ES2637629T3 - Inducción de una respuesta inmunitaria frente al virus del dengue usando un enfoque de sensibilización-refuerzo - Google Patents

Inducción de una respuesta inmunitaria frente al virus del dengue usando un enfoque de sensibilización-refuerzo Download PDF

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Abstract

Kit de sensibilización-refuerzo para su uso en un método de inducción de una respuesta inmunitaria profiláctica frente al virus del dengue (DEN), comprendiendo el kit de sensibilización-refuerzo dos o más dosis de un inmunógeno del virus DEN de sensibilización que van a administrarse consecutivamente, y una o más dosis de un inmunógeno del virus DEN de refuerzo, en el que el inmunógeno del virus DEN de sensibilización está compuesto por un sistema de expresión de ADN, y en el que el inmunógeno del virus DEN de refuerzo está compuesto por un sistema de replicón del virus de la encefalitis equina venezolana (VRP), en el que el sistema de VRP y el sistema de expresión de ADN contienen ADN que codifica para los genes de premembrana y de envuelta del virus DEN a partir de cepas de DEN seleccionadas del grupo que consiste en DEN1, DEN2, DEN3 o DEN4, en el que los genes de cápside y glicoproteína del sistema de VRP se reemplazan por genes de premembrana y de envuelta del mismo serotipo de DEN que en el sistema de expresión de ADN, en el que el ARN que codifica para el sistema de VRP y el ARN que codifica para el gen de cápside o glicoproteína de encefalitis equina venezolana se expresan juntos, y en el que las partículas de VRP se purifican y se usan en la vacuna.

Description

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DESCRIPCION
Induccion de una respuesta inmunitaria frente al virus del dengue usando un enfoque de sensibilizacion-refuerzo Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
La materia de la invencion se refiere a una composicion de sensibilizacion-refuerzo para su uso en un metodo de inclusion de una respuesta inmunitaria profilactica frente al virus del dengue.
Antecedentes
El virus del dengue, el agente causante de la fiebre del dengue (DF) y la fiebre del dengue hemorragico (DHF), es un virus del genero Flavivirus, un virus de ADN monocatenario con envuelta con polaridad positiva. Su ARN codifica para aproximadamente 3.400 aminoacidos. El virus existe como cuatro serotipos distinguibles antigenicamente.
La fiebre del dengue es la infeccion humana por arbovirus mas habitual a nivel mundial y una preocupacion de salud publica grave que explica estimaciones de 100 millones de infecciones al ano (OMS 1986; Monath y Helnz 1996; Thomas, et al 2003). DF y DHF se encuentran en la mayorfa de zonas tropicales incluyendo Africa, Asia, el Pacffico, Australia, y las Americas.
Aunque el virus puede crecer en una variedad de especies de mosquitos, incluyendo Aedes albopictus, Aedes polinesiensis y Aedes scutellaris, Aedes aegypti es el vector de mosquito mas eficaz debido a su habitat domestico (Gubler 1988). Se han identificado cuatro serotipos del virus del dengue antigenicamente distintos provocando todos ellos enfermedades en humanos (Gubler, et al 1979; Henohal y Putnak 1990). Cada de uno de los cuatro serotipos, aunque distintos, es lo suficientemente parecido a los otros como para provocar unicamente proteccion cruzada parcial tras la infeccion (OMS 1986). Tras la infeccion, se detecta viremia normalmente temprano en el inicio de los sfntomas (Halstead 1997). Aunque muchas de las infecciones por dengue son leves, algunas infecciones dan como resultado DHF y sfndrome de choque por dengue (DSS), que son potencialmente mortales. Esto se produce habitualmente en un pequeno numero de personas durante una segunda infeccion provocada por un virus del dengue que es diferente al virus que provoca la primera infeccion (Halstead 1997).
