KR20160023683A - 뎅기 바이러스 백신 조성물 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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앤드류 베트
베스-앤 그리스월드 콜러
고빈다라잔 다나세카란
라메쉬 브이. 친탈라
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머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
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Abstract

본 발명은 제1 및 제2 뎅기 백신을 포함하는 뎅기 바이러스 백신 조성물에 관한 것이고, 여기서 제1 뎅기 백신은 생 약독화 뎅기 백신이고, 제2 뎅기 백신은 재조합 뎅기 서브유닛 백신 또는 불활성화된 뎅기 백신이고; 생 약독화 뎅기 백신은 적어도 하나의 생 약독화 뎅기 바이러스 또는 적어도 하나의 생 약독화 키메라 플라비바이러스를 포함한다. 본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물은 하나 이상의 아주반트를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제1 및 제2 뎅기 백신은 4가이다. 본 발명은 또한 뎅기 감염의 치료 또는 예방을 위해 또는 그의 발병 또는 임상 증상의 진행을 예방하거나 개선하거나 지연시키기 위해 본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

뎅기 바이러스 백신 조성물 및 그의 사용 방법{DENGUE VIRUS VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 대상체에서 뎅기 바이러스 감염, 및/또는 그의 임상 증상의 예방 및/또는 치료에 유용한, 뎅기 바이러스 감염에 대한 면역학적 반응을 유도하는 조성물에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 그 전체내용이 본원에 참고로 포함된, 2013년 6월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/837,721을 우선권 주장한다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 언급
본원의 서열 목록은 파일 명칭 "23532WOPCT-SEQLIST-13JUNE2014.TXT" (생성일 2014년 6월 13일 및 크기 17.5 KB)의 ASCII 포맷의 서열 목록으로서 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출한다. EFS-Web을 통해 제출된 상기 서열 목록은 본원 명세서의 일부이고, 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
플라비바이러스과(Flaviviridae)는 원형 황열병 바이러스 (YF), 뎅기 바이러스의 4개의 혈청형 (DEN-1, DEN-2, DEN-3, 및 DEN-4), 일본 뇌염 바이러스 (JE), 진드기 매개 뇌염 바이러스 (TBE), 웨스트 나일 바이러스 (WN), 세인트 루이스 뇌염 바이러스 (SLE), 및 약 70개의 다른 질환 유발 바이러스를 포함한다. 플라비바이러스는 양성 단일 가닥 RNA 게놈을 함유하는 작은 외피보유 바이러스이다. 10개의 유전자 생성물은 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 의해 코딩되고, 다음 순서로 조직된 폴리단백질로서 번역된다: 캡시드 (C), "전구막 (preMembrane)" (세포로부터 비리온 방출 직전에 "막" (M)으로 처리되는 prM), "외피" (E), 이어서 비-구조 (NS) 단백질 NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b 및 NS5 (문헌 [Chambers, T. J. et al., Annual Rev Microbiol (1990) 44:649-688]; [Henchal, E. A. and Putnak, J. R., Clin Microbiol Rev. (1990) 3:376-396]에서 검토됨). 이어서, 개별적인 플라비바이러스 단백질은 숙주 및 바이러스에 의해 코딩되는 프로테아제에 의해 매개되는 정확한 처리 사건을 통해 생산된다.
플라비바이러스의 외피는 숙주 세포막으로부터 유래되고, 바이러스에 의해 코딩되는 막에 고정된 막 (M) 및 외피 (E) 당단백질을 포함한다. E 당단백질은 가장 큰 바이러스 구조 단백질이고, 세포 표면 부착 및 엔도솜 내 융합 활성을 책임지는 기능적 도메인을 포함한다. 또한, 이것은 숙주 면역계의 주요 표적이고, 보호 면역과 연관되는 바이러스 중화 항체의 생산을 유도한다.
뎅기 바이러스는 아에데스(Aedes) 속, 주로 에이. 아에깁티(A. aegypti) 및 에이. 알보픽투스(A. albopictus)의 모기에 의해 인간에게 전염된다. 뎅기 바이러스 감염은 전통적인 뎅기열 (DF)을 통한 불현성 또는 경미한 열 질환으로부터 뎅기 출혈열/뎅기 쇼크 증후군 (DHF/DSS)에 이르는 다양한 임상 양성을 야기한다. 뎅기열은 고열, 두통, 관절 및 근육 통증, 발진, 림프절병증 및 백혈구감소증을 특징으로 한다 (Gibbons, R. V. and D. W. Vaughn, British Medical Journal (2002) 324:1563-1566). DHF/DSS는 아동에서 보다 흔한 감염의 보다 심각한 형태로서, 점상출혈 및 반상출혈의 존재부터 자발성 중증 출혈 및 심각한 쇼크까지 혈관 투과성 및/또는 중증 출혈성 증상으로 나타난다. 진단 및 즉각적인 의료 개입이 수행되지 않으면, DHF/DSS의 급성 발병 및 빠른 진행은 치료되지 않을 경우 치명적일 수 있다.
뎅기 바이러스는 세계적인 이환율 및 사망률의 측면에서 절지동물 전염 바이러스의 가장 유의한 군이고, 매년 1억 명에서 뎅기 감염이 발생하는 것으로 추정되고, 여기에는 적어도 3,600만 명의 뎅기열 환자 및 250,000 내지 500,000명의 DHF/DSS 환자가 포함된다 ([Gubler, D. J., Clin. Microbiol. Rev. (1998) 11:480-496]; [Gibbons, 상기 문헌]). 세계적인 인구 증가, 특히 열대 지방 전체에 걸친 도시화 및 지속되는 모기 제어 수단의 결여 때문에, 뎅기의 모기 매개체는 열대, 아열대 및 일부 온대 지역 전체에 걸쳐 그 분포를 확장하였고, 이 때문에 전세계 인구의 절반을 넘는 인구가 뎅기 감염의 위험에 노출되고 있다. 현대의 항공 여행 및 인간 이동은 뎅기 혈청형의 세계적인 분포를 촉진하였고, 이에 의해 다중 혈청형의 뎅기가 많은 지역에서 현재 풍토성이다. 지난 20년 이상 동안 뎅기 전염병의 빈도 및 DHF/DSS의 발생률이 증가하고 있다. 예를 들어, 동남 아시아에서, DHF/DSS는 아동 입원 및 사망의 주된 원인이다 ([Gubler, 상기 문헌]; [Gibbons and Vaughn, 상기 문헌]).
현재까지, 플라비바이러스 백신의 개발은 혼합된 성공을 거두었다. 플라비바이러스에 의해 유발되는 질환에 대해 보호하기 위한 백신 후보물질을 생산하기 위한 노력으로 실시된, 다음과 같은 4개의 기본적인 방법이 존재한다: 생-약독화 (live-attenuated), 불활성화된 전체 바이러스, 재조합 서브유닛 단백질, 및 DNA-기재 백신. 황열병 바이러스에 대한 생-약독화 백신은 수 십년 동안 이용가능하였고, 보다 최근에 일본 뇌염에 대한 생 약독화 백신이 전세계적으로 다양한 국가에서 등록되었다. 불활성화된 전체 바이러스 백신의 사용이 TBE 및 JE 바이러스에 대해 제시되었고, 몇 개의 등록된 제품이 이용가능하다 (Heinz et al. Flavivirus and flavivirus vaccines. Vaccine 30: 4301-06 (2012)).
상기 강조된 YF, JE, 및 TBE 백신의 성공에도 불구하고, 뎅기 바이러스에 대한 백신을 개발하기 위한 생-약독화 바이러스 및 불활성화된 바이러스 방법의 사용은 유의한 시험을 충족하였다. 뎅기 바이러스의 4개의 혈청형 (DEN1, DEN2, DEN3, 및 DEN4)이 존재하고, 각각의 혈청형의 균주는 세계의 뎅기 풍토성 지역 전체에 걸쳐 순환하는 것으로 밝혀졌다. 천연 감염은 감염 혈청형에 대해 오래 지속되는 면역성을 부여하지만, 다른 뎅기 혈청형에는 부여하지 않는다. 질환의 보다 심각한 형태 (DHF/DSS)는 뎅기 바이러스의 한 혈청형의 감염 후에 또 다른 혈청형에 의한 제2 감염이 발생할 때, 2차 뎅기 감염 후에 가장 종종 발생한다. DHF 및 DSS와 2차 뎅기 감염의 보다 빈번한 연관성은 제2 뎅기 바이러스 유형의 감염성을 향상시키는 한 바이러스 유형에 의한 감염에 의해 유도되는 비-중화 항체에 의한 것으로 가정되었다 (항체 의존성 향상-ADE).
현재까지, 임상적으로 시험된 대다수의 백신은 생 약독화 백신이다. 비-복제성 백신 후보의 사용도 시험되고 있다. 예를 들어, 아이비 (Ivy) 등 (미국 특허 6,432,411)은 DEN1-4 80% E (DEN-2 외피 폴리펩티드의 아미노산 1-395의 동등물) 단백질을 포함하는 4가 서브유닛 백신을 개시하고 있다. 문헌 [Ivy et al., 상기 문헌]은 또한 DEN1-4 80% E 및 이스코매트릭스(ISCOMATRIX)® 아주반트를 포함하는 조성물을 보고하였다. 콜러 (Coller) 등 (WO 2012/154202)은 DEN1-4의 DEN1-4 80% E를 포함하는 4가 제제를 개시하고 있다. 또한, 불활성화된 바이러스는 잠재적인 백신 후보로서 또는 효과적인 백신의 성분으로서 사용될 수 있다 ([Putnak et al. Vaccine 23: 4442-4452 (2005)], US 6190859, US 6254873 및 스터너 (Sterner) 등의 WO 2007/002470).
그러나, 뎅기 백신을 개발하기 위한 모든 이들 노력에도 불구하고, 현재까지 어떠한 뎅기 백신도 현재 등록되어 있지 않다. 따라서, 뎅기 감염 및/또는 뎅기-관련 질환에 대한 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 안정하고 안전하고 효과적인 백신에 대한 필요성이 계속 존재한다.
본 발명은 생 약독화 뎅기 백신 ("LAV") 및 제2 뎅기 백신을 포함하는 뎅기 바이러스 백신 조성물에 관한 것이고, 제2 뎅기 백신은 비-복제성 뎅기 백신이다. 일부 실시양태에서, 비-복제성 뎅기 백신은 재조합 뎅기 서브유닛 백신, DNA 백신, 접합체 백신, 또는 불활성화된 뎅기 백신으로부터 선택되고, 생 약독화 뎅기 백신은 적어도 하나의 생 약독화 뎅기 바이러스 또는 생 약독화 키메라 뎅기 바이러스를 포함한다. 추가 실시양태에서, 비-복제성 백신은 뎅기 서브유닛 백신 또는 불활성화된 뎅기 백신이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, LAV는 4가이다 (즉, DEN1-4로부터의 생 약독화 뎅기 바이러스, 또는 DEN1-4로부터의 키메라 생 약독화 뎅기 바이러스, 또는 이들의 조합물을 포함한다). 본 발명의 일부 실시양태에서, 제2 백신은 적어도 하나의 뎅기 외피 (E) 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 서브유닛 백신이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 뎅기 서브유닛 백신은 4가이고, 각각 N-말단의 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 DEN1, DEN2, DEN3 및 DEN4의 야생형 E의 길이의 약 80%로 이루어진 말단절단된 뎅기 E 단백질을 포함한다. 생 약독화 백신으로서 동일한 조성물 내의 제2 뎅기 백신의 존재는 살아있는 바이러스 생존력에 유의한 영향을 주지 않는 것으로 밝혀졌고, 따라서 비-복제성 생 백신을 동일한 제제로 투여할 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 생 약독화 뎅기 백신은 4가이고, 4개의 키메라 플라비바이러스를 포함하고; 각각의 4개의 키메라 플라비바이러스는 단일 뎅기 바이러스 혈청형의 prM 및 E 단백질 및 상이한 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질을 포함하고, 여기서 각각의 키메라 플라비바이러스는 약독화된 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 4개의 키메라 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질은 황열병 바이러스로부터 유래된 것이다. 따른 바람직한 실시양태에서, 각각의 4개의 키메라 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질은 prM 및 E 단백질과 상이한 뎅기 혈청형으로부터의 것이다.
본 발명은 또한 생 약독화 뎅기 백신 및 재조합 뎅기 서브유닛 백신 및 아주반트를 포함하는 뎅기 바이러스 백신 조성물에 관한 것이다. 본원에서 설명되는 일부 실시양태에서, 아주반트는 알루미늄 염 아주반트이다. 개별 실시양태에서, 아주반트는 사포닌-기재 아주반트 또는 toll-유사 수용체 효능제 아주반트이다.
본 발명의 다른 측면은 유효량의 본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 뎅기 감염의 예방, 또는 그의 증상의 예방 또는 개선 방법을 포함한다. 본 발명의 상기 측면의 추가 실시양태에서, 조성물은 프라임 (prime)/부스트 (boost) 요법으로 투여되고, 여기서 조성물의 일정 용량이 환자에게 투여되고, 미리 결정된 시간이 경과한 후, 조성물의 제2 용량을 환자에게 다시 투여한다. 미리 결정된 시간이 각각의 용량 사이에서 경과한 후, 추가의 용량이 임의로 환자에게 투여될 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 뎅기 감염에 대한 면역 반응을 유도하여 뎅기 감염 가능성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, (a) 생 약독화 4가 뎅기 백신을 포함하는 제1 백신 및 재조합 4가 뎅기 서브유닛 백신 또는 불활성화된 뎅기 백신을 포함하는 제2 백신을 혼합하여 뎅기 바이러스 백신 조성물을 형성하고, 여기서 생 약독화 4가 뎅기 백신은 뎅기 혈청형 1-4의 생 약독화 뎅기 바이러스 또는 생 약독화 키메라 뎅기 바이러스를 포함하고; 재조합 4가 뎅기 서브유닛 백신은 뎅기 혈청형 1-4의 뎅기 외피 (E) 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 것인 단계; (b) 혼합 후의 단계 (a)의 뎅기 바이러스 백신 조성물을 뎅기에 대한 면역 반응이 유도되어야 하는 환자에게 투여하여 뎅기 감염의 가능성을 감소시키는 단계를 포함한다. 이 방법의 일부 실시양태에서, 면역 반응은 뎅기 감염을 예방하거나 또는 그의 증상을 예방하거나 개선한다. 본 발명의 상기 측면의 추가 실시양태에서, 조성물의 제2 용량은 미리 결정된 시간이 경과한 후 환자에게 투여된다. 조성물의 제2 용량의 제1 백신 및 제2 백신은 단일 바이알 내에 또는 2개의 별개의 바이알 내에 제제화되고, 환자에게 투여하기 전에 함께 혼합될 수 있다.
