开可能易受不同实施方式的影响，但是在理解本公开可以被认为是本公开的原理的例示并且并非旨在将本公开的范围限制为本说明书中图示和公开的范围的情况下，在附图中和以下详细论述中示出了某些实施方式。
根据本公开的第一实施方式，提供了一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含一个或更多个减毒活黄病毒、一个或更多个碳水化合物和一个或更多个氨基酸，其中，该组合物适于快速冷冻干燥处理，并且重构的组合物保留了病毒的期望特性，所述期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性。
术语“活”以其常规含义使用，活病毒是尚未灭活的病毒，即，能够在允许的细胞上复制的病毒。减毒活黄病毒是一种不会在动物或人类中诱导由对应的野生型病毒引起的疾病并且能够诱导特异性免疫应答的病毒。
根据本公开的第二实施方式，一个或更多个减毒活黄病毒是重组黄病毒和/或嵌合黄病毒。
根据本公开的第三实施方式，一个或更多个减毒活黄病毒选自包括下述各者的组：所述各者为登革热(DEN)病毒、黄热病(YF)病毒、日本脑炎(JE)病毒、昆津病毒、西尼罗河(WN)病毒、蜱传脑炎(TBE)病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、寨卡病毒、或其任何相关的黄病毒。
然而，根据第三实施方式的优选方面，一个或更多个减毒活黄病毒是登革热(DEN)病毒，可选地是选自包括DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的组的不同血清型的多个减毒活登革热(DEN)病毒。
根据本公开的第四实施方式，一个或更多个减毒活黄病毒选自包括下述各者的组：所述各者为减毒活嵌合/重组黄热病(YF)病毒和/或减毒活嵌合/重组日本脑炎(JE)病毒、和/或减毒活嵌合/重组登革热(DEN)病毒、和/或减毒活嵌合/重组西尼罗河病毒(WN)病毒和/或减毒活嵌合/重组蜱传脑炎(TBE)病毒和/或嵌合登革热病毒(黄热病-登革热)病毒、和/或嵌合YF-WN(黄热病-西尼罗河病毒)病毒和/或嵌合YF-JE(黄热病-日本脑炎)病毒或其任何相关的黄病毒。
然而，根据第四实施方式的优选方面，一个或更多个减毒活黄病毒是减毒活嵌合/重组登革热病毒(DEN)。
根据本公开的第五实施方式，用于免疫原性组合物中的减毒活重组/嵌合登革热病毒描述如下：
A)NIH重组菌株/其构造的简要说明：
下文说明的与所有四种登革热病毒血清型(DEN 1、DEN 2、DEN 3和DEN 4)的减毒疫苗菌株的产生有关的所有活性已经在NIH，US进行。WO2002095075和WO2008022196的内容整体并入本文。
基因的起源
1.已经通过从野生型菌株的非转化3’端缺失约30个核苷酸(Δ30)(在DEN-3的情况下，附加的31个核苷酸(Δ31))而开发了登革热病毒血清型1-4的减毒菌株(rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30(ME)、rDEN3Δ30/31&rDEN4Δ30)中的每个减毒菌株。Δ31突变也可以单独产生以辨别Δ30或Δ31在组合Δ30/31缺失突变中的贡献。
2.通过用DEN 2M和E蛋白的M和E蛋白替代减毒的DEN 4血清型的M和E蛋白来开发DEN 2病毒血清型。
3.从结构上讲，所有四个菌株均为35-50纳米大小的包膜阳性RNA病毒。
4.本文所使用的rDEN1Δ30-1545菌株对病毒多蛋白中的氨基酸残基编号484处的单个Lys→Arg突变(A1545G突变)进行编码。
5.本文所使用的rDEN2/4Δ30(ME)-1495、7163菌株对病毒多蛋白中的氨基酸残基编号186处的Ser→Phe突变(C1495T突变)和氨基酸残基编号112处的Leu→Phe突变(A7163C突变)进行编码。
6.rDEN3Δ30/31包括原始Δ30缺失和去除原始TL-2结构和TL-3结构的非连续的31个核苷酸缺失。本文所使用的所得rDEN3Δ30/31-7164菌株对病毒多蛋白中的氨基酸残基编号115处的Val→Ala突变(T7164C突变)进行编码。
7.本文所使用的rDEN4Δ30-7132、7163、8308菌株对病毒多蛋白中的氨基酸残基编号102处的Thr→Ile突变(C7132T突变)、氨基酸残基编号112处的Leu→Phe突变(A7163C突变)和氨基酸残疾编号249处的Lys→Arg突变(A8308G突变)进行编码。
描绘DEN疫苗菌株的RNA序列和病毒结构的图：
请参见图1、图2和图3
下表中给出了用于产生疫苗菌株的野生型菌株：
B)转换程序：
为了产生登革热病毒疫苗菌株，基本上遵循以下步骤：
1.通过使用逆转录酶和PCR产生短DNA区段来创建包含野生型DEN病毒的全长cDNA拷贝的质粒。将如此获得的片段适当地连接以产生完整的双链DNA，该双链DNA包含克隆在质粒中的野生型DEN的全长基因组cDNA链。
2.通过使3’UTR的子片段突变并用包含Δ30区域的子片段替代野生型DEN的3’UTR来插入Δ30突变。通过位点特异性PCR诱变引入特异性突变。
3.为了产生DEN 2疫苗菌株，将DEN 2的结构基因M和E克隆到质粒中，并且DEN 2的结构基因M和E用于替代包含Δ30突变的DEN 4克隆质粒中的结构基因。为了产生DEN 3疫苗菌株，在野生型克隆中引入了30个和31个核苷酸的两个缺失。
4.使用AmpliCap SP6Message Maker试剂盒(EpiCentre Technologies，Madison)从线性化质粒合成基因组长度加帽的RNA转录物，并使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，巴伦西亚，加利福尼亚)纯化RNA。使用DOTAP脂质体转染试剂(Roche，印第安纳波利斯，印第安纳州)用纯化的RNA转录物转染Vero细胞(登革热3的C6/36)，以回收所需病毒。对拯救的病毒进行扩增，末端稀释克隆和最终扩增以在Vero细胞中产生种子病毒。下表2中列出了每个菌株进行扩增和末端稀释的循环次数的细节。
*扩增和末端稀释克隆的所有进一步工作均在Vero细胞中进行。
根据第五实施方式的第一方面，嵌合病毒具有表现出如上所定义的减毒活病毒的特性的特殊性。因此，在本公开的上下文中，可以使用表达一个或更多个黄病毒的包膜蛋白或者一个或更多个黄病毒的一个或更多个包膜蛋白的一个或更多个表位并诱导特异性免疫应答的任何嵌合病毒，特异性免疫应答包含对包膜蛋白或所述表位所来源的菌株或至少一个菌株进行中和的抗体。
根据第五实施方式的第二方面，减毒活重组登革热病毒核酸还包含突变，该突变产生具有表型的突变体，该表型选自包括下述各者的组：所述各者为Vero细胞或人肝细胞系HuH-7中的温度敏感性、蚊子细胞或人肝细胞系HuH-7中的宿主细胞限制、用于改善Vero细胞中的复制的宿主细胞适应性、或小鼠或猴子中的减毒，其中，组合物包含选自包括下述各者的组的成分：
(1)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(2)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(3)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(4)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(5)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(6)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(7)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(8)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(9)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(10)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(11)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(12)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(13)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(14)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(15)rDEMΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(16)rDENlΔ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(17)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(18)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(19)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(20)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(21)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(22)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(23)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(24)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(25)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(26)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(27)rDEMΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(28)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(29)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(30)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(31)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(32)rDENlΔ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(33)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(34)