La infeccion por virus del dengue se produce tras la picadura de mosquitos Aedes infectados por el virus del dengue, que se habfan infectado previamente al alimentarse de humanos infectados. Los sfntomas de infeccion por dengue incluyen fiebre alta, cefalea intensa, dolor retroorbital, desarrollo de una erupcion, nauseas, dolor muscular y articular, y empiezan habitualmente en el plazo de cinco a seis dfas tras la picadura de un mosquito infectado. Los sfntomas de DHF tambien incluyen hemorragia subdermica marcada, que provoca un hematoma amoratado, asf como hemorragia de la nariz, las encfas y del tracto gastrointestinal (GI). La tasa de mortalidad asociada con DHF es del 6 al 30% produciendose la mayorfa de las muertes en lactantes. El tratamiento de DHF es sintomatico y de apoyo, y tiene como objetivo el reemplazo de la perdida de lfquidos (Nimmannitya 1996).
No es posible realizar un diagnostico exacto de DF leve o clasica basandose en caracterfsticas clfnicas solas puesto que muchos de los sfntomas de DF se parecen a los de otras enfermedades, tales como infeccion por chikungunya (Nimmannitya 1996), sarampion, gripe y rickettsiosis. El diagnostico diferencial debe incluir malaria y otras enfermedades vfricas, bacterianas y rickettsiosis. Los metodos de diagnostico para la infeccion se basan normalmente en la deteccion de virus, antfgenos vfricos, secuencias genomicas y deteccion de anticuerpos especfficos del dengue (Shu y Huang 2004). DHF puede, en algunos casos, diagnosticarse con mas exactitud basandose en signos y sfntomas clfnicos, incluyendo fiebre alta continuada durante de 2 a 7 dfas, hepatomegalia, hemoconcentracion, choque y tromocitopenia.
La mayorfa de infecciones dan como resultado DF, que es autolimitante. Sin embargo, DHF y DSS son potencialmente mortales. Aunque se han autorizado vacunas frente a otros flavivirus, tales como la fiebre amarilla y la encefalitis japonesa, actualmente no existen vacunas eficaces para proteger frente a DF, DHF o DSS.
Actualmente existen dos candidatos a vacuna tetravalente atenuada viva frente al dengue. Sin embargo, ambas de estas vacunas pueden ser o bien reactogenicas o bien escasamente inmunogenicas en algunos receptores. Las alternativas prometedoras incluyen virus quimericos (por ejemplo, fiebre amarilla/dengue), protefnas recombinantes, virus inactivados y vacunas de acido nucleico (ADN). Las vacunas de ADN pueden ser particularmente utiles en el logro de una respuesta inmunitaria mediada por celulas asf como humoral.
La evidencia experimental sugiere que, en primates no humanos, vacunas de ADN de dengue, administradas solas, requieren varias administraciones de refuerzo y largos intervalos entre las administraciones con el fin de inducir inmunidad protectora. Otras vacunas no replicantes tales como las vacunas inactivadas purificadas pueden a menudo inducir altos tftulos de anticuerpo neutralizante pero estas vacunas pueden ser malos inductores de memoria inmunologica a largo plazo. Por tanto, se necesita una composicion y un metodo de inmunizacion seguros
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y eficaces para la induccion mas oportuna de inmunidad duradera frente a la infeccion por virus del dengue.
Porter, K.R. et al. 2005. A dengue-VEE replicon particle vaccine induces the best immune response in a prime-boost regimen. Am. J. Trop. Med. Hyg. 73(6) supl.: 180-181 ensenan una composicion de sensibilizacion-refuerzo que utiliza elementos vfricos de una unica cepa, en la que se potencia la respuesta inmunitaria a una vacuna de ADN de dengue mediante un regimen de sensibilizacion-refuerzo que utiliza un sistema de replicon del virus de la encefalitis equina venezolana que expresa la protefna de envuelta completa y premembrana o una version truncada de las mismas de la cepa DEN-1 West Pac 74.
La patente estadounidense 6.455.509 da a conocer vacunas de acido nucleico de dengue que inducen anticuerpos neutralizantes, en las que la vacuna puede incluir un vector de expresion de plasmido eucariota que incluye al menos parte del gen de la envuelta y opcionalmente el gen PreM del virus del dengue.