본 발명은 또한 뎅기 감염과 연관된 질환, 예컨대 뎅기열, DSS 또는 DHF의 치료 또는 예방을 위한, 본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물의 용도에 관한 것이다.
본원 명세서 및 첨부되는 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 분명하게 달리 나타내지 않으면 복수의 대상을 포함한다.
"또는"이라는 표현은 문맥이 나타낸 가능성 중의 하나를 분명히 지시하지 않는 한 가능성 중의 하나 또는 둘 모두를 나타낸다. 몇몇 경우에, "및/또는"은 가능성 중의 하나 또는 둘 모두를 강조하기 위해 사용되었다.
본원 명세서 및 첨부되는 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 다음 정의 및 약어가 적용된다:
본원에서 "LAV"로도 언급되는 용어 "생 약독화 백신"은 유효량의 적어도 하나의 생 약독화 뎅기 바이러스 및/또는 키메라 뎅기 바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신을 의미하고, 여기서 바이러스가 질환을 야기하는 능력은 야생형 뎅기 바이러스에 비해 감소된다.
용어 "키메라 플라비바이러스 백신"은 뎅기 바이러스 혈청형의 prM 및/또는 E 단백질 및 상이한 제2 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질을 함유하는 유효량의 바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신을 의미한다. 제2 플라비바이러스는 상이한 뎅기 혈청형 또는 또 다른 플라비바이러스, 예컨대 황열병 바이러스일 수 있다.
"비-복제성 백신"은 재조합 서브유닛 백신, 불활성화된 백신, 접합체 백신, 또는 DNA 백신으로부터 선택되는, 뎅기 바이러스 감염 또는 그의 임상 증상의 예방 또는 치료를 위한 뎅기 바이러스 백신을 의미한다.
"불활성화된 백신"은 유효량의 사멸된 또는 불활성 전체 뎅기 바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신을 의미하고, 여기서 바이러스는 화학물질, 열 또는 방사선 조사를 포함하는 임의의 수단에 의해 불활성화된다. 불활성화된 백신은 불활성화 후에 낮은 잔류 감염성, 예를 들어 불활성화 후에 <5 플라크 형성 단위 (PFU)/mL를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 불활성화 후에 매우 소량의 잔류 감염성, 예를 들어 ≤0.4 PFU/mL, ≤3 PFU/mL, 또는 ≤2 PFU/mL, <1 PFU/mL, ≤0.5 PFU/mL, 또는 ≤0.1 PFU/mL가 존재한다. 특정 백신의 PFU는 예를 들어 플라크 검정, 면역염색 검정, 또는 바이러스 감염성의 검출을 위한 관련 기술 분야에 알려진 다른 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
"접합체 백신"은 담체 단백질에 공유 부착된 뎅기 항원을 포함하는 백신을 의미한다.
"DNA 백신"은 뎅기 단백질, 뎅기 단백질 단편, 및 뎅기 융합 단백질, 및 그의 변이체를 포함하는 뎅기 단백질 항원을 코딩하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 백신이다. DNA 백신은 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 항원을 코딩하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 플라스미드 (예를 들어 DNA 또는 바이러스 플라스미드)를 포함한다.
"서브유닛 백신"은 하나 이상의 뎅기 항원 성분을 포함하지만, 뎅기 바이러스를 완성하지 않는 백신, 예컨대 뎅기 면역원성 에피토프, 뎅기 단백질, 상이한 뎅기 혈청형 항원의 융합체를 포함하는 뎅기 항원 융합 단백질, 또는 뎅기 단백질 단편을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 서브유닛 백신은 1가 (단일 뎅기 항원 포함) 또는 다가 (하나 초과의 항원 성분 포함)일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 서브유닛 백신은 4가이다.
본 발명의 조성물에 사용되는 뎅기 바이러스 백신은 인간 지원자에서 상동성 뎅기 바이러스에 대한 바이러스 중화 항체 반응을 유도할 때 효과적이고, 건강한 위험한 환경에 처한 대상체에 대한 허용되는 안전성 프로파일을 가져야 한다.
용어 "치료"는 치료적 처치 및 예방 또는 억제 조치를 모두 의미한다. 치료를 "필요로 하는" 개체는 임의의 임상 증상을 보이는 지의 여부와 상관없이 이미 뎅기에 감염된 개체뿐만 아니라 뎅기에 감염될 위험이 있는 개체를 포함한다. 본 발명의 뎅기 백신 조성물을 사용한 환자의 치료는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 환자에서 뎅기에 대한 면역 반응의 유도/증가, 하나 이상의 뎅기 바이러스에 대한 바이러스 중화 항체 반응의 유도, 뎅기에 감염된 환자에서 뎅기의 임상 증상의 가능성의 억제, 개선, 제거, 또는 감소, 뎅기열, DHF, 또는 DSS 및/또는 뎅기 감염과 연관된 다른 질환 또는 합병증의 발생 가능성의 억제 또는 감소, 뎅기 감염 및/또는 뎅기와 연관된 다른 질환 또는 합병증의 중증도 또는 지속 기간의 감소, 및 뎅기 감염 가능성의 억제 또는 감소.
용어 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는 요구되는 효과를 생성하기 위해 충분한 백신 조성물이 환자에게 도입됨을 의미한다: 환자에서 뎅기에 대한 면역 반응의 유도/증가, 환자에서 뎅기에 대한 바이러스 중화 항체 반응의 유도/증가, 뎅기 감염 가능성의 억제 또는 감소, 뎅기 재발 감염 가능성의 억제 또는 감소, 뎅기에 감염된 환자에서 뎅기 감염의 임상 증상의 개선 또는 제거, 뎅기열, DHF, 또는 DSS의 억제, 뎅기와 연관된 질환의 중증도 또는 지속 기간의 감소. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 상기 수준이 상이할 수 있음을 알 것이다.
용어 "면역 반응"은 세포-매개 (T-세포) 면역 반응 및/또는 항체 (B-세포) 반응을 의미한다.
용어 "환자"는 면역적격 및 면역손상 개체를 비롯하여, 본원에서 설명되는 뎅기 백신/면역원성 조성물이 투여되는 임의의 인간을 의미한다. 본원에서 규정되는 바와 같이, "환자"는 천연 감염 또는 백신 접종을 통해 뎅기에 이미 감염된 환자 또는 후속적으로 노출될 수 있는 환자를 포함한다.
"MAA"는 머크 (Merck) 알루미늄 아주반트를 의미한다. MAA는 무정형 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 아주반트이다. 용어 "MAA"는 본원에서 용어 "무정형 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트" 또는 "AAHS"와 교환가능하게 사용된다.
"ISCOM-유사 아주반트"는 그의 기능에 기여하는 특징적인 구형의 케이지(caged)-유사 구조를 갖는 특징적인 케이지-유사 입자를 함께 형성하는, 사포닌, 콜레스테롤 및 인지질로 이루어진 면역 자극 복합체 (ISCOM)를 포함하는 아주반트이다 (검토를 위해, 문헌 [Barr and Mitchell, Immunology and Cell Biology 74: 8-25 (1996)] 참조). 이 용어는 항원과 함께 생산되고 항원을 ISCOM™ 입자 내에 포함하는 ISCOM™ 아주반트 및 항원 없이 생산되는 중공 (hollow) ISCOM-형 아주반트인 ISCOM™ 매트릭스 아주반트를 모두 포함한다. 본원에서 제시되는 조성물 및 방법의 바람직한 실시양태에서, ISCOM-형 아주반트는 ISCOM™ 매트릭스 입자 아주반트, 예컨대 항원 없이 제조되는 이스코매트릭스™이다 (ISCOM™ 및 이스코매트릭스™은 CSL 리미티드 (CSL Limited, 호주 파크빌)의 등록상표이다).
"V180"은 각각의 4개의 뎅기 바이러스 혈청형 (뎅기 바이러스 (DENV) 1, DENV2, DENV3, 및 DENV4)로부터의 말단절단된 외피 당단백질 (DEN-80E)을 포함하는 4가 서브유닛 백신을 의미한다 (콜러 등의 WO 2012/154202 참조).
다음 약어가 본원에서 사용되고, 다음과 같은 의미를 갖는다: DEN (대안적으로, DENV)는 뎅기 바이러스이고, h는 시간이고, GMT는 기하 평균 역가이고, IM은 근육내이고, IMX는 이스코매트릭스™이고, LAV는 생 약독화 바이러스이고, MAA는 머크 알루미늄 아주반트이고, MAPA는 머크 알루미늄 포스페이트 아주반트이고, PFU는 플라크 형성 단위이고, SC는 피하이고, WNV는 웨스트 나일 바이러스이고, YF (대안적으로, YFV)는 황열병 바이러스이고, wt는 야생형이다.
도 1은 실시예 1 및 2에서 설명되는 바와 같이 현장 혼합 (field-mix) 후 T=0 및 T=24시간에 바이러스 역가에 대한 나열된 아주반트, 항원, 또는 조합물과 rYF-DEN2 LAV의 현장 혼합의 효과를 보여준다. 바이러스의 최종 농도는 1x105 PFU/용량 (즉, 2 x 105 PFU/ml)이었다.
도 2는 아주반트 및/또는 뎅기 서브유닛 백신과 재조합 키메라 YF-DEN(1-4) 바이러스의 혼합의 효과를 보여준다. 각각의 4개의 키메라 YF-DEN 바이러스를 적절한 농도의 4가 DEN-80E 또는 4가 DEN-80E+아주반트와 현장 혼합하고, 혼합물을 현장 혼합 후 0h 및 24h에 생존가능 바이러스에 대해 적정하였다 (실시예 3 및 4 참조). 바이러스의 최종 농도는 1x105 PFU/용량 (즉, 2 x 105 PFU/ml)이었다.
도 3은 아주반트 및/또는 뎅기 항원 (4가 DEN-80E, V180)의 존재 하에 야생형 뎅기 바이러스를 포함하는 복합 제제 (co-formulation)의 적합성/안정성 데이타를 제공한다. 항원/아주반트 샘플을 실시예 5에 설명된 바와 같이 제조하고, wt 뎅기 바이러스와 현장 혼합하였다. 바이러스 생존력은 실시예 6에 설명된 바와 같이 현장 혼합 후 0시간 (줄무늬 막대) 및 24시간 (속이 찬 막대)에 베로 (Vero) 세포에 대해 시험관내 플라크 검정을 이용하여 시험하였다. 바이러스 역가 (PFU/ml)는 각각의 뎅기 바이러스 (D1-D4)에 대해 제시된다.
도 4는 아주반트 및/또는 뎅기 항원 (전체 불활성화된 rYF-DEN2)의 존재 하에 rYF-DEN2 키메라 생 약독화 바이러스를 포함하는 복합 제제의 적합성/안정성 데이타를 제공한다. 항원/아주반트 샘플은 실시예 7에 설명된 바와 같이 제조하고, 실시예 8에 설명된 바와 같이 rYF-DEN2 LAV와 현장 혼합하였다. 바이러스 생존력은 실시예 6에 설명된 바와 같이 현장 혼합 후 0시간 (줄무늬 막대) 및 24시간 (속이 찬 막대)에 베로 세포에 대한 시험관내 플라크 검정을 이용하여 시험하였다. 바이러스 역가 (PFU/ml)는 rYF-DEN2 LAV와 (1) PBS, (2) 전체 불활성화된 rYF-DEN2 ("PIV"), (3) PIV + MAA 및 (4) PIV + 알히드로겔 (Alhydrogel)의 혼합물에 대해 제시된다.
도 5는 통상적인 프라임 부스트 전략 (군 1-3)에 비해 "프라임-부스트" 백신 접종 전략의 일부로서의 복합 제제의 면역원성 (군 4 및 5)을 평가한 레서스 마카크 (rhesus macaque)에서 면역원성 연구 결과를 요약한 것이다. 복합 제제는 4가 재조합 뎅기 서브유닛 백신 후보 (V180) 및 4가 뎅기 LAV를 포함하였다. 제4주 (용량 1 투여 4주 후)에서 모든 군에 대해 DENV1, DENV2, DENV3 및 DENV4에 대한 기하 평균 중화 역가 (LiCor50 GMT)가 제시된다. 실시예 9 참조.
도 6은 제28주 (용량 2 투여 4주 후)에서 도 5에 제시된 바와 동일한 군에 대해 DENV1, DENV2, DENV3 및 DENV4에 대한 기하 평균 중화 역가를 제시한다.
도 7은 실시예 9에 설명된 군에 대해 DENV1, DENV2, DENV3 및 DENV4에 대한 종적 (longitudinal) 기하 평균 중화 역가를 보여준다.
본 발명은 생 약독화 뎅기 백신 (LAV)과 제2 뎅기 백신의 복합 제제에 관한 것이고, 여기서 제2 뎅기 백신은 비-복제성 뎅기 백신이다. 본 발명의 실시양태에서, 제2 백신은 뎅기 서브유닛 백신 또는 불활성화된 뎅기 백신이고, 임의로 아주반트를 추가로 포함한다. LAV 및 제2 백신은 동일한 바이알 또는 별개의 바이알 내에 제제화되고, 대상체에게 투여하기 전에 함께 혼합된다. 본 발명의 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 프라임-부스트 치료 요법에서 환자에게 2회 이상 투여된다.
어느 한 시점에서 LAV를 투여한 후, 2주 내지 2년 후에 제2 뎅기 백신을 투여하는 것을 포함하는 통상적인 이종성 프라임-부스트 요법은 사용될 수 있는 대안적인 방법이지만, 이 방법은 어떤 백신 (LAV 또는 제2 백신)이 먼저 투여되어야 하는지에 대한 혼란을 야기할 수 있다. LAV 및 제2 백신을 적절한 순서로 투여하는 것은 중요하고, 그 이유는 순서 바뀜 (서브유닛 또는 불활성화된 백신 먼저 투여한 후, LAV 투여)은 매우 낮은 면역 반응을 야기할 수 있고, 이것은 천연적으로 감염될 경우 개인의 보다 심각한 뎅기 질환의 위험을 증가시킬 수 있다. 따라서, LAV 및 제2 백신의 환자에 대한 동시 투여는 완전한 치료 요법의 투여를 단순화한다. 프라임-부스트 요법으로 투여될 때, (1) LAV 및 (2) 비-복제성 백신의 복합 제제는 주로 프라임에서 LAV에 의해 및 부스트에서 비-복제성 백신에 의해 유도되는 강한 면역 반응을 촉발할 것으로 생각된다.