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(35)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(36)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(37)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(38)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(39)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(40)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(41)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(42)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(43)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(44)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(45)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(46)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(47)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(48)rDENlΔ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(49)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(50)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(51)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(52)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(53)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(54)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(55)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(56)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(57)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(58)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(59)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(60)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(61)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(62)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(63)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(64)rDENlΔ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(65)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(66)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(67)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(68)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(69)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(70)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(71)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(72)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(73)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(74)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(75)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(76)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(77)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(78)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(79)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,i
(80)rDENl/2Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(81)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(82)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(83)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(84)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(85)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(86)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(87)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(88)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(89)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,ι
(90)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(91)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(92)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ305 rDEN4/3Δ30,
(93)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(94)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(95)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(96)rDENl/2Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(97)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(98)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(99)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,ι
(100)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(101)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(102)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(103)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(104)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(105)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(106)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(107)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(108)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(109)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(110)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(111)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(112)rDENl/2Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(113)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(114)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(115)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(116)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(117)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(118)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(119)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(120)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(121)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ305 rDEN4Δ30,
(122)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(123)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(124)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(125)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(126)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(127)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(128)rDENl/2Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(129)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(130)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(131)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(132)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(133)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(134)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(135)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(136)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(137)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(138)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(139)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(140)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(141)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(142)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(143)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(144)rDENl/3Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(145)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(146)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(147)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(148)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(149)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(150)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(151)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(152)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(153)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(154)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(155)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(156)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(157)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(158)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(159)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(160)rDENl/3Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(161)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(162)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(163)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(164)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(165)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(166)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(167)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(168)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(169)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(170)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(171)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(172)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(173)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(174)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(175)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(176)rDENl/3Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(177)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(178)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(179)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(180)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(181)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(182)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(183)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(184)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(185)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(186)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(187)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(188)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(189)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(190)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(191)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(192)rDENl/3Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(193)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(194)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(195)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(196)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(197)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(198)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(199)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(200)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(201)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(202)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(203)