Breve sumario de invencion
La invencion se refiere a una composicion de sensibilizacion-refuerzo para su uso en un metodo de induccion de una respuesta inmunitaria profilactica frente al virus del dengue (DEN) segun la reivindicacion 1. La siguiente descripcion tambien explica, en aras de una divulgacion completa y descripcion exhaustiva y, por tanto, para mejor entendimiento, metodos de induccion de una respuesta inmunitaria frente al virus del dengue, por ejemplo un metodo para la induccion de una respuesta inmunitaria frente al virus del dengue con reactogenicidad reducida sensibilizando al sujeto con un inmunogeno no replicante y reforzando con una vacuna vfrica tetravalente atenuada viva. Los ejemplos de inmunogenos no replicantes incluyen vacunas tetravalentes de ADN que contienen secuencias de ADN que codifican para protefnas del virus del dengue o vacunas tetravalentes de protefnas de virus del dengue inactivadas y purificadas.
Se describen ademas, en aras de totalidad, metodos de induccion de una respuesta inmunitaria al virus del dengue mediante regfmenes de vacunacion de sensibilizacion-refuerzo heterologos. Las composiciones de sensibilizacion y refuerzo contienen diferentes sistemas de expresion que codifican para y expresan protefnas vfricas del dengue. Los sistemas de expresion incluyen vectores de expresion de adenovirus, vectores de expresion de ADN y sistemas de expresion de replicon del virus de la encefalitis equina venezolana.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1. Graficos que ilustran respuestas de anticuerpos de inmunoglobulina (IgG) serica de primates no humanos inmunizados con una vacuna tetravalente de ADN de dengue (TDNA), una vacuna tetravalente inactivada y purificada de dengue (TPIV), seguido por una vacuna tetravalente atenuada viva de dengue (TLAV). Las muestras se sometieron a prueba mediante ELISA a una dilucion de 1:100.
Figura 2. Graficos de barras que ilustran un anticuerpo neutralizante en el dfa 60 tras la inmunizacion de monos con una vacuna tetravalente de ADN de dengue (TDNA), una vacuna tetravalente inactivada y purificada de dengue (TPIV), y una vacuna tetravalente atenuada viva de dengue (TLAV).
Descripcion de realizaciones preferidas
METODO SENSIBILIZACION-REFUERZO USANDO ADN/TPIV/TLAV
Existe la necesidad de la induccion de una respuesta inmunitaria de larga duracion y eficaz contra la infeccion por el virus del dengue. Para satisfacer esta necesidad crftica, la invencion contemplada comprende metodos de inmunizacion que usan ADN de virus del dengue o protefnas de virus del dengue inactivado como inmunogeno de sensibilizacion con virus del dengue vivo atenuado como inmunogeno de refuerzo en un esquema de inmunizacion de sensibilizacion-refuerzo (veanse los ejemplos 1 y 2). La respuesta inmunitaria resultante tiene mayor eficacia y seguridad.
Los virus vivos atenuados (LAV) presentan a menudo respuestas inmunitarias significativamente elevadas con respecto a otras composiciones inmunitarias, pero tambien presentan frecuentemente reactogenicidad perjudicial. Con el fin de mejorar la inmunogenicidad de las vacunas contra el dengue, mientras se reduce la reactividad potencial, un aspecto contempla un metodo para la induccion de inmunidad frente al virus del dengue que comprende administrar una vacuna de ADN tetravalente (TDNA) o una vacuna tetravalente purificada e inactivada (SPIV) como inmunogeno de sensibilizacion seguido por un refuerzo con un virus tetravalente vivo atenuado (TLAV). La justificacion de la invencion es que la sensibilizacion con vacunas no replicantes, tales como ADN o protefna, generara una respuesta inmunitaria que reducira la reactogenicidad y mejorara la inmunogenicidad del TLAV (vease el ejemplo 1).