본 발명 이전에는, 생 약독화 바이러스를 포함하는 뎅기 백신 조성물 내의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 백신 및/또는 아주반트의 존재가 생 약독화 바이러스를 불활성화하여 바이러스 역가를 감소시키는 잠재력을 갖는 것으로 생각되었다. 밍케 (Minke) 등 ([Vaccine 29 (2011) 4608-4612] 및 [Veterinary Immunol, and Immunopathol. 111 (2006) 47-57]) 및 거쓰리 (Guthrie) 등 [Vaccine 27 (2009) 4434-4438]은 카르보머 (carbomer) 아주반트 내에 제제화된 WNV로부터 유도되는 prM/E 유전자를 발현하는 변형된 살아있는 재조합 카나리아 폭스 바이러스를 보고하였다. 그러나, 상기 백신 조성물은 별개의 바이러스 서브유닛 항원을 함유하지 않았다.
프라임-부스트 전략에서 상이한 뎅기 바이러스 백신이 시험되었다. 시몬스 (Simmons) 등 (Virology 396 280-288 (2010))은 불활성화된 백신 또는 DNA-기재 백신 형태의 비-복제성 백신으로 동물을 프라이밍한 후, 4가 생 약독화 백신으로 부스팅함으로써 레서스 마카크에서 뎅기에 대한 프라임 부스트 방법을 시험하였다. 카나카테 (Kanakatte) 등 (WO 2008127307)은 또한 DNA 발현 시스템, 아데노바이러스 발현 벡터 또는 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 시스템을 포함하는 프라이밍 면역원 및 4가 생 약독화 백신을 포함하는 부스팅 면역원을 사용하는, 뎅기에 대한 이종성 프라임 부스트 요법을 설명하고 있다. 상기 방법에서, 부스팅 면역원은 프라이밍 면역원 투여 2주 내지 2개월 후에 투여된다.
가이 (Guy) 등 (WO 2008/047023)은 환자에서 DEN1-4에 대한 보호를 유도하기 위한 방법을 보고한 바 있고, 이 방법은 (a) (i) 제1 혈청형의 백신의 뎅기 바이러스의 용량 및 제2 혈청형의 백신의 뎅기 바이러스의 용량, 및 (ii) 제3 혈청형의 백신의 뎅기 바이러스의 용량 및 제4 혈청형의 백신의 뎅기 바이러스의 용량의 제1 연속 투여, 및 (b) 용량 (i) 및 (ii)의 제2 연속 투여를 시행하는 것을 포함하고, 여기서 용량 (i) 및 (ii)는 별개의 해부학적 부위에 동시에 투여되고, 제2 연속 투여는 제1 연속 투여 후 적어도 30일 내지 최대 12개월에 실시된다. 따라서, 뎅기에 대한 프라임/부스트 방법에 대한 이전의 보고는 부스팅 면역원으로서 LAV의 사용에 초점을 맞추고, 프라이밍 조성물의 투여와 LAV의 투여 사이에 수 주 내지 수 개월의 시간이 경과할 것을 필요로 한다.
본 발명자들은 본원에서 놀랍게도, 생 약독화 DEN 바이러스 (1가 및 4가 키메라 rYF-DEN)의 바이러스 역가가 아주반트 첨가 24시간 후에 DEN1 역가의 작은 감소가 관찰되었지만, 동일한 바이알 내의 뎅기 서브유닛 항원 (DEN2-80E 또는 4가 DEN1-4 80E) 및/또는 아주반트의 첨가에 의해 유의하게 영향받지 않았음을 밝혀내었다 (도 1 및 2, 실시예 2 및 4 참조). 본 발명자들은 또한 wt 뎅기 바이러스의 생존력이 단독으로 또는 MAA 또는 알히드로겔 아주반트와 혼합된 뎅기 서브유닛 항원을 갖는 제제/혼합물에 의해 영향받지 않음을 밝혀내었다 (도 3 및 실시예 5 참조). 키메라 rYF-DEN2 LAV의 바이러스 역가가 단독으로 또는 MAA 또는 알히드로겔 아주반트와 혼합된 전체 불활성화된 rYF-DEN2를 갖는 혼합물에 의해 영향받지 않음이 추가로 밝혀졌다 (도 4, 실시예 7-8).
본원에서, 통상적인 프라임 부스트 (4가 LAV 프라임, V180 서브유닛 부스트) 및 복합 제제 프라임 부스트 방법 (4가 LAV + 4가 서브유닛 복합 제제 프라임, 이어서 4가 LAV + 4가 서브유닛 복합 제제 부스트)의 사용은 4가 YF-DEN LAV 백신을 프라임 및 부스트 둘 모두로서 사용하는 프라임-부스트 요법에 비해 4개의 모든 DENV 유형에 대해서 우수한 중화 역가를 유도함이 추가로 밝혀졌다 (실시예 9, 도 5 및 6 참조). 용량 2 투여 4주 후에 복합 제제군에서 측정된 중화 반응은 통상적인 프라임- 부스트 요법을 실시한 군에서 유도된 것과 동등하였다. 이것은 YF-DEN 백신과 4가 뎅기 서브유닛 백신 및 아주반트 (MAA 또는 이스코매트릭스®)의 복합 제제가 서브유닛 부스트에 대한 반응에 나쁜 영향을 주지 않음을 나타낸다.
따라서, 이종성 프라임/부스트 방법의 이점은 (1) 뎅기 LAV 및 (2) 제2 뎅기 백신을 포함하는 복합 제제의 투여를 통해 달성될 수 있고, 여기서 제2 뎅기 백신은 비-복제성 뎅기 백신이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 비-복제성 백신은 프라이밍 및 부스팅 조성물 둘 모두로서 서브유닛 뎅기 백신 및 불활성화된 뎅기 백신로부터 선택된다.
따라서, 본 발명은 뎅기 감염의 가능성을 예방하거나 감소시키거나, 또는 그의 임상 증상을 예방, 치료 또는 개선하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은
(a) 이를 필요로 하는 환자에게 생 약독화 뎅기 백신 및 제2 뎅기 백신을 포함하는 제1 뎅기 바이러스 백신 조성물 (LAV)을 투여하고, 여기서 제2 뎅기 백신은 비-복제성 뎅기 백신인 단계;
(b) 단계 (a) 후에 미리 결정된 시간이 경과하기를 기다리는 단계;
(c) 환자에게 뎅기 LAV 및 제2 뎅기 백신을 포함하는 제2 뎅기 바이러스 백신 조성물을 투여하고, 여기서 제2 뎅기 백신은 비-복제성 뎅기 백신인 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 비-복제성 백신은 뎅기 서브유닛 백신 또는 불활성화된 뎅기 백신이다.
일부 실시양태에서, 단계 (c)의 제2 뎅기 바이러스 백신 조성물 (복합 제제)은 단계 (a)의 복합 제제 (제1 뎅기 바이러스 백신 조성물)과 동일하다. 개별 실시양태에서, 단계 (c)의 복합 제제는 단계 (a)의 복합 제제와 동일하지 않다. 추가 실시양태에서, 방법은 단계 (b) 및 (c)를 1회 이상 반복하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (a) 및/또는 단계 (c)의 LAV 및 제2 뎅기 백신은 별개의 바이알 내에 제제화되고, 투여 전에 함께 혼합된다. 프라임/부스트 요법에서 본 발명의 조성물의 사용은 주로 프라임 (제1 용량)에서 LAV에 의해 및 부스트 (제2 용량)에서 비-복제성 백신 (예를 들어 서브유닛 또는 불활성화된 백신)에 의해 유도되는 강한 면역 반응을 촉발할 것으로 생각된다.
따라서, 본 발명은 유효량의 제1 뎅기 백신 및 제2 뎅기 백신 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 뎅기 바이러스 백신 조성물에 관한 것이고, 여기서 제1 뎅기 백신은 생 약독화 뎅기 백신이고, 제2 뎅기 백신은 비-복제성 뎅기 백신이고, 생 약독화 뎅기 백신은 적어도 하나의 생 약독화 뎅기 바이러스 또는 적어도 하나의 생 약독화 키메라 플라비바이러스를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물의 비-복제성 백신은 재조합 뎅기 서브유닛 백신 또는 불활성화된 뎅기 백신으로부터 선택된다.
본 발명의 제약 또는 무균 뎅기 바이러스 백신 조성물을 제조하기 위해서, 제1 뎅기 백신 및 제2 뎅기 백신은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 혼합된다. 대안적으로, 제1 뎅기 백신 및 제2 뎅기 백신은 혼합 전에 제약상 허용되는 담체를 포함하고, 백신이 혼합될 때 추가의 담체를 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]을 참조한다. 제약상 허용되는 담체는 생리학상 적합한 임의의 모든 용매, 분산매, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 직장, 척수, 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한)에 적합할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제약상 허용되는 담체"는 인간에게 투여하기 적합한 본 발명의 활성 성분 (예를 들어 전체, 불활성화된 바이러스, 생 약독화 바이러스, 생 약독화 키메라 바이러스, 바이러스 단백질, 뎅기 항원 단백질 또는 뎅기 항원 접합체를 코딩하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 플라스미드)과 혼합되는, 상기 설명된 바와 같은 물질을 의미한다. 본 발명의 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 자연에서 동일한 형태로 발생하지 않고, 예를 들어 물질은 자연에 존재하지 않거나 물질의 순도 및/또는 무균성이 대응하는 천연 물질과 동일하지 않기 때문에 인공 물질이다. 예를 들어, 주사용 증류수의 멸균, 박테리아 미함유, 용질 미함유 제제인 주사용 멸균수는 자연에서 동일한 형태로 발생하지 않고, 제약상 허용되는 담체로 간주된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 본원에서 개시되는 하나 이상의 활성 성분 (예를 들어 4가 LAV) 및 주사용 멸균수를 포함한다. 추가 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 정제수, 주사용수, 멸균 정제수, 및 정균 주사용수를 비롯하여, 제약 또는 생물학적 제제에 적합하고 자연에서 발생하는 물과 동일하지 않은 또 다른 형태의 물일 수 있다.
제약 조성물은 일반적으로 멸균되고 제조 및 보관 조건 하에 안정하여야 한다. 치료 및 진단제의 제제는 예를 들어, 동결건조된 분말, 슬러리, 수용액, 현탁액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 백신 제조 및 투여에 적합한 다른 규칙적인 구조의 형태로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY]; [Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy], [Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY]; [Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY] 참조).
본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물은 아래에서 논의되는 아주반트, 완충제, 안정화제, 가용화제, 염, 항미생물 보존제, 계면활성제, 장성 변경제, 킬레이팅제, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 덱스트란 T40, 디에탄올아민, 구아니딘, 염화칼슘, 시트르산나트륨, 알부민, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 지질, 및 헤파린을 포함하고 이로 제한되지 않는 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 제제 내의 그의 기능, 및 예상된 투여 방식, 용량, 및 다른 인자, 예컨대 조성물의 예상된 저장 시간 및 온도에 따라 어떤 추가의 부형제가 목적하는 뎅기 바이러스 백신 조성물에 포함되어야 하는지 쉽게 결정할 수 있다. 통상의 기술자는 추가의 부형제의 양이 상이할 수 있고, 인간에게 투여하기 위해 안전하고 목적하는 기능을 위해 효과적인 적절한 양을 쉽게 결정할 수 있음을 알고 있다.
생 약독화 뎅기 바이러스 백신
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물은 뎅기에 대한 면역 반응을 유도하거나, 뎅기에 대한 바이러스 중화 항체 반응을 유도하거나, 감염에 대해 보호하거나 감염 가능성을 감소시키거나 또는 그의 임상 증상의 중증도 또는 지속 기간을 감소시키는, 뎅기 바이러스 유형 1 (DEN1), 뎅기 바이러스 유형 2 (DEN2), 뎅기 바이러스 유형 3 (DEN3) 및 뎅기 바이러스 유형 4 (DEN4) 중 적어도 하나를 갖는 생 약독화 뎅기 백신을 포함한다. 본 발명의 실시양태에서, 생 약독화 뎅기 백신은 1가, 2가, 3가 또는 4가이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, LAV는 4가이고, 즉, DEN 유형 1-4에 대해 보호하고, DEN1, DEN2, DEN3 및 DEN4 LAV 성분을 포함한다.
본 발명의 각각의 LAV 성분은 독립적으로 약독화 키메라 플라비바이러스 또는 약독화 뎅기 바이러스인 생 약독화 바이러스를 포함한다. 뎅기 바이러스의 약독화는 관련 기술 분야에 공지된 방법을 포함하는 상이한 기술, 예컨대 조직 배양액에서의 연속 계대배양을 통해 또는 보다 잘 규정된 유전자 조작을 통해 달성될 수 있다. 뎅기 바이러스 및 키메라 뎅기 바이러스의 약독화를 위해 유용한 돌연변이는 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, WO 02/095075, WO 2006/44857, US 특허 7,189,403, WO 2003/103571, WO 2000/014245, 및 WO 2008/022196을 참조한다. 알려진 약독화 뎅기 균주, 예컨대 WO 06/134433, WO 2006/134443, WO 2007/141259, WO 96/40933, WO 2000/057907, WO 2000/057908, WO 2000/057909, WO 2000/057910, 및 WO 2007/015783에 기재된 균주도 본원의 조성물에 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태는 4가 생 약독화 뎅기 백신을 포함한다. 상기 4가 생 약독화 백신은 4개의 약독화 뎅기 균주, 3개의 약독화 뎅기 균주 및 1개의 약독화 키메라 플라비바이러스 균주, 2개의 약독화 뎅기 균주 및 2개의 약독화 키메라 플라비바이러스 균주, 1개의 약독화 뎅기 균주 및 3개의 약독화 키메라 플라비바이러스, 또는 4개의 약독화 키메라 플라비바이러스를 포함할 수 있다.