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(204)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(205)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(206)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(207)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(208)rDENl/4Δ30,rDEN2Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(209)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(210)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(211)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(212)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(213)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(214)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(215)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(216)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(217)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(218)rDENl/4Δ305rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(219)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(220)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(221)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(222)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(223)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ305 rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(224)rDENl/4Δ30,rDEN2/lΔ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(225)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(226)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(227)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(228)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(229)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(230)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(231)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(232)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(233)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(234)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(235)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(236)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(237)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(238)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(239)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,
(240)rDENl/4Δ30,rDEN2/3Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30,
(241)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4Δ30,
(242)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/lΔ30,
(243)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/2Δ30,
(244)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3Δ30,rDEN4/3Δ30,
(245)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4Δ30,
(246)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/lΔ30,
(247)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/2Δ30,
(248)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/lΔ30,rDEN4/3Δ30,
(249)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4Δ30,
(250)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/lΔ30,
(251)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/2Δ30,
(252)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/2Δ30,rDEN4/3Δ30,
(253)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4Δ30,
(254)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/lΔ30,
(255)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/2Δ30,以及
(256)rDENl/4Δ30,rDEN2/4Δ30,rDEN3/4Δ30,rDEN4/3Δ30.
根据本公开的第六实施方式，一个或更多个碳水化合物包括但不限于天然碳水化合物、合成碳水化合物、多元醇、玻璃化转变促进剂单糖、二糖、三糖、寡糖及其对应的糖醇、多羟基化合物比如碳水化合物衍生物和化学改性的碳水化合物、羟乙基淀粉和糖的共聚物。天然碳水化合物和合成碳水化合物均适合使用。合成碳水化合物包括但不限于糖苷键被硫醇或碳键取代的那些。可以使用D和L形式的碳水化合物。碳水化合物可以是非还原性的或还原性的。当使用还原性碳水化合物时，优选地添加美拉德反应的抑制剂。适用于组合物中的还原性碳水化合物是本领域已知的那些还原性碳水化合物，这些还原性碳水化合物包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖和乳果糖。非还原性碳水化合物包括但不限于选自糖醇和其他直链多元醇的多羟基化合物的非还原性糖苷。其他有用的碳水化合物包括棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、纤维二糖、甘露二糖和糖醇。糖醇糖苷优选地为单糖苷，特别是通过对二糖比如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽糖进行还原获得的化合物。玻璃形成剂选自包括蔗糖、甘露醇、海藻糖、甘露糖、棉子糖、乳糖醇、乳糖酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、麦芽糖、乳糖山梨糖醇、右旋糖、岩藻糖、或其组合的组。
然而，根据第六实施方式的优选方面，免疫原性组合物包含蔗糖作为合适的碳水化合物稳定剂，其重量/体积(w/v)的范围在1％至20％之间，优选地在1％至10％之间，更优选地在3％至6％之间，最优选地小于或等于5％。
根据本公开的第七实施方式，一个或更多个氨基酸包括但不限于亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、或者氨基酸、肽、水解蛋白质或诸如血清白蛋白之类的蛋白质的组合。
然而，根据第七实施方式的优选方面，免疫原性组合物包含甘氨酸作为合适的氨基酸稳定剂，其重量/体积(w/v)的范围在1％至20％之间，优选地在1％至10％之间，更优选地在3％至6％之间，最优选地小于或等于5％。
根据本公开的第八实施方式，免疫原性组合物可以另外包含选自包括碳酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂和酒石酸盐缓冲剂的组的缓冲剂、以及包含磷酸盐缓冲剂的更复杂的有机缓冲剂，该磷酸盐缓冲剂含有磷酸钠和/或磷酸钾，磷酸钠和/或磷酸钾以一定比率选择成实现期望的pH。在另一示例中，缓冲剂含有经配制以实现期望pH的三(羟甲基)氨基甲烷或“Tris”。在另一示例中，缓冲剂可以是含Hank盐的最低必需培养基。
根据本公开的第九实施方式，免疫原性组合物可以另外包含防腐剂，该防腐剂选自包括下述各者的组：所述各者为2-苯氧基乙醇、苄索氯铵(Phemerol)、苯酚、间甲酚、硫柳汞、甲醛、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对氯间甲酚、或苯甲醇、或其组合。
根据本公开的第十实施方式，免疫原性组合物可以另外包含选自包括表面活性剂、聚合物和盐的组的药学上可接受的赋形剂。表面活性剂的示例可以包括非离子表面活性剂比如聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80等。聚合物的示例可以包括葡聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、环糊精等。盐的示例可以包括NaCl、MgCl2、KCl、CaCl2等。