METODO DE SENSIBILIZACION-REFUERZO HETEROLOGO USANDO REPLICON DE VEE/VECTOR DE EXPRESION DE ADN/VECTOR DE EXPRESION DE ADENOVIRUS
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Se contempla el uso de un vector de adenovirus o replicon del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) para expresar protefnas del virus del dengue como o bien una sensibilizacion o bien un refuerzo, que se describe en detalle en el ejemplo 3. En los metodos de inmunizacion contemplados, o bien vectores de expresion de adenovirus, vector de expresion de ADN o bien replicon de VEE, conteniendo cada uno secuencias de ADN de virus del dengue, comprenden la inmunizacion de sensibilizacion. Posteriormente a la inmunizacion de sensibilizacion, se administra un refuerzo heterologo o bien como vector de expresion de adenovirus o bien como replicon de VEE, conteniendo cada uno secuencias que codifican para protefnas del virus del dengue (vease la tabla 2).
Ejemplos
Ejemplo 1: Composicion y metodo de induccion de una respuesta contra el dengue usando TDNA/TPIV/TLAV
Se sensibilizaron grupos de macacos de la India (N=4) con o bien dos (2) dosis de TDNA, una dosis de TPIV, o bien una dosis de TLAV, seguido por refuerzo con TLAV. Se preparo el TLAV del dengue mediante pases en serie de cuatro aislados de virus monovalente de tipo natural en celulas primarias de rinon de perro (PDK). Se sometieron a prueba los virus sometidos a pases en macados de la India donde indujeron niveles significativamente menores de viremia en comparacion con virus originales de tipo natural no sometidos a pases. Se propagaron entonces en celulas de pulmon de macaco de la India fetal (FRhL) y se combinaron para preparar la formulacion de TLAV. La formulacion puede comprender cualquier combinacion cepas del virus del dengue y pueden usarse protefnas. Un aspecto preferido, ilustrado en este ejemplo, consiste en Den 1 PDK 27, DEN 2 PDK 50, DEN 3 PdK 20 y DEN 4 PDK 6.
TDNA puede consistir en constructos o secuencias de ADN que codifican para cualquier protefna del dengue. En este ejemplo, se ilustra un aspecto preferido, que consiste en genes de premembrana (prM) y de envuelta (E) de DEN 1 West Pac, DEN 2 de tipo natural/Phil + dominio de protefnas de membrana asociadas a lisosomas (LAMP), DEN 3 de tipo natural/Phil, y DEN 4 de tipo natural/Phil. El constructo de DEN 2 tiene un reemplazo en los dominios citoplasmaticos y transmembrana C-terminales de E por LAMP.
De manera similar, TPIV puede ser una combinacion de una o mas protefnas de virus del dengue purificadas e inactivadas. Como ilustracion, en un aspecto preferido, el TPIV consiste en la protefna nucleo (C), premembrana (prM), envuelta (E) y protefna no estructural 1 (NS1) de DEN 1 (West Pac), DEN 2 (S16803), DEN 3 (CH53489) y DEN 4 (TVP-360). Se hicieron crecer los virus en celulas Vero, se purificaron, se inactivaron con formalina y se adsorbieron sobre hidroxido de aluminio al 0,1%.
En referencia a la figura 1, las respuestas de anticuerpos medidas mediante ELISA demostraron respuestas inmunitarias tetravalentes y altos tftulos de IgG especffica de dengue en todos los grupos, que se mantuvieron hasta el dfa de la exposicion. En referencia a la figura 2, se demostraron anticuerpos neutralizantes de virus con bajo tftulo (Nab) frente a DEN-1, DEN-3 y DEN-4 despues de la sensibilizacion en todos los grupos de vacuna. Nab frente a DEN-2 fueron los mas altos en animales que recibieron el TLAV (GMT = 1216) seguido por los grupos que recibieron TPIV (GMT = 347) y TDNA (GMT =126). Los tftulos de Nab alcanzaron el punto maximo un mes despues del refuerzo de TLAV y luego descendieron a lo largo del tiempo en todos los grupos. Se observaron los tftulos de Nab tetravalente mas persistentes con el regimen de TPIV/TLAV.