키메라 플라비바이러스를 포함하는 본 발명의 실시양태에서, 각각의 키메라 플라비바이러스는 단일 뎅기 바이러스 혈청형의 prM 및 E 단백질 및 상이한 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질 (즉, "백본")을 포함하고, 여기서 각각의 키메라 플라비바이러스는 약독화된 것이다. 재조합 생 약독화 플라비바이러스 균주의 제작 방법은 알려진 약독화 균주를 베이스(base)로 사용하는 것을 포함하고, 여기서 방법은 베이스 바이러스의 동등한 유전자를 관심있는 관련 바이러스로부터의 적절한 유전자 (prM 및 E)를 치환하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 WNV에 대해 사용되었고, 여기서 키메라 바이러스는 WNV의 prM 및 E 유전자를 포함하는 약독화 DEN-4 균주를 기초로 한 유형간 키메라이다 ([Bray, M. et al., J. Virol. (1996) 70:4162-4166]; [Chen, W., et al., J. Virol. (1995) 69:5186-5190]; [Bray, M. and Lai, C.-J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:10342-10346]; [Lai, C. J. et al., Clin. Diagn. Virol. (1998) 10:173-179]).
또 다른 방법은 이전에 JE 바이러스, DEN 바이러스, 및 WN 바이러스에 대해 사용된, 재조합 키메라 백신을 개발하기 위한 베이스로서 YF 17D 약독화 황열병 균주의 사용이었다. 황열병 백본을 포함하는 키메라 황열병 백신은 임의의 황열병 균주, 예를 들어 YFV 17D로부터의 prM 및 E 단백질을 코딩하는 유전자를 뎅기 혈청형의 것으로 교체함으로써 제작할 수 있다. DNA 클로닝 후에, RNA를 전사시키고, 베로 세포 내로 형질감염시켜 YFV 17D 복제 기구 및 관련 뎅기 바이러스의 외부 코트를 보유하는 키메라 바이러스를 얻는다. 문헌 [Guirakhoo et al., Journal of Virology, 74(12): 5477-5485 (2000)]; [Guy et al., Vaccine 28: 632-649 (2010)]; [Monath T.P. Adv Virus Res (2003) 61:469-509]; [Monath et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103:6694]; 및 WO 98/37911을 참조한다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 생 약독화 백신은 단일 뎅기 혈청형의 prM 및 E 단백질 및 황열병 백본을 포함하는 키메라 플라비바이러스를 포함한다.
본 발명의 조성물에 유용한 키메라 생 약독화 백신은 또한 뎅기 키메라 바이러스를 포함할 수 있고, 여기서 prM 및 E 단백질은 단일 뎅기 바이러스 혈청형으로부터 유래되고, 캡시드 및 비-구조 단백질은 상이한 뎅기 바이러스 혈청형으로부터 유래된다. 키메라 바이러스가 제2 뎅기 혈청형으로부터의 백본을 포함하는 실시양태에서, 약독화된 임의의 뎅기 백본이 키메라 바이러스에 사용될 수 있다. 약독화는 연속 계대배양배양을 통해, 규정된 유전자 돌연변이의 도입을 통해, 또는 공지의 약독화 뎅기 균주의 사용을 통해 달성할 수 있다. 뎅기 키메라 백신은 예를 들어 화이트헤드 (Whitehead) 등의 WO 03/092592에 기재되어 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생 약독화 백신은 캡시드 및 비-구조 단백질이 prM 및 E 단백질과는 상이한 뎅기 혈청형으로부터 유래된 키메라 플라비바이러스를 포함한다.
본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물은 유효량의 생 약독화 바이러스 백신을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생 약독화 뎅기 백신의 역가는 10 내지 약 1x107 플라크 형성 단위 (PFU)이다. 개별 실시양태에서, 생 약독화 뎅기 백신의 역가는 약 1x102 내지 약 1x106 PFU이다. 다른 실시양태에서, 생 약독화 뎅기 백신의 역가는 약 1x103 내지 약 1x105 PFU이다.
뎅기 서브유닛 백신
본 발명의 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 뎅기 항원 단백질을 포함하는 뎅기 서브유닛 백신을 포함한다. 본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, 서브유닛 백신은 하나 이상의 뎅기 단백질, 융합 단백질, 또는 그의 단편 또는 단편들을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 뎅기 서브유닛 백신은 뎅기 외피 또는 E 단백질, 또는 그의 단편을 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 서브유닛 백신은 4가이고, 즉, 4개의 모든 뎅기 혈청형에 대한 면역 반응을 표적화한다. 4가 서브유닛 백신은 4개의 재조합 뎅기 단백질 또는 4개 미만, 예를 들어 재조합 DEN1 단백질, 재조합 DEN2 단백질, 및 재조합 DEN3/4 융합 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서브유닛 백신은 재조합체 발현 시스템을 사용하여 생산되고 분비된 DEN1-4 (예를 들어 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E, 또는 DEN4-80EZip)의 뎅기 바이러스 외피 당단백질, 또는 그의 단편을 포함한다. 상기 서브유닛 백신은 아래에서 보다 상세히 설명되는 바와 같은 아주반트를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 뎅기 서브유닛 백신은 하나 이상의 정제된 뎅기 바이러스 외피 ("E") 단백질, 제약상 허용되는 부형제를 포함하고, 여기서 상기 E 단백질은 E 단백질이 숙주 세포에서 재조합 방식으로 발현될 때 성장 배지 내로 분비될 수 있도록 각각 N-말단의 아미노산 1에서 시작하여 야생형 E의 약 80%의 길이를 구성하고, 조성물은 인간 대상체에서 중화 항체의 생산 유도한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 뎅기 서브유닛 백신은 유효량의 아주반트를 추가로 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, DEN-4 E 단백질은 US 6,749,857 및 WO 2012/154202에 설명된 바와 같이 이량체 ("DEN4-80EZip")이다.
본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 상기 설명된 조성물 내의 E 단백질은 곤충 숙주 세포에서 재조합 방식으로 생산되고 발현된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, E 단백질은 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 쉬나이더 (Schneider) 2 (S2) 숙주 세포에서 재조합 방식으로 생산되고 발현된다.
본 발명의 재조합 서브유닛 뎅기 바이러스 E 단백질은 드로소필라 쉬나이더 2 (S2) 세포를 사용하는 세포 배양 발현 시스템에 의해 생산될 수 있다. 이 시스템은 천연-유사 구조를 유지하는 뎅기 재조합 외피 단백질을 생산하는 것으로 입증되었다 ([Cuzzubbo et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. (2001) 8:1150-55]; [Modis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2003) 100:6986-91]; [Modis et al., Nature (2004) 427:313-9]; [Zhang et al., Structure (2004)12(9): 1607-18]). 상기 발현 시스템은 또한 다른 플라비바이러스, 예컨대 웨스트 나일, 일본 뇌염, C형 간염, 및 진드기 매개 뇌염 바이러스로부터의 다른 재조합 외피 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다. 재조합 외피 단백질은 C-말단에서 말단절단되어, 80%의 천연 외피 단백질 ("80E")을 생성한다. 따라서, 80E는 N-말단의 아미노산 1에서 시작하여 E 단백질의 대략 처음 80%의 연속적인 아미노산으로서 규정된다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태는 N-말단의 아미노산 잔기 1에서 시작하여 야생형 E의 약 80%의 길이로 이루어지는 말단절단된 80E 단백질을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서 사용되는 E 단백질은 단백질의 막 고정 부분 (카르복시 말단의 E의 대략 마지막 10%)이 결실되고, 즉, N-말단의 아미노산 1에서 시작하여 E의 처음 90%까지의 연속적인 아미노산은 세포외 배지로 분비되어 회수를 용이하게 할 수 있다. 말단절단은 80E 부분을 막 고정 부분과 연결하는 E 단백질의 "줄기" 부분을 추가로 결실시키고; 줄기 부분은 주목할 만한 항원 에피토프를 함유하지 않고, 따라서 바람직한 항원, DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E, 또는 DEN4-80EZip에 포함되지 않는다. 90% 초과, 100% 미만의 E 단백질이 클로닝되고 분비될 수 있고, 즉, 단백질은 길이가 90%+이고, 카르복시 말단절단될 수 있고, 말단절단된 E 단백질이 분비가능하다면 막에 걸쳐진 도메인의 일부를 포함할 수 있다. "분비가능한"은 분비될 수 있음을, 일반적으로 발현 시스템 내의 형질전환된 세포로부터 분비될 수 있음을 의미한다. 따라서, 통상의 기술자는 단백질이 분비가능하다면, 본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 뎅기 E 단백질이 본원에서 예시된 80%와 상이할 수 있음을 알 것이다. 본 발명의 각각의 측면의 바람직한 실시양태에서, DEN E 단백질은 외피 단백질의 N-말단 아미노산으로부터 시작하여 제393 내지 제401 아미노산에서 끝나는 약 80%의 길이, 예를 들어 뎅기 바이러스 유형 2의 아미노산 1 내지 아미노산 395이다. 본 발명의 각각의 측면의 개별 실시양태에서, 뎅기 E 단백질은 N-말단의 아미노산 1에서 시작하여 E의 약 75%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98%의 연속적인 아미노산일 수 있다. 본원에서 본 발명의 측면의 예시적인 실시양태에서, DEN E 단백질은 N-말단의 아미노산 1에서 시작하여 E 단백질의 약 80%의 연속 아미노산; 예컨대 서열 1에 제시된 DEN1-80E, 서열 2에 제시된 DEN2-80E, 서열 3에 제시된 DEN3-80E 및 서열 4에 제시된 DEN4-80E이다.
분비된 E 단백질은 재조합 단백질의 면역원성이 보다 향상되도록 DEN4-80EZip 단백질에서처럼 이량체화를 용이하게 하는 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 DEN4-80EZip 단백질은 서열 5에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 조성물에 포함된 DEN1, DEN2, 및 DEN3 80E 항원은 단량체이고, DEN4 80E 항원은 이량체이다.
본 발명의 상기 측면의 개별 실시양태에서, 조성물 내의 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E 및 DEN4-80E 단백질은 단량체이다. 상기 실시양태에서, DEN4 성분은 DEN1, DEN2, 및 DEN3 단백질의 개별 양의 약 1.5 내지 약 3배, 바람직하게는 DEN1, DEN2, 및 DEN3 성분 (단백질)의 양의 약 2배의 양으로 존재한다. 본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, 조성물 내의 DEN1:DEN2:DEN3:DEN4 항원의 비는 대략 1:1:1:2이다.
뎅기 E 단백질을 포함하는 본 발명의 실시양태에서, 조성물 내의 각각의 E 단백질의 양은 약 0.5 ㎍ 내지 약 500 ㎍이다. 개별 실시양태에서, 각각의 E 단백질의 양은 약 0.5 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 0.5 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 0.5 ㎍ 내지 약 350 ㎍, 0.5 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 0.5 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 0.5 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 0.5 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 0.5 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 0.5 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 약 350 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 10 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 10 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 10 ㎍ 내지 약 350 ㎍, 10 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 10 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 10 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 10 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 25 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 25 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 25 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 25 ㎍ 내지 약 350 ㎍, 25 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 25 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 25 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 25 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 25 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 또는 25 ㎍ 내지 약 50 ㎍이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 조성물 내의 각각의 E 단백질의 양은 약 1.0 ㎍ 내지 약 100 ㎍이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 조성물 내의 각각의 E 단백질의 양은 대략 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500 ㎍으로부터 선택된다.
불활성화된 뎅기 백신
본 발명의 뎅기 백신 조성물에서 뎅기 서브유닛 백신에 대한 대안으로서, 전체 불활성화된 뎅기 백신 또는 불활성화된 뎅기 키메라 백신이 또한 사용될 수 있다. 본원에서 조성물의 불활성화된 뎅기 백신은 하나 이상의 전체 불활성화된 뎅기 바이러스 및/또는 하나 이상의 불활성화된 키메라 바이러스를 포함한다. 본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 불활성화된 뎅기 백신은 4가이고, 전체 불활성화된 DEN1, DEN2, DEN3 및 DEN4를 포함한다. 개별 실시양태에서, 불활성화된 백신은 4개의 불활성화된 키메라 뎅기 바이러스를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 불활성화된 백신은 4가이고, 하나 이상의 전체 불활성화된 뎅기 바이러스 및 하나 이상의 불활성화된 뎅기 키메라 바이러스, 예를 들어 불활성화된 전체 DEN1 바이러스, 불활성화된 전체 DEN2 바이러스, 불활성화된 DEN3 키메라 바이러스 및 불활성화된 DEN4 키메라 바이러스를 포함한다. 통상의 기술자는 백신 조성물이 4개의 모든 뎅기 혈청형을 표적화한다면, 불활성화된 전체 또는 키메라 DEN 바이러스의 임의의 조합물이 본 발명의 4가 조성물 및 방법에 사용될 수 있음을 알 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 불활성화된 뎅기 백신은 문헌 [Putnak et al. Vaccine 23: 4442-4452 (2005)], US 6190859, US 6254873 및 스터너 등의 WO 2007/002470에 설명되어 있다. 대안적으로, 뎅기 바이러스 균주 및 키메라 뎅기 균주/키메라 플라비바이러스 균주는 관련 기술 분야에 공지된 방법을 통해, 예를 들어 화학물질, 열 또는 방사선을 사용하여 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위해 불활성화될 수 있다.
아주반트
아주반트로 알려진, 관심있는 항원에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있는 화합물과 백신의 동시 투여는 심도있게 연구되어 왔다. 관심있는 항원에 대한 면역 반응의 증가에 추가로, 일부 아주반트는 목적하는 면역 반응을 촉발하기 위해 필요한 항원의 양을 감소시키거나 또는 지속적인 면역 반응의 유도 및 질환으로부터의 보호 제공을 위해 임상 요법에 필요한 주사의 수를 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
그 목적을 위해, 본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물은 아주반트를 이용할 수 있다. 본원에서 설명되는 조성물의 아주반트는 상기 설명된 바와 같이 목적하는 기능을 수행하고, 조성물의 LAV를 불활성화하거나 그의 역가에 유의한 영향을 주지 않는 임의의 아주반트일 수 있다.
알루미늄-기재 화합물은 60년 전에 아주반트 활성을 갖는 것으로 결정되었다 (검토를 위해, 문헌 [Lindblad, E.B. Immunol, and Cell Biol. 82: 497-505 (2004)]; [Baylor et al. Vaccine 20: S18-S23 (2002)] 참조). 알루미늄 아주반트는 일반적으로 적절한 용량으로 사용될 때 안전한 것으로 간주된다. 많은 알루미늄 아주반트가 전세계적으로 규제 당국에 의해 인간에 대한 투여를 위해 승인되었다.