根据本公开的第十一实施方式，免疫原性组合物可以另外包含选自包括铝盐、氢氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝和硫酸铝钾的组的佐剂。
根据本公开的第十二实施方式，免疫原性组合物可以另外包含免疫刺激组分，该免疫刺激组分选自包括下述各者的组：所述各者为油和水乳剂、MF-59、脂质体、脂多糖、皂角苷、脂质A、脂质A衍生物、单磷酰基脂质A、3-脱酰基的单磷酰基脂质A、AS01、AS03、寡核苷酸、包含至少一个未甲基化CpG和/或脂质体的寡核苷酸、弗氏佐剂、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、聚合物、共聚物比如包括嵌段共聚物的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚合物p1005、CRL-8300佐剂、间苯二甲酰二肽、TLR-4激动剂、鞭毛蛋白、衍生自革兰氏阴性细菌的鞭毛蛋白、TLR-5激动剂、能够结合TLR-5受体的鞭毛蛋白的片段、QS-21、ISCOMS、皂苷与固醇和脂质的组合。
根据本公开的第十三实施方式，所述免疫原性组合物被冻干(冷冻干燥)。
根据本公开的第十四实施方式，冻干的免疫原性组合物在2摄氏度-8摄氏度下稳定持续12个月至36个月，在25摄氏度下持续2个月至6个月，在37摄氏度下持续1周至4周，在42摄氏度下持续2天-7天，在55摄氏度下持续2天-7天。
根据本公开的第十五实施方式，一种用于重构冻干的免疫原性组合物的方法包括以下步骤：用可选地盐水或注射用水(WFI)的水溶液重构该冻干的免疫原性组合物。
根据本公开的第十六实施方式，免疫原性组合物在重构后的最终pH在pH 6.0至pH8.0的范围内，更优选地在pH 7.0至pH 8.0的范围内，更优选地在pH 7.2至pH 7.9的范围内，并且最优选地在pH 7.5至pH 7.9的范围内。
根据本公开的第十七实施方式，用于制备减毒活嵌合/重组四价登革热(DEN)疫苗组合物的方法包括以下步骤的任何子集或全部：
a)使Vero细胞复活并且使其适于在含Hank盐溶液和10％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)中生长
b)将Vero细胞最初在组织培养瓶(具有可用于细胞生长的175cm2表面积的TCF)中扩增，从而产生Vero细胞的主库和工作库
c)使来自工作细胞库的冷冻保存的细胞复活，扩增并进一步在滚瓶中传代(可用于细胞生长的850cm2表面积)，并且在37℃±1℃下孵育以获得单层
d)用登革热病毒血清型1、2、3和4的工作种子感染滚瓶中的Vero细胞单层
e)将所有滚瓶在34℃±1℃下孵育20分钟，并且使用含Hank盐溶液和2％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)将体积补足至120ml/RB。进一步地，将所有滚瓶在34℃±1℃和0.7RPM滚动速度下孵育2天
f)在第2天，用不含胎牛血清的新鲜病毒培养基来洗涤滚瓶中的单层，并且将RBs在34±1℃下以0.7RPM滚动速度孵育3天
g)在感染后第5天，收集来自所有感染的滚瓶的细胞上清液，并且用不含胎牛血清的新鲜病毒培养基重新进料瓶
h)取多个收获物并单独处理以获得澄清的单价病毒库(CMVP)
i)通过至少一个澄清过滤器通过直流过滤(DFF)来过滤病毒收获物
j)用非特异性核酸内切酶处理病毒收获物以降解细胞DNA
k)将经处理的病毒收获物进行切向流过滤
l)用包含至少一个氨基酸和至少一个碳水化合物的稳定剂来稳定病毒收获物，以形成稳定的病毒收获物
m)通过至少一个灭菌级过滤器通过DFF对稳定的病毒收获物进行灭菌
n)将每种登革热病毒血清型的澄清的单价病毒库(CMVP)储存在-60℃或温度更低的聚碳酸酯瓶中
o)将所有四种病毒血清型的澄清的单价病毒库(CMVP)混合在一起以获得最终散装物，将该散装物填充在小瓶中并冻干以获得药物产品，即，重组登革热四价疫苗(减毒活疫苗)
根据第十七实施方式的第一方面，使用的Vero细胞系是ATCC CCL-81(cGMPVero，源自非洲绿猴的肾脏细胞(Cercopithecus aeothiops；可获自ATCC，马萨那斯，弗吉尼亚州，美国)。
根据第十七实施方式的第二方面，在丢弃输入材料并单独处理以获得澄清的单价病毒库(CMVP)之前，以适当的时间间隔进行多次收获约4次-5次，更优选地在第5天、第7天、第9天和第11天进行4次。与常规的单次收获方法相比，在多次收获的情况下，相同数量的输入材料可带来更高的产量。这也节省了用于上游加工，即，用于感染的细胞扩增，的时间和总生产成本。
根据第十七实施方式的第三方面，其中，病毒培养基包括具有Hank盐溶液的最低必需培养基(MEM)，该Hank盐溶液另外包含右旋糖、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠。
根据第十七实施方式的第四方面，通常通过减小孔径(例如6μ、0.8μ、0.45μ、0.2μ)的过滤器来澄清含有病毒的培养基。合适的市售过滤器和过滤装置是本领域众所周知的，并且可以由本领域技术人员选择。示例性过滤装置包括例如Millipak(Millipore)过滤装置、Kleenpak(Pall)过滤装置和Sartobran TM P过滤装置。
根据第十七实施方式的第五方面，将过滤的收获物用非特异性核酸内切酶、最优选地核酸酶来处理，其中，浓度在1单位/ml-10单位/ml之间变化，温度在4℃-37℃之间，并且间隔在2小时至12小时之间。
根据第十七实施方式的第六方面，使经核酸酶处理的收获物通常通过截留分子量(MWCO)为500KD，更优选地为300KD，最优选地为100KD的过滤器进一步经受切向流过滤(TFF)。
根据第十七实施方式的第七方面，对病毒收获物进行切向流过滤(TFF)，从而促成至少10倍浓度的病毒收获物，并且进一步促成残余杂质的去除。
还优选地，残余杂质包括残余DNA、残余牛血清白蛋白(BSA)和残余宿主细胞蛋白。
根据第十七实施方式的第八方面，上述方法产生了纯化和浓缩的黄病毒制剂，更优选地登革热病毒制剂，其中，制剂包含浓缩的减毒活登革热病毒颗粒、痕量的残余细胞DNA(＜10ng/剂量)、残余BSA(<50ng/剂量)和残余细胞蛋白。此外，根据上述方法，经纯化的病毒的总回收率为至少50％。
根据第十七实施方式的第九方面，将包含一个或更多个氨基酸和一个或更多个碳水化合物的溶液的稳定剂与浓缩病毒原液(TFF浓缩物)以60:40或50:50或40:60的原液与稳定剂的比例混合以获得最终制剂。
还优选地，将包含浓度为7.5％至15％(w/v)的蔗糖和浓度为7.5％至15％(w/v)的甘氨酸的溶液的稳定剂与浓缩的病毒原液(TFF浓缩物)以病毒原液与稳定剂的比例为60:40或50:50或40:60混合，以获得包含浓度为3％至6％(w/v)的蔗糖和浓度为3％至6％(w/v)的甘氨酸的最终制剂。
还优选地，将包含浓度为12.5％(w/v)的蔗糖和浓度为12.5％(w/v)的甘氨酸的溶液的稳定剂与浓缩的病毒原液(TFF浓缩物)以病毒原液与稳定剂的比例为60:40混合，以获得包含浓度为5％(w/v)的蔗糖和浓度为5％(w/v)的甘氨酸的最终制剂。
还优选地，将包含浓度为11.25％(w/v)的蔗糖和浓度为12.5％(w/v)的甘氨酸的溶液的稳定剂与浓缩的病毒原液(TFF浓缩物)以病毒原液与稳定剂的比例为60:40混合，以获得包含浓度为4.5％(w/v)的蔗糖和浓度为5％(w/v)的甘氨酸的最终制剂。
还优选地，将包含浓度为15％(w/v)的蔗糖和浓度为15％(w/v)的甘氨酸的溶液的稳定剂与浓缩的病毒原液(TFF浓缩物)以病毒原液与稳定剂的比例为60:40混合，以获得包含浓度为6％(w/v)的蔗糖和浓度为6％(w/v)的甘氨酸的最终制剂。
根据第十七实施方式的第十方面，对于每种登革热血清型，黄病毒、更优选地登革热病毒的用以获得主种子和工作种子的感染复数(MOI)在0.01至0.1的范围内。
还优选地，登革热病毒的用以获得主种子和工作种子的感染复数(MOI)为0.01。
根据第十七实施方式的第十一方面，免疫原性组合物包含黄病毒，更优选地包含剂量为不低于每种登革热病毒血清型1、2、3和4的2.5log10PFU/0.5ml的登革热病毒。
根据第十七实施方式的第十二方面，免疫原性组合物包含登革热病毒，其剂量为每种登革热病毒血清型1、2、3和4的log 103至log105PFU/0.5ml，更优选地log103至log104PFU/0.5ml，最优选地log103PFU/0.5ml。
根据本公开的第十八实施方式，免疫原性组合物的冻干(冷冻干燥)的方法包括冷冻、初步干燥和二次干燥的步骤。
还优选地，减毒活嵌合/重组四价登革热(DEN)疫苗组合物的冻干(冷冻干燥)方法包括以下步骤中的任何子集或全部：
a)在20℃至5℃之间的温度下的产物负载
b)在每个温度下随着保持时间逐步冷冻，其中，冷冻步骤包括在约-30℃至-45℃下以0.5℃/min至1℃/min的冷冻速率冷冻约60分钟至930分钟
c)在-20℃退火5小时，然后在-45℃冷冻
d)初步干燥包括以约0.5℃/分钟逐步升温至1.0℃/分钟，以达到约-25℃至-32℃的库存温度，并且在约55μbar的压力下保持约600分钟至1980分钟
e)二次干燥涉及以0.5℃/min至1.0℃/min的速率加热产物，以达到约25℃至30℃的库存温度，并且在55μbar的压力下保持约360分钟至600分钟
冻干循环的总持续时间为约48小时至56小时。考虑了根据小瓶规格和冻干机设计的温度和循环持续时间的变化。基于预定的循环将产物冻干，以达到约2.0％w/w至3.5％w/w的目标水分含量。
如本文所使用的，术语“冷冻干燥”或“冻干(lyophilize)”或“冻干(lyophilization)”涉及冻干，并且是指将悬浮液冷冻的过程，此后通过在低压下升华来去除水。如本文中所使用的，术语“升华”是指组合物的物理性质的变化，其中，该组合物直接从固态变为气态而不变成液体。
根据本公开的第十九实施方式，免疫原性组合物被配制成用于使用在减少健康状况的发作或预防健康状况的方法中，该方法包括经由肌内、或静脉内、皮下、或经皮、或皮内向人类受试者施用有效量的免疫原性组合物。
根据本公开的第二十实施方式，健康状况选自包括下述各者的组：所述各者为登革热病毒感染、寨卡病毒感染、西尼罗河感染、日本脑炎感染、昆金病毒感染、蜱传脑炎感染、圣路易斯脑炎病毒感染、墨累谷脑炎病毒感染、黄热病病毒感染。
根据本公开的第二十一实施方式，免疫原性组合物可以以有效产生中和抗体和保护的剂量经由皮下、皮内或肌内施用。疫苗以与剂量制剂相容的方式施用，并且以预防和/或治疗有效的量施用。本公开的免疫原性组合物可以作为主要预防药剂给予处于感染风险中的成人或儿童，或者可以用作治疗感染患者的辅助药剂。例如，本文所公开的减毒活登革热(DEN)四价活疫苗组合物可以用于处于登革热病毒感染风险中的成人或儿童，或者可以用作治疗登革热病毒感染患者的辅助药剂。