Seis meses despues de la vacunacion de refuerzo, se expusieron todos los animales vacunados y un grupo de control sin vacunar a virus DEN-3 vivo no atenuado. Tal como se muestra en la 1, se midio la viremia serica durante 10 dfas despues de la exposicion a virus vivo para evaluar la proteccion. Se observo proteccion completa frente a la viremia en el grupo de TLAV/TLAV y el grupo de TPIV/LAV. Tres de cuatro animales en el grupo de TDNA/TDNA/TLAV presentaron de 1 a 3 dfas de viremia (media = 1,5 dfas) en comparacion con los controles sin vacunar, que tenfan una media de 4,75 dfas de viremia. La medicion de tftulos de Nab de virus 14 dfas despues de la exposicion mostro un aumento de 2-5 veces y 2-10 veces en los grupos de TPIV/TLAV y de TLAV/TLAV respectivamente, mientras que el regimen de TDNA/TLAV dio como resultado un aumento de 6-53 veces.
Tabla 1
Viremia despues de la exposicion
Grupo
Mono Dfas de viremia Dfas medios de viremia (por grp)
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10
ADN/ADN/LAV
A71 - - - - - - + - - - -
856Z
894Z + - + - - - - - - -
922Z - - - - + + + - - -
1,5
PIV/LAV
890Z
A63Z
916Z
5
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25
30
35
40
45
A96Z
0,0
LAV/LAV
P146
860Z
3158
928Z
0,0
SAL/SAL
914Z + + + + + + - - - -
B85 - + - - - - + - + +
868Z - + + - - + + + - -
898Z - + + + + - - - - -
4,75
La conclusion a partir de estos estudios demuestra que la sensibilizacion con TPIV dio como resultado un aumento de la inmunogenicidad de la vacuna y de la eficacia protectora en comparacion con la sensibilizacion con TDNA, y no impidio el refuerzo eficaz con TLAV.
Ejemplo comparativo
Ejemplo 2: Uso profetico de TDNA/TPIV/TLAVpara inducirinmunidad en humanos
Un aspecto de la invencion actual es un metodo de administracion de TDNA/TPIV seguido por formulacion de TLAV a humanos con el fin de inducir una respuesta inmunitaria contra el dengue. El TDNA, TPIV y TLAV pueden estar compuestos por cualquier cepa o secuencia genica del dengue, tal como se ilustra en el ejemplo 1.
Pueden usarse otros metodos de administracion. Sin embargo, como ilustracion del metodo de la invencion contemplado, se da a conocer el siguiente ejemplo profetico como realizacion preferida. En el ejemplo profetico, el TDNA se administra por via intramuscular como un total de 5 mg (1,25 mg/serotipo) usando el instrumento Biojector sin aguas. El TDNA se administra como dos dosis, con un mes de separacion. El TPIV se administra como una unica dosis de 4 ug (1 ug/serotipo) por via intramuscular, usando una aguja y una jeringa. El TLAV se administra como 5 logs/serotipo por via subcutanea usando una aguja y una jeringa.
Ejemplo 3: Ejemplos profeticos de inmunizacion de sensibilizacion/refuerzo usando replicon de VEE, sistema de expresion de adenovirus o composiciones de sistema de expresion de ADN
El metodo de inmunizacion contemplado comprende varias posibles composiciones de sensibilizacion/refuerzo usando replicon de VEE, sistema de expresion de adenovirus o un sistema de expresion de ADN, conteniendo cada sistema secuencias genicas del dengue. En la tabla 2 se ilustran composiciones y combinaciones de sensibilizacion- refuerzo a las que se hace referencia.