따라서, 알루미늄-기재 화합물, 예컨대 수산화알루미늄 (Al(OH)3), 알루미늄 히드록시포스페이트 (AlPO4), 무정형 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 (AAHS), 또는 소위 "명반" (KA1(804)·12H20) (문헌 [Klein et al., Analysis of aluminum hydroxyphosphate vaccine adjuvants by Al MAS NMR., J. Pharm. Sci. 89(3): 311-21 (2000)] 참조)이 본원에서 제시되는 조성물과 조합될 수 있다. 본원에서 제시되는 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 알루미늄 아주반트는 알루미늄 히드록시포스페이트 또는 "MAA"로도 언급되는 AAHS이다. 개별 실시양태에서, 알루미늄 아주반트는 본원에서 "MAPA"로 언급되는 알루미늄 포스페이트 아주반트이다. 다른 실시양태에서, 아주반트는 수산화알루미늄이다.
통상의 기술자는 표적화된 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 증가시킬 때 안전하고 효과적인 알루미늄 아주반트의 최적 용량을 결정할 수 있을 것이다. 알루미늄의 안전성 프로파일, 및 FDA-승인 백신에 포함되는 알루미늄의 양에 대한 논의는, 문헌 [Baylor et al., Vaccine 20: S18-S23 (2002)]을 참조한다. 일반적으로, 알루미늄 아주반트의 효과적이고 안전한 용량은 용량당 50 ㎍ 내지 1.25 mg의 원소 알루미늄 (100 ㎍/mL 내지 2.5 mg/mL 농도)이다.
따라서, 본 발명의 구체적인 실시양태는 생 약독화 뎅기 바이러스 백신 및 제2 뎅기 백신을 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 제2 백신은 본원의 임의의 실시양태에 설명된 바와 같은 비-복제성 백신이고, 상기 조성물은 알루미늄 아주반트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-복제성 백신은 뎅기 서브유닛 백신 또는 불활성화된 뎅기 백신으로부터 선택된다. 본 발명의 실시양태에서, 뎅기 조성물은 백신 용량당 약 50 ㎍ 내지 약 1.25 mg의 원소 알루미늄을 포함하는 아주반트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 백신 조성물의 용량당 알루미늄 아주반트는 약 100 ㎍ 내지 약 1.0 mg, 약 100 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 850 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 100 내지 약 250 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 1.25 mg, 약 200 ㎍ 내지 약 1.0 mg, 약 200 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 850 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 1.25 mg, 약 300 ㎍ 내지 약 1.0 mg, 약 300 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 850 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 1.25 mg, 약 400 ㎍ 내지 약 1.0 mg, 약 400 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 850 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 1.25 mg, 약 500 ㎍ 내지 약 1.0 mg, 약 500 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 850 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 600 ㎍ 내지 약 1.25 mg, 약 600 ㎍ 내지 약 1.0 mg, 약 600 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 600 ㎍ 내지 약 850 ㎍, 약 600 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 또는 약 600 ㎍ 내지 약 700 ㎍의 원소 알루미늄의 양을 포함한다.
본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물과 함께 사용될 수 있는 다른 아주반트는 지질다당류, 모노포스포릴 지질 A, 및 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트를 비롯하여, CpG 올리고뉴클레오티드, 또는 toll-유사 수용체, 예컨대 TLR4 및 TLR9에 대해 작용하는 다른 분자를 함유하는 아주반트 (검토를 위해, 문헌 [Daubenberger, C.A., Curr. Opin. Mol. Ther. 9(1):45-52 (2007)]; [Duthie et al., Immunological Reviews 239(1): 178-196 (2011)]; [Hedayat et al., Medicinal Research Reviews 32(2): 294-325 (2012)] 참조)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물에 유용한 추가의 아주반트는 면역자극 올리고뉴클레오티드 (IMO; 예를 들어 U.S. 7,713,535 및 U.S. 7,470,674 참조); T-헬퍼 에피토프, 지질-A 및 그의 유도체 또는 변이체, 리포솜, 인산칼슘, 시토카인 (예를 들어 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) IL-2, IFN-α, Flt-3L), CD40, CD28, CD70, IL-12, 열-쇼크 단백질 (HSP) 90, CD134 (OX40), CD137, 코백신 (CoVaccine) HT, 비-이온성 블록 공중합체, 불완전 프로인트 (Freund) 아주반트, 케모킨, 콜레라 독소; 이. 콜라이(E. coli) 열-불안정성 장독소; 백일해 독소; 무라밀 디펩티드, 무라밀 펩티드 유사체, MF59, SAF, 면역자극 복합체, 생분해가능 미세구, 폴리포스파젠; 합성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 설명되는 조성물과 함께 사용하기 위한 추가의 아주반트는 사포닌 (예를 들어 QS21)을 단독으로 또는 ISCOM ("면역 자극 복합체", 검토를 위해, 문헌 [Barr and Mitchell, Immunology and Cell Biology 74: 8-25 (1996)]; 및 [Skene and Sutton, Methods 40: 53-59 (2006)] 참조)의 특징적인 형태로 콜레스테롤 및 인지질과 조합되어 함유하는 아주반트이다. 상기 아주반트는 "사포닌-기재 아주반트"로 언급된다. 본원에서 제공되는 조성물 및 방법의 구체적인 실시양태에서, 돌연변이체 독소 및/또는 독소 단백질은 ISCOM-형 아주반트 또는 ISCOM 매트릭스 입자 아주반트인 "ISCOM", 예컨대 항원 없이 제조된 이스코매트릭스™ (ISCOM™ 및 이스코매트릭스™은 CSL 리미티드 (호주 파크빌)의 등록상표이다)와 조합된다.
사용 방법
본 발명의 실시양태는 또한 (i) 다음에서 사용하기 위한, (ii) 다음에 대한 의약 또는 조성물로서 사용하기 위한, 또는 (iii) 다음에 대한 의약의 제조에서 사용하기 위한 하나 이상의 본원에서 설명되는 뎅기 백신 조성물을 포함한다: (a) 요법 (예를 들어, 인체의); (b) 의약; (c) DEN1, DEN2, DEN3 및/또는 DEN4를 포함하는 뎅기 바이러스 복제의 억제; (d) 하나 이상의 DEN1, DEN2, DEN3 및/또는 DEN4에 대한 면역 반응 또는 보호 면역 반응의 유도; (e) 하나 이상의 종류의 뎅기에 대한 바이러스 중화 항체 반응의 유도; (f) 뎅기 바이러스 감염의 치료 또는 예방; (g) 뎅기 바이러스 감염의 재발 예방; (h) 뎅기 바이러스 감염과 연관된 병리학적 증상의 진행, 발생 또는 중증도의 감소 및/또는 뎅기 바이러스 감염 가능성의 감소; 또는 (i) 뎅기열, 뎅기 출혈열, 뎅기 쇼크 증후군을 포함하고 이로 제한되지 않는 뎅기-연관 질환(들)의 발병, 중증도, 또는 진행의 치료, 예방 또는 지연. 상기 용도에서, 뎅기 백신 조성물은 임의로 하나 이상의 아주반트 (예를 들어, 본원에서 설명되는 MAA, 알루미늄 포스페이트, 알히드로겔, 또는 다른 알루미늄염 아주반트, 사포닌-기재 아주반트, 예컨대 이스코매트릭스™ (CSL 엘티디.), TLR-효능제, 또는 지질 나노입자)와 조합되어 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 조성물을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 뎅기 바이러스 감염 또는 뎅기-연관 질환의 예방 및/또는 치료적 처치 방법을 제공한다.
"환자" (대안적으로 본원에서 "대상체"로 언급됨)는 뎅기 바이러스, 예컨대 DEN1, DEN2, DEN3, 또는 DEN4로 감염될 수 있는 포유동물을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 환자는 인간이다. 환자는 예방적으로 또는 치료적으로 처치될 수 있다. 예방적 처치는 뎅기 감염의 가능성 또는 중증도 또는 그의 효과, 예를 들어, 뎅기열을 감소시키기 위해 충분한 보호 면역을 제공한다. 치료적 처치는 뎅기 감염의 중증도를 감소시키거나 뎅기 감염의 재발 또는 그의 임상 효과를 억제하키기 위해 수행할 수 있다.
예방적 처치는 본원에서 설명되는 바와 같이 본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물은 일반적인 집단 또는 뎅기 감염의 위험이 증가된 개인, 예를 들어 아에데스 속의 모기가 창궐하는 지역에 살거나 이 지역으로 여행을 떠나는 개인에게 투여될 수 있다.
"치료를 필요로 하는" 개체는 이미 뎅기로 감염된 (예를 들어 하나 이상의 DEN1, DEN2, DEN3, 또는 DEN4로 감염된) 개체, 및 감염되기 쉬운 개체 또는 감염 가능성의 감소가 요구되는 임의의 개인을 포함한다.
본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물은 관련 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 제제화되고 환자에게 투여된다. 제약 투여에 대한 지침은 일반적으로 예를 들어 문헌 [Vaccines Eds. Plotkin and Orenstein, W.B. Sanders Company, 1999]; [Remington's Pharmaceutical Sciences 20th Edition, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 2000]; 및 [Modern Pharmaceutics 2nd Edition, Eds. Banker and Rhodes, Marcel Dekker, Inc., 1990]에 제시되어 있다.
따라서, 본 발명은 환자에게 면역학적 유효량의 본원에서 설명되는 임의의 뎅기 바이러스 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 뎅기 감염에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
또한, 뎅기 감염의 치료를 위한, 또는 뎅기 감염과 연관된 임의의 병리학적 병태의 치료를 위한 방법이 본 발명에 의해 제공되고, 상기 치료는 감염의 예방, 및 임상 증상의 중증도의 감소, 질환 진행의 지연 또는 억제, 및/또는 감염 가능성 또는 그의 임상 증상의 감소를 포함하고; 상기 방법은 환자에게 면역학적 유효량의 본원에서 설명되는 임의의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 실시양태는 프라임/부스트 요법으로 본 발명의 2종 이상의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은
(a) 뎅기 감염의 예방 또는 감염 가능성의 감소를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 제1 뎅기 바이러스 백신 조성물을 투여하는 단계;
(b) 단계 (a) 후에 미리 결정된 시간이 경과하기를 기다리는 단계;
(c) 상기 환자에게 본 발명의 제2 뎅기 바이러스 백신 조성물을 투여하는 단계;
(d) 임의로 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계를 포함하고;
이에 의해 환자에서 뎅기 감염이 예방되거나 또는 뎅기로 감염될 가능성이 감소하는 것인, 뎅기 감염의 예방 또는 감염 가능성의 감소를 필요로 하는 환자에서 뎅기 감염을 예방하거나 또는 감염 가능성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 실시양태에서, 본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물은 액체의 형태이다 (즉, 뎅기 LAV 및 비-복제성 뎅기 바이러스 백신은 동일한 바이알 또는 용기 내에 액체로서 함께 제제화된다). 개별 실시양태에서, 뎅기 바이러스 백신 조성물은 동결건조되고 (즉, 뎅기 LAV 및 비-복제성 뎅기 바이러스 백신은 함께 제제화되고, 동일한 바이알 또는 다른 용기 내에 동결건조됨), 환자에게 투여하기 전에 무균 희석제로 재구성된다. 추가 실시양태에서, LAV 및 비-복제성 백신은 별개의 바이알 또는 용기 내에 제공되고, 환자에게 투여하기 전에 함께 혼합된다. 상기 실시양태에서, LAV 및 비-복제성 백신은 (1) 둘 모두 액체 형태이거나, (2) 둘 모두 동결건조된 것이거나, 또는 (3) 하나의 백신은 액체 형태이고 하나의 백신은 동결건조된 것일 수 있다. 하나의 백신은 액체 형태이고 하나의 백신이 동결건조된 것이면, 동결건조된 백신은 액체 백신으로 재구성되어 본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물을 형성할 수 있거나, 동결건조된 백신은 멸균 희석제로 재구성된 후에 액체 백신과 혼합되어 본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물을 형성할 수 있다.
제1 용량 및 제2 용량, 또는 그 후의 임의의 용량 사이의 시간은 약 2주 내지 약 2년이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 2개월 내지 12개월 시간이 다중 투여 사이에 경과한다. 본 발명의 상기 측면의 개별 실시양태에서, 백신 조성물의 각각의 용량의 각각의 투여 사이의 시간은 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 및 24개월로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 뎅기 바이러스 백신 조성물은 동일하다. 개별 실시양태에서, 제1 및 제2 뎅기 바이러스 백신 조성물은 동일하지 않다.
본 발명의 뎅기 바이러스 백신 조성물은 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 비경구로, 즉 피내, 피하 또는 근육내 주사에 의해 투여된다. 피하 및 근육내 투여는 예를 들어 바늘 또는 제트 주입기(jet-injector)를 사용하여 수행할 수 있다.
본원에서 설명되는 조성물은 투여 제제에 적합한 방식으로, 및 뎅기 감염의 치료 및/또는 감염 가능성의 감소에 면역학상 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 측면에서, 환자에게 투여되는 용량은 시간이 경과함에 따라 환자에서 유익한 반응, 예컨대 뎅기 바이러스 수준의 감소에 영향을 주기에, 또는 뎅기 감염 가능성의 감소를 위해 충분하여야 한다. 투여되는 뎅기 바이러스 백신의 양은 연령, 성별, 체중 및 전반적인 건강 상태를 비롯하여 치료되는 대상체에 따라 결정될 수 있다. 이와 관련하여, 투여가 필요한 백신의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 결정될 것이다. 뎅기 감염에 대한 치료 또는 예방시에 투여되는 백신의 유효량을 결정할 때, 의사는 순환 혈장 수준, 질환의 진행, 및 항-뎅기 항체의 생산을 평가할 수 있다. 임의의 사건에서, 본 발명의 면역원성 조성물의 적합한 용량은 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
적합한 투여 요법은 바람직하게는 환자의 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 투여 경로; 목적하는 효과; 및 사용되는 특정 조성물을 비롯하여 관련 기술 분야에 공지된 인자를 고려하여 결정된다. 투여 기간은 관련 기술 분야에 공지된 인자에 따라 결정되고, 2주 내지 24개월 범위일 수 있다. 초기 투여 후에, 1회 이상의 추가의 용량이 항체 역가를 유지 및/또는 부스팅하기 위해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 뎅기 감염의 예방, 또는 그의 증상의 예방 또는 개선을 위한 방법에 관한 것이고, 이 방법은 (a) 제1 및 제2 뎅기 백신을 혼합하여 뎅기 바이러스 백신 조성물을 형성하고, 여기서 제1 뎅기 백신은 생 약독화 뎅기 백신이고, 제2 뎅기 백신은 비-복제성 뎅기 백신인 단계; (b) 뎅기 감염 또는 그의 증상이 예방 또는 개선되어야 하는 환자에게 단계 (a)의 뎅기 바이러스 백신 조성물의 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, 뎅기 바이러스 백신 조성물은 조성물이 안정한 상태로 유지되는, 혼합 후 일정 시간 내에, 예를 들어 24시간 내에 환자에게 투여된다. 본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 비-복제성 뎅기 백신은 재조합 뎅기 서브유닛 백신 또는 불활성화된 뎅기 백신이다.