根据本公开的第二十二实施方式，免疫原性组合物可以配制为单剂量小瓶、多剂量小瓶或预填充注射器，其中，所述免疫原性组合物可以以单剂量方案或优选地多剂量方案给予，其中，疫苗接种的主要过程可以用1个-2个单独的剂量，然后以维持和/或加强免疫应答所需的后续时间间隔——例如在1个-4个月给予第二剂量——给予其他剂量，并且如果需要，在几个月或几年之后给予后续剂量。剂量方案还将至少部分地根据赋予保护性免疫所需的加强剂量的需要来确定。
本文所公开的其他实施方式还涵盖疫苗试剂盒，该疫苗试剂盒包括第一容器和第二容器，该第一容器包含冻干的(冷冻干燥的)免疫原性组合物，该第二容器包含水溶液，该水溶液可选地为盐水或WFI(注射用水)，用于重构该冻干的(冷冻干燥的)免疫原性组合物。
在整个说明书中，词语“包括(comprise)”或变型比如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的元件、整数或步骤，或元件组、整数组或步骤组，但不排除任何其他元件、整数或步骤，或元件组、整数组或步骤组，并且可以表示“包括(includes)”、“包含(including)”等。“基本上由...组成”或“主要包括”同样具有美国专利法中所赋予的含义，并且该术语是开放式的，从而允许存在比所列举的内容更多的内容，只要所列举的内容的基本或新颖特征不会因存在比所列举的内容更多的内容而改变即可，但排除现有技术实施方式。
在整个说明书中，词语“免疫原性组合物”涵盖引发针对由载体表达的感兴趣的抗原或免疫原的免疫应答的任何组合物。例如，在施用于受试者之后，引发针对靶向免疫原或感兴趣的抗原的免疫应答。术语“疫苗组合物”和“疫苗”涵盖诱导针对感兴趣的抗原的保护性免疫应答或者有效地防御抗原的任何组合物。例如，在施用或注射到受试者中之后，引发针对靶向抗原或免疫原的保护性免疫应答或者提供针对由载体表达的抗原或免疫原的有效保护。
表述“至少”或“至少一个”的使用暗示使用一个或更多个元件或成分或数量，这是因为该使用可以在本发明的实施方式中实现一个或更多个期望的目的或结果。尽管已经描述了本发明的某些实施方式，但是这些实施方式仅通过示例的方式呈现，并且并非旨在限制本发明的范围。，本领域技术人员在阅读本文的公开内容之后可以在本发明的范围内对本发明的制剂进行变化或修改。这样的变化或修改完全在本发明的精神之内。
对于各种物理参数、尺寸和数量给出的数值仅为近似值，并且可以设想，高于分配给物理参数、尺寸和数量的数值的值落入本发明的范围内，除非在说明书中有相反的陈述。
类似地，纯化中所用的组分例如过滤器、柱并非旨在以任何方式进行限制或排除，并且可以根据从业者的判断代替其他组分以实现相同的目的。
尽管本文中已经将相当多的重点放在优选实施方式的特定特征上，但是应当理解的是，在不脱离本公开的原理的情况下，可以添加许多附加特征并且可以在优选实施方式中进行许多改变。根据本文的公开内容，本公开的优选实施方式中的这些及其他变化对于本领域技术人员而言将是明显的，由此应当清楚地理解，前述描述性内容应当仅被解释为是对本公开的举例说明而非限制。
优点
本文中上面所描述的本公开具有若干技术进步和优点，所述若干技术进步和优点包括但不限于实现稳定的冻干免疫原性组合物及其制造方法，该稳定的冻干免疫原性组合物包含减毒活重组登革热病毒、至少一个碳水化合物、至少一个氨基酸。当与其他冻干的免疫原性组合物相比时，本公开提供以下优点：
1.疫苗组合物中涉及的最少组分
2.重组疫苗保留了病毒的期望特性，所述期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性
3.在2℃-8℃、25℃、37℃、42℃和55℃下延长的时间段的改进的稳定性
4.不含防腐剂、聚合物和表面活性剂
5.制造这种稳定的组合物/制剂的改进的方法，该改进的方法促成提高的产率。
示例：
包括以下示例以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解的是，在以下示例中公开的组合物和技术代表发明人发现的在本文所公开的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，鉴于本公开，本领域技术人员应当理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在所公开的特定实施方式中进行许多改变，并且仍获得相同或相似的结果。
示例1
多次收获与单次收获
进行某些实验以初步鉴定适用于临床前测试和临床测试的免疫原性组合物的制造方法，并且鉴定出黄病毒免疫原性组合物或疫苗的用途。在一些示例性方法中，减毒活重组/嵌合登革热病毒在各种组合物中用作示例性黄病毒，以用于临床前测试和临床测试。候选登革热疫苗菌株由美国国立卫生研究院(NIH)提供。
用于制造减毒活嵌合/重组四价登革热(DEN)疫苗组合物的方法包括以下步骤中的任何子集或全部：
1.使Vero细胞复活并且使其适于在含Hank盐溶液和10％胎牛血清(FBS)的最低必需培养基(MEM)中生长。
2.将Vero细胞最初在组织培养瓶(具有可用于细胞生长的175cm2表面积的TCF)中扩增，从而产生Vero细胞的主库和工作库。
3.使来自工作细胞库的冷冻保存的细胞复活，扩增并进一步在滚瓶(RB)中传代(可用于细胞生长的850cm2表面积)，并且在37℃±1℃和0.7RPM滚动速度下孵育以获得单层。
4.用登革热病毒血清型1、2、3和4的工作种子以0.01MOI感染滚瓶中的Vero细胞单层。
5.将所有滚瓶在34℃±1℃下孵育20分钟，并且使用含Hank盐溶液和2％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)将体积补足至120ml/RB。进一步地，将所有滚瓶在34℃±1℃和0.7RPM滚动速度下孵育2天。
6.在第2天，用不含胎牛血清的新鲜病毒培养基来洗涤滚瓶中的单层，并且将RBs在34±1℃下以0.7RPM滚动速度孵育3天在第2天，用不含胎牛血清的新鲜病毒培养基来洗涤滚瓶中的单层，以去除痕量的FBS，并且在34℃±1℃和0.7RPM滚动速度下孵育3天。
7.在感染后第5天，收集来自所有感染的滚瓶的细胞上清液，并且用包含MEM但不含胎牛血清的新鲜病毒培养基重新进料瓶，其中，该MEM具有另外包含右旋糖、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的Hank盐溶液。
以在不同时间点(从感染后第4天至第12天)如每天、奇数天、偶数天等的单次收获和多次收获的方式执行用于收获登革病毒的各种方法。进行了单次收获与多次收获的病毒效价相对于产量的比较。
从第4天开始，在相应的天按设定方式(设定为1至4)收获感染的RB。收获之后，用新鲜的病毒培养基VM对RB重新进料，并且在34℃下孵育直至下一次收获。此外，分别在第6天(设定5)和第7天(设定6)收集单次收获的上清液。
通过Spearman Karber方法测试这些样品的病毒效价(CCID50)。
用登革热病毒血清型1(DEN 1)获得的生长曲线显示，在第5天、7天、9天和11天的多次收获给出良好的病毒效价，并且因此将成为另外批次的选择(参见图4)。
对Den 2、Den 3和Den 4，使用18RB进行了关于多次收获与单次收获的另一项试验。
有关使用90个滚瓶的DEN 2、DEN 3、DEN 4病毒的对数产量效价请参见图5(多次收获与单次收获)
来自单一批次的多次收获的累积产量比通过单次收获获得的产量高得多(约0.4log至0.6log)。由于0.3log相当于绝对值的两倍，因此这种差异更为明显。因此，与单次收获相比，多次收获的方法更有益和更优选。
示例2：
登革热病毒在Vero细胞上生长。因此需要从收获物中去除杂质。诸如宿主细胞DNA之类的杂质用Benzonase处理。
核酸酶浓度和温度对细胞DNA含量和病毒效价的影响
1.取多个收获物并单独处理以获得澄清的单价病毒库(CMVP)
2.通过6μ+0.45μ过滤器来澄清这些多个收获物，并且用核酸酶处理以降解细胞DNA
3.进行了各种实验，以鉴定用于处理收获物的理想的核酸酶浓度和温度
在该实验中，在34℃±1℃下以四种不同的浓度500单位/升、1250单位/升、2500单位/升和5000单位/升加入核酸酶持续2小时。观察到：在核酸酶的浓度为1250单位/升、2500单位/升和5000单位/升时，存在DNA的最佳降解。基于结果，选择1250单位/升作为工作浓度。
参见图6：核酸酶浓度对DNA含量的影响
参见图7：温度对细胞DNA含量和病毒效价的影响
登革热病毒对长时间的温度敏感，因此在实验中使用短时间的暴露，即在不同温度下暴露2小时。观察到在37℃下效价损失，而DNA含量低。在34℃，病毒效价没有损失，DNA含量低。在25℃和2至8℃的温度下，病毒效价没有损失，DNA降解也更少。因此选择34℃进行处理。
示例3：过滤和浓缩
1.登革热病毒在Vero细胞上生长。因此需要从收获物中去除杂质。
2.杂质，例如宿主细胞DNA，宿主细胞蛋白，残余BSA和残余苯并ase酶。
3.切向流过滤(TFF)是用来去除这些杂质的过程。
4.将经过苯佐菌酶处理的收获物进行TFF去除杂质。
在最初的实验中，使用300KD的Millipore V筛选盒和Pall T系列300KD进行了TFF。观察到渗透物中的病毒损失≥3.5log。因此，计划将暗盒尺寸更改为100KD。在这些实验中，观察到在密理博盒中渗透物中没有病毒。
在根据结果对TFF进行各种试验后，仅用10倍浓缩工艺筛选出100KD V的默克密理博暗盒，这为我们提供了期望的产物。病毒被浓缩以减少散装疫苗和去除杂质的存储空间需求。基于下表，可以清楚地看出，在Benzonase处理和TFF处理后，病毒效价没有明显下降，宿主细胞DNA也没有明显去除。
CVP：澄清病毒库(过滤后收获)
BCVP：用核酸酶处理的CVP
CMVP：澄清的单价病毒库(TFF后，添加稳定剂，0.2μ过滤后)
示例4：
各种稳定剂的研究及稳定剂制剂的优化
使用各种稳定制剂(例如，效价损失或Log10PFU/剂量)测试了减毒活黄病毒免疫原性组合物的稳定性作为效力损失的函数。
如表11和表12所示，使用不同的稳定剂组合来配制登革热单价散装物。这些稳定剂的主要组分是明胶、山梨糖醇、蔗糖、甘氨酸、磷酸盐(KH2PO4，K2HPO4)、谷氨酸盐、乳清蛋白水解物(LAH)和氨基酸比如L-组氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-丙氨酸、三甲基甘氨酸等。
稳定剂-II包含L-组氨酸(2.1％)、L-丙氨酸1％、三甲基甘氨酸(3％)、L-精氨酸盐酸盐(16％)、乳清蛋白水解物(3.5％)。
获得的TFF病毒浓缩物的体积使用不同的稳定剂组合稳定化，如下所述：
所有这些制剂在37℃下进行7天的热稳定性研究。在第0天、1天、3天、5天和7天通过CCID50间歇地测试样品的传染性效价。
各种液体制剂的传染性效价的结果显示，在相应的登革热病毒效价中，效价显著下降，然后完全丧失(1天至5天后)。
液体制剂不能保持稳定性的这种失败促使尝试冻干制剂。将含有明胶+山梨糖醇+稳定剂II(稳定剂E)的登革热单价散装物冻干，并且在37℃下进行7天的热稳定性研究。在第0天、1天、3天、5天和7天通过CCID50间歇地测试样品的传染性效价。与液体制剂相比，传染性效价的结果显示出更好的稳定性，并且显著保留了病毒效价。因此，登革热单价制剂的冻干方法成功克服了稳定性差的问题，并且发现病毒效价的损失显著降低。
还尝试了由蔗糖+甘氨酸组成的另一稳定剂G，并且对于所有四种登革热病毒而言，该另一稳定剂G呈冻干制剂的形式是优异的。在第0天、1天、3天、5天和7天通过CCID50间歇地测试样品的传染性效价。与其他稳定剂例如明胶+山梨糖醇+稳定剂II相比，该另一稳定剂G的传染性效价的结果显示出更好的稳定性。此外，该另一稳定剂G易于制备和使用，这是因为它来自非动物来源。