Tabla 2: Combinaciones de composiciones de sensibilizacion-refuerzo
Sensibilizacion
Refuerzo
Sistema de expresion de ADN
Vector de expresion de adenovirus
Sistema de replicon de VEE
Vector de expresion de adenovirus
Sistema de expresion de ADN
Sistema de replicon de VEE
Vector de expresion de adenovirus
Sistema de replicon de VEE
Por ejemplo, el vector de expresion de adenovirus, enumerado en la tabla 2, puede ser cualquier vector de expresion de adenovirus. Al vector de expresion de adenovirus contemplado se le han quitado los genes E1 y E4, que se reemplazan por los genes de premembrana (prM) y de envuelta (E) de o bien dEn 1 y DEN 2 o bien DEN 3 y DEN
4. La composicion de adenovirus contemplada se administra, por tanto, o bien como unico vector de adenovirus que expresa genes de solo dos cepas del dengue (es decir, DEN 1 y 2 o 3 y 4) o bien como una mezcla de 2 vectores de adenovirus expresando uno DEN 1 y 2 y expresando el otro vector DEN 3 y 4.
El sistema de expresion de ADN es cualquier sistema de expresion de ADN adecuado que puede realizar expresion in vivo. Un sistema preferido es pVR1012 (vease la patente n.° 6.455.509 concedida a Kochel, et al). En esta composicion, se inserta un constructo o secuencia de ADN que codifica para genes de membrana y envuelta del dengue para o bien DEN 1, 2, 3 o bien 4 en el plasmido. La composicion es, por tanto, o bien un unico plasmido que contiene genes para una unica cepa del dengue o bien una mezcla de 2 o mas plasmidos conteniendo cada uno genes de diferentes cepas del dengue.
De manera similar al sistema de expresion de ADN, el sistema de replicon (VRP) de la encefalitis equina venezolana (VEE) contiene protefnas de premembrana y envuelta de o bien DEN 1, 2, 3 o bien 4. Como la composicion de vacuna de ADN, la composicion de VRP es o bien un unico VRP que contiene genes para una unica cepa del
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dengue o bien una mezcla de 2 o mas sistemas VRP conteniendo cada uno genes de diferentes cepas del dengue. Los genes de prM y E del dengue se clonan en un vector de plasmido que contiene el genoma de VEE, reemplazando los genes de capside y glicoprotefna de VEE. Este plasmido recombinante contiene todas las secuencias (excepto la capside y glicoprotefna de VEE) para empaquetar el ARN en partfculas de replicon. Otros dos plasmidos, conteniendo cada uno los genes de capside y glicoprotefna de VEE, proporcionan los elementos que faltan en trans, y forman partes del sistema tripartita (tres plasmidos). Se prepara ARN a partir de cada uno de los tres plasmidos mediante transcripcion in vitro.
Se usa una mezcla de los 3 ARN para transfectar celulas BHK (de rinon de crfa de hamster). Los ARN se traducen para dar protefnas en las celulas transfectadas. Las celulas BHK transfectadas producen entonces VRP en los que se ha empaquetadoel ARN recombinante que contiene genes del dengue. Estos VRP se purifican y se usan como vacuna. Las vacunas de VRP del dengue pueden infectar celulas pero no pueden propagar una nueva descendencia.
Ejemplo 4: Vacunacion usando un sistema de expresion de ADNlcomposicion de sensibilizacion/refuerzo de replicon de VEE
Como ilustracion, se construyo una vacuna candidata DIME-VRP que expresaba protefnas de premembrana (prM) y envuelta (E) de virus del dengue de tipo 1 a partir de un sistema de replicon de virus de la encefalitis equina venezolana (VEE). Se compararon tres regfmenes de vacunacion (vacuna de ADN DIME, DIME-VRP, y una vacuna de sensibilizacion-refuerzo heterologa con ADN DIME como inmunogeno de sensibilizacion y DDIME-VRP como inmunogeno de refuerzo) para determinar la inmunogenicidad y la proteccion frente a la exposicion al virus del dengue 1 en un modelo de primate no humano.