본 발명의 상기 측면의 추가 실시양태는 (c) 뎅기 바이러스 백신 조성물의 투여 후에 미리 결정된 시간이 경과하도록 하는 단계, 및 (d) 본 발명의 조성물의 제2 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 실시양태에서, 단계 (c) 및 (d)는 임의로 1회 이상 반복될 수 있다.
상기 설명된 방법에서, 제1 뎅기 백신은 바람직하게는 4가이고, DEN1, DEN2, DEN3, 및 DEN 4 성분을 포함하고, 여기서 각각의 성분은 본원에서 설명되는 바와 같은 생 약독화 뎅기 바이러스 또는 생 약독화 키메라 플라비바이러스를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 생 약독화 백신은 4개의 키메라 플라비바이러스를 포함하고, 여기서 각각의 키메라 플라비바이러스는 단일 뎅기 바이러스 혈청형의 prM 및 E 단백질 및 상이한 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질을 포함하고, 각각의 키메라 플라비바이러스는 약독화된 것이다. 특정 실시양태에서, 4개의 키메라 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질은 황열병 바이러스로부터의 것이다. 개별 실시양태에서, 각각의 4개의 키메라 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질은 prM 및 E 단백질과는 상이한 뎅기 혈청형으로부터의 것이다.
본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 제2 뎅기 백신은 DEN1, DEN2, DEN3, 및 DEN4로부터의 뎅기 E 단백질, 또는 그의 단편을 포함하는 4가 재조합 뎅기 서브유닛 백신이다. 본 발명의 상기 방법에 유용한 서브유닛 백신이 본원에서 설명된다. 바람직한 실시양태에서, E 단백질은 각각 N-말단의 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 DEN1, DEN2, DEN3 및 DEN4의 야생형 E의 길이의 약 80%로 이루어진다.
상기한 방법의 특정 실시양태에서, 생 약독화 백신은 동결건조되고, 재조합 서브유닛 백신은 혼합 전에 액체이다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)의 혼합은 동결건조된 백신을 액체 백신으로 재구성하는 것을 포함한다. 개별 실시양태에서, 동결건조된 백신은 단계 (a)에서 액체 백신과 혼합하기 전에 무균 희석제로 재구성된다.
본원에서 언급되는 모든 간행물은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 방법 및 물질을 설명하고 개시할 목적으로 본원에 참고로 포함된다. 본원의 어떠한 내용도, 본 발명이 선행 발명 때문에 그 개시내용보다 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 생각되지 않아야 한다.
본원에서 본 발명의 상이한 실시양태를 동반하는 도면을 참조하여 설명하였지만, 본 발명은 상기 정확한 실시양태에 제한되지 않고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 첨부된 청구항에 규정된 바와 같은 본 발명의 범위 또는 취지로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형을 본원에서 실행할 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1
아주반트 또는 뎅기 항원의 존재 하에 rYF-DEN2 키메라 생 약독화 바이러스의 안정성 시험을 위한 제제의 제조.
본 발명자들은 시험관내 플라크 검정을 이용하여 각종 아주반트 및/또는 뎅기 항원의 존재 하에 생 약독화 키메라 뎅기 2 백신 ("rYF-DEN2 LAV")을 포함하는 제제의 안정성을 평가하였다. 본 연구에 사용된 LAV는 뎅기/황열병 ("YF") 키메라 바이러스로 이루어지고, 여기서 DEN2 바이러스의 prM 및 E 유전자를 황열병 바이러스 백본 상에 놓아서 YF-DEN2 키메라 바이러스를 생성하였다. 황열병-뎅기 키메라 백신 벡터는 YFV 17D로부터 prM 및 E 단백질을 코딩하는 유전자를 뎅기 2의 것으로 교체함으로써 제작하였다. DNA 클로닝 후에, RNA를 전사시키고 베로 세포 내로 형질감염시켜 YFV 17D 복제 기구 및 뎅기 2 바이러스의 외부 코트를 보유하는 키메라 바이러스를 얻었다 (문헌 [Guirakhoo et al., J. Virol. 74(12): 5477-85 (2000)] 참조).
모든 제제는 무균 기술을 이용하여 생물-안전 캐비넷 (bio-safety cabinet) 내에서 제조하였다. 시험을 위한 샘플을 먼저 둘베코 (Dulbecco) PBS 내에 목적하는 아주반트, 뎅기 항원, 또는 아주반트/항원 조합물을 사용하여 제제화하고, 13 mm 플루로텍 (Flurotec) 스토퍼로 밀봉된 2 ml 무균 ISO 바이알에 넣었다. 본 연구에서 시험한 아주반트/항원 샘플은 다음과 같았다: (1) PBS 단독; (2) 머크 인산알루미늄 아주반트 ("MAPA"); (3) 머크 무정형 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 아주반트 ("MAA"); (4) DEN-2 외피 폴리펩티드의 DEN2 80% E, 아미노산 1-395 ("DEN2-80E"); (5) 이스코매트릭스™ ("IMX"); (6) TLR9 효능제 아주반트 ("IMO-2055"); (7) DEN2-80E + MAPA; 및 (8) DEN2-80E + MAA. MAA 또는 MAPA와 함께 DEN2-80E를 함유하는 샘플을 탁상용 원심분리기 상에서 원심분리하고, DEN2-80E가 알루미늄 아주반트에 흡착되었는지 확인하기 위해 상청액을 UV 분광광도계를 이용하여 스캐닝하였다. rYF-DEN2 LAV와 현장 혼합하기 전에, 모든 제제를 2-8℃에서 저장하였다.
아주반트/항원 샘플을 아래 설명된 바와 같이 rYF-DEN2 LAV와 1:1 비로 현장 혼합하였다. rYF-DEN2 LAV와 현장 혼합하기 전후의 샘플의 용량 및 농도는 표 1에 제시된 바와 같았다.
[표 1]
일가 시험 샘플의 농도
Figure pct00001
각각의 제제 1 ml을 제조하였다.
실시예 2
rYF-DEN2 키메라 LAV를 DEN2-80E 항원 및/또는 아주반트와 조합하여 포함하는 제제의 안정성 시험
표 1에 열거된 항원/아주반트 샘플을 rYF-DEN2 LAV와 현장 혼합하고, 아래 설명된 바와 같이 베로 세포 상에서 시험관내 플라크 검정을 이용하여 바이러스 생존력에 대해 시험하였다.
6 웰 플레이트를 9 x 105개 베로 세포/웰로 접종하였다. 베로 세포의 계대배양배양 수준은 P31이었다. 플라크 검정을 위해 바이러스 샘플을 희석하기 위해 (T=0h 시점), YF-DEN2 LAV로부터 P2 바이러스의 1 mL 분취액 (역가 3.3 x 106 PFU/mL)을 22℃ 수조 내에서 해동하였다. 바이러스의 희석은 2% 배지 199 내에서 수행하여, 2 x 105 PFU/mL의 바이러스 역가를 갖는 희석 원액을 생산하였다. 상기 희석 원액으로부터, 0.5 mL의 바이러스를 새로운 튜브 내로 분취하고, 실시예 1에 기재된 아주반트/항원 제제 중 하나의 0.5 mL과 혼합하여 1:1 희석액을 제공하였다. 얻어진 총 부피는 1 mL이었고, 그 중 0.5 mL은 T=0h 플라크 검정을 위해 사용하고, 0.5 mL은 T=24 시점 플라크 검정에 사용하기 위해 4℃에서 저장하였다.
1:1 LAV:아주반트/항원 샘플의 추가의 희석액을 96-웰 플레이트에서 제조하여, 각각의 시험 샘플의 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:10,000, 1:100,000 및 1:1,000,000 희석액을 제공하였다. 검정을 수행하기 위해, 베로 세포 단층을 PBS로 세척하고, 200 ㎕의 희석된 샘플 (이중으로)을 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 바이러스 접종물을 세포 웰 상으로 확산시키고, 플레이트를 인큐베이터에 넣었다. 접종물을 균등하게 확산시키기 위해 플레이트를 1시간 동안 10-15 min마다 흔들었다. 1시간의 흡착 후에, 3 ml의 0.8% 메틸 셀룰로스를 각각의 웰에 첨가함으로써 세포를 덮어씌우고, 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이팅하였다.
5일 인큐베이션 후에, 각각의 웰로부터 메틸 셀룰로스 오버레이를 흡인 제거하고, 2 mL 1X 크리스탈 바이올렛 (crystal violet) 염색 용액을 첨가하였다. 염색은 실온에서 1시간 동안 수행하였고, 이때 염색제를 흡인 제거하였다. 각각의 웰을 2 mL의 멸균 증류수로 2회 세척하였다. 세척액을 진공 용기 내로 흡인 제거하고, 플레이트를 공기 건조시켰다. 바이러스 역가는 적절한 바이러스 희석에서 플라크의 수를 계수함으로써 결정하였다.
24시간 후에, 저장 후 각각의 샘플의 바이러스 역가를 결정하기 위해 상기 절차를 반복하였다. 샘플을 상기 설명된 바와 같이 제조하였다. 결과는 아주반트, 서브유닛 항원 단독 또는 아주반트/항원 제제가 어느 것도 T=0에서 LAV의 바이러스 역가에 임의의 효과를 미치지 않았음을 나타낸다 (도 1 참조). 결과는 rYF-DEN2 LAV가 서브유닛 항원 단독 및 대부분의 아주반트와 함께 심지어 4℃에서 24시간 인큐베이션 후에도 안정하였지만; IMO-2055는 24시간 후에 바이러스 역가의 유의한 (~2 로그) 감소를 유발하였음을 추가로 나타낸다. 세포 생존력은 시험한 다른 샘플군에 비해 상기 샘플에서 또한 최하였다.
실시예 3
아주반트 및/또는 뎅기 항원의 존재 하에 rYF-DEN(1-4) 키메라 생 약독화 바이러스의 안정성 시험을 위한 제제의 제조.
뎅기 유형 1-4 ("rYF-DEN (1-4) LAV")의 생 약독화 키메라 황열병/뎅기 바이러스를, 단독으로 또는 MAA 또는 이스코매트릭스™ (CSL 엘티디., 호주 파크빌)와 조합한 4가 DEN-80E (1-4) 서브유닛 백신과 조합으로 포함하는 백신의 안정성을 평가하기 위해 또 다른 연구를 수행하였다. 황열병-뎅기 키메라 백신 벡터는 YFV 17D로부터 prM 및 E 단백질을 코딩하는 유전자를 각각의 4가지 뎅기 혈청형의 것으로 교체함으로서 제작하였다. DNA 클로닝 후에, RNA를 전사시키고 베로 세포 내로 형질감염시켜 YFV 17D 복제 기구 및 관련 뎅기 바이러스의 외부 코트를 보유하는 키메라 바이러스를 얻었다.
모든 제제는 무균 기술을 이용하여 생물-안전 캐비넷 내에서 제조하였다. 시험을 위한 샘플은 둘베코 PBS 내에 목적하는 아주반트, 뎅기 항원(들), 또는 아주반트/항원(들) 조합물을 사용하여 제제화하고, 플루로텍 스토퍼로 밀봉된 2 ml 무균 ISO 바이알에 넣었다. 본 연구에서 시험한 아주반트/항원 샘플은 다음과 같았다: (1) PBS 단독; (2) 4가 DEN-80E (DEN1-80E + DEN2-80E + DEN3-80E + DEN4-80E); (3) 4가 DEN-80E + 이스코매트릭스™; (4) 4가 DEN-80E + MAA. 아주반트/항원 샘플을 아래 설명된 바와 같이 YF-DEN (1-4) LAV와 1:1 비로 현장 혼합하였다. YF-DEN (1-4) LAV와 현장 혼합하기 전후의 샘플의 용량 및 농도는 표 2에 제시된 바와 같았다.
[표 2]
4가 시험 샘플의 농도
Figure pct00002
모든 제제를 LAV와 현장 혼합하기 전에 2-8℃에서 저장하였다.
실시예 4
생 약독화 YF-DEN (1-4) 바이러스를 갖는 제제의 안정성 시험
실시예 3에서 제조한 항원/아주반트 샘플을 rYF-DEN(1-4) LAV와 현장 혼합하고, 아래 설명된 바와 같이 베로 세포 상에서 시험관내 플라크 검정을 이용하여 바이러스 생존력에 대해 시험하였다.
6 웰 플레이트를 9x105개 세포/웰로 접종하였다. 베로 세포의 계대배양배양 수준은 P37이었다. 바이러스 및 rYF-DEN(1-4) LAV + 아주반트/DEN-80E 서브유닛 샘플의 1:1 혼합물의 제조는 본질적으로 1가 연구에 대해 실시예 2에 설명된 바와 같았다. 1:1 LAV:아주반트/항원 샘플의 추가의 희석액을 96-웰 플레이트 내에서 제조하여, 각각의 시험 샘플의 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:10,000, 1:100,000 및 1:1,000,000 희석액을 제공하였다. T=0 및 T=24시간에 샘플에 대해 수행한 플라크 검정은 본질적으로 실시예 2에 설명된 바와 같았다.
결과는 시험한 모든 제제가 바이러스 생존력에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았음을 나타낸다 (도 2 참조). 그러나, 4가 DEN-80E, 4가 DEN-80E + 이스코매트릭스™ 및 4가 DEN-80E + MAA를 포함하는 샘플에서 24시간 인큐베이션 후에 rYF-DEN1 바이러스 역가의 적은 (~1 로그) 감소가 존재하였다.