参见图8：DEN-1效价CCID50/ml(液体与冻干)
参见图9：DEN 2效价CCID50/ml(液体与冻干)
NT-未测试
参见图10：DEN-3效价CCID50/ml(液体与冻干)
请参见图11：DEN 4效价CCID50/ml(冻干)
参照稳定性研究的所有上述结果，使用LYO 2(蔗糖和甘氨酸)来获得更好的稳定性曲线。因此，蔗糖和甘氨酸的稳定剂组合物被进一步优化以获得更稳定的制剂。
示例5：
冻干条件
对于登革热疫苗的开发，最初已经尝试了用于液体疫苗的各种不同的稳定剂制剂，但是发现病毒在液体制剂中不能保持稳定，并且在37℃下储存5天内液体制剂存在显著的效价损失。液体制剂对登革热疫苗无效。因此，进一步决定使用冻干进行登革热疫苗散装物的下一试验。
计划不同的冻干试验并在登革热单价以及四价散装物上执行所述不同的冻干试验，以研究稳定剂用于疫苗制剂的适用性和所有四种病毒血清型在低温储存期间在四价混合物中的稳定性。
研究试验显示，冻干形式的病毒比液体形式的病毒更稳定，并且冻干后未观察到病毒效价损失，如示例4所示。
选择了冻干形式的登革热疫苗，以获得更好的产品稳定性。如示例4所示，通过使用含有明胶-山梨糖醇或蔗糖-甘氨酸作为稳定剂的登革热CMVP-散装物来进行冻干试验。由于明胶是猪来源的，并且目前在疫苗中使用明胶存在一些伦理学问题。其制备的复杂性还要求明胶在高温下水解。在使用明胶-山梨糖醇稳定剂的情况下，在所有四种血清型的传染性效价中均没有一致性，并且从解冻步骤到冻干步骤均没有观察到相当大的病毒损失。
在用明胶+山梨糖醇+稳定剂II对登革热散装物进行一些冻干试验后，转向了蔗糖+甘氨酸，如示例4所示，冻干试验显示，与LYO 1制剂相比，LYO 2制剂具有更好的病毒稳定性。
在1号至7号试验中，冻干循环持续时间从56小时的标准循环改变。冻干循环时间的减少对效价损失和水分含量有影响。然而，病毒效价没有重大损失，随着循环时间的减少，水分含量从2.50％w/w增加到3.34％w/w。因此，冻干循环持续时间设定在56小时左右。
参见图12：冻干循环
示例6：登革热病毒单价散装物在37℃±1℃下冻干14天后的稳定性数据
用不同浓度的蔗糖和甘氨酸配制登革热病毒单价散装物(DEN 1、2、3、4)，以获得包含如表19所附的蔗糖和甘氨酸浓度的最终制剂(SG1、SG2、SG3、SG4、SG5、SG6)。使用标准冻干方案将稳定的单价制剂冻干。将如下表中所附的所有冻干的单价和四价登革热制剂在37℃±1℃下进行热稳定性研究14天。在各个时间点收集样品并测试传染性效价。
参见图13:冻干后的DEN-1效价Log10 pfu/ml
参见图14:冻干后的DEN-2效价Log10 pfu/ml
参见图15:冻干后的DEN-3效价Log10 pfu/ml
参见图16：冻干后的DEN-4效价Log10 pfu/ml
对于包含不同浓度的蔗糖和甘氨酸稳定剂的冻干单价制剂，上述热稳定性结果表明蔗糖和甘氨酸的浓度在维持病毒传染性效价中起主要作用。
用SG1和SG2制剂观察到病毒效价的相对更多变化。SG3、SG4、SG5、SG6制剂在所有四种血清型中未观察到显著差异。然而，SG3，即，5％蔗糖和5％甘氨酸制剂是用于另外批次的稳定剂组合物的选择。
示例7：
减毒活登革热四价疫苗(重组，冻干)的稳定性数据
具有血清型(DEN-1、DEN 2、DEN-3、DEN-4)的组合的登革热四价疫苗(DTV)(活的，减毒的，重组的)，所述血清型(DEN-1、DEN 2、DEN-3、DEN-4)的组合使用如示例6中所附的蔗糖-甘氨酸(SG)组合物稳定，并且根据示例5在3ml管状USP 1型玻璃小瓶中进一步冻干。容器封闭系统由溴化丁基橡胶塞和可翻转的铝盖密封件和塑料盖密封件组成。在上述容器封闭系统中评估了SG稳定化疫苗的稳定性和质量，以根据ICH的用以支持DP有效期的要求进行后续研究。
长期/实时稳定性研究的稳定性指示参数如下：
1.每种血清型的病毒效价
2.pH
3.水分含量
1.登革热四价疫苗冻干后在2℃-8℃下多至12个月的稳定性数据：
参见图17A：冻干后在2℃-8℃下多至12个月的DEN-1效价Log10 pfu/0.5ml数据
参见图17B：冻干后在2℃-8℃下多至12个月的DEN-2效价Log10 pfu/0.5ml数据
参见图17C：冻干后在2℃-8℃下多至12个月的DEN-3效价Log10 pfu/0.5ml数据
参见图17D：冻干后在2℃-8℃下多至12个月的DEN-4效价Log10 pfu/0.5ml数据
在2℃-8℃下多至12个月对pH和水分含量进行估计。pH值保持在7.6至7.8的范围内(图18)。残余水分含量均低于3.0％w/w多至12个月储存为止(图19)。
2.登革热四价疫苗冻干后在25℃±2℃下和60％±5％相对湿度下多至6个月的稳定性数据：
参见图20A：冻干后在25℃±2℃下多至6个月的DEN-1效价Log10 pfu/0.5ml数据
参见图20B：冻干后在25℃±2℃下多至6个月的DEN-2效价Log110 pfu/0.5ml数据
参见图20C：冻干后在25℃±2℃下多至6个月的DEN-3效价Log10 pfu/0.5ml数据
参见图20D：冻干后在25℃±2℃下多至6个月的DEN-4效价Log10 pfu/0.5ml数据
在25℃±2℃下多至6个月(暴露6个月后)在初始时间点和最终时间点估计pH和水分含量。与初始值相比，在加速条件下储存6个月，pH值没有发生变化(p<0.001)；平均值±3SD从7.60-7.79变为7.54-7.71(图21)。储存6个月后，残余水分含量保持在3％w/w的上限内，平均值±3SD为1.845w/w-2.774％w/w(图22)。
3.登革热四价疫苗冻干后在37℃±1℃下多至7天的稳定性数据：
将批次暴露于37℃±1℃下持续7天。对病毒血清型(DEN1-DEN4)进行滴定并计算效价损失。效价损失在所有批次中是一致的。冻干DTV中登革热1至登革热4血清型的病毒效价的平均Log10损失和标准偏差分别为0.604±0.117、0.607±0.066、0.548±0.130、0.684±0.109(图23)。
参见图23：登革热四价疫苗冻干后在37℃±1℃下多至7天的稳定性数据
4.登革热四价疫苗冻干后在42℃±1℃下多至7天的稳定性数据：
针对代表性批次来评估登革热四价疫苗(DTV)(活的，减毒的)的稳定性。将冻干的成品小瓶暴露于42℃下的热应力条件持续7天。在暴露期结束时滴定每种病毒血清型(DEN1-DEN4)，与初始效价进行比较并且计算效价损失。
(参见图24)
5.登革热四价疫苗冻干后在55℃±1℃下多至2天的稳定性数据：
针对代表性批次来评估登革热四价疫苗(DTV)(活的，减毒的)的稳定性。将冻干的成品小瓶暴露于55℃下的热应力条件持续2天。在暴露期结束时滴定每种病毒血清型(DEN1-DEN4)，与初始效价进行比较并且计算效价损失。
尽管已经参照某些优选实施方式描述了本发明，但是对于本领域技术人员而言将明显的是，在不脱离如所附权利要求限定的本发明的范围的情况下可以进行各种改变和修改。
Claims (52)
1.一种免疫原性组合物，包含：
a)一个或更多个减毒活黄病毒；
b)一个或更多个约3％至6％(w/v)的碳水化合物；以及
c)一个或更多个约3％至6％(w/v)的氨基酸；
其中，所述组合物适于冷冻干燥处理，并且重构的组合物保留病毒的期望特性，所述期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述一个或更多个减毒活黄病毒是重组黄病毒或嵌合黄病毒。
3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述一个或更多个减毒活黄病毒选自包括下述各者的组：所述各者为登革热(DEN)病毒、黄热病(YF)病毒、日本脑炎(JE)病毒、昆津病毒、西尼罗河(WN)病毒、蜱传脑炎(TBE)病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、寨卡病毒、嵌合登革热(黄热病-登革热)病毒、嵌合YF-WN(黄热病-西尼罗河)病毒、嵌合YF-JE(黄热病-日本脑炎)病毒、或其任何相关的黄病毒。
4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述一个或更多个减毒活黄病毒包含登革热(DEN)病毒，可选地包含选自DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的组的不同血清型的多个减毒活登革热(DEN)病毒。
5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，所述减毒活登革热(DEN)病毒是四价的并且包含登革热病毒血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4。
6.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其中，所述减毒活登革热(DEN)病毒是重组登革热病毒和/或嵌合登革热病毒，其包含对来自第一登革热病毒的至少一个结构蛋白进行编码的第一核苷酸序列和对来自第二登革热病毒的非结构蛋白进行编码的第二核苷酸序列。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述减毒活登革热病毒血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4在登革热病毒基因组的3’非转化区中携带表示为Δ30突变的30个核苷酸缺失和/或表示为Δ31突变的31个核苷酸缺失。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述减毒活登革热病毒血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4具有在Vero细胞或人肝细胞系HuH-7中对温度敏感的表型。
9.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述一个或更多个碳水化合物选自包括下述各者的组：所述各者为天然碳水化合物、合成碳水化合物、单糖、二糖、三糖、寡糖、还原糖、非还原糖、糖醇、多元醇、多羟基化合物、化学改性的碳水化合物、糖共聚物、玻璃化转变促进剂，其中，所述玻璃化转变促进剂选自包括蔗糖、甘露醇、海藻糖、甘露糖、棉子糖、乳糖醇、乳糖酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、麦芽糖、乳糖山梨糖醇、右旋糖、岩藻糖、或其组合的组。
10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其中，所述碳水化合物中的至少一个碳水化合物是蔗糖。
11.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述一个或更多个氨基酸选自包括亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、或其组合的组。
12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中，所述氨基酸中的至少一个氨基酸是甘氨酸。