Se inmunizaron grupos de 3 y 4 macacos cangrejeros con tres dosis de vacuna de ADN DIME (DDD), tres dosis de DIME-VRP (vvv) o con dos dosis de vacuna de sensibilizacion de ADN y una tercera dosis de refuerzo de DIME- VRP (DDV). Se inoculo un grupo de control de animales con PBS. Se midio el anticuerpo neutralizante de virus mediante la prueba de neutralizacion de reduccion de placas (PRNT) y se determinaron los tftulos de neutralizacion al 50% (PRNT-50) mediante analisis probit. Se midieron las respuestas de celulas T mediante ELISPOT de gamma- IFN. Medido 4 semanas despues de la inmunizacion final, el grupo de DDV produjo los tftulos de anticuerpo neutralizante de virus mas altos (PRNT-50 = 2304) seguido por los grupos VVV (PRNT-50 = 1405) y DDD (PRNT-50 = 1364). Sin embargo, se demostraron respuestas de celulas T moderadas unicamente en animales vacunados con DDD y DDV.
Cinco meses despues de la dosis final, se expusieron todos los animales a virus del dengue 1 vivo y se determino la viremia infectando celulas Vero con sueros recogidos de hemorragias diarias. Los tres (3) animales de control se volvieron viremicos durante 6-7 dfas (media = 6,3 dfas). Todos los regfmenes de vacunacion mostraron una proteccion significativa frente a la viremia. Los animales inmunizados con DDV estaban completamente protegidos frente a la viremia (media = 0 dfas). Los animales vacunados con DDD y VW tenfan dfas medios de viremia de 0,66 y 0,75, respectivamente. Por tanto, la respuesta de anticuerpos y la proteccion logradas a partir de DlME-VRP era comparable a las logradas a partir de la vacuna de DlME-ADN. Sin embargo, el enfoque de sensibilizacion-refuerzo dio como resultado mayores respuestas de anticuerpos y proteccion completa.
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Son realizaciones adicionales:
1. Un metodo de induccion de una respuesta inmunitaria frente al virus del dengue que comprende administrar un inmunogeno del virus del dengue de sensibilizacion que comprende una vacuna de ADN tetravalente o una vacuna tetravalente purificada e inactivada y un inmunogeno del virus del dengue de refuerzo que comprende una vacuna vfrica tetravalente atenuada viva.
2. El metodo de la realizacion 1, en el que dicha vacuna de ADN tetravalente contiene secuencias de ADN que codifican para protefnas del dengue.
3. El metodo de la realizacion 1, en el que dicha vacuna de ADN tetravalente contiene una secuencia de ADN que codifica para los genes de prM/E de DeN 1, DEN 2, DEN 3 y DEN 4.
4. El metodo de la realizacion 3, en el que dicha secuencia de ADN de DEN 2 es un constructo que tiene un reemplazo de los dominios citoplasmaticos y transmembrana C-terminales de E por dominio de membrana asociado a lisosomas.
5. El metodo de la realizacion 1, en el que dicha vacuna tetravalente purificada e inactivada contiene protefnas del dengue purificadas que representan cualquier cepa de DEN 1, DEN 2, DEN 3 y DEN 4.
6. El metodo de la realizacion 1, en el que dicha vacuna vfrica atenuada viva comprende un virus del dengue vivo atenuado que representa cualquier cepa de DEN 1, DEN 2, DEN 3 y DEN 4.
7. El metodo de la realizacion 1, en el que dicho inmunogeno de refuerzo se administra entre dos semanas y 2 meses de dicha administracion de dicho inmunogeno de sensibilizacion.
8. Un metodo de induccion de una respuesta inmunitaria frente al virus del dengue que comprende administrar un inmunogeno del virus del dengue de sensibilizacion y reforzar con un inmunogeno del virus del dengue heterologo en el que:
a. dicho inmunogeno del virus del dengue de sensibilizacion se selecciona del grupo que consiste en:
i) un sistema de expresion de ADN;
ii) un vector de expresion de adenovirus; y
iii) un sistema de replicon del virus de la encefalitis equina venezolana;
b. dicho inmunogeno del virus del dengue de refuerzo se selecciona del grupo que consiste en:
i) un vector de expresion de adenovirus; y
ii) un sistema de replicon del virus de la encefalitis equina venezolana.