실시예 5
아주반트 및/또는 뎅기 항원 (4가 DEN-80E)의 존재 하에 다른 뎅기 바이러스의 적합성/안정성 시험을 위한 제제의 제조
단독으로 또는 MAA 또는 알히드로겔과 조합한 4가 DEN-80E (1-4) 서브유닛 백신과 조합으로 동시-제제화할 때 다른 뎅기 바이러스 (DENV 1 내지 4)의 적합성/안정성을 평가하기 위해 또 다른 연구를 수행하였다. 사용된 야생형 (wt) 뎅기 바이러스는 WHO 참조 균주 (DEN1 - 웨스트 퍼시픽 (West Pacific) 74; DEN2 - 16803; DEN3 - CH53489; 및 DEN4 - TVP-360)이었다.
모든 제제는 무균 기술을 이용하여 생물-안전 캐비넷 내에서 제조하였다. 시험을 위한 샘플은 둘베코 PBS 내에서 목적하는 아주반트, 뎅기 항원(들), 또는 아주반트/항원(들) 조합물을 사용하여 제제화하고, 플루로텍 스토퍼로 밀봉된 2 ml 무균 ISO 바이알에 넣었다. 본 연구에서 시험한 아주반트/항원 샘플은 다음과 같았다: (1) PBS 단독; (2) 4가 DEN-80E (V180; DEN1-80E + DEN2-80E + DEN3-80E + DEN4-80E); (3) 4가 DEN-80E (V180) + MAA; 및 (4) 4가 DEN-80E (V180) + 알히드로겔. 아주반트/항원 샘플 (1)-(4)를 아래 설명된 바와 같이 wt 뎅기 바이러스와 1:1 비로 따로 현장 혼합하였다. wt 뎅기 바이러스와 현장 혼합하기 전후의 샘플의 용량 및 농도는 표 3에 제시된 바와 같았다.
[표 3]
4가 시험 샘플의 농도
Figure pct00003
모든 제제를 LAV와 현장 혼합하기 전에 2-8℃에서 저장하였다.
실시예 6
아주반트 및/또는 뎅기 항원 (4가 DEN-80E (V180))의 존재 하에 야생형 뎅기 바이러스를 갖는 복합 제제의 적합성/안정성 시험
실시예 5에서 제조한 항원/아주반트 샘플 (1) - (4)를 wt 뎅기 바이러스와 현장 혼합하고, 아래 설명된 바와 같이 베로 세포 상에서 시험관내 플라크 검정을 이용하여 바이러스 생존력에 대해 시험하였다.
베로 세포 (p38)를 24-웰 플레이트 내에 4.0 x 105 세포/웰로 접종하였다. 바이러스 및 wt 뎅기 바이러스 + 아주반트/DEN-80E 서브유닛 (V180) 샘플의 1:1 혼합물의 제조는 본질적으로 1가 연구에 대해 실시예 2에 설명된 바와 같았다. 1:1 wt 뎅기 바이러스/항원 샘플의 추가의 희석액을 96-웰 플레이트 내에서 제조하여, 각각의 시험 샘플의 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:10,000, 1:100,000 및 1:1,000,000 희석액을 제공하였다. T=0 및 T=24시간에 샘플에 대해 수행한 플라크 검정은 본질적으로 실시예 2에 설명된 바와 같았다.
결과는 설명된 모든 제제가 바이러스 생존력에 대해 영향을 미치는 것으로 보이지 않았음을 나타낸다 (도 3 참조). 그러나, PBS, 4가 DEN-80E 및 4가 DEN-80E + MAA를 포함하는 샘플에서 24시간 인큐베이션 후에 DENV 3 역가의 작은 (~1 로그) 감소가 존재하였다.
실시예 7
아주반트 및/또는 뎅기 항원 (전체 불활성화된 rYF-DEN2)의 존재 하에 rYF-DEN2 키메라 생 약독화 바이러스의 적합성/안정성 시험을 위한 제제의 제조
단독으로 또는 MAA 또는 알히드로겔과 조합한, 전체 정제된 불활성화된 rYF-DEN2 (PIV)와 조합으로 rYF-DEN2 LAV의 안정성을 평가하기 위해 또 다른 연구를 수행하였다. 정제된 불활성화된 rYF-DEN2 바이러스 (PIV)는 문헌 [Putnak et al., (J Infect Dis. 174(6): 1176-84 (1996))에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 간단히 설명하면, rYF-DEN2-감염된 베로 세포로부터의 상청액을 수거하고, 1000 rpm에서 10분 동안 청정화하고, 0.45 ㎛ 필터 (CN/CA형)를 통해 여과한 후, ~100 ml/min의 여과 속도, 압력 15-20 psi에서 접선 유동 (tangential flow) 여과시켰다 (저 단백질 결합 100 kDa 컷오프 (cutoff) 막). 농축 이후, 샘플을 17K rpm에서 4℃에서 18시간 동안 수크로스 구배 (15-60%) 한외-원심분리하였다. 구배 튜브의 저변으로부터 분획 (각각 1 ml)을 수집하고, 총 단백질 및 뎅기 특이적 단백질에 대해 분석하였다. 양성 분획을 모으고 PBS로 희석하고, 0.22 ㎛ 저단백질-결합 필터 (GV형, 밀리포어 (Millipore))를 통해 여과하였다. 여과한 풀 (pool)을 10일 동안 항온 수조 내에서 22℃에서 50 ml 폴리프로필렌 튜브 내에서 0.05% 포르말린으로 불활성화시켰다. 완전 바이러스 불활성화는 플라크 검정에 의해 확인하였다. 불활성화 후에, 용액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 유리 포르말린은 아황산수소나트륨으로 중화시켰다.
모든 PIV 제제는 무균 기술을 이용하여 생물-안전 캐비넷 내에서 제조하였다. 시험을 위한 샘플은 둘베코 PBS 내에서 목적하는 아주반트, 뎅기 항원(들), 또는 아주반트/항원(들) 조합물로 제제화하고, 플루로텍 스토퍼로 밀봉된 2 ml 무균 ISO 바이알에 넣었다. 본 연구에서 시험한 아주반트/항원 샘플은 다음과 같았다: (1) PBS 단독; (2) 전체 불활성화된 rYF-DEN2 PIV; (3) 전체 불활성화된 rYF-DEN2 PIV + MAA; 및 (4) 전체 불활성화된 rYF-DEN2 PIV + 알히드로겔. 아주반트/항원 샘플을 아래 설명된 바와 같이 rYF-DEN LAV와 1:1 비로 현장 혼합하였다. rYF-DEN2 생 약독화 뎅기 바이러스와 현장 혼합하기 전후의 샘플의 용량 및 농도는 표 4에 제시된 바와 같았다.
[표 4]
시험 샘플의 농도
Figure pct00004
모든 제제를 LAV와 현장 혼합하기 전에 2-8℃에서 저장하였다.
실시예 8
아주반트 및/또는 뎅기 항원 (전체 불활성화된 rYF-DEN2)의 존재 하에 rYF-DEN2 키메라 생 약독화 바이러스를 갖는 제제의 적합성/안정성 시험.
실시예 7에서 제조된 항원/아주반트 샘플을 rYF-DEN2 LAV와 현장 혼합하여 복합 제제를 제조하고, 아래 설명된 바와 같이 베로 세포 상에서 시험관내 플라크 검정을 이용하여 바이러스 생존력에 대해 시험하였다.
베로 세포 (p40)를 24-웰 플레이트 내에 4.0 x 105 세포/웰로 접종하였다. 바이러스, 및 rYF-DEN2 + 아주반트/전체 불활성화된 YF-DEN2 샘플의 1:1 혼합물의 제조는 본질적으로 1가 연구에 대해 실시예 2에 설명된 바와 같았다. 1:1 rYF-DEN2 LAV/항원 샘플의 추가의 희석액을 96-웰 플레이트 내에서 제조하여 각각의 시험 샘플의 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:10,000, 1:100,000 및 1:1,000,000 희석액을 제공하였다. T=0 및 T=24시간에 샘플에 대해 수행한 플라크 검정은 본질적으로 실시예 2에 설명된 바와 같았다.
결과는 시험한 모든 제제가 바이러스 생존력에 대해 영향을 미치지 않았음을 나타낸다 (도 4 참조).
실시예 9
마카카 물라타(Macaca mulatta)에서 뎅기 프라임-부스트 백신 접종 전략의 평가
레서스 마카크에서 수행된 상기 비-GLP 연구의 목적은 복합 제제 "프라임-부스트" 백신 접종 전략을 평가하고 이를 통상적인 프라임 부스트 전략에 비교하는 것이었다. 연구를 위해, 2가지 백신 후보, 즉, 4가 재조합 뎅기 서브유닛 백신 후보 (V180) 및 4가 뎅기 생 약독화 백신 (LAV)을 상이한 요법을 이용하여 투여하였다. 4가 V180 후보는 각각의 4가지 뎅기 바이러스 혈청형 (뎅기 바이러스 (DENV) 1, DENV2, DENV3, 및 DENV4)로부터 말단절단된 외피 당단백질 (DEN-80E)를 포함하였다. 4가 LAV는 생 약독화 키메라 황열병/뎅기 유형 1-4 4의 뎅기 바이러스 ("YF-DEN")를 포함하였다. 황열병-뎅기 키메라 백신 벡터는 YFV 17D로부터 prM 및 E 단백질을 코딩하는 유전자를 각각의 4가지 뎅기 혈청형의 것으로 교체함으로써 제작하였다. DNA 클로닝 후에, RNA를 전사시키고 베로 세포 내로 형질감염시켜 YFV 17D 복제 기구 및 관련 뎅기 바이러스의 외부 코트를 보유하는 키메라 바이러스를 얻었다.
중화 역가 (DENV에 대해) 및 ELISA (WNV에 대해)에 의해 플라비바이러스 (DENV 1, 2, 3 및 4, 및 WNV) 항체-음성이고 3 kg를 초과하는 두 성별의 건강한 성체 인도 레서스 마카크 (n=4/군)를 본 연구에서 사용하였다. 백신을 표 5에 기재된 바와 같이 투여하였다. 연구를 위해, 군 1에는 0 및 24주에 YF-DEN 백신을 피하 (SC) 투여하였다. 군 2 및 3에는 통상적인 프라임 부스트를 투여하였고, 여기서 YF-DEN 백신을 0주에 제공한 후, 24주에 MAA와 제제화한 V180을 제공하였다. 군 2에는 표준 SC 경로에 의해 YF-DEN 백신을 투여한 반면, 군 3에는 근육내 (IM) 경로에 의해 백신을 투여하였다. 이것에 의해 본 발명자들은 군 4 및 5에 제공된 복합 제제에 대해 사용된 것과 동일한 투여 경로인 IM 제공한 YF-DEN 백신의 면역원성을 평가할 수 있었다. 군 4 및 5에는 0 및 24주에 YF-DEN 백신 및 V180의 복합 제제를 투여하였다. 군 4에서 MAA가 아주반트로서 포함되고, 군 5에서 이스코매트릭스™가 아주반트로서 포함되었다. 모든 백신은 용량당 0.5-mL로 투여하였다. 백신 접종 후에, 동물을 접종 부위에서 임의의 변화, 또는 백신에 대한 이상 반응을 나타낼 수 있는 활동 또는 급식 습관의 다른 변화에 대해 매일 관찰하였다.
[표 5]
레서스 마카크 면역원성 연구에서 사용된 스케줄 및 제제
Figure pct00005
바이러스-중화 활성은 LiCor-기반 미세중화 검정을 이용하여 제32주 연구 내내 4주 마다 결정하였다. LiCor 검정을 위해, 베로 세포를 평저 96-웰 조직 배양 플레이트에서 100 ㎕ 10% 배지 199 내에 1.5x104 세포/웰로 철야 접종하였다. 별개의 96-웰 플레이트에서, 혈청 샘플을 1:10에서 시작하여 8 희석에 대해 이중으로 2배 연속 희석하였다. 종점 적정에 도달하지 못한 샘플에 대해, 샘플을 보다 높은 희석율에서 재시험하였다. 혈청을 50 pfu/웰로 희석한 동일 부피의 바이러스와 함께 인큐베이팅하였다. 모든 검정 희석은 2% 배지 199 내에서 수행하였다. 혼합물을 37℃ + 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 중화 이후, 전체 혼합물을 플레이팅시킨 베로 세포 상에 첨가하고, 37℃ + 5% CO2에서 4일 동안 인큐베이팅하였다. 배양 배지의 제거 이후, 세포를 30분 동안 PBS 내에서 3.7% 포름알데히드로 고정하였다. 플레이트를 200 ㎕ 0.1% Titon X-100/PBS로 각각 5분 동안 2회 세척하였다. 플레이트를 50 ㎕의 4G2 항체로 2.8 ㎍/ml로 염색하였다. 이어서, 비오티닐화 말 항-마우스 IgG를 7.5 ㎍/ml로 첨가한 후, IRDye® 800CW (리-코르 인크. (Li-Cor, Inc.), 미국 네브래스카주 링컨) 스트렙타비딘 (1:1000) 및 DRAQ5 (1:10,000)의 칵테일을 첨가하였다. 상기 최종 발색을 위해 플레이트를 암소에 유지하였다. 항체 및 시약을 0.2% Tween-20을 보충한 오디세이 (Odyssey) 차단 완충제 내에 희석하였다. 0.1% Tween-20/PBS를 사용하여 플레이트를 항체 교환 사이에 3회 세척하였다. 인큐베이션 단계를 실온에서 1시간 동안 수행하였다. 세척 및 분배 단계는 바이오텍 (BioTek)® EL406 플레이트 세척기 시스템 (바이오텍 인스트루먼츠, 인크 (BioTek Instruments, Inc), 미국 버몬트주 위누스키)을 이용하여 자동화하였다. 플레이트를 공기-건조시키고, 적외선 오디세이® Sa 영상화 시스템 (리-코르 바이오사이언시즈 (Li-Cor Biosciences))을 사용하여 스캐닝하였다. 비처리 데이타를 엑셀 (Excel) 프로세싱 워크시트 내로 도입하였다. 이중 웰을 평균하고, 혈청 종점 중화 역가를 각각의 검정 플레이트 상에 포함된 바이러스 대조군에 비해 50% 초과로 800 nm/700 nm 형광 통합 강도비를 감소시키는 최고 혈청 희석비의 역수로서 규정하였다. 프리즘(Prism)® (그래프패드 소프트웨어, 인크. (GraphPad Software, Inc.))를 이용하여 결과를 그래프로 그렸다. 모든 샘플은 1:10 희석비에서 시작하도록 설정하였다. 샘플이 상기 희석비에서 중화시키지 못하면, 1:5의 역가를 지정하였다.