13.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，还包含佐剂。
14.根据权利要求13所述的免疫原性组合物，其中，所述佐剂包含铝盐，可选地为氢氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝和硫酸铝钾中的至少一者。
15.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，还包含至少一个附加的免疫刺激组分，所述至少一个附加的免疫刺激组分选自包括下述各者的组：所述各者为油和水乳剂、MF-59、脂质体、脂多糖、皂角苷、脂质A、脂质A衍生物、单磷酰基脂质A、3-脱酰基的单磷酰基脂质A、AS01、AS03、寡核苷酸、包含至少一个未甲基化CpG和/或脂质体的寡核苷酸、弗氏佐剂、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、聚合物、共聚物比如包括嵌段共聚物的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚合物p 1005、CRL-8300佐剂、间苯二甲酰二肽、TLR-4激动剂、鞭毛蛋白、衍生自革兰氏阴性细菌的鞭毛蛋白、TLR-5激动剂、能够结合TLR-5受体的鞭毛蛋白的片段、QS-21、ISCOMS、皂苷与固醇和脂质的组合。
16.根据权利要求1至15中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物被冻干(冷冻干燥)。
17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述冻干的组合物用可选地盐水或WFI(注射用水)的水溶液重构。
18.根据权利要求1至17中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物的最终pH为约7-8。
19.根据权利要求1至18中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述登革热病毒在vero细胞中繁殖。
20.根据权利要求19所述的免疫原性组合物，其中，Vero细胞系是ATCC CCL-81(cGMPVero，非洲绿猴的肾脏——Cercopithecus aeothiops；可获自ATCC，马萨那斯，弗吉尼亚州，美国)。
21.根据权利要求1至20中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述登革热病毒以不小于2.5log10 PFU/0.5ml的剂量存在。
22.一种免疫原性组合物，包含：
a)登革热病毒血清型1(rDEN 1Δ30)，
b)登革热病毒血清型2(rDEN 2/4Δ30)，
c)登革热病毒血清型3(rDEN 3Δ30/31)，
d)登革热病毒血清型4(rDEN 4Δ30)，
e)约3％至6％(w/v)的蔗糖
f)约3至6％(w/v)的甘氨酸
其中，所述组合物适于冷冻干燥处理，并且重构的组合物保留病毒的期望特性，所述期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性。
23.一种免疫原性组合物，包含：
a)登革热病毒血清型1(rDEN 1Δ30)，
b)登革热病毒血清型2(rDEN 2/4Δ30)，
c)登革热病毒血清型3(rDEN 3Δ30/31)，
d)登革热病毒血清型4(rDEN 4Δ30)，
e)约4％至5％(w/v)的蔗糖
f)约4至5％(w/v)的甘氨酸
其中，所述组合物适于冷冻干燥处理，并且重构的组合物保留病毒的期望特性，所述期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性。
24.一种免疫原性组合物，包含：
a)登革热病毒血清型1(rDEN 1Δ30)，NLT 2.5log10 PFU/0.5ml
b)登革热病毒血清型2(rDEN 2/4Δ30)，NLT 3.0log10 PFU/0.5ml
c)登革热病毒血清型3(rDEN 3Δ30/31)，NLT 2.5log10 PFU/0.5ml
d)登革热病毒血清型4(rDEN 4Δ30)，NLT 2.5log10 PFU/0.5ml
e)约5％(w/v)的蔗糖
f)约5％(w/v)的甘氨酸
其中，所述组合物适合于冷冻干燥处理，并且重构的组合物保留病毒的期望特性，所述期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性。
25.一种免疫原性组合物，包含：
a)登革热病毒血清型1(rDEN 1Δ30)，NLT 2.5log10 PFU/0.5ml
b)登革热病毒血清型2(rDEN 2/4Δ30)，NLT 3.0log10 PFU/0.5ml
c)登革热病毒血清型3(rDEN 3Δ30/31)，NLT 2.5log10 PFU/0.5ml
d)登革热病毒血清型4(rDEN 4Δ30)，NLT 2.5log10 PFU/0.5ml
e)约4.5％(w/v)的蔗糖
f)约5％(w/v)的甘氨酸
其中，所述组合物适合于冷冻干燥处理，并且重构的组合物保留病毒的期望特性，所述期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性。
26.一种免疫原性组合物，包含：
a)登革热病毒血清型1(rDEN 1Δ30)，NLT 2.5log10 PFU/0.5ml
b)登革热病毒血清型2(rDEN 2/4Δ30)，NLT 3.0log10 PFU/0.5ml
c)登革热病毒血清型3(rDEN 3Δ30/31)，NLT 2.5log10 PFU/0.5ml
d)登革热病毒血清型4(rDEN 4Δ30)，NLT 2.5log10 PFU/0.5ml
e)约6％(w/v)的蔗糖
f)约6％(w/v)的甘氨酸
其中，所述组合物适于冷冻干燥处理，并且重构的组合物保留病毒的期望特性，所述期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性。
27.根据权利要求1至26中的任一项所述的免疫原性组合物，还包含防腐剂。
28.根据权利要求27所述的免疫原性组合物，其中，所述防腐剂选自下述各者的组：所述各者为2-苯氧基乙醇、苄索氯铵(Phemerol)、苯酚、间甲酚、硫柳汞、甲醛、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对氯间甲酚、或其组合。
29.一种制造免疫原性组合物的方法，所述方法包括：
a)用另外含有右旋糖、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的Hanks盐溶液多次收获包含至少一个血清型登革热病毒的上清液；
b)通过孔径在约6微米至约0.45微米之间的至少一个澄清过滤器通过直流过滤(DFF)来过滤病毒收获物；
c)在34℃±1℃下用非特异性核酸内切酶处理所述病毒收获物至少2小时；
d)使用截留分子量(MWCO)为100kDa的膜通过切向流过滤(TFF)来浓缩所述病毒收获物；
e)用包含蔗糖和甘氨酸的稳定剂来稳定所述病毒收获物以形成稳定的病毒收获物；
f)通过孔径在约0.8微米至约0.2微米之间的至少一个澄清过滤器通过DFF对所述稳定的病毒收获物进行灭菌，以形成纯化病毒的无菌病毒收获物；
其中，纯化病毒的总回收率为至少50％
g)可选地，对所述无菌病毒收获物进行冷冻干燥。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述非特异性核酸内切酶是核酸酶。
31.根据权利要求29所述的方法，其中，所述病毒收获物用浓度在0.5单位/ml至5单位/ml范围内的核酸酶处理。
32.根据权利要求29所述的方法，其中，所述病毒收获物用浓度为1.25单位/ml的核酸酶处理。
33.根据权利要求29所述的方法，其中，所述病毒收获物经受切向流过滤(TFF)，导致至少10倍浓度的病毒收获物。
34.根据权利要求29所述的方法，其中，所述稳定剂包含浓度为3％至6％(w/v)的蔗糖和浓度为3％至6％(w/v)的甘氨酸。
35.根据权利要求29所述的方法，其中，所述稳定剂包含浓度为4％至5％(w/v)的蔗糖和浓度为4％至5％(w/v)的甘氨酸。
36.根据权利要求29所述的方法，其中，所述稳定剂包含浓度为5％(w/v)的蔗糖和浓度为5％(w/v)的甘氨酸。
37.根据权利要求29所述的方法，其中，所述稳定剂包含浓度为4.5％(w/v)的蔗糖和浓度为5％(w/v)的甘氨酸。
38.根据权利要求29所述的方法，其中，所述稳定剂包含浓度为6％(w/v)的蔗糖和浓度为6％(w/v)的甘氨酸。
39.根据权利要求29所述的方法，其中，所述免疫原性组合物的冻干或冷冻干燥包括冷冻、初步干燥和二次干燥的步骤。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述冷冻步骤包括在约-45℃下冷冻约690分钟至930分钟。
41.根据权利要求39所述的方法，其中，所述初步干燥步骤包括以约+0.5℃/分钟升温至1.0℃/分钟以达到约-25℃的库存温度并且保持约1800分钟至1980分钟。
42.根据权利要求39所述的方法，其中，所述二次干燥步骤包括以约+0.5℃/分钟升温至1.0℃/分钟以达到约+25℃的库存温度，并且保持约420分钟至540分钟。
43.根据权利要求39所述的方法，其中，所述冷冻步骤包括在约-45℃下冷冻约60分钟。
44.根据权利要求39所述的方法，其中，所述初步干燥步骤包括以约+0.5℃/分钟升温至1.0℃/分钟以达到约-32℃的库存温度，并且保持约600分钟至1800分钟。
45.根据权利要求39所述的方法，其中，所述二次干燥步骤包括以约+0.5℃/分钟升温至1.0℃/分钟以达到约+25℃的库存温度，并且保持约360分钟至600分钟。
46.根据权利要求29至45中的任一项所述的方法，其中，冻干的免疫原性组合物在25℃下储存延长的时间段。
47.根据权利要求29至45中的任一项所述的方法，其中，冻干的免疫原性组合物在37℃下储存延长的时间段。
48.根据权利要求29至45中的任一项所述的方法，其中，冻干的免疫原性组合物在42℃下储存延长的时间段。
49.根据权利要求29至45中的任一项所述的方法，其中，冻干的免疫原性组合物在55℃下储存延长的时间段。
50.根据权利要求1至26中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物被配制成用于使用在减少健康状况的发作或预防所述健康状况的方法中，所述方法包括经由肌内、静脉内、皮下、经皮、或皮内向人类受试者施用有效量的所述免疫原性组合物。
51.根据权利要求50所述的免疫原性组合物，其中，所述健康状况选自包括下述各者的组：所述各者为登革热病毒感染、寨卡病毒感染、西尼罗河感染、日本脑炎感染、昆金病毒感染、蜱传脑炎感染、圣路易斯脑炎病毒感染、墨累谷脑炎病毒感染、黄热病病毒感染。
52.一种试剂盒，所述试剂盒包括第一容器和第二容器，所述第一容器包含权利要求1至26中的任一项所述的免疫原性组合物，所述第二容器包含用于重构冻干(冷冻干燥)的免疫原性组合物的水溶液。
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