9. El metodo de la realizacion 8, en el que dicho inmunogeno de sensibilizacion esta compuesto por uno o mas sistemas de expresion de adenovirus conteniendo cada uno de dichos sistemas de adenovirus ADN que codifica para genes de premembrana y envuelta de DEN 1 y DEN 2 o DEN 3 y DEN 4.
10. El metodo de la realizacion 8, en el que dicho inmunogeno de sensibilizacion esta compuesto por uno o mas sistemas de expresion de ADN conteniendo cada uno de dichos sistemas de ADN ADN que codifica para genes de premembrana y envuelta del virus del dengue de cepas del dengue seleccionadas del grupo que consiste en DEN 1, DEN 2, DEN 3 y DEN 4.
11. El metodo de la realizacion 8, en el que dicho inmunogeno de sensibilizacion esta compuesto por uno o mas sistemas de replicon del virus de la encefalitis equina venezolana conteniendo cada sistema de encefalitis equina venezolana ADN que codifica para genes de premembrana y envuelta del virus del dengue de las cepas del dengue seleccionadas del grupo que consiste en DEN 1, DEN 2, DEN 3 y DEN 4.
12. El metodo de la realizacion 8, en el que dicho inmunogeno de refuerzo esta compuesto por uno o mas sistemas de expresion de adenovirus conteniendo cada uno de dichos sistemas de adenovirus ADN que codifica para genes de premembrana y envuelta de tanto DEN 1 y DEN 2 como DEN 3 y DEN 4.
13. El metodo de la realizacion 8, en el que dicho inmunogeno de refuerzo esta compuesto por uno o mas sistemas de replicon del virus de la encefalitis equina venezolana conteniendo cada uno de dichos sistemas de encefalitis equina venezolana ADN que codifica para genes de premembrana y envuelta del virus del dengue de cepas del
dengue seleccionadas del grupo que consiste en DEN 1, DEN 2, DEN 3 y DEN 4.

Claims (1)

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    REIVINDICACIONES
    Kit de sensibilizacion-refuerzo para su uso en un metodo de induccion de una respuesta inmunitaria profilactica frente al virus del dengue (DEN), comprendiendo el kit de sensibilizacion-refuerzo dos o mas dosis de un inmunogeno del virus DEN de sensibilizacion que van a administrate consecutivamente, y una o mas dosis de un inmunogeno del virus DEN de refuerzo,
    en el que el inmunogeno del virus DEN de sensibilizacion esta compuesto por un sistema de expresion de ADN,
    y en el que el inmunogeno del virus DEN de refuerzo esta compuesto por un sistema de replicon del virus de la encefalitis equina venezolana (VRP), en el que el sistema de VRP y el sistema de expresion de ADN contienen ADN que codifica para los genes de premembrana y de envuelta del virus DEN a partir de cepas de DEN seleccionadas del grupo que consiste en DEN1, DEn2, DEN3 o DEN4,
    en el que los genes de capside y glicoprotefna del sistema de VRP se reemplazan por genes de premembrana y de envuelta del mismo serotipo de DEN que en el sistema de expresion de ADN, en el que el ARN que codifica para el sistema de VRP y el ARN que codifica para el gen de capside o glicoprotefna de encefalitis equina venezolana se expresan juntos, y en el que las partfculas de VRP se purifican y se usan en la vacuna.
    Dos o mas kits de sensibilizacion-refuerzo segun la reivindicacion 1, para su uso en un metodo de induccion de una respuesta inmunitaria profilactica frente al virus DEN.
    Uno o mas kits de sensibilizacion-refuerzo para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho sistema de expresion de ADN es pVR1012.
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