제4주 (용량 1의 4주 후)에 대한 모든 군에 대한 DENV1, DENV2, DENV3 및 DENV4에 대한 기하 평균 중화 역가를 도 5에 요약한다. 상기 시점에, 군 1에서 DENV3에 반응하지 않은 1마리 동물을 제외하고는 모든 면역화시킨 동물에서 바이러스-중화 항체 반응이 검출되었다. 제4주 결과로부터 핵심 결론은 다음과 같다:
· IM 제공한 4가 YF-DEN 백신은 백신을 표준 SC 경로에 의해 제공할 때 유도된 것보다 더 우수하지는 않더라도 동등한 중화 역가를 자극하였다 (군 3을 군 1 및/또는 2와 비교한다).
· 용량 1의 4주 후에 복합 제제군 (군 4 및 5)에서 측정된 중화 반응은 YF-DEN 백신을 단독으로 제공할 때 유도된 것 (군 1, 2, 및 3)보다 더 우수하지는 않더라도 동등하였다. 이것은 YF-DEN 백신과 V180 서브유닛 백신 및 아주반트 (MAA 또는 이스코매트릭스™)의 복합 제제가 제1 용량의 백신에서 LAV에 대한 반응에 부정적인 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
제28주 (용량 2의 4주 후)에 대한 모든 군에 대한 DENV1, DENV2, DENV3 및 DENV4에 대한 기하 평균 중화 역가를 도 6에 요약한다. 상기 시점에, 모든 면역화시킨 동물에서 바이러스-중화 항체 반응이 검출되었다. 제28주 결과로부터 핵심 결론은 다음과 같다:
· 통상적인 프라임 부스트 (군 2 및 3) 및 복합 제제 프라임 부스트 방안 (군 4 및 5)은 둘 모두 4가 YF-DEN 백신 (군 1)에 비해 4개의 모든 DENV 유형에 대해 우월한 중화 역가를 유도하였다. 역가는 DENV 유형에 따라 3 내지 19배 더 높았다.
· 용량 2의 4주 후에 복합 제제군 (군 4 및 5)에서 측정된 중화 반응은 통상적인 프라임-부스트 요법을 투여한 군 (군 2 및 3)에서 유도된 것에 동등하였다. 이것은 YF-DEN 백신과 V180 서브유닛 백신 및 아주반트 (MAA 또는 이스코매트릭스®)의 복합 제제가 서브유닛 부스트에 대한 반응에 부정적인 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
모든 군에 대한 DENV1, DENV2, DENV3 및 DENV4에 대한 종적 기하 평균 중화 역가를 도 7에 제시한다. 종합하면, 데이타는 동물에게 제0주 및 제24주에 4가 LAV와 함께 혼합된 V180 서브유닛 백신을 투여하는 복합 제제 프라임-부스트 요법이 통상적인 프라임-부스트 방안에 대등한 반응을 끌어내고, 반응은 상동성 백신으로서 제공된 LAV에 비해 우월함을 입증한다.
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Glu Ser Thr Glu His Gly Thr 145 150 155 160 Thr Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr Ser Glu Ile Gln Leu Thr 165 170 175 Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Lys Glu Lys Ser Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala 210 215 220 Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln Asp Leu Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr 260 265 270 Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys 275 280 285 Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly 290 295 300 Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val 305 310 315 320 Leu Val Gln Ile Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Ser Thr Gln Asp Glu Arg Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Ile Gly Ala Gly Glu 370 375 380 Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly 385 390 395 <210> 2 <211> 395 <212> PRT <213> Dengue 2 <400> 2 Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Leu Thr Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Thr Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys 115 120 125 Ile Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val Val Ile Thr Pro His 130 135 140 Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys 145 150 155 160 Glu Val Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr 165 170 175 Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Lys Asp Lys Ala Trp Leu Val 195 200 205 His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met 260 265 270 Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg 275 280 285 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 290 295 300 Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 305 310 315 320 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro 370 375 380 Gly Gln Leu Lys Leu Asp Trp Phe Lys Lys Gly 385 390 395 <210> 3 <211> 393 <212> PRT <213> Dengue 3 <400> 3 Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Gln Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Thr Gln Leu Ala Thr Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Gly Lys 50 55 60 Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Ile Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Val Cys Lys His Thr Tyr 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln Cys Leu Glu Ser Ile Glu Gly Lys 115 120 125 Val Val Gln His Glu Asn Leu Lys Tyr Thr Val Ile Ile Thr Val His 130 135 140 Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Gln Gly Val Thr Ala 145 150 155 160 Glu Ile Thr Pro Gln Ala Ser Thr Val Glu Ala Ile Leu Pro Glu Tyr 165 170 175 Gly Thr Leu Gly Leu Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn 180 185 190 Glu Met Ile Leu Leu Thr Met Lys Asn Lys Ala Trp Met Val His Arg 195 200 205 Gln Trp Phe Phe Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala Thr Thr 210 215 220 Glu Thr Pro Thr Trp Asn Arg Lys Glu Leu Leu Val Thr Phe Lys Asn 225 230 235 240 Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly 245 250 255 Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Asn Ser Gly 260 265 270 Gly Thr Ser Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp 275 280 285 Lys Leu Glu Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe 290 295 300 Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile 305 310 315 320 Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser 325 330 335 Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala 340 345 350 Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu 355 360 365 Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala 370 375 380 Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Lys Lys Gly 385 390 <210> 4 <211> 395 <212> PRT <213> Dengue 4 <400> 4 Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Trp Val Asp Leu Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Gln Gly Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Thr Ala Lys Glu Val Ala Leu Leu Arg Thr Tyr Cys Ile Glu Ala Ser 50 55 60 Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr Ile Cys Arg Arg Asp Val 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Ser Gly Lys Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Leu Val Gln Ile Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val Val Val Thr Val His 130 135 140 Asn Gly Asp Thr His Ala Val Gly Asn Asp Thr Ser Asn His Gly Val 145 150 155 160 Thr Ala Thr Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser Val Glu Val Lys Leu Pro 165 170 175 Asp Tyr Gly Glu Leu Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Ile Leu Met Lys Met Lys Lys Lys Thr Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Ala Ala Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Ser Glu Val His Trp Asn Tyr Lys Glu Arg Met Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val Thr Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Ser Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Val Asp Ser 260 265 270 Gly Asp Gly Asn His Met Tyr Ala Gly His Leu Lys Cys Lys Val Arg 275 280 285 Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly 290 295 300 Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr 305 310 315 320 Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro 325 330 335 Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile 340 345 350 Ser Ser Thr Pro Phe Ala Glu Tyr Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu 355 360 365 Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp 370 375 380 Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly 385 390 395 <210> 5 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DEN4-80EZip <400> 5 Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Trp Val Asp Leu Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Gln Gly Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Thr Ala Lys Glu Val Ala Leu Leu Arg Thr Tyr Cys Ile Glu Ala Ser 50 55 60 Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr Ile Cys Arg Arg Asp Val 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Ser Gly Lys Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Leu Val Gln Ile Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val Val Val Thr Val His 130 135 140 Asn Gly Asp Thr His Ala Val Gly Asn Asp Thr Ser Asn His Gly Val 145 150 155 160 Thr Ala Thr Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser Val Glu Val Lys Leu Pro 165 170 175 Asp Tyr Gly Glu Leu Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Ile Leu Met Lys Met Lys Lys Lys Thr Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Ala Ala Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Ser Glu Val His Trp Asn Tyr Lys Glu Arg Met Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val Thr Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Ser Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Val Asp Ser 260 265 270 Gly Asp Gly Asn His Met Tyr Ala Gly His Leu Lys Cys Lys Val Arg 275 280 285 Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly 290 295 300 Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr 305 310 315 320 Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro 325 330 335 Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile 340 345 350 Ser Ser Thr Pro Phe Ala Glu Tyr Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu 355 360 365 Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp 370 375 380 Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 385 390 395 400 Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg Met Lys 405 410 415 Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu 420 425 430 Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg Gly Gly 435 440 445 Cys Gly Gly 450

Claims (41)

  1. 제1 및 제2 뎅기 백신을 포함하고, 여기서 제1 뎅기 백신은 생 약독화 뎅기 백신이고 제2 뎅기 백신은 비-복제성 뎅기 백신이고; 생 약독화 뎅기 백신은 적어도 하나의 생 약독화 뎅기 바이러스 또는 적어도 하나의 생 약독화 키메라 플라비바이러스를 포함하는 것인, 뎅기 바이러스 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 비-복제성 뎅기 백신이 재조합 뎅기 서브유닛 백신 또는 불활성화된 뎅기 백신인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 뎅기 백신이 뎅기 바이러스 유형 1 (DEN1), 뎅기 바이러스 유형 2 (DEN2), 뎅기 바이러스 유형 3 (DEN3), 및 뎅기 바이러스 유형 4 (DEN4)로부터의 뎅기 E 단백질, 또는 그의 단편을 포함하는 4가 뎅기 서브유닛 백신인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, E 단백질이 각각 N-말단의 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 DEN1, DEN2, DEN3 및 DEN4의 야생형 E의 길이의 약 80%로 이루어진 것인 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 아주반트가 알루미늄염 아주반트인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 조성물 내의 원소 알루미늄의 양이 약 50 ㎍ 내지 약 1.25 mg인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 조성물 내의 원소 알루미늄의 양이 약 200 ㎍ 내지 약 850 ㎍인 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 아주반트가 사포닌-기재 아주반트인 조성물.
  10. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 내의 각각의 E 단백질의 양이 약 0.5 ㎍ 내지 약 500 ㎍인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 조성물 내의 각각의 E 단백질의 양이 약 1.0 ㎍ 내지 약 100 ㎍인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, DEN4 E 단백질의 양이 DEN1, DEN2, 및 DEN3 E 단백질의 양의 약 1.5 내지 약 2.5배인 조성물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 E 단백질이 곤충 숙주 세포 내에서 재조합 방식으로 생산되고 발현되는 것인 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생 약독화 뎅기 백신이 4가인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 생 약독화 뎅기 백신이 4개의 키메라 플라비바이러스를 포함하고; 각각의 키메라 플라비바이러스는 단일 뎅기 바이러스 혈청형의 prM 및 E 단백질 및 상이한 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질을 포함하고, 각각의 키메라 플라비바이러스는 약독화된 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 4개의 키메라 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질이 황열병 바이러스로부터의 것인 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 각각의 4개의 키메라 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질이 prM 및 E 단백질과는 상이한 뎅기 혈청형으로부터의 것인 조성물.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 생 약독화 뎅기 백신의 역가가 10 내지 약 1x107 플라크 형성 단위 (PFU)인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 생 약독화 뎅기 백신의 역가가 약 1x103 내지 약 1x105 PFU인 조성물.
  20. 뎅기에 대한 면역 반응의 유도를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 뎅기 바이러스 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 뎅기에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  21. 뎅기 감염의 예방, 또는 그의 증상의 예방 또는 개선을 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 뎅기 바이러스 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 뎅기 감염을 예방하거나, 또는 그의 증상을 예방 또는 개선하는 방법.
  22. (a) 생 약독화 뎅기 백신인 제1 백신 및 비-복제성 뎅기 백신인 제2 뎅기 백신을 혼합하여 뎅기 바이러스 백신 조성물을 형성하는 단계;
    (b) 뎅기 감염 또는 그의 증상이 예방 또는 개선되어야 하는 환자에게 단계 (a)의 뎅기 바이러스 백신 조성물을 투여하는 단계
    를 포함하는, 뎅기 감염을 예방하거나, 또는 그의 증상을 예방 또는 개선하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 비-복제성 뎅기 백신이 재조합 뎅기 서브유닛 백신 또는 불활성화된 뎅기 백신인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 제1 뎅기 백신이 4가이고, DEN1, DEN2, DEN3, 및 DEN4 성분을 포함하고, 여기서 각각의 성분은 생 약독화 뎅기 바이러스 또는 생 약독화 키메라 플라비바이러스를 포함하는 것인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 제2 뎅기 백신이 DEN1, DEN2, DEN3, 및 DEN4로부터의 뎅기 E 단백질, 또는 그의 단편을 포함하는 4가 재조합 뎅기 서브유닛 백신인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 생 약독화 백신이 동결건조된 것이고, 재조합 서브유닛 백신이 혼합 전에 액체인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 단계 (a)의 혼합이 동결건조된 백신을 액체 백신으로 재구성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 동결건조된 백신이 단계 (a)에서 액체 백신과 혼합하기 전에 무균 희석제로 재구성되는 것인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 생 약독화 백신 및 재조합 서브유닛 백신 둘 모두가 혼합 전에 액체 형태인 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, E 단백질이 각각 N-말단의 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 DEN1, DEN2, DEN3 및 DEN4의 야생형 E의 길이의 약 80%로 이루어지는 것인 방법.
  31. 제22항에 있어서, 생 약독화 백신이 4개의 키메라 플라비바이러스를 포함하고; 각각의 키메라 플라비바이러스는 단일 뎅기 바이러스 혈청형의 prM 및 E 단백질 및 상이한 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질을 포함하고, 각각의 키메라 플라비바이러스는 약독화된 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 4개의 키메라 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질이 황열병 바이러스로부터의 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 각각의 4개의 키메라 플라비바이러스의 캡시드 및 비-구조 단백질이 prM 및 E 단백질과는 상이한 뎅기 혈청형으로부터의 것인 방법.
  34. (a) 뎅기 감염의 예방 또는 감염 가능성의 감소를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 제1 뎅기 바이러스 백신 조성물을 투여하는 단계;
    (b) 단계 (a) 후에 미리 결정된 시간이 경과하기를 기다리는 단계;
    (c) 상기 환자에게 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 제2 뎅기 바이러스 백신 조성물을 투여하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 환자에서 뎅기 감염이 예방되거나 또는 뎅기로 감염될 가능성이 감소되는 것인, 뎅기 감염의 예방 또는 감염 가능성의 감소를 필요로 하는 환자에서 뎅기 감염을 예방하거나 감염 가능성을 감소시키는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 제1 및 제2 뎅기 바이러스 백신 조성물이 동일한 것인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 단계 (b)의 시간이 2개월 내지 2년인 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)를 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  38. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 뎅기 바이러스 백신 조성물이 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
  39. 뎅기 감염과 연관된 질환의 치료 또는 예방을 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 뎅기 바이러스 백신 조성물의 용도.
  40. 환자에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 뎅기 바이러스 백신 조성물의 용도.
  41. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 뎅기 감염과 연관된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 뎅기 바이러스 백신 조성